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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA “Aislamiento y caracterización parcial de bacterias lácticas halófilas de quesos en México” TESIS Para Obtener el Título de: QUIMICA DE ALIMENTOS PRESENTA: Adriana Berenice Gutiérrez Ortega MÉXICO, D.F. 2008. Neevia docConverter 5.1 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. JURADO ASIGNADO: PRESIDENTA: Maria Elena Cañizo Suárez. VOCAL: Dra. Maria del Carmen Wacher Rodarte. SECRETARIO: Dr. Humberto Hernández Sánchez. 1er SUPLENTE: Agustín Reyo Herrera. 2do SUPLENTE: Martha Giles Gómez. LUGAR DONDE SE DESARROLLÓ EL TEMA: Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional. ASESOR: Dr. Humberto Hernández Sánchez. _________________________ SUSTENTANTE: Adriana Berenice Gutiérrez Ortega. ________________________ Neevia docConverter 5.1 i Dedicada a ese angelito que siempre estuvo a mi lado y aunque no físicamente si en mis pensamientos y que fue mi inspiración para terminar mi carrera, pero sobre todo mi motivación para salir adelante y no caerme, gracias por estar siempre conmigo y perdón por no poder verte. Neevia docConverter 5.1 ii AGADECIMIENTOS A Dios por darme tantas oportunidades y que a pesar de mis fracasos siempre ha estado a mi lado y me ha perdonado todo sin merecerlo, enseñándome lo maravilloso que es la vida, que con dedicación y trabajo todo se puede lograr. A la virgen de Españita por que siempre ha estado a mi lado y me ha dado la fe para seguir adelante. A la H. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO por darme la oportunidad de pertenecer a esta gran institución a la cual le debo más de lo que me ha dado, por que es un gran orgullo ser universitaria. A mi madre, por ser una gran mujer, un ejemplo a seguir y la mejor madre del mundo, por enseñarme a luchar por lo que se quiere y buscar una mejor calidad de vida, por darme la vida y cuidar de mi, y por defender siempre a tu familia, gracias mamita te quiero mucho. A mi hermana Karla por ser la única de mi familia que ha creído en mi, por su apoyo incondicional y sus palabras de aliento, que para mi ella es un gran ejemplo a seguir y mi mayor orgullo y por ser la mejor hermana del mundo, gracias, te quiero mucho. A mi padre por que a pesar de que nunca ha creído en mi, y que para él vale más cualquier crítica en contra mía, que mis propias palabras, a pesar de que yo soy su hija. Le he demostrado con esto de lo que soy capaz. Y sin embargo para mí siempre será mi padre y el mejor del mundo. A mi abuelo Francisco Ortega C. (q. p. d.) por ser el mejor abuelo del mundo y darme la oportunidad de conocerlo y dejarme una sonrisa como el mejor recuerdo que tengo de él. Y darme lo más valioso de mi vida, que es mi madre. A mi abuelita Concepción Gudiño (q. p. d.) por ser la mejor abuelita del mundo, una gran mujer y sobre todo muy sabia, por que otra como ella no creo que exista. Al Instituto Politécnico Nacional por prestarme sus instalaciones para la realización de mi tesis. Al Dr. Humberto Hernández S. por darme el honor y la oportunidad de conocerlo y trabajar con él, por su apoyo y atención hacia mí. Neevia docConverter 5.1 iii A mi mejor amiga Laura A. Salgado por estar conmigo siempre y brindarme lo más valioso del mundo que es para mi, su gran amistad. Gracias por estos 11 años de conocerte. A Saúl Arellano E. por aguantarme tanto y demostrarme lo que es que alguien te ame de verdad, gracias por estar conmigo a pesar de todo. Te quiero mucho. A mi gran amiga Luz María Román Miranda por brindarme su amistad y ser un gran ejemplo a seguir, por que ella demuestra lo fuerte que es una mujer, por que es esposa, madre, estudiante, trabajadora y para mi es un orgullo tenerla como amiga por que es un gran ejemplo para muchas. Al mejor amigo del mundo Francisco J. Reyes R. por estar conmigo en muchas situaciones difíciles, escucharme y darme sus sabios consejos, pero sobre todo por brindarme su valiosísima amistad, gracias. Te quiero mucho. A Fredy Morales Trejo, por ayudarme en el desarrollo de mi tesis y hacerme muy divertida la estancia en el laboratorio (sobre todo por platicar mucho conmigo). Gracias por tu apoyo. A mis amigos y compañeros de la H. Facultad de Química, Alicia Barbosa, Talía A., Verónica Aviles, Aída C., Norma M., Iralda, Jesús Barbosa y Rosa. A mis amigos y compañeros del laboratorio del H. Instituto Politécnico Nacional, a Maribel C. (por ser la primera en hacerme sentir muy a gusto en el laboratorio al brindarme lo más valioso de cada ser humano que es la amistad), a Alaide, Brenda, Alejandro, Deni y su esposo David. Neevia docConverter 5.1 iv “La Universidad es el gran proyecto social de la nación mexicana. Los beneficios para el país están a la vista, son inobjetables. Pero la universidad es también un proyecto siempre inacabado, siempre mejorado, prodigioso y generoso; criticado y elogiado, polémico y diverso” (Juan Ramón de la Fuente) “No hay situación por difícil que parezca que no sirva para evolucionar” (Alejandro Maldonado) “Si engrandecemos nuestras alegrías como engrandecemos nuestras penas, nuestras dificultades se perderían” (Alejandro Maldonado) Neevia docConverter 5.1 v INDICE I. INTRODUCCION ........................................................................................................ 2 II. ANTECEDENTES ...................................................................................................... 5 II.1. Generalidades de la leche ................................................................................... 5 II.2. Fabricación de quesos ........................................................................................5 II.3. Maduración de los quesos ................................................................................... 6 II.3.1. Queso Tipo Cotija ......................................................................................... 6 II.3.2 Queso Doble Crema ...................................................................................... 8 II.4.1. Papel de las LAB en la fabricación de quesos ........................................... 10 II.5. Cultivos iniciadores. ........................................................................................... 11 II.5.1. Funciones esenciales de los cultivos iniciadores. ...................................... 13 II. 5.2.- Bacterias ácido lácticas no iniciadoras (NSLAB) ..................................... 13 II.5.3. Papel de los metabolitos de las bacterias lácticas en tecnología quesera. 15 II.5.3.1. Ácido láctico ......................................................................................... 15 II.5.3.2. Péptidos, aminoácidos y productos derivados .................................... 16 II.5.4. Fuentes de las bacterias lácticas ................................................................ 17 II.5.5. HALAB en quesos ....................................................................................... 18 II.6. Aislamiento y caracterización de microorganismos .......................................... 20 II.6.1. Aislamiento y recuento. ............................................................................... 20 II.6.2. Características fisiológicas y bioquímicas. ................................................. 21 II.6.2.1 Prueba catalasa .................................................................................... 21 II.6.2.2 Prueba de oxidasa. ............................................................................... 22 II.6.2.3 Prueba de hidrólisis en almidón ............................................................ 24 II.6.2.4 Prueba de licuefacción de gelatina. ...................................................... 28 II.6.2.5 Prueba de Voges-Proskauer (VP-MR). ................................................. 29 II.6.2.6 Prueba de hidrólisis de caseína. ........................................................... 30 II.6.2.7 Prueba de reducción de nitrato. ............................................................ 31 II.6.2.8 Producción de gas a partir de glucosa y pruebas de fermentación de hidratos de carbono. .......................................................................................... 33 II.6.2.9 Producción de amoniaco a partir de arginina. ...................................... 35 II.6.2.10 Determinación de la actividad lipolítica. .............................................. 35 II.6.2.11 Determinación de la actividad proteolítica. ......................................... 36 III. OBJETIVOS ............................................................................................................ 38 III.1. Objetivo general ............................................................................................... 38 Neevia docConverter 5.1 vi III.2. Objetivos particulares ....................................................................................... 38 IV. JUSTIFICACIÓN ..................................................................................................... 40 V. METODOLOGÍA. ..................................................................................................... 42 V.1. Materia prima. ................................................................................................... 42 V.2. Métodos de análisis .......................................................................................... 42 V.2.1 Determinación de humedad. ....................................................................... 42 V.2.2. Determinación de pH. ................................................................................. 42 V.3. Preparación de los medios de aislamiento de bacterias ácido-lácticas halófilas. .................................................................................................................... 43 V.4. Aislamiento de bacterias ácido-lácticas halófilas a partir de muestras de queso. ....................................................................................................................... 45 V.5. Características morfológicas y de cultivo.......................................................... 46 V.5.1. Prueba de Movilidad. ................................................................................. 46 V.6. Características de crecimiento en relación a [NaCl], temperaturas y tiempo óptimo de crecimiento. ............................................................................................. 47 V.7. Características fisiológicas y bioquímicas. ....................................................... 48 V.7.1. Prueba de Catalasa ....................................................................................... 48 V.7.2. Prueba de Oxidasa. ....................................................................................... 48 V.7.3. Prueba de hidrólisis de almidón. .................................................................... 49 V.7.4. Prueba de licuefacción de gelatina. ............................................................... 49 V.7.5. Prueba de Voges-Proskauer y Rojo de Metilo (VP-MR). .............................. 50 V.7.6. Prueba de hidrólisis de caseína. .................................................................... 50 V.7.7. Prueba de reducción de nitrato. ..................................................................... 51 V.7.8. Producción de gas a partir de glucosa. ......................................................... 52 V.7.9. Producción de amoniaco a partir de arginina. ............................................... 52 V.7.10. Determinación de la actividad lipolítica, se realizo en agar de tributirina. ... 52 V.7.11 Determinación de la actividad proteolítica. ................................................... 53 VI. Diagrama de Bloques ............................................................................................. 54 VI.1. Esquema general del aislamiento y caracterización de las cepas aisladas del queso tipo cotija (QC) y queso doble crema (QDC). ................................................ 54 VI.2. Preparación de la leche para inocular. ............................................................ 55 VI.3 Aislamiento de las bacterias presentes en los quesos utilizados (queso tipo cotija y queso doble crema). ........................................................................................ 55 VII. Equipo y Reactivos ................................................................................................ 56 Neevia docConverter 5.1 vii VIII. Resultados y discusión. ........................................................................................ 58 VIII.1. Análisis de los quesos tipo cotija y doble crema. .......................................... 58 VIII.2. Determinación del contenido de NaCl. .......................................................... 58 VIII. 4. Características microscópicas y macroscópicas a partir de las cepas aisladas del queso tipo cotija (QC) y queso doble crema (QDC). ........................... 60 VIII. 4.1. Observaciones microscópicas: ............................................................... 60 VIII.4.2. Observaciones macroscópicas: .............................................................. 61 VIII.5. Determinación de [NaCl], Temperatura y tiempo óptimo de crecimiento para cada cepa aislada. .................................................................................................... 65 VIII.6. Pruebas bioquímicas. ..................................................................................... 70IX. CONCLUSIONES ................................................................................................... 75 X. GLOSARIO .............................................................................................................. 78 X.1. Abreviaturas ...................................................................................................... 79 XI. BIBLIOGRAFÍA. ...................................................................................................... 81 INDICE DE FIGURAS Fig. 1 Ruta metabólica de la lactosa en bacterias lácticas homofermentativas (www.biologia.edu.ar) ................................................................................................... 10 Fig. 2 Ruta metabólica de la lactosa en bacterias lácticas heterofermentativas (www.biologia.edu.ar) ................................................................................................... 10 Fig. 3 Cultivos iniciadores de bacterias ácido-lácticas homofermentativas (www.biologia.edu.ar) ................................................................................................... 12 Fig. 4 Ruta metabólica para la producción de ............................................................ 15 ácido láctico (www.biologia.edu.ar).............................................................................. 15 Fig.5 Ejemplo de la proteolísis esquematizado por el sistema proteolítico de los lactococcos (www.biologia.edu.ar)............................................................................... 17 Fig.6 Imagen de una bacteria con flagelos peritricos .................................................. 19 Fig.7 Molécula de Glucosa ........................................................................................... 25 Tabla 2. Datos del contenido de NaCl de los quesos tipo cotija y doble crema (fresco y seco) ............................................................................................................................. 59 Tabla 3. Datos de pH en caldo GYPC y en leche descremada inoculados con las cepas aisladas de los quesos tipo cotija y doble crema. ............................................. 59 Fig. 8 Tinción Gram de las bacterias halófilas aisladas del ......................................... 60 Neevia docConverter 5.1 viii queso tipo cotija [bacterias Gram (+)] .......................................................................... 60 Fig. 9 Tinción Gram de las bacterias halófilas aisladas del ......................................... 61 queso doble crema [bacterias Gram (+)] ..................................................................... 61 Fig. 10 Cepas del QDC y QC inoculadas en caldo GYPC a las 24 h. a) caldo GYPC sin inocular, b) caldo GYPC inoculado con la cepa aislada de QDC y c) caldo GYPC inoculado con la cepa aislada del QC .......................................................................... 62 Fig. 11 Cepas del QDC y QC inoculadas en caldo GYPC a las 48 h. d) caldo GYPC sin inocular, e) caldo GYPC inoculado con la cepa de QC y f) caldo GYPC inoculado con la cepa de QDC. .................................................................................................... 62 Fig. 12 Colonias de queso tipo cotija en agar GYPC a las 48 h. de inoculación. ....... 63 Fig.13 Colonias de QDC en agar GYPC inclinado. ..................................................... 63 Fig. 14 Colonias de queso doble crema en agar GYPC a las 48 h. de inoculación. ... 63 Fig.15 Prueba de movilidad de la cepa del queso tipo cotija. i) Medio sin TTC y j) Amplificación de la imagen j k) Medio con TTC. .......................................................... 64 Fig. 16 Curva de crecimiento a diferentes concentraciones de NaCl para la cepa aislada del QDC a 24 y 48 horas de incubación. ......................................................... 65 Fig. 17 Curva de crecimiento a diferentes concentraciones de NaCl para la cepa aislada del QC a las 24 y 48 horas de incubación. ..................................................... 66 Datos de la figura 17. ................................................................................................... 66 Fig. 18 Curva de crecimiento a la concentración óptima de NaCl para la cepa aislada del QC, la cual es al 2.5% y a las 48 horas. ................................................................ 67 Fig. 19 Curva de crecimiento a diferentes Temperaturas para determinar la Temperatura óptima para la cepa aislada de QDC con 4% NaCl. ............................. 67 Fig. 20 Curva de crecimiento que como se observa el tiempo de desarrollo óptimo es a las 48 horas. .............................................................................................................. 68 Fig. 21 Curva de crecimiento promedio de las absorbancias de la fig. 20 en relación al tiempo de desarrollo óptimo el cual es a las 48 horas (círculo color vino). ................. 68 Fig. 22 Curva de crecimiento en relación al tiempo de desarrollo óptimo para el QC el cual es a las 48 horas. ................................................................................................. 69 Fig. 23 Curva de crecimiento en relación al tiempo de desarrollo óptimo (círculo color vino) para la cepa aislada de QC el cual es a las 48 horas (promedio de la grafica fig. 21). ............................................................................................................................... 69 Datos de las figuras 22 y 23. ........................................................................................ 70 Cuadro 1. Pruebas bioquímicas ................................................................................... 70 Neevia docConverter 5.1 ix Cuadro 2. Características bioquímicas y fisiológicas de las bacterias aisladas de los quesos europeos reportados en la literatura. .............................................................. 71 Cuadro 3. Características bioquímicas y fisiológicas de las cepas aisladas. .............. 71 Cuadro 4. Resultados de la prueba de fermentación de carbohidratos. ..................... 72 Neevia docConverter 5.1 I. INTRODUCCIÓN 1 INTRODUCCIÓN Neevia docConverter 5.1 I. INTRODUCCIÓN 2 I. INTRODUCCION El queso es un alimento extraordinario, porque tiene un valor nutricional muy completo; es rico en proteínas, calcio y vitaminas A y D. Actualmente, existen más de 50 razas de animales que producen leche para elaborar queso como son: vacas, búfalas, ovejas, cabras, llamas, entre otras razas que aportan sus cualidades hasta obtener una gran variedad de sabores, olores y colores en los quesos, esto sin importar el método tradicional y/o artesanal para prepararse, la fabricación en ranchos, cooperativas o de forma industrial; hay quesos que solamente se producen en su país de origen. Uno de los principales contribuyentes a la maduración de los quesos son las “bacterias ácido lácticas” (LAB). Sin embargo, los medios alcalinos y salinos para la cuantificación o aislamiento de las LAB, no han sido aplicados previamente al análisis de la microbiota en los quesos. Actualmente se sabe que el origen de estas comunidades LAB esta tanto en intestinos de humanos como de animales, en productos lácteos, alimentos vegetales fermentados y de agua de mar (llamadas bacterias lácticas marinas). El descubrimiento relativamente reciente de las llamadas bacterias lácticas marinas y su aislamiento a partir de agua de mar y de la corteza de algunos quesos madurados europeos ha dado lugar a una serie de investigaciones en Europa y Japón para tratar de averiguar el posible papel de estos microorganismos en la maduración de esos quesos. Los géneros principales identificados son: Marinilactibacillus y Halolactibacillus y tienenlas características de ser halofílicos. Neevia docConverter 5.1 I. INTRODUCCIÓN 3 Durante la producción de quesos, se les adiciona alrededor de 5% (w/w) de NaCl y el pH se incrementa de alrededor de 5.0 hasta arriba de 7.5. Sin embargo, los medios alcalinos y salinos para la cuantificación o aislamiento de las LAB, no han sido aplicados previamente al análisis de la microbiota en los quesos. Se piensa que la fuente de estos microorganismos puede ser la sal de origen marino que se utiliza en la fabricación de estos quesos (Ishikawa et al., 2006). En México existen varios quesos con bastante sal y relativamente bajo contenido de humedad (Queso tipo cotija, doble crema de Pijijiapan Chiapas, etc.) que pudieran contener este tipo de bacterias. Las bacterias acido-lácticas (LAB) juegan un papel importante en los procesos de fermentación láctea y cárnica, y tienen una gran influencia en la calidad y preservación de los productos finales. Los papeles primarios de las LAB son la producción de ácido láctico a partir de carbohidratos, dando como resultado un decremento de pH y la proteólisis para liberar péptidos cortos y aminoácidos libres. Estos compuestos afectan el sabor y textura de los productos. Por lo tanto, el conocimiento de los sistemas proteolíticos y de transporte globales de estas bacterias ha sido el principal sujeto de investigación en las dos décadas pasadas (Piuri et al., 2003). El objetivo de este estudio es la cuantificación y aislamiento de las bacterias lácticas usando medios salinos, con la intención de confirmar la presencia de bacterias ácido lácticas halofílicas (nombradas HALAB, quizá de origen marino) en queso doble crema y queso tipo cotija, así como para conocer su papel en la maduración de los quesos; además de su caracterización fisiológica (capacidad de acidificación, proteólisis, lipólisis, etc.). Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 4 ANTECEDENTES Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 5 II. ANTECEDENTES II.1. Generalidades de la leche. La leche fue uno de los primeros alimentos pecuarios utilizados por el hombre e incluso, uno de los primeros alimentos sometidos a procesos fermentativos debido a la facilidad con que sufre transformaciones microbianas que la acidifican; de esta manera el hombre de la antigüedad aprendió el arte de elaborar leches fermentadas y muy probablemente a partir de éstas, los primeros quesos (García et al., 1993, Alais, 1998). II.2. Fabricación de quesos. Según la NOM-121-SSA1-1994, los quesos son productos elaborados con la cuajada de leche estandarizada y pasteurizada de vaca o de otras especies animales, con o sin adición de crema, obtenida por la coagulación de la caseína con cuajo, bacterias lácticas, enzimas apropiadas, ácidos orgánicos comestibles y con o sin tratamiento ulterior por calentamiento, drenada, prensada o no, con o sin adición de fermentos de maduración, mohos especiales, sales fundentes (citratos y fosfatos que ayudan a disolver las proteínas y emulsificar las grasa para suavizar los quesos) e ingredientes comestibles opcionales, dando lugar a diferentes variedades de quesos pudiendo por su proceso ser fresco, madurado o procesado. Dentro del proceso de fabricación de los quesos se lleva a cabo el salado, cuyos objetivos son: completar el desuerado del queso, favoreciendo el drenaje de la fase acuosa libre de la cuajada; modificar la hidratación de las proteínas; intervenir en la formación de la corteza; actuar sobre el desarrollo de los microorganismos y la actividad enzimática, dar sabor salado para enmascarar el que aportan otras sustancias a lo largo de la maduración del queso (Chamorro & Losada, 2002). Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 6 II.3. Maduración de los quesos. Los quesos frescos ya estarían listos para consumir llegados a este punto, sin embargo, a la mayoría de los quesos les queda un largo periodo de añejamiento y curado hasta estar completamente listos. Durante el añejamiento, nuevos microorganismos se introducen en el queso, intensificando su sabor. Lentamente la caseína y la grasa se convierten en una compleja red interna de aminoácidos, aminas y ácidos grasos (http: //www.es.wikipedia.org). En México son pocos los quesos originarios madurados debido a la falta de higiene con la que se elaboran y a la temperatura ambiental. Por estas razones los quesos se pudren antes de un buen madurado, no obstante se tienen algunos quesos de maduración rápida, como el Doble Crema de Chiapas, el Sopero de Tabasco y el Sierra del Centro del país y de maduración tardía como el Balancam, el Añejo, el Cotija (Michoacán y Jalisco) y tipo cotija, el de Chincho, el Huasteco y el Bola de Chiapas (Villegas, 1993). La humedad es uno de los factores más importantes en la conservación de quesos. Un queso húmedo permitirá un rápido crecimiento de las bacterias que contenga, en unos cuantos días la acidez habrá llegado a su máximo, cambiando las características de la cuajada. Este es el caso de los quesos tipo cotija y doble crema, que cuando se dejan acidificar a su máximo, toman un olor ácido nauseabundo (no putrefacto) por la gran acidez de los lactobacilos, posteriormente baja la acidez y aumenta el aroma, adquiriendo un penetrante olor, característico de estos productos (Villegas, 1993). II.3.1. Queso Tipo Cotija. Este queso es una variante del queso Ranchero y del Adobero, siendo un queso de presentación cilíndrica de 11 a 40kg, seco, salado, con sabor penetrante, de Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 7 consistencia firme y desmoronable. Se elabora principalmente en Guerrero, Michoacán y Morelos. Para su elaboración se emplea leche de vaca, entera o semidescremada, fresca o ácida. El cultivo láctico que se emplea debe ser muy ácido (Villegas, 1993). El proceso para su fabricación es el siguiente: Colado de la leche en manta Reposo hasta la separación del suero Reposo de 30 a 40 minutos Corte de la cuajada Maduración. Adición del cuajo Movimiento suave por 10 minutos; verificar que la temperatura se mantenga a 34º - 38ºC y la acidez de 22º a 28ºD Extracción del suero y compresión de la cuajada Adición de 0.2 g de cloruro de calcio / 1000 mL de leche Volteado y prensado con presión fuerte durante 12 h. Prensado con presión moderada durante 2 h. Moldeado Desmoronamiento de la pasta y adición de sal Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 8 II.3.2 Queso Doble Crema. Este producto, también conocido como queso de Chiapas, pertenece al grupo de quesos de pasta blanda, fresca y prensada. Se elabora con leche de vaca (por lo general procedente de ganado de doble propósito, cebú-pardo suizo), cruda o bronca, entera o parcialmente descremada. En el mercado se presenta en piezas de formato pequeño, prismático- rectangulares y cilíndrico-planas; su peso oscila entre unos 250g y 1000g (Cervantes, et al., 2006). La pasta del queso crema tropical está altamente desmineralizada debido a un prolongado cuajado ácido-enzimático, que ocurre en varias horas a temperatura ambiente. El producto final, muestra una pasta blanquizca o ligeramente amarilla (según el contenido de la grasa), una consistencia blanda o friable, pero fácilmente tajable. Su sabor ácido y salado es agradable. Algunos de los pasos más notables en el proceso de fabricación de este queso son los siguientes (Cervantes, et al., 2006): • Maduración de la leche. La leche bronca, fresca, se deja reposar durante 3 a 5 horas a fin de que la microbiota natural se multiplique; también para descremar, parcialmente por flotación. • Reposo de la cuajada o “dormido”. Después de adicionar el cuajo, se deja cuajar la leche en quietud, durante varias horas (hasta 20) a temperaturaambiente tropical. El propósito es producir una cuajada ácida, altamente desmineralizada. • Cortado o “quebrado”. Después de que la leche ha cuajado, al día siguiente de la adición del cuajo, y cuando sobrenada una delgada capa de suero, se procede a cortar la cuajada con cuchillo o con una pala delgada de madera. Esta operación Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 9 facilita la extracción del suero por exudación. El corte es amplio (mayor de 2 cm.), y a veces tosco, empleándose las manos, por ello se habla de “quebrado” de la cuajada. • Manteado o “bolseado”. La cuajada previamente cortada se coloca, con delicadeza, en una bolsa de algodón o plástico. • Amasado y salado. La cuajada “seca” se coloca en una artesa de madera y se amasa manualmente incorporándole, al mismo tiempo, sal fina (10 – 15g/kg). • Moldeado. Se efectúa en moldes prismático-rectangulares de madera, en ellos se colocan adecuadamente unos paños de tela y se introduce poco a poco la cuajada, presionándola manualmente. • Prensado. Se lleva a cabo en prensas rústicas de tornillo, construidas con madera resistente. • Acondicionamiento. Después del desaprensado, el desbordeado y el oreado, las piezas de queso son envueltas en papel encerado, estaño y celofán transparente (rojo o amarillo). • II.4. Las bacterias lácticas. Las bacterias de las fermentaciones alimentarías son bacterias Gram (+). Normalmente se considera como un grupo a las bacterias lácticas (LAB), que se caracterizan por una gran producción de ácido láctico. Tienen forma de bacilos o cocos y son catalasa (-). Sintetizan su ATP en la fermentación láctica de los carbohidratos. El ácido láctico es en algunos casos el único producto final (homofermentación) y en otras ocasiones se producen además etanol, acetato y CO2 (heterofermentación) (Bourgeois & Larpent, 1995). Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 10 Fig. 1 Ruta metabólica de la lactosa en bacterias lácticas homofermentativas (www.biologia.edu.ar). Fig. 2 Ruta metabólica de la lactosa en bacterias lácticas heterofermentativas (www.biologia.edu.ar). II.4.1. Papel de las LAB en la fabricación de quesos. Las bacterias ácido lácticas (LAB) modifican la composición química de la leche, mejorando la conservabilidad del producto y sintetizando moléculas aromatizantes que aportan cualidades sensoriales apreciadas o, en algunos casos, rechazadas por parte de la población. Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 11 La lipólisis que llevan a cabo es relativamente limitada, (a excepción del queso tipo cotija que no es limitada) pero la pequeña cantidad de componentes que en ella se producen tienen una gran influencia sobre el gusto y aroma. La degradación de las proteínas de la cuajada constituye el principal fenómeno de la maduración. Es el origen del ablandamiento de la pasta, de su cambio de opacidad y color y por los productos formados, participa en el desarrollo del sabor y del aroma. Muchas LAB poseen enzimas proteolíticas intracelulares o ligadas a sus paredes. Entre estas microbiotas se producen fenómenos de antagonismo: algunos lactobacilos inhiben el desarrollo de Clostridium tyrobutyricum, Lactococcus lactis sintetiza nisina que inhibe los Clostridium y algunas bacterias Gram (+). La acidificación y liberación de peróxidos bloquean el crecimiento de microorganismos Gram (-), eventualmente productores de putrefacción (Bourgeois & Larpent, 1995). II.5. Cultivos iniciadores. Hasta 1880 la mayor parte de los queseros confiaban para la producción de ácido en el agriado natural de la leche. Algunos utilizaban para ello suero ácido, mientras que otros empleaban leche agriada espontáneamente procedente de su vaca sana favorita. En la actualidad los cultivos iniciadores, se obtienen de muy diversos orígenes (bancos de cepas mantenidos por centros de investigación, organizaciones lecheras, laboratorios comerciales o instituciones de enseñanza). En quesería, un cultivo iniciador es una mezcla de uno o más microorganismos cuyo crecimiento en la leche o cuajada produce la maduración del queso con su actividad metabólica. La mayoría de los cultivos iniciadores en quesería son cultivos controlados de Lactococcus lactis subsp. lactis y cremoris (Scott, 1991). Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 12 Fig. 3 Cultivos iniciadores de bacterias ácido-lácticas homofermentativas (www.biologia.edu.ar). El desarrollo de las bacterias lácticas en la leche transforma la lactosa en ácido láctico, principalmente. Esta nueva acidez se llama acidez desarrollada y origina la desestabilización de las proteínas. Dependiendo de la utilización que se le vaya a dar a la leche, este tipo de acidez se puede desarrollar de forma voluntaria. El ácido láctico reduce el pH del medio facilitando toda la serie de reacciones que tienen lugar durante la elaboración del queso. La transformación de la leche por fermentación es una de las actividades biotecnológicas más antiguas. Se basa en la formación de ácido láctico por la reacción fundamental en la producción de lácteos fermentados (Amiot, 1991): Las enzimas de los cultivos iniciadores bacterianos, vivos o muertos, provocan la degradación de los diversos componentes de la leche, permitiendo la producción de precursores de toda una serie de sustancias que son las responsables de la C12 H22 O11 H2O Lactosa monohidratada 4 CH3 CHOH COOH Ácido láctico CULTIVOS INICIADORES Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 13 textura, el sabor y el aroma del queso. Cuando los lactococos del cultivo iniciador mueren, libera a la cuajada diversas enzimas (Scott, 1991). II.5.1. Funciones esenciales de los cultivos iniciadores. En la industria láctea, las funciones esenciales de los cultivos lácticos iniciadores, se sintetizan como sigue: • Para la producción de ácido láctico. Como resultado de la fermentación de la lactosa, al ácido láctico imparte un sabor distintivo y fresco (ácido), durante la manufactura de leches fermentadas. En la elaboración de queso, el ácido láctico es importante durante la coagulación y texturización de la cuajada. • Para la producción de compuestos volátiles (v.g. diacetilo y acetaldehído), los cuales contribuyen al sabor y aroma de estos productos lácteos. • Los cultivos lácticos pueden poseer una actividad proteolítica o lipolítica, la cual puede ser deseable, especialmente durante la maduración de algunos tipos de queso. • Pueden ser producidos otros compuestos, por ejemplo alcohol, el cual es esencial durante la manufactura de kefir y kumis. • La condición ácida de estos productos lácteos previene el crecimiento de patógenos y también de microorganismos alteradores (Cheesman, 1984). II. 5.2.- Bacterias ácido lácticas no iniciadoras (NSLAB). Muchas veces los campesinos fabrican quesos sin utilizar cultivos iniciadores, la fabricación del producto se realiza con las LAB que están presentes de manera natural en la leche; estos quesos son generalmente denominados artesanales (Cogan et al., 1997). Los quesos fabricados a partir de leche sin pasteurizar y siguiendo los Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 14 procedimientos tradicionales de manufactura pueden contener una diversa y rica microbiota; la calidad de los quesos depende de la composición de la microbiota. Cuando los quesos son producidos siguiendo procesos tradicionales a partir de leche cruda, la microbiota juega un papel fundamental en la fermentación y es uno de los parámetros que más afecta la calidad del queso. Además, la biodiversidad de las bacterias involucradas en el queso puede considerarse el factor fundamental para la conservación de las características típicas de los productos de quesería tradicionales (Demarigny et al., 1997). Las NSLAB usualmentese incrementan desde un bajo número en la cuajada fresca hasta dominar la microbiota de los quesos maduros. Contrario a los iniciadores, las NSLAB toleran los ambientes hostiles del queso durante su maduración (32-39% de humedad, 4-6% de sal, pH de 4.9-5.3 a 13ºC y una deficiencia de nutrimentos). El papel de las NSLAB en la maduración aun no ha sido resuelto satisfactoriamente, aunque la inclusión de cultivos adjuntos de algunas cepas de NSLAB o el uso de leche cruda durante la fabricación de quesos, incrementa el nivel de aminoácidos libres, péptidos y ácidos grasos libres, lo cual conduce a mejorar la intensidad de sabores y aromas y acelera la maduración de los quesos (Fitzsimons, et al., 1999; De Angelis, et al., 2001). Aunque las NSLAB pueden ser aisladas a partir del queso, la mayoría de ellas son inactivadas por la pasteurización; su presencia en quesos fabricados con leche pasteurizada se puede deber a contaminación después de la pasteurización por la flora presente en el aire, en el equipo utilizado, en los ingredientes, o a variedades que sobreviven a la pasteurización (Martley & Crow, 1993). Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 15 II.5.3. Papel de los metabolitos de las bacterias lácticas en tecnología quesera. Los productos resultantes del metabolismo de las bacterias lácticas, ejercen una serie de efectos sobre las características fisicoquímicas, microbiológicas, sensoriales y de textura de los diversos tipos de queso. II.5.3.1. Ácido láctico. La producción de ácido láctico que realizan las bacterias del cultivo, acelera la coagulación de la leche por el cuajo, ya que el pH óptimo de actividad de las enzimas coagulantes es inferior al pH inicial de la leche (6.5). Por otra parte, el ácido láctico ocasiona una desmineralización del coágulo con pérdida de Ca2+ en el suero en forma de lactato de calcio soluble, lo que modifica notablemente las características del coágulo (Núñez, 1985). La producción de ácido láctico lleva aparejado un descenso del pH a niveles próximos a 5.0, lo que regula la velocidad de las reacciones de degradación de proteína y grasa que tienen lugar a lo largo de la maduración. Fig. 4 Ruta metabólica para la producción de ácido láctico (www.biologia.edu.ar). Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 16 Además, el ácido láctico ejerce una fuerte acción antimicrobiana frente a la mayoría de los microorganismos patógenos que pueden contaminar accidentalmente al queso, tales como Salmonella, Staphylococcus aureus, etc. La combinación de concentración de ácido láctico y bajo nivel de pH es el principal agente responsable de la desaparición de los patógenos a lo largo de la maduración del queso (Núñez, 1985). II.5.3.2. Péptidos, aminoácidos y productos derivados. En la mayoría de los quesos, a partir de la segunda semana de maduración comienzan a descender los niveles de bacterias lácticas procedentes del cultivo. A su muerte estas bacterias se lisan, liberando al exterior las enzimas intracelulares localizadas en membrana y citoplasma, entre las que tienen especial importancia, las implicadas en la degradación de caseína. Estas enzimas, en combinación con las enzimas coagulantes, prosiguen la formación de péptidos cortos y aminoácidos libres. Estos péptidos cortos y aminoácidos forman parte del “sabor de fondo”, sobre el que resaltan en cada queso los compuestos característicos de su aroma (Núñez, 1985). Una proteólisis demasiado fuerte, resultante de la acción de los fermentos o de los microorganismos contaminantes confiere al queso un gusto amargo. En el caso de los quesos tipo suizo, Streptococcus thermophilus elimina del medio los productos amargos originados en la proteólisis, lo que explica que en estos quesos aparezcan muy raramente gustos amargos a pesar de que en su elaboración se utilizan cuajos microbianos (Amiot, 1991). Por lo tanto, el conocimiento de los sistemas proteolíticos y de transporte globales de estas bacterias ha sido el principal sujeto de investigación en las dos décadas pasadas (Piuri et al., 2003). Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 17 Fig.5 Ejemplo de la proteolísis esquematizado por el sistema proteolítico de los lactococcos (www.biologia.edu.ar). II.5.4. Fuentes de las bacterias lácticas. Comúnmente las fuentes conocidas para las comunidades de bacterias ácido lácticas (LAB) son los intestinos humanos y animales, productos lácteos y alimentos vegetales fermentados. En la suposición de que las fuentes para las LAB son más de las que se han estudiado hasta ahora, se han llevado a cabo aislamientos de LAB a partir de organismos marinos y se encontraron dos géneros nuevos de LAB halofílicas (nombradas HALAB), y que han sido denominadas como Marinilactibacillus y Halolactibacillus (Ishikawa et al., 2003; Ishikawa et al., 2005). Estos organismos son ligeramente halofílicos, crecen preferencialmente bajo condiciones fisicoquímicas encontradas en el agua de mar (concentración total de sal: 3.2 - 3.8% (w/v)). El agua marina contiene un 3% de NaCl, más pequeñas cantidades de muchos otros elementos y minerales por tanto los microorganismos aislados del mar, tienen normalmente requerimientos específicos para el sodio. El crecimiento de los halófilos requiere al menos algo de cloruro de sodio, pero la concentración óptima varía bastante de un microorganismo a otro; por tanto el término moderadamente halófilo Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 18 se reserva para aquellos que requieren 6-15% de NaCl y el término discretamente halófilo para los que requieren 1-6% de sal (Michael, T. 1978). II.5.5. HALAB en quesos. La presencia de bacterias Gram (-) típicamente marinas, tales como Halomonas spp. y Vibrio spp. en quesos madurados fue reportada por diversos autores (Maoz et al., 2003; Feurer et al., 2004; Bockelmann et al., 2005; & Mounier et al., 2005). Feurer et al., (2004) aislaron la Marinilactibacillus psychrotolerans a partir de quesos suaves hechos de leche cruda (producidos en una granja) y leche pasteurizada (producidos industrialmente). Considerando estos descubrimientos y las características halofílicas de las bacterias HALAB, resulta improbable que éstas sean derivadas de la leche cruda. Podría ser considerado que estas HALAB hayan venido de ambientes marinos por vía de la sal de mar adicionada a los quesos y hayan encontrado ahí su origen en términos de salinidad, pH, temperatura, fuentes de carbono y los nutrimentos orgánicos complejos de los quesos (Ishikawa et al., 2006). Recientemente se ha descubierto la presencia de LAB halófilas y alcalofílicas (llamadas HALAB) en diversos quesos producidos en Europa, principalmente Marinilactibacillus psychrotolerans y Alkalibacterium olivapovliticus (Ishikawa et al., 2006). Marinilactibacillus psychrotolerans es una HALAB de hábitat marino, con un óptimo de crecimiento de 2.0 – 3.75% de NaCl y pH de 8.5 – 9.0 (Ishikawa et al., 2003). Marinilactibacillus psychrotolerans (psy.chro.to’le.rans. Gr. adj. psychros cold; L. part. adj. tolerans tolerante; N.L. adj. psychrotolerans tolerante a temperaturas heladas). La especie tiene todas las características que definen a este género. Las colonias son profundas en medio de agar son amarillas claro, opacas y lenticulares con diámetros de 2-4 milímetros. Las células son 0.4-0.5 x 2.3-4.5 μm y alargadas en cultivos mayores. Crece uniformemente a través de una columna de medio agar Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 19 semisólido. El ácido se produce de una gama bastante amplia de carbohidratos, alcoholes de azúcar y compuestos relacionados de carbono. El genero de Marinilactibacillus tiene las características de ser células Gram (+), no esporuladas, bacilos rectos, producción por separado, en pares o en cadenas cortas, son móviles con flagelosperitricos. Catalasa y oxidasa negativos. Reducción de nitrato y licuefacción en gelatina son negativos. Fig.6 Imagen de una bacteria con flagelos peritricos. Hay producción débil de amoniaco de L-arginina, es ligeramente halofílico y altamente halotolerante; la concentración optima de NaCl para su crecimiento es de 2.0-3.75% (p/v) con un intervalo máximo de 17.0-20.5% (p/v) (dependiendo de la cepa). El crecimiento ocurre entre -1.8ºC y 40-45ºC con una temperatura optima de 37-40ºC. El género Alkalibacterium se reportó primero como A. olivapovliticus, el cual fue aislado a partir de aguas alcalinas de lavado de aceituna comestible y fue halofílica y alcalofílica (Ntougias & Russell, 2001). Metaboliza carbohidratos mediante fermentación ácido láctica. Se ha reportado la presencia de Marinilactibacillus psychrotolerans en la corteza de quesos suaves alemanes y franceses como una flora menor (Maoz et al., 2003; Feurer et al., 2004) y en jamones curados deteriorados italianos, como flora dominante (Rastelli et al., 2005). Considerando el Flagelos peritricos. Membrana plasmática Citoplasma Pared celular DNA Flagelos Fili Ribosomas Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 20 contenido de agua de los quesos suaves (generalmente entre 50-55% para quesos suaves madurados), la concentración real de NaCl en la fase acuosa de las muestras de queso, podría ser suficientemente elevado para producir condiciones osmóticas favorables para el crecimiento de las HALAB (Ishikawa et al., 2006). II.6. Aislamiento y caracterización de microorganismos. La taxonomía tradicional de los microorganismos, basada fundamentalmente en criterios morfológicos y fisiológicos, se ha visto sometida a continuas reordenaciones y cambios. Esto se ha debido fundamentalmente a la aplicación de técnicas moleculares muy potentes al estudio taxonómico como son la hibridación DNA-DNA, la secuenciación de diferentes regiones del genoma bacteriano, etc. (Guillamón et al., 2003). II.6.1. Aislamiento y recuento. La microbiología ha requerido el aislamiento y recuento de los microorganismos para poder llevar a cabo estudios sobre las poblaciones que se desarrollan en los diferentes procesos industriales. Para ello es necesario disponer de medios de cultivo donde crezcan los microorganismos fuera de su ambiente natural (Guillamón et al., 2003). En esta investigación se implementará una serie de medios de cultivo para el aislamiento de bacterias halófilas a partir de muestras de quesos. El medio del que se parte para esta investigación es el GYPF (Glucosa-Extracto de levadura-Peptona y Extracto de pescado el cual es sustituido por extracto de carne) al 7% de NaCl, sin embargo, la composición de este medio debe ser adaptada para el óptimo aislamiento de las bacterias lácticas halófilas presentes. Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 21 II.6.2. Características fisiológicas y bioquímicas. Los métodos utilizados para la caracterización de las bacterias halófilas de nuestras muestras de quesos son las pruebas bioquímicas descritas a continuación: Prueba catalasa, Prueba de Oxidasa, Prueba de hidrólisis en almidón, Prueba de licuefacción de gelatina, Prueba de Voges-Proskuer (VP), Prueba de hidrólisis de caseína, Prueba de reducción de nitrato, Producción de gas a partir de glucosa, Prueba de fermentación de hidratos de carbono, Producción de amoniaco a partir de arginina, Determinación de la actividad lipolítica, Determinación de la actividad proteolítica, Prueba de Movilidad. II.6.2.1 Prueba catalasa. PRINCIPIO: Probar la presencia de la enzima catalasa. Esta prueba se ha usado como ayuda para la identificación de bacterias. Cuando las flavoproteínas reducidas o las proteínas con azufre y hierro reducidas se unen con el oxígeno con la ayuda de las oxidasas presentes en la cadena respiratoria de todas las bacterias, se forman dos compuestos tóxicos: el peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical superóxido (O2-). FADH2 FAD + 2H+ + 2 e- Flavoproteína Flavoproteína reducida Oxidasa O2 + 2 e- + 2H+ H2O2 O FADH2 FAD + 2H+ + 2 e- Flavoproteína Flavoproteína reducida Oxidasa 2 O2 + 2 e- + 2H+ 2O2- + 2H+ El H2O2 es un producto final oxidativo de la degradación aerobia de las azúcares. La flavoproteína reducida reacciona de manera directa con el oxígeno gaseoso por Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 22 vía de la reducción de electrones para formar H2O2, no por la acción directa entre el hidrógeno y el oxígeno molecular. Las catalasas eliminan en forma catalítica los intermediarios de la reducción del oxígeno. La reacción química que ocurre durante la realización de la prueba de catalasa es expresada en la siguiente ecuación: Catalasa 2H2O2 2H2O + O2 La catalasa esta presente en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas (aerotolerantes) que contienen citocromos. Los anaerobios obligados (estrictos) carecen de esta enzima; la mayoría de las bacterias anaerobias poseen peroxidasa en lugar de catalasa. Las catalasas son consideradas “hidroperoxidasas”; las catalasas (peróxido de hidrógeno oxidorreductasas) están presentes en los animales y vegetales. El centro activo de la catalasa es una clase de proteínas hemo denominada citocromo, sin embargo los lactobacilos carecen de citocromos. Los investigadores Taylor y Achanzar evaluaron la eficacia de la fuerza del peróxido de hidrógeno de 0.5 a 5% y establecieron que una gota al 3% de la concentración fue la más efectiva (Blazevic and Ederer, 1975; Mac. Faddin, 1991). II.6.2.2 Prueba de oxidasa. PRINCIPIO: Determinar la presencia de las enzimas oxidasas. Basándose en la producción bacteriana de una enzima oxidasa intracelular. Esta reacción de oxidasa se debe a un sistema de citocromo oxidasa que activa la oxidación del citocromo reducido por el oxígeno molecular, el que a su vez actúa como un aceptor de electrones en la fase terminal del sistema de transferencia de electrones. Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 23 Los anaerobios obligados carecen de la actividad de oxidasa, no pueden vivir en presencia del oxígeno atmosférico y no poseen un sistema de citocromo oxidasa. Deibel y Evans mostraron que las especies de lactobacillus carecen de esta actividad enzimática. El sistema citocromo oxidasa varía entre las especies bacterianas; algunos microorganismos poseen sólo una oxidasa mientras que otros pueden producir dos o tres. Los citocromos distintos de la citocromo oxidasa terminal son enzimas b c1 c responsables de un resultado positivo en la prueba de oxidasa; la producción de estas dos enzimas difiere de los diversos géneros. La citocromo oxidasa fue denominada con muchos otros nombres como son: Atmungsferment, citocromo c oxidasa, citocromo a3 oxidasa y citocromo a oxidasa. Los citocromos son pigmentos respiratorios que contienen compuestos ferroporfirina. El citocromo aa3 contiene dos moléculas de hemo A y cada una contiene un átomo de Fe (hierro), que varía en sus valenciasentre Fe3+ (férrico) y Fe2+ (ferroso) durante la oxidación y la reducción, y los átomos de Cu2+ (cobre) asociados con la actividad de citocromo oxidasa y la reacción de electrones con el oxígeno molecular. Citocromo-Fe3+ + e- Citocromo-Fe2+ (Oxidado-eliminación (reducido-ganancia de electrones) de electrones) (FÉRRICO) (FERROSO) Los electrones provenientes del citocromo c son captados por la citocromo oxidasa oxidada, que los transfiere a una molécula de oxígeno. El oxígeno libre es necesario para la regeneración indirecta del citocromo c oxidado. La prueba en realidad determina la presencia del citocromo c y los resultados son positivos sólo en las bacterias que contienen citocromo c como una enzima respiratoria. Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 24 2 Citocromo c reducido + 2H+ + ½ O2 2 Citocromo c oxidado + H2O Un resultado positivo de oxidasa consiste en una serie de reacciones, con un componente autooxidable del sistema citocromo como catalizador final. Los sustratos artificiales pueden ser sustituidos por los aceptores naturales de electrones en cualquier parte dentro de la cadena de transporte de electrones donde ellos reducen el sistema citocromo c-citocromo oxidasa. Los diversos colorantes reactivos de la prueba de oxidasa son aceptores artificiales de electrones; el reactivo p- fenilendiamina y el indofenol son tanto aceptores como dadores de electrones. Estos sustratos artificiales pueden ser incoloros o coloreados, lo cual depende de su estado; la reacción de oxidasa final brinda un producto coloreado (Mac. Faddin 1991). II.6.2.3 Prueba de hidrólisis en almidón. PRINCIPIO: Determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar el almidón por medios enzimáticos y probar la desaparición del almidón por el uso de un reactivo de yodo. El almidón es un homopolisacárido, un producto de condensación de muchos monómeros (unidades moleculares) de un único tipo de monosacárido, α-D-glucosa, que forma un polímero de muchas unidades unidas por puentes α-glucosídicos (acetal). Los polisacáridos (C6H10O5)n como el almidón y las dextrinas por definición se producen por la unión de más de seis moléculas de monosacáridos. La estructura básica del almidón es una mezcla de dos moléculas de polisacárido poliglucosa: amilosa lineal (10-20%) y amilopectina ramificada (80-90%), por lo común en una relación 1:4 a 1:5. El almidón que sólo da glucosa con la hidrólisis se denomina glucosán. Citocromo Oxidasa Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 25 El almidón es una clase de hidrato de carbono de alto peso molecular con una solubilidad baja en su estado nativo, sólo levemente soluble en agua e insoluble en etanol acuoso y por lo general en disolventes orgánicos. Los residuos de glucosa (dextrosa) del almidón, α-amilosa y amilopectina, son todas moléculas de α-D-glucosa (glucopiranosa). La glucosa (C6H12O6) es un monosacárido de 6 carbonos, una hexosa. Fig.7 Molécula de Glucosa. La diferencia estructural entre α−glucosa y β−glucosa es la posición (proyección) de los grupos OH en el carbón número 1: α, hacia abajo y β hacia arriba. La forma habitual encontrada en el almidón es α. En este caso la diferencia con la celulosa es la digestibilidad. La celulosa está compuesta de unidades de β-glucosa indigeribles; el almidón está formado por unidades α-digeribles. La glucosa que aparece de manera natural es D-isómero; sin embargo, existen dos isómeros ópticos, D y L. Las dos formas son imágenes especulares pero no son idénticas; son asimétricas y no pueden superponerse. La forma D se presenta de manera natural; la forma L es artificial. La forma aldehído es inestable y existe sólo como un intermediario transitorio en la reacciones de hidratos de carbono. Los aldehídos reaccionan con un grupo alcohol para formar un compuesto hemiacetal inestable que no involucra una pérdida de agua, o con dos grupos alcohol (p. ej., residuos de glucosa) con pérdida de agua por Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 26 la formación de acetal. La glucosa posee una ligadura hemiacetal a la cual se une una ligadura éter (-C-O-C-) y un grupo –OH; el OH en el hemiacetal es activado por una ligadura éter unida en el mismo sitio. + HOR- + H2O R’ y R’’ en el almidón son idénticos; residuos de α, D-glucosa. En el almidón, los puentes de oxígeno acetal (-C-O-R) que unen las unidades de glucosa son hidrolizados con facilidad, en especial en presencia de ácidos y ciertas enzimas, por ejemplo amilasas. La hidrolasa, la enzima específica para la hidrólisis del almidón, fue denominada en un principio como diastasa y en la actualidad se denomina amilasa. Existen dos tipos de amilasas: α-amilasa o endoamilasa, excretada por muchas bacterias, y β-amilasa o exoamilasa, presente en los vegetales superiores. El pH óptimo para la actividad de la α-amilasa es de 6.9-7.2, pero varía de 5.5 a 6.5 con diferentes sustratos y es inestable por debajo del pH 4.5. Su temperatura óptima es de 50-55ºC, pero la reacción parece satisfactoria a 37ºC. La hidrólisis enzimática ocurre en las uniones α-1,4-acetal y α-1,6-acetal que mantienen junto el polímero de almidón. La α-amilasa cataliza la hidrólisis de las uniones α-1,4-glucosídicas (acetal) de polisacáridos como el almidón. Ataca el interior de las cadenas de polisacárido, ya sea amilosa o amilopectina, en puntos al azar para formar una mezcla de fragmentos de 5 a 9 unidades de la configuración α. La amilosa es degradada por completo por la amilasa. La hidrólisis completa del almidón requiere otra enzima, que actúa en los puntos de ramificación 1,6 en la molécula de amilopectina, como la oligo-1,6-glucosidasa. +HOR’ Segundo Alcohol Alcohol Acetal HemiacetalAldehído Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 27 La amilasa convierte el almidón en productos distintos en las entidades que poseen hemiacetal (dextrina, maltosa, glucosa). El almidón también puede ser hidrolizado por hidrólisis ácida, con la formación de los mismos productos intermediarios y de glucosa como producto final; éste es un ejemplo de la acción catalítica del ion hidrógeno. La hidrólisis completa del almidón soluble forma residuos únicos de glucosa en un proceso de pasos secuenciales. (C6H10O5)n* α-Amilosa + Amilopectina (C6H10O5) x Dextrinas (C6H10O5) y + (C6H10O5) z *La molécula se torna cada vez más pequeña a medida que progresa la hidrólisis; n es un número más grande que x, x es mayor que y e y mayor que z. A medida que la hidrólisis progresa, el color del yodo ya no se produce más debido a la formación de acrodextrinas que son incoloras. Las moléculas terminales de maltosa son hidrolizadas de manera sucesiva con la degradación gradual, más o menos completa, de los intermediarios dextrinas a maltosa y a una cantidad más pequeña de glucosa. Los monosacáridos como la glucosa no pueden convertirse en hidratos de carbono más simples por la hidrólisis. Algunos azúcares reductores y sustancias fermentables son producidos a través de la reacción; sin embargo, el principal mecanismo de la reacción es la ruptura de polisacáridos primero a dextrinas, seguida por una fase más lenta de formación de maltosa (Mac. Faddin 1991). α-amilasa H2O Almidón (hidrato de carbono no reductor) (Color azul solublecon yodo) (Color rojo azulado a rojo castaño insoluble con yodo) Almilopectina Eritrodextrinas (Color azul violeta rojo castaño con yodo) α-amilasa H2O Acrodextrinas (incoloras con yodo) Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 28 II.6.2.4 Prueba de licuefacción de gelatina. PRINCIPIO: Determinar la capacidad de un microorganismo de producir enzimas de tipo proteolítico (gelatinasas) que licúan/hidrolizan la gelatina o muestran cambios característicos debido a los productos de degradación. La gelatina, es una proteína derivada del colágeno animal, se incorpora a diferentes medios de cultivo para determinar la capacidad de un microorganismo de producir enzimas proteolíticas (proteinasas), detectadas por digestión o licuefacción de la gelatina. Las enzimas capaces de producir gelatinolisis se denominan gelatinasas. Estas enzimas proteolíticas a menudo son importantes factores de virulencia de algunos microorganismos. Las proteínas naturales son demasiado grandes para entrar en una célula bacteriana; por ende, para que una célula pueda usar las proteínas, éstas primero deben ser catabolizadas a componentes más pequeños. Ciertas bacterias segregan gelatinasas exocelulares para degradar las proteínas y esta capacidad ayuda a la identificación bacteriana. El catabolismo de las proteínas por parte de las gelatinasas es un proceso de dos pasos; el resultado final es una mezcla de aminoácidos aislados. Proteína + H2O Polipéptidos Polipéptidos + H2O Aminoácidos individuales La gelatina es hidrolizada por la gelatinasa en sus aminoácidos constitutivos, con pérdida de sus características gelificantes (Mac. Faddin 1991). Básicamente hay cinco medios/métodos para detectar la degradación de la gelatina por microorganismos: Medio basal líquido: licuefacción. Medio sólido nutritivo: hidrólisis. Galatinasas Proteinasas Galatinasas Proteinasas Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 29 Tiras de carbón-gelatina: hidrólisis. Película radiográfica: degradación de la gelatina. Agar gelatina: alcalinización. II.6.2.5 Prueba de Voges-Proskauer (VP-MR). PRINCIPIO: Determinar la capacidad de algunos microorganismos para producir un producto final neutro, acetilmetilcarbinol (AMC, acetoína), a partir de la fermentación de la glucosa. Voges-Proskauer (VP-MR) es un éponimo doble; Voges y Proskauer fueron los primeros bacteriólogos en observar una coloración roja en los medios de cultivo después del tratamiento con hidróxido de potasio. La prueba de Voges-Proskauer (VP-MR) se basa en la detección de acetoína, un producto final neutro derivado del metabolismo de la glucosa. La glucosa es metabolizada a ácido pirúvico, el principal intermediario en la glucólisis. A partir del ácido pirúvico, las bacterias pueden seguir muchos caminos metabólicos; la producción de acetoína es una de las vías metabólicas de la degradación de la glucosa en las bacterias. Los miembros de la familia Enterobacteriaceae se clasifican de manera característica como fermentadores de ácidos mixtos o del ácido fórmico lo que indica que los productos finales de la fermentación de la glucosa son ácidos: como el fórmico, acético, succínico, además de etanol, hidrógeno y dióxido de carbono. H2 CO2 Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 30 Los fermentadores de ácidos mixtos con posterioridad pueden ser divididos en dos grupos: a) los que producen ácidos pero no 2,3-butanodiol (o 2,3-butileno glicol), y b) los que producen 2,3-butanodiol como sus principales productos finales. La acetoína puede ser metabolizada por uno de dos medios: a) reducción a 2,3- butanodiol, el cual se acumula a menos que ocurra una reoxidación o b) raras veces por oxidación de diacetilo, el que puede ser metabolizado aún más. Stahly y Werkman encontraron que la formación de acetoína y 2,3-butanodiol es un sistema reversible de reducción u oxidación, acetoína a 2,3-butanodiol por reducción del 2,3- butanodiol oxidado a acetoína; la exposición al oxígeno atmosférico y a los álcalis revierte con lentitud la reacción (Mac. Faddin 1991). II.6.2.6 Prueba de hidrólisis de caseína. PRINCIPIO: Determinar la capacidad de un microorganismo para hidrolizar la caseína (http: //www.es.wikipedia.org). Para ello los microorganismos se desarrollan en un medio que contiene caseína y consta de dos fracciones: 1. TSA: Agar triptona de soya, el propósito general de este medio de cultivo es para cultivo y aislamiento de microorganismos delicados y no delicados o para almacenamiento de cultivo. Usado para el precultivo y enumeración de microorganismos como E.coli. Este medio de cultivo es conveniente para el cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios (http: //www.es.wikipedia.org). 2Piruvato Acetoína + 2 CO2 2,3-butanodiol Oxidación 2,3-Butanodiol deshidrogenasa Acetoína Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 31 2. Leche descremada: Fuente de caseína. La caseína es la principal proteína de la leche, se encuentra fundamentalmente de forma micelar en la leche. La micela consiste en un complejo estructural de múltiples submicelas o unidades de caseína que, a su vez, están compuestas de cadenas de aminoácidos. Una unidad de caseína completa está compuesta, en peso, por aproximadamente el 40% de α-caseína, 35% de β-caseína, 15% de κ-caseína y 10% de componentes minoritarios. Por tanto para que ocurra la proteolísis o degradación de las cadenas proteícas en sustancias más simples, como peptonas, péptidos y aminoácidos, se requiere de una fuente de caseína, que en este caso la contiene la leche descremada (Scott, R. 1991). II.6.2.7 Prueba de reducción de nitrato. PRINCIPIO: Determinar la capacidad de un microorganismo de reducir los nitratos o nitritos o gas nitrógeno libre. La reducción de nitrato (NO3-) a nitrito (NO2-) y a nitrógeno gaseoso (N2) por lo común se produce en condiciones de anaerobiosis, en las cuales un microorganismo produce su oxígeno del nitrato. El oxígeno actúa como un aceptor de hidrógeno; es decir, el protón y el aceptor final de electrones. La mayoría de las bacterias aerobias son anaerobias facultativas y sólo pueden reducir los nitratos en ausencia de oxígeno. Esta respiración anaerobia es un proceso de oxidación en el que las sustancias inorgánicas (sobre todo nitrato y sulfato, rara vez carbonato) producen oxígeno para actuar como un aceptor de electrones a fin de proporcionar energía. En la reducción de nitratos, los citocromos bacterianos transportan electrones a moléculas aceptoras específicas. Gunsalus y Stainer establecieron que el nitrato actúa como último oxidante en los sistemas de citocromos. La reducción de nitratos características de una especie particular es más o menos constante. Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 32 Reducción de nitratos a nitritos. Las posibilidades del producto final en la reducción del nitrato son muchas: nitrito (NO2-), amoníaco (NH3), nitrógeno molecular (N2), óxido nítrico (NO), óxido nitroso (N2O) o hidroxilamina (R-NH-OH). El producto formado depende de la especie bacteriana. El producto final más común es el nitrógeno molecular (un gas) formado por la vía de la reducción del nitrito. De acuerdo con las condiciones ambientales, estos productos por lo común no son oxidados con posterioridad ni asimilados en el metabolismo celular, pero son excretados en el medio circundante. La reducción de nitrato a nitrógeno gaseoso (N2) u oxido nitroso (N2O) se denomina desnitrificación. El nitrato actúa como un aceptor de electrones; por cada molécula de nitrato reducido se aceptan cinco electrones.Nitrato a nitrógeno molecular. En el proceso de desnitrificación, puede acumularse óxido nitroso (un intermediario) si la concentración de nitrato es alta; cuando la concentración de nitrato es baja, el óxido nitroso es reducido con posterioridad a nitrógeno molecular. En la reducción de nitratos pueden ocurrir diversos procesos para la utilización de los productos finales obtenidos. El amoníaco o la hidroxilamina pueden ocurrir diversos procesos para la utilización de los productos finales obtenidos, pueden estar asimilados en los componentes celulares que contienen nitrógeno (proteínas y ácidos nucleicos) para la síntesis de nuevos compuestos. Por consiguiente, en la prueba de reducción de nitratos, la reducción se evidencia por la presencia de un producto final catabólico o por la ausencia de nitrato en el medio (Blazevic and Ederer, 1975; Mac. Faddin, 1991). NO3- + 2 e- + 2 H+ NO2- + H2O Nitrato Nitrito 2NO3- + 10 e- + 12 H+ N2 + 6H2O Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 33 1. Si al realizar la prueba hay aparición de burbujas en el tubo no es necesario añadir nitrato si el microorganismo es no fermentador. 2. Si el microorganismo es fermentador (e.g. Enterobacteriaceae), el gas producido puede ser hidrógeno, de esta manera se debe añadir nitrato y la prueba ser interpretada como se describió en el número 1. II.6.2.8 Producción de gas a partir de glucosa y pruebas de fermentación de hidratos de carbono. PRINCIPIO: Determinar la capacidad de un microorganismo para fermentar (degradar) un hidrato de carbono específico incorporado en un medio basal y producir ácido o ácido con gas visible. Los patrones de fermentación por lo general son característicos para grupos bacterianos específicos o especies, además de ayudar en la diferenciación entre géneros. Un ejemplo de un polisacárido es la inulina, que está compuesta por muchos polímeros del monosacárido de fructosa. Los alcoholes que se denominan en conjunto “azúcares” son: adonitol, dulcitol, manitol y sorbitol. Todos son alcoholes polihídricos, que son productos de la reducción de un monosacárido. Los polisacáridos, trisacáridos y disacáridos son demasiado complejos para penetrar en una célula bacteriana para su degradación. Si pueden ser metabolizados por una especie bacteriana particular, primeros son catabolizados a monosacáridos menos complejos por enzimas exocelulares para que puedan ser incorporados al interior de la célula. La fermentación es un proceso metabólico anaerobio de oxidación-reducción, en el cual un sustrato orgánico actúa como el aceptor final de hidrógeno (aceptor de Glucosa reducción Sorbitol (alcohol hexahidroxilado) Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 34 electrones) en lugar de oxígeno. La fermentación de sustratos orgánicos como los hidratos de carbono da por resultado productos finales reducidos y oxidados. Algunas bacterias pueden fermentar la glucosa en anaerobiosis; otras oxidan la glucosa. Algunas pueden utilizar ambos mecanismos para su metabolismo, mientras otras no pueden utilizar la glucosa por ningún mecanismo. La manera y la magnitud por las cuales un sustrato es catabolizado dependen de las especies bacterianas y de las condiciones de cultivo. La principal vía fermentativa de degradación de la glucosa es la vía de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP). Los productos finales característicos de la fermentación bacteriana son: a) ácido láctico, b) ácidos acético y fórmico, c) ácido láctico y alcohol etílico (etanol), d) etanol, e) acetilmetilcarbinol (acetoína) y CO2, f) ácido succínico a ácido propiónico y CO2, g) CO2 y acetona a alcohol isopropílico (isopropanol) y h) ácido butírico a alcohol butílico (butanol). Las bacterias producen clases diversas de patrones de fermentación, de acuerdo con los productos finales formados característicos. Las pruebas de fermentación de hidratos de carbono pueden utilizarse para determinar qué productos finales se han formado pero no las vías metabólicas utilizadas. Asimismo, el medio contiene otros constituyentes para el crecimiento que pueden degradarse para dar diversos productos finales similares a los producidos por la degradación de los hidratos de carbono mientras que el microorganismo está utilizando alguno de los carbonos producidos por la degradación del hidrato de carbono para producir nuevas células. El indicador de pH utilizado con más frecuencia para demostrar la fermentación del hidrato de carbono es el rojo de fenol, ya que la mayoría de los productos finales del metabolismo de los hidratos de carbono son ácidos orgánicos. Con el rojo fenol, el cambio de color ocurre cerca del pH original del medio (pH ácido 6.8; medio pH 7.4). Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 35 La peptona en el medio también es degradada por las especies bacterianas y produce sustancias alcalinas. El ácido producido por la fermentación de un hidrato de carbono se observa por un cambio de pH sólo cuando se produce más ácido por la degradación del hidrato de carbono que sustancias alcalinas provenientes de la degradación de la peptona. La observación de un cambio de color que denota ácidez está influenciada por dos factores: a) el indicador de pH utilizado y b) las propiedades buffer del medio (Mac. Faddin, 1991). II.6.2.9 Producción de amoniaco a partir de arginina. PRINCIPIO: Se basa en la degradación de la arginina por la vía de la Arginina Desaminasa (ADI) a través de la siguiente reacción (Liu, S.Q. and Pilone, G.J. 1998): ADI L-Arginina → L-Citrulina + NH3 II.6.2.10 Determinación de la actividad lipolítica. PRINCIPIO: Determinar la capacidad de microorganismos para producir la enzima lipasa, que cataliza la hidrólisis de triglicéridos y diglicéridos a ácidos grasos y glicerol, evidenciada por un brillo aceitoso, iridiscente, sobre las colonias y alrededor de ellas en el medio en placa (Smeltzer, M., Hart, M. & Iandolo, J., 1992). Lípido es un término abarcativo para describir un grupo de grasas o derivados de las grasas. Los lípidos se clasifican en tres grupos principales: a) las grasas simples (neutras), que por hidrólisis producen ésteres de ácidos grasos y alcohol; b) las grasas compuestas, que por hidrólisis dan productos diferentes de los alcoholes y ácidos grasos (p. ej., fosfolípidos y glucolípidos), y c) derivados grasos, que se obtienen por la hidrólisis de lípidos simples o compuestos. Las grasas neutras son ésteres de glicerol y de ácidos grasos de cadena larga R es una cadena carbonada de ácidos grasos (cadena lateral alquílica de ácidos grasos ) esterificada al glicerol Neevia docConverter 5.1 II. ANTECEDENTES 36 (glicerina), un alcohol trihidratado (polihídrico). Los fosfolípidos son ésteres complejos de alcohol, ácido graso, ácido fosfórico y una base nitrogenada. La enzima lipasa actúa sobre los ésteres emulsionados de glicéridos y/o lípidos. Los triglicéridos (triacilgliceroles) son hidrolizados a monoglicéridos (monoacilgliceroles), glicerol y una variedad de diferentes ácidos grasos saturados o no saturados. La lipasa es específica para las cadenas α y α1 de triglicéridos. Cuando se hidrolizan, las unidades éster (ligaduras carbonil-oxígeno) se rompen y elementos del agua se combinan con los fragmentos. Cuando las uniones éster de los glicéridos son hidrolizadas, los ácidos grasos se comportan como ácidos carboxílicos comunes y son insolubles en agua (Mac. Faddin, 1991). II.6.2.11 Determinación de la actividad proteolítica. PRINCIPIO: Determinar la capacidad de un microorganismo para degradar proteínas, para esta determinación se utilizó la prueba de hidrólisis de caseína y licuefacción de gelatina. Neevia docConverter 5.1 III. OBJETIVOS 37
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