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ACTIVIDAD DE Ricinus communis L. FRENTE A MOSQUITA BLANCA Trialeurodes vaporariorum WESTWOOD (HOMOPTERA: ALEYRODIDAE). T E S I S PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE: M A E S T R O E N C I E N C I A S P R E S E N T A : ING. MIGUEL ÁNGEL RAMOS LÓPEZ DIRECTORA DE TESIS: DRA. MARIA CRISTINA PEREZ-AMADOR Y BARRÓN MÉXICO, D.F. MARZO, 2006. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS FACULTAD DE CIENCIAS UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. A G R A D E C I M I E N T O S . A mi madre la señora Paz Olivia López García, a la que toda mi vida llevo en mi mente, admiro, quiero, por haberme dado la vida y cuidado. A mi sobrino Kevin que llego para aprender a comprender mejor a la vida, así como a mis hermanos Abelardo, Oscar y Carlos. A Blanca que quiero mucho, por haber llegado a mi vida y compartir su tiempo y espacio conmigo. A mis grandes amigos que quiero mucho y espero contar con su amistad toda mi vida, mil gracias a todos ustedes. A la Dra. Laura Delia Ortega Arenas y al Dr. Cesáreo Rodríguez Hernández, por permitir la utilización de sus instalaciones en el Colegio de Postgraduados para la realización de este trabajo. A Josefina, Carlitos y Verónica por su amistad y apoyo en el laboratorio. Y muy respetuosamente al jurado: Dra. María Cristina Pérez Amador. Dr. Zenón Cano Santana. Dr. Baldomero Esquivel Rodríguez. M. en C. Yolanda Domínguez Rubio. Dra. Patricia Guevara Fefer. INDICE GENERAL I.1 INTRODUCCIÓN. 2 I.2 METABOLITOS SECUNDARIOS. 2 I.3 RESPUESTA DE LAS ESPECIES VEGETALES Y LA PRESIÓN DE SELECCIÓN POR HERBIVORÍA. 4 I.4 ALCALOIDES. 5 I.5 EFECTO DE LOS ALCALOIDES FRENTE A INSECTOS. 7 I.6 RICININA 8 I,7 LA HIGUERILLA Ricinus communis. 9 I.8 LA MOSQUITA BLANCA Trialeurodes vaporariorum. 11 I.9 JUSTIFICACIÓN 13 I.10 OBJETIVOS 14 I.11 HIPÓTESIS 15 II. MATERIALES Y MÉTODOS 16 II.1 OBTENCIÓN DEL ALCALOIDE RICININA 16 II.2 EXTRACTOS ACUOSOS DE SEMILLAS DE Ricinus communis 16 II.3 ENSAYO BIOLÓGICO 17 II.3.1 CRIA DE MOSQUITA BLANCA 17 II.3.2 EXPERIMENTO DE CONCENTRACIÓN DE REPELENCIA MEDIA (CR50) 18 II.3.3 EXPERIMENTO DE CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA (CL50) 22 II.3.4 PRUEBA DE TRNSLOCACIÓN DE LA RICININA 23 III. RESULTADOS 24 III.1 CONCENTRACIÓN Y PRESENCIA DE LA RICININA 24 III.2 EXPERIMENTO DE CONCENTRACIÓN DE REPELENCIA MEDIA (CR50) 25 III.3 EXPERIMENTO DE CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA (CL50) 31 III.4 PRUEBA DE TRANSLOCACIÓN DE LA RICININA 34 IV. DISCUSIÓN 35 IV.1 RENDIMIENTO DE RICININA 35 IV.2 CONCENTRACIÓN DE REPELENCIA MEDIA (CR50) 36 IV.3 CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA (CL50) 38 IV.4 MOVILIDAD DE LA RICININA 39 V CONCLUSIONES 40 VI LITERATURA CITADA 41 2 I.1 INTRODUCCIÓN. El estudio de los metabolitos secundarios como productos defensivos de las especies vegetales frente a sus herbívoros, ha sido ampliamente estudiado, siendo los pioneros de este campo de investigación Ehrlich y Raven (1964), sin embargo actualmente los trabajos en ésta área del conocimiento de la ecología química se han ido incrementando. Dentro de los metabolitos secundarios que tienen mayor capacidad de actividad defensiva, se encuentran los alcaloides (Levin, 1978; Robinson, 1979), de los cuales, se desarrolló todo un grupo sintético de insecticidas, el grupo de los “carbamatos” que tienen su origen en el alcaloide fisostigmina (Morón, 1985). La ricinina es un alcaloide contenido en la higuerilla Ricinus communis, esta especie vegetal en México no reporta plagas según Reyes (1991), por otro lado Herrera (1997) demostró efecto insecticida de extractos acuosos hechos con la semilla de R. communis frente a la mosquita blanca Trialeurodes vaporariorum, y Olaifa (1991) comprobó que la ricinina tiene efecto letal contra los pulgones de la especie Myzus persica. En esta investigación se determinará el efecto repelente y el efecto letal de la ricinina, así como de dos extractos acuosos realizados a las semillas de R. communis, frente a T. vaporariorum. I.2 METABOLITOS SECUNDARIOS. Las especies vegetales contienen una gran diversidad de sustancias denominadas metabolitos secundarios (Brattsten, 1979; Gros, 1985; Krebs, 1985), y algunos de estas sustancias las usan como mecanismos defensivos contra herbívoros (Ehrlich y Raven, 1964). 3 En este sentido, hay diversos trabajos que sustentan la teoría de la defensa química de las especies vegetales frente al estrés causado por sus consumidores (Kubo, 1985; Berenbaum, 1988; Berembaum, 1991; Berembaum, 1993; Espinosa, 1991). En estos trabajos la parte medular de la defensa es atribuida a factores químicos, por lo que se ha explorado el papel de los metabolitos secundarios como un mecanismo de respuesta a la presión selectiva ejercida por los herbívoros (Berenbaum, 1988), ya sea por efecto de una sustancia en particular del metabolismo secundario (Berenbaum, 1991) o de un grupo de sustancias, o bien, del efecto de mezclas de compuestos secundarios (Espinosa, 1991). Sin embargo, existe poca evidencia que compruebe que un compuesto individual o una mezcla determina la resistencia de las especies vegetales contra un herbívoro o patógeno con cierto grado de especialización (Berenbaum, 1993). En ocasiones, la actividad biológica se basa en la diversidad de los metabolitos secundarios presentes en la especia, o bien, la efectividad contra un grupo de consumidores, pudiendo ser ineficaz contra otros (Kubo, 1985). Ehrlich y Raven (1967) sugieren que algunos metabolitos secundarios le sirven a las especies vegetales como potentes insecticidas o repelentes de insectos. Así que las especies vegetales que producen metabolitos secundarios poseen ventajas selectivas contra las que no lo hacen. Los aleloquímicos son metabolitos secundarios definidos como sustancias no nutritivas, capaces de afectar el crecimiento, el desarrollo, la salud y la conducta en individuos de una especie diferente y pueden dividirse en: kairomonas y alomonas (Reese, 1979; Berenbaum, 1988). Las kairomonas, son aleloquímicos presumiblemente empleados en beneficio del organismo receptor; son compuestos químicos producidos por las especies vegetales que pueden ser atrayentes o estimulantes de la alimentación y de la oviposición de algunos insectos. Estos compuestos 4 favorecen al organismo que las percibe y no tienen un valor nutritivo especial (Reese, 1979), los flavonoides tienen como función biológica, la de atraer insectos, favoreciendo así la polinización de las especies vegetales que los contienen (Gros, 1985, Valencia, 1995). Por su parte las alomonas son aleloquímicos que benefician al organismo que las produce, desalentando o inhibiendo la posibilidad de ser comido repeliendo a los depredadores, inhibiendo entre otras actividades la alimentación, reduciendo su digestibilidad, envenenandoa sus agresores con sustancias tóxicas. Las alomonas benefician al emisor y ocasionan un efecto negativo al receptor o consumidor (Reese, 1979). La azadiractina es una sustancia que tiene efectos letales y de disminución de crecimiento en larvas de lepidópteros (Simmonds, 1990) y podemos mencionarla como alomona. I.3 RESPUESTA DE LAS ESPECIES VEGETALES Y LA PRESIÓN DE SELECCIÓN POR HERBIVORÍA. Las especies vegetales durante su crecimiento y desarrollo se enfrentan a diferentes tipos de presiones selectivas de naturaleza biótica y abiótica. En los primeros encontramos el daño causado por herbívoros (mamíferos e insectos) y patógenos (hongos y bacterias) principalmente y entre los factores abióticos se encuentran las deficiencias en la calidad nutricional del suelo, el agua, las condiciones microclimáticas, el pH y la luz. Cuando las especies vegetales se someten a cualquier tipo de agente capaz de producir algún daño en su metabolismo celular y por consiguiente a su crecimiento y desarrollo, surgen cambios metabólicos, estos cambios son capaces de incrementar la “resistencia” de la planta al daño (Azcon-Bieto, 1993). De manera general, ante las diversas presiones, a que las especies vegetales están expuestas, éstas desarrollan dos tipos de respuestas 5 evolutivas, según Barcelo (1992): 1) desarrollo de funciones y nuevas estructuras que contrarrestan el daño, 2) las especies vegetales adaptan (evolutivamente) sus funciones para poder operar en condiciones adversas, es decir, las especies vegetales resisten esas condiciones. Con frecuencia en la planta se presentan simultáneamente los dos tipos de respuestas: contrarrestar y resistir. De los estudios de las especies vegetales, el daño causado por herbívoros y patógenos constituye uno de los temas sobresalientes en el campo de la ecología química (Oyama, 1986; Cano, 1987), ya que a los metabolitos secundarios se les ha atribuido un papel muy importante en la defensa de las especies vegetales contra sus consumidores (Ehrlich y Raven, 1964 y Kubo, 1985). Y de los metabolitos secundarios los alcaloides son el grupo de compuestos químicos más ampliamente distribuidos y estudiados (Verpoorte, 1994). I.4 ALCALOIDES. Los alcaloides son uno de los grupos más numerosos de los metabolitos secundarios, con cerca de 16 000 compuestos, (Verpoorte, 1994). En general son compuestos sólidos, cristalinos, incoloros, de reacción básica que contienen uno o más átomos de nitrógeno que forman parte de un anillo (Valencia, 1995). Su biosíntesis se deriva de los aminoácidos, los dos grupos de mayor número son los alcaloides indólicos con más de 4 100 compuestos, los cuales derivan del triptofano, y el segundo grupo es el de los alcaloides isoquinolínicos-feniletilamínicos, con más de 4 000 compuestos conocidos que se derivan de la fenilalanina y de la tirosina (Verpoorte, 1994). Los alcaloides tienen dos cualidades adicionales: poseen estructuras moleculares complejas y actividad farmacológica importante (Valencia, 1995). Estos compuestos se presentan en hojas, semillas, raíces y corteza de las especies vegetales, aunque no están 6 universalmente distribuidos por las especies vegetales (Gros, 1985). A veces se encuentran en las especies vegetales en forma de bases libres, es más común encontrarlos en forma de sales solubles (Valencia, 1995). Los ácidos orgánicos con los que generalmente se encuentran combinados son el málico, oxálico, succínico, cítrico, tartárico, y tánico, entre otros y algunas veces están unidos a moléculas de azúcares formando glicoalcaloides, y alcaloides que se encuentran en forma de amidas (Valencia, 1995). Por razones históricas y debido a la complejidad estructural que presentan los alcaloides, su nomenclatura no ha sido sistematizada, por lo que suelen ser designados según el género de la planta que los contiene y de la cual fueron aislados inicialmente (Gros, 1985) y en algunos casos por el nombre de su descubridor (Valencia, 1995). De acuerdo a Gros (1985), los alcaloides se han agrupado en: 1. Alcaloides pirrolidínicos (p. ej., la cocaína). 2. Alcaloides piridínicos y piperidínicos (p. ej., la ricinina). 3. Alcaloides isoquinolínicos-feniletilamínicos (p. ej., la papaverina). 4. Alcaloides morfínicos (p. ej., la morfina). 5. Alcaloides quinolínicos (p. ej., la quinina). 6. Alcaloides indólicos (p. ej., la yohimbina). 7. Alcaloides imidazólicos (p. ej., la pilocarpina). 8. Alcaloides quinazolínicos (p. ej., la vasicina). 9. Alcaloides quinolizidínicos (p. ej., la lupinina). 10. Alcaloides pirrolizidínicos (p. ej., la monocrotalina). 11. Alcaloides de la eritrina (p. ej., la eritratidina). 12. Alcaloides de las amarillidáceas (p. ej., la licorina). 13. Alcaloides de los licopodios (p. ej., la licopodina). 14. Alcaloides esteroidales (p. ej., la tomatidina). 15. Alcaloides diterpénicos (p. ej., la atisina). 7 Se ha escrito mucho acerca de la función que desempeñan los alcaloides en las especies vegetales, pero todavía es objeto de especulaciones y teorías (Gros, 1985; Valencia, 1995). Las principales teorías, según Valencia (1995) son: 1. Son productos finales del metabolismo vegetal y no tienen función alguna en la vida de la planta. 2. Son reguladores del crecimiento de las especies vegetales 3. Sirven como repelentes o atrayentes de insectos 4. Es la forma en la cual la especie vegetal almacena nitrógeno y sustancias de reserva capaces de suministrar nitrógeno u otros elementos necesarios para la planta. 5. Son agentes venenosos que sirven de protección contra los animales herbívoros. I.5 EFECTO DE LOS ALCALOIDES FRENTE A INSECTOS. El rol de los metabolitos secundarios como mecanismos defensivos de las especies vegetales ha sido sujeto de numerosos estudios, siendo los alcaloides el grupo más estudiado en este sentido (Levin, 1978). Se ha demostrado el papel tóxico y repelente de los alcaloides en algunos insectos como principales formas de acción (Robinson, 1979). Levinson (1976) hace una recopilación sobre el efecto en insectos de algunos alcaloides con propiedades inhibidoras de la alimentación y/o repelentes, entre los que se haya la tomatina contra larvas de Leptinotarsa decemlineata (Lepidoptera), la solanina contra larvas de Pieris brassicae (Lepidoptera), la gramina contra adultos de Schistocerca gregaria (Orthoptera), la cafeína y la conesina contra adultos de Dysdercus fulvoniger, D. koenigii, D. völkeri (Hemiptera), y la quinina, estricina, brucina, nicotina, berberina, pilocarpina, atropina, escopolamina, morfina, conesina, esparteina, tomatina y cafeína contra larvas de Bombix mori, 8 Pieris brassicae y Lymantria dispar (Lepidoptera). Se ha demostrado que la α-tomatina tiene acción repelente contra Empoasca fabae (Homoptera), mientras que la solanina, la tomatina, la lupinina, la hiosciamina, la hordenina, la lobelina, la veratrina y la gramina presentaron algún grado de efecto letal sobre Melanoplus bivittatus (Orthoptera), (Robinson, 1979). Por otra parte, Baldwin (1988) demostró la acción defensiva de los alcaloides nicotina y nornicotina sobre Manduca sexta (Lepidoptera), mientras que Stamp (1996) notó que la tomatina tuvo actividad biológica sobre Maduca sexta, Helicoverpa zea y Spodoptera exigua (Lepidoptera). Por último, de Boer (1999) encontró que los alcaloides pirrolizidínicos presentes en la planta de Senecio jacobaea (Asteraceae) disminuyen el daño por herbivoría de Spodoptera exigua y Mamestra brassicae (Lepidoptera). Los alcaloides han sido de gran utilidad en la industria agroquímica ya que el alcaloide fisostigmina, proveniente de la planta Physostigma venenosum fue sintetizado a mediados del siglo pasado para desarrollar todo el grupo de insecticidas químicos conocidos como carbamatos (Morón, 1985). Por otro lado el alcaloide ricinina,contenido en R. communis, no reporta plagas en México (Reyes, 1991), convirtiéndolo en un metabolito secundario con amplias posibilidades de ser empleado como insecticida vegetal. I.6 RICININA. La ricinina es un alcaloide del grupo de los piridínicos y piperidínicos, ya que es un sistema heterocíclico compuesto con un átomo de nitrógeno en un anillo de seis miembros característico de este grupo, en el cual el par de electrones del nitrógeno no puede ser protonado debido a que en su estructura hay grupos que atraen electrones, por lo que el par de 9 electrones del nitrógeno se deslocaliza, debido a esto presenta una reacción neutra a los indicadores (Valencia, 1995). Este alcaloide se encuentra presente en todas las partes jóvenes de la planta de Ricinus communis L. (Waller, 1961), así como en hojas y semillas (Reyes, 1991); su estructura es: N-metil-3-ciano-4-metoxi-2-piridona (Waller, 1961), de peso molecular 164.17 (Harbone, 1995) con punto de ebullición 200-201°C, soluble en agua, metanol, etanol, cloroformo y éter (Merck Index, 1976; Reyes, 1991), además es considerada como tóxica (Ki, 2001; Reyes, 1991). FIGURA 1. Estructura química de la ricinina (Skursky, 1969; Reyes, 1991). Sobre la utilidad que tiene la ricinina en la planta de Ricinus communis hay poca investigación, sin embargo Olaifa et al. (1991) demostraron que tiene efecto letal contra Myzus persicae. El trabajo consistió en montar un experimento donde se obtuvieron bajo condiciones controladas especies vegetales de Ricinus communis y de Phaseolus vulgaris de 10 a 14 semanas de edad, en las cuales se colocaron 360 ejemplares de M. persicae en el envés de las hojas. A las 8 h ya había muerto el 100% de los pulgones que se alimentaron de las hojas de R. communis, mientras que los que se alimentaron de P. vulgaris seguían vivos. Los pulgones alimentados con R. communis presentaron el alcaloide ricinina. Este trabajo sugirió la actividad letal de la ricinina contra M. persicae, así como la acción defensiva del alcaloide en la planta de Ricinus communis. OCH3 CN O N CH3 10 I.7 LA HIGUERILLA Ricinus communis. Ricinus communis, conocida como higuerilla, es originaria de África (Cuadra, 1981; Niembro, 1986). Su raíz es pivotante y constituye el anclaje principal de la planta, tiene númerosas raíces secundarias y oblicuas, situadas a poca profundidad (Cuadra, 1981). Pascual-Villalobos (1995) describe su morfología según se expone a continuación. El tallo principal es recto seccionado por entrenudos, hueco en su parte interior, su color depende de la variedad y puede ser verde, rosado o caoba; a partir del cuarto nudo aparecen las ramas secundarias que producen, a su vez ramas adicionales observándose en ambas producción de racimos, las hojas son alternas, pecioladas, palmeadas con siete a once lóbulos, dentadas, con nervación palmatinervia, pecíolos redondos; con dos glándulas nectaríferas en la unión con la lámina, dos glándulas en la unión con el pecíolo, sus flores están agrupadas en una panícula terminal de 10 a 40 cm de largo, la cual es monoica, las flores femeninas están localizadas en la parte superior y las masculinas en la inferior de la inflorescencia. El fruto es una cápsula trilocular con tres semillas (cada una de las cuales puede alcanzar hasta 1 cm de longitud), lisas y con estrías oscuras (Cuadra, 1981). La higuerilla contiene en las hojas dos alcaloides: la ricinina (0.55%) y la N-demetilricinina (0.016%), siendo este último un metabolito exogénico de la ricinina; seis flavonoides glucósidos: el kaemferol-3-0-β-D- xylopiranósido, el kaemferol-3-0-β-D-glucopiranósido, el kaemferol-3-0-β- rutinosido, la quercetina-3-0-β-D-xilopiranósido, la quercetina-3-0-β-D- glucopiranósido y la quercetina-3-0-β-rutinósido (Kang, 1985; Reyes, 1991). Las semillas, por su parte, contienen del 64 al 71% de aceite de ricino (que está constituido en su mayor parte por ésteres del glicerol y 11 trilglicéridos del ácido ricinoléico) y el remanente está compuesto de monoglicéridos, esterol, fosfolípidos, ácidos grasos libres, hidrocarburos y ceras (Reyes, 1991); almidón, albumina, fibra leñosa y agua (Ponce, 1984); así como la proteína ricina y el alcaloide ricinina (Reyes, 1991; Rodríguez, 2000). El contenido de la proteína en las semillas es de 18 a 26% y de ricinina de 87 a150 mg por 100 g (Reyes, 1991). En R. communis no se han reportado daños ocasionados por plagas y enfermedades (Reyes, 1991; Pascual-Villalobos, 1995). I.8 LA MOSQUITA BLANCA Trialeurodes vaporariorum. La especie, Trialeurodes vaporariorum Westwood (Homoptera: Aleyrodidae), conocida como mosquita blanca de los invernaderos (Ortega, 1998), es de origen americano, pero actualmente presenta una distribución cosmopolita como plaga en especies vegetales cultivadas en invernaderos (Mound, 1983). El género Trialeurodes, presenta los siguientes rasgos: El estuche pupal es de forma alargada a casi circular; el cuerpo generalmente está endurecido por una cresta longitudinal que tiene el margen entero o dentado presenta pliegues torácicos y caudales, las pupas poseen un borde que se eleva verticalmente de modo muy conspicuo; las pupas son de colores translúcidos a blanquecinos, sin patrones de coloración notables (Neal, 1994), por su parte, T. vaporariorum, tiene cuatro tipos de lípidos cuticulares: parafinas, alcoholes, aldehídos y acetatos, con preponderancia de los alcoholes (Neal, 1994). En condiciones de laboratorio a 24 ± 2 °C la duración de cada etapa de desarrollo de T. vaporariorum, para huevo, ninfas y pseudopupa, es de 6, 7 y 4 días respectivamente, en tanto que a 20.8°C la duración de cada una de ellas es de 8, 13 y 17 días (Ortiz, 1989). 12 Trialeurodes vaporariorum es tanto poliándrica como poligínica (Byrne, 1991), la raza “inglesa” es partenogenética y la “americana” es bisexual; los machos tienen un número cromosómico haploide de 11 y las hembras uno diploide de 22 (Bink-Moenen, 1990; Byrne, 1991). La fecundidad de las hembras a 18 °C es de 319.5 huevos, a 33 °C es de 5.5 y a 9 °C es de cero huevos (Byrne, 1991). Esta especie es polífaga, ya que sus hospederas pertenecen aproximadamente a 400 especies y a 82 familias (Mound, 1983), se considera como transmisora de varias enfermedades, como el virus del amarillamiento (Van Dorst, 1983) y el virus del “chino del jitomate” (Velásquez, 1989). Este insecto se ha convertido en una amenaza para la agricultura en México, ya que actualmente en ciertos casos ha ocasionado la pérdida total del cultivo afectado (Ortega, 1990). La presencia de la mosquita blanca como plaga primaria frecuentemente se asocia con el desarrollo de razas resistentes y con el uso indiscriminado de insecticidas, principalmente de aquellos cuyas concentraciones subletales provocan que la plaga incremente su tasa de reproducción (Elhag, 1984). Tiene la capacidad de tolerar la actividad de cualquier producto químico hasta ahora utilizado para su control (Wardlow, 1972, 1976, 1984; Ortega, 1990; Ortega, 1998; Omer, 1992). Sin embargo, se han buscado alternativas para el control de la mosquita blanca, entre los que se encuentran los extractos acuosos de diferentes partes de la planta de Ricinus communis (Herrera, 1997; Rodríguez, 2000), extractos de neem, Azadirachta indica (Ascher, 1993) y extractos de Nicotiana gossei (Liu, 1995). 13 I.9 JUSTIFICACIÓN. Es el uso de insecticidas químicos el principal método de combate empleado para reducir los daños ocasionados a los cultivos afectados por la mosquita blanca de los invernaderos Trialeurodes vaporariorum Westwood (Ortega, 1998), sin embargo su mal uso ha ocasionado graves problemas de contaminación, desarrollo de resistencia e incremento de los costos de producción entre otros (Ortega, 1990; Ortega,1998; Sanderson, 1992). Esta situación obliga a buscar alternativas con posibilidades reales de desarrollo que eviten el deterioro ecológico y que resulten efectivas para proteger a los cultivos agrícolas de las plagas de insectos (López, 1994; Rodríguez, 2000). Existe gran interés en investigar las respuestas que tienen las especies vegetales en la producción de metabolitos secundarios útiles para su defensa frente a la herbivoría (Harbone, 1985). Una respuesta es la variación en la producción de metabolitos secundarios como flavonoides, alcaloides, y terpenos, algunos metabolitos reducen la apetecibilidad de la especie vegetal para el herbívoro (Serratos, 1987), otros son tóxicos (Tipping, 1987). Considerando a los alcaloides como sustancias útiles en la defensa de las especies vegetales contra insectos herbívoros que ocasionan daños en las diferentes etapas de crecimiento y desarrollo de las especies vegetales (Levinson, 1976; Robinson, 1979; Valencia 1995). En este trabajo se evaluaron, el efecto repelente, mediante un una prueba de concentración de repelencia media (CR50); así como el efecto letal, con una prueba de concentración letal media (CR50), del alcaloide ricinina y de los extractos acuosos hechos en frío y en caliente de la semilla de Ricinus communis frente a la mosquita blanca Trialeurodes vaporariorum. Se ha demostrado la translocación de la ricinina desde las hojas seniles, hacia las hojas jóvenes del mismo individuo de R. communis (Skurky, 1969), por lo que se determinó la translocación que presentó la 14 ricinina en individuos de frijol variedad canario 107, desde su sistema radicular, hacia tallos y hojas. I.10 OBJETIVOS. El objetivo general de este trabajo es determinar el efecto biológico de los extractos acuosos de la semilla de higuerilla Ricinus communis (Euphorbiaceae) y del alcaloide ricinina sobre la mosquita blanca Trialeurodes vaporariorum (Homoptera: Aleyrodidae). Los objetivos específicos derivados del anterior son los siguientes: 1. Determinar el material vegetal óptimo de R. communis para llevar a cabo las extracciones de la ricinina. 2. Determinar la concentración de repelencia media (CR50) que tienen los extractos acuosos en caliente y frío de R. communis y del alcaloide ricinina sobre T. vaporariorum. 3. Determinar la concentración letal media (CL50) que tienen los extractos acuosos en caliente y frío de R. communis y del alcaloide ricinina sobre T. vaporariorum. 4. Determinar si la ricinina tiene la capacidad de translocarse dentro de la planta de frijol Phaseolus vulgaris (Fabaceae), desde su sistema radicular, hacia sus tallos y hojas. 15 I. 11 HIPÓTESIS. Partiendo de que los alcaloides juegan un rol significativo como mecanismos defensivos en las especies vegetales contra los insectos plaga, y que la ricinina presenta efecto letal contra Myzus persicae (Homoptera: aphididae), y de que los extractos acuosos de Ricinus communis han presentado efecto letal contra Trialeurodes vaporariorum (Homoptera: Aleyrodidae). Entonces la ricinina tendrá efecto letal y efecto repelente contra la mosquita blanca de los invernaderos T. vaporariorum; así mismo, por ser el alcaloide presente en las semillas de R. communis. Existe literatura acerca de la translocación de la ricinina de las hojas seniles, hacia las hojas jóvenes del mismo individuo vegetal, así como de su alta solubilidad, en agua, y de que las plantas transportan sus nutrientes desde el sistema radicular hacia sus otros órganos, lo cual puede hacer que la ricinina pueda trastocarse desde el sistema radicular de las plantas de frijol Phaseolus vulgaris, variedad canario 107, hacia sus tallos y hojas. 16 II. MATERIALES Y METODOS II.1 OBTENCIÓN DEL ALCALOIDE RICININA. En la fábrica de la ciudad de Ocotlán, Oaxaca que se dedica a la extracción del aceite de las semillas de Ricinus communis queda como subproducto un bagazo que aún contiene residuos de aceite. Para realizar este estudio se adquirió (10 Kg) de bagazo y (10 Kg) de semilla, en este lugar. Se realizó una extracción continua en un soxhlet del bagazo y de la semilla, trabajándose en porciones de 250 g de cada uno. Lo primero que se realizó, fue una extracción con hexano, en porciones de 8 h diarias por tres días, hasta completar 24 h; posteriormente se realizó una extracción con etanol, de la misma manera que con el hexano. El extracto etanólico, fue evaporado al vacío con ayuda de un rotovapor y se obtuvo un extracto color rojizo (25 ml), el cual se dejó reposar por 2 semanas a temperatura ambiente, tiempo en que se tardaron en formar unos cristales de color rojizo. Estos cristales tuvieron un punto de fusión (p. f.) de 199-200 °C con un Rf de 0.35, en una placa desarrollada en un sistema de disolvente con metanol. La ricinina obtenida fue identificada por el p. f. y por una cromatoplaca de silicagel Merck 60 F de 2 mm de espesor, con un testigo de ricinina pura proporcionado por el Dr. Manuel Jiménez del Instituto de Química de la UNAM. II.2 EXTRACTOS ACUOSOS DE SEMILLA DE Ricinus communis. Para la obtención del extracto acuoso en frío se colocaron 50 g de semilla de R. communis en 500 ml de agua destilada y se trituraron 60 segundos en una licuadora, luego se paso a un vaso de precipitados de 250 17 ml, se dejo reposar el material durante 24 h, después de las cuales se coló con una tela de organdí con abertura de 300 micras. En el caso del extracto acuoso de semillas de R. communis, hecho en caliente, se siguió el mismo método, que se empleó para realizar el extracto acuoso hecho en frío, la excepción fue que el material triturado se puso a hervir durante 30 min., con ayuda de un mechero, transcurrido ese tiempo se retiró el material del fuego y se dejó reposar por 24 h, después de las cuales se coló. Por último, se preparó una cromatoplaca de silicagel Merck 60 F de 2 mm de espesor con los extractos de semilla de R. communis hechos en frío y en caliente para observar la presencia del alcaloide ricinina en los extractos. II.3 ENSAYO BIOLÓGICO. II.3.1 CRIA DE MOSQUITA BLANCA. La cría de Trialeurodes vaporariorum se realizó en el invernadero del área de Toxicología del Instituto de Fitosanidad del Colegio de Postgraduados. Primero se introdujeron 1000 adultos de T. vaporariorum en jaulas entomológicas de 80 x 80 x 40 cm3 cubiertas con tela de organdí blanca y con una abertura del tejido de 300 micras. En su interior se colocaron seis plantas de frijol (Phaseolus vulgaris) variedad canario 107, que sirvieron como hospederas para la oviposición (Fig. 2). Los adultos se mantuvieron sobre las plantas durante una semana después de la cual se retiraron con un aspirador bucal. Las plantas infestadas se movieron a otra jaula para esperar la emergencia de adultos de la primera generación, con los cuales se efectuaron los bioensayos. La colonia se mantuvo en condiciones de invernadero a una temperatura de 20 ± 5 °C y fotoperíodo de 12 h. 18 Figura 2. FIGURA 2. Jaula entomológica, elaborada de tela de organdí, en su interior se colocaron adultos de T. vaporariorum, con los que se realizaron los experimentos. II.3.2 EXPERIMENTO DE CONCENTRACIÓN DE REPELENCIA MEDIA (CR50). El experimento de concentración de repelencia media (CR50), con el cuál se determinó la acción repelente de la ricinina y de los extractos acuosos de semilla de R. communis, se llevó a cabo en el invernadero del área de Toxicología del Instituto de Fitosanidad del Colegio de Postgraduados, de enero a abril de 2002. Los tratamientos fueron: 1) extracto acuoso frío de semilla de R. communis, 2) extracto acuoso caliente de semilla de R. communis, 3) solución con ricinina y 4) agua. En el experimento se utilizó el método del cilindro empleado por Muigai(2002), empleando cilindros transparentes de acrílico de 15 cm de altura por 12.5 cm de diámetro y tapados en uno de sus extremos con acrílico transparente en la parte superior del cilindro se realizó un orificio circular de 3 cm de diámetro en su parte media y otro, también circular de 5 mm de diámetro en un costado (Fig. 3) tapado con un tapón de corcho a través del cual se introdujeron 20 adultos de mosquita blanca. El fondo de cada 80 cm 80 cm 40 cm/- / 19 contenedor se cubrió con tela de organdí con una abertura de 300 micras, sostenida con una liga del número 12. Figura 3. Modelo con el cual se elaboró la prueba de acción repelente, la parte inferior se cubrió de tela de organdí y sostenida con una liga. Se diseñó un dispositivo para colocar discos de frijol P. vulgaris variedad canario 107, embebidos en los diferentes tratamientos, empleando tapas de cajitas plásticas de película fotográfica color blanco de 35 mm. En la zona onda de la parte media de la tapa de plástico se utilizó para colocar una bolita de algodón humedecido con agua destilada y sobre la bolita de algodón se colocó un disco de papel filtro (Whatman Grade 40) de 2.5 cm de diámetro (Fig. 4). Figura 4. Tapa de plástico de película fotográfica, en la parte superior, se hace un hueco (señalada), se colocó una bolita de algodón humedecida, posteriormente se cubrió con un circulo de papel filtro y con un círculo de hoja, previamente tratada; sobre el círculo de hoja se puso un pedacito de tela de organdí de 3 mm de abertura (A) y se sostuvo con un anillo cortado del tubo de la película (B). 12.5 cm 15 cm Diámetro 5 mm Diámetro 3 cm A B - ------+-- . ----l~ [l 20 Se cortaron discos de hoja de 2.5 cm de diámetro, de foliolos de seis a siete semanas de edad de plantas de P. vulgaris variedad canario 107. Los discos se sumergieron completamente en forma individual en cada una de los tratamientos, con las siguientes concentraciones logarítmicas: 0.00001, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1.0 y 10.0 % para determinar los límites de respuesta de repelencia (ventana de respuesta biológica). Luego se intercalaron dosis logarítmicas entre estos límites, para efectuar el bioensayo completo. Para el experimento final se manejaron ocho concentraciones las cuales fueron: agua, 0.1, 1, 1.5, 2.5, 4, 6, 8 y 10%. Cada tratamiento contó con cuatro repeticiones. Una vez que se determinaron las concentraciones que se emplearon en todos los tratamientos, se volvieron a cortar discos de hoja de 2.5 cm y se sumergieron en las nuevas concentraciones, a cada solución con su respectiva concentración se le adicionó el adherente agrícola comercial Inex1® al 1%. Se realizaron dos inmersiones del disco de la hoja durante 5 s, con el fin de asegurar una cobertura total del producto sobre el disco de la hoja, los discos se dejaron secar durante 20 min, secos se colocaron sobre el dispositivo con el haz de la hoja adyacente al papel filtro. Después cada disco se cubrió con una malla con abertura de 4 mm, la cual se sostuvo con un corte en forma de anillo de la cajita de la película. La tapa con su disco de hoja se insertó en el orificio de 3 cm, realizado al centro del cilindro. Para la colecta de los adultos de mosquita blanca se empleó un aspirador bucal, construido con manguera de latéx y con una pipeta Pasteur de vidrio de 7 mm de diámetro y tela de organdí de 300 micras de abertura, para cubrir su parte superior. Los adultos se les dejaron ayunar por un periodo de 2 h, posteriormente se introdujeron en el cilindro por el orificio lateral. 1 Coadyuvante agrícola. Reduce la tensión superficial de los líquidos, permitiendo mezclas mas homogéneas, mejora la cobertura de la aspersión aumentando la penetración de los insecticidas, fungicidas, herbicidas, desecantes y fertilizantes, tanto en el tanque de mezcla como en la aspersión y sobre el follaje de la planta (PLM agrícola, 2004). 21 Los cilindros se colocaron con el dispositivo de la hoja hacia arriba, sobre una mesa con luz artificial blanca con el fin de estimular la atracción de las mosquitas blancas hacia la parte superior del cilindro que es donde se encontraba el círculo de hoja con el tratamiento correspondiente. El registro de la repelencia se realizó cada hora durante 7 h continuas y una última observación se llevó a cabo a las 24 h de haberse iniciado el experimento, para lo cual se contaron los insectos posados sobre los discos de hoja. Los valores de la CR50 se expresaron en mg/ml de producto. Los datos del bioensayo se analizaron con dos análisis estadísticos: 1) un análisis de covarianza (ANCOVA) para conocer las diferencias significativas entre las concentraciones de una misma sustancia y las diferencias significativas entre las tres sustancias, así mismo a los resultados del ANCOVA se les aplicó la prueba de Tukey para conocer entre que resultados hubo diferencias significativas, y 2) mediante un análisis de predicción inversa, para conocer las concentraciones de repelencia y letal media (CR50), con la ayuda del paquete estadístico Systat 2000. La ecuación empleada fue la siguiente (Zar, 1999): Donde: Ў = es el valor de la concentración estimada de la sustancia necesaria para repeler al 50% de los organismos. β = es el número promedio de organismos repelidos. a = es la ordenada al origen del modelo de regresión que relaciona el número de organismos muertos y/o repelidos y la concentración de la sustancia, y b = es la pendiente de la regresión que relaciona el número de organismos muertos y/o repelidos y la concentración de la sustancia. β - a Ў = b 22 II.3.3 EXPERIMENTO DE CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA (CL50). Este experimento, se determinó la acción tóxica de la ricinina y de los extractos acuosos de semilla de R. communis, se llevó a cabo de junio a julio de 2002. Los tratamientos fueron: 1) extracto acuoso frío de semilla de R. communis, 2) extracto acuoso caliente de semilla de R. communis, 3) solución con ricinina y 4) agua, con cuatro réplicas por tratamiento. Para determinar las concentraciones finales de este experimento, también se realizó una ventana de respuesta biológica, a concentraciones logarítmicas similares a las empleadas en el experimento de concentración de repelencia media, quedando finalmente ocho concentraciones, las cuales fueron: agua, 0.001, 0.01, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 y 5.0%. Se colectaron 20 adultos de T. vaporariorum con un aspirador bucal el cual se hizo igual que en el experimento de acción repelente, las pipetas se colocaron en un refrigerador a –5° C durante 15 min con el fin de inmovilizar a las mosquitas blancas se trabajó en una cámara climática a una temperatura de 5° C para que las mosquitas blancas permanezcan inmóviles durante su manipulación. Se transfirieron las mosquitas blancas a un círculo de 4 cm de diámetro hecho de papel cartulina color negro, el cual se colocó dentro de una caja Petri de 4 cm de diámetro, se asperjó 1 ml de cada solución con un atomizador manual con capacidad de 9 ml. Posteriormente se taparon las cajas petri y se colocan en el interior de una cámara bioclimática a 20 ° C ± 3 °C con una humedad relativa de 75% . El registro de la mortalidad se realizó a las 2 h, después de las cuales se contabilizaron el número de individuos muertos, tomando como muerto todo adulto que estaba inmóvil y que al tocarlo con un pincel no presentó movilidad. Los valores de la CL50 se expresaron en mg/ml de producto. Los datos del bioensayo se analizaron mediante los análisis de covarianza y de predicción inversa igual que en el experimento de repelencia. 23 II.3.4 PRUEBA DE TRANSLOCACIÓN DE LA RICININA. Una vez que probamos el efecto biológico de la ricinina, así como de los extractos acuosos hechosen frío y en caliente de semillas de R. communis, y con el fin de determinar si es posible la translocación de la ricinina en Phaseolus vulgaris variedad canario 107, para probar esto, se ejecutó una prueba durante los meses de agosto y septiembre de 2002, empleando ocho tratamientos o concentraciones de ricinina, los cuales fueron: 1.0, 0.75, 0.50, 0.25, 0.1, 0.01, 0.001 y 0.0001%. Las disoluciones para cada tratamiento se hicieron con agua destilada y los tratamientos contaron con cuatro repeticiones cada uno. En una cámara bioclimática se puso a germinar semillas de frijol P. vulgaris variedad canario 107 en una charola de germinación de unicel con agrolita a 25 °C ± 5 ° C, con humedad relativa de 75%, y fotoperiodo de 15/9 horas luz/obscuridad. Las individuos, germinaron a los cuatro días, y a los 10 días, cuando las plantas presentaron dos hojas verdaderas, se les limpio de la agrolita que las raíces tenían. Después a cada tubo de ensaye se le vertieron 20 ml de disolución con su respectiva concentración, una vez vertido cada tratamiento, se colocó un individuo de P. vulgaris a cada tubo. Los tubos se distribuyeron de manera aleatoria en una gradilla para tubos de ensaye, la cual se colocó nuevamente en la cámara bioclimática en las condiciones previamente descritas por 24 h. Una vez transcurrido el tiempo, se retiraron los individuos, de los tubos y se seccionaron las raíces, los tallos y las hojas, para realizar un macerado con metanol en un mortero de porcelana. Finalmente, se realizó una cromatoplaca de silicagel Merck 60 F de 2 mm de espesor con estándar de ricinina, para detectar la presencia del alcaloide en cada uno de los órganos seccionados. 24 III. RESULTADOS. III.1 CONCENTRACIÓN Y PRESENCIA DE LA RICININA. El rendimiento que obtuvimos de la ricinina de la extracción realizada en semillas de R. communis fue de 385.6 mg/kg; mientras que para la extracción hecha al bagazo de la misma semilla se obtuvo 477.2 mg/kg. Al realizar la placa de cromatografía, se corroboró que la sustancia extraída fue el alcaloide ricinina (Fig. 5A). En los extractos acuoso hechos en frío y en caliente a semillas de la misma especie, que fueron empleados para los experimentos de concentración de repelencia media (CR50) y de concentración letal media (CL50) también hubo presencia de ricinina, este dato se corroboró con una cromatoplaca de silicagel (Fig. 5B). A B FIGURA 5(A). Cromatografía en placa de silicagel, en donde: 1 extracción hecha a la semilla; 2. extracción hecha al bagazo, y 3. Estándar de ricinina, y la 5(B). donde: 1. extracto acuoso hecho en caliente de la semilla de R. communis; 2. extracto acuoso hecho en frío de semilla de R. communis, y 3. Estándar de ricinina. 1 2 3 1 2 3 25 III.2 EXPERIMENTO DE CONCENTRACIÓN DE REPELENCIA MEDIA (CR50). Tabla 1. Análisis de covarianza para determinar el efecto de la concentración, el tratamiento y el tiempo sobre el porcentaje de organismos posados de T. vaporariorum sobre discos de frijol embebidos en tres diferentes tratamientos. Fuente S.C. g.l. C.M. F P Concentración (c) Tiempo (t) Tratamiento (tr) tr×t c×tr c×t Error 1438.9 21090.2 3505.7 1451.6 102.6 217.4 4027.8 8 7 2 14 16 56 760 179.9 3012.9 1752.8 103.7 6.4 3.9 5.3 33.9 568.5 330.7 19.6 1.2 0.7 < 0.001 < 0.001 < 0.001 < 0.001 0.254 0.928 Se encontró un efecto significativo de la concentración, el tiempo y el tratamiento, así como de la interacción tratamiento × tiempo sobre el porcentaje de organismos posados de T. vaporariorum en los discos de frijol embebidos, pero no de las interacciones concentración × tratamiento y concentración × tiempo (Tabla 1). Se observa en todos los tratamientos que conforme aumenta la concentración, disminuye el porcentaje de organismos posados (Figs. 6, 7 y 8). Asimismo el porcentaje de organismos posados se incrementa con el tiempo (Figs. 6, 7 y 8). Por otro lado el efecto de la ricinina fue significativamente más potente en su efecto de repelencia que el extracto hecho en frío y realizado en caliente (Fig. 9). Mientras que el extracto caliente tuvo un efecto significativo más alto de repelencia que el extracto frío (Fig. 9). 26 El comportamiento que se observó durante el desarrollo del experimento de CR50 con el extracto acuoso hecho en frío de la semilla de R. communis, fue el siguiente, a mayor concentración del extracto, menor fue el porcentaje de organismos posados en los discos de frijol, variedad canario 102, y a mayor tiempo transcurrido mayor fue el porcentaje de individuos posados en los discos (Fig. 6). Esto nos indicó que el efecto de repelencia se fue perdiendo conforme el tiempo transcurría. 0 20 40 60 80 100 120 H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H24 Tiempo (h) % d e or ga ni sm os p os ad os 100 80 60 40 25 15 10 1 Testigo FIGURA 6. Promedio de organismos de T. vaporariorum posados en discos de frijol embebidos con soluciones que tenían, distintas concentraciones del extracto acuoso en frío de la semilla de R. communis. concentración en mg/ml Agua -- -)i(- ___ __ -+- 27 Durante el desarrollo del experimento de CR50 con el extracto acuoso hecho en caliente de la semilla de R. communis, muestra que a mayor concentración del extracto, menor porcentaje de organismos posados en los discos de frijol, variedad canario 102, y a mayor tiempo transcurrido mayor porcentaje de individuos posados en los discos (Fig.7). 0 20 40 60 80 100 120 H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H24 Tiempo (h) % d e or ga ni sm os p os ad os 100 80 60 40 25 15 10 1 Testigo FIGURA 7 Promedio de organismos de T. vaporariorum posados en discos de frijol embebidos en una solución con distintas concentraciones del extracto acuoso en caliente de la semilla de R. communis. concentración en mg/ml Agua 1-- -l!(- -lIE- __ -+- -- ~ 28 Finalmente, en el desarrollo del experimento de CR50 con la ricinina, también se observó que a mayor concentración del alcaloide, menor fue el porcentaje de organismos posados en discos de frijol, variedad canario 102, y a mayor tiempo transcurrido mayor fue el porcentaje de individuos posados en los discos (Fig. 8); observándose como el efecto de repelencia se fue mermando conforme el tiempo transcurría. 0 20 40 60 80 100 120 H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H24 Tiempo (h) % d e or ga ni sm os p os ad os 100 80 60 40 25 15 10 1 Testigo FIGURA 8 Promedio de organismos de T. vaporariorum posados en discos de frijol embebidos en una solución con distintas concentraciones del alcaloide ricinina. concentración en mg/ml Agua -lc(- -+- 29 Se realizó la comparación del promedio de individuos posados en discos de frijol, variedad canario 102, de los diferentes tratamientos, tomando en consideración todas las concentraciones con que contó cada uno de ellos, también se les realizó un análisis de covarianza para determinar si hubo diferencias significativas entre los tratamientos, y al resultado obtenido se le aplicó una prueba de Tukey para observar entre cuales variables hubo diferencias significativas (Fig. 9). FIGURA 9. Porcentaje de organismos de T. vaporariorum posados en discos de frijol embebidos en tres tratamientos a diferentes concentraciones. Letras diferentes denotan diferencias significativas entre tratamientos (prueba de Tukey; P<0.05). c b a 6 8 10 12 14 16 18 0 1 10 15 25 40 60 80 100 Concentraciones mg/ml % d e po sa do s Extr. Frío Extr. Caliente Ricinina b c a Agua I-+- -- 30 TABLA 2. Análisis de predicción inversa para determinar la concentración de repelencia media CR50 sobre T. vaporariorum de los diferentes tratamientos,empleadas en el experimento. Tratamiento b s(b) CME YPROM K(10)-5 CR50 Extracto frío 0.033 0.009 3.046 2.639 67.51 256.1mg/ml Extracto caliente 0.045 0.013 6.656 4.5 109.89 158.5mg/ml Ricinina 0.073 0.018 13.89 7.75 355.51 67.5mg/ml X2 =90204 (promedio de todas las concentraciones y todos los tratamientos empleadas al cuadrado) F = 5.57 (valor de la “F” en tablas que corresponde a : Fα1, n-2 GL) Yi = 10 (valor del número de repelidos deseado 50%) b = Pendiente de la regresión que relaciona el número de organismos repelidos y la concentración del tratamiento empleado (aumenta en el N° de organismos repelidos por cada incremento en la concentración en una unidad) s(b) = Error estándar de la pendiente (mide la precisión del estimador de la pendiente) CME = Cuadrado medio del error N = 36 (número total de pares de datos de X y Y usados en la regresión (X = concentración y Y = número de repelidos con esa concentración) YPROM = promedio del número de organismos repelidos con esa concentración. K = b2 – F (s(b))2 b2 Cuadrado de la pendiente de la regresión que relaciona el número de organismos repelidos y la concentración del tratamiento. (s(b))2 = Es el aumento en el número de individuos repelidos por cada unidad que aumenta la concentración. F = Valor de la “F” en tablas que corresponde a : Fα-1, n-2 GL. Según el modelo matemático propuesto para determinar la CR50, obtuvimos la cantidad necesaria para cada tratamiento empleado necesaria para repeler al 50% de una población de T. vaporariorum. Se decidió tomar la cuarta hora como la más representativa del efecto repelente, debido a que en esa hora se posaron más del 90% de la población de mosquita blanca en el tratamiento con agua. β - a Ў = b 31 III.3 EXPERIMENTO DE CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA (CL50). Tabla 3. Análisis de covarianza para determinar el efecto de la concentración y del tratamiento sobre el porcentaje de organismos muertos de T. vaporariorum en cajas Petri con tres diferentes tratamientos. Fuente S.C. g.l. C.M. F P Concentración (c) Tratamiento (tr) c×tr Error 799.9 56.2 0.9 406.8 8 2 2 102 799.9 28.1 0.4 4.0 200.6 7.1 0.1 < 0.001 0.001 0.897 Se encontró un efecto significativo de la concentración y el tratamiento sobre el porcentaje de organismos muertos de T. vaporariorum en cajas Petri (Tabla 1). El efecto letal de los tratamientos varió en el siguiente orden ricinina > extracto caliente = extracto frío (Fig. 10). 32 Se realizó la comparación del promedio de individuos muertos en cajas de Petri, para cada tratamiento, tomando en consideración todas las concentraciones con que contó cada uno de ellos, también se les realizó un análisis de covarianza para determinar si hubo diferencias significativas entre las tratamientos, y al resultado obtenido se le aplicó una prueba de Tukey para observar entre cuales variables, hubo diferencias significativas (Fig. 11). FIGURA 10. Porcentaje de organismos de T. vaporariorum muertos en cajas Petri asperjados con tres tratamientos a diferentes concentraciones. Letras diferentes denotan diferencias significativas entre tratamientos (prueba de Tukey; P<0.05). 0 2 4 6 8 10 12 14 16 0 0,01 0,1 1 5 10 20 30 50 Concentraciones mg/ml % d e m ue rt os Extr. Frío Extr. Caliente Ricinina a b b Agua 1--- -+- 33 TABLA 4. Análisis de predicción inversa para determinar la concentración letal media CL50 sobre T. vaporariorum de los tratamientos empleadas en el experimento. Tratamiento b s(b) CME YPROM K CL50 Extracto Frío 0.144 0.025 4.991 6.964 0.019 41.6 mg/ml Extracto Caliente 0.159 0.018 2.739 6.893 0.024 36.1 mg/ml Ricinina 0.161 0.027 5.637 8.536 0.023 25.7 mg/ml X2 =90204 (promedio de todas las concentraciones y todos los tratamientos empleadas al cuadrado) F = 5.57 (valor de la “F” en tablas que corresponde a : Fα1, n-2 GL) Yi = 10 (valor del número de muertos deseado 50%) b = Pendiente de la regresión que relaciona el número de organismos muertos y la concentración del tratamiento empleado (aumenta en el N° de organismos muertos por cada incremento en la concentración en una unidad) s(b) = Error estándar de la pendiente (mide la precisión del estimador de la pendiente) CME = Cuadrado medio del error N = 36 (número total de pares de datos de X y Y usados en la regresión (X = concentración y Y = número de muertos con esa concentración) YPROM = promedio del número de organismos muertos con esa concentración. K = b2 – F (s(b))2 b2 Cuadrado de la pendiente de la regresión que relaciona el número de organismos muertos y la concentración del tratamiento. (s(b))2 = Es el aumento en el número de individuos muertos por cada unidad que aumenta la concentración. F = Valor de la “F” en tablas que corresponde a : Fα-1, n-2 GL. Según el modelo matemático propuesto para determinar la CR50, obtuvimos la cantidad de cada tratamiento empleado necesaria para matar al 50% de una población de T. vaporariorum. β - a Ў = b 34 III.4 PRUEBA DE TRANSLOCACIÓN DE LA RICININA. En el experimentó de translocación se observa la banda de detección de ricinina en la cromatoplaca de silicagel, realizada a las raíces, tallos y hojas de frijol, que previamente se sometieron a diferentes concentraciones de ricinina; donde solamente se detectó la presencia del alcaloide en concentraciones mayores a 0.1% en la raíces, hojas y tallos de frijol después de macerarlas. FIGURA 11. Esta figura muestra, las tres diferentes placas de silicagel, que se les realizaron a las raíces, tallos y hojas de frijol, tratadas con ricinina, claramente es observable que la ricinina se movió hasta las hojas. Cromatoplaca de la raíz 1. 0% 0. 75 % 0. 50 % 0. 25 % 0. 1% 0. 01 % 0. 00 1% 0. 00 01 % Ri ci ni na Cromatoplaca de las hojas Cromatoplaca de los tallos 1. 0% 0. 75 % 0. 50 % 0. 25 % 0. 1% 0. 01 % 0. 00 1% 0. 00 01 % Ri ci ni na 1. 0% 0. 75 % 0. 50 % 0. 25 % 0. 1% 0. 01 % 0. 00 1% 0. 00 01 % Ri ci ni na 35 IV. DISCUSIÓN IV.1 RENDIMIENTO DE RICININA. El considerar semillas y bagazo de semillas de Ricinus communis para realizar las extracciones de la ricinina, tuvo como finalidad la de determinar con que material se obtendría mayor rendimiento, y trabajar con ella para la obtención de la ricinina necesaria de todos los experimentos. De nuestros resultados, para el rendimiento de ricinina en bagazo y semillas de R. communis, obtuvimos mayor rendimiento en el bagazo con 477.2 mg/kg, que con la semilla 385.6 mg/kg, esto se debió a que la semilla cuenta con un porcentaje muy elevado de aceite de ricino y en este aceite no se encuentra la ricinina (Reyes, 1991), la cual si esta presente en las testas de la semilla (Reyes, 1991; Rodríguez, 2000) y cuando trabajamos a la semilla completa, estuvimos trabajando con menor cantidad de testas de la misma; mientras que el bagazo de la semilla esta compuesto principalmente de testas de semilla trituradas y cuenta con poca cantidad de aceite (Reyes, 1991), por lo que al trabajar con este material, la concentración de la ricinina fue mayor, lo que facilitó la extracción de la ricinina necesaria para los experimentos con que contó este trabajo de investigación. El rendimiento de ricinina obtenido en este trabajo tuvo un valor de 477.2 mg/kg, mientras que Reyes (1991), quien trabajó con bagazo del mismo lugar; reportó un rendimiento de 594.07 mg/Kg. Esto pudo deberse a que en este primero se desengraso con hexano el bagazo y luego se realizo una extracción con etanol y de esta forma se obtuvo una ricinina con menos cantidad de impurezas ala cual se evito lavar con carbón activado; por su lado Reyes (1991), tuvo que lavar su ricinina con carbón activado para quitarle le exceso de impurezas. Se sabe que Ricinus communis es una planta tóxica para animales y que el alcaloide ricinina es uno de los compuestos que le confieren esta 36 propiedad tóxica (Waller, 1961, Olaifa, 1991), así mismo sabemos que esta planta no presenta plagas de insectos en México (Reyes, 1991). Por otra parte, aunque la información que existe para demostrar la función de la ricinina, como sustancia defensiva contra la herbivoría ocasionada por insectos es pobre. Este trabajo nos ayudó a despejar esta duda, ya que como se pudo ver (Figs. 9 y 10) la ricinina actúo como repelente y sirvió para matar, en ambos casos individuos adultos de Trialeurodes vaporariorum. Estas dos propiedades según Reese (1979), son propiedades alomónicas. Hubo presencia de ricinina en los extractos acuosos en frío y en caliente (Fig. 5B), realizados a la semilla de R. communis, confirmando la solubilidad en agua que tiene la ricinina, que Reyes (1991) ya había reportado. IV.2 CONCENTRACIÓN DE REPELENCIA MEDIA (CR50). Observamos como en la hora número 4 (Figs. 6, 7 y 8) en el tratamiento testigo, donde solo se aplicó agua, el 90 % de la población de T. vaporariorum ya se había posado en los discos de P. vulgaris, mientras que en concentraciones de 80 mg/ml o menores, para los extractos acuosos hechos en frío y en caliente alcanzó en mismo porcentaje hasta la hora número 6, esto se debió a que no tienen los individuos de T. vaporariorum otra opción para alimentarse que los discos de P. vulgaris embebidos en las diferentes concentraciones de esos dos tratamientos (Figs. 6y 7), mientras que para el tratamiento ricinina hasta la hora 7 hubo un resultado similar sin llegar a ser este del 90% (Fig. 8). Por otro lado, los tres tratamientos presentaron diferencias en cuanto a las concentraciones empleadas sobre adultos de T. vaporariorum (Figs. 6, 7 y 8), podemos explicar estas diferencias, diciendo que mientras hubo un incremento en las concentraciones el número de organismos posados de T. vaporariorum fue menor, pero cuando más tiempo transcurrió los individuos posados aumentaron, debido a que la ricinina va 37 perdiendo su actividad con el tiempo. Lo cual concuerda con el reporte de Waller (1969) quien reporta una vida media de inicial de la ricinina en la planta de R. communis de 4 h, pudiendo incrementarse hasta a 6.7 días. Con el ANCOVA realizado a las tres tratamientos empleadas en el experimento, observamos que la ricinina presentó diferencia significativa (P<0.001) respecto a los extractos acuosos hechos a la semilla de R. communis en caliente y en frío, ya que hubo menos organismos posados en discos de frijol de T. vaporariorum (Tabla 1 y Fig. 9), por otro lado el extracto acuoso hecho en caliente fue significativamente diferente al extracto acuoso hecho en frío (P<0.001), lo anterior es un resultado esperado ya que Levinson (1976), Robinson (1979) y Valencia (1995) refieren a los alcaloides como tratamientos repelentes de insectos. Los resultados del análisis de predicción inversa (Tabla 2), el cual nos permitió conocer las concentraciones de repelencia media (CR50) para las tres tratamientos empleadas, nos muestran que para la cuarta hora de observación la CR50 para la ricinina fue de 67.51 mg/ml, en el extracto acuoso hecho en caliente tuvo un valor de 158.54 mg/ml y el extracto acuoso hecho en frío fue de 256.11 mg/ml; siendo el alcaloide ricinina solo sin la presencia de otros constituyentes químicos presentes en la semilla de R. communis la sustancia que presentó mejor desempeño, necesitando menor cantidad para alcanzar una concentración que fuera capaz de repeler al 50 % de una población de mosquita blanca de la especie T. vaporariorum, esto nos permite asumir que la ricinina es un aleloquímico presente en hojas y semillas de R. communis le confiere a esta planta una actividad repelente contra T. vaporariorum. 38 IV.3 CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA (CL50). Las tres tratamientos aplicadas presentaron diferencias en cuanto a las concentraciones empleadas, mientras hubo un incremento en las concentraciones de ricinina y de los dos extractos acuosos, el número de organismos muertos de T. vaporariorum fue mayor. Con el ANCOVA realizado a las tres tratamientos empleadas en el experimento, observamos que la ricinina presentó diferencia significativa (P<0.001) respecto a los extractos acuosos hechos a la semilla de R. communis en caliente y en frío, ya que hubo más individuos muertos de T. vaporariorum en las cajas de petri (Tabla 3 y Fig. 10), lo anterior es un resultado esperado ya que Levinson (1976), Robinson (1979) y Valencia (1995) atribuyen a los alcaloides como sustancias tóxicas que le sirven de protección a las plantas frente a herbívoros y sobre todo a Olaifa (1991) quien demostró el efecto letal de la ricinina en pulgones. Los resultados del análisis de predicción inversa (Tabla 4), el cual nos permitió conocer las concentraciones letales medias (CL50) para las tres tratamientos empleadas, nos muestran los valores para la CR50 que en la ricinina fue de 25.69 mg/ml, en el extracto acuoso hecho en caliente tuvo un valor de 36.06 mg/ml y el extracto acuoso hecho en frío fue de 41.63 mg/ml; siendo el alcaloide ricinina solo sin la presencia de otros constituyentes químicos presentes en la semilla de R. communis la sustancia que presentó mejor desempeño, necesitando menor cantidad para alcanzar una concentración capaz de matar al 50 % de una población de T. vaporariorum, esto nos permite asumir que la ricinina es un aleloquímico presente en hojas y semillas de R. communis le confiere a esta planta una actividad letal contra adultos de T. vaporariorum. Por otro lado se confirma la actividad biológica contra individuos adultos de T. vaporariorum que tienen los extractos acuosos, lo cual ya se había reportado por Herrera (1997) y Rodríguez (2000). 39 IV.4 MOVILIDAD DE LA RICININA Los resultados obtenidos de la prueba de la movilidad de la ricinina en plantas de frijol de la variedad canario 107 demostró que este alcaloide tiene la capacidad de moverse a través de la raíz por el tallo y las hojas de una planta de diferente familia a la que lo produce de forma natural, abriendo una nueva hipótesis sobre si la ricinina que se mueve en el frijol será capaz de proteger a esta planta también del ataque de T. vaporariorum de forma sistémica y de si la presencia del alcaloide no afectará al frijol. 39 V. CONCLUSIONES 1) El alcaloide ricinina es un metabolito secundario del grupo de las alomonas presente las semillas de R. communis el cual sirve como repelente frente a la mosquita blanca T. vaporariorum. 2) La ricinina también es una alomona presente en las semillas de R. communis que le sirve como sustancia tóxica letal sobre la mosquita blanca T. vaporariorum 3) La ricinina tiene una gran capacidad de movilidad en P. vulgaris pero aún hay que hacer más estudios para conocer si al moverse dentro de una planta distinta a R. communis sigue presentando sus características repelente y/o tóxica letal. 4) Los extractos acuosos en frío y en caliente de la semilla de R. communis presentaron actividad repelente (256.11 y 158.54 mg/ml respectivamente) y tóxica letal (41.63 y 36.06 mg/ml respectivamente) contra T. vaporariorum, así se puede emplear cualquiera de estos como alternativa de control de la mosquita blanca en P. vulgaris. 5) Se recomienda trabajar con bagazo de la semilla de Ricinus communis, para la obtención del alcaloide ricinina que con la semilla misma, debido a que obtuvimos 477.2 mg/kg de ricinina en bagazo, respecto a los 385.6 mg/kg en semilla. 41 LITERATURA CITADA. 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