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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA LOS REYES IZTACALA, EDO. DE MEX. 2006 AISLAMIENTO DE PLÁSMIDOS DE BACTERIAS DEGRADADORAS DE PETRÓLEO DEL OESTE DEL GOLFO DE MÉXICO T E S I S QUE PARA OBTENER EL TITULO DE: B I O L O G O P R E S E N T A: GABRIELA CRUZ MAYORGA Asesor: M. en C. Jorge Manuel Romero Jarero UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Mientras los hombres sean libres para preguntar lo que deben; libres para decir lo que piensan; libres para pensar lo que quieran; la libertad nunca se perderá y la ciencia nunca retrocederá. Julius Robert Oppenheimer Navegar por el infinito mundo de la naturaleza es maravilloso, pero el haber surgido de ella es único. Gabriela Cruz Mayorga DEDICATORIA A mi mamá JUANITA, a mi papá ANGEL, por su infinito apoyo, comprensión, amor y sobre todo por haber creído siempre en mí, todos mis logros se los debo a ustedes por haberme enseñado a ser una persona responsable y capaz de enfrentar adversidades. Con todo mi AMOR y RESPETO.......... A mis hermanos ANGELES, REYNA e IVAN, quienes me han fortalecido, mis compañeros ante las adversidades, por estar a mi lado en todo momento y sobre todo por sus alegrías y tristezas que han llenado mi vida.......... A mi amado compañero, a mi gran amigo, a quien siempre esta a mi lado, a quien por su gran valor humano me hace sentir que nunca hay que dejarse vencer, porque la vida puso en mi camino a una maravillosa persona. A ti DAVID.......... AGRADECIMIENTOS A la Universidad Nacional Autónoma de México por darme la oportunidad de cursar mis estudios de profesionales, en especial a la Facultad de Estudios Superiores Iztacala. Un sincero agradecimiento a los sinodales, por el valioso tiempo dedicado a la revisión de este trabajo y por las sugerencias que lograron enriquecerlo. Al M. en C. Jorge Manuel Romero Jarero, por la dirección, confianza y la oportunidad para realizar esta investigación en el Instituto de Ciencias del Mar y Limnología (ICM y L). Al Dr. Pedro Ramírez García por su sinceridad, seriedad y valiosas opiniones. Al Dr. Saúl Flores Maya por sus sugerencias tan oportunas y puntuales. A la M. en C. Elizabeth Ramírez Flores por tener siempre la disposición para atender mis dudas y por sus valiosas sugerencias. A la Biól. María Dolores Hurtado Bocanegra por sus comentarios precisos y sobre todo por su sinceridad. MÁS AGRADECIMIENTOS A la Dra. Pilar Negrete de la Universidad Autónoma Metropolitana por su valioso apoyo. A la M. en C. Ma. del Carmen Monroy Dosta y los Biólogos Verónica García Castillo y Raúl Gutiérrez Lucas de la Universidad Autónoma Metropolitana por su valiosa ayuda, interés y amistad. A Felipe, un gran compañero, por brindarme su amistad y gran apoyo. A la Ing. Edith de la Cruz del ICM y L, por su tiempo, interés y amistad. A la Lic. Dalia Badillo Pérez por conocerla en el momento preciso y por su enorme ayuda. A mis compañeras del laboratorio de microbiología marina, ICM y L, Berenice y Yamel, por su amistad. A mis compañeros que conocí durante esta maravillosa carrera (FES-IZTACALA), Xochilt, Leo, Daniela, Lupita, Manuel, Aarón, Luis y Luz por enseñarme el valor de la amistad a pesar de nuestras diferencias. A todas aquellas personas que de alguna manera me apoyaron a la realización de este trabajo. INDICE Pág. RESUMEN 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1 2. MARCO TEÓRICO......................................................................................................... 4 Petróleo..............................................................................................................................4 Contaminación por petróleo............................................................................................6 Efectos que influyen sobre un derrame de petróleo en el medio ambiente marino .7 Factores ambientales involucrados en la biodegradación de hidrocarburos.............8 Bacterias hidrocarbonoclásticas ...................................................................................10 Plásmidos que participan en la biodegradación de hidrocarburos ...........................12 Rutas de Biodegradación...............................................................................................13 3. ANTECEDENTES .......................................................................................................... 16 4. HIPÓTESIS ..................................................................................................................... 18 5. OBJETIVOS ................................................................................................................... 18 6. ÁREA DE ESTUDIO ..................................................................................................... 19 7. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................... 22 Cuantificación.................................................................................................................22 Aislamiento y Purificación de cepas bacterianas .......................................................24 Tinción Gram..................................................................................................................25 Aislamiento de plásmidos (Birnboin y Doly, 1979)..................................................25 Electroforesis ..................................................................................................................26 Identificación de las cepas bacterianas ........................................................................27 8. RESULTADOS ............................................................................................................... 30 Cuantificación.................................................................................................................30 Obtención de cepas puras y Tinción Gram.................................................................40 Aislamiento de plásmidos .............................................................................................42 Identificación de las cepas bacterianas ........................................................................48 9. DISCUSIÓN .................................................................................................................... 50 10. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 63 11. RECOMENDACIONES .............................................................................................. 6412. APÉNDICE ................................................................................................................... 65 13. REFERENCIAS ............................................................................................................ 69 RESUMEN La biodegradación de los componentes del petróleo se lleva a cabo por algunos microorganismos como las bacterias debido a su capacidad metabólica, la cual está regulada por genes que se encuentran en los plásmidos, estas bacterias son nombradas como hidrocarbonoclásticas. El presente trabajo se enfocó a una posible obtención de plásmidos presentes en bacterias hidrocarbonoclásticas obtenidas del Oeste del Golfo de México expuestas a un medio adicionado con petróleo. Para ello, el presente estudio se dividió en dos fases, que comprende el trabajo campo y laboratorio. Se realizó el muestreo durante la Campaña Oceanográfica OGM-1 a bordo del buque Oceanográfico “Justo Sierra” de la UNAM, se tomaron muestras de agua y sedimento en 56 estaciones en la zona Oeste del Golfo de México. Se realizaron diluciones tomadas en serie de 3 de las muestras de agua y sedimento, después fueron inoculadas en medio mineral con petróleo e incubadas a 25°C, estas muestras se analizaron siguiendo la técnica de cuantificación del número mas probable (NMP) a los tres meses del muestreo; las muestras positivas se sembraron en agar marino considerando la morfología de caja para la selección de las cepas. Para la purificación de las cepas se realizó el método de resiembra en placa y posteriormente la tinción Gram. Finalmente se realizó la técnica de Birnboin y Doly para el aislamiento de plásmidos basándose en una desnaturalización alcalina selectiva para el ADN cromosomal, mientras que el ADN del plásmido permanece. De acuerdo con los resultados obtenidos de la cuantificación se observaron concentraciones bajas que fluctuaron entre 3 x 101 a 2.1 x 103 NMP/100 ml de bacterias degradadoras de petróleo para las muestras de agua y en sedimento 3.6 x 105 y 1.5 a 2.8 x 106 NMP/100 ml como concentraciones bajas, en cambio 4.6 x 107 NMP/100 ml como concentración alta de bacterias hidrocarbonoclásticas. Las mayores densidades de bacterias en este estudio, tanto para agua como para sedimento se presentaron frente a las desembocaduras de la Laguna Madre, la Laguna de Tamiahua y la Laguna de Alvarado. Todas las cepas puras aisladas de agua y sedimento, son del tipo Gram negativa y mostraron una morfología de bacilos, a excepción de la estación 21 (sedimento), donde se observaron diplococos y en la estación 26 (agua) monococos. En el aislamiento de los plásmidos se detectó la presencia de estos, excepto en las cepas de las estaciones 26 y 40 de las muestras de agua, presentando pesos moleculares con intervalos de 15 632 pb a 19, 687 pb en las muestras de agua y para las muestras de sedimento de 18 841 pb a 21 546 pb, mencionándose como plásmidos degradativos. De acuerdo a la identificación de las cepas con presencia de plásmidos en las muestras de agua y sedimento, la mayoría pertenece al género Pseudomonas con las especies identificadas como P. putida, P. vesicularis, P. stutzeri y P. facilis, además se presentaron las bacterias Flavobacterium devorans en ambas muestras y sólo en las muestras de sedimento las bacterias Alcaligenes faecalis y Acinetobacter calcoaceticus, todas son reportadas como degradadoras de petróleo. La presencia de bacterias hidrocarbonoclásticas y los plásmidos presentes en ellas, hace evidente la actividad de la utilización de los hidrocarburos como fuente de energía por dichas bacterias, presentes en la zona Oeste del Golfo de México. Cruz Mayorga Gabriela 1 1. INTRODUCCIÓN En los últimos 40 años la contaminación por petróleo o hidrocarburos ha sido uno de los problemas más graves en el ambiente marino debido a su explotación, transporte, derrames accidentales y en algunas ocasiones por filtraciones naturales, que afecta el crecimiento y el comportamiento de las comunidades biológicas, provocando desastres ecológicos que pueden ser irreparables (Jiménez, 2003). Cuando ocurre un derrame de petróleo, éste es degradado por diferentes procesos, físicos, químicos y biológicos (Fuentes, 1994), dentro de estos uno de los principales procesos es la evaporación, que se produce rápidamente; los compuestos volátiles se evaporan de 5 a 10 días quedando generalmente compuestos alifáticos y aromáticos, los cuales forman en el agua una suspensión que finalmente es degradada por grupos de microorganismos. La velocidad a la que se producen los procesos mencionados dependerá del clima, el estado de mar (el oleaje, temperatura, corrientes marinas etc.) y el tipo de petróleo (Austin, 1988). La biodegradación de los componentes del petróleo o hidrocarburos es el resultado de la capacidad de algunos microorganismos de utilizar dichos compuestos como fuente de carbono y energía, lo que les permite sobrevivir en este medio (Margesin, 2003). Estos microorganismos están ampliamente distribuidos en la naturaleza, en lagos, ríos, suelos y océanos. Para el ambiente marino es determinante que existan estos microorganismos y sean capaces de aumentar su población en presencia de los hidrocarburos, esto se atribuye a diversos grupos de microbios como hongos, protozoarios, algas, levaduras y bacterias (Atlas, 1991). Entre dichos microorganismos se encuentra un grupo de bacterias heterótrofas llamadas degradadoras de petróleo o hidrocarbonoclásticas, las cuales están ampliamente distribuidas en el mar y actualmente se conocen varias de ellas (Lizárraga, 1996). Destacan los géneros Achromobacter, Arthrobacter, Acinetobacter, Vibrio, Flavobacterium y Pseudomonas, este último género es el más estudiado con relación a la degradación de hidrocarburos (Atlas, 1981). Cruz Mayorga Gabriela 2 La degradación de hidrocarburos se lleva a cabo por la actividad metabólica de las bacterias hidrocarbonoclásticas, de acuerdo con diversos análisis genéticos se han encontrado que los genes que regulan el catabolismo de los hidrocarburos se encuentran en los plásmidos (moléculas extracromosomales de ADN, bicatenario, circular, con replicación independiente) presentes en su citoplasma (Puertas, 1992). La etapa inicial de la biodegradación de los hidrocarburos esta dirigida por enzimas sintetizadas por los plásmidos (Yano, 1980). Dichas bacterias se desarrollan favorablemente en los vertidos de petróleo, e incluso, su crecimiento puede acelerarse mediante la adicción de nutrientes inorgánicos como fósforo y nitrógeno; las bacterias oxidadoras de hidrocarburos aumentan su número de 103 a 106 veces (Alexander, 1994). El estudio de plásmidos involucrados en el metabolismo de hidrocarburos provee algunas perspectivas en cuanto a la funcionalidad y transferencia a las células hijas, así como la función que los plásmidos han tenido en la evolución de cepas bacterianas mejor adaptadas (Shapiro et al., 1980). Dichos estudios han reportado que el material extracromosomal de ciertas cepas de Pseudomonas presentan un tamaño aproximado de 30 Kb, por su amplia forma degradativa hacia los hidrocarburos (Colín, 1997). Un alto porcentaje de bacterias marinas aisladas de sedimentos marinos, estuarios y ecosistemas pelágicos presentan con frecuencia plásmidos que les confieren la capacidad de degradar el petróleo, en algunos estudios se han identificado uno o más plásmidos en más del 52 % de estas bacterias. En el Golfo de México se han realizado investigaciones en las que se reportan la presencia de plásmidos degradativos, los cuales se relacionan con la utilización de hidrocarburos (Sobecky, 2002). En la actualidad las aguas litorales encaran problemas de contaminación, que están produciendo serios daños. Esta contaminación se encuentra en relación directa con el aporte de contaminantes que llevan los ríos, explotacionespetroleras y descargas de ciudades costeras al océano (Vizcaíno, 1986). Cruz Mayorga Gabriela 3 Desde 1970, para llevar acabo o aplicar procesos de biorestauración en sistemas acuáticos se han usado procesos de degradación microbiana para limpiar el ambiente contaminado (Chapell, 1998). A partir del descubrimiento de que diversos tipos de microorganismos pueden llevar a cabo la fragmentación o degradación de hidrocarburos en diversos ambientes, los estudios referentes al tema se han incrementado. El presente estudio esta enfocado al aislamiento de plásmidos, que es el material genético relacionado con la degradación de los hidrocarburos, es decir, ADN extracromosómico que ayuda a la bacteria a la metabolización de compuestos de carbono, sólo algunos microorganismos como las bacterias hidrocarbonoclásticas (llamadas así por su adaptación y alimentación) tienen esta capacidad. Alrededor del mundo se han hecho estudios moleculares en relación a los plásmidos, entre los más estudiados se encuentran los resistentes a antibióticos, sin embargo, las comunidades científicas desde los años 40 no sólo se preocupan por la salud del hombre sino también por la del medio ambiente, se han percatado del deterioro ambiental que día a día se incrementa, por ende los plásmidos degradativos constituyen un factor importante en la recuperación del ambiente, sobre todo en zonas afectadas por el hombre, debido a los significativos aportes de hidrocarburos que se dan por diversos factores como los derrames de petróleo en el mar. La presencia de las bacterias hidrocarbonoclásticas permitirá el aislamiento de los plásmidos que contribuirá de manera general a afirmar la presencia de este tipo de plásmidos en las bacterias de esta zona (oeste) del Golfo de México que no ha sido estudiada, con la finalidad de contribuir a estudios de biorestauración. Cruz Mayorga Gabriela 4 2. MARCO TEÓRICO Petróleo En la actualidad, la principal fuente de energía para la industria es el petróleo y el contaminante más persistente en el ambiente marino. Este proviene de plantas y animales prehistóricos, por lo que también se le conoce como combustible fósil (Rodríguez, 2000). Los principales componentes del petróleo son los hidrocarburos, los cuales son compuestos químicos que contienen únicamente hidrógeno y carbono. El carbono (80-87%) y el hidrógeno (10-15%) son los principales y más abundantes elementos del petróleo (98% de su composición total), aunque otros como el azufre (0-10%), nitrógeno (0-1%) y el oxígeno (0-5%) están presentes en menores cantidades (Botello et al., 1996). Los hidrocarburos van desde aquellos cuya molécula contienen un solo átomo de carbono hasta los que están constituidos por decenas o aún centenas de átomos de carbono, ya sea como cadenas o anillos. Todos forman una gran familia de compuestos orgánicos de los que existen más de 1,000 compuestos (Pathaik, 1997). La composición del petróleo puede variar dependiendo de la fuente de los materiales, las presiones, las temperaturas, la estructura química de las rocas, etc. (Canales, 1998). Los hidrocarburos, que en una mezcla específica constituyen el petróleo (figura 1), se clasifican en alifáticos, alicíclicos y aromáticos, clasificación que, a su vez, se subdivide de la siguiente manera: alcanos (1) Alifáticos alquenos (2) alquinos (3) cicloalcanos (4) Hidrocarburos Alicíclicos cicloalquenos (5) bencénicos (6) Aromáticos polifenilos (7) polinucleares (8) Figura 1. Subdivisión de los hidrocarburos (Albert, 1988). Cruz Mayorga Gabriela 5 (1) Alcanos (compuestos de cadena lineal) (2) Alquenos y (3) Alquinos (contienen dobles o triples ligaduras en la cadena) (2) (3) (4) Cic loalcanos (compuestos cíclicos) (5) Cicloalquenos (doble enlace) (6) Bencénicos (derivados alifáticos y (7) Polifenilos (dos o más anillos bencénicos) alicíclicos, compuestos anillados) (8) Polinucleares (dos o más anillos fusionados) Metano CH4 Etano CH3-CH3 Propano CH3-CH2-CH3 Butano CH3-CH2-CH2-CH3 Pentano CH3-CH2-CH2-CH2-CH3 Hexano CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3 Heptano CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3 Octano CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3 Nonano CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3 Decano CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3 Acetileno HC≡CH 2-Butino CH3-C≡C-CH3 Etileno CH2 =CH2 Propileno CH2 =CH-CH3 1-Buteno CH2 =CH-CH2-CH3 1,3 ciclopentadieno ciclohexeno ciclopropano ciclohexano tolueno estireno bifenilo trifenilo antraceno benzantraceno Cruz Mayorga Gabriela 6 Muchos de los hidrocarburos están sujetos a la biodegradación, principalmente esta en función del tipo y tamaño de la molécula del hidrocarburo. Los alcanos de cadena intermedia (C10-C24) son degradados rápidamente, mientras que los de cadena corta resultan tóxicos para muchos microorganismos, pero generalmente estos hidrocarburos se evaporan rápidamente. Por otra parte, los compuestos aromáticos son degradados más lentamente que los alcanos (Yánez, 1995). Contaminación por petróleo Actualmente la explotación y el transporte del petróleo son las principales fuentes de contaminación por hidrocarburos en el ambiente marino. Se calcula que aproximadamente el 60% de la producción mundial de petróleo se transporta por vía marítima (2.2 millones de toneladas de petróleo anualmente) y que el 0.1% de él se derrama accidentalmente en el mar (tabla 1) (Albert, 1988). Las descargas de desechos industriales y municipales, así como filtraciones naturales de petróleo en el mar, también son fuentes importantes de contaminación (Botello et al., 1996). Tabla1.- Accidentes por derrame de petróleo en el mar (Albert, 1988; Munn, 2004). Año Lugar 1962 Ensenada de Cook, Alaska, EUA 1970 Golfo de México, Costas de Campeche 1976 Arnoco Cádiz (buque italiano), Gran Bretaña, Francia 1979 Pozo Ixtoc, Golfo de México, Campeche 1985 Ranger Texas (plataforma marina, EUA), Golfo de México 1989 Exxon Valdez (buque petrolero), Alaska 1991 Guerra del Golfo (Golfo Pérsico) 2002 Prestige (buque petrolero), Costas de Galicia, España 2004 Río y playa Coatzacoalcos, Veracruz, Golfo de México Cruz Mayorga Gabriela 7 Efectos que influyen sobre un derrame de petróleo en el medio ambiente marino Después de una descarga o derrame de petróleo en el mar, se forma una delgada capa de este compuesto sobre la superficie del agua. Sobre esta capa actúan factores físicos, químicos y biológicos como (figura 2): -Evaporación: La pérdida de muchas moléculas de hidrocarburos de bajo peso molecular (10 átomos de carbono o menos) de la superficie de las manchas de aceite es muy rápida. Cuanto más agitado es el estado del mar, más rápido será este proceso. -Dispersión: La tasa de dispersión depende en gran medida de la naturaleza y constitución del petróleo derramado, incrementándose en presencia del oleaje y los vientos. Aquellos conglomerados de petróleo que no puedan dispersarse de manera efectiva debido a su grosor, pueden persistir por varias semanas en la superficie o bien ser transportados hacia las playas más cercanas endonde son depositados. -Disolución: Un hidrocarburo será más soluble en el agua cuanto menor sea su peso molecular y mayor su polaridad. Se calcula que las solubilidades en el agua de mar son 25% menores en relación a las aguas dulces, debido al efecto de las sales. Los microorganismos pueden producir compuestos más solubles en el medio marino. -Emulsificación: El petróleo en el agua puede formar una emulsión llamada “crema de chocolate”, que se forma después de su disolución y alteración química de sus componentes lo que se facilita por la presencia de compuestos tensoactivos en el agua. -Sedimentación: Se produce cuando los componentes del petróleo se agregan en conglomerados o residuos de mayor densidad a la del agua del mar. -Biodegradación: Es considerada el principal proceso, en el que los compuestos orgánicos son transformados a productos inorgánicos como bióxido de carbono, agua y sales minerales, efectuado por organismos. En ecosistemas naturales, la biodegradación de los compuestos orgánicos se presenta como una opción viable para el tratamiento de agua y Cruz Mayorga Gabriela 8 suelos marinos contaminados por dichos compuestos químicos (Rodríguez, 2000) (Botello et al., 1996). Figura 2.- Diagrama de los procesos más importantes después de un derrame de petróleo en el océano. Factores ambientales involucrados en la biodegradación de hidrocarburos Oxígeno La mayoría de los microorganismos degradadores de hidrocarburos involucran el oxígeno (actúa como aceptor de electrones), principalmente en el paso inicial de la degradación, en la cual implica una enzima oxigenasa, por lo que se considera un proceso aerobio (Rojas, 1997; Piña, 2004). La cantidad requerida de O2 por bacterias depende del tipo de hidrocarburo a degradar (tabla 2) (Fuentes, 1994). De acuerdo con Canales (1998) la demanda teórica de oxígeno es de 3.5 mg para oxidar 1 mg de petróleo. Los microorganismos requieren altas cantidades de oxígeno para romper las cadenas y anillos que forman los hidrocarburos (Piña, 2004). Generalmente la concentración de oxígeno en el agua de mar es de 8.6 mg/l y la concentración máxima es de 14.6 mg/l (Grant y Long, 1989). Cruz Mayorga Gabriela 9 Por otra parte, la biodegradación anaeróbica de hidrocarburos no esta descartada, aunque es poco común en la naturaleza (Testa y Winegardner, 1991). Tabla 2.- Cantidades de Oxígeno (mg) requerido por bacterias para oxidar 1 mg de hidrocarburo a dióxido de carbono y agua (Fuentes 1994). Temperatura La degradación de los hidrocarburos por bacterias puede ocurrir en un amplio rango de temperaturas, sin embargo, se ha reportado que hay una mayor degradación entre 25-35 °C ya que contribuye a acelerar e incrementar las reacciones bioquímicas de los organismos, y facilita la evaporación de hidrocarburos tóxicos para las bacterias (Austin, 1988). Por otro lado Pilpel (1968) puntualiza que no ocurre degradación en las regiones polares, sin embargo, Zobell (1973) reportó biodegradación a una temperatura de 0 °C. Margesin (2003) menciona que los microorganismos están bien adaptados a 0 °C y que hay degradación de hidrocarburos aunque en un bajo porcentaje (10-20 %). Fósforo y Nitrógeno Son nutrientes inorgánicos que usualmente están disueltos en el agua. Contribuyen al crecimiento de la población bacteriana. Las capas superiores del mar contienen un máximo de 0.1 mg/l; se ha calculado que las cantidades de 6-60 mg de nitrato y 1-10 mg de fosfato son necesarios para que degraden 1g de petróleo (Alexander, 1994); la carencia de estos nutrientes limita la actividad bacteriana. Se reporta la utilización de fertilizantes con fósforo y nitrógeno para estimular la biodegradación del petróleo (Chapelle, 1998). Hidrocarburo O2 (mg) etano 1.3 hexano 3.53 benceno 3.08 tolueno 3.13 xileno 3.17 naftaleno 3.00 octano 3.5 Cruz Mayorga Gabriela 10 PH El pH afecta el comportamiento de las funciones celulares, transporte en la membrana celular y el equilibrio de las reacciones catalizadas de los microorganismos. El pH es constante en el mar, sin embargo, se determina un intervalo entre 7.5 y 8 para contribuir a la degradación del petróleo por bacterias (Barry et al., 1992). Bacterias hidrocarbonoclásticas Las bacterias en base a su metabolismo se dividen en autótrofas (obtienen su energía de la luz solar) y heterótrofas (obtienen su energía de la descomposición de materia orgánica). Dentro de las heterótrofas encontramos bacterias que llevan acabo la degradación de hidrocarburos, los cuales son utilizados como fuente de carbono y energía, a este grupo de bacterias se les denomina hidrocarbonoclásticas o degradadoras de petróleo, las podemos encontrar tanto en ambientes terrestres como marinos (Fuentes, 1994). Las bacterias hidrocarbonoclásticas poseen enzimas que permiten la oxidación de los hidrocarburos del petróleo. Esta oxidación cambia las propiedades de los compuestos, facilitando su conversión a bióxido de carbono y agua (Atlas, 1993). Dicha oxidación disminuye la toxicidad del petróleo y aumenta su solubilidad en agua, incrementando la biodisponibilidad (García, 1985). Con base en esto debe tomarse en cuenta que bajo condiciones favorables las bacterias hidrocarbonoclásticas degradan prácticamente cualquier hidrocarburo presente en el medio, desde alcanos hasta aromáticos (Fuentes, 1994). Generalmente los ecosistemas marinos presentan bacterias hidrocarbonoclásticas, estas comprenden menos del 1% de la comunidad bacteriana, sin embargo, se incrementan hasta un 10% después de que el ambiente ha sido contaminado con petróleo (Atlas, 1991). Hay un período de aclimatación para que las bacterias empiecen el proceso de degradación, y presente dicho incremento, el cual puede aparecer de 1 a 4 semanas dependiendo de la cantidad de microorganismos y del tipo de hidrocarburos presentes (Testa y Winegardner, 1991). Cruz Mayorga Gabriela 11 Se han identificado más de 20 géneros de bacterias capaces de degradar los hidrocarburos (tabla 3) (Atlas, 1981). Entre las bacterias hidrocarbonoclásticas más frecuentes y estudiadas se encuentran las del género Pseudomonas destacando las especies putida y aeruginosa las cuales crecen en alcanos. Otro ejemplo es el género Achromobacter, que presenta una notable capacidad de degradar hidrocarburos aromáticos (Valderrama, 1990). La diversidad de este tipo de bacterias se debe a que su capacidad de metabolizar los diferentes compuestos orgánicos del petróleo no esta restringida a un solo género y especie. Tabla 3.- Bacterias identificadas en la degradación de compuestos derivados del petróleo (Fuentes, 1994) (Valderrama, 1990). Género Especie Compuesto degradado Acinetobacter sp. n-alcanos baumani hidrocarburos saturados y aromático calcoaceticus bifenilos policlorados Achromobacter sp. bifenilos policlorados Alcaligenes sp. petróleo crudo Flavobacterium devorans bifenilos policlorados Marinobacter aquaelolei petróleo crudo Nocardia sp. dibenzotiofeno Pseudomonas sp. tolueno bifenilos policlorados fenantreno petróleo crudo aeruginosa fenol n-alcanos fluorescens petróleo crudo putida n-alcanos tolueno stutzeri tetracloroetileno Rhodococcus sp. dibenzotiofeno alcanos Micrococcus sp. petróleo crudo Cruz Mayorga Gabriela 12 Plásmidos que participan en la biodegradación de hidrocarburos Muchas bacterias poseen pequeñas moléculas extracromosomales de ADN llamados plásmidos. Son moléculas súper helicoidales, generalmente circulares, covalentemente cerradas que se replican independientemente del cromosoma de la bacteria y controlan su propio número de copias, además muchos de los plásmidos se puedentransmitir de una célula a otra por medio del proceso de conjugación (Brent et al., 1991; Jonson y Woodford, 1998). Los plásmidos presentan genes que no son esenciales para las actividades normales de las bacterias, sin embargo, codifican funciones útiles para las células bajo ciertas circunstancias ambientales y permiten que la bacteria se adapte (Jonson y Woodford, 1998; Singleton, 2004), por ejemplo los plásmidos R, con genes que confieren resistencia a antibióticos; el plásmido Col, con genes que producen bacteriocinas; genes resistentes a metales pesados, etc. (Sumners, 1996; Prescott, 2003). Los plásmidos que le confiere a las bacterias la capacidad para degradar hidrocarburos, son llamados degradativos o catabólicos los cuales han sido nombrados de acuerdo al hidrocarburo que degradan; entre los más estudiados se encuentra OCT, CAM, NAH, SAL y TOL (tabla 4) (Bull y Meadow, 1979; Goodfellow y O’Donnell, 1993). Dichos plásmidos presentan genes que codifican para enzimas que permiten a la célula utilizar a los hidrocarburos, estas enzimas se encargan de la degradación de los sustratos hasta compuestos cercanos al metabolismo central de la bacteria (Sumners, 1996). Este tipo de plásmidos (degradativos) se han clasificado con base en la incompatibilidad, la cual se define como la inhabilidad que tienen dos plásmidos para coexistir en la misma célula (Scaife, 1985). A partir de la incompatibilidad se han formado grupos (denominados Inc) de plásmidos, por ejemplo, los que degradan alcanfor (CAM) y n-alcanos (OCT) están dentro del grupo IncP-2. Los plásmidos que degradan naftaleno (NAH) y tolueno (TOL) están en el grupo IncP-9 (Shapiro et al., 1980); el TOL es el más estudiado de los plásmidos degradativos (Yánez, 1995). Por otra parte los plásmidos degradativos han sido aislados de distintos géneros bacterianos, presentes en ambientes terrestres y marinos; el género Pseudomonas es el más Cruz Mayorga Gabriela 13 relacionado con dichos plásmidos (Yánez, 1995). Los pesos moleculares de estos plásmidos han sido reportados entre 8 y 160 Kb (Prescott, 2003). Tabla 4.- Plásmidos degradativos y componente de hidrocarburo que degradan (Shapiro et al., 1980). Rutas de Biodegradación Las bacterias hidrocarbonoclásticas degradan por diversas vías metabólicas los distintos componentes del petróleo como benceno, tolueno, xileno, naftaleno y compuestos alifáticos. En el proceso de degradación, se da una oxidación de los sustratos hasta compuestos que entran al ciclo de Krebs (Canales, 1998). La ruta que se produce para degradar alcanos (figura 3) puede ocurrir por varios mecanismos, uno de ellos y él más frecuente se da por medio del ataque de una enzima oxigenasa al grupo metilo terminal donde el oxígeno se incorpora formando un alcohol primario, que posteriormente es oxidado a un aldehído y finalmente a un ácido graso (A). Algunas bacterias atacan subterminalmente al alcano (B), el oxígeno es insertado en un átomo de carbono dentro de la cadena a un lado del extremo formando un alcohol secundario que por oxidación es metabolizado a una cetona y después a un acetilester, en el cual se rompe el enlace dando Plásmidos Sustrato CAM alcanfor OCT octano SAL salicilato NAH naftaleno TOL tolueno m-xileno p-xileno pAC21 p-clorobifenil pAC25 3-clorobenzoato pJP1 2,4-diclorofenol Cruz Mayorga Gabriela 14 finalmente un alcohol primario más ácido acético para ser metabolizado posteriormente por la vía de la β-oxidación. El alcohol primario antes producido es oxidado a un aldehído y finalmente a un grupo carboxilo, obteniéndose un ácido graso. Los ácidos grasos son rápidamente metabolizados por vía β-oxidación para formar acetil-CoA (Grant y Long, 1989; Atlas, 1996; Kirchman, 2000). Los hidrocarburos aromáticos como el tolueno son oxidados a benzoato y este a catecol el cual es abierto por medio de un rompimiento meta, resultando semialdehído hidroxi-cis-mucónico. El metabolismo posterior conduce a la formación de ácido fórmico, ácido pirúvico y acetaldehído. Alternativamente, el anillo de catecol puede ser abierto por rompimiento oxidativo orto resultando un ácido cis-mucónico, este finalmente es oxidado a ácido succínico y acetil-CoA, intermediarios comunes del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (figura 4) (Shapiro et al., 1980). Figura 3.- Rutas metabólicas para la degradación de alcanos por bacterias hidrocarbonoclásticas (Atlas, 1996; Kirchman 2000). Cruz Mayorga Gabriela 15 Figura 4.- Ruta de oxidación para Tolueno (Yañez, 1995). Enzimas codificadas por el plásmido: XO = xileno oxidasa, BADH = Benzil alcohol deshidrogenasa, BZDH = Benzaldehído deshidrogenasa, TO = Toluato oxidasa, C230 = catecol 2,3-oxigenasa, HMSH = 2, semialdehido hidromucónico hidrolasa. Enzimas codificadas por el cromosoma: BO = benzoato oxidasa, C120 = catecol 1,2-oxigenasa, MLE = Enzima muconato lactonizante, MI = muconola ctona isomerasa, ELH = Lactona enol hidrolasa. Cruz Mayorga Gabriela 16 3. ANTECEDENTES Se han realizado diversos estudios en torno a las bacterias hidrocarbonoclásticas en varios países. En el Golfo de México también han sido estudiadas en lo que se refiere a taxonomía, abundancia y en menor grado aspectos moleculares. La biodegradación de petróleo por bacterias fue adquiriendo especial atención a partir de los años 70’s por su gran potencial de restauración en ambientes contaminados (Bogan et. al, 2003). Al-Hadhrami et al. en 1995 reportaron una comunidad formada por 8 cepas bacterianas aisladas de muestras de sedimento contaminado del Golfo de Oman, Arabia, presentaron un 75% de “mousse” en un período de 60 días. Dichas muestras fueron preparadas en agua de mar con petróleo. Ramsay et al. en el 2000 realizaron un estud ió en la costa de Queensland, Australia, reportaron que la adición de aceites en sedimento estimuló el número de bacterias degradadoras de alcanos incrementándose de 105 a 108 células/g de sedimento; el número de bacterias degradadoras de aromáticos se incrementó de 104 a 106 células/g de sedimento en un lapso de 90 días. Se aislaron las cepas de los géneros Aeromonas, Alcaligenes, Vibrio, Pseudomonas, Alteromonas y Moraxella. Pereira et al. en el 2002 reportaron un rápido incremento en la población de bacterias degradadoras de petróleo en sedimento marino de la bahía de Galicia impactado por petróleo crudo, utilizaron la técnica del NMP para la cuantificación, y confirmaron la presencia e importancia de este tipo de bacterias. Leahy et al. en 1990 reportaron que existe relación entre la capacidad de degradación de hidrocarburos y los plásmidos aislados de 242 cepas de bacterias marinas de sedimento obtenidas del Golfo de México, Campeche, sitio con altas concentraciones de hidrocarburos debido a una contaminación crónica. Cruz Mayorga Gabriela 17 Sobecky en el 2002 informó un alto porcentaje de bacterias aisladas de ambientes marinos como estuarios, columna de agua, sedimentos etc. en presencia de hidrocarburos que muestran plásmidos. Hada y Sizemore en 1981 reportaron plásmidos aislados de bacterias de una zona con actividad de hidrocarburos del noroeste del Golfo de México. Pleshakova et al. en el 2001 reportaron que la bacteria Acinetobacter calcoaceticus es eficiente en la degradación de los componentes de varios aceites como alcanos e isoalcanos, esta cepa tiene plásmidos de 120, 9 y 8 Kb, que puede sertransferido de una célula a otra, e incluso, a bacterias del género Pseudomonas. Zhong et al. en el 2002 realizaron una investigación en la bahía de San Diego, California, en este estudio se encontró el plásmido de 50 Kb presente en Micrococcus el cual fue aislado de sedimento marino impactado por petróleo. Jiménez en el 2003 reportó para la zona del Golfo de México, Campeche, la presencia de plásmidos en bacterias Pseudomonas con pesos moleculares de 10,000 pb, los cuales menciona como degradativos. De acuerdo con los datos encontrados por Lizárraga et al. en 1991 en el Golfo de México (Campeche), mencionan que hay altos índices de bacterias hidrocarbonoclásticas, lo cual representa una intensa biodegradación de hidrocarburos en esta zona de extracción de petróleo, debido a la capacidad degradativa de las bacterias la cual se atribuye a los plásmidos. En otras áreas del Golfo de México se plantea la posibilidad de desarrollar un estudio de acuerdo con los antecedentes, encaminado a establecer qué bacterias hidrocarbonoclásticas se presentan y la relación con la presencia de plásmidos que les confieren la capacidad para degradar hidrocarburos en la zona del Oeste del Golfo. Para este lugar aún no se ha reportado un estudio en relación a los plásmidos involucrados en la degradación del petróleo así como el peso molecular que presentan dichos plásmidos. Cruz Mayorga Gabriela 18 4. HIPÓTESIS La biodegradación de los diferentes hidrocarburos en ambientes marinos está en función principalmente de microorganismos especializados, los cuales son capaces de utilizar los hidrocarburos como fuente de energía, de acuerdo con lo anterior se propone que puedan aislarse bacterias degradadoras de petróleo de las muestras de agua y sedimento marino impactados por petróleo, por lo tanto es posible encontrar plásmidos presentes en ellas a los cuáles se les confiere dicha capacidad. 5. OBJETIVOS Objetivo General: ♦ Determinar la presencia de plásmidos en bacterias degradadoras de petróleo obtenidas de muestras de agua y sedimento del Oeste del Golfo de México. Objetivos particulares: • Determinar cuantitativamente las bacterias degradadoras de petróleo, de las muestras de agua y sedimento mediante la técnica del Número Más Probable en el área de estudio. • Obtener cepas puras de bacterias hidrocarbonoclásticas aisladas de las muestras de agua y sedimento. • Obtener plásmidos de las diferentes cepas aisladas de agua y sedimento. • Determinar el peso molecular de los plásmidos extraídos de las cepas bacterianas obtenidas de agua y sedimento. • Identificar las cepas bacterianas con presencia de plásmidos de las muestras de agua y sedimento. Cruz Mayorga Gabriela 19 6. ÁREA DE ESTUDIO El área de estudio se localiza en el sector oeste del Golfo de México (figura 5), frente a las costas de Tamaulipas y Veracruz en las coordenadas 26°00’00’’ latitud norte, 94°00’00’’ longitud oeste. Tamaulipas cuenta con ríos importantes que corren en dirección al Océano (Golfo de México) tal es el caso de los ríos, Bravo, Soto La Marina, San Fernando y Pánuco; las lagunas más sobresalientes son Laguna Madre, El Barril, Almagre, Morales y San Andrés (García, 2001). La plataforma continental de Tamaulipas es una región donde el desarrollo industrial y petrolero ha tenido gran auge en los últimos 40 años. Se caracteriza por ser una zona de filtraciones naturales de petróleo, además de poseer una alta dinámica costera como es el caso del Anticiclón Mexicano (Ponce et al., 1994). Parte de la economía de Tamaulipas esta basada en la producción de camarón alcanzando las 16,000 toneladas por año (Vázquez, 2000). La mayor parte del territorio de Veracruz se extiende por la planicie costera del Golfo de México, lo rigen importantes ríos Tuxpan, Tecolutla, Papaloapan y Coatzacoalcos descargando sus aguas al mar; las lagunas más sobresalientes son Tamiahua y Alvarado (Anuario estadístico, 1997). Económicamente es destacable la explotación comercial del ostión que produce alrededor de 40,000 toneladas en un año (Vázquez, 2000). La zona de estudio (Tamaulipas–Veracruz) se caracteriza por la presencia de lodos de origen terrígeno cuya presencia se debe a la gran cantidad de ríos que desembocan en esta área del Golfo (Vázquez, 2000). Los sedimentos superficiales de la plataforma son lodo y arenas finas; la plataforma en esta región es estrecha, generalmente menor a 50 Km. de ancho y finaliza a una profundidad de 100 m. (Hernández, 1999). El área recibe la influencia de la compleja hidrodinámica que ésta determinada por los patrones de circulación general que prevalecen a lo largo del Golfo de México, ya que Cruz Mayorga Gabriela 20 por sus dimensiones y sus características de cuenca semicerrada es el gran mar interior del Atlántico tropical y un verdadero mediterráneo entre las Américas del Norte y del sur (Botello et al., 1996). Se extiende en un área total de 1 768 000 Km. con regiones muy profundas mayores a 3 400 m. (De la Lanza, 1991). Almacena cerca de 2.3 x 106 Km3 de agua en donde se presentan diversos procesos físicos, químicos y biológicos (corrientes oceánicas, anillos ciclónicos y anticiclónicos, huracanes, nortes, etc.). La circulación del Golfo esta relacionada con la influencia de las aguas cálidas y salinas que constituyen la corriente de Lazo la cual entra a través del Canal de Yucatán; a su paso por la cuenca, las corrientes forman anillos que se desplazan al interior con una circulación anticiclónica e influyen a las aguas adyacentes generando remolinos ciclónicos (De la Lanza, 1991). Estos flujos juegan un papel decisivo en la circulación, en la renovación, en los balances térmicos y salinos de sus masas de agua superficial; en la climatología, en la hidrografía y en la dinámica de los procesos costeros. A esta gran masa de agua (Golfo de México) descargan 38 importantes ríos con un aporte de alrededor de 31.6 x 106 Kg s-1 de agua dulce al Golfo, acarrean 775 millones de toneladas de detritos y alrededor de 208 millones de toneladas de materiales disueltos. Constituyen también las rutas de distribución de una amplia gama de desechos tóxicos que contaminan y ponen en peligro a diversos hábitats (Botello et al., 1996). Sin embargo, las descargas de los ríos no son la única fuente de contaminantes hacia el Golfo, a lo largo de su costa existen sitios que contienen pozos petroleros, los principales reservorios se encuentran en Florida, Louisiana, Texas, Tamaulipas, Veracruz y Campeche, estas zonas son de gran importancia económica así como de puntos importantes de contaminación debido a los derrames o accidentes petroleros (López, 2002). Cruz Mayorga Gabriela 21 Figura 5.- Área de Estudio y ubicación de las estaciones de muestreo de la Campaña OGM-1. Golfo de México T am au lip as Veracruz Laguna de Tamiahua Laguna de Alvarado L at itu d N Río Soto la marina Laguna Madre 0 50 100 Km Río Tuxpan Longitud W Cruz Mayorga Gabriela 22 7. MATERIALES Y MÉTODOS El presente estudio se divide en dos fases, el trabajo realizado en campo y en el laboratorio. Campo Se realizó el muestreo durante la Campaña Oceanográfica OGM-1, de Septiembre a Octubre del 2002, a bordo del buque Oceanográfico “Justo Sierra” de la Universidad Nacional Autónoma de México. Se tomaron muestras de agua y sedimento en 56 estaciones previamenteseleccionadas perpendicularmente a la costa del Oeste del Golfo de México (figura 5). De las 71 estaciones predeterminadas para el muestreo, 15 estaciones (1 a la 11 y 58, 62, 63, 67) no fueron muestreadas por condiciones climáticas inadecuadas. Colecta de agua.- Se utilizaron bolsas bacteriológicas estériles tipo Niskin (5 litros), las cuales por medio del cable hidrográfico se bajaron a una profundidad de 10 m., a través del mensajero se rompió la bolsa para ser llenada en un lapso de diez minutos, el muestreador fue subido y posteriormente la muestra fue procesada en condiciones estériles. Colecta de sedimento.- Se utilizó una draga tipo Smith-Mclntyre, esta fue diseñada para suelos arenosos cercanos a la zona litoral o el nucleador de caja para fondo blando; se bajó a una profundidad de 20 a 300 m. (de acuerdo a la estación muestreada). En un núcleo de 5 cm. se tomó la parte superficial del sedimento con la ayuda de una jeringa estéril sin punta, se guardó la muestra en bolsas estériles para ser procesada inmediatamente en el laboratorio del barco (Negrete-Romero, 1995). Cuantificación Para la cuantificación de bacterias hidrocarbonoclásticas de las muestras de agua y sedimento se utilizó la técnica de Número Más Probable (NMP) (Mills et al., 1978; Jiménez, 2003). Debido a la duración del crucero, las primeras fases de esta técnica se realizaron en el barco. Para el conteo se efectuaron diluciones decimales en serie para ambas muestras (agua y sedimento), las diluciones fueron hechas en tubos estériles con 9 ml de medio mineral (Lyman y Fleming, 1940; Lizárraga et al., 1982); las cuales se Cruz Mayorga Gabriela 23 realizaron de la siguiente manera: se transfirió1ml de la muestra original a un primer tubo (10-1) y de este 1ml a un segundo tubo (10-2) y así sucesivamente hasta obtener una última dilución de 10-6, todo en condiciones estériles (figura 6). Posteriormente los cultivos se hicieron a partir de muestras directas y las diluciones 10-1, 10-2 de agua y para sedimento 10-4, 10-5, 10-6; por cada dilución se prepararon 3 frascos pildoreros con tapón de rosca, conteniendo 9 ml de medio mineral (Lyman y Fleming, 1940; Lizárraga et al., 1982) y 50 µl de petróleo crudo proveniente del pozo Ixtoc-I, los cuales se esterilizaron en autoclaves modelo L21, a estos frascos se les inoculó 1ml de la muestra diluida anteriormente. Los cultivos de muestra directa se obtuvieron con 1 ml de la muestra original de agua inoculada directamente a los frascos pildoreros (medio mineral y petróleo). Se obtuvieron 18 frascos por estación, 9 de agua (3 de muestra directa ,10-1, 10-2) y 9 de sedimento, considerando sólo las últimas tres diluciones (3 de 10-4, 10-5, 10-6) (Carpenter, 1979). Los cultivos se incubaron por 3 meses a 25 °C, previsto como el tiempo necesario para que se presente una óptima degradación del petróleo (Mills et al., 1978) (figura 6). Laboratorio Después de los 3 meses de incubación, se realizó la revisión de los cultivos. Los que presentaron emulsificación fueron evaluados como positivos y los negativos fueron desechados, dichos cultivos se compararon con un frasco control preparado con medio mineral y petróleo sin inóculo. Posteriormente se realizó la lectura de los viales positivos de cada muestra de agua y sedimento, obteniendo un código de tres dígitos, los cuales se buscaron en la tabla estadística correspondiente para obtener el NMP de microorganismos, esta marca el 95% de límite de confianza para cada valor (America Water Works Association, 1973). El Número Más Probable (NMP) no sólo es un método cuantitativo para microorganismos de aguas residuales y terrestres, también es empleado para microorganismos marinos. Mills et al. (1978) menciona que el método del NMP es el más Cruz Mayorga Gabriela 24 viable para la enumeración de los microorganismos degradadores de petróleo en un ambiente estuarino y marino usando medios líquidos salinos adicionados con petróleo. Aislamiento y Purificación de cepas bacterianas De los cultivos de agua y sedimento con mayores concentraciones de bacterias, se tomó 1 ml de cada uno para sembrarse en tubos con caldo Zobell (9 ml cada uno) (Oppenheimer y Zobell, 1952; Lizárraga et al., 1990), se incubaron por 48 hrs. a 25 °C. De la muestra en caldo Zobell, se tomaron 100 µl y se sembraron por expansión en medio Zobell 2216 (DIFCO) (agar marino) (Oppenheimer y Zobell, 1952; Lizárraga et al., 1991; Pereira et al., 2002) las cajas se incubaron a 25 °C por 24 hrs., posteriormente se realizó la descripción de las características morfológicas (forma, elevación, margen, tamaño, color) de las colonias (figura 7) (American Society for Microbiology, 1980). Después se seleccionaron colonias para el aislamiento y purificación de las cepas bacterianas, en base a la diversidad morfológica de las colonias en caja. Se tomaron las colonias con el asa de siembra y se sembraron en agar marino por estría con el fin de aislar las distintas cepas bacterianas; para la purificación de las colonias se utilizó el método de resiembra en placa (Brent et al., 1991). Las colonias purificadas se sembraron por estría en frascos pildoreros (por cada colonia) con agar marino colocados de forma inclinada (7 ml), se incubaron a 25 °C durante 5 días, para tener un abundante crecimiento y conservar las cepas. Del frasco se tomó una azada para hacer un cultivo y propagar el microorganismo en tubos con caldo zobell (7ml), se incubó por una semana a una temperatura de 25 °C. De los tubos con caldo Zobell se obtuvo una muestra con el asa, esta fue sembrada por estría en caja petri con agar marino para obtener las colonias separadas y homogéneas, se incubaron a 25 °C por 24 hrs., posteriormente se realizó la tinción Gram. De estas colonias se consideraron las características morfológicas (figura 7) (American Society for Microbiology, 1980). Cruz Mayorga Gabriela 25 Tinción Gram De cada caja petri se tomó una pequeña muestra para realizar la tinción (apéndice), la cual clasifica las bacterias en dos grupos: Gram negativas o Gram positivas de acuerdo a la coloración obtenida, debido a diferencias químicas de sus paredes celulares. Las Gram (+) proporcionan un color violeta intenso o azul ya que retienen el colorante violeta en su capa de péptido glucano después del intento de decoloración, mientras que en las Gram (-) tras la decoloración se elimina el cristal violeta y yodo, hasta la tinción de contraste con safranina que las tiñe de color rosa, las cuales presentan en su pared celular péptido glucano y lipopolisacáridos (Tortora et al., 1993). Las preparaciones fueron observadas al microscopio a 10X, 40X y 100X con el fin de determinar si se trataban de Gram – o + y asegurarse que las cepas estuvieran completamente puras, tomando en cuenta la forma celular (figura 7). Aislamiento de plásmidos (Birnboin y Doly, 1979) Para la extracción de plásmidos se utilizaron 16 cepas puras elegidas al azar. Las cepas purificadas se sembraron en tubos de ensayo con 7 ml de medio LB (Luria-Bertani), se incubaron a 25 °C durante 8 días en agitación a baño maría hasta igualar el grado 0.5 en la escala de MacFarland (Sidney, 1996). Para el aislamiento de plásmidos se utilizó el método de Birnboin y Doly (1979), se basa en el principio de una desnaturalización alcalina selectiva para el ADN cromosomal, mientras que el ADN del plásmido permanece. De los cultivos en medio LB se tomaron 1.5 ml y se colocaron en un tubo Eppendorf (1.5 ml de capacidad) previamente esterilizado, se centrifugó por 30 segundos en microcentrífuga a 10 000 g por minuto. Enseguida se removió cuidadosamente el sobrenadante con la ayuda de una pipeta Pasteur, en 100µl de Lisozima a una concentración de 2 mg/ml resuspendiéndola en el vórtexy se incubó durante 30 min. a 0 °C. Se agregaron 200 µl de una solución alcalina conteniendo dodecil sulfato de sodio (SDS) al 1% con 0.2 N de NaOH, mezclándolo suavemente, se colocó 5 min. a 0 °C. Después se agregó 150 µl de solución acetato de sodio 3 M con un pH 4.8, se mezcló por inversión durante unos segundos, enseguida se colocó a –20 °C por 1 hora. Se centrifugó por 5 min., la pastilla Cruz Mayorga Gabriela 26 obtenida se eliminó, de acuerdo a la técnica esta contiene ADN cromosómico y el sobrenadante fue transferido a un segundo tubo Eppendorf, se le agregó 1 ml de etanol frío, colocando el tubo a –20°C durante 30 min., después se centrífugó por 3 min., el sobrenadante se eliminó quedando la pastilla, esta fue disuelta en 100 µl de una solución de acetato de sodio 0.1 M y 100 µl de tris 0.05 M, se reprecipitó con 300 µl de etanol frío enseguida se centrifugó por 3 min., retirando 400 µl del sobrenadante. Enseguida se le agregó nuevamente 100 µl de una solución de acetato de sodio 0.1 M y 100 µl de tris 0.05 M y 300 µl de etanol frío, se volvió a centrifugar por 3 min. quedando solo la pastilla. Electroforesis Después de centrifugar, la pastilla (muestra) fue disuelta con 3 µl de RNAsa, el tubo se colocó en baño maría a 80 °C durante10 min. enseguida se le agregó 40 µl de buffer de carga 6X (Invitrogen). Las muestras se corrieron en gel de agarosa al 0.8% (Birnboin y Doly, 1979) al cual previamente se le agregó 15 µl de Bromuro de etidio. El gel (25 ml) se vertió en la cámara de electroforesis, colocando el peine de 10 pozos, dejándolo solidificar por 1 hora. Al pozo 1 se le agregó 10 µl del marcador de peso molecular de 1Kb DNA Ladder (Invitrogen), a los 8 pozos restantes 10 µl de la muestra problema y en el pozo 10 (10 µl) el plásmido de peso molecular de 10 000 pb de la cepa 38/F07 de Pseudomonas sp. (aislada del Golfo de México, Campeche) (Jiménez, 2003), se utilizó como referencia para detectar la presencia de plásmidos. La cámara de electroforesis fue llenada con Buffer de corrida hasta cubrir el gel, después se conectó a una fuente de poder (Life technologist, modelo 250) a 70 milivolts aproximadamente por 1 hora. Los geles fueron irradiados con una lámpara de luz UV, esto con el fin de hacer un examen preliminar. Una vez revelados, los geles se lavaron con agua durante 30 seg. para eliminar excesos de bromuro de etidio. Posteriormente se colocaron en el transiluminador de rayos UV a longitudes de onda corta (250-320 nm). Las imágenes de Cruz Mayorga Gabriela 27 los geles con los plásmidos fueron capturadas en la computadora (adaptada al transiluminador) por medio del programa DNA Reader. Se analizaron por duplicado todas las cepas de agua y sedimento desde el aislamiento hasta la electroforesis. Después de haber efectuado la electroforesis de las diferentes cepas que fueron sometidas al proceso de aislamiento de plásmidos de acuerdo con el método de Birnboin y Doly (1979), se calcularon los pesos moleculares de los plásmidos problema, extrapolando los valores obtenidos de su desplazamiento (movilidad relativa) con los valores del marcador, para ello se realizó una curva de calibración para cada uno de los geles por medio de una regresión lineal a través de la movilidad relativa de las bandas marcador de referencia. Se obtuvieron los pesos moleculares en pares de bases para cada uno de los plásmidos extraídos de las cepas de agua y sedimento. Identificación de las cepas bacterianas Se realizó la identificación de las cepas previamente purificadas que presentaron plásmidos por medio de la prueba bioquímica API 20 NE (bioMérieux) (Analytical Profile Index, 1999) que es un sistema estandarizado (kit) que combina 8 test convencionales y 12 test de asimilación para Gram negativos. La galería API 20 NE está compuesta por 20 microtubos que contienen medios y/o sustratos en forma deshidratada. El test 21 pertenece a la prueba de la oxidasa (si es positivo aparece un color violeta). Los test convencionales se inocularon con una suspensión bacteriana realizada en solución salina (2ml) (apéndice) con una turbidez igual al grado 0.5 en la escala de McFarland. Las reacciones producidas durante el periodo de incubación se traducen en virajes espontáneos coloreados o revelados por la adición de reactivos. A los test de asimilación se les inoculó con medio mínimo (apéndice), como resultado las bacterias crecen si son capaces de utilizar el sustrato correspondiente. Se dispuso de los reactivos necesarios contenidos en el kit (apéndice). La lectura de todas las reacciones se hizo con la ayuda de la Tabla de lectura, a partir de estos datos se realizó la identificación que se obtuvo con la Tabla de Identificación y Catálogo Analítico. Cruz Mayorga Gabriela 28 MUESTRA DE AGUA Y SEDIMENTO: 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 Serie de tres frascos por cada muestra directa y dilución 3 meses de incubación a 25 ºC 9 ml de medio mineral / tubo 9 ml de medio mineral y 50µl petróleo crudo / frasco Muestra original 1 ml de muestra directa (agua) 1 ml Cruz Mayorga Gabriela 29 Figura 6.- Diluciones en serie. AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN: 1 ml 100µl Caldo Zobell (9ml) por 48 hrs. colonias 1 colonia Caldo Zobell (7ml) Carac. morfológicas Frasco pildorero de las colonias c/agar marino inclinado Carac. morfológicas de las colonias Tinción Gram Cepa pura Medio LB grado 0.5 Macfarland Aislamiento de Plásmidos Figura 7.- Aislamiento y purificación de bacterias hidrocarbonoclásticas de muestras de agua y sedimento. resiembra en placa Caja petri c / agar marino 25°C x 24 hrs. Caja petri c / agar marino 25°C x 24 hrs. Viales positivos (+) Cruz Mayorga Gabriela 30 8. RESULTADOS Cuantificación Las muestras de la estación 12 a la 71 tanto de agua como de sedimento fueron analizadas a los tres meses de su incubación. Las muestras positivas presentaron cambios con respecto al frasco control (figura 8), en dichas muestras es evidente la presencia de bacterias degradadoras de petróleo ya que se formó una emulsión, adquirieron una coloración café (mousse de chocolate) debido a la fragmentación del petróleo (figura 9). Los resultados del estudio cuantitatitvo de agua y sedimento por estación muestreada están expresados en NMP de bacterias degradadoras de petróleo en 100 ml de muestra, las cuales se presentan en la tabla 5. Se observa que todas las estaciones presentaron bacterias hidrocarbonoclásticas tanto en muestras de agua como de sedimento. En agua las concentraciones fluctuaron entre 3 x 101 a 2.1 x 103 NMP/100 ml encontrando las mayores concentraciones de bacterias hidrocarbonoclásticas (1.5 y 2.1 x 103 NMP/100 ml) en el 14% de las estaciones muestreadas (14-17, 19, 20, 66 y 71), sin embargo, el 50% de las estaciones (18, 21, 22, 24-30, 40-42, 44-50, 53, 60, 64, 65, 68-70) (figura 10) presentaron una concentración promedio de 2.2 x 102 NMP/100 ml. Para las muestras de sedimento se presentaron concentraciones de 3.6 x 105 a 4.6 x 107 NMP/100 ml, esta última concentración sólo se encontró en las estaciones 16, 17, 20 y 29 (4%), sin embargo, el 65% de las estaciones(12-15, 18,19, 21-28, 30, 35, 37, 40- 50, 52, 53, 64-69 y 71) (figura 10) presentaron una concentración promedio de 2.1 x 106 NMP/100 ml. La figura 11 muestra la distribución de todas las concentraciones de bacterias hidrocarbonoclásticas de las muestras de agua y sedimento, en la cual se observa que las estaciones que presentaron mayores concentraciones para ambas muestras, se localizan frente a la desembocadura de la Laguna Madre (Tamaulipas), Laguna de Tamiahua y la Laguna de Alvarado (Veracruz), además se presenta que en las muestras de sedimento las concentraciones son más elevadas en comparación con las de agua. Cruz Mayorga Gabriela 31 Figura 8.- Frascos con medio mineral y petróleo. A) con degradación de petróleo, B) control. Figura 9.- Degradación de una microgota de petróleo por Pseudomonas. Cruz Mayorga Gabriela 32 Tabla 5.- NMP de bacterias / 100 ml de las muestras de agua y sedimento de las estaciones 12- 71estaciones, de la estación 1 a 11, 58, 63, 67 no fueron muestreadas; nm = no muestreada. ESTACIÓN AGUA NMP/100ml SEDIMENTO NMP/100ml ESTACIÓN AGUA NMP/100ml SEDIMENTO NMP/100ml 12 nm 2 x 106 41 2.3 x 102 2 x 106 13 nm 2.8 x 106 42 2 x 102 2 x 106 14 1.5 x 103 2.8 x 106 43 7.3 x 101 1.5 x 106 15 1.5 x 103 2.1 x 106 44 1.5 x 102 2.1 x 106 16 2.1 x 103 4.6 x 107 45 1.5 x 102 1.5 x 106 17 1.5 x 103 4.6 x 107 46 2.3 x 102 2.1 x 106 18 2.8 x 102 2.8 x 106 47 2.8 x 102 2.1 x 106 19 1.5 x 103 2.8 x 106 48 2.8 x 102 1.5 x 106 20 2.1 x 103 4.6 x 107 49 2.8 x 102 2 x 106 21 2.8 x 102 2.8 x 106 50 2 x 102 2.1 x 106 22 2.3 x 102 2.8 x 106 51 3 x 101 3.6 x 105 23 7.3 x 101 2.1 x 106 52 3.6 x 101 1.5 x 106 24 2 x 102 2.8 x 106 53 2.1 x 102 2 x 106 25 2.1 x 102 2.1 x 106 54 7.2 x 101 3.6 x 105 26 2 x 102 2.1 x 106 55 3.6 x 101 3.6 x 105 27 2 x 102 2.1 x 106 56 7.2 x 101 7.3 x 105 28 2.3 x 102 2.8x 106 57 6 x 101 3.6 x 105 29 2.8 x 102 4.6 x 107 59 7.3 x 101 6 x 105 30 2.8 x 102 2 x 106 60 2.8 x 102 3.6 x 105 31 7.3 x 101 3.6 x 105 61 3.6 x 101 3.6 x 105 32 3.6 x 101 3.6 x 105 62 3.6 x 101 nm 33 7.3 x 101 3.6 x 105 64 2.3 x 102 2.1 x 106 34 7.3 x 101 3.6 x 105 65 2.8 x 102 2.1 x 106 35 3 x 101 1.5 x 106 66 1.5 x 103 2.1 x 106 36 3.6 x 101 7.3 x 105 68 2.1 x 102 2.8 x 106 37 3.6 x 101 2 x 106 69 2 x 102 2.8 x 106 38 7.3 x 101 3.6 x 105 70 2.3 x 102 3.6 x 105 39 7.3 x 101 3.6 x 105 71 1.5 x 103 2.8 x 106 40 2 x 102 2 x 106 --- --- --- Cruz Mayorga Gabriela 33 Figura 10.- Distribución de bacterias hidrocarbonoclásticas de acuerdo a las altas concentraciones. 19° 20° 21° 22° 23° 24° 25° 26° 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 99° 98° 97° 96° 95° 94° 0 50 100 km Golfo de México Veracruz Río Tuxpan Laguna de Alvarado T am au lip as Laguna Madre Río Soto la marina Laguna de Tamiahua Sedimento (107) (106 ) Agua (103 ) (102 ) NM (no muestreadas) Rio Pánuco Río Tecolutla Cruz Mayorga Gabriela 34 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 61 66 71 estaciones lo g de N M P /1 00 m l Agua Sedimento Figura 11.- Distribución espacial de bacterias hidrocarbonoclásticas de muestras de agua y sedimento del Oeste del Golfo de México. Cruz Mayorga Gabriela 35 Características morfológicas de las colonias Para el aislamiento de las cepas utilizadas se observó la morfología de caja; se encontraron características similares en las muestras de agua y sedimento. El color que predominó en las colonias fue el blanco cremoso repitiéndose en varias estaciones, para agua (a) se presenta un 64% y en sedimento (s) 54%, después blanco transparente 20% (a), 23% (s), amarillo claro14% (a), 20% (s), el color naranja sólo se presentaron en las colonias de la estación 26 en la muestra de agua con el 2% y el color blanco solo en la estación 21 para sedimento con el 2%; se observaron tres tipos de forma, circular, irregular y puntiforme para ambas muestras, circular 54% (a), 51% (s), irregular 24% (a), 25% (s) y puntiforme 22% (a), 24% (s); en cuanto a la elevación se presentó con mayor frecuencia la convexa con 92% (a) y 96% (s), la elevación plana 6% (a), 4% (s) y cupulada 2% (a), esta última elevación no se presentó en las muestras de sedimento. El tamaño fue variable, de acuerdo a la forma de la colonia las más pequeñas fueron aquellas de forma puntiforme con un tamaño promedio de .08 cm tanto para agua como para sedimento; en cuanto a la luz de las colonias 80% opaca (a), 90% (s), translúcida 20% (a), 10% (s); el margen 100% entero en ambas muestras (agua-sedimento) (tabla 6 y 7). Cruz Mayorga Gabriela 36 Tabla 6.- Características de las colonias de las muestras de agua con mayores concentraciones de acuerdo al NMP (número más probable) crecidas en agar marino. Estación Tamaño-cm Color Forma Elevación Margen Luz 14 .20-.06 B. C. circular convexa entero opaca 15 .22-.07 B. C. circular convexa entero opaca 16 .14-.09 B. C. circular convexa entero opaca 17 .17-.05 B. C. circular convexa entero opaca “ .15-.1 A. C. irregular convexa entero opaca “ .05-.03 B. T. puntif. convexa entero translúcida 18 .12-.09 B. C. circular convexa entero opaca 19 .16-.1 B. C. irregular convexa entero opaca 20 .19-.04 B. C. circular convexa entero opaca 21 .19-.04 B. C. circular convexa entero opaca 22 .14-.09 B. C. circular convexa entero opaca 24 .13-.12 B. C. circular convexa entero opaca 25 .18-.08 B. C. circular convexa entero opaca " .06-.05 B. T. puntif. convexa entero translúcida 26 .09 NRAJ puntif. cupulada entero opaca 27 .07-.04 B. T. puntif. convexa entero translúcida 28 .09-.05 B. T. puntif. convexa entero translúcida 29 .13-.09 B. C. irregular convexa entero opaca 30 .19-.04 B. C. circular convexa entero opaca “ .05-.03 B. T. puntif. convexa entero translúcida 40 .09-.06 B. C. irregular plana entero opaca 41 .19-.04 B. C. circular convexa entero opaca 42 .27-.05 B. C. circular convexa entero opaca “ .05-.01 B. T. puntif. convexa entero translúcida 44 .14-.05 B. C. circular convexa entero opaca “ .03-.01 B. T. puntif. convexa entero translúcida 45 .11-.02 B. C irregular convexa entero opaca “ .19-.11 A. C. irregular convexa entero opaca 46 .17-.05 B. C. circular convexa entero opaca “ .17-.12 A. C. circular convexa entero opaca 47 .27-.12 B. C. irregular plana entero opaca “ .12-.1 A. C. circular convexa entero opaca 48 .3-.07 B. C. irregular convexa entero opaca 49 .1-.04 B. C. circular convexa entero opaca Cruz Mayorga Gabriela 37 (puntif. = puntiforme, B. C. = Blanco Cremoso, B. T. = Blanco Transparente, NRAJ. = Naranja, A. C. = Amarillo Claro). 50 .14-.05 B. C. circular convexa entero opaca “ .19-.13 A. C. irregular convexa entero opaca “ .07-.02 B. T. puntif. convexa entero translúcida 53 .23-.1 B. C. circular convexa entero opaca “ .12-.1 A. C. circular convexa entero opaca “ .05-.02 B. T. puntif. convexa entero translúcida 60 .38-.1 B. C. irregular plana entero opaca “ .17-.13 A. C. circular convexa entero opaca 64 .27-.05 B. C. circular convexa entero opaca 65 .19-.04 B. C. circular convexa entero opaca 66 .13-.06 B. C. circular convexa entero opaca “ .08-.04B. T. puntif. convexa entero translúcida 68 .19-.04 B. C. circular convexa entero opaca 69 .10-.02 B. C. irregular convexa entero opaca 70 .15-.07 B. C. irregular convexa entero opaca 71 .14-.09 B. C. circular convexa entero opaca Cruz Mayorga Gabriela 38 Tabla 7.-Características de las colonias de las muestras de sedimento con mayores concentraciones de acuerdo al NMP (número más probable) crecidas en agar marino. Estación Tamaño-cm Color Forma Elevación Margen Luz 12 .14-.08 B. C circular convexa entero opaca 13 .15-.06 B. C. circular convexa entero opaca 14 .17-.05 B. C. circular convexa entero opaca 15 .12-.06 B. C. circular convexa entero opaca 16 .13-.1 B. C. circular convexa entero opaca 17 .14-.1 B. C. circular convexa entero opaca “ .06-.04 B. T. puntif. convexa entero translúcida 18 .23-.06 B. C. circular convexa entero opaca " .14-.1 A. C. circular convexa entero opaca 19 .07 B. T. puntif. convexa entero translúcida 20 .12-.09 B. C. circular convexa entero opaca 21 .1 B. circular convexa entero opaca 22 .08 B. T. puntf. convexa entero opaca 23 .21-.09 B. C. circular convexa entero opaca 24 .16-.07 B. C. irregular convexa entero opaca 25 .09-.02 B. T. puntif. convexa entero translúcida 26 .21-.07 B. C. circular convexa entero opaca “ .15-.1 A. C. irregular convexa entero opaca 27 .09-.02 B. T. puntif. convexa entero translúcida 28 .12-.05 B. C. circular convexa entero opaca 29 .17-.09 B. C. circular convexa entero opaca “ .13-.1 A. C. irregular convexa entero opaca 30 .19-.06 B. C. circular convexa entero opaca “ .15-.1 A. C. circular convexa entero opaca 35 .12-.05 B. C. irregular convexa entero opaca “ .14-.1 A. C. circular convexa entero opaca 37 .1-.07 B. C. irregular convexa entero opaca 40 .1-.07 B. C. irregular convexa entero opaca 41 .15-.06 B. C. irregular convexa entero opaca “ .12-.1 A. C. circular convexa entero opaca 42 .21-.09 B. C. circular convexa entero opaca " 0.5-.02 B. T. puntif. convexa entero translúcida 43 .25-.1 B. C. circular convexa entero opaca “ .19-.1 A. C. circular convexa entero opaca 44 .25-.07 B. C. irregular plana entero opaca “ .05-.02 B. T. puntif. convexa entero translúcida 45 .14-.09 B. C. irregular plana entero opaca 46 .16-.09 B. C. irregular convexa entero opaca 47 .14-.08 B. C. circular convexa entero opaca “ .04-.02 B. T. puntif. convexa entero translúcida Cruz Mayorga Gabriela 39 (puntif. = puntiforme, B. C. = Blanco Cremoso, B. T. = Blanco Transparente, B. = Blanco, A. C. = Amarillo Claro). 48 .20-.15 B. C. circular convexa entero opaca “ .08-.05 B. T. puntif. convexa entero translúcida 49 .9-.04 B. T. puntif. convexa entero translúcida 50 .19-.06 B. C. circular convexa entero opaca " .12-.1 A. C. circular convexa entero opaca 52 .15-.1 B. C. circular convexa entero opaca “ .15-.1 A. C. irregular convexa entero opaca 53 .15-.06 B. C. circular convexa entero opaca “ .16-.12 A. C. irregular convexa entero opaca 64 .07-.03 B. T. puntif. convexa entero translúcida 65 .09-.04 B. T. puntif. convexa entero translúcida 66 .19-.06 B. C. circular convexa entero opaca “ .15-.1 A. C. irregular convexa entero opaca 68 .19-.06 B. C. circular convexa entero opaca “ .20-.15 A. C. circular convexa entero opaca 69 .25-.1 B. C. circular convexa entero opaca “ .08-.06 B. T. puntif. convexa entero translúcida 71 .16-.02 B. C. irregular convexa entero opaca Cruz Mayorga Gabriela 40 Obtención de cepas puras y Tinción Gram Se aislaron y purificaron 37 cepas (19 cepas de agua y 18 de sedimento) las cuales fueron seleccionadas de acuerdo a la diversidad morfológica de las colonias (figura 12). Por otra parte, la tinción Gram indicó que el 100% de las cepas de las muestras de agua y sedimento se caracterizaron por ser bacterias Gram negativo. En cuanto a la forma celular, en general las cepas de agua y sedimento mostraron una morfología característica de bacilos (95%), a excepción de la estación 21 (sedimento) que se observaron diplococos y para la estación 26 (agua) monococos (5%). En la tabla 8 se presentan las características morfológicas de las colonias aisladas y purificadas de las muestras de agua y sedimento. Tabla 8.- Características de las cepas aisladas (A = agua, S = sedimento) (- = negativo) (F. C. = forma celular) (trans. =translúcida) (B. C. =Blanco Cremoso, B. T. = Blanco Transparente, B. = blanco, A. C. = Amarillo Claro, NRA. = naranja). Estación A S tamaño forma elevación margen luz color Gram F. C. 16-46-71 * .11cm circular convexa entero opaca B. C. - bacilos 16-43-66 * .14cm circular convexa entero opaca B. C. - bacilos 47-53-60 * .12cm circular convexa entero opaca A. C. - bacilos 18-43-68 * .13cm circular convexa entero opaca A. C. - bacilos 17-45-50 * .14cm irregular convexa entero opaca A. C. - bacilos 29-52-66 * .14cm irregular convexa entero opaca A. C. - bacilos 19-45-69 * .13cm irregular convexa entero opaca B. C. - bacilos 24-41-71 * .14cm irregular convexa entero opaca B. C. - bacilos 40-47-60 * .13cm irregular plana entero opaca B. C. - bacilos 44-45 * .30cm irregular plana entero opaca B. C. - bacilos 17-42-66 * .07cm puntiforme convexa entero trans. B. T. - bacilos 17-48-69 * .08cm puntiforme convexa entero trans. B. T. - bacilos 21 * .08cm circular convexa entero opaca B. - diplococos 26 * .09cm puntiforme cupulada entero opaca NRA. - monococos Cruz Mayorga Gabriela 41 Estación 16 (agua) Estación 19 (agua) Estación 21 (sedimento) Estación 17 (sedimento) Estación 26 (agua) Figura 12.- Características de algunas cepas purificadas (en caja petri con agar marino). Cruz Mayorga Gabriela 42 Aislamiento de plásmidos Se eligieron al azar 16 cepas puras para la extracción de plásmidos (agua-estación 71, 16, 40, 50, 19, 47, 66, 26 y sedimento-estación 43, 45, 16, 71, 48, 66, 29, 21) de las cuales 14 fueron positivas (presencia de plásmidos). En la figura 13 se muestra el gel con las muestras de agua, se observa que en 6 cepas (pozo 2, 3, 5, 6, 7, 8) hay presencia de plásmidos (uno por cepa); en los pozos 4 y 9 no se presenta algún bandeo, podemos decir que no hay plásmidos. Para ambos geles (agua, sedimento) en el pozo 1 se encuentra el marcador de 1 Kb que se tomó como referencia para obtener el peso molecular de los plásmidos de las cepas y en el pozo 10 el plásmido de referencia. En la figura 14 se muestra la curva de calibración de acuerdo a los datos de la tabla 9 que corresponde a la migración del marcador, para el análisis de cada una de las cepas de agua. En la tabla 10 se muestran los pesos moleculares de los plásmidos presentes en las cepas de las muestras de agua, calculados a partir de la movilidad relativa (migración de las muestras). Figura 13.- Gel de agarosa sujeto a electroforesis para las muestras de agua. Pozo 1) marcador; 2) estación 71; 3) estación 16; 4) estación 40; 5) estación 50; 6) estación 19; 7) estación 47; 8) estación 66; 9) estación 26; 10) plásmido de referencia (cepa 38/F07). 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 216 pb 3 054 pb 2 036 pb 1 636 pb 1 018 pb Cruz Mayorga Gabriela 43 y = -2.6098x + 5.0793 R2 = 0.9847 2.9 3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Rf lo g P M Figura 14.- Curva de calibración del marcador de referencia (1kb DNA Ladder) para determinar los pesos moleculares de cada plásmido presente en las cepas de las muestras de agua; log PM (logaritmo del peso molecular).
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