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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA Adquisición de competencia para la micropropagación de Stanhopea tigrina, Laelia anceps, Epidendrum veroscriptum y Cattleya x esbetts (Orchidaceae). T E S I S P : M. en C. Amadeo Barba Álvarez. Que para obtener el título de: B I O L O G O R E S E N T A Mario Sinaí Tinoco Juárez Director de Tesis: Dr. Martín Mata Rosas Instituto de Ecología A. C. Asesor Interno: México, D.F. 2006 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. El presente trabajo de investigación se realizó en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales de la Unidad de Recursos Naturales del Instituto de Ecología, A.C., bajo la dirección del Dr. Martín Mata Rosas. DEDICATORIA A mis padres Alma y Francisco con mucho amor, siendo consciente del inmenso cariño, sacrificio y paciencia que tuvieron conmigo, agradeciéndoles el apoyo incondicional que me brindaron siempre. A mi hermano Carlos con mucho cariño, gracias por el apoyo y el ánimo que me brindaste, pero sobre todo, por ser mi hermano. Este trabajo es tuyo también. A mami Yoya (†), sé que estarás contenta allá donde te encuentras, estoy seguro que hubieras estado conmigo en este día de alegría. A mami Reyna, no tengo palabras para agradecerte el gran cariño que por mi has mostrado, tus oraciones y consejos no los olvidaré jamás A toda mi familia, tíos, primos, y sobrinos, por las porras que me echaron para que culminara este sueño que hoy se convierte en realidad AGRADECIMIENTOS A Dios por permitirme conocer la grandeza de su creación a través de la Biología, y estar conmigo siempre y en todo momento. A la Universidad Nacional Autónoma de México, por los conocimientos y experiencia adquiridos. Al Instituto de Ecología A. C. por abrirme las puertas para realizar servicio social y tesis en sus instalaciones. Al herbario de la Asociación Mexicana de Orquideología por haberme proporcionado información para la descripción de las especies. Al Dr. en C. Martín Mata Rosas por dirigir mi tesis, y no solo eso, gracias por tu amistad y por el apoyo que me brindaste para resolver muchas situaciones difíciles. Al M. en C. Amadeo Barba Álvarez por haberme apoyado como asesor interno de la Facultad para la realización de este trabajo. A los sinodales: Dra. Hortensia Rosas Acevedo, M. en C. Susana Luna Rosales, y Biol. Juan Romero Arredondo por las observaciones que permitieron pulir y mejorar esta tesis. A los maestros que han contribuido con sus conocimientos en mi desarrollo personal, escolar y profesional. A mis amigos de generación: Eloísa, Elvira, Selene, Alberto, Antelmo, Genaro, Israel y Leonardo por los momentos inolvidables que pasamos juntos durante toda la carrera, gracias chavos. A Karla, Rocío y Lucero, por la amistad que me han brindado y que hemos tenido durante varios años. A mis amistades y compañeros de la Facultad y del CELC: Betty, Edith, Edna Alicia, Itzia, Leticia, Laura, Marisela, Mary Chuy (†), Rosario, Soledad, Socorro, Camilo, Eduardo, Fausto, Fernando, Gustavo y Ulises, por enseñarme a luchar por nobles ideales y tenerle un gran amor a nuestra alma mater. A los cuates del Laboratorio de Cultivo de Tejidos: Ana, Claudia, Esmeralda, Haydée, Mónica, Rosario, Wendy Ariana, Yadi, José Antonio, José Juan, José Luis, Paco, Orlando y Víctor, por las peripecias y momentos felices que convivimos juntos. A mis amigos de Xalapa: Beler, Brenda, Lisseth, Kikita, Mónica, Yadira, Alejandro, David, Fernando, Hugo, Luis, Juan, Reegel, que han convivido conmigo una etapa nueva de mi vida. De la Nueva Evangelización: a la maestra Irma, a Alma, Ángeles, Blanca, Diana, Mary Anna, Yolanda, Surya, Teresa, Aarón, Ángel, Edgar, Juan Manuel, Miguel y Rafael por enseñarme a vivir con alegría en Dios, gracias por su amistad sincera, oraciones, confianza, cariño y apoyo. Y a quienes no se encuentran escritos aquí, pero que con una palabra de aliento, un consejo, un abrazo sincero, me animaron a seguir adelante, gracias también. ÍNDICE ABREVIATURAS I RESUMEN II 1. INTRODUCCIÓN 1 2. ANTECEDENTES 4 2.1. BIODIVERSIDAD EN MÉXICO 2.2. AMENAZAS A LA BIODIVERSIDAD 5 2.2.1. Problemática en México 6 2.2.2. Amenazas al Bosque Mesófilo de Montaña 2.3. PROBLEMÁTICA DE LA FAMILIA ORCHIDACEAE 7 2.3.1. Stanhopea tigrina Bateman 8 2.3.1.1. Clasificación taxonómica 2.3.1.2. Sinonimias 2.3.1.3. Nombres comunes 2.3.1.4. Distribución 2.3.1.5. Descripción botánica 9 2.3.2. Laelia anceps Lindl. Subsp. anceps 11 2.3.2.1. Clasificación taxonómica 2.3.2.2. Sinonimias 2.3.2.3. Nombres comunes 2.3.2.4. Distribución 2.3.2.5. Descripción botánica 12 2.3.3. Epidendrum veroscriptum Hágsater 13 2.3.3.1. Clasificación taxonómica 2.3.3.2. Sinonimias 2.3.3.3. Nombres comunes 2.3.3.4. Distribución 2.3.3.5. Descripción botánica 14 2.3.4. Cattleya x esbetts 15 2.3.4.1. Clasificación taxonómica 16 2.3.4.2. Distribución 2.3.4.3. Descripción botánica 2.3.4.4. Híbridos 2.4. ALTERNATIVAS DE CONSERVACION 17 2.4.1. Conservación in situ 2.4.2. Conservación ex situ 18 2.4.3. Conservación in situ de orquídeas 19 2.4.4. Conservación ex situ de orquídeas 20 2.5. CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES 21 2.5.1. Competencia morfogenética 22 2.5.2. Micropropagación 23 2.5.3. Reguladores del crecimiento 26 2.5.4. Auxinas 27 2.5.5. Citocininas 28 2.5.6. Balance auxina-citocinina 29 2.6. EL CULTIVO DE TEJIDOS EN LA FAMILIA ORCHIDACEAE 30 2.6.1. Micropropagación de orquídeas 2.6.2. Uso de los protocormos en la micropropagación 31 2.6.3. Descubrimiento y obtención del PLB 32 2.6.4. Micropropagación de los géneros bajo estudio 33 2.7. INTERES COMERCIAL 34 3. JUSTIFICACION 36 4. OBJETIVO GENERAL 37 5. OBJETIVOS PARTICULARES 6. HIPÓTESIS 7. MATERIALES Y METODOS 38 7.1. Material biológico empleado 7.2. Fase de inducción 7.3. Fase de expresión y desarrollo 39 7.4. Individualización 7.5. Establecimiento ex vitro de Laelia anceps y Epidendrum veroscriptum 40 7.6. Análisis estadístico 8. RESULTADOS 41 8.1. Stanhopea tigrina Bateman 8.1.1 Inducción 8.1.2 Formación de PLBs a partir del cultivo in vitro de protocormos de S. tigrina 43 8.1.3 Análisis portratamiento para la formación de PLBs a partir del cultivo in vitro de protocormos de S. tigrina 8.1.4 Formación de brotes a partir del cultivo in vitro de protocormos de S. tigrina 46 8.1.5 Análisis por tratamiento para la formación de brotes a partir del cultivo in vitro de protocormos de S. tigrina 8.1.6 Tasa de crecimiento con respecto a la formación de brotes a partir de protocormos cultivados in vitro de S. tigrina 51 8.1.7 Alturas obtenidas de las plántulas de S. tigrina cultivadas in vitro. 54 8.1.8 Análisis del efecto de los períodos de inducción con respecto a las alturas alcanzadas por las plántulas de S. tigrina obtenidas a partir de protocormos. 56 8.2. Laelia anceps Lindl. Subsp. anceps 58 8.2.1 Inducción 8.2.2 Formación de PLBs a partir del cultivo in vitro de protocormos de L. anceps 60 8.2.3 Análisis por tratamiento para la formación de PLBs a partir del cultivo in vitro de protocormos de L. anceps 8.2.4 Formación de brotes a partir del cultivo in vitro de protocormos de L. anceps 63 8.2.5 Análisis por tratamiento para la formación de brotes a partir del cultivo in vitro de protocormos de L. anceps. 8.2.6 Tasa de crecimiento con respecto a la formación de brotes a partir de protocormos cultivados in vitro de L. anceps. 68 8.2.7 Alturas obtenidas de las plántulas de L. anceps cultivadas in vitro. 71 8.2.8 Análisis del efecto de los períodos de inducción con respecto a las alturas alcanzadas por las plántulas de L. anceps obtenidas a partir de protocormos. 73 8.3. Epidendrum veroscriptum Hágsater 75 8.3.1 Inducción 8.3.2 Formación de PLBs a partir del cultivo in vitro de protocormos de E. veroscriptum 77 8.3.3 Análisis por tratamiento para la formación de PLBs a partir del cultivo in vitro de protocormos de E. veroscriptum. 8.3.4 Formación de brotes a partir del cultivo in vitro de protocormos de E. veroscriptum. 80 8.3.5 Análisis por tratamiento para la formación de brotes a partir de protocormos cultivados in vitro de E. veroscriptum. 8.3.6 Tasa de crecimiento con respecto a la formación de brotes a partir de protocormos cultivados in vitro de E. veroscriptum. 85 8.3.7 Alturas obtenidas de las plántulas de E. veroscriptum cultivadas in vitro. 88 8.3.8 Análisis del efecto de los períodos de inducción con respecto a las alturas alcanzadas por las plántulas de E. veroscriptum obtenidas a partir de protocormos. 90 8.4. Cattleya x esbetts 92 8.4.1 Inducción 8.4.2 Formación de PLBs a partir del cultivo in vitro de protocormos de C. x esbetts. 94 8.4.3 Análisis por tratamiento para la formación de PLBs a partir del cultivo in vitro de protocormos de C. x esbetts. 8.4.4 Formación de brotes a partir del cultivo in vitro de protocormos de C. x esbetts 97 8.4.5 Análisis por tratamiento para la formación de brotes a partir de protocormos cultivados in vitro de C. x esbetts. 8.4.6 Tasa de crecimiento con respecto a la formación de brotes a partir de protocormos cultivados in vitro de C. x esbetts . 102 8.4.7 Alturas obtenidas de las plántulas de C. x esbetts cultivadas in vitro. 105 8.4.8 Análisis del efecto de los períodos de inducción con respecto a las alturas alcanzadas por las plántulas de C. x esbetts obtenidas a partir de protocormos. 107 8.5. ESTABLECIMIENTO EX VITRO. 109 9. DISCUSION 113 10. CONCLUSIONES 118 11. BIBLIOGRAFIA 120 APENDICE 1. Medio Murashige & Skoog 126 ABREVIATURAS 2,4-D Ácido 2,4-diclorofenoxiacético AIA Ácido indolacético AIB Ácido indolbutírico ANA Ácido naftalenacético ANOVA Análisis de varianza BA N6-benciladenina BAP 6-Bencilaminopurina E. E. Error estándar LSD Less Significative Difference (diferencia mínima significativa) MB Medio Basal (sin reguladores de crecimiento) MS Medio Murashige & Skoog PLB Protocorm Like Body (Cuerpo Parecido a Protocormo) I RESUMEN Se determinó el período de adquisición de competencia celular, definido como el potencial endógeno de una célula o tejido para responder a una señal organogénica y activar una ruta de desarrollo específica, para la micropropagación de Stanhopea tigrina, Epidendrum veroscriptum, Laelia anceps y Cattleya x esbetts a partir del cultivo de protocormos. Éstos fueron cultivados en medio de Murashige y Skoog (MS) adicionado con una combinación factorial de N6-benciladenina (BA) (0, 1, 3, y 5 mg/L) y ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4-D) (0, 0.5 mg/L), y se ensayaron diferentes períodos de inducción (4, 8, 12, 16, 20, 24 y 28 días). Después de los períodos de inducción, los protocormos fueron transferidos a medio MS libre de reguladores de crecimiento para la fase de expresión. La principal respuesta obtenida a partir de los protocormos cultivados en las especies estudiadas fue la formación de cuerpos semejantes a protocormos (PLBs) y/o brotes adventicios. En Stanhopea tigrina, la formación de PLBs fue escasa, siendo la principal respuesta la formación de brotes, obteniéndose la mayor competencia en los protocormos cultivados en medio adicionado con 5 mg/L de BA y 0.5 mg/L de 2,4-D, donde se obtuvo un promedio de 8.75±2 brotes por explante en un período de 24 días de inducción; las tallas más altas alcanzadas por las plántulas se obtuvieron en dos períodos: en medio sin reguladores del crecimiento a los 24 días, en medio adicionado con 0.5 mg/L de 2,4-D, y en medio adicionado con 5 mg/L de BA en combinación de 0.5 mg/L de 2,4-D, alcanzando en ambos casos una talla promedio de 1.6±0.1 cm. Para L. anceps la mayor formación de brotes se obtuvo en el medio sin reguladores del crecimiento, en un período de inducción de 4 días, con una formación promedio de 26.5±12.2 brotes por explante; la talla más alta alcanzada por las plántulas fue de 3.6±0.49 cm en el medio sin reguladores del crecimiento, con un tiempo de inducción de 4 días. En el caso de E. veroscriptum la mayor competencia se obtuvo a los 16 días de inducción en el medio adicionado con 3 mg/L de BA y 0.5 mg/L de 2,4-D, con una formación de 9.6±2.4 brotes por explante aproximadamente; la talla más alta alcanzada por las plántulas obtenidas fue de 4.5±0.57 cm en el medio adicionado con 0.5 mg/L de 2,4-D, en un tiempo de 28 días de inducción. Finalmente, C. x esbetts obtuvo la mayor formación de brotes en un tiempo de inducción de 20 días, en el tratamiento adicionado únicamente con 1 mg/L de BA, con 18.7 ±5.4 brotes por explante. La mayores tallas alcanzadas por las plántulas se obtuvieron en: medio sin reguladores del crecimiento, con un promedio de 1.4 ± 0.04 cm, en un tiempo inducción de 4 días; y en el medio adicionado con 0.5 mg/L de 2,4-D, cuya talla alcanzada fue de 1.4 ± 0.13 cm, con 16 días de inducción. Finalmente, las plántulas obtenidas de E. veroscriptum y L. anceps que alcanzaron una talla promedio de 5 cm, fueron transferidas a condiciones ex vitro y se obtuvo una supervivencia del 100% después de 60 días. II 1. INTRODUCCION La familia Orchidaceae es una de las más grandes y más diversas familias de plantas, con datos estimados en 800 géneros y alrededor de 25,000 especies (Arditti, 1992; Dreesler, 1993; Espejo et al., 2002; Dixon et al., 2003), y como resultado de su capacidad única para hibridizar, se conocen más de 60,000 híbridos (Griesbach, 1986). Este grupo, siendo el más evolucionado de las angiospermas, cuenta con adaptaciones altamente especializadas para atraer, engañar y manipular insectos con el fin de lograr la polinización, hecho que tiene fascinados a observadores desde los tiempos de Darwin (Dressler,1981). Las orquídeas son plantas herbáceas, perennes, ubicadas dentro del grupo de las monocotiledóneas (Wiard, 1987), son plantas terrestres, humícolas (que habitan entre las hojas muertas del suelo), litofíticas (que viven sobre las rocas) y con mayor frecuencia epífitas (que se establecen sobre otra planta) (Barba et al., 2002). Es una familia cosmopolita, originaria de las regiones tropicales y subtropicales (Álvarez, 1970), prácticamente se distribuye en todo el mundo con excepción de los hielos permanentes y los desiertos (Quintanar, 1961). En México se distribuyen alrededor de 1,200 especies de orquídeas (Espejo y López- Ferrari, 1998a, 1998b, citado por Espejo et al., 2002), con un endemismo de 40%; en México los estados con mayor diversidad de orquídeas son: Chiapas, Oaxaca, Veracruz, Puebla, Hidalgo, San Luis Potosí, Guerrero, Michoacán, Jalisco, Nayarit y Sinaloa, con poblaciones muy pequeñas en el Estado de México y Morelos (Soto, 1996). El 60% de las especies mexicanas de orquídeas se encuentran en los bosques mesófilos de montaña (Hágsater y Soto, 2001), los cuales se caracterizan por ser una serie de comunidades vegetales que prosperan en lugares donde prevalece un clima húmedo y a la vez fresco (Rzedowski, 1996). Cuando las orquídeas viven sin disturbios en su hábitat naturalmente seleccionado, como es el caso del BMM, éste les proporciona las condiciones favorables para su crecimiento y propagación, pero cualquier intromisión en la cadena ecológica puede llegar a causar su extinción; hay factores tales como el uso indiscriminado de insecticidas, que matan a sus polinizadores, el aumento global de la temperatura y el descenso de la humedad, así como la destrucción de selvas y bosques, y de los árboles específicos en los que ellas se establecen (Sánchez-Espinosa et al., 2000). Además, muchas de las poblaciones silvestres están siendo seriamente afectadas por el volumen de individuos reproductores que se extraen. Lo anterior trae 1 como consecuencia el lento o nulo restablecimiento de las poblaciones, llegando a ocasionar en algunos casos la extinción local (Sosa y Platas, 1998). En este contexto, la conservación de germoplasma valioso se ha planteado como una medida inaplazable y prioritaria; la estrategia de conservación de germoplasma depende de la naturaleza del material biológico, y está definida por la duración de su ciclo de vida, el modo de reproducción, el tamaño de los individuos y el estatus ecológico (silvestre o domesticado) (Rublúo, 1985). Se ha intentado realizar una efectiva conservación in situ a través del mantenimiento de áreas naturales protegidas como reservas, parques nacionales y otros tipos de áreas protegidas, realizando programas de recuperación de especies, restauración de hábitats, control de especies invasoras y manejo de poblaciones de plantas y ecosistemas; sin embargo, cuando lo anterior no es posible, debido a riesgos de pérdida por manejo o factores ambientales, se recurre a la conservación ex situ; en este sentido los jardines botánicos y otras instituciones de investigación, tienen una importante función, buscando rescatar el germoplasma amenazado mediante el mantenimiento de colecciones vivas, estableciendo bancos de semillas, suministrando material para diferentes propósitos con el fin de eliminar o reducir la presión de la recolección silvestre, y a través de la propagación y multiplicación in vitro de plantas (Wyse, 2001). Así, las técnicas de cultivo de tejidos vegetales aparecen como opción viable para la propagación y conservación de material biológico (Rublúo, 1985). El Cultivo de Tejidos Vegetales (CTV) es una herramienta biotecnológica cuyo fundamento se basa en la totipotencialidad celular, lo que permite tener en un medio de cultivo químicamente definido cualquier estructura vegetal (embriones, semillas, inflorescencias, tallos, raíces, meristemos, células individuales, granos de polen, etc.) bajo condiciones asépticas controladas (George y Sherrington, 1984). Las técnicas de CTV han mostrado ser un importante procedimiento en la multiplicación, el mejoramiento y la conservación de las plantas útiles al hombre (Villalobos, 1985). En adición, tales técnicas han sido adaptadas para utilizarse con un amplio rango de especies silvestres y han sido aplicadas exitosamente para la germinación en semillas y esporas, rescate de embriones, cultivo de meristemos y de callo (Fay, et al., 1999). El principal uso de la micropropagación ha sido la multiplicación masiva de plantas tales como rododendro, rosas, fucsia, clavel, manzana, frambuesa, coliflor, papa, etc. (Evans, 1990). La micropropagación ha demostrado su utilidad práctica en especies de multiplicación deficiente o relativamente lenta (orquídeas, espárrago, fresa, cactáceas, etc.) y en plantas que, aunque sean 2 más fácilmente propagables asexualmente, su número se incrementa más cuando se trabaja in vitro que con los métodos tradicionales de esqueje, estolón, bulbo, etc., como es el caso de las plantas de ornato, incluyendo también a las orquídeas (Lozoya, 1985). Además de la micropropagación, con el CTV se pueden realizar estudios básicos de fisiología, genética, bioquímica y ciencias afines, bioconversión y producción de compuestos útiles, asimismo se puede incrementar la variabilidad genética y la propagación de plantas; así, es posible realizar una conservación e intercambio de germoplasma más eficientes (Mroginski y Roca, 1993). Por todo lo anteriormente expuesto, es posible afirmar que el CTV ha sido una gran herramienta de trabajo en el área de la biotecnología, pues gracias a su uso, ha sido posible lograr la propagación masiva de gran variedad de plantas tanto maderables como medicinales y ornamentales. Este trabajo se realizó con el fin de producir un protocolo eficiente de propagación para las especies estudiadas y determinar cual es el período de adquisición de competencia para la mayor formación de brotes y/o PLBs a partir del cultivo in vitro de protocormos de Stanhopea tigrina, Laelia anceps, Epidendrum veroscriptum y Cattleya x esbetts, orquídeas que están bajo alguna categoría de protección o que poseen un alto valor ornamental; hasta el momento no se han realizado ensayos sobre la adquisición de competencia en la familia Orchidaceae; por lo cual este primer esfuerzo puede ser encaminado a la producción de un gran número de individuos en un menor tiempo y con menos insumos, que sean la base para cubrir la demanda comercial de que son objeto y contribuir de esta manera a disminuir el saqueo y comercio ilegal de individuos silvestres. Stanhopea tigrina Bateman es una especie endémica de nuestro país, muy apreciada por su valor ornamental, lo que ha provocado una sobrecolecta de individuos silvestres y una comercialización ilegal (Soto, 2002); actualmente se encuentra bajo protección especial por parte del gobierno federal (Norma Oficial Mexicana, 2002), por lo cual, es fundamental buscar alternativas para su conservación y preservación. Laelia anceps Lindley es una especie mexicana y endémica, una de las más utilizadas en hibridización (Halbinger y Soto, 1997), con un alto potencial ornamental y de gran interés económico; aunque no se encuentra catalogada dentro de la NOM-059-ECOL-2001, las presiones de colecta y comercio ilegal han disminuido considerablemente sus poblaciones, por lo que es preciso estudiar esta especie y ofrecer alternativas para su cultivo y comercialización. El género Epidendrum está muy extendido en nuestro país, dentro de las especies que se distribuyen en México se encuentra E. veroscriptum 3 Hágsater, a pesar que no se encuentra bajo alguna categoría de protección por parte del gobierno Mexicano, tiene un alto potencial ornamental y económico (García-Cruz y Sánchez, 1999), además que el hábitat donde se distribuye, el bosque mesófilo de montaña, es unode los ecosistemas que están en riesgo de desaparecer y por consecuencia, las especies que contiene. Finalmente, Cattleya x esbetts es un híbrido muy apreciado como planta de ornato, de gran importancia comercial debido al tamaño, color y belleza de sus flores, popular por su fácil cultivo (Hágsater, 1971), el cual se puede comercializar por productores nacionales y generar recursos económicos importantes. 4 2. ANTECEDENTES 2.1. BIODIVERSIDAD EN MÉXICO Según diversas estimaciones, alrededor de unos 10 millones de especies habitan sobre la Tierra, particularmente en los bosques tropicales. Dentro de esta faja de biodiversidad que ciñe los trópicos, quizás de 50 a 80% de la diversidad biológica del mundo se localiza en unos 6 o 12 países (WRI, UICN y PNUMA, 1992). Entre los siete países considerados como “megadiversos” se encuentra México en tercer lugar, pues se calcula que alberga entre 10 y 12% del total de la biota del mundo (Toledo, 1994). La alta diversidad biológica que México presenta es un producto combinado de las variaciones en topografía y clima encontrados en su superficie; éstas se mezclan unas con otras, creando un mosaico de condiciones ambientales y microambientales bien diverso (Flores, 1994) Se calcula que existen unas 250,000 especies de plantas vasculares en el mundo (Wilson, 1993). México ocupa el cuarto lugar a nivel mundial en riqueza de flora vascular (Challenger, 1998), pues se han descrito alrededor de 22,800 especies de plantas vasculares (Rzedowski, 1998) y con un total que se espera sume entre 29,000 y 34,000 especies de plantas (Toledo y Ordóñez, 1993; Flores y Gerez, 1994). De ese total de especies descritas para México, más del 40% son habitantes exclusivas del territorio nacional, es decir, son especies endémicas (CONABIO, 2000). En el territorio nacional se encuentran casi todos los tipos de vegetación reconocidos en el mundo, y en cuanto a riqueza florística se refiere, se encuentran en primer lugar los bosques templados y los tropicales secos (7,000 spp), después están los matorrales xerófilos y pastizales (6,000 spp); en tercer lugar aparece el bosque tropical perennifolio (5,000 spp), en cuarto el bosque mesófilo de montaña (BMM) (3,000 spp); y por último la vegetación ruderal (2,000 spp) y acuática (1,000 spp). Sin embargo, como caso especial destaca el BMM que ocupa una superficie de 17,886.86 km2, alrededor de 0.5 a 1% del territorio nacional; en términos de número de especies en relación a su superficie, contiene la mayor riqueza biológica, incluyendo un 30% de endemismo (Flores y Gerez, 1994). 4 2.2. AMENAZAS A LA BIODIVERSIDAD Aunque el hombre sea una especie natural clasificada entre los mamíferos, con sus instrumentos, productos químicos, medios de transporte y especialmente con su capacidad de razonamiento y de investigación, ha llegado a considerarse a si mismo como una especie que se encuentra aparte del resto de la naturaleza (Went, 1981). Para las sociedades humanas, las plantas silvestres y cultivadas proveen el alimento, fibras, productos medicinales, tintes, fragancias, y plantas ornamentales, entre muchas cosas más (Mounder et al., 2002). Las plantas son la base para la vida en la Tierra y sin su capacidad para capturar la energía del Sol a través del proceso de la fotosíntesis, el hombre no podría vivir en este planeta (Maxted y Hawkes, 1997). Sin embargo, el rápido incremento de la población, la contaminación, el excesivo consumo de recursos y el gradual deterioro de una ética sobre el uso sustentable de los recursos que nos ofrece la Tierra, ha puesto a la humanidad y la biodiversidad del planeta al borde de una crisis (Owen, 1986). La biodiversidad hoy en día está siendo destruida a una tasa tan alta como nunca se había presentado en la historia de este planeta. A finales del siglo XX se calculaba una pérdida de entre 100 y 10,000 especies por año, lo que representa grandes e importantes amenazas a la diversidad genética. Por ejemplo, a escala mundial se ha perdido casi la misma proporción de bosques húmedos templados, que en una época abarcaban un área casi igual a la de Malasia. Y aunque en las regiones templadas y boreales septentrionales la superficie total de los bosques no ha variado mucho en los últimos años, en muchas zonas los bosques ricos en especies, que crecen desde hace muchos años, han sido sustituidos por bosques secundarios y plantaciones (WRI, UICN, PNUMA, 1992). Los científicos aseguran que los cambios climatológicos experimentados por el planeta en los últimos cinco años no se percibían desde hace 18,000 años. (Curiel, 2004). 5 2.2.1. Problemática en México En México, una de las principales causas de la destrucción de la biodiversidad es la deforestación: la selva húmeda primaria ha sido talada en más de 90% de su área original; la selva subhúmeda ha perdido un 60% de su cobertura original; los ecosistemas de zonas áridas están alterados en quizás más de 75% de su área total; los bosques mesófilos de montaña y los de pino y encino han desaparecido en por lo menos 50% de sus áreas de distribución (Challenger, 1998). El abandono del campo y la falta de alternativas de uso y manejo de los recursos naturales, contribuyen en forma determinante a ésta deforestación masiva, que va desde 200 mil a 800 mil hectáreas por año, aumentando la superficie de suelo erosionado y lo más grave, la pérdida de biodiversidad útil por el empobrecimiento de la conservación in situ (Del Amo y Flores, 2001). Los cambios de uso del suelo han afectado de manera considerable la gran variedad de ecosistemas que existen en el país; tan sólo entre 1970 y 1990, según la Organización Internacional de Comercio (1998), aumentaron 40% las áreas arables y las de pastoreo 15%, mientras la superficie forestal disminuyó 15%. Estudios desarrollados en México han demostrado la vulnerabilidad de muchos sectores del país a los posibles efectos del cambio climático. En el sector forestal se ha pronosticado que cerca del 50% de la cobertura vegetal del territorio nacional sufriría cambios; algunos bosques de coníferas, matorrales xerófilos y pastizales podrían incluso desaparecer; también se advierte que el 48% de la superficie de México, incluyendo los estados de Aguascalientes, Baja California, Coahuila, Jalisco, Colima, Nayarit, Querétaro, Guanajuato, Michoacán, Sonora e Hidalgo resultaría propensa a la desertificación (Curiel, 2004). 2.2.2. Amenazas al Bosque Mesófilo de Montaña En México y en general en todo Latinoamérica, los bosques mesófilos de montaña sufren una fuerte intervención que está provocando su pérdida irreversible ya que se localizan en sitios con suelo de origen volcánico muy fértil pero de alta pendiente, que son convertidos a cafetales, y a que estos sitios son muy apreciados para asentamientos humanos por su clima agradable, y debido a que estos bosques tienen una tasa de crecimiento absoluta y un proceso sucesional más lentos que otros bosques en la zona tropical, son ecosistemas frágiles (William, 1989). 6 2.3. PROBLEMÁTICA DE LA FAMILIA ORCHIDACEAE El origen del problema de la amenaza a las poblaciones de orquídeas a nivel mundial es un incremento de las poblaciones humanas que exigen cantidades progresivamente más grandes de recursos. Desde que la mayoría de los países tropicales enfrentan problemas económicos severos y tienen una población multi-étnica con ideas y tradiciones diferentes en el uso de recursos naturales, es muy difícil planear el uso de la tierra, y mantener una vigilancia efectiva para que se cumplan esos planes (Hágsater y Soto, 2001). De acuerdo con Hágsater (1976), desde el siglo XIX, muchos colectores voraces han violado bosques y selvas en busca de orquídeas, llevándose todo lo que encontraban a su paso, incluyendo plántulas, comprometiendo el delicado equilibrioecológico del lugar en cuanto a presencia de orquídeas se refiere. También se tiene que la facilidad con que se pueden polinizar las orquídeas silvestres para producir híbridos decorativos ha conducido a una colecta masiva de estas especies epífitas, lo que ha diezmado sus poblaciones (Challenger, 1998). En el caso de México, la amenaza más grande para las orquídeas continúa siendo la destrucción y/o transformación del hábitat a campos agrícolas; en las partes bajas del bosque mesófilo de montaña se han transformado áreas extensas en plantaciones de café; la agricultura tradicional es practicada en muchas regiones de México. Aunque muchas poblaciones de orquídeas han sido afectadas por este uso de la tierra, raramente se ha llevado a la extinción a las especies debido a la práctica común de dejar unos pocos árboles, barrancos arbolados y otros parches pequeños de vegetación original entre las parcelas cultivadas. Otro problema serio en México es la extensión de zonas ganaderas; esta actividad ha sido una de las más aprovechables en nuestro país, aunque para conseguir eso, muchos bosques originales fueron completamente destruidos durante la conversión a pastizales; en el caso del bosque de niebla, el 22% de su superficie es ahora trabajada como zona de ganado (Soto, 1996). 7 2.3.1. Stanhopea tigrina Bateman Las características y belleza de S. tigrina, su aroma característico (parecido al chocolate) y el tamaño de sus flores (Hartley, 2001), hacen de esta orquídea una planta atractiva, con alto valor ornamental. Y es precisamente esto, el saqueo y el comercio ilegal de esta especie, lo que la ha puesto en la lista de la NOM-059-ECOL-2001, (Norma Oficial Mexicana, 2002), como una especie amenazada, por lo que es urgente y primordial buscar alternativas de conservación y uso sustentable para esta especie. 2.3.1.1.Clasificación taxonómica (Dressler, 1993) • División: Magnoliophyta • Clase: Liliopsida • Subclase: Liliidae • Orden: Orchidales • Familia: Orchidaceae • Subfamilia: Epidendroideae • Tribu: Maxillarieae • Subtribu: Stanhopeinae • Género: Stanhopea • Especie: Stanhopea tigrina Bateman (Fig. 1) Fig. 1. Flor de Stanhopea tigrina Bateman 2.3.1.2. Sinonímias: Stanhopea nigro-violácea 2.3.1.3. Nombres comunes: "Toritos" (Pue., D.F.), "vaca" (Ver.), "calavera" (Qro.), "tecuán morado", "torito negro" (Ciudad de México, Veracruz). 2.3.1.4. Distribución: Stanhopea tigrina Bateman es una especie epífita o rupícola, endémica de nuestro país, se localiza en la Sierra Madre Oriental, en Tamaulipas, San Luis Potosí, Querétaro, Hidalgo, Puebla, Veracruz, Oaxaca y Chiapas (Fig. 2). Sus hábitats naturales son el bosque húmedo de pino-encino y bosque de pino-encino-Liquidámbar, ocasionalmente en bosque de lluvia de montaña, de 600 a 1700 m de elevación. Florece en julio y agosto Es polinizada por abejas de la especie Euglossa viridissima (Van der Pijl y Dodson, 1966). 8 Fig. 2. Distribución geográfica de Stanhopea tigrina Bateman. Fuente: Hágsater y Soto, 2002 2.3.1.5. Descripción botánica. Hierba epífita, cespitosa, masiva, de 40-70 cm de alto. Raíces flexuosas, 2-3 mm de grosor. Pseudobulbos unifoliados, agregados, ovoides a subglobosos, longitudinalmente sulcados, de 3-7.5 cm de alto, 2-3.5 cm de ancho. Vainas fibrosas, fugaces, hasta de 12.5 cm de largo. Hoja con un pecíolo sulcado, de 5-14 cm de largo, 4.5-6.5 mm de grosor; lámina elíptica, acuminada, margen ondulado, de 23-45 x 5-13 cm Inflorescencia péndula, de 20-35 cm de largo, pedúnculo subterete, de 5-12.5 cm de largo, con brácteas cafés, imbricadas, cimbiformes, ampliamente ovadas, obtusas, apiculadas, papiráceo-cartáceas, de 1.5-7 cm de largo; usualmente biflora. Brácteas florales elípticas u oblanceoladas, agudas u obtusas, aristadas, de 7-9 x 3-7.5 cm Ovario subtrígono, 3-carinado, furfuráceo, de 7.5-10.5 cm de largo, 7-8 mm de grosor. Flores mirando hacia abajo, muy grandes, de 11-18 cm de diámetro; sépalos crema o amarillos, con manchas variables, algo reticuladas de color púrpura a púrpura negruzco, más grandes y densas hacia la base y en el margen superior de los sépalos laterales; pétalos amarillos y una gran mancha púrpura en la base y otras pocas submarginales hacia el ápice; hipoquilo amarillo, con 2 bandas púrpura, grandes a los lados y 2 más pequeñas, brillantes a los lados del orificio, púrpura en la superficie interna; mesoquilo y epiquilo punteados de púrpura, columna blanquecina, axialmente verdosa, con manchas púrpura claro; fragancia muy intensa, dulce, aromática (fenil etil acetato, acetato de cinamilo, indol, acetato de bencilo, fenil etil alcohol; (Whitten y Williams, 1992). Sépalo dorsal extendido o reflexo, ovado u ovado-lanceolado, obtuso-redondeado, cóncavo en la base, los márgenes revolutos, de 9 8-11 x 3-5 cm Sépalos laterales connados entre sí por 15-20 mm, extendidos o algo reflexos, cóncavos, incurvados, oblicuamente ovados, obtuso-redondeados, márgenes ligeramente revolutos, de 7-10 x 4.5-7.5 cm Pétalos reflexos, torcidos, linearoblongos, obtusos, apiculados, repandos, plicados, de 7-9.8 x 1.8-2.8 cm Labelo de 63-87 mm de largo, hipoquilo profundamente cóncavo-saccato, ampliamente cimbiforme, de 30-40 mm de largo, 40-50 mm de ancho, 20-23 mm de alto, con una quilla ancha cerca de la base y rodeado el orificio, orificio muy amplio, obtriangular, obcordado; fondo interno del saco 7-8-carinado, la parte distal gibosa y carinada, rugosa; mesoquilo con 2 cuernos falcados, muy carnosos, anchos, aplanados, arqueados, alzados en la base y recurvados en el ápice, aproximándose al ápice de la columna, de 4.5-5.8 cm de largo, 1.3-1.8 mm de ancho; epiquilo más o menos transversalmente rómbico-flabelado, longitudinalmente canaliculado especialmente en el ápice; de 33-43 x 42-50 mm, base cuneada, ápice trilobado, lóbulos laterales alzados, agudos, el medio pequeño, deltoide, obtuso, deflexo, canaliculado. Columna de 65-90 mm de largo, 30- 35 mm de ancho; arqueada en el ¼ basal, subparalela al labelo arriba de la base; trígona- subrómbica en corte transversal, dorsiventralmente comprimida, los ⅔ distales alados, esta parte elíptica, las alas petaloides, membranáceas, apicalmente enrolladas; ápice con 2 dientes divergentes, redondeados, de 3.5 mm de largo; ventralmente con una carina elevada, subestigmática, de 15 mm de largo. Cavidad estigmática, una ranura transversal, de 1 x 4.5 mm Rostelo un tabique transversal con 2 pequeños dientes laterales divergentes, recurvados. Antera subovoide, el ápice prominente, ovado, bilocular, con 2 dientes laterales, de 5 x 4 mm Polinario de 11.5-12 mm de largo, con 2 polinios, de 4.5 x 0.8 mm, oblanceolados, dorsiventralmente comprimidos; estípite oblanceolado, grueso, de 2 mm de largo; viscidio obovado, basalmente bífido, apicalmente caudado, 6.5 mm de largo. Cápsula elipsoide, 6- carinada, de 8-8.5 cm de largo, 3.1-3.8 cm de grosor, con la columna persistente. Número cromosómico 2n = 40 (Hágsater y Soto, 2002). 10 2.3.2. Laelia anceps Lindl. Subsp. anceps L. anceps es la especie mexicana del género con mayor importancia hortícola; ha sido y probablemente seguirá siendo una de las grandes favoritas de los cultivadores (Soto, 1993). Las subespecies anceps no se encuentran en riesgo; existen grandes poblaciones en Veracruz, San Luis Potosí y Tamaulipas. En Chiapas y Oaxaca es poco conocida debido a que está distribuida en estaciones pequeñas y aisladas de dichos estados. (Halbinger y Soto, 1997). Sin embargo, la fuerte presión de colecta que enfrenta esta especie podría, en un futuro, ponerla en alguna categoría de riesgo por el gobierno mexicano. Por otro lado, es una planta de fácil cultivo, lo que hace que esta especie sea una de las orquídeas mexicanas más utilizadas para hibridización (Soto, 1993). 2.3.2.1. Clasificacióntaxonómica (Dressler, 1993) • División: Magnoliophyta • Clase: Liliopsida • Subclase: Liliidae • Orden: Orchidales • Familia: Orchidaceae • Subfamilia: Epidendroideae • Tribu: Epidendreae I - New World • Subtribu: Laeliinae • Género: Laelia • Especie: Laelia anceps Lindl. Subsp. anceps (Fig. 3) Fig. 3. Inflorescencias de L. anceps Lindl. 2.3.2.2. Sinonimias: No se encontraron sinonimias para esta especie 2.3.2.3. Nombres comunes: “Vara de San Diego, “flor de San Miguel”, flor de todos santos”. 2.3.2.4. Distribución: Laelia anceps Lindley se distribuye en la Sierra Madre Oriental y la altiplanicie Central de Chiapas. Laelia anceps subsp. Anceps puede ser encontrada en la vertiente del Golfo de México; en los estados de Nuevo León, Tamaulipas, San Luis Potosí, Hidalgo, Querétaro, Puebla, Veracruz, Oaxaca y Chiapas (Fig. 4), y también en Guatemala y Honduras, en 11 bosques templados de encino (Quercus conspersa, Q. oleoides, Q. laeta), usualmente con especies tropicales de árboles caducifolios (Acacia, Erythrina), prefieren lugares con precipitación anual promedio de 1200 a 2100 mm Existían localidades en Veracruz con poblaciones gigantescas, de cientos o miles de plantas, en otras regiones son mucho más pequeñas, incluso relictuales (Halbinger y Soto, 1997). Fig. 4. Distribución geográfica de Laelia anceps Lindley. Fuente: Halbinger y Soto, 1997. 2.3.2.5. Descripción botánica. Pseudobulbos elipsoides a ovalados, reducidos, con doble borde, separados por un rizoma alargado (3-4.5 cm), ápice sencillo, hojas elípticas, inflorescencia cubierta con largas brácteas de doble borde, con 1 a 3 flores en la parte terminal es diagnóstico. Las flores son largas, de 7 a 12 cm de altura, normalmente de un color rosa-púrpura, la mitad del labelo presenta una coloración púrpura oscuro. La otra mitad presenta una coloración amarilla con tres líneas terminales que pueden ser observadas, así como líneas ramificadas de diferentes tonos de rojo en la columna. Durante días muy soleados las flores emiten una fragancia agradable. Las flores duran por espacio de 10 a 16 días o más, la floración es de octubre a diciembre (Halbinger y Soto, 1997). 12 2.3.3. Epidendrum veroscriptum Hágsater Esta especie no se encuentra en riesgo; se puede decir que además un número no determinado de especies e híbridos son cultivados en invernaderos o al aire libre, algunos son relativamente fáciles de propagar y otros no, por lo cual la micropropagación representa una buena alternativa para esta especie, de la cual no se tienen estudios sobre su propagación el interés que se tiene por esta especie es debido a lo atractivo de su follaje y flores; convierte en un buen candidato con potencial ornamental y económico, principalmente para patios y jardines. 2.3.3.1. Clasificación taxonómica (Dressler, 1993) • División: Magnoliophyta • Clase: Liliopsida • Subclase: Liliidae • Orden: Orchidales • Familia: Orchidaceae • Subfamilia: Epidendroideae • Tribu: Epidendreae I - New World • Subtribu: Laeliinae • Género: Epidendrum • Especie: Epidendrum veroscriptum Hágsater (Fig. 5) Fig. 5. Inflorescencias de E. veroscriptum 2.3.3.2. Sinonimia: E. scriptum A. Rich y Galeotti., Ann. Sci. Nat. Sér. 3.3.22. 1845. 2.3.3.3. Nombres comunes: No se encontraron nombres comunes para esta especie. 2.3.3.4. Distribución. Esta especie se encuentra en México (Chiapas, Guerrero, Oaxaca, Puebla y Veracruz (Fig. 6); Belice, Guatemala y El Salvador, viviendo a una altitud de 400- 1,970 msnm, en Comunidades de Bosque mesófilo de montaña; bosque de encino; Selva caducifolia; bosque tropical perennifolio y ocasionalmente en acahual. (Hágsater y Salazar, 1993). 13 Fig. 6. Distribución geográfica de Epidendrum veroscriptum Hágsater. Fuente: Hágsater y Salazar, 1993. 2.3.3.5. Descripción botánica. Hierba epífita o litófita, erecta, cespitosa, de (32) 50-120 cm de alto incluyendo la inflorescencia; tallos rollizos, rectos, de (13) 40-100 cm de largo, 4-9 mm de diámetro, sencillos, cubiertos por 3-6 vainas tubulares, escariosas, de 2-6 cm de largo; raíces basales, carnosas, filiformes, de 1.5-2.5 mm de diámetro. Hojas (5) 7-14, distribuidas a lo largo del tallo, la lámina angostamente elíptica, escasamente acuminada, aguda, sin mucrón aparente, de 6-20 cm de largo, 1.5-5.5 cm de ancho, membranosas, ligeramente carinadas. Inflorescencia apical, paniculada, densa, de 12-45 cm de largo, la bráctea espatácea ausente, el pedúnculo corto, de 2-6 cm de largo, generalmente sin brácteas, raramente con 2-4, imbricadas, oblongo- triangulares, acuminadas, agudas, envolventes, conduplicadas, de 15-40 mm de largo, 2-5.5 mm de ancho; brácteas florales más cortas que el ovario, abrazadoras, triangulares, acuminadas, agudas, de 2-5 mm de largo, 0.6-1.4 mm de ancho; flores 12-200, simultáneas, resupinadas, sin fragancia, los sépalos, pétalos y mitad basal de la columna verde amarillento, la mitad apical de la columna y el labelo blancos, el disco marcado con puntos morados, dispuestos en forma de círculo, ocasionalmente blanco (una misma planta puede mostrar variación en la coloración de un año a otro); sépalo dorsal reflexo, angostamente espatulado-oblanceolado, agudo, mucronado, de 9-17 mm de largo, 3-5 mm de ancho, el margen extendido, entero, finamente furfuráceo dorsalmente, los sépalos laterales reflexos, angostamente espatulado-oblanceolados, obtusos, mucronados, de 9-17 mm de largo, 3-5 mm de ancho, el margen extendido, entero, finamente 14 furfuráceos dorsalmente; pétalos reflexos a extendidos. filiformes, agudos, sin mucrón aparente, de 8-16 mm de largo, 0.5-0.7 mm de ancho, el margen extendido, entero; labelo tetralobado, la base cordada, de 5-8 mm de largo, 7.5-11 mm de ancho, bicalloso, los callos subglobosos, prominentes, tricarinado, las carinas prominentes, la central llegando hasta el seno apical, los lóbulos basales semielípticos a dolabriformes, el margen entero a eroso, el ápice obtuso, de 2.5-3 mm de largo, 3.5-4 mm de ancho, los lóbulos apicales elíptico-oblongos, falcados, el margen entero, el ápice redondeado a obtuso, de 3-3.5 mm de largo, 0.8-1.2 mm de ancho, fuertemente divergentes; columna recta, obcónica, delgada, de 7.5-12 mm de largo, 1-1.2 mm de diámetro, el margen del clinandrio sin llegar al ápice de la columna, entero; antera subesférica; polinios de forma "ala de pájaro", fuertemente comprimidos lateralmente, el nectario poco profundo, llegando hasta la zona de inserción de los segmentos del perianto; ovario de 11-35 mm de largo, 0.2-0.7 mm de diámetro, finamente furfuráceo. Fruto una cápsula elipsoide, de 1.8-2 cm de largo, 8-10 mm de diámetro, el cuello largo, de 6-7.5 mm de largo (Hágsater y Salazar, 1993). 2.3.4. Cattleya x esbetts Entre todos los géneros que constituyen la gran familia de las orquídeas, el de las Cattleyas de América Tropical es el que tiene mayor notoriedad, debido al tamaño, color y belleza de sus flores. El perfume especial y agradable de la mayoría de ellas y su larga durabilidad, las hace ideales para trabajos de floristería. Además de ser la más popular entre los aficionados por su fácil cultivo (Hágsater, 1971). Es un género con alto potencial ornamental y económico, en la actualidad la producción de plantas de híbridos de Cattleya es un negocio bien organizado a nivel mundial. La facilidad para hibridizar las plantas de este especie ha sido el detonante económico por el cual han sido estudiadas y muy apreciadas desde hace más de dos siglos. Actualmente existen miles de híbridos que forman la gran legión de nuevos tipos de Cattleyas (Hartmann, 1971), un ejemplo de lo anterior es precisamente C. x esbetts,cuyo atractivo como planta de interés ornamental es evidente, y cuyo potencial económico puede incrementarse obteniendo mejores resultados mediante micropropagación, con menos tiempo de cultivo y costos de producción más bajos. 15 2.3.4.1. Clasificación taxonómica (Dressler, 1993) • División: Magnoliophyta • Clase: Liliopsida • Subclase: Liliidae • Orden: Orchidales • Familia: Orchidaceae • Subfamilia: Epidendroideae • Tribu: Epidendreae I - New World • Subtribu: Laeliinae • Género: Cattleya • Especie: Cattleya x esbetts (Fig. 7) Fig. 7. Planta completa de C. x esbetts 2.3.4.2. Distribución: Estas hermosas plantas son indígenas del hemisferio occidental, desde México hasta el Perú y Sur del Brasil (Lager, 1981). Se pueden encontrar en latitudes que van de los 500 hasta los 1,600 msnm. 2.3.4.3. Descripción botánica. La definición botánica de las Cattleyas, son plantas epífitas o rupícolas formadas por una serie de pseudobulbos unidos por rizomas en forma ahusada, cuya longitud varía según la especie. De la parte superior de estos pseudobulbos se desprenden una o varias hojas carnosas de forma elíptica alargada. En la parte inferior se producen raíces adherentes que permiten a la planta alimentarse y sujetarse a los árboles o rocas donde crecen. En las Cattleyas existen dos grupos, Cattleyas unifoliadas, que tienen una sola hoja por bulbo, y las bifoliadas, que tienen dos hojas por bulbo (Hágsater, 1971). 2.3.4.4. Híbridos. Los híbridos naturales son encontrados en la naturaleza pero son relativamente raros, pero las especies de orquídeas son renombradas por su promiscuidad (Koopowitz, 1996). Muchos de los llamados “híbridos” de Cattleyas son en realidad combinaciones de géneros diferentes, principalmente Laelias, Brassavolas (Rhyncolaelias) y Sophronitis. Esas combinaciones han sido nombradas, respectivamente, Laeliocattleyas, Brassocattleyas, Brassolaeliocattleyas, Sophrolaeliocattleyas y la combinación de las cuatro son llamadas Potinaras, un nombre acuñado para obviar una combinación compleja (Rentoul, 1982). 16 2.4. ALTERNATIVAS DE CONSERVACION La palabra conservación se deriva de dos voces latinas, con que significa “juntos”, y servare que significa “mantener” o “guardar”. Literalmente, por consiguiente, conservación significa “mantener” o “conservar unidos” (Owen, 1986). El éxito de la conservación de la biodiversidad requiere un sinnúmero de habilidades, técnicas y prácticas que deben alinearse en una misma dirección y frecuentemente representan una mezcla de temáticas biológicas, económicas y sociales; también necesita actuar a varios niveles de organización biológica, desde genes, alelos, individuos y poblaciones hasta ecosistemas completos, preservando no solamente los componentes de la biodiversidad sino también las interacciones entre ellos; asimismo, no puede ser llevada a cabo efectivamente por el trabajo individual de una única institución o sector; los retos frente a la supervivencia biológica requieren el uso de cualquier herramienta que se encuentre a la mano, escogiendo las combinaciones correctas para cumplir con las necesidades específicas de cada población, especie, comunidad vegetal y hábitats naturales en donde éstas crecen. Este acercamiento multidisciplinario ha sido denominado “conservación integral” (Wyse, 2001). Actualmente se manejan dos principales alternativas de conservación de especies: conservación in situ y conservación ex situ. 2.4.1. Conservación in situ. Implica la conservación de la biodiversidad en sus ecosistemas y hábitats naturales, permitiendo la interacción con su entorno (UICN-BGCS y WWF, 1989). El objetivo de la conservación in situ es el de permitir que la biodiversidad se mantenga por si sola dentro del contexto ecosistémico en donde esta se encuentra. De acuerdo con el texto derivado de la Convención sobre Diversidad Biológica (CBD por sus siglas en inglés), en la que participaron 187 países, la conservación in situ puede y debe ser siempre una prioridad para los gobiernos (Wyse, 2001). El primer paso lo constituye la conservación misma del hábitat (in situ). Adicionalmente, los estudios florísticos, ya sea existentes o por realizarse, permitirán identificar las especies que requieren de una protección especial, las “especies clave” para cada región y el hábitat adecuado para cada una de ellas (Maxted, 1997). Otros puntos importantes a tomar en cuenta son: el establecimiento de áreas protegidas o áreas donde se necesita tomar medidas especiales para 17 conservar la diversidad biológica; regulación o manejo de los recursos biológicos importantes para la conservación de ésta biodiversidad; la promoción de la protección de los ecosistemas, hábitats naturales y el mantenimiento de poblaciones viables de especies en sus ambientes naturales; rehabilitación y restauración de ecosistemas degradados y promover la recuperación de especies amenazadas, entre otros (Rae, 1999). La sustentabilidad en los proyectos que se realicen pueden fomentar la conservación in situ. El uso sostenible de la biodiversidad debe ser visto como un principio guía para el desarrollo. El desarrollo y la integridad ambiental deben estar ligados de manera inseparable; así, el uso sostenible se puede definir en dos vertientes: a) el uso sostenible de especies silvestres provee beneficios para la conservación, no sólo para especies particulares sino también para sus ecosistemas asociados; b) el uso sostenible provee beneficios a largo plazo de importantes recursos para las comunidades y posibilidades que han sido reducidas por la sobre explotación (Glowka, 1994, citado por Wyse, 2000). 2.4.2. Conservación ex situ. Es considerada como alternativa de preservación más que como conservación, ya que disminuye la presión sobre poblaciones silvestres en aquellas plantas que son de interés científico, hortícola, comerciales y de interés para recolectores. Además, la base para una estrategia integral de conservación debe contemplar, para cada taxón, una selección de muestras biológicas con la más amplia diversidad genética y los métodos apropiados para su propagación y conservación (almacenamiento de semillas, criopreservación, cultivos in vitro, etc.) (UICN- BGCS y WWF, 1989). Tradicionalmente, los métodos de conservación ex situ han sido enfocados en la colección y almacenamiento de semillas. Los métodos comunes para el almacenamiento de semillas adoptados por los almacenes de germoplasma mundial, son adecuados para especies productoras de abundantes semillas ortodoxas viables. Sin embargo, muchas especies amenazadas no se encuentran dentro de este criterio y no pueden ser almacenadas adecuadamente por largos períodos utilizando técnicas convencionales de almacenamiento de semillas. Para estas especies, el cultivo in vitro se utiliza ahora rutinariamente para la propagación y mantenimiento de material clonado (Touchell y Dixon, 1999). Además, la recolección ilegal de muchas especies de plantas en su medio silvestre nos marca una pauta para promover se comercialización legal, ligada a los programas de propagación, difusión y educación de las mismas (Maxted, 1997). 18 De acuerdo a Hágsater (1976) y para el caso de las orquídeas, los fundamentos para promover su conservación son los siguientes: desde un punto de vista exclusivamente escolástico, se conservan para permitir su estudio en su hábitat natural y la continuación de su proceso evolutivo; desde un punto de vista indirectamente comercial, se maneja la creación de bancos genéticos para su propagación e hibridización. Sin embargo, la real importancia de las orquídeas como organismos fijadores de carbono, donde hay pocos o ningún organismo fijador del carbono, se hace cada vezmás aparente. Esto apunta a la importancia de las orquídeas, especialmente las epífitas, en el mantenimiento del equilibrio ecológico de bosques y selvas tropicales. 2.4.3. Conservación in situ en orquídeas Cattling (1996) propone una serie de acciones a realizar una adecuada conservación in situ para las orquídeas. Primero, para el manejo de las poblaciones de orquídeas no necesariamente es una cuestión de mantener condiciones prístinas o el crecimiento de bosques muy viejos, pero a menudo ciertos tipos de perturbación sólo permiten mantener un sucesorio o al menos algunos remiendos del hábitat original. Segundo, sin tener en cuenta la escasa información disponible acerca de los hábitats y ecología de las orquídeas, es posible realizar un buen manejo de las mismas en muchos casos a través de 1) una familiaridad con los principios básicos de la ecología de las orquídeas, 2) observaciones de las plantas bajo condiciones naturales, y 3) la experimentación limitada y análisis de los datos. Tercero, el monitoreo debe ser seguido necesariamente de una protección o cooperación legal; así, el manejo activo de las poblaciones requerirá de este apoyo con mayor frecuencia. En México, tanto las comunidades locales, organizaciones no gubernamentales (ONG’s), gobiernos locales y gobierno Federal (a través de instituciones como SEMARNAT, PROFEPA, CONAFOR, CONABIO), e instituciones educativas, deberán estar involucrados en la situación y manejo actual de las áreas en conservación, atendiendo en este caso, principalmente aquellas zonas que sean ricas en orquídeas. (Hágsater y Soto, 2001). Finalmente, las acciones de manejo como las ya mencionadas, necesariamente deben evaluar los intercambios y afectaciones que pueden existir en los diferentes organismos que habitan en el área a proteger. Es probable que se gane más en conjunto cuando la conservación de una especie o un grupo de especies esté incorporada en un plan de dirección de ecosistema más amplio (Cattling, 1996), ya que de no ser así, se corre el riesgo de que no puedan incrementarse 19 los estándares de vida de la población local en su conjunto, lo que provocaría que no sobreviva en las siguientes décadas (Hágsater y Soto, 2001). 2.4.4. Conservación ex situ en orquídeas La Agenda Internacional establece que la conservación ex situ debe ser vista como parte de la finalidad de conservar y no la finalidad misma; como un recurso para la reintroducción dentro de hábitats deteriorados y el incremento de poblaciones como parte del manejo de ecosistemas, como medio de selección de material para su introducción dentro de programas de guardería, agricultura local, plantaciones ornamentales y silvicultura local, etc. (Wyse, 2001). La base para una estrategia integral de conservación debe contemplar para cada taxón, una selección de muestras biológicas con la más amplia diversidad genética y los métodos apropiados para su propagación y conservación (almacenamiento de semillas, cultivo in vitro, criopreservación, entre otros); asimismo, y de acuerdo con la Asociación Mexicana de Jardines Botánicos (AMJB), las colecciones nacionales deben tener mejores condiciones de cultivo en cada Jardín Botánico, ya que representan una valiosa estrategia de conservación (Rodríguez- Acosta, 2000). Dentro de este contexto, las colecciones vivas de orquídeas tienen un papel importante en la conservación de las mismas (Dixon et al., 2003). Las orquídeas, conocidas también como la Familia Real de las plantas (Rivero, 2001), tienen una gran ventaja sobre otras familias de plantas de ser extremadamente fecundas: una cápsula es capaz de producir cientos, miles o millones de semillas. La Tierra podría ser desbordada con orquídeas si todas las semillas germinaran y se desarrollaran hasta la madurez, pero en la naturaleza un porcentaje relativamente bajo de semillas sobrevive durante la germinación. Aunado a lo anterior está la pérdida de sus hábitats naturales, lo que hace a las orquídeas particularmente vulnerables en la naturaleza, pero las cuales, recíprocamente, hace que éstas sean excelentes candidatas para la conservación ex situ (Jesup, 1996). Soto (1996) propuso las siguientes consideraciones para poder llevar a cabo una efectiva conservación ex situ de orquídeas: 1. Mayor trabajo monográfico y florístico, especialmente en los géneros o áreas que no hayan sido cubiertos. 2. Reconocimiento preciso de áreas particulares de alta diversidad y endemismo, basados en información exacta. 20 3. Reconocimiento preciso de hábitats y especies que estén viviendo situaciones críticas para su conservación, basados en trabajo de campo y datos objetivos. 4. Colección de información sobre la historia natural y ecología de las especies seleccionadas de orquídeas. 5. Investigación demográfica sobre las orquídeas con diferentes historias de vida, para que puedan ser establecidos modelos para el manejo de otras especies. 6. Conocer los efectos demográficos y genéticos de fragmentación del hábitat. 7. Tipos de manejo necesarios para reforzar la preservación de la diversidad de orquídeas en sistemas agrícolas. Un punto fundamental a considerar para las orquídeas como alternativa de conservación ex situ, son las técnicas de Cultivo de Tejidos Vegetales, las cuales han resultado ser una herramienta valiosa en el estudio, la multiplicación y conservación de especies en peligro de extinción (helechos, cactáceas, orquídeas, compuestas, cícadas, etc.). Una de esas técnicas es la micropropagación, que puede usarse como una medida para lograr una producción controlada que podría abastecer una demanda comercial y con ello disminuir presiones sobre las poblaciones silvestres (Maxted, 1997; Rodríguez-Acosta, 2000). 2.5. CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES El Cultivo de Tejidos Vegetales es un término comúnmente utilizado para describir todos los tipos de cultivo in vitro de plantas; asimismo, es una herramienta biotecnológica cuyo fundamento se basa en la totipotencialidad celular, lo cual permite cultivar cualquier estructura vegetal, (protoplastos, células, callo, órganos disectados e incluso plantas enteras) en un medio de cultivo químicamente definido, pues está demostrado que cada célula viviente tiene el potencial genético para reproducir un organismo completo. La elaboración de este principio ha sido acreditada al fisiólogo en plantas alemán Haberlandt, quien fue el primero en explicar este término en 1902, y quien predijo que los tejidos, células y órganos pueden ser mantenidos en cultivo indefinidamente (Hartmann et al., 1990, Krikorian, 1995). Las técnicas de cultivo de tejidos vegetales han mostrado ser un importante procedimiento en la multiplicación, el mejoramiento y la conservación de las plantas útiles al hombre (Villalobos, 1985); sin embargo, 21 para que lo anterior sea posible, las células deben ser capaces de responder a los reguladores de crecimiento, es decir, ser competentes. (George y Sherrington, 1984). 2.5.1. Competencia morfogenética. La competencia celular en las plantas ha llegado a ser definida en diversos estudios como el potencial endógeno que tiene una célula o tejido para responder a una señal organogénica o de otra naturaleza, que activa una ruta particular de diferenciación, es decir, para desarrollarse de una manera particular a través de un tipo de programación interior o "memoria" (Christianson y Warnick, citado por Ellis y Bildebarck, 1989; Hartmann et al., 1990; Lackie y Dow, 1999; Segura, 2001; Taiz y Zeiger, 2002). La regeneración in vitro en tejidos de plantas puede ser separado dentro de los siguientes eventos de desarrollo: adquisición de competencia, inducción o determinación y expresión (Thorpe y Kumar, 1993). Las células, antes de llegar a ser competentes, deben cambiar o “desdiferenciarse” para responder a la nueva señal (Thorpe, 1995). Cuando lascélulas del explante alcanzan la competencia morfogenética, ésta es comparable a la desdiferenciación, esto quiere decir que se recobra la actividad meristemática de las células más o menos maduras a través del proceso inverso de la diferenciación de las células o tejidos. Dado que la diferenciación se refiere a los cambios morfológicos y fisiológicos en células y tejidos de un desarrollo relativamente no especializado (indiferenciado) a uno más especializado, la desdiferenciación serán los cambios morfológicos y fisiológicos donde las células con mayor o menor madurez recobran la actividad meristemática y alcanzan un estado competente (López, 2000). La determinación es un proceso por el cual el destino de desarrollo de una célula o grupo de células se organiza o se limita a una ruta de desarrollo particular (Thorpe, 1995), es la activación de un “mecanismo de memoria”, tal como se menciona en la definición de competencia, el cual se mantiene incluso cuando las condiciones que indujeron su adquisición son alteradas mediante manipulación ambiental (Azcón-Bieto y Talón, 2001). Así, después de asimilada la adquisición de la competencia por medio de la determinación, las células son llamadas entonces a ser expresadas y en algún punto del desarrollo la dirección es irreversible. En la fase de expresión, las células o tejidos experimentarán 22 organogénesis o embriogénesis, por medio de los cuales puede iniciarse la formación de raíces, brotes o flores según sea el caso (Sánchez-Espinosa et al., 2000). De acuerdo con Escamilla (2000), para evaluar la competencia morfogenética de los explantes se realizan estudios exponiendo los explantes a dos tipos de medio de cultivo, uno con reguladores de crecimiento (medio de inducción) y un segundo medio que es libre de hormonas (medio basal), y se pueden seguir dos métodos: el primero consiste en proporcionar pulsos a los explantes con altas concentraciones de reguladores del crecimiento, generalmente citocininas, estos pulsos pueden ser de horas o días, posteriormente los explantes son transferidos a un medio basal donde se expresa la respuesta morfogenética; el segundo método consiste en colocar los explantes en el medio basal durante diferentes tiempos, posteriormente se transfieren al medio de inducción donde se proporciona el pulso requerido para finalmente ser transferidos nuevamente a medio basal; el tiempo de inducción es proporcionado frecuentemente en altas concentraciones de citocininas, durante períodos cortos (pulsos), más que en bajas concentraciones por largos períodos. Lo anterior es posible gracias al uso de la micropropagación como herramienta eficaz para estudiar las respuestas morfogenéticas que expresa el explante utilizado. 2.5.2. Micropropagación. El término micropropagación es utilizado específicamente para referirse a la aplicación de las técnicas de Cultivo de Tejidos en la propagación de plantas iniciando con varias pequeñas partes de plantas creciendo asépticamente en un tubo de ensayo u otro contenedor (Hartmann et al., 1990). El principal uso de la micropropagación ha sido la producción masiva de plantas, extendiéndose desde plantas de vivero (como rododendro o rosa), ornamentales (como fucsia, orquídea o clavel), frutas (como manzanas o frambuesas) hasta verduras y cosechas del campo (como la coliflor, papa, o altramuces); además, cualquier sistema de micropropagación debe producir grandes cantidades de plantas uniformes que sean genotípicamente y fenotípicamente iguales a la planta original de la cual fueron producidas (Evans, 1990). En la micropropagación se dan los siguientes estadios de desarrollo: Estadio 0. Involucra que la planta donadora tenga un crecimiento vigoroso. Estadio 1. Involucra el diseño de un medio para estimular el inicio de la formación de brotes y su desarrollo, o la estimulación de yemas axilares preexistentes y su posterior desarrollo. Aquí la concentración empleada de citocininas y auxinas pueden ser proporcional, pero si el 23 sistema está sintetizando la auxina (o citocinina) adecuada, entonces sólo una citocinina (o auxina) puede ser necesaria. Estadio 2. Involucra el incremento o sostenimiento del nivel de producción de brotes o un enramado precoz. Esto se ha logrado generalmente por un incremento en el nivel de citocininas, pero puede ser preferible optar por una tasa baja de multiplicación por medio del uso de bajos niveles de citocinina, debido a que en el primer caso se puede provocar algún cambio genético. Estadio 3. Involucra el uso de auxinas para estimular el enraizamiento. Este estadio de desarrollo se hace generalmente bajo condiciones asépticas, sin embargo, es posible en muchos casos realizarlo ex vitro. Estadio 4. Transferencia final a ambiente natural (Krikorian, 1995). Los tres tipos principales de micropropagación que son empleados son: la activación de yemas preexistentes, organogénesis y embriogénesis somática (Bonga y Aderkas, 1992; Sánchez- Espinosa et al., 2000). Activación de yemas preexistentes. Este proceso ocurre normalmente cuando las yemas axilares son liberadas de la dominancia apical, principalmente por manipulación de las hormonas (especialmente las citocininas) en el medio nutritivo; el tipo de explante más frecuente es una pequeña sección con un entrenudo; el rango de formación de brotes axilares algunas veces se incrementa después de varios subcultivos (Bonga y Aderkas, 1992). Organogénesis. Órganos tales como brotes, hojas y flores pueden con frecuencia ser inducidos a formas adventicias sobre tejidos de plantas cultivadas; la creación de nuevas formas y organización, es denominada morfogénesis u organogénesis (George y Sherrington, 1984). Entre los diversos factores que afectan la diferenciación de estos brotes están la fuente del inóculo (tejidos jóvenes han mostrado mejores respuestas in vitro que los maduros), el medio de cultivo, que debe estar químicamente definido, factores físicos como el pH del medio, temperatura, luz, la condición física del medio y la humedad, los cuales influyen en el crecimiento y desarrollo organizado de los inóculos (Villalobos, 1985). Existen dos tipos de organogénesis • Organogénesis directa: Es el proceso cuando piezas relativamente grandes de plantas intactas son transferidas a medio nutritivo, donde nuevos brotes, raíces, embriones somáticos e incluso flores son frecuentemente formadas sin el crecimiento inicial de tejido calloso. 24 • Organogénesis indirecta: Es cuando el medio y los reguladores del crecimiento favorecen una rápida proliferación de células y la formación de callo a partir de un explante (George y Sherrington, 1984), y con esto obtener brotes con raíz a partir de ese callo, los cuales pueden ser removidos posteriormente para que puedan consolidarse como plantas completas (Krikorian, 1995). Embriogénesis somática. Es la formación de embriones adventicios, sin mediación de un proceso sexual, los cuales se originan de células individuales (Amaro et al., 1998). Dichas células son llamadas somáticas y sufren una diferenciación para llegar a formar una estructura bipolar conteniendo ejes radical y apical (Smith, 2000). En la embriogénesis somática los embriones son semejantes a los que se encuentran en las semillas que fueron generadas por reproducción sexual, y sólo requieren germinar también para formar una planta completa (Amaro et al., 1998). Las embriogénesis somática también pueden ocurrir por dos vías de desarrollo: vía directa, sin formación de callo, ó vía indirecta, con la mediación de tejido indiferenciado denominado callo (Sánchez-Espinosa et al., 2000). • Embriogénesis somática directa. La embriogénesis somática directa es la formación de embriones somáticos o tejido embriogenético directamente del explante sin la formación de una fase intermedia de callo. (Gamborg, 1968). • Embriogénesissomática indirecta. Los embriones somáticos o embrioides, pueden también ser producidos indirectamente en células desorganizadas y cultivo de tejidos. Los explantes que fueron embriogenéticamente predeterminados, pueden dar lugar a callo y a partir de ahí, a embriones somáticos como tales (George y Sherrington, 1984). En estudios recientes se afirma haber obtenido embriones somáticos de orquídeas a partir del cultivo in vitro de estructuras tales como hojas de Phalaenopsis amabilis (Chen y Chang, 1999), entrenudos y cortes de tallos florales de Oncidium “Sweet Sugar” (Chen y Chang, 2000a), regeneración a partir de callo de Phalaenopsis Nebula (Chen, Chang y Chang, 2000b), así como segmentos de raíces de Oncidium “Gower Ramsey” (Chen y Chang, 2001)). Las estructuras obtenidas a partir de la micropropagación de estas orquídeas no son reconocidas como PLBs, sino como embriones somáticos, y sin embargo en este trabajo se le seguirá reconociendo como PLBs a las estructuras parecidas a protocormos, de acuerdo a la nomenclatura utilizada por la mayoría de los investigadores para este tipo de estudios. 25 Finalmente, considerando que los recursos genéticos vegetales incluyen a todas las plantas útiles, podemos concluir que los métodos de CTV pueden aplicarse no solamente en el nivel terminal de la investigación en recursos genéticos (preservación del recurso), sino en forma amplia, en prácticamente todos los procesos de utilización de los recursos genéticos, tales como la propagación masiva, la obtención de plantas libres de virus, la inducción de la variabilidad genética in vitro, tanto la espontánea como la inducida por el uso de mutágenos, y la obtención de productos secundarios útiles (Rublúo, 1985). 2.5.3. Reguladores del crecimiento El concepto de hormona vegetal surge a partir de los experimentos de Darwin sobre el fototropismo de los coleóptilos, en los cuales se indicó la presencia de una señal de transporte. Esto llevó al descubrimiento de la auxina en 1928 y su posterior identificación como ácido indolacético (AIA) (Davies, 1995). Así, se tiene que una hormona vegetal o fitohormona es un compuesto orgánico que se sintetiza en alguna parte de una planta y que se trasloca a otra parte, en donde concentraciones muy bajas causan una respuesta fisiológica (Salisbury y Ross, 1994) Las fitohormonas tienen diferentes estructuras químicas y funciones, sin embargo, presentan algunas características comunes, estas son: 1) producidas en pequeñas cantidades; 2) activas a muy bajas concentraciones; y 3) sintetizadas comúnmente en una parte de la planta y traslocadas al sitio de acción (Arditti, 1992). A partir del conocimiento de las hormonas vegetales se logran obtener varias sustancias de forma natural y sintética, acuñándoles el nombre de Reguladores del Crecimiento Vegetal. Dichos reguladores son definidos como los compuestos sintéticos y hormonas de las plantas que modifican los procesos fisiológicos de las mismas; regulan el crecimiento imitando la acción de las hormonas, influyendo en la síntesis de hormonas, destrucción, traslocación o (posiblemente) modificando los sitios de acción hormonales (Hartmann et al., 1990). En el caso de las orquídeas, su aplicación fue guiada para promover la germinación de semillas y crecimiento de plantas (Arditti, 1967, citado por Martínez, 1985). Los cinco grupos principales de hormonas de plantas han sido caracterizados así: auxinas, citocininas, giberelinas, ácido abscísico y etileno. Existen reguladores del crecimiento adicionales que no se abordarán en este trabajo y que han sido descubiertos y utilizados recientemente, tales como las poliaminas, jasmonatos, el ácido salicílico, los brasinoesteroides y el péptido sistemina, 26 pero que se ha sugerido que pueden regular la floración, vernalización y senescencia (Hartmann et al., 1990; Arditti, 1992, Bonga y Aderkas, 1992; Davies, 1995; Barba, 2001). Para controlar el crecimiento y la diferenciación, los reguladores de crecimiento son añadidos al medio nutritivo o son suministrados en pulsos cortos antes del cultivo. Una vez asimilados por las células, los reguladores de crecimiento interactúan con las hormonas endógenas y si la célula es competente, es decir, que posea una habilidad fisiológica o de desarrollo para expresar una cierta característica o respuesta a un estímulo específico, seguirá una respuesta de crecimiento. Si embargo, para obtener la respuesta deseada, no siempre es necesario proveer reguladores de crecimiento externos. A veces, la respuesta apropiada puede obtenerse proporcionando factores físicos o químicos que afecten la movilización, producción o alteración de los reguladores de crecimiento endógenos (Bonga y Aderkas, 1992, Gamborg, 1968). 2.5.4. Auxinas. El nombre auxina proviene del griego auxein, que significa crecer; fue dado a la sustancia reguladora del crecimiento producida en el ápice del coleóptilo de avena. En general en las plantas, los reguladores de crecimiento se desplazan desde su lugar de síntesis con cierta dirección y con determinada velocidad; así, la traslocación de la auxina desde sus puntos principales de síntesis, que son los meristemos apicales, básicamente es hacia abajo (basipétalo). Los principales efectos de las auxinas en las plantas son el alargamiento y la división celular, la formación de brotes, raíces y tejido calloso, la respiración, abscisión, partenocarpia, dominancia apical, embriogénesis somática, etcétera. (Barba, 2001). Además, las auxinas influyen de forma decisiva en procesos como la diferenciación vascular, la formación de raíces adventicias, la dominancia apical y el desarrollo de frutos (Segura, 2001). Dentro de las auxinas naturales se encuentran el ácido indol-3-acético (AIA), distribuido ampliamente por todo el reino vegetal, el ácido fenilacético (detectado en tallos de tomate y girasol), algunos cloro-indoles en chícharo y el ácido indolbutírico (AIB). Debido a su relativa estabilidad y habilidad de resistir la esterilización por autoclave, las auxinas sintéticas son utilizadas ampliamente, las hay de naturaleza química muy diversa: ácidos indólicos, ácidos naftalénicos, clorofenoxiácidos (como el ácido 2,4-diclorofenoxiacético) y derivados de los ácidos benzoico y picolínico. Tienen, además, interés las llamadas antiauxinas (como el ácido p- 27 clorofenoxi-isobutírico) que, por su analogía estructural y carencia de efecto fisiológico, pueden inhibir la acción de las auxinas (Arditti, 1992). 2.5.5. Citocininas. Este grupo de hormonas de las plantas fue descubierto en 1955 cuando investigadores de la universidad de Wisconsin aislaron kinetina, una citocinina que no existe en la naturaleza (Arditti, 1992). Con el paso del tiempo se han logrado aislar e identificar más de 18 citocininas naturales, siendo una de ellas la zeatina (la más ampliamente distribuida), extraída del endospermo del maíz (Zea mays) (Barba, 2001). Se considera que las citocininas son sintetizadas mayoritariamente en zonas meristemáticas de las raíces; asimismo, no se excluye la participación de los órganos aéreos en el proceso de biosíntesis de estas hormonas, especialmente los tejidos meristemáticos, (Azcón-Bieto, 2001). Las citocininas se encuentran en todas las plantas con flor como sustancias libres o como parte del RNA. Los embriones y frutos jóvenes son especialmente ricos en citocininas, también han sido aisladas a partir de raíces y sus exudados, hojas, flores y otras partes de la planta (Arditti, 1992). Las citocininas naturales conocidas son derivados de la adenina (6-aminopurina). Todas ellas poseen un sustituyente, de naturaleza isoprenoide o aromática, en el nitrógeno amínico de la posición 6 del anillo de purina; las principales formas conjugadas de las citocininas son: nucleósidos (ribósidos), nucleótidos (ribótidos), glucósidos, alanilderivados y metiltioderivados.
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