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Aislamiento-de-plasmidos-de-bacterias-degradadoras-de-petroleo-del-Oeste-del-Golfo-de-Mexico

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
 
 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA 
 LOS REYES IZTACALA, EDO. DE MEX. 2006 
 
 
AISLAMIENTO DE PLÁSMIDOS DE BACTERIAS 
DEGRADADORAS DE PETRÓLEO DEL OESTE 
DEL GOLFO DE MÉXICO 
T E S I S 
 QUE PARA OBTENER EL TITULO DE: 
 B I O L O G O 
 P R E S E N T A: 
 GABRIELA CRUZ MAYORGA 
Asesor: M. en C. Jorge Manuel Romero Jarero 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Mientras los hombres sean libres para preguntar lo que deben; libres 
para decir lo que piensan; libres para pensar lo que quieran; la libertad 
nunca se perderá y la ciencia nunca retrocederá. 
 
Julius Robert Oppenheimer 
 
 
 
Navegar por el infinito mundo de la naturaleza 
es maravilloso, pero el haber surgido de ella es único. 
 
Gabriela Cruz Mayorga 
 
 
DEDICATORIA 
 
 
 
A mi mamá JUANITA, a mi papá ANGEL, por su infinito apoyo, 
comprensión, amor y sobre todo por haber creído siempre en mí, todos mis logros 
se los debo a ustedes por haberme enseñado a ser una persona responsable y capaz 
de enfrentar adversidades. Con todo mi AMOR y RESPETO.......... 
 
 
 
 
A mis hermanos ANGELES, REYNA e IVAN, quienes me han fortalecido, 
mis compañeros ante las adversidades, por estar a mi lado en todo momento y sobre 
todo por sus alegrías y tristezas que han llenado mi vida.......... 
 
 
 
 
A mi amado compañero, a mi gran amigo, a quien siempre esta a mi lado, a 
quien por su gran valor humano me hace sentir que nunca hay que dejarse vencer, 
porque la vida puso en mi camino a una maravillosa persona. A ti DAVID.......... 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
A la Universidad Nacional Autónoma de México por darme la oportunidad de 
cursar mis estudios de profesionales, en especial a la Facultad de Estudios Superiores 
Iztacala. 
 
 
Un sincero agradecimiento a los sinodales, por el valioso tiempo dedicado a la revisión 
de este trabajo y por las sugerencias que lograron enriquecerlo. 
 
 
Al M. en C. Jorge Manuel Romero Jarero, por la dirección, confianza y la oportunidad 
para realizar esta investigación en el Instituto de Ciencias del Mar y Limnología (ICM y 
L). 
 
 
Al Dr. Pedro Ramírez García por su sinceridad, seriedad y valiosas opiniones. 
 
 
Al Dr. Saúl Flores Maya por sus sugerencias tan oportunas y puntuales. 
 
 
A la M. en C. Elizabeth Ramírez Flores por tener siempre la disposición para atender 
mis dudas y por sus valiosas sugerencias. 
 
 
A la Biól. María Dolores Hurtado Bocanegra por sus comentarios precisos y sobre todo 
por su sinceridad. 
 
 
 
MÁS AGRADECIMIENTOS 
 
 
A la Dra. Pilar Negrete de la Universidad Autónoma Metropolitana por su valioso 
apoyo. 
 
A la M. en C. Ma. del Carmen Monroy Dosta y los Biólogos Verónica García Castillo y 
Raúl Gutiérrez Lucas de la Universidad Autónoma Metropolitana por su valiosa ayuda, 
interés y amistad. 
 
A Felipe, un gran compañero, por brindarme su amistad y gran apoyo. 
 
A la Ing. Edith de la Cruz del ICM y L, por su tiempo, interés y amistad. 
 
A la Lic. Dalia Badillo Pérez por conocerla en el momento preciso y por su enorme 
ayuda. 
 
A mis compañeras del laboratorio de microbiología marina, ICM y L, Berenice y 
Yamel, por su amistad. 
 
A mis compañeros que conocí durante esta maravillosa carrera (FES-IZTACALA), 
Xochilt, Leo, Daniela, Lupita, Manuel, Aarón, Luis y Luz por enseñarme el valor de la 
amistad a pesar de nuestras diferencias. 
 
A todas aquellas personas que de alguna manera me apoyaron a la realización de este 
trabajo. 
 
 
 
INDICE Pág. 
 
RESUMEN 
 
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1 
 
2. MARCO TEÓRICO......................................................................................................... 4 
Petróleo..............................................................................................................................4 
Contaminación por petróleo............................................................................................6 
Efectos que influyen sobre un derrame de petróleo en el medio ambiente marino .7 
Factores ambientales involucrados en la biodegradación de hidrocarburos.............8 
Bacterias hidrocarbonoclásticas ...................................................................................10 
Plásmidos que participan en la biodegradación de hidrocarburos ...........................12 
Rutas de Biodegradación...............................................................................................13 
 
3. ANTECEDENTES .......................................................................................................... 16 
 
4. HIPÓTESIS ..................................................................................................................... 18 
 
5. OBJETIVOS ................................................................................................................... 18 
 
6. ÁREA DE ESTUDIO ..................................................................................................... 19 
 
7. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................... 22 
Cuantificación.................................................................................................................22 
Aislamiento y Purificación de cepas bacterianas .......................................................24 
Tinción Gram..................................................................................................................25 
Aislamiento de plásmidos (Birnboin y Doly, 1979)..................................................25 
Electroforesis ..................................................................................................................26 
Identificación de las cepas bacterianas ........................................................................27 
 
8. RESULTADOS ............................................................................................................... 30 
Cuantificación.................................................................................................................30 
Obtención de cepas puras y Tinción Gram.................................................................40 
Aislamiento de plásmidos .............................................................................................42 
Identificación de las cepas bacterianas ........................................................................48 
 
9. DISCUSIÓN .................................................................................................................... 50 
 
10. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 63 
 
11. RECOMENDACIONES .............................................................................................. 6412. APÉNDICE ................................................................................................................... 65 
 
13. REFERENCIAS ............................................................................................................ 69 
RESUMEN 
 
La biodegradación de los componentes del petróleo se lleva a cabo por algunos 
microorganismos como las bacterias debido a su capacidad metabólica, la cual está regulada por 
genes que se encuentran en los plásmidos, estas bacterias son nombradas como 
hidrocarbonoclásticas. El presente trabajo se enfocó a una posible obtención de plásmidos presentes 
en bacterias hidrocarbonoclásticas obtenidas del Oeste del Golfo de México expuestas a un medio 
adicionado con petróleo. Para ello, el presente estudio se dividió en dos fases, que comprende el 
trabajo campo y laboratorio. Se realizó el muestreo durante la Campaña Oceanográfica OGM-1 a 
bordo del buque Oceanográfico “Justo Sierra” de la UNAM, se tomaron muestras de agua y 
sedimento en 56 estaciones en la zona Oeste del Golfo de México. Se realizaron diluciones tomadas 
en serie de 3 de las muestras de agua y sedimento, después fueron inoculadas en medio mineral con 
petróleo e incubadas a 25°C, estas muestras se analizaron siguiendo la técnica de cuantificación del 
número mas probable (NMP) a los tres meses del muestreo; las muestras positivas se sembraron en 
agar marino considerando la morfología de caja para la selección de las cepas. Para la purificación 
de las cepas se realizó el método de resiembra en placa y posteriormente la tinción Gram. 
Finalmente se realizó la técnica de Birnboin y Doly para el aislamiento de plásmidos basándose en 
una desnaturalización alcalina selectiva para el ADN cromosomal, mientras que el ADN del 
plásmido permanece. De acuerdo con los resultados obtenidos de la cuantificación se observaron 
concentraciones bajas que fluctuaron entre 3 x 101 a 2.1 x 103 NMP/100 ml de bacterias 
degradadoras de petróleo para las muestras de agua y en sedimento 3.6 x 105 y 1.5 a 2.8 x 106 
NMP/100 ml como concentraciones bajas, en cambio 4.6 x 107 NMP/100 ml como concentración 
alta de bacterias hidrocarbonoclásticas. Las mayores densidades de bacterias en este estudio, tanto 
para agua como para sedimento se presentaron frente a las desembocaduras de la Laguna Madre, la 
Laguna de Tamiahua y la Laguna de Alvarado. Todas las cepas puras aisladas de agua y sedimento, 
son del tipo Gram negativa y mostraron una morfología de bacilos, a excepción de la estación 21 
(sedimento), donde se observaron diplococos y en la estación 26 (agua) monococos. En el 
aislamiento de los plásmidos se detectó la presencia de estos, excepto en las cepas de las estaciones 
26 y 40 de las muestras de agua, presentando pesos moleculares con intervalos de 15 632 pb a 19, 
687 pb en las muestras de agua y para las muestras de sedimento de 18 841 pb a 21 546 pb, 
mencionándose como plásmidos degradativos. De acuerdo a la identificación de las cepas con 
presencia de plásmidos en las muestras de agua y sedimento, la mayoría pertenece al género 
Pseudomonas con las especies identificadas como P. putida, P. vesicularis, P. stutzeri y P. facilis, 
además se presentaron las bacterias Flavobacterium devorans en ambas muestras y sólo en las 
muestras de sedimento las bacterias Alcaligenes faecalis y Acinetobacter calcoaceticus, todas son 
reportadas como degradadoras de petróleo. La presencia de bacterias hidrocarbonoclásticas y los 
plásmidos presentes en ellas, hace evidente la actividad de la utilización de los hidrocarburos como 
fuente de energía por dichas bacterias, presentes en la zona Oeste del Golfo de México.
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 1 
 
1. INTRODUCCIÓN 
En los últimos 40 años la contaminación por petróleo o hidrocarburos ha sido uno 
de los problemas más graves en el ambiente marino debido a su explotación, transporte, 
derrames accidentales y en algunas ocasiones por filtraciones naturales, que afecta el 
crecimiento y el comportamiento de las comunidades biológicas, provocando desastres 
ecológicos que pueden ser irreparables (Jiménez, 2003). Cuando ocurre un derrame de 
petróleo, éste es degradado por diferentes procesos, físicos, químicos y biológicos (Fuentes, 
1994), dentro de estos uno de los principales procesos es la evaporación, que se produce 
rápidamente; los compuestos volátiles se evaporan de 5 a 10 días quedando generalmente 
compuestos alifáticos y aromáticos, los cuales forman en el agua una suspensión que 
finalmente es degradada por grupos de microorganismos. La velocidad a la que se producen 
los procesos mencionados dependerá del clima, el estado de mar (el oleaje, temperatura, 
corrientes marinas etc.) y el tipo de petróleo (Austin, 1988). 
 
La biodegradación de los componentes del petróleo o hidrocarburos es el resultado 
de la capacidad de algunos microorganismos de utilizar dichos compuestos como fuente de 
carbono y energía, lo que les permite sobrevivir en este medio (Margesin, 2003). Estos 
microorganismos están ampliamente distribuidos en la naturaleza, en lagos, ríos, suelos y 
océanos. Para el ambiente marino es determinante que existan estos microorganismos y 
sean capaces de aumentar su población en presencia de los hidrocarburos, esto se atribuye a 
diversos grupos de microbios como hongos, protozoarios, algas, levaduras y bacterias 
(Atlas, 1991). Entre dichos microorganismos se encuentra un grupo de bacterias 
heterótrofas llamadas degradadoras de petróleo o hidrocarbonoclásticas, las cuales están 
ampliamente distribuidas en el mar y actualmente se conocen varias de ellas (Lizárraga, 
1996). Destacan los géneros Achromobacter, Arthrobacter, Acinetobacter, Vibrio, 
Flavobacterium y Pseudomonas, este último género es el más estudiado con relación a la 
degradación de hidrocarburos (Atlas, 1981). 
 
 
 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 2 
 
La degradación de hidrocarburos se lleva a cabo por la actividad metabólica de las 
bacterias hidrocarbonoclásticas, de acuerdo con diversos análisis genéticos se han 
encontrado que los genes que regulan el catabolismo de los hidrocarburos se encuentran en 
los plásmidos (moléculas extracromosomales de ADN, bicatenario, circular, con 
replicación independiente) presentes en su citoplasma (Puertas, 1992). La etapa inicial de la 
biodegradación de los hidrocarburos esta dirigida por enzimas sintetizadas por los 
plásmidos (Yano, 1980). Dichas bacterias se desarrollan favorablemente en los vertidos de 
petróleo, e incluso, su crecimiento puede acelerarse mediante la adicción de nutrientes 
inorgánicos como fósforo y nitrógeno; las bacterias oxidadoras de hidrocarburos aumentan 
su número de 103 a 106 veces (Alexander, 1994). 
 
El estudio de plásmidos involucrados en el metabolismo de hidrocarburos provee 
algunas perspectivas en cuanto a la funcionalidad y transferencia a las células hijas, así 
como la función que los plásmidos han tenido en la evolución de cepas bacterianas mejor 
adaptadas (Shapiro et al., 1980). Dichos estudios han reportado que el material 
extracromosomal de ciertas cepas de Pseudomonas presentan un tamaño aproximado de 30 
Kb, por su amplia forma degradativa hacia los hidrocarburos (Colín, 1997). 
 
Un alto porcentaje de bacterias marinas aisladas de sedimentos marinos, estuarios y 
ecosistemas pelágicos presentan con frecuencia plásmidos que les confieren la capacidad de 
degradar el petróleo, en algunos estudios se han identificado uno o más plásmidos en más 
del 52 % de estas bacterias. En el Golfo de México se han realizado investigaciones en las 
que se reportan la presencia de plásmidos degradativos, los cuales se relacionan con la 
utilización de hidrocarburos (Sobecky, 2002). 
 
En la actualidad las aguas litorales encaran problemas de contaminación, que están 
produciendo serios daños. Esta contaminación se encuentra en relación directa con el aporte 
de contaminantes que llevan los ríos, explotacionespetroleras y descargas de ciudades 
costeras al océano (Vizcaíno, 1986). 
 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 3 
 
Desde 1970, para llevar acabo o aplicar procesos de biorestauración en sistemas 
acuáticos se han usado procesos de degradación microbiana para limpiar el ambiente 
contaminado (Chapell, 1998). A partir del descubrimiento de que diversos tipos de 
microorganismos pueden llevar a cabo la fragmentación o degradación de hidrocarburos en 
diversos ambientes, los estudios referentes al tema se han incrementado. 
 
El presente estudio esta enfocado al aislamiento de plásmidos, que es el material 
genético relacionado con la degradación de los hidrocarburos, es decir, ADN 
extracromosómico que ayuda a la bacteria a la metabolización de compuestos de carbono, 
sólo algunos microorganismos como las bacterias hidrocarbonoclásticas (llamadas así por 
su adaptación y alimentación) tienen esta capacidad. Alrededor del mundo se han hecho 
estudios moleculares en relación a los plásmidos, entre los más estudiados se encuentran los 
resistentes a antibióticos, sin embargo, las comunidades científicas desde los años 40 no 
sólo se preocupan por la salud del hombre sino también por la del medio ambiente, se han 
percatado del deterioro ambiental que día a día se incrementa, por ende los plásmidos 
degradativos constituyen un factor importante en la recuperación del ambiente, sobre todo 
en zonas afectadas por el hombre, debido a los significativos aportes de hidrocarburos que 
se dan por diversos factores como los derrames de petróleo en el mar. La presencia de las 
bacterias hidrocarbonoclásticas permitirá el aislamiento de los plásmidos que contribuirá de 
manera general a afirmar la presencia de este tipo de plásmidos en las bacterias de esta zona 
(oeste) del Golfo de México que no ha sido estudiada, con la finalidad de contribuir a 
estudios de biorestauración. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 4 
 
 
2. MARCO TEÓRICO 
 Petróleo 
En la actualidad, la principal fuente de energía para la industria es el petróleo y el 
contaminante más persistente en el ambiente marino. Este proviene de plantas y animales 
prehistóricos, por lo que también se le conoce como combustible fósil (Rodríguez, 2000). 
 
Los principales componentes del petróleo son los hidrocarburos, los cuales son 
compuestos químicos que contienen únicamente hidrógeno y carbono. El carbono (80-87%) 
y el hidrógeno (10-15%) son los principales y más abundantes elementos del petróleo (98% 
de su composición total), aunque otros como el azufre (0-10%), nitrógeno (0-1%) y el 
oxígeno (0-5%) están presentes en menores cantidades (Botello et al., 1996). Los 
hidrocarburos van desde aquellos cuya molécula contienen un solo átomo de carbono hasta 
los que están constituidos por decenas o aún centenas de átomos de carbono, ya sea como 
cadenas o anillos. Todos forman una gran familia de compuestos orgánicos de los que 
existen más de 1,000 compuestos (Pathaik, 1997). La composición del petróleo puede 
variar dependiendo de la fuente de los materiales, las presiones, las temperaturas, la 
estructura química de las rocas, etc. (Canales, 1998). 
 
Los hidrocarburos, que en una mezcla específica constituyen el petróleo (figura 1), 
se clasifican en alifáticos, alicíclicos y aromáticos, clasificación que, a su vez, se subdivide 
de la siguiente manera: 
 alcanos (1) 
 Alifáticos alquenos (2) 
 alquinos (3) 
 
 cicloalcanos (4) 
 Hidrocarburos Alicíclicos cicloalquenos (5) 
 
 bencénicos (6) 
 Aromáticos polifenilos (7) 
 polinucleares (8) 
 
 
Figura 1. Subdivisión de los hidrocarburos (Albert, 1988). 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 5 
 
(1) Alcanos (compuestos de cadena lineal) 
 
 
 
 
 
 
 
 (2) Alquenos y (3) Alquinos (contienen dobles o triples ligaduras en la cadena) 
 
 (2) (3) 
 
 
 
 
(4) Cic loalcanos (compuestos cíclicos) (5) Cicloalquenos (doble enlace) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
(6) Bencénicos (derivados alifáticos y (7) Polifenilos (dos o más anillos bencénicos) 
 alicíclicos, compuestos anillados) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 (8) Polinucleares (dos o más anillos fusionados) 
 
 
 
 
Metano CH4 
Etano CH3-CH3 
Propano CH3-CH2-CH3 
Butano CH3-CH2-CH2-CH3 
Pentano CH3-CH2-CH2-CH2-CH3 
Hexano CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3 
Heptano CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3 
Octano CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3 
Nonano CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3 
Decano CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3 
Acetileno HC≡CH 
2-Butino CH3-C≡C-CH3 
Etileno CH2 =CH2 
Propileno CH2 =CH-CH3 
1-Buteno CH2 =CH-CH2-CH3 
1,3 
ciclopentadieno 
 
ciclohexeno 
 
ciclopropano 
 
ciclohexano 
 
 
tolueno 
 
 
 
estireno 
 
bifenilo 
 
trifenilo 
 
antraceno 
 
benzantraceno 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 6 
 
 Muchos de los hidrocarburos están sujetos a la biodegradación, principalmente esta 
en función del tipo y tamaño de la molécula del hidrocarburo. Los alcanos de cadena 
intermedia (C10-C24) son degradados rápidamente, mientras que los de cadena corta 
resultan tóxicos para muchos microorganismos, pero generalmente estos hidrocarburos se 
evaporan rápidamente. Por otra parte, los compuestos aromáticos son degradados más 
lentamente que los alcanos (Yánez, 1995). 
 
Contaminación por petróleo 
 
Actualmente la explotación y el transporte del petróleo son las principales fuentes 
de contaminación por hidrocarburos en el ambiente marino. Se calcula que 
aproximadamente el 60% de la producción mundial de petróleo se transporta por vía 
marítima (2.2 millones de toneladas de petróleo anualmente) y que el 0.1% de él se derrama 
accidentalmente en el mar (tabla 1) (Albert, 1988). Las descargas de desechos industriales y 
municipales, así como filtraciones naturales de petróleo en el mar, también son fuentes 
importantes de contaminación (Botello et al., 1996). 
 
Tabla1.- Accidentes por derrame de petróleo en el mar (Albert, 1988; Munn, 2004). 
 
Año Lugar 
1962 Ensenada de Cook, Alaska, EUA 
1970 Golfo de México, Costas de Campeche 
1976 Arnoco Cádiz (buque italiano), Gran Bretaña, Francia 
1979 Pozo Ixtoc, Golfo de México, Campeche 
1985 Ranger Texas (plataforma marina, EUA), Golfo de México 
1989 Exxon Valdez (buque petrolero), Alaska 
1991 Guerra del Golfo (Golfo Pérsico) 
2002 Prestige (buque petrolero), Costas de Galicia, España 
2004 Río y playa Coatzacoalcos, Veracruz, Golfo de México 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 7 
 
Efectos que influyen sobre un derrame de petróleo en el medio ambiente 
marino 
 
 Después de una descarga o derrame de petróleo en el mar, se forma una delgada capa 
de este compuesto sobre la superficie del agua. Sobre esta capa actúan factores físicos, 
químicos y biológicos como (figura 2): 
 
 -Evaporación: La pérdida de muchas moléculas de hidrocarburos de bajo peso 
molecular (10 átomos de carbono o menos) de la superficie de las manchas de aceite es muy 
rápida. Cuanto más agitado es el estado del mar, más rápido será este proceso. 
 
 -Dispersión: La tasa de dispersión depende en gran medida de la naturaleza y 
constitución del petróleo derramado, incrementándose en presencia del oleaje y los vientos. 
Aquellos conglomerados de petróleo que no puedan dispersarse de manera efectiva debido 
a su grosor, pueden persistir por varias semanas en la superficie o bien ser transportados 
hacia las playas más cercanas endonde son depositados. 
 
 -Disolución: Un hidrocarburo será más soluble en el agua cuanto menor sea su peso 
molecular y mayor su polaridad. Se calcula que las solubilidades en el agua de mar son 
25% menores en relación a las aguas dulces, debido al efecto de las sales. Los 
microorganismos pueden producir compuestos más solubles en el medio marino. 
 
 -Emulsificación: El petróleo en el agua puede formar una emulsión llamada “crema de 
chocolate”, que se forma después de su disolución y alteración química de sus componentes 
lo que se facilita por la presencia de compuestos tensoactivos en el agua. 
 
 -Sedimentación: Se produce cuando los componentes del petróleo se agregan en 
conglomerados o residuos de mayor densidad a la del agua del mar. 
 
 -Biodegradación: Es considerada el principal proceso, en el que los compuestos 
orgánicos son transformados a productos inorgánicos como bióxido de carbono, agua y 
sales minerales, efectuado por organismos. En ecosistemas naturales, la biodegradación de 
los compuestos orgánicos se presenta como una opción viable para el tratamiento de agua y 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 8 
 
suelos marinos contaminados por dichos compuestos químicos (Rodríguez, 2000) (Botello 
et al., 1996). 
 
Figura 2.- Diagrama de los procesos más importantes después de un derrame de petróleo en el océano. 
 
Factores ambientales involucrados en la biodegradación de hidrocarburos 
 
Oxígeno 
 La mayoría de los microorganismos degradadores de hidrocarburos involucran el 
oxígeno (actúa como aceptor de electrones), principalmente en el paso inicial de la 
degradación, en la cual implica una enzima oxigenasa, por lo que se considera un proceso 
aerobio (Rojas, 1997; Piña, 2004). La cantidad requerida de O2 por bacterias depende del 
tipo de hidrocarburo a degradar (tabla 2) (Fuentes, 1994). De acuerdo con Canales (1998) la 
demanda teórica de oxígeno es de 3.5 mg para oxidar 1 mg de petróleo. Los 
microorganismos requieren altas cantidades de oxígeno para romper las cadenas y anillos 
que forman los hidrocarburos (Piña, 2004). Generalmente la concentración de oxígeno en el 
agua de mar es de 8.6 mg/l y la concentración máxima es de 14.6 mg/l (Grant y Long, 
1989). 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 9 
 
 Por otra parte, la biodegradación anaeróbica de hidrocarburos no esta descartada, 
aunque es poco común en la naturaleza (Testa y Winegardner, 1991). 
 
Tabla 2.- Cantidades de Oxígeno (mg) requerido por bacterias para oxidar 1 mg de 
hidrocarburo a dióxido de carbono y agua (Fuentes 1994). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Temperatura 
La degradación de los hidrocarburos por bacterias puede ocurrir en un amplio rango 
de temperaturas, sin embargo, se ha reportado que hay una mayor degradación entre 25-35 
°C ya que contribuye a acelerar e incrementar las reacciones bioquímicas de los 
organismos, y facilita la evaporación de hidrocarburos tóxicos para las bacterias (Austin, 
1988). Por otro lado Pilpel (1968) puntualiza que no ocurre degradación en las regiones 
polares, sin embargo, Zobell (1973) reportó biodegradación a una temperatura de 0 °C. 
Margesin (2003) menciona que los microorganismos están bien adaptados a 0 °C y que hay 
degradación de hidrocarburos aunque en un bajo porcentaje (10-20 %). 
 
Fósforo y Nitrógeno 
Son nutrientes inorgánicos que usualmente están disueltos en el agua. Contribuyen 
al crecimiento de la población bacteriana. Las capas superiores del mar contienen un 
máximo de 0.1 mg/l; se ha calculado que las cantidades de 6-60 mg de nitrato y 1-10 mg de 
fosfato son necesarios para que degraden 1g de petróleo (Alexander, 1994); la carencia de 
estos nutrientes limita la actividad bacteriana. Se reporta la utilización de fertilizantes con 
fósforo y nitrógeno para estimular la biodegradación del petróleo (Chapelle, 1998). 
Hidrocarburo O2 (mg) 
etano 1.3 
hexano 3.53 
benceno 3.08 
tolueno 3.13 
xileno 3.17 
naftaleno 3.00 
octano 3.5 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 10 
 
PH 
El pH afecta el comportamiento de las funciones celulares, transporte en la 
membrana celular y el equilibrio de las reacciones catalizadas de los microorganismos. El 
pH es constante en el mar, sin embargo, se determina un intervalo entre 7.5 y 8 para 
contribuir a la degradación del petróleo por bacterias (Barry et al., 1992). 
 
Bacterias hidrocarbonoclásticas 
 
Las bacterias en base a su metabolismo se dividen en autótrofas (obtienen su energía 
de la luz solar) y heterótrofas (obtienen su energía de la descomposición de materia 
orgánica). Dentro de las heterótrofas encontramos bacterias que llevan acabo la degradación 
de hidrocarburos, los cuales son utilizados como fuente de carbono y energía, a este grupo 
de bacterias se les denomina hidrocarbonoclásticas o degradadoras de petróleo, las 
podemos encontrar tanto en ambientes terrestres como marinos (Fuentes, 1994). 
 
Las bacterias hidrocarbonoclásticas poseen enzimas que permiten la oxidación de 
los hidrocarburos del petróleo. Esta oxidación cambia las propiedades de los compuestos, 
facilitando su conversión a bióxido de carbono y agua (Atlas, 1993). Dicha oxidación 
disminuye la toxicidad del petróleo y aumenta su solubilidad en agua, incrementando la 
biodisponibilidad (García, 1985). Con base en esto debe tomarse en cuenta que bajo 
condiciones favorables las bacterias hidrocarbonoclásticas degradan prácticamente 
cualquier hidrocarburo presente en el medio, desde alcanos hasta aromáticos (Fuentes, 
1994). 
 
Generalmente los ecosistemas marinos presentan bacterias hidrocarbonoclásticas, 
estas comprenden menos del 1% de la comunidad bacteriana, sin embargo, se incrementan 
hasta un 10% después de que el ambiente ha sido contaminado con petróleo (Atlas, 1991). 
Hay un período de aclimatación para que las bacterias empiecen el proceso de degradación, 
y presente dicho incremento, el cual puede aparecer de 1 a 4 semanas dependiendo de la 
cantidad de microorganismos y del tipo de hidrocarburos presentes (Testa y Winegardner, 
1991). 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 11 
 
 Se han identificado más de 20 géneros de bacterias capaces de degradar los 
hidrocarburos (tabla 3) (Atlas, 1981). Entre las bacterias hidrocarbonoclásticas más 
frecuentes y estudiadas se encuentran las del género Pseudomonas destacando las especies 
putida y aeruginosa las cuales crecen en alcanos. Otro ejemplo es el género 
Achromobacter, que presenta una notable capacidad de degradar hidrocarburos aromáticos 
(Valderrama, 1990). La diversidad de este tipo de bacterias se debe a que su capacidad de 
metabolizar los diferentes compuestos orgánicos del petróleo no esta restringida a un solo 
género y especie. 
 
Tabla 3.- Bacterias identificadas en la degradación de compuestos derivados del petróleo 
(Fuentes, 1994) (Valderrama, 1990). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Género Especie Compuesto degradado 
Acinetobacter sp. n-alcanos 
 baumani hidrocarburos saturados y aromático 
 calcoaceticus bifenilos policlorados 
Achromobacter sp. bifenilos policlorados 
Alcaligenes sp. petróleo crudo 
Flavobacterium devorans bifenilos policlorados 
Marinobacter aquaelolei petróleo crudo 
Nocardia sp. dibenzotiofeno 
Pseudomonas sp. tolueno 
 bifenilos policlorados 
 fenantreno 
 petróleo crudo 
 aeruginosa fenol 
 n-alcanos 
 fluorescens petróleo crudo 
 putida n-alcanos 
 tolueno 
 stutzeri tetracloroetileno 
Rhodococcus sp. dibenzotiofeno 
 alcanos 
Micrococcus sp. petróleo crudo 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 12 
 
Plásmidos que participan en la biodegradación de hidrocarburos 
 
 Muchas bacterias poseen pequeñas moléculas extracromosomales de ADN 
llamados plásmidos. Son moléculas súper helicoidales, generalmente circulares, 
covalentemente cerradas que se replican independientemente del cromosoma de la bacteria 
y controlan su propio número de copias, además muchos de los plásmidos se puedentransmitir de una célula a otra por medio del proceso de conjugación (Brent et al., 1991; 
Jonson y Woodford, 1998). Los plásmidos presentan genes que no son esenciales para las 
actividades normales de las bacterias, sin embargo, codifican funciones útiles para las 
células bajo ciertas circunstancias ambientales y permiten que la bacteria se adapte (Jonson 
y Woodford, 1998; Singleton, 2004), por ejemplo los plásmidos R, con genes que confieren 
resistencia a antibióticos; el plásmido Col, con genes que producen bacteriocinas; genes 
resistentes a metales pesados, etc. (Sumners, 1996; Prescott, 2003). 
 
 Los plásmidos que le confiere a las bacterias la capacidad para degradar 
hidrocarburos, son llamados degradativos o catabólicos los cuales han sido nombrados de 
acuerdo al hidrocarburo que degradan; entre los más estudiados se encuentra OCT, CAM, 
NAH, SAL y TOL (tabla 4) (Bull y Meadow, 1979; Goodfellow y O’Donnell, 1993). 
Dichos plásmidos presentan genes que codifican para enzimas que permiten a la célula 
utilizar a los hidrocarburos, estas enzimas se encargan de la degradación de los sustratos 
hasta compuestos cercanos al metabolismo central de la bacteria (Sumners, 1996). 
 
 Este tipo de plásmidos (degradativos) se han clasificado con base en la 
incompatibilidad, la cual se define como la inhabilidad que tienen dos plásmidos para 
coexistir en la misma célula (Scaife, 1985). A partir de la incompatibilidad se han formado 
grupos (denominados Inc) de plásmidos, por ejemplo, los que degradan alcanfor (CAM) y 
n-alcanos (OCT) están dentro del grupo IncP-2. Los plásmidos que degradan naftaleno 
(NAH) y tolueno (TOL) están en el grupo IncP-9 (Shapiro et al., 1980); el TOL es el más 
estudiado de los plásmidos degradativos (Yánez, 1995). 
 
Por otra parte los plásmidos degradativos han sido aislados de distintos géneros 
bacterianos, presentes en ambientes terrestres y marinos; el género Pseudomonas es el más 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 13 
 
relacionado con dichos plásmidos (Yánez, 1995). Los pesos moleculares de estos plásmidos 
han sido reportados entre 8 y 160 Kb (Prescott, 2003). 
 
Tabla 4.- Plásmidos degradativos y componente de hidrocarburo que degradan (Shapiro et al., 
1980). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Rutas de Biodegradación 
 
Las bacterias hidrocarbonoclásticas degradan por diversas vías metabólicas los 
distintos componentes del petróleo como benceno, tolueno, xileno, naftaleno y compuestos 
alifáticos. En el proceso de degradación, se da una oxidación de los sustratos hasta 
compuestos que entran al ciclo de Krebs (Canales, 1998). La ruta que se produce para 
degradar alcanos (figura 3) puede ocurrir por varios mecanismos, uno de ellos y él más 
frecuente se da por medio del ataque de una enzima oxigenasa al grupo metilo terminal 
donde el oxígeno se incorpora formando un alcohol primario, que posteriormente es 
oxidado a un aldehído y finalmente a un ácido graso (A). Algunas bacterias atacan 
subterminalmente al alcano (B), el oxígeno es insertado en un átomo de carbono dentro de 
la cadena a un lado del extremo formando un alcohol secundario que por oxidación es 
metabolizado a una cetona y después a un acetilester, en el cual se rompe el enlace dando 
 
 
Plásmidos Sustrato 
CAM alcanfor 
OCT octano 
SAL salicilato 
NAH naftaleno 
TOL tolueno 
 m-xileno 
 p-xileno 
pAC21 p-clorobifenil 
pAC25 3-clorobenzoato 
pJP1 2,4-diclorofenol 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 14 
 
finalmente un alcohol primario más ácido acético para ser metabolizado posteriormente por 
la vía de la β-oxidación. El alcohol primario antes producido es oxidado a un aldehído y 
finalmente a un grupo carboxilo, obteniéndose un ácido graso. Los ácidos grasos son 
rápidamente metabolizados por vía β-oxidación para formar acetil-CoA (Grant y Long, 
1989; Atlas, 1996; Kirchman, 2000). 
 
Los hidrocarburos aromáticos como el tolueno son oxidados a benzoato y este a 
catecol el cual es abierto por medio de un rompimiento meta, resultando semialdehído 
hidroxi-cis-mucónico. El metabolismo posterior conduce a la formación de ácido fórmico, 
ácido pirúvico y acetaldehído. Alternativamente, el anillo de catecol puede ser abierto por 
rompimiento oxidativo orto resultando un ácido cis-mucónico, este finalmente es oxidado a 
ácido succínico y acetil-CoA, intermediarios comunes del ciclo de los ácidos tricarboxílicos 
(figura 4) (Shapiro et al., 1980). 
 
 
 
 
Figura 3.- Rutas metabólicas para la degradación de alcanos por bacterias hidrocarbonoclásticas 
(Atlas, 1996; Kirchman 2000). 
 
 
 
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Figura 4.- Ruta de oxidación para Tolueno (Yañez, 1995). 
Enzimas codificadas por el plásmido: XO = xileno oxidasa, BADH = Benzil alcohol 
deshidrogenasa, BZDH = Benzaldehído deshidrogenasa, TO = Toluato oxidasa, C230 = catecol 
2,3-oxigenasa, HMSH = 2, semialdehido hidromucónico hidrolasa. Enzimas codificadas por el 
cromosoma: BO = benzoato oxidasa, C120 = catecol 1,2-oxigenasa, MLE = Enzima muconato 
lactonizante, MI = muconola ctona isomerasa, ELH = Lactona enol hidrolasa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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3. ANTECEDENTES 
Se han realizado diversos estudios en torno a las bacterias hidrocarbonoclásticas en 
varios países. En el Golfo de México también han sido estudiadas en lo que se refiere a 
taxonomía, abundancia y en menor grado aspectos moleculares. 
 
La biodegradación de petróleo por bacterias fue adquiriendo especial atención a 
partir de los años 70’s por su gran potencial de restauración en ambientes contaminados 
(Bogan et. al, 2003). 
 
Al-Hadhrami et al. en 1995 reportaron una comunidad formada por 8 cepas 
bacterianas aisladas de muestras de sedimento contaminado del Golfo de Oman, Arabia, 
presentaron un 75% de “mousse” en un período de 60 días. Dichas muestras fueron 
preparadas en agua de mar con petróleo. 
 
Ramsay et al. en el 2000 realizaron un estud ió en la costa de Queensland, Australia, 
reportaron que la adición de aceites en sedimento estimuló el número de bacterias 
degradadoras de alcanos incrementándose de 105 a 108 células/g de sedimento; el número 
de bacterias degradadoras de aromáticos se incrementó de 104 a 106 células/g de sedimento 
en un lapso de 90 días. Se aislaron las cepas de los géneros Aeromonas, Alcaligenes, Vibrio, 
Pseudomonas, Alteromonas y Moraxella. 
 
Pereira et al. en el 2002 reportaron un rápido incremento en la población de 
bacterias degradadoras de petróleo en sedimento marino de la bahía de Galicia impactado 
por petróleo crudo, utilizaron la técnica del NMP para la cuantificación, y confirmaron la 
presencia e importancia de este tipo de bacterias. 
 
Leahy et al. en 1990 reportaron que existe relación entre la capacidad de 
degradación de hidrocarburos y los plásmidos aislados de 242 cepas de bacterias marinas de 
sedimento obtenidas del Golfo de México, Campeche, sitio con altas concentraciones de 
hidrocarburos debido a una contaminación crónica. 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 17 
 
Sobecky en el 2002 informó un alto porcentaje de bacterias aisladas de ambientes 
marinos como estuarios, columna de agua, sedimentos etc. en presencia de hidrocarburos 
que muestran plásmidos. 
 
Hada y Sizemore en 1981 reportaron plásmidos aislados de bacterias de una zona 
con actividad de hidrocarburos del noroeste del Golfo de México. 
 
Pleshakova et al. en el 2001 reportaron que la bacteria Acinetobacter calcoaceticus 
es eficiente en la degradación de los componentes de varios aceites como alcanos e 
isoalcanos, esta cepa tiene plásmidos de 120, 9 y 8 Kb, que puede sertransferido de una 
célula a otra, e incluso, a bacterias del género Pseudomonas. 
 
Zhong et al. en el 2002 realizaron una investigación en la bahía de San Diego, 
California, en este estudio se encontró el plásmido de 50 Kb presente en Micrococcus el 
cual fue aislado de sedimento marino impactado por petróleo. 
 
Jiménez en el 2003 reportó para la zona del Golfo de México, Campeche, la presencia 
de plásmidos en bacterias Pseudomonas con pesos moleculares de 10,000 pb, los cuales 
menciona como degradativos. 
 
De acuerdo con los datos encontrados por Lizárraga et al. en 1991 en el Golfo de 
México (Campeche), mencionan que hay altos índices de bacterias hidrocarbonoclásticas, 
lo cual representa una intensa biodegradación de hidrocarburos en esta zona de extracción 
de petróleo, debido a la capacidad degradativa de las bacterias la cual se atribuye a los 
plásmidos. En otras áreas del Golfo de México se plantea la posibilidad de desarrollar un 
estudio de acuerdo con los antecedentes, encaminado a establecer qué bacterias 
hidrocarbonoclásticas se presentan y la relación con la presencia de plásmidos que les 
confieren la capacidad para degradar hidrocarburos en la zona del Oeste del Golfo. Para 
este lugar aún no se ha reportado un estudio en relación a los plásmidos involucrados en la 
degradación del petróleo así como el peso molecular que presentan dichos plásmidos. 
 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 18 
 
4. HIPÓTESIS 
La biodegradación de los diferentes hidrocarburos en ambientes marinos está en 
función principalmente de microorganismos especializados, los cuales son capaces de 
utilizar los hidrocarburos como fuente de energía, de acuerdo con lo anterior se propone que 
puedan aislarse bacterias degradadoras de petróleo de las muestras de agua y sedimento 
marino impactados por petróleo, por lo tanto es posible encontrar plásmidos presentes en 
ellas a los cuáles se les confiere dicha capacidad. 
 
5. OBJETIVOS 
Objetivo General: 
 
♦ Determinar la presencia de plásmidos en bacterias degradadoras de petróleo obtenidas 
de muestras de agua y sedimento del Oeste del Golfo de México. 
 
Objetivos particulares: 
 
• Determinar cuantitativamente las bacterias degradadoras de petróleo, de las muestras 
de agua y sedimento mediante la técnica del Número Más Probable en el área de 
estudio. 
 
• Obtener cepas puras de bacterias hidrocarbonoclásticas aisladas de las muestras de 
agua y sedimento. 
 
• Obtener plásmidos de las diferentes cepas aisladas de agua y sedimento. 
 
• Determinar el peso molecular de los plásmidos extraídos de las cepas bacterianas 
obtenidas de agua y sedimento. 
 
• Identificar las cepas bacterianas con presencia de plásmidos de las muestras de agua 
y sedimento. 
 
 
 
 
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6. ÁREA DE ESTUDIO 
El área de estudio se localiza en el sector oeste del Golfo de México (figura 5), 
frente a las costas de Tamaulipas y Veracruz en las coordenadas 26°00’00’’ latitud norte, 
94°00’00’’ longitud oeste. 
 
Tamaulipas cuenta con ríos importantes que corren en dirección al Océano (Golfo 
de México) tal es el caso de los ríos, Bravo, Soto La Marina, San Fernando y Pánuco; las 
lagunas más sobresalientes son Laguna Madre, El Barril, Almagre, Morales y San Andrés 
(García, 2001). La plataforma continental de Tamaulipas es una región donde el desarrollo 
industrial y petrolero ha tenido gran auge en los últimos 40 años. Se caracteriza por ser una 
zona de filtraciones naturales de petróleo, además de poseer una alta dinámica costera como 
es el caso del Anticiclón Mexicano (Ponce et al., 1994). Parte de la economía de 
Tamaulipas esta basada en la producción de camarón alcanzando las 16,000 toneladas por 
año (Vázquez, 2000). 
 
 La mayor parte del territorio de Veracruz se extiende por la planicie costera del 
Golfo de México, lo rigen importantes ríos Tuxpan, Tecolutla, Papaloapan y Coatzacoalcos 
descargando sus aguas al mar; las lagunas más sobresalientes son Tamiahua y Alvarado 
(Anuario estadístico, 1997). Económicamente es destacable la explotación comercial del 
ostión que produce alrededor de 40,000 toneladas en un año (Vázquez, 2000). 
 
La zona de estudio (Tamaulipas–Veracruz) se caracteriza por la presencia de lodos 
de origen terrígeno cuya presencia se debe a la gran cantidad de ríos que desembocan en 
esta área del Golfo (Vázquez, 2000). Los sedimentos superficiales de la plataforma son 
lodo y arenas finas; la plataforma en esta región es estrecha, generalmente menor a 50 Km. 
de ancho y finaliza a una profundidad de 100 m. (Hernández, 1999). 
 
El área recibe la influencia de la compleja hidrodinámica que ésta determinada por 
los patrones de circulación general que prevalecen a lo largo del Golfo de México, ya que 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 20 
 
por sus dimensiones y sus características de cuenca semicerrada es el gran mar interior del 
Atlántico tropical y un verdadero mediterráneo entre las Américas del Norte y del sur 
(Botello et al., 1996). Se extiende en un área total de 1 768 000 Km. con regiones muy 
profundas mayores a 3 400 m. (De la Lanza, 1991). Almacena cerca de 2.3 x 106 Km3 de 
agua en donde se presentan diversos procesos físicos, químicos y biológicos (corrientes 
oceánicas, anillos ciclónicos y anticiclónicos, huracanes, nortes, etc.). 
 
La circulación del Golfo esta relacionada con la influencia de las aguas cálidas y 
salinas que constituyen la corriente de Lazo la cual entra a través del Canal de Yucatán; a 
su paso por la cuenca, las corrientes forman anillos que se desplazan al interior con una 
circulación anticiclónica e influyen a las aguas adyacentes generando remolinos ciclónicos 
(De la Lanza, 1991). Estos flujos juegan un papel decisivo en la circulación, en la 
renovación, en los balances térmicos y salinos de sus masas de agua superficial; en la 
climatología, en la hidrografía y en la dinámica de los procesos costeros. 
 
A esta gran masa de agua (Golfo de México) descargan 38 importantes ríos con un 
aporte de alrededor de 31.6 x 106 Kg s-1 de agua dulce al Golfo, acarrean 775 millones de 
toneladas de detritos y alrededor de 208 millones de toneladas de materiales disueltos. 
Constituyen también las rutas de distribución de una amplia gama de desechos tóxicos que 
contaminan y ponen en peligro a diversos hábitats (Botello et al., 1996). Sin embargo, las 
descargas de los ríos no son la única fuente de contaminantes hacia el Golfo, a lo largo de 
su costa existen sitios que contienen pozos petroleros, los principales reservorios se 
encuentran en Florida, Louisiana, Texas, Tamaulipas, Veracruz y Campeche, estas zonas 
son de gran importancia económica así como de puntos importantes de contaminación 
debido a los derrames o accidentes petroleros (López, 2002). 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Figura 5.- Área de Estudio y ubicación de las estaciones de muestreo de la Campaña OGM-1. 
 
Golfo 
 
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México 
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Veracruz 
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 0 50 100 Km 
 Río Tuxpan 
 
Longitud W 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 22 
 
 
7. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
El presente estudio se divide en dos fases, el trabajo realizado en campo y en el laboratorio. 
 
Campo 
Se realizó el muestreo durante la Campaña Oceanográfica OGM-1, de Septiembre a 
Octubre del 2002, a bordo del buque Oceanográfico “Justo Sierra” de la Universidad 
Nacional Autónoma de México. Se tomaron muestras de agua y sedimento en 56 estaciones 
previamenteseleccionadas perpendicularmente a la costa del Oeste del Golfo de México 
(figura 5). De las 71 estaciones predeterminadas para el muestreo, 15 estaciones (1 a la 11 y 
58, 62, 63, 67) no fueron muestreadas por condiciones climáticas inadecuadas. 
 
Colecta de agua.- Se utilizaron bolsas bacteriológicas estériles tipo Niskin (5 litros), 
las cuales por medio del cable hidrográfico se bajaron a una profundidad de 10 m., a través 
del mensajero se rompió la bolsa para ser llenada en un lapso de diez minutos, el 
muestreador fue subido y posteriormente la muestra fue procesada en condiciones estériles. 
 
Colecta de sedimento.- Se utilizó una draga tipo Smith-Mclntyre, esta fue diseñada 
para suelos arenosos cercanos a la zona litoral o el nucleador de caja para fondo blando; se 
bajó a una profundidad de 20 a 300 m. (de acuerdo a la estación muestreada). En un núcleo 
de 5 cm. se tomó la parte superficial del sedimento con la ayuda de una jeringa estéril sin 
punta, se guardó la muestra en bolsas estériles para ser procesada inmediatamente en el 
laboratorio del barco (Negrete-Romero, 1995). 
 
Cuantificación 
 
Para la cuantificación de bacterias hidrocarbonoclásticas de las muestras de agua y 
sedimento se utilizó la técnica de Número Más Probable (NMP) (Mills et al., 1978; 
Jiménez, 2003). Debido a la duración del crucero, las primeras fases de esta técnica se 
realizaron en el barco. Para el conteo se efectuaron diluciones decimales en serie para 
ambas muestras (agua y sedimento), las diluciones fueron hechas en tubos estériles con 9 
ml de medio mineral (Lyman y Fleming, 1940; Lizárraga et al., 1982); las cuales se 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 23 
 
realizaron de la siguiente manera: se transfirió1ml de la muestra original a un primer tubo 
(10-1) y de este 1ml a un segundo tubo (10-2) y así sucesivamente hasta obtener una última 
dilución de 10-6, todo en condiciones estériles (figura 6). 
 
Posteriormente los cultivos se hicieron a partir de muestras directas y las diluciones 
10-1, 10-2 de agua y para sedimento 10-4, 10-5, 10-6; por cada dilución se prepararon 3 
frascos pildoreros con tapón de rosca, conteniendo 9 ml de medio mineral (Lyman y 
Fleming, 1940; Lizárraga et al., 1982) y 50 µl de petróleo crudo proveniente del pozo 
Ixtoc-I, los cuales se esterilizaron en autoclaves modelo L21, a estos frascos se les inoculó 
1ml de la muestra diluida anteriormente. Los cultivos de muestra directa se obtuvieron con 
1 ml de la muestra original de agua inoculada directamente a los frascos pildoreros (medio 
mineral y petróleo). Se obtuvieron 18 frascos por estación, 9 de agua (3 de muestra directa 
,10-1, 10-2) y 9 de sedimento, considerando sólo las últimas tres diluciones (3 de 10-4, 10-5, 
10-6) (Carpenter, 1979). Los cultivos se incubaron por 3 meses a 25 °C, previsto como el 
tiempo necesario para que se presente una óptima degradación del petróleo (Mills et al., 
1978) (figura 6). 
 
Laboratorio 
 Después de los 3 meses de incubación, se realizó la revisión de los cultivos. Los 
que presentaron emulsificación fueron evaluados como positivos y los negativos fueron 
desechados, dichos cultivos se compararon con un frasco control preparado con medio 
mineral y petróleo sin inóculo. Posteriormente se realizó la lectura de los viales positivos de 
cada muestra de agua y sedimento, obteniendo un código de tres dígitos, los cuales se 
buscaron en la tabla estadística correspondiente para obtener el NMP de microorganismos, 
esta marca el 95% de límite de confianza para cada valor (America Water Works 
Association, 1973). 
 
El Número Más Probable (NMP) no sólo es un método cuantitativo para 
microorganismos de aguas residuales y terrestres, también es empleado para 
microorganismos marinos. Mills et al. (1978) menciona que el método del NMP es el más 
 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 24 
 
viable para la enumeración de los microorganismos degradadores de petróleo en un 
ambiente estuarino y marino usando medios líquidos salinos adicionados con petróleo. 
 
Aislamiento y Purificación de cepas bacterianas 
 
De los cultivos de agua y sedimento con mayores concentraciones de bacterias, se 
tomó 1 ml de cada uno para sembrarse en tubos con caldo Zobell (9 ml cada uno) 
(Oppenheimer y Zobell, 1952; Lizárraga et al., 1990), se incubaron por 48 hrs. a 25 °C. De 
la muestra en caldo Zobell, se tomaron 100 µl y se sembraron por expansión en medio 
Zobell 2216 (DIFCO) (agar marino) (Oppenheimer y Zobell, 1952; Lizárraga et al., 1991; 
Pereira et al., 2002) las cajas se incubaron a 25 °C por 24 hrs., posteriormente se realizó la 
descripción de las características morfológicas (forma, elevación, margen, tamaño, color) 
de las colonias (figura 7) (American Society for Microbiology, 1980). 
 
 Después se seleccionaron colonias para el aislamiento y purificación de las cepas 
bacterianas, en base a la diversidad morfológica de las colonias en caja. Se tomaron las 
colonias con el asa de siembra y se sembraron en agar marino por estría con el fin de aislar 
las distintas cepas bacterianas; para la purificación de las colonias se utilizó el método de 
resiembra en placa (Brent et al., 1991). Las colonias purificadas se sembraron por estría en 
frascos pildoreros (por cada colonia) con agar marino colocados de forma inclinada (7 ml), 
se incubaron a 25 °C durante 5 días, para tener un abundante crecimiento y conservar las 
cepas. Del frasco se tomó una azada para hacer un cultivo y propagar el microorganismo en 
tubos con caldo zobell (7ml), se incubó por una semana a una temperatura de 25 °C. 
 
De los tubos con caldo Zobell se obtuvo una muestra con el asa, esta fue sembrada 
por estría en caja petri con agar marino para obtener las colonias separadas y homogéneas, 
se incubaron a 25 °C por 24 hrs., posteriormente se realizó la tinción Gram. De estas 
colonias se consideraron las características morfológicas (figura 7) (American Society for 
Microbiology, 1980). 
 
 
 
 
 
 
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Tinción Gram 
 
De cada caja petri se tomó una pequeña muestra para realizar la tinción (apéndice), 
la cual clasifica las bacterias en dos grupos: Gram negativas o Gram positivas de acuerdo a 
la coloración obtenida, debido a diferencias químicas de sus paredes celulares. Las Gram 
(+) proporcionan un color violeta intenso o azul ya que retienen el colorante violeta en su 
capa de péptido glucano después del intento de decoloración, mientras que en las Gram (-) 
tras la decoloración se elimina el cristal violeta y yodo, hasta la tinción de contraste con 
safranina que las tiñe de color rosa, las cuales presentan en su pared celular péptido glucano 
y lipopolisacáridos (Tortora et al., 1993). Las preparaciones fueron observadas al 
microscopio a 10X, 40X y 100X con el fin de determinar si se trataban de Gram – o + y 
asegurarse que las cepas estuvieran completamente puras, tomando en cuenta la forma 
celular (figura 7). 
 
Aislamiento de plásmidos (Birnboin y Doly, 1979) 
 
Para la extracción de plásmidos se utilizaron 16 cepas puras elegidas al azar. Las 
cepas purificadas se sembraron en tubos de ensayo con 7 ml de medio LB (Luria-Bertani), 
se incubaron a 25 °C durante 8 días en agitación a baño maría hasta igualar el grado 0.5 en 
la escala de MacFarland (Sidney, 1996). Para el aislamiento de plásmidos se utilizó el 
método de Birnboin y Doly (1979), se basa en el principio de una desnaturalización alcalina 
selectiva para el ADN cromosomal, mientras que el ADN del plásmido permanece. 
 
De los cultivos en medio LB se tomaron 1.5 ml y se colocaron en un tubo Eppendorf 
(1.5 ml de capacidad) previamente esterilizado, se centrifugó por 30 segundos en 
microcentrífuga a 10 000 g por minuto. Enseguida se removió cuidadosamente el 
sobrenadante con la ayuda de una pipeta Pasteur, en 100µl de Lisozima a una concentración 
de 2 mg/ml resuspendiéndola en el vórtexy se incubó durante 30 min. a 0 °C. Se agregaron 
200 µl de una solución alcalina conteniendo dodecil sulfato de sodio (SDS) al 1% con 0.2 N 
de NaOH, mezclándolo suavemente, se colocó 5 min. a 0 °C. Después se agregó 150 µl de 
solución acetato de sodio 3 M con un pH 4.8, se mezcló por inversión durante unos 
segundos, enseguida se colocó a –20 °C por 1 hora. Se centrifugó por 5 min., la pastilla 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 26 
 
obtenida se eliminó, de acuerdo a la técnica esta contiene ADN cromosómico y el 
sobrenadante fue transferido a un segundo tubo Eppendorf, se le agregó 1 ml de etanol frío, 
colocando el tubo a –20°C durante 30 min., después se centrífugó por 3 min., el 
sobrenadante se eliminó quedando la pastilla, esta fue disuelta en 100 µl de una solución de 
acetato de sodio 0.1 M y 100 µl de tris 0.05 M, se reprecipitó con 300 µl de etanol frío 
enseguida se centrifugó por 3 min., retirando 400 µl del sobrenadante. Enseguida se le 
agregó nuevamente 100 µl de una solución de acetato de sodio 0.1 M y 100 µl de tris 0.05 
M y 300 µl de etanol frío, se volvió a centrifugar por 3 min. quedando solo la pastilla. 
 
Electroforesis 
 
Después de centrifugar, la pastilla (muestra) fue disuelta con 3 µl de RNAsa, el tubo 
se colocó en baño maría a 80 °C durante10 min. enseguida se le agregó 40 µl de buffer de 
carga 6X (Invitrogen). 
 
Las muestras se corrieron en gel de agarosa al 0.8% (Birnboin y Doly, 1979) al cual 
previamente se le agregó 15 µl de Bromuro de etidio. El gel (25 ml) se vertió en la cámara 
de electroforesis, colocando el peine de 10 pozos, dejándolo solidificar por 1 hora. Al pozo 
1 se le agregó 10 µl del marcador de peso molecular de 1Kb DNA Ladder (Invitrogen), a 
los 8 pozos restantes 10 µl de la muestra problema y en el pozo 10 (10 µl) el plásmido de 
peso molecular de 10 000 pb de la cepa 38/F07 de Pseudomonas sp. (aislada del Golfo de 
México, Campeche) (Jiménez, 2003), se utilizó como referencia para detectar la presencia 
de plásmidos. 
 
 La cámara de electroforesis fue llenada con Buffer de corrida hasta cubrir el gel, 
después se conectó a una fuente de poder (Life technologist, modelo 250) a 70 milivolts 
aproximadamente por 1 hora. Los geles fueron irradiados con una lámpara de luz UV, esto 
con el fin de hacer un examen preliminar. Una vez revelados, los geles se lavaron con agua 
durante 30 seg. para eliminar excesos de bromuro de etidio. Posteriormente se colocaron en 
el transiluminador de rayos UV a longitudes de onda corta (250-320 nm). Las imágenes de 
 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 27 
 
los geles con los plásmidos fueron capturadas en la computadora (adaptada al 
transiluminador) por medio del programa DNA Reader. Se analizaron por duplicado todas 
las cepas de agua y sedimento desde el aislamiento hasta la electroforesis. 
 
Después de haber efectuado la electroforesis de las diferentes cepas que fueron 
sometidas al proceso de aislamiento de plásmidos de acuerdo con el método de Birnboin y 
Doly (1979), se calcularon los pesos moleculares de los plásmidos problema, extrapolando 
los valores obtenidos de su desplazamiento (movilidad relativa) con los valores del 
marcador, para ello se realizó una curva de calibración para cada uno de los geles por 
medio de una regresión lineal a través de la movilidad relativa de las bandas marcador de 
referencia. Se obtuvieron los pesos moleculares en pares de bases para cada uno de los 
plásmidos extraídos de las cepas de agua y sedimento. 
 
Identificación de las cepas bacterianas 
 
 Se realizó la identificación de las cepas previamente purificadas que presentaron 
plásmidos por medio de la prueba bioquímica API 20 NE (bioMérieux) (Analytical Profile 
Index, 1999) que es un sistema estandarizado (kit) que combina 8 test convencionales y 12 
test de asimilación para Gram negativos. La galería API 20 NE está compuesta por 20 
microtubos que contienen medios y/o sustratos en forma deshidratada. El test 21 pertenece 
a la prueba de la oxidasa (si es positivo aparece un color violeta). 
 
Los test convencionales se inocularon con una suspensión bacteriana realizada en 
solución salina (2ml) (apéndice) con una turbidez igual al grado 0.5 en la escala de 
McFarland. Las reacciones producidas durante el periodo de incubación se traducen en 
virajes espontáneos coloreados o revelados por la adición de reactivos. A los test de 
asimilación se les inoculó con medio mínimo (apéndice), como resultado las bacterias 
crecen si son capaces de utilizar el sustrato correspondiente. Se dispuso de los reactivos 
necesarios contenidos en el kit (apéndice). La lectura de todas las reacciones se hizo con la 
ayuda de la Tabla de lectura, a partir de estos datos se realizó la identificación que se 
obtuvo con la Tabla de Identificación y Catálogo Analítico. 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 28 
 
 
MUESTRA DE AGUA Y SEDIMENTO: 
 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 
 
 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 
 
 
 
 
Serie de tres frascos por cada 
muestra directa y dilución 
3 meses de incubación a 25 ºC 
 
 
 
 
9 ml de 
medio 
mineral / 
tubo 
9 ml de medio mineral y 
50µl petróleo crudo / 
frasco 
 
Muestra 
original 
 
1 ml de muestra 
directa (agua) 
1 ml 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 29 
Figura 6.- Diluciones en serie. 
 
 
 
 
AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN: 
 
 1 ml 100µl 
 
 
Caldo Zobell (9ml) por 48 hrs. 
colonias 
1 colonia 
Caldo 
Zobell 
 (7ml) 
Carac. morfológicas Frasco pildorero 
 de las colonias c/agar marino inclinado 
Carac. morfológicas 
de las colonias 
Tinción Gram 
Cepa pura 
Medio LB 
grado 0.5 
Macfarland 
Aislamiento 
de 
Plásmidos 
Figura 7.- Aislamiento y purificación de bacterias hidrocarbonoclásticas de muestras de agua y 
sedimento. 
resiembra en placa 
Caja petri c / agar 
marino 25°C x 24 hrs. 
Caja petri c / 
agar marino 
25°C x 24 hrs. 
Viales positivos 
(+) 
 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 30 
 
 8. RESULTADOS 
 
Cuantificación 
 
 Las muestras de la estación 12 a la 71 tanto de agua como de sedimento fueron 
analizadas a los tres meses de su incubación. Las muestras positivas presentaron cambios 
con respecto al frasco control (figura 8), en dichas muestras es evidente la presencia de 
bacterias degradadoras de petróleo ya que se formó una emulsión, adquirieron una 
coloración café (mousse de chocolate) debido a la fragmentación del petróleo (figura 9). 
 
Los resultados del estudio cuantitatitvo de agua y sedimento por estación 
muestreada están expresados en NMP de bacterias degradadoras de petróleo en 100 ml de 
muestra, las cuales se presentan en la tabla 5. Se observa que todas las estaciones 
presentaron bacterias hidrocarbonoclásticas tanto en muestras de agua como de sedimento. 
En agua las concentraciones fluctuaron entre 3 x 101 a 2.1 x 103 NMP/100 ml encontrando las 
mayores concentraciones de bacterias hidrocarbonoclásticas (1.5 y 2.1 x 103 NMP/100 ml) en 
el 14% de las estaciones muestreadas (14-17, 19, 20, 66 y 71), sin embargo, el 50% de las 
estaciones (18, 21, 22, 24-30, 40-42, 44-50, 53, 60, 64, 65, 68-70) (figura 10) presentaron 
una concentración promedio de 2.2 x 102 NMP/100 ml. 
 
Para las muestras de sedimento se presentaron concentraciones de 3.6 x 105 a 
4.6 x 107 NMP/100 ml, esta última concentración sólo se encontró en las estaciones 16, 17, 
20 y 29 (4%), sin embargo, el 65% de las estaciones(12-15, 18,19, 21-28, 30, 35, 37, 40-
50, 52, 53, 64-69 y 71) (figura 10) presentaron una concentración promedio de 2.1 x 106 
NMP/100 ml. La figura 11 muestra la distribución de todas las concentraciones de bacterias 
hidrocarbonoclásticas de las muestras de agua y sedimento, en la cual se observa que las 
estaciones que presentaron mayores concentraciones para ambas muestras, se localizan 
frente a la desembocadura de la Laguna Madre (Tamaulipas), Laguna de Tamiahua y la 
Laguna de Alvarado (Veracruz), además se presenta que en las muestras de sedimento las 
concentraciones son más elevadas en comparación con las de agua. 
 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 31 
 
 
 
 
Figura 8.- Frascos con medio mineral y petróleo. A) con degradación de petróleo, B) control. 
 
 
 
 
Figura 9.- Degradación de una microgota de petróleo por Pseudomonas. 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 32 
Tabla 5.- NMP de bacterias / 100 ml de las muestras de agua y sedimento de las estaciones 12-
71estaciones, de la estación 1 a 11, 58, 63, 67 no fueron muestreadas; nm = no muestreada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ESTACIÓN 
AGUA 
NMP/100ml 
SEDIMENTO 
NMP/100ml 
 
ESTACIÓN 
AGUA 
NMP/100ml 
SEDIMENTO 
NMP/100ml 
12 nm 2 x 106 41 2.3 x 102 2 x 106 
13 nm 2.8 x 106 42 2 x 102 2 x 106 
14 1.5 x 103 2.8 x 106 43 7.3 x 101 1.5 x 106 
15 1.5 x 103 2.1 x 106 44 1.5 x 102 2.1 x 106 
16 2.1 x 103 4.6 x 107 45 1.5 x 102 1.5 x 106 
17 1.5 x 103 4.6 x 107 46 2.3 x 102 2.1 x 106 
18 2.8 x 102 2.8 x 106 47 2.8 x 102 2.1 x 106 
19 1.5 x 103 2.8 x 106 48 2.8 x 102 1.5 x 106 
20 2.1 x 103 4.6 x 107 49 2.8 x 102 2 x 106 
21 2.8 x 102 2.8 x 106 50 2 x 102 2.1 x 106 
22 2.3 x 102 2.8 x 106 51 3 x 101 3.6 x 105 
23 7.3 x 101 2.1 x 106 52 3.6 x 101 1.5 x 106 
24 2 x 102 2.8 x 106 53 2.1 x 102 2 x 106 
25 2.1 x 102 2.1 x 106 54 7.2 x 101 3.6 x 105 
26 2 x 102 2.1 x 106 55 3.6 x 101 3.6 x 105 
27 2 x 102 2.1 x 106 56 7.2 x 101 7.3 x 105 
28 2.3 x 102 2.8x 106 57 6 x 101 3.6 x 105 
29 2.8 x 102 4.6 x 107 59 7.3 x 101 6 x 105 
30 2.8 x 102 2 x 106 60 2.8 x 102 3.6 x 105 
31 7.3 x 101 3.6 x 105 61 3.6 x 101 3.6 x 105 
32 3.6 x 101 3.6 x 105 62 3.6 x 101 nm 
33 7.3 x 101 3.6 x 105 64 2.3 x 102 2.1 x 106 
34 7.3 x 101 3.6 x 105 65 2.8 x 102 2.1 x 106 
35 3 x 101 1.5 x 106 66 1.5 x 103 2.1 x 106 
36 3.6 x 101 7.3 x 105 68 2.1 x 102 2.8 x 106 
37 3.6 x 101 2 x 106 69 2 x 102 2.8 x 106 
38 7.3 x 101 3.6 x 105 70 2.3 x 102 3.6 x 105 
39 7.3 x 101 3.6 x 105 71 1.5 x 103 2.8 x 106 
40 2 x 102 2 x 106 --- --- --- 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 33 
 
Figura 10.- Distribución de bacterias hidrocarbonoclásticas de acuerdo a las altas concentraciones. 
 
19° 
20° 
21° 
22° 
23° 
24° 
25° 
26° 
1 
 
2 3 4 5 6 7 8 9 
10 11 12 13 14 
15 16 17 18 19 
20 21 22 23 24 
25 26 27 28 29 
30 31 32 
33 34 35 
36 37 38 
39 40 41 
42 43 44 
45 46 47 
48 49 50 
51 52 53 
 
54 55 56 
57 58 59 
60 61 62 
63 64 65 
66 67 68 
69 70 71 
 99° 98° 97° 96° 95° 94° 
0 50 100 km 
Golfo 
 
de 
 
México 
 
Veracruz 
 
Río Tuxpan 
Laguna de 
Alvarado 
 
T
am
au
lip
as
 
Laguna 
Madre 
Río Soto 
la marina 
Laguna de 
Tamiahua 
Sedimento (107) 
 
 (106 ) 
 
Agua (103 ) 
 (102 ) 
 
NM (no muestreadas) 
Rio Pánuco 
Río Tecolutla 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 34 
 
 
 
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 61 66 71
estaciones
lo
g 
de
 N
M
P
/1
00
m
l
Agua Sedimento
 
 
 
Figura 11.- Distribución espacial de bacterias hidrocarbonoclásticas de muestras de agua y 
sedimento del Oeste del Golfo de México. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 35 
 
Características morfológicas de las colonias 
 
Para el aislamiento de las cepas utilizadas se observó la morfología de caja; se 
encontraron características similares en las muestras de agua y sedimento. El color que 
predominó en las colonias fue el blanco cremoso repitiéndose en varias estaciones, para 
agua (a) se presenta un 64% y en sedimento (s) 54%, después blanco transparente 20% (a), 
23% (s), amarillo claro14% (a), 20% (s), el color naranja sólo se presentaron en las colonias 
de la estación 26 en la muestra de agua con el 2% y el color blanco solo en la estación 21 
para sedimento con el 2%; se observaron tres tipos de forma, circular, irregular y 
puntiforme para ambas muestras, circular 54% (a), 51% (s), irregular 24% (a), 25% (s) y 
puntiforme 22% (a), 24% (s); en cuanto a la elevación se presentó con mayor frecuencia la 
convexa con 92% (a) y 96% (s), la elevación plana 6% (a), 4% (s) y cupulada 2% (a), esta 
última elevación no se presentó en las muestras de sedimento. El tamaño fue variable, de 
acuerdo a la forma de la colonia las más pequeñas fueron aquellas de forma puntiforme con 
un tamaño promedio de .08 cm tanto para agua como para sedimento; en cuanto a la luz de 
las colonias 80% opaca (a), 90% (s), translúcida 20% (a), 10% (s); el margen 100% entero 
en ambas muestras (agua-sedimento) (tabla 6 y 7). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 36 
 
 
Tabla 6.- Características de las colonias de las muestras de agua con mayores 
concentraciones de acuerdo al NMP (número más probable) crecidas en agar marino. 
 
 
 
 
 
Estación Tamaño-cm Color Forma Elevación Margen Luz 
14 .20-.06 B. C. circular convexa entero opaca 
15 .22-.07 B. C. circular convexa entero opaca 
16 .14-.09 B. C. circular convexa entero opaca 
17 .17-.05 B. C. circular convexa entero opaca 
“ .15-.1 A. C. irregular convexa entero opaca 
“ .05-.03 B. T. puntif. convexa entero translúcida 
18 .12-.09 B. C. circular convexa entero opaca 
19 .16-.1 B. C. irregular convexa entero opaca 
20 .19-.04 B. C. circular convexa entero opaca 
21 .19-.04 B. C. circular convexa entero opaca 
22 .14-.09 B. C. circular convexa entero opaca 
24 .13-.12 B. C. circular convexa entero opaca 
25 .18-.08 B. C. circular convexa entero opaca 
" .06-.05 B. T. puntif. convexa entero translúcida 
26 .09 NRAJ puntif. cupulada entero opaca 
27 .07-.04 B. T. puntif. convexa entero translúcida 
28 .09-.05 B. T. puntif. convexa entero translúcida 
29 .13-.09 B. C. irregular convexa entero opaca 
30 .19-.04 B. C. circular convexa entero opaca 
“ .05-.03 B. T. puntif. convexa entero translúcida 
40 .09-.06 B. C. irregular plana entero opaca 
41 .19-.04 B. C. circular convexa entero opaca 
 42 .27-.05 B. C. circular convexa entero opaca 
“ .05-.01 B. T. puntif. convexa entero translúcida 
44 .14-.05 B. C. circular convexa entero opaca 
“ .03-.01 B. T. puntif. convexa entero translúcida 
45 .11-.02 B. C irregular convexa entero opaca 
“ .19-.11 A. C. irregular convexa entero opaca 
46 .17-.05 B. C. circular convexa entero opaca 
“ .17-.12 A. C. circular convexa entero opaca 
47 .27-.12 B. C. irregular plana entero opaca 
“ .12-.1 A. C. circular convexa entero opaca 
48 .3-.07 B. C. irregular convexa entero opaca 
49 .1-.04 B. C. circular convexa entero opaca 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 37 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
(puntif. = puntiforme, B. C. = Blanco Cremoso, B. T. = Blanco Transparente, NRAJ. = Naranja, A. 
C. = Amarillo Claro). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
50 .14-.05 B. C. circular convexa entero opaca 
“ .19-.13 A. C. irregular convexa entero opaca 
“ .07-.02 B. T. puntif. convexa entero translúcida 
53 .23-.1 B. C. circular convexa entero opaca 
“ .12-.1 A. C. circular convexa entero opaca 
“ .05-.02 B. T. puntif. convexa entero translúcida 
60 .38-.1 B. C. irregular plana entero opaca 
“ .17-.13 A. C. circular convexa entero opaca 
64 .27-.05 B. C. circular convexa entero opaca 
65 .19-.04 B. C. circular convexa entero opaca 
66 .13-.06 B. C. circular convexa entero opaca 
“ .08-.04B. T. puntif. convexa entero translúcida 
68 .19-.04 B. C. circular convexa entero opaca 
69 .10-.02 B. C. irregular convexa entero opaca 
70 .15-.07 B. C. irregular convexa entero opaca 
71 .14-.09 B. C. circular convexa entero opaca 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 38 
 
Tabla 7.-Características de las colonias de las muestras de sedimento con mayores 
concentraciones de acuerdo al NMP (número más probable) crecidas en agar marino. 
 
Estación Tamaño-cm Color Forma Elevación Margen Luz 
12 .14-.08 B. C circular convexa entero opaca 
13 .15-.06 B. C. circular convexa entero opaca 
14 .17-.05 B. C. circular convexa entero opaca 
15 .12-.06 B. C. circular convexa entero opaca 
16 .13-.1 B. C. circular convexa entero opaca 
17 .14-.1 B. C. circular convexa entero opaca 
“ .06-.04 B. T. puntif. convexa entero translúcida 
18 .23-.06 B. C. circular convexa entero opaca 
" .14-.1 A. C. circular convexa entero opaca 
19 .07 B. T. puntif. convexa entero translúcida 
20 .12-.09 B. C. circular convexa entero opaca 
21 .1 B. circular convexa entero opaca 
22 .08 B. T. puntf. convexa entero opaca 
23 .21-.09 B. C. circular convexa entero opaca 
24 .16-.07 B. C. irregular convexa entero opaca 
25 .09-.02 B. T. puntif. convexa entero translúcida 
26 .21-.07 B. C. circular convexa entero opaca 
“ .15-.1 A. C. irregular convexa entero opaca 
27 .09-.02 B. T. puntif. convexa entero translúcida 
28 .12-.05 B. C. circular convexa entero opaca 
29 .17-.09 B. C. circular convexa entero opaca 
“ .13-.1 A. C. irregular convexa entero opaca 
30 .19-.06 B. C. circular convexa entero opaca 
“ .15-.1 A. C. circular convexa entero opaca 
35 .12-.05 B. C. irregular convexa entero opaca 
“ .14-.1 A. C. circular convexa entero opaca 
37 .1-.07 B. C. irregular convexa entero opaca 
40 .1-.07 B. C. irregular convexa entero opaca 
41 .15-.06 B. C. irregular convexa entero opaca 
“ .12-.1 A. C. circular convexa entero opaca 
42 .21-.09 B. C. circular convexa entero opaca 
" 0.5-.02 B. T. puntif. convexa entero translúcida 
43 .25-.1 B. C. circular convexa entero opaca 
“ .19-.1 A. C. circular convexa entero opaca 
44 .25-.07 B. C. irregular plana entero opaca 
“ .05-.02 B. T. puntif. convexa entero translúcida 
45 .14-.09 B. C. irregular plana entero opaca 
46 .16-.09 B. C. irregular convexa entero opaca 
47 .14-.08 B. C. circular convexa entero opaca 
“ .04-.02 B. T. puntif. convexa entero translúcida 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 39 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
(puntif. = puntiforme, B. C. = Blanco Cremoso, B. T. = Blanco Transparente, B. = Blanco, A. C. = 
Amarillo Claro). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
48 .20-.15 B. C. circular convexa entero opaca 
“ .08-.05 B. T. puntif. convexa entero translúcida 
49 .9-.04 B. T. puntif. convexa entero translúcida 
50 .19-.06 B. C. circular convexa entero opaca 
" .12-.1 A. C. circular convexa entero opaca 
52 .15-.1 B. C. circular convexa entero opaca 
“ .15-.1 A. C. irregular convexa entero opaca 
53 .15-.06 B. C. circular convexa entero opaca 
“ .16-.12 A. C. irregular convexa entero opaca 
64 .07-.03 B. T. puntif. convexa entero translúcida 
65 .09-.04 B. T. puntif. convexa entero translúcida 
66 .19-.06 B. C. circular convexa entero opaca 
“ .15-.1 A. C. irregular convexa entero opaca 
68 .19-.06 B. C. circular convexa entero opaca 
“ .20-.15 A. C. circular convexa entero opaca 
69 .25-.1 B. C. circular convexa entero opaca 
“ .08-.06 B. T. puntif. convexa entero translúcida 
71 .16-.02 B. C. irregular convexa entero opaca 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 40 
 
Obtención de cepas puras y Tinción Gram 
 
Se aislaron y purificaron 37 cepas (19 cepas de agua y 18 de sedimento) las cuales 
fueron seleccionadas de acuerdo a la diversidad morfológica de las colonias (figura 12). 
 
Por otra parte, la tinción Gram indicó que el 100% de las cepas de las muestras de 
agua y sedimento se caracterizaron por ser bacterias Gram negativo. En cuanto a la forma 
celular, en general las cepas de agua y sedimento mostraron una morfología característica 
de bacilos (95%), a excepción de la estación 21 (sedimento) que se observaron diplococos y 
para la estación 26 (agua) monococos (5%). En la tabla 8 se presentan las características 
morfológicas de las colonias aisladas y purificadas de las muestras de agua y sedimento. 
 
Tabla 8.- Características de las cepas aisladas (A = agua, S = sedimento) (- = negativo) (F. C. = 
forma celular) (trans. =translúcida) (B. C. =Blanco Cremoso, B. T. = Blanco Transparente, B. = 
blanco, A. C. = Amarillo Claro, NRA. = naranja). 
 
 
 
Estación A S tamaño forma elevación margen luz color Gram F. C. 
16-46-71 * .11cm circular convexa entero opaca B. C. - bacilos 
16-43-66 * .14cm circular convexa entero opaca B. C. - bacilos 
47-53-60 * .12cm circular convexa entero opaca A. C. - bacilos 
18-43-68 * .13cm circular convexa entero opaca A. C. - bacilos 
17-45-50 * .14cm irregular convexa entero opaca A. C. - bacilos 
29-52-66 * .14cm irregular convexa entero opaca A. C. - bacilos 
19-45-69 * .13cm irregular convexa entero opaca B. C. - bacilos 
24-41-71 * .14cm irregular convexa entero opaca B. C. - bacilos 
40-47-60 * .13cm irregular plana entero opaca B. C. - bacilos 
44-45 * .30cm irregular plana entero opaca B. C. - bacilos 
17-42-66 * .07cm puntiforme convexa entero trans. B. T. - bacilos 
17-48-69 * .08cm puntiforme convexa entero trans. B. T. - bacilos 
21 * .08cm circular convexa entero opaca B. - diplococos 
26 * .09cm puntiforme cupulada entero opaca NRA. - monococos 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 41 
 
 
 Estación 16 (agua) Estación 19 (agua) 
 
 Estación 21 (sedimento) Estación 17 (sedimento) 
 
 
Estación 26 (agua) 
Figura 12.- Características de algunas cepas purificadas (en caja petri con agar marino). 
 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 42 
 
Aislamiento de plásmidos 
 
Se eligieron al azar 16 cepas puras para la extracción de plásmidos (agua-estación 
71, 16, 40, 50, 19, 47, 66, 26 y sedimento-estación 43, 45, 16, 71, 48, 66, 29, 21) de las 
cuales 14 fueron positivas (presencia de plásmidos). En la figura 13 se muestra el gel con 
las muestras de agua, se observa que en 6 cepas (pozo 2, 3, 5, 6, 7, 8) hay presencia de 
plásmidos (uno por cepa); en los pozos 4 y 9 no se presenta algún bandeo, podemos decir 
que no hay plásmidos. Para ambos geles (agua, sedimento) en el pozo 1 se encuentra el 
marcador de 1 Kb que se tomó como referencia para obtener el peso molecular de los 
plásmidos de las cepas y en el pozo 10 el plásmido de referencia. En la figura 14 se muestra 
la curva de calibración de acuerdo a los datos de la tabla 9 que corresponde a la migración 
del marcador, para el análisis de cada una de las cepas de agua. En la tabla 10 se muestran 
los pesos moleculares de los plásmidos presentes en las cepas de las muestras de agua, 
calculados a partir de la movilidad relativa (migración de las muestras). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 13.- Gel de agarosa sujeto a electroforesis para las muestras de agua. Pozo 1) marcador; 2) 
estación 71; 3) estación 16; 4) estación 40; 5) estación 50; 6) estación 19; 7) estación 47; 8) estación 
66; 9) estación 26; 10) plásmido de referencia (cepa 38/F07). 
 
 
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 
12 216 pb 
 
3 054 pb 
2 036 pb 
1 636 pb 
1 018 pb 
 
 
 
Cruz Mayorga Gabriela 43 
 
 
y = -2.6098x + 5.0793
R2 = 0.9847
2.9
3
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Rf
lo
g
 P
M
 
 
Figura 14.- Curva de calibración del marcador de referencia (1kb DNA Ladder) para determinar los 
pesos moleculares de cada plásmido presente en las cepas de las muestras de agua; log PM 
(logaritmo del peso molecular).

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