Caracterizacion-bioquimica-de-una-betalactamasa-producida-por-Klebsiella-pneumoniae-causante-de-infecciones-nosocomiales-en-Mexico

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE 
MÉXICO 
FACULTAD DE QUÍMICA 
CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE 
UNA BETALACTAMASA PRODUCIDA POR 
Klebsiella pneumoniae CAUSANTE DE 
INFECCIONES NOSOCOMIALES EN 
MÉXICO. 
T E S I S 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
 
QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA 
 
P R E S E N T A : 
 
JOANNA MARÍA ORTIZ ALCÁNTARA 
 MÉXICO, D. F. 2006 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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 2
 
 
Jurado Asignado: 
 
 
Presidente Prof. Luz del Carmen Castellanos Román 
 
Vocal Prof. Norma Angélica Castellanos Chávez 
 
Secretario Prof. Celia Mercedes Alpuche Aranda 
 
1er. Suplente Prof. María de los Ángeles Granados Silvestre 
 
2° Suplente Prof. María del Carmen Urzua Hernández 
 
 
 
Sitio donde se desarrolló el tema: 
 
Laboratorio de Infectología, Microbiología e Inmunología Clínica, Unidad de 
Medicina Experimental, Facultad de Medicina UNAM, Hospital General de 
México. 
 
 
 
______________________________ 
Dra. Celia Mercedes Alpuche Aranda 
Asesora del tema 
 
 
 
______________________________ 
Dra. María Dolores Alcántar Curiel 
Supervisora técnica 
 
 
 
______________________________ 
Joanna María Ortiz Alcántara 
Sustentante 
 
 
 
 
 
 3
 
 
 
 
A las personas más importantes en mi vida: 
 
 
Cecilia y Bernardo 
Ivette y Nelly 
Héctor 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 4
Mil gracias a: 
 
 
Mis padres Cecilia y Bernardo por la vida, por su amor y sus sabias palabras. 
Mis hermanitas Ivette y Nelly por ser mis amigas y hacerme siempre sonreír. 
Héctor por hacerme tan feliz. 
Atziri, Verónica y Julissa por ser mis súper amigas. 
Las familias Ortiz y Alcántara por siempre apoyarme y creer en mi. 
 
 
Agradezco especialmente a: 
 
 
La Dra. Celia Mercedes Alpuche Aranda, mi primera mentora en la ciencia, 
por la oportunidad de acercarme a la investigación en el laboratorio a su 
cargo, por ser un ejemplo a seguir. 
La Dra. María Dolores Alcántar Curiel por todas sus enseñanzas. 
La QFB Catalina Gayosso Vázquez por su valioso apoyo para realizar este 
trabajo, y sobretodo por su amistad. 
Todos mis compañeros de laboratorio, principalmente a Marcia, Araceli y 
Roberto, por tenderme siempre la mano. 
Dr. Guillermo Mendoza por su invaluable ayuda en la purificación de la 
betalactamasa, por su tiempo y su paciencia. 
 
 
 
 
 5
 
ÍNDICE GENERAL 
 
 Página 
ABREVIATURAS..........................................................................................7 
1. INTRODUCCIÓN.........................................................................................9 
1.1. Infecciones nosocomiales..................................................................9 
1.2. Klebsiella pneumoniae.....................................................................12 
1.3. Antibióticos.......................................................................................14 
1.4. Resistencia a los antibióticos...........................................................20 
1.5. Las betalactamasas como base molecular de la resistencia a los 
antibióticos betalactámicos...................................................................21 
1.6. Características moleculares y bioquímicas de las betalactamasas 
de espectro extendido (BLEEs)............................................................27 
2. ANTECEDENTES.......................................................................................36 
3. JUSTIFICACIÓN.........................................................................................40 
4. OBJETIVOS................................................................................................41 
4.1. Objetivo general...............................................................................41 
4.2. Objetivos particulares.......................................................................41 
5. MATERIALES Y MÉTODOS.......................................................................42 
5.1. Diseño experimental.........................................................................42 
5.2. Cepas bacterianas...........................................................................44 
5.3. Punto isoeléctrico.............................................................................44 
5.4. Prueba biológica de hidrólisis de CAZ..............................................45 
5.5. Obtención del extracto crudo...........................................................45 
5.6. Purificación de la betalactamasa con pI 6.0.....................................46 
5.7. Determinación de la masa molecular relativa...................................47 
5.8. Determinación de proteínas.............................................................47 
5.9. Electroforesis en dos dimensiones...................................................47 
5.10. Evaluación de la hidrólisis enzimática y determinación de párame- 
tros cinéticos.........................................................................................49 
5.11. Extracción de ADN plasmídico por el método de lisis alcalina.........49 
 6
5.12. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y secuenciación del 
producto de PCR...................................................................................50 
6. RESULTADOS............................................................................................ 52 
6.1. Caracterización bioquímica de la betalactamasa con pI 6.0.............52 
6.2. Caracterización molecular de la betalactamasa con pI 6.0...............53 
7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS..................................................................55 
8. CONCLUSIONES........................................................................................58 
9. APÉNDICE I. TABLAS Y FIGURAS............................................................59 
9.1. Geles de pI y prueba biológica de hidrólisis de CAZ.........................59 
9.2. Determinación de la masa molecular relativa de la betalactamasa 
con pI 6.0 semipurificada.......................................................................62 
9.3. Determinación de proteínas..............................................................64 
9.4. Constantes cinéticas.........................................................................65 
9.5. Geles del producto de PCR y cuantificación de ADN en el producto 
purificado...............................................................................................66 
9.6. Secuencia de nucleótidos de la región codificante del gen blaTEM ...67 
10. APÉNDICE II. CALIBRACIÓN DE LA COLUMNA SUPERDEX 75............68 
11. REFERENCIAS...........................................................................................69 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 7
 
ABREVIATURAS 
 
ADN Ácido desoxirribonucleico 
AMK Amikacina 
AMP Ampicilina 
ASB Albúmina sérica bovina 
ATCC Colección Americana de Cultivos Tipo 
AZM AztreonamBHI Infusión cerebro corazón 
BLEE Betalactamasa de espectro extendido 
CAZ Ceftazidima 
CAZR Resistente a Ceftazidima 
CDC Centro de Control de Enfermedades 
CMN Centro Médico Nacional 
CTX Cefotaxima 
Da Dalton 
EDTA Ácido etilendiaminotetraacético 
IEF Isoelectroenfoque 
IN Infecciones nosocomiales 
kDa Kilodalton 
LB Medio Luria Bertani 
MIC Concentración Mínima Inhibitoria 
Mr Masa molecular relativa 
MRHA Hemaglutinina manosa resistente 
MSHA Hemaglutinina manosa sensible 
PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida 
PBP Proteína de unión a la penicilina 
PBS Solución amortiguadora de fosfatos 
pCMB p-cloromercuribenzoato 
PCR Reacción en cadena de la polimerasa 
 8
PFGE Electroforesis por campos pulsados 
pI Punto isoeléctrico 
RHOVE Red Hospitalaria de Vigilancia Epidemiológica 
RIF Rifampicina 
RIFR Resistente a rifampicina 
SDS Dodecil sulfato de sodio 
TBE Solución amortiguadora con Tris, boratos y EDTA 
TR Transconjugante 
UCI Unidad de Cuidados Intensivos 
UCIN Unidad de Cuidados Intensivos Neonatales 
Ve Volumen de elusión 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 9
 
1. INTRODUCCIÓN 
 
1.1 Infecciones nosocomiales 
 
Las infecciones nosocomiales pueden definirse como aquellas que se 
adquieren durante la hospitalización y que no están presentes, en el periodo 
de incubación, en el momento del ingreso del paciente al hospital. Se 
manifiestan durante la misma o en ocasiones tras el alta del paciente30, 38. 
Constituyen un problema importante de salud pública ya que condicionan altas 
tasas de morbilidad y mortalidad, así como un incremento en el tiempo de 
estancia hospitalaria y en los costos de atención22. 
En los Estados Unidos de América se estima que hay 5.7 infecciones 
nosocomiales (IN) por cada 100 admisiones, ya que de los 35 millones de 
pacientes que son hospitalizados, al menos 2.5 millones desarrollan una 
infección de este tipo. En ese país en promedio la tasa de infecciones 
intrahospitalarias va de 3 a 5 por ciento64. 
En México, se asume una tasa de IN de entre el 10 y 15 por ciento, de 
acuerdo a estudios realizados en hospitales de referencia y de segundo nivel, 
con una tasa de mortalidad asociada a las mismas del 5 %, lo que ubica a las 
IN como la séptima causa de muerte62, 63, 64, 65, 78. La frecuencia con que se 
presentan IN depende del tipo de hospital y las condiciones del paciente, de 
manera que las tasas reportadas en diferentes hospitales de México varían 
entre 2.5 a 18.9 infecciones por cada 100 ingresos38. En hospitales pediátricos 
las tasas son más elevadas, principalmente en recién nacidos y pacientes que 
se encuentran en unidades de cuidados intensivos (UCI) con una tasa de 
mortalidad de 10.5 a 11.7 por cada 100 infecciones 4, 5, 25, 57. 
Las infecciones nosocomiales no representan un problema nuevo. En el 
siglo XVIII en París, se les identificó por primera vez como un factor asociado 
con la mortalidad, al relacionarse con la fiebre pútrida, causante del 80% de 
las muertes en pacientes amputados. En 1847, el médico húngaro Ignaz 
Semmelweis realizó el primer estudio en la materia, en una clínica de 
 10
maternidad en Viena en la que había una elevada mortalidad debida a fiebre 
puerperal; Semmelweis observó que la mortalidad entre las madres atendidas 
en el parto por médicos y estudiantes de medicina era más alta comparada 
con la de aquellas atendidas por parteras y atribuyó este hecho a que las 
manos de los médicos y estudiantes se encontraban contaminadas con restos 
de las necropsias realizadas, algunas de las cuales correspondían a pacientes 
que habían muerto a causa de la fiebre puerperal. El número de casos de esta 
enfermedad, así como la mortalidad asociada, disminuyeron 
significativamente al instituirse la medida del estricto lavado de manos con 
una solución de hipoclorito de calcio. Un siglo después, en 1968 el único 
escrito autorizado acerca de las IN era el manual Infection Control in the 
Hospital publicado por la Asociación Americana de Hospitales. A partir de 
1970, el Centro de Control de Enfermedades (CDC) realiza cada 10 años una 
conferencia internacional de infecciones nosocomiales en Atlanta Georgia 
como un esfuerzo promotor de la investigación y el control de tales 
infecciones38. 
Las infecciones nosocomiales, pueden ser causadas por diversos 
microorganismos. Se estima que el 95% de éstas son causadas por bacterias. 
Dos tercios por bacilos gram-negativos, los más frecuentes Klebsiella oxytoca, 
Klebsiella pneumoniae, Enterobacter spp. Pseudomonas spp., Serratia spp., 
Proteus vulgaris, Escherichia coli, Citrobacter freundii, Providencia spp. y un 
tercio por cocos gram-positivos como Staphylococcus aureus, Staphylococcus 
aureus coagulasa negativa y Enterococcus spp. Otros microorganismos, como 
agentes virales (rotavirus), hongos (Candida spp.) y parásitos como 
Pneumocystis han sido implicados también en la aparición de infecciones 
nosocomiales, principalmente en pacientes inmunosuprimidos38, 44. 
 Las enterobacterias como E. coli y particularmente K. pneumoniae son 
responsables de gran cantidad de IN particularmente en las salas de cuidados 
intensivos (UCIs) en la mayoría de los hospitales 27, 44, 56, 58. 
El uso inapropiado de antimicrobianos ha promovido el desarrollo de cepas 
bacterianas resistentes a los antibióticos de uso común. Cepas 
 11
multirresistentes que incluyen a Staphylococcus spp. resistente a meticilina, 
Enterococcus spp. resistente a vancomicina y Klebsiella pneumoniae 
resistente a antibióticos de amplio espectro como cefalosporinas de tercera y 
cuarta generación son causantes de infecciones nosocomiales21, 33. Especies 
como K. pneumoniae, K. ozaenae y Serratia marcescens, a partir de 1983 se 
han reportado con una creciente resistencia a cefalosporinas de tercera y 
cuarta generación debido a la producción de enzimas capaces de inactivar a 
los diferentes tipos de antibióticos betalactámicos como las penicilinas, las 
cefalosporinas, los inhibidores de betalactamasas, los carbapenémicos y 
monobactámicos44, 52. 
De acuerdo a su fuente, las infecciones nosocomiales pueden ser 
autógenas (endógenas), si los microorganismos causantes de la infección 
forman parte de la biota normal del paciente o éste es un portador sano; o 
bien, exógenas si el agente causal de la infección es transferido desde otro 
paciente, del personal o del ambiente38. 
Los factores de riesgo relacionados con el desarrollo de infecciones 
intrahospitalarias son diversos; Incluyen la edad y el sexo del paciente, 
servicio, tiempo de internación, presencia de infecciones anteriores, 
enfermedades subyacentes, tipo y duración de la cirugía, catéteres, apoyo 
ventilatorio continuo, terapia inmunosupresora, estado nutricional, respuesta 
inmune, factores genéticos y factores relacionados con resistencia alterada38. 
Las infecciones intrahospitalarias más frecuentes son la infección 
respiratoria, principalmente la neumonía nosocomial, la infección asociada a 
dispositivos intravasculares, la infección urinaria nosocomial, y la infección de 
herida quirúrgica38. 
Los factores de riesgo que se conjugan para dar lugar a IN, en su mayoría 
son susceptibles de prevención y control; en este sentido, el inicio de 
operación de la Red Hospitalaria de Vigilancia Epidemiológica (RHOVE) en 
México, es una de las estrategias nacionales de fortalecimiento de la práctica 
médica y la vigilancia epidemiológica, herramienta útil para la identificación 
temprana y estudio de las infecciones nosocomiales22. 
 12
1.2 Klebsiella pneumoniae 
 
Klebsiella es un género de la familia Enterobacteriaceae constituido por 
bacilos gram-negativos, no móviles, encapsulados. El género fue establecido 
en 1885 y actualmente contiene 5 especies: K. pneumoniae, K. oxytoca, K. 
terrígena, K. planticola y K. ornitholytica,que pueden diferenciarse de acuerdo 
a ciertas características bioquímicas señaladas en la Tabla A. En Klebsiella 
pneumoniae se reconocen tres subespecies (pneumoniae, ozaenae y 
rhinoscleromatis) las cuales no pueden ser separadas por hibridación de 
ADN, aunque presentan algunas diferencias bioquímicas (Tabla A)80. 
 
Tabla A. Características bioquímicas del género Klebsiella 
 
Característica 
K. pneumoniae 
subsp. 
pneumoniae 
 
K. pneumoniae 
subsp. 
ozaenae 
 
K. pneumoniae 
subsp. 
rhinoscleromatis 
 
K. oxytoca 
 
 
K. terrigena 
 
K.planticola 
 
K. ornitholytica 
Producción de 
indol 
- - - + - reacción 
variable 
+ 
Ornitina 
descarboxilasa 
- - - - - - + 
lisina 
descarboxilasa 
+ reacción 
variable 
- + + + + 
crecimiento a 
10 °C 
- - - + + + + 
prueba de rojo 
de metilo 
- + + - + reacción 
variable 
+ 
prueba de 
Voges 
Proskauer 
+ - - + + + + 
 
 Tomado de West, P. W. Extended-spectrum β-lactamase-producing Klebsiella spp. British J. 
Biomed. Science. 57, 226-233 (2000). 
 
Klebsiella pneumoniae es la especie médicamente más importante del 
género. En los seres humanos, se encuentra como biota normal de la 
nasofaringe y el tracto intestinal. Es un patógeno oportunista que afecta 
principalmente a individuos inmunocomprometidos que se encuentran 
hospitalizados y padecen de enfermedades como diabetes mellitus u 
obstrucción pulmonar crónica. Es responsable de infecciones del tracto 
urinario, septicemia y neumonia. 
 13
Los mecanismos de patogenicidad de Klebsiella son: la presencia de 
cápsula, las adhesinas, la resistencia al efecto bactericida del suero y los 
sideróforos. 
Klebsiella desarrolla cápsulas prominentes compuestas por polisacáridos 
que forman densas estructuras fibrosas sobre la superficie de la bacteria, 
protegiéndola por un lado de la fagocitosis por granulocitos polimorfonucleares 
y por otro de los factores bactericidas del suero. Existen 77 distintos tipos 
capsulares con virulencia variable. Los que presentan los antígenos 
capsulares K1, K2, K4 y K5 son los más importantes. 
El pili o fimbria es una proyección filamentosa no flagelar de la superficie 
de la bacteria que media generalmente las propiedades de adherencia en la 
familia Enterobacteriaceae. Estas estructuras tienen hasta 10 µm de longitud 
y un diámetro de 1 a 11 nm. Consisten de proteínas globulares poliméricas 
(pilinas) con una masa molecular de 15 a 26 kDa. Los pili son capaces de 
aglutinar eritrocitos de distintas especies animales; dependiendo de si la 
reacción es inhibida por D-manosa, estas adhesinas se designan como 
hemaglutininas manosa sensibles o manosa resistentes (MSHA y MRHA por 
sus siglas en inglés) respectivamente. Hay dos tipos predominantes de pili en 
Klebsiella, el tipo 1 y el tipo 3. Los pili de tipo 1 son MSHA que aglutinan 
eritrocitos de cobayo; su proteína de adhesión se localiza en el cuerpo fimbrial 
y es capaz de unirse a trisacáridos de las glicoproteínas del hospedero, que 
contengan manosa; este tipo de pili permite que la bacteria se adhiera a 
células epiteliales de los tractos urogenital, respiratorio e intestinal. Los pili de 
tipo 3 aglutinan solo eritrocitos tratados con ácido tánico, son MRHA y 
permiten la adhesión a células endoteliales, epitelio del tracto respiratorio, 
células uroepiteliales, y en los riñones a membrana basal tubular, a las 
cápsulas de Bowman y a los vasos renales. 
La actividad bactericida del suero es mediada primariamente por proteínas 
del complemento. Éstas, después de su activación en cascada se acumulan 
como un complejo de ataque a la membrana, en la superficie del 
microorganismo. Los microorganismos patógenos han desarrollado 
 14
estrategias para contrarrestar el efecto bactericida del suero; en el caso de 
Klebsiella, uno de los mecanismos propuestos es que los polisacáridos de la 
cápsula podrían cubrir y enmascarar a los lipopolisacáridos y exhibir una 
estructura de superficie que no active al complemento. 
Finalmente, otro mecanismo de patogenicidad de Klebsiella es la 
producción de sideróforos, que son agentes quelantes de hierro (factor de 
crecimiento bacteriano esencial) que tienen bajo peso molecular y alta 
afinidad y son capaces de unir competitivamente hierro unido a proteínas del 
hospedero, asegurando el suministro de dicho metal para la bacteria; los 
sideróforos producidos por las enterobacterias pertenecen a dos grupos 
químicos distintos; uno consiste en sideróforos de tipo fenolato y otro de tipo 
hidroxamato, siendo el primero el grupo más común60. 
 
 
1.3 Antibióticos 
 
Los antibióticos son compuestos de bajo peso molecular que inactivan a 
las bacterias (bactericidas), o inhiben su crecimiento (bacteriostáticos). 
Muchos antibióticos son producidos por microorganismos como bacterias y 
hongos. Algunos de éstos han sido modificados por un proceso químico para 
hacerlos más activos o menos sensibles a los mecanismos de resistencia de 
las bacterias (antibióticos semisintéticos); y otros antibióticos son totalmente 
sintéticos. Entre las características deseables en un antibiótico se encuentran: 
pocos o ningún efecto secundario, amplio espectro de actividad contra 
distintos tipos de bacteria, buena distribución en el cuerpo, y mínimo efecto en 
la microbiota47, 81. 
 El intervalo de microorganismos susceptibles a cierto antibiótico se 
expresa como su espectro de acción . Los antibióticos efectivos contra 
bacterias tanto gram-positivas como gram-negativas se denominan de amplio 
espectro; si el antibiótico es efectivo principalmente contra bacterias gram-
positivas o gram- negativas, es de espectro restringido47, 79. 
 15
 
Clasificación de antibióticos 
I. Betalactámicos: Los antibióticos de este tipo se denominan así ya 
que contienen un anillo de 4 miembros llamado betalactámico. Su mecanismo 
de acción consiste en inhibir el último paso en la síntesis del peptidoglicano de 
la pared celular. En este paso se unen, mediante enlaces transversales, dos 
cadenas de peptidoglicano por medio de una reacción de transpeptidación 
mediada por transpeptidasas; a estas últimas se unen las penicilinas y otros 
antibióticos betalactámicos, por lo que reciben el nombre de proteínas de 
unión a las penicilinas (PBPs por sus siglas en inglés). Aunque la pared 
celular continua sintetizándose, la falta de enlaces transversales la debilita. 
Las carboxipeptidasas, también consideradas PBPs posiblemente son 
importantes para la modificación del peptidoglicano. Por otro lado, el complejo 
antibiótico-PBP estimula la liberación de autolisinas que digieren la pared 
celular existente dando como resultado la lisis de la célula bacteriana15, 47, 81. 
Los antibióticos betalactámicos se agrupan a su vez en: 
a) Penicilinas: La estructura básica de las penicilinas es un núcleo que 
consiste de anillo tiazólico-anillo betalactámico-cadena lateral. El anillo 
betalactámico es esencial para la actividad antibacteriana, mientras que la 
cadena lateral determina en gran parte el espectro de acción y las 
propiedades farmacológicas de una penicilina en particular. Las penicilinas 
pueden dividirse en penicilinas de origen natural, como la penicilina G o la 
penicilina V, que son producidas por Penicillium chrysogenum y son 
efectivas contra bacterias gram-positivas no productoras de 
betalactamasas, anaerobias y cocos gram-negativos selectos, como 
Neisseria; penicilinas resistentes a penicilinasas (semisintéticas) como la 
meticilina, nafcilina e isoxasolil penicilinas, antibióticos de elección contra 
S. aureus y Staphylococcus epidermidis resistentes a penicilina, y activas 
contra algunos estreptococos; aminopenicilinas como ampicilina y 
amoxicilina, con el mismo espectro que la penicilina G, pero más activas 
contra cocos gram-negativos y miembros de la familia Enterobacteriaceae; 
 16
carboxipenicilinas como carbenicilinay ticarcilina; y ureidopenicilinas como 
azlocilina, mezlocilina y piperacilina, activas contra estreptococos, 
Haemophilus spp., y bacilos aerobios gram-negativos resistentes a 
ampicilina como P. aeruginosa15, 40. 
b) Cefalosporinas: Son antibióticos producidos por el hongo 
Cephalosporium acremonium, (actualmente llamado Acremonium 
chrysogenum). Su modo de acción es similar al de las penicilinas. Difieren 
de estas últimas porque en lugar del anillo tiazólico de cinco miembros 
tienen un anillo de dihidrotiacina de seis miembros. Se clasifican de 
acuerdo a su actividad antibacteriana como cefalosporinas de primera 
generación (cefalotina, cefazolina, cefapirina, cefadroxil) actúan contra 
bacterias gram-positivas y poco contra gram- negativas; cefalosporinas de 
segunda generación (cefamandol, cefonicida, cefuroxima, cefoxitina, 
cefotetan, cefmetazol) actúan contra gram-positivos y algunos gram-
negativos; cefalosporinas de tercera generación (ceftizoxima, cefotaxima, 
ceftriazona, cefoperazona, ceftazidima) actúan contra gram- positivos y 
marcadamente contra gram-negativos; y cefalosporinas de cuarta 
generación (cefpirome y cefepime) que actúan contra gram-positivos y 
gram- negativos, incluyendo a P. aeruginosa y miembros de la familia 
Enterobacteriaceae con betalactamasas cromosomales e inducibles40, 43, 
47, 81. 
c) Carbapenémicos: Son antibióticos derivados de la tienamicina, 
compuesto producido por Streptomyces cattleya. Se diferencian de la 
penicilinas y cefalosporinas por el reemplazo de un sulfuro por metileno en 
el anillo de 5 miembros, el cual como en el caso de las cefalosporinas, 
posee un doble enlace. El imipenem se une con alta afinidad a PBPs de 
bacterias tanto gram- positivas como gram-negativas y no es hidrolizado 
por la mayoría de las betalactamasas cromosomales o plasmídicas de S. 
aureus, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, 
Proteus rettgeri, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Klebsiella oxytoca, 
Pseudomonas aeruginosa, B. Cepacia, y B. Fragilis, pero si lo hidrolizan 
 17
las betalactamasas de S. maltophilia, y algunas enzimas de Bacillus y 
Bacteroides. El meropenem se caracteriza por una excelente penetración 
en la bacteria, alta afinidad por PBPs y estabilidad a betalactamasas. Es 
ligeramente más activo que el imipenem contra organismos gram-
negativos. 
d) Monobactámicos: A partir de Chromobacterium violaceum se aisló 
un compuesto monocíclico con actividad antibacteriana, éste fue 
posteriormente modificado para dar lugar al aztreonam. El aztreonam es 
un antibiótico betalactámico monocíclico cuya actividad contra bacterias 
gram-positivas o anaerobias no es apreciable, debido a que no se une a 
PBPs en estas especies. El aztreonam se une principalmente a PBP3 en 
Enterobacteriaceae, Pseudomonas y otras bacterias aerobias gram-
negativas. No es hidrolizado por la mayoría de las betalactamasas 
cromosomales o plasmídicas, aunque si por K. oxytoca y B. cepacia y por 
enzimas plasmídicas que hidrolizan a cefotaxima. 
e) Inhibidores de betalactamasas: Estos compuestos tienen poca 
actividad antimicrobiana, pero inhiben potentemente a las betalactamasas. 
Clínicamente se emplean 3 antibióticos de este tipo, el ácido clavulánico, el 
sulbactam y el tazobactam. Pueden restablecer la actividad antibacteriana 
de amoxicilina, ampicilina, piperacilina, mezlocilina y cefoperazona, 
susceptibles de hidrólisis por betalactamasas. Hay diferencias menores en 
potencia, actividad y farmacología entre los inhibidores de betalactamasas, 
y clínicamente se consideran terapéuticamente equivalentes, excepto para 
Klebsiella spp., caso en el que el ácido clavulánico es efectivo en cepas 
resistentes a sulbactam y tazobactam. Este tipo de antibióticos son más 
efectivos contra betalactamasas producidas por S. aureus, H. influenzae, 
Branhamella catarrhalis, Bacteroides spp., y algunas enterobacteriaceas. 
No son inhibidas las betalactamasas cromosomales de Serratia spp., C. 
freundii, Enterobacter spp., P. aeruginosa, y de algunas 
enterobacteriaceas14, 40. 
 18
II. Glucopéptidos: En este grupo se incluye a la vancomicina y a la 
teicoplanina. Su mecanismo de acción consiste en inhibir la síntesis de 
peptidoglicano en los pasos de transglucosilación y transpeptidación 
uniéndose a la porción D-ala-D-Ala del UDP-muramil-pentapéptido. Son 
efectivos contra bacterias gram-positivas. 
 III. Aminoglucósidos: Son trisacáridos con grupos amino cuyo blanco 
es la subunidad 30S del ribosoma bacteriano; al unirse a dicha subunidad, 
impiden su unión con la subunidad 50S para formar el ribosoma activo, 
inhibiendo así la síntesis de proteínas. Son activos contra numerosas 
bacterias patógenas, pero debido a sus efectos secundarios como el daño 
renal y la pérdida de la audición, se ha limitado su uso. Son aminoglucósidos: 
kanamicina, gentamicina y estreptomicina. 
IV. Tetraciclinas: Son compuestos de 4 anillos fusionados, de 6 
miembros. Se unen a la subunidad 30S del ribosoma bacteriano, interfiriendo 
con la síntesis de proteínas. Generalmente son bacteriostáticos. 
V. Macrólidos y lincosaminas: Inhiben la síntesis de proteínas 
uniéndose a la subunidad 50S del ribosoma, inhibiendo la translocación. Son 
bacteriostáticos para muchas bacterias, pero bactericidas para algunas gram- 
positivas. La eritromicina es un ejemplo de macrólido. Las lincosaminas 
difieren de los macrólidos estructuralmente, pero tienen el mismo mecanismo 
de acción. La clindamicina, es la lincosamina más empleada, y es efectiva 
contra bacterias anaerobias estrictas como Bacteroides. 
VI. Quinolonas: Interfieren con la replicación del ADN al unirse a la 
ADN girasa e inhibiendo su actividad, previniendo el superenrollamiento del 
ADN. Las fluoroquinolonas pueden penetrar a macrófagos y 
polimorfonucleares por lo que pueden actuar contra bacterias que sobreviven 
dentro de los fagocitos. Son activas contra bacterias gram-negativas, gram- 
positivas y Mycoplasma .Algunos ejemplos son: Ciprofloxacina y norfloxacina. 
VII. Rifamicinas: Estos antibióticos inhiben a la ARN polimerasa, 
interfiriendo con la transcripción del ADN. Son activas contra bacterias gram- 
 19
positivas y micobacterias. La rifampicina y el rifabuten pertenecen a éste 
grupo. 
VIII. Trimetropima/sulfonamidas: Son inhibidores de enzimas en la vía de 
producción del ácido tetrahidrofólico, cofactor esencial para las reacciones de 
transferencia de carbono que ocurren en vías para la síntesis de ácidos 
nucleicos y formilmetionina. Son activas principalmente contra gram-negativos 
y se emplean para tratar infecciones de vías urinarias bajas no complicadas y 
nocardiosis. En este grupo se encuentran el sulfametoxazol , sulfisoxazol y 
trimetoprima-sulfametoxazol. 
IX. Metronidazol: Interfiere con la síntesis de ADN. Es activo contra 
bacterias anaerobias, Gardnerella vaginalis, Trichomonas vaginalis y C. 
difficile. 
X. Cloranfenicol: Interfiere con la unión del mARN a los ribosomas, es 
activo contra gram-positivos y gram-negativos, así como anaerobios. 
XI. Estreptograminas: Se unen a la subunidad 50S del ribosoma, 
impidiendo la elongación de la cadena peptídica . El dalfopristin y quinupristin 
pertenecen a éste grupo, individualmente son bacteriostáticos y mezclados 
bactericidas ( Synercid)40, 47, 81. 
XII. Fosfonomicina y bacitracina: Inhiben la síntesis del peptidoglicano. 
La fosfonomicina inhibe la conversión de UDP-NAG a UDP-NAM y se emplea 
para tratar infecciones ocasionadas por S. aureus meticilina resistente. La 
bacitracina interfiere con el reciclamiento del bactoprenol, y se emplea para 
prevenir infecciones en heridas superficiales ya que es muy tóxica para uso 
interno47, 81. 
XIII. Polimixinas: Ocasionan disrupción de la membrana celular, son 
activas principalmente contra gram-negativos, algunos ejemplos son: 
polimixina B y colistina40,47, 81. 
 
 
 
 
 20
1.4 Resistencia a los antibióticos 
 
La resistencia a los antibióticos puede ser una propiedad inherente o 
adquirida por un organismo para resistir los efectos de un antibiótico47, 81. En 
las bacterias, la capacidad de desarrollar resistencia a cualquier 
antimicrobiano puede estar mediada por mecanismos de variabilidad genética. 
La variabilidad genética es fundamental para que ocurra la evolución de los 
organismos. En las bacterias, puede ocurrir por medio de mutaciones 
puntuales (cambio micro evolucionario); rearreglos de segmentos largos de 
ADN que incluyen inversiones, duplicaciones, inserciones, deleciones o 
transposiciones de largas secuencias de ADN de un sitio del cromosoma o 
plásmido bacteriano a otro (cambio macroevolucionario); adquisición de ADN 
contenido en plásmidos, bacteriófagos, secuencias desnudas de ADN o 
elementos genéticos transponibles. Los mecanismos anteriores, permiten a la 
bacteria desarrollar resistencia a agentes antimicrobianos, la cual, una vez 
presente puede transferirse a otras bacterias en forma horizontal o vertical. 
Esto ocurre mediante procesos como transformación, transducción, 
conjugación o transposición. El amplio uso de los antibióticos, favorece la 
expansión de cepas resistentes, que proliferan y transfieren a otras cepas 
susceptibles los genes de resistencia55. Existen distintos mecanismos 
mediante los cuales los microorganismos son resistentes a los antibióticos: 
a) El organismo carece de la estructura blanco del antibiótico. Un 
ejemplo son las micobacterias, que al carecer de una pared celular típica son 
resistentes a los betalactámicos. 
b) El organismo puede restringir la entrada del antibiótico. Como es el 
caso de las bacterias gram-negativas, cuya membrana externa impide el paso 
de las penicilinas naturales. 
c) La pérdida acelerada del antibiótico, debida al bombeo hacia fuera 
del mismo por medio de bombas de flujo, es otro mecanismo de resistencia a 
tetraciclinas y cloramfenicol, presente en bacterias entéricas, S. aureus y B. 
subtilis. 
 21
d) El organismo puede poseer enzimas que inactivan al antibiótico 
mediante hidrólisis, como es el caso de las betalactamasas o bien enzimas 
que modifican al antibiótico añadiéndole grupos químicos, como las enzimas 
modificadoras de aminoglucósidos presentes en bacterias gram-negativas, o 
las acetiladoras de cloranfenicol en S. aureus. 
e) Otro mecanismo es la modificación o protección del blanco del 
antibiótico, como ocurre entre las bacterias gram-positivas, en las que se 
altera la especificidad de unión de las PBPs de manera que el antibiótico 
betalactámico ya no puede unirse. Otro ejemplo es el de la proteína 
citoplasmática protectora del ribosoma, que impide la unión de la tetraciclina al 
ribosoma en bacterias gram-positivas, Micoplasma, Neisseria, Haemophilus y 
Bacteroides. 
f) También, puede tener lugar que la alteración de una vía metabólica 
bloquee al antibiótico, como es el caso de las sulfonamidas cuya resistencia 
se presenta en bacterias entéricas y S. aureus23, 47, 81. 
 
 
1.5 Las betalactamasas como base molecular de la resistencia a los 
antibióticos betalactámicos 
 
Las betalactamasas son enzimas que hidrolizan el anillo betalactámico, 
inactivando a los antibióticos denominados betalactámicos, como las 
penicilinas, cefalosporinas, carbapenémicos, monobactámicos e inhibidores 
de betalactamasas. Estas enzimas son la principal causa de resistencia 
bacteriana a dichos antibióticos37, 44. 
El nivel de resistencia a antibiótico mediada por una betalactamasa 
particular en una población bacteriana está determinada por diversas 
variables como su localización, cinética, cantidad y condiciones 
fisicoquímicas. La eficiencia de la enzima en la hidrólisis de un antibiótico 
depende tanto de la tasa de hidrólisis (Vmáx), como de su afinidad por el 
antibiótico (Km). Otras variables son la cantidad de betalactamasa producida 
 22
por la célula bacteriana, la susceptibilidad de la proteína blanco (PBP) al 
antibiótico y la tasa de difusión del antibiótico al espacio periplásmico de la 
célula44. 
Entre las bacterias gram-positivas, lo estafilococos son los principales 
productores de betalactamasas, la mayoría inducibles y excretadas 
extracelularmente . Los genes que codifican para la producción de éstas 
enzimas generalmente se encuentran en pequeños plásmidos o 
transposones. Plásmidos grandes que codifican para éste tipo y otros de 
resistencia también existen y pueden transferirse por conjugación entre cepas 
de S. aureus y entre S. aureus y Staphylococcus epidermidis. 
En las bacterias gram-negativas, las betalactamasas se encuentran en el 
espacio periplásmico. En éste caso, la gran variedad de betalactamasas 
producidas ha conducido al desarrollo de varios esquemas de clasificación, de 
los que se hablará más adelante55. 
 
Mecanismo de acción de las betalactamasas 
Un gran número de betalactamasas actúan mediante un mecanismo en el 
que se forma un éster de serina. Dicho mecanismo, consiste primeramente en 
la asociación no covalente de la enzima con el antibiótico, formándose el 
complejo no covalente de Michaelis; posteriormente, el anillo betalactámico 
es atacado por el grupo hidroxilo libre de la cadena lateral de un residuo de 
serina en el sitio activo de la enzima, formando un enlace covalente éster acil. 
La hidrólisis del éster finalmente libera al sitio activo de la enzima, así como al 
fármaco hidrolizado e inactivo (Figura A). Este mecanismo es seguido por 
betalactamasas de las clases moleculares A, C y D, mientras que las enzimas 
de clase B utilizan iones zinc para romper el anillo betalactámico 44. 
 
 
 
 
 
 
 
 23
Figura A. Mecanismo de acción de las serin-betalactamasas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tomado de Livermore, D. M. β-Lactamases in Laboratory and Clinical Resistance. Clin. Microbiol. 
Rev. 8, 557-584 (1995). 
 
 
 
 
 
 24
Clasificación de betalactamasas 
La primera clasificación de las betalactamasas fue realizada por Sawai y 
col. en 1968, y en ésta se describían penicilinasas y cefalosporinasas, 
empleando la respuesta a antisuero como un factor de discriminación 
adicional. Posteriormente, Richmond y Sykes proponen otro esquema en 
1973, el cual incluía a todas las betalactamasas de bacterias gram-negativas 
descritas hasta entonces, clasificándolas en 5 grupos de acuerdo a su afinidad 
al sustrato. Sykes y Matthew, amplían el esquema anterior en 1976, 
enfatizando la diferenciación de las betalactamasas mediadas por plásmidos 
de acuerdo a su punto isoeléctrico (pI). La primera clasificación basada en la 
estructura molecular fue propuesta por Ambler en 1980; dentro de este 
esquema, las betalactamasas son clasificadas de acuerdo a su secuencia en 
4 clases, designadas de la A a la D. Las clases A, C y D comprenden distintos 
grupos de serinenzimas, y la clase B a las que contienen zinc. En el esquema 
propuesto por Mitsuhashi e Inoue en 1981, se añade la categoría de 
betalactamasas que hidrolizan cefuroxime a la clasificación “penicilinasas y 
cefalosporinasas”. 
En 1989, Bush propone el primer esquema en el cual se correlacionan las 
propiedades del sustrato e inhibitorias con la estructura molecular, el cual fue 
actualizado en 1995 por Bush, Jacoby y Medeiros. 
En el sistema de 1995, como en el de 1989, se designan 4 grupos de 
betalactamasas: grupo 1 cefalosporinasas que no son inhibidas por ácido 
clavulánico, grupo 2 betalactamasas que son generalmente inhibidas por 
inhibidores de betalactamasas dirigidos al sitio activo y que pertenecen a las 
clases moleculares A ó D, grupo 3 metalo- betalactamasas pobremente 
inhibidas por todos los inhibidores de betalactamasas clásicos, excepto EDTA 
y p-cloromercuribenzoato (pCMB) y grupo 4 penicilinasas que no son 
inhibidas por ácidoclavulánico. Sin embargo, se hicieron 3 cambios. Dado que 
el número de betalactamasas TEM- (que proviene de Temoniera, nombre de 
la paciente de quién se aisló una cepa de E. coli productora de una enzima de 
ésta familia en Grecia en 1965) y SHV- (contracción de sulphydril variable, 
 25
que denota una respuesta variable a sulfidril inhibidores) continuaba 
incrementándose, se decidió clasificar a las derivadas de éstas enzimas en 
grupos con el prefijo 2b; las betalactamasas de espectro extendido (ESBLs 
por sus siglas en inglés “Extended Spectrum Beta Lactamases”, BLEEs en 
español) fueron colocadas en un grupo 2be en lugar de la designación de 
grupo anterior 2b’, similarmente, las betalactamasas estructuralmente 
derivadas del grupo 2b con afinidad reducida hacia inhibidores de 
betalactamasas, se colocaron en el grupo 2br; el tercer grupo de enzimas 
añadido al esquema es el 2f, que incluye a la enzimas que hidrolizan al 
carbapenem, que son débilmente inhibidas por ácido clavulánico y que se 
sabe poseen serina en su sitio activo12, 44. En la tabla B, se resumen los 
esquemas de clasificación de las betalactamasas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 26
Tabla B. Esquemas de clasificación de betalactamasas bacterianas 
 
 
Perfil de 
inhibición 
Grupo 
de Bush, 
Jacoby y 
Medeiros 
Grupo 
de 
Bush 
(1989) 
Clase de 
Richmond-
Sykes 
Tipo de 
Mitsuhashi-
Inoue a 
Clase 
molecular 
Preferencia al 
sustrato 
Ácido 
clavulánico 
EDTA
Enzimas 
representativas
1 1 Ia,Ib,Id CSasa C Cefalosporinas - - Amp C; MIR-1 
2a 2a No incluido PCasa V A Penicilinas + - Penicilinasas de 
bacterias gram-
positivas 
2b 2b III PCasa I A Penicilinas, 
cefalosporinas 
+ - TEM-1, TEM-2, 
SHV-1 
2be 2b’ No incluido, 
excepto K1 
en clase IV 
CXasa A Penicilinas, 
cefalosporinas 
de corto y 
amplio espectro, 
monobactámicos
+ - TEM-3 a TEM-
26, SHV-2 a 
SHV-6, K1 
2br No 
incluido 
No incluida No incluido A Penicilinas ± - TEM-30 a TEM-
36, TRC-1 
2c 2c II, V PCasa IV A Penicilinas, 
carbenicilina 
+ - PSE-1, PSE-3, 
PSE-4 
2d 2d V PCasa II, 
PCasaIII 
D Penicilinas, 
cloxacilina 
± - OXA-1 a 
OXA –11, PSE-2 
(OXA-10) 
2e 2e Ic CXasa A Cefalosporinas + - Cefalosporinasas 
inducibles de 
Proteus vulgaris 
2f No 
incluido 
No incluido No incluido A Penicilinas, 
cefalosporinas, 
carbapenémicos
+ - NMC-A de 
Enterobacter 
cloacae, Sme-1 
de Serratia 
marcescens 
3 3 No incluido No incluido B Mayor parte de 
betalactámicos, 
incluyendo 
carbapenémicos
- + L1 de 
Xanthomonas 
maltophilia, CcrA 
de Bacteroides 
fragilis 
4 4 No incluido No incluido No 
determinada
Penicilinas - ¿? Penicilinasa de 
Pseudomonas 
cepacia 
 
a CSasa, cefalosporinasa; PCasa, penicilinasa; CXasa, betalactamasa que hidroliza cefuroxima. 
 
Tomado de Bush, K. , Jacoby G. A. & Medeiros A. A . A Functional Classification Squeme for β-lactamases 
and its correlation with molecular structure . Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1211-1233 (1995). 
 
 
 
 
 
 
 
 27
1.6 Características moleculares y bioquímicas de las betalactamasas de 
espectro extendido (BLEEs). 
 
Las betalactamasas de espectro extendido (BLEEs) son enzimas 
mediadas por plásmidos que confieren resistencia a antibióticos oxiimino- 
betalactámicos tales como cefotaxima, ceftazidima así como a aztreonam, los 
cuales fueron diseñados para ser efectivos contra las cepas productoras de 
betalactamasas determinadas por plásmidos conocidas41. La mayoría de las 
BLEEs pertenecen a la clase molecular de Ambler A; las enzimas de clase A 
se caracterizan por poseer un sitio activo que contiene serina y una masa 
molecular de aproximadamente 29 kDa9. Una forma analítica para identificar a 
las BLEEs, se basa en conocer su punto isoeléctrico (pI), que corresponde al 
pH en el cual la proteína, que posee cargas positivas y negativas, presenta 
una carga neta de cero50. 
Las BLEEs fueron primeramente encontradas en Europa, donde han 
incrementado su prevalencia, y actualmente se reportan en todo el mundo18. 
La predilección de las BLEEs por Klebsiella es parcialmente explicada por 
la infección cruzada, con la diseminación clonal de cepas productoras, lo cual 
es facilitado por el hecho de que Klebsiella sobrevive más tiempo de otros 
bacilos gram-negativos en la piel. Sin embargo, la infección cruzada no 
explica por qué tantos distintos tipos de enzimas han sido encontrados en 
Klebsiella comparada con otros géneros o por qué algunos hospitales han 
presentado diseminación de algún tipo en especial de BLEEs entre Klebsiella 
de diversos serotipos. Probablemente, Klebsiella es particularmente un buen 
vector para plásmidos o permite la evolución de los genes que codifican 
BLEEs más rápidamente que otras enterobacterias. En este sentido, es 
notable que muchos genes que codifican para BLEEs se encuentran en 
plásmidos grandes con bajo número de copias y que plásmidos grandes que 
confieren multirresistencia han sido por mucho tiempo más comunes en 
Klebsiella que en E. coli, aunque con el paso del tiempo las BLEEs se han 
diseminado a otros géneros de la familia Enterobacteriaceae. 
 28
 
La mayor parte de las BLEEs son mutantes de TEM-1, TEM-2 y SHV-1, 
con 1 a 4 sustituciones de aminoácidos en su secuencia. Estos cambios, que 
representan menos del 2 % de la secuencia proteica, remodelan de manera 
suficiente el sitio activo de la enzima para permitir el ataque a la mayoría de 
las cefalosporinas aminotiazólicas44. Existen actualmente más de 130 
betalactamasas de tipo TEM ( pI 5.2-6.5) y más de 50 de tipo SHV (pI 7.0-
8.2). TEM-10, TEM-12 y TEM-26 se encuentran entre las más comunes en 
Norte y Sur América, mientras que SHV-5 y SHV-12 son los miembros más 
comunes de la familia SHV9, 42, 55. Las BLEEs de tipo TEM y SHV son más 
frecuentemente encontradas en E. coli y K. pneumoniae, aunque también se 
han encontrado en Proteus spp., Providencia spp. y otros géneros de la 
familia Enterobacteriaceae9, 49, 51. 
Las BLEEs tipo SHV se observaron por primera vez en K. pneumoniae en 
los años 80 , SHV-1 fue la primera betalactamasa codificada en el cromosoma 
del género Klebsiella y es la más frecuentemente encontrada en K. 
pneumoniae9, 19, 37, 45. En muchas cepas de K. pneumoniae bla SHV-1 o un gen 
relacionado está integrado en el cromosoma bacteriano.3 Posteriormente se 
demostró que SHV-1 es idéntica a la enzima PIT-2, descrita por Pitton en 
1972, que es codificada por un transposón y encontrada en plásmidos, 
sugiriendo la naturaleza móvil de los genes que confieren resistencia a los 
antibióticos betalactámicos. LEN-1 descrita por Arakawa en 1986 es una 
betalactamasa cromosomal encontrada en cepas de K. pneumoniae; el 
análisis de la secuencia nucleotídica demuestra que los genes de LEN-1 están 
muy relacionados con la secuencia del gen bla SHV-136, 37. Otra enzima que 
presenta un perfil bioquímico similar es OHIO-1 que demostró tener 91.8 % de 
homología en la secuencia de aminoácidos con SHV-1 y LEN-1 y sólo un 
63.7% de homología entre SHV-1 y TEM-1. En 1983 se describe por primera 
vez la transferencia de resistencia en aislados de K. pneumoniae y Serratia 
marcescens generando la producción de una nueva betalactamasa 
denominada SHV-2, originada por una mutación en el gen de la enzima SHV-
 29
1, en la posición 238, que corresponde a una glicina que fue sustituida por una 
serina9, 37. La mayoría de las variantes de SHV que poseen un fenotipo de 
BLEE se caracterizan por poseer la mutación anterior. Un número de 
variantes relacionadas a SHV-5 (pI 8.2, codificada por un plásmido de 150 kb) 
tienen además una sustitución en la posición 240, que corresponde a 
glutamato que es sustituido por lisina. El residuo de serina en la posición 238 
es crítico para la eficiente hidrólisis de ceftazidima y el residuo de lisina es 
crítico para la eficiente hidrólisis de cefotaxima. SHV-5 difiere de SHV-3 en 
dosposiciones, una arginina en lugar de una leucina en la posición 205 y una 
lisina en lugar de glutamato en la posición 240. También se encontró que 
SHV-5 difiere de SHV-4 por el aminoácido leucina en la posición 205. 
(numeración de aminoácidos de acuerdo al esquema de Ambler)7, 9. 
TEM-1 es la betalactamasa más comúnmente encontrada en bacterias 
gram-negativas; esta enzima es capaz de hidrolizar penicilinas y algunas 
cefalosporinas como cefalotina y cefaloridina. TEM-2, la primera enzima 
derivada de TEM-1 posee una sola sustitución de aminoácido de la enzima 
original ( glutamina es sustituida por lisina en la posición 39 ), esto causó un 
salto del pI de 5.4 a 5.6, pero no alteró su preferencia por el sustrato. TEM-3, 
originalmente reportada en 1989 fue la primera betalactamasa de tipo TEM 
que presentó el fenotipo BLEE9, 41. TEM-3 es codificada por el gen bla T-3 y 
mediante la secuenciación del mismo se encontró que ésta enzima difiere de 
TEM-2 en 2 posiciones: lisina (TEM-3) por glutamato (TEM-2) en el residuo 
104 y serina (TEM-3) por glicina (TEM-2) en la posición 238 (numeración de 
aminoácidos de acuerdo al esquema de Ambler)9. 
Algunos residuos de aminoácidos son importantes para la producción del 
fenotipo BLEE cuando las sustituciones ocurren en esa posición. Éstas 
incluyen glutamato a lisina en la posición 104, arginina a serina o histidina en 
la posición 164, glicina a serina en la posición 238 y glutamato a lisina en la 
posición 240 (numeración de aminoácidos de acuerdo al esquema de 
Ambler)9, 71, 76. 
 
 30
El grupo más común de BLEEs aparte de las familias TEM y SHV es el 
denominado CTX-M que también pertenece a la clase molecular A y se 
caracteriza por una marcada actividad hidrolítica contra cefotaxima. 
Actualmente se conocen más de 40 enzimas CTX-M, siendo CTX-M-14, CTX-
M-3 y CTX-M-2 las más encontradas8, 42. 
Otras BLEEs de clase A son menos comunes que las anteriores y se han 
encontrado principalmente en Pseudomonas aeruginosa aunque también en 
enterobacterias, en regiones geográficas limitadas. Algunos ejemplos son 
PER-1 encontrada en Turkia, Francia, e Italia; VEB-1 y VEB-2 en el sureste de 
Asia, y GES-1, GES-2 e IBC-2 en el sur de África, Francia y Grecia. BLEEs 
aisladas únicamente en enterobacterias y también poco comunes son BES-1, 
IBC-1, SFO-1 y TLA-1. 
Por su parte, las BLEEs de tipo OXA, pertenecen a la clase molecular D, 
son relativamente resistentes a la inhibición por ácido clavulánico y confieren 
resistencia a ceftazidima, aunque OXA-17 confiere mayor resistencia a 
cefotaxima y cefepima. Se encuentran principalmente en Pseudomonas 
aeruginosa2, 42. 
Las betalactamasas denominadas AmpC, forman parte de la clase 
molecular C, se caracterizan por ser inducibles por betalactámicos, resistentes 
a la inhibición por ácido clavulánico y por conferir resistencia a cefamicinas y 
oxiimino-betalactámicos. Están codificadas en genes cromosómicos en 
muchos bacilos gram-negativos y aunque el gen AmpC no se encuentra en el 
cromosoma de especies de Klebsiella y Salmonella enzimas AmpC se han 
encontrado mediadas por plásmidos42, 59. 
Las carbapenemasas, son betalactamasas que hidrolizan 
significativamente al menos imipenem y/o meropenem además de oxiimino-
cefalosporinas y cefamicinas y pueden pertenecer a las clases moleculares A 
(NMC-A, Sme-1 a Sme-3, IMI-1, en Enterobacter cloacae y Serratia 
marcescens; KPC-1 en Klebsiella pneumoniae; GES-2 en Pseudomonas 
aeruginosa), B (familia IMP, encontradas en gram-negativos, y especies de 
Pseudomonas y Acinetobacter y VIM son las carbapenemasas más 
 31
significativas en la clínica) y D (oxacilinasas con propiedades de 
carbapenemasa, aisladas en Acinetobacter baumannii). Actualmente son poco 
comunes pero su capacidad de hidrolizar antibióticos carbapenémicos, a los 
cuales son sensibles otras betalactamasas, causa especial preocupación42, 53. 
 
En México se han llevado a cabo pocos estudios enfocados a la 
caracterización de BLEEs . Silva y col. en 1999 en un estudio llevado a cabo 
con Enterobacterias encontraron que cepas de K. pneumoniae, E. coli y 
Enterobacter cloacae presentaron resistencia a oxiimino cefalosporinas. 
Además observaron que solo las cepas de K. pneumoniae tenían la capacidad 
de transferir su resistencia por conjugación. De acuerdo al punto isoeléctrico y 
la hibridación de ADN tanto de las cepas aisladas como de las 
transconjugantes, se observó que las betalactamasas más frecuentes fueron 
derivadas de SHV74. 
En otro reporte realizado por Silva y col. en el 2000, se encontró que una 
cepa de E. coli la cual fue llamada R70 presentó resistencia a cefalosporinas 
de espectro extendido; esta E. coli posee tres plásmidos diferentes de 150 kb, 
120 kb y 77 kb, los cuales codifican 2 betalactamasas con pI de 7.0 y 9.0. Sólo 
el plásmido de 150 kb fue transferido por conjugación y codifica una 
betalactamasa con pI de 9.0, la cual se denominó TLA-1 y no está relacionada 
con las enzimas TEM y SHV. En el 2001, Silva y col. encontraron en cepas 
de K. pneumoniae aisladas de un brote por IN en un hospital de Morelos, que 
los plásmidos que codifican la resistencia son de 135 kb , 105 kb y 80 kb. 
Mediante reacción encadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) 
se obtuvo un fragmento de 900 pb que corresponde a SHV y otro fragmento 
de 503 pb correspondiente a TEM. Mediante la secuenciación del gen 
completo para SHV se observó una doble mutación: en la posición 238 glicina 
es sustituida por serina y glutamina es sustituida por lisina en la posición 240, 
en comparación con la secuencia de la betalactamasa SHV-175. 
En un estudio realizado en el Hospital General de México, por González-
Vertiz y col., en el 2001 encontraron que cepas de K. pneumoniae 
multirresistentes aisladas de casos de bacteremia y productoras de BLEEs 
 32
estaban asociadas a un brote de IN en el área de neonatos de dicho hospital. 
Las cepas de K. pneumoniae identificadas, pertenecían a una misma clona, y 
eran resistentes a amikacina, gentamicina, ampicilina, cefotaxima y 
ceftazidima. Esta clona de K. pneumoniae era productora de dos 
betalactamasas con pI de 5.4 y 8.2, correspondiendo a ésta última la actividad 
de BLEE33. 
En otro estudio realizado por Martínez -Aguilar y col., en el 2001, sobre 
BLEEs producidas por aislados de K. pneumoniae multirresistentes, 
causantes de sepsis y neumonía en la unidad de cuidados intensivos de 
neonatos (UCIN) del Hospital General de Durango, se encontró por 
electroforesis de campos pulsados (PFGE por sus siglas en inglés) que siete 
aislados de K. pneumoniae resistentes a ceftazidima y cefotaxima 
correspondían a la misma clona, productora de dos betalactamasas con un pI 
de 5.4 y 9.0, correspondiendo a la última la actividad de ESBL. Los perfiles de 
plásmidos fueron idénticos, además de que el plásmido de 56.7 kb transfirió a 
E. coli la resistencia a ceftazidima por conjugación. En este estudio se apreció 
un elevado impacto en la mortalidad debido a la diseminación de las cepas 
multirresistentes de K. pneumoniae en la UCIN48. 
En el estudio de Alcántar-Curiel y col. de 2004 se analizaron 82 casos de 
bacteremia e infección del tracto urinario (60 y 40 % de los casos 
respectivamente) causados por K. pneumoniae en el Hospital General de 
Durango, en un periodo de 23 meses. El 49% de los episodios correspondía a 
la Unidad de Cuidados Intensivos Neonatales (UCIN). Se encontró que todos 
los aislados eran susceptibles a imipenem; 62.2% era resistente a ceftazidima, 
cefotaxima, y aztreonam; 69.5% era resistente a amikacina; 58.5% era 
resistente a gentamicina; y 7.3 % a ciprofloxacina. Los 82 aislados se 
asociaron a 28 patrones distintos por PFGE y la diseminación de 2 clonas 
resistentes a ceftazidima ocasionó el 44% de los casos. El fenotipo de BLEE 
en estas clonas fue transferido por megaplásmidos idénticos o altamenterelacionados. La actividad de BLEE correspondió a SHV-5 y TLA-1. La alta 
prevalencia del fenotipo BLEE en estas infecciones fue atribuida a la 
 33
transmisión cruzada de las dos clonas resistentes a ceftazidima y la 
diseminación horizontal de los megaplásmidos idénticos o altamente 
relacionados1. 
En la Tabla C se enlistan algunas BLEEs inhibidas por ácido clavulánico 
producidas por Klebsiella pneumoniae. 
 
 
 
 
 
 
 
 34
 
Tabla C. BLEEs inhibidas por ácido clavulánico producidas por K. pneumoniae 
Tasa relativa de hidrólisis a, b Enzima Producción Cepa 
PEN AMP CARB CLOX OXA LOR LOT FOX NCF TAX TAZ ATM IMP 
TEM-3 
(CTX-1) 
pCFF04 CF104 100 110 35 0.97 5 120 31, 
110c
< 1 NDd 170,450c 8.3 0.36 0.01 
TEM-5 
(CAZ-1) 
pCFF14 CF504 100c 78 e 60 ND ND ND 380 ND ND 150 490 120 <0.1 
TEM-8 
(CAZ-2) 
pCFF34 CF704 100c 240e 75 ND ND ND 170 ND ND 640 260 210 <0.1 
TEM-9 pMG228 2639Ef 100 51 19 8.7 ND 67 33 <0.05 ND 12 35 40 1.2 
TEM-10 
(MGH-1) 
pJPQ100 KC2 100 130 36 16 ND 77 18 <0.05 ND 1.6 68 10 <0.02
TEM-11 
(CAZ-lo) 
P 2326 ND ND ND ND ND 100g,h ND <0.5 ND 2.5 0.9 <0.5 ND 
TEM-16 
(CAZ-7) 
pCFF84 CF1304 100c ND ND ND ND ND ND ND ND 9.8 98 28 ND 
TEM-20 pUD30 A268 100c 150 12 i 2 ND 150 ND ND ND 250 <1 <1 <1 
TEM-21 pUD22 D660 100c 66 13 i 1 ND 290 ND ND ND 493 57 <1 <1 
TEM-22 pSLH52 SLK52 100c 97 e 16 1 2 410 ND <0.5 ND 130 10 <0.05 <0.5 
TEM-24 
(CAZ-6) 
pCFF74 CF1104 100c ND ND ND ND ND ND ND ND 208 848 134 ND 
TEM-26 
(YOU-1) 
pJPQ101 KPS1 100 ND 32 18 ND 120 ND ND ND 7.5 170 49 ND 
SHV-3 pUD21 86-4 100c 153 21 <1 ND 250 ND ND ND 37 <1 <1 <1 
SHV-4 
(CAZ-5) 
p210-2 Kp210-2 100c 195 35 i ND ND 320c 200 ND ND 115 52 4 <1 
SHV-5 
(CAZ-4) 
pAFF1,pCFF54 160(CF3104) 100 242 31c 9 c 10g 140g 180c 
,43g
ND ND 134c,25g 49c,11g 2 <1 
SHV-6 pSLH47 SLK-47 100c 52 8 i <1 ND 80 ND ND ND 1 0.09 0.3 ND 
a Abreviaturas: LOR, cefaloridina; LOT, cefalotina; PEN, bencilpenicilina; AMP, ampicilina; CARB, carbenicilina; CLOX, cloxacilina; OXA, oxacilina; FOX, cefoxitina; 
NCF, nitrocefina; TAX, cefotaxima; TAZ, ceftazidima; ATM, aztreonam; IMP, imipenem; CA, ácido clavulánico; SUL, sulbactam; TZI, tazobactam; pCMB, p-
cloromercuribenzoato ; P, plásmido; IC50 concentración inhibitoria 50. 
b Los ensayos se llevaron a cabo espectrofotométricamente y los datos son reportados como Vmáx relativa a menos que se señale lo contrario. 
c Ensayo microacidimétrico 
d No determinado 
e Amoxicilina 
f La enzima para la hidrólisis fue purificada de la transconjugante E. coli 2639E 
 g concentración de sustrato 100 µM 
 h El sustrato de referencia fue cefaloridina 
 i Ticarcilina 
 35
 
 
 Tabla C. continuación 
IC50 para inhibición (µM) Inhibida por Enzima Producción Cepa 
CA SUL TZB ATM CLOX pCMB EDTA
Peso molecular
(kDa) 
pI Clase molecular
TEM-3 
(CTX-1) 
pCFF04 CF104 0.03 0.03 0.01 18j < 100 - ND 29 6.3 A 
TEM-5 
(CAZ-1) 
pCFF14 CF504 0.03 1.2 0.28 100j ND + - 29 5.55 A 
TEM-8 
(CAZ-2) 
pCFF34 CF704 + k + k + k 62j ND ND ND 29 6.0 A 
TEM-9 pMG228 2639Ef 0.29 0.90 0.34 ND ND + - 29 5.59 A 
TEM-10 
(MGH-1) 
pJPQ100 KC2 0.03 0.34 0.08 30j ND + - 29 5.57 A 
TEM-11 
(CAZ-lo) 
P 2326 + k + k ND ND ND ND ND 29 5.6 Al 
TEM-16 
(CAZ-7) 
pCFF84 CF1304 + + + 31j ND ND ND ND 6.3 A 
TEM-20 pUD30 A268 < 5 + ND ND <1000 ND ND ND 5.4 Al 
TEM-21 pUD22 D660 < 50 + ND ND <1000 ND ND ND 6.4 Al 
TEM-22 pSLH52 SLK52 <0.05 >1 ND 38 <100 ND ND 29 6.3 A 
TEM-24 
(CAZ-6) 
pCFF74 CF1104 + + + 29j ND ND ND 29 6.50 A 
TEM-26 
(YOU-1) 
pJPQ101 KPS1 0.01 0.35 0.08 89j 30j ND ND 29 5.58 A 
SHV-3 pUD21 86-4 0.04 2.7 0.10 ND >1000 ND ND 29 7.0 A 
SHV-4 
(CAZ-5) 
p210-2 Kp210-2 0.03m 0.14m + k 1.1j ND ND ND 29 7.8 A 
SHV-5 
(CAZ-4) 
pAFF1,pCFF54 160(CF3104) 0.01 0.63 0.08 0.02m ND ND ND ND 8.2 A 
SHV-6 pSLH47 SLK-47 <1 1 ND ND >1000 ND ND ND 7.6 ND 
j Km 
k El inhibidor restauró la actividad de la cefalosporina o penicilina en ensayos microbiológicos 
l Clase molecular identificada por oligotipificación 
m Ki 
 
Tomado de Bush K., Jacoby G.A. & Medeiros A.A . (1995) A Functional Classification Squeme for β-lactamases and its correlation with molecular structure 
.Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1211-1233. 
 
 
 36
2. ANTECEDENTES 
 
En trabajos previos realizados en el laboratorio donde se desarrolló la 
presente tesis, con el objetivo de asociar el impacto clínico y los datos 
epidemiológicos en relación a la prevalencia de la resistencia a cefalosporinas 
de tercera generación en K. pneumoniae asociada a infecciones nosocomiales, 
se analizaron aislados provenientes de tres centros hospitalarios: Hospital 
General de Durango, Hospital Civil de Guadalajara y Hospital de Pediatría del 
CMN Siglo XXI. 
Se estudiaron 82 aislamientos de K. pneumoniae causantes de IN 
provenientes del Hospital General de Durango obtenidos de abril de 2000 a 
febrero de 2002. El patrón de susceptibilidad encontrado fue 100% de 
resistencia a ampicilina (AMP), 69.5% a amikacina (AMK), 62.2% a aztreonam 
(AZM), ceftazidima (CAZ) y cefotaxima (CTX). Mediante electroforesis de 
campos pulsados (PFGE) se identificaron 28 clonas de K. pneumoniae. Las 
cepas resistentes a ceftazidima (CAZR) pertenecían a 17 clonas, todas 
productoras de BLEEs. Las clonas CAZR se identificaron predominantemente 
en las áreas pediátricas y particularmente en la Unidad de Cuidados Intensivos 
Neonatales (UCIN). El 60 % de los aislamientos se obtuvieron de hemocultivos 
y el 40% de urocultivos1. 
En el Hospital Civil de Guadalajara se llevó a cabo el mismo estudio; se 
aislaron 168 cepas de K. pneumoniae causantes de IN; éstas presentaron 
100% de resistencia a AMP, 73.8% a AMK, 75.59% a CTX y 74.4% a CAZ. 
Mediante PFGE se encontraron 59 clonas de K. pneumoniae. Las cepas CAZR 
pertenecían a 25 clonas, con predominio de 3 clonas y provenían también 
principalmente de las áreas pediátricas, particularmente la UCINEX. La fuente 
de aislamiento fue hemocultivo en el 36.3% de los casos, el resto provenía de 
distintas fuentes. 
En el Hospital de Pediatría del CMN Siglo XXI fueron aisladas 80 cepas de 
K. pneumoniae en un periodo de 8 meses, con un patrón de susceptibilidad de 
100% de resistencia a AMP, 69% a AMK, 56% a CTX y 76% a CAZ. Se 
 37
identificaron 49 clonas por PFGE de las cuales 22 correspondían a cepas 
CAZR. El 28.8% de los aislamientos provenía de hemocultivos. La UCIN y la 
sala de lactantes fueron las más afectadas por IN24. 
La gran diversidad clonal sugería la probabilidad de que el fenotipo de 
resistencia a cefalosporinas se hubiera diseminado de manera horizontal por 
plásmidos. 
En los hospitales de Guadalajara y Durango se observó variabilidad clonal 
de las K. pneumoniae CAZR causantes de IN, con predominio de diseminación 
clonal, implicando la necesidad de reforzar los programas de precauciones 
universales de contacto, y el establecimiento urgente de un programa de 
control de antibióticos. Por otro lado, en el Hospital de Pediatría del CMN Siglo 
XXI no hubo predominio de diseminación clonal, lo que sugiere infección 
endógena. 
Una vez demostrada la frecuencia de resistencia a CAZ en cepas de K. 
pneumoniae causantes de IN y su posible ruta de diseminación, se realizó un 
estudio con el objetivo de caracterizar molecularmente a las betalactamasas de 
espectro extendido producidas por las clonas de K. pneumoniae resistentes a 
CAZ aisladas con más frecuencia como causantes de infecciones 
nosocomiales (clonas tipo) en cada uno de los centros hospitalarios ya 
mencionados para poder asociar el mecanismo molecular de resistencia de las 
clonas CAZR a los datos clínicos y epidemiológicos. En este estudio, se 
encontró mediante la prueba de E-test (AB BIODISK) que todas las clonas tipo 
de los tres centros hospitalarios son productoras de BLEEs y que la resistencia 
a cefalosporinas de tercera generación (CAZ) era transferida a E. coli (ATCC 
J53-2 resistente a Rifampicina) por conjugación en un plásmido con un tamaño 
>50 kb y <100kb. Así mismo, se observó que todas las E. coli 
transconjugantes son productoras de BLEEs, y la actividad biológica de estas 
últimas se asocia al pI de 8.2 en los casos del Hospital Civil de Guadalajara y 
Hospital de Pediatría del CMN Siglo XXI y a los pI de 8.2 y 9.0 para el Hospital 
General de Durango. Los genes asociados en la producción de BLEEs son de 
tipo TEM, SHV-5 y probablemente TLA-1. Según se encontró mediante 
 38
reacción en cadena de la polimerasa, PCR por sus siglas en inglés (manuscrito 
en preparación). 
 La cepa 468, identificada mediante pruebas bioquímicas como Klebsiella 
pneumoniae fue aislada de un caso de bacteremia nosocomial el 13 de julio de 
2000 en el Hospital Civil de Guadalajara; pertenece a la clona G18 y es una de 
las clonas tipo empleadas en el estudio anterior. Los perfiles de susceptibilidad 
a antibióticos por el método de Kirby-Bauer tanto de la cepa original como de la 
transconjugante son los reportados en la tabla D. 
 
Tabla D. Perfil de susceptibilidad a antibióticos de la cepa 468 y su 
transconjugante . 
 
Antibiótico 468 (G18) 468 TR 
 Kirby-
Bauer 
(mm) 
Categoría MIC 
(µg/mL) 
Kirby-
Bauer 
(mm) 
Categoría MIC 
(µg/mL) 
Ampicilina 8 R 37 6 R >46 
Amikacina 20 S 5.1 24 S 1.5 
Aztreonam 12 R >58 6 R >58 
Ceftazidima 13 R 41 6 R >126 
Ciprofloxacino 31 S <0.11 27 S 0.19 
Cefotaxima 16 I 19 14 R 31 
Cefuroxima 12 R >8.0 6 R >8.0 
Cefepime 22 S 4.3 18 S 9.8 
Cefoxitina 15 I 20 26 S 4.0 
Gatifloxacino 10 R >6.0 27 S 0.25 
Gentamicina 16 S 4.5 15 S 0.6 
Imipenem 21 S 2.1 31 S <0.56 
Levofloxacino 17 S 4.0 30 S 0.125 
Tobramicina 6 R >48 13 I 10 
Ofloxacino 11 R 6.0 25 S 0.25 
Estreptomicina 6 R >96 16 S 10 
Trimetoprim-sulfametoxazol 7 R >256 33 S <6.0 
Ticarcilina-ácido clavulánico 18 I 32 15 I 58 
Tetraciclina 7 R >48 22 S 4.0 
Piperacilina-Tazobactam 17 R 64 21 S 16 
 
 
De acuerdo a lo mencionado previamente, tanto la clona original G18 como 
su transconjugante son productoras de BLEEs cuya actividad biológica fue 
asociada al pI de 8.2 en ambos casos de acuerdo a bioensayo de hidrólisis de 
CAZ sobre el gel de isoelectroenfoque. En este último, también se observó la 
presencia de otras betalactamasas con pI 5.4, 6.0, y 7.5 en la clona original, y 
 39
pI 5.4 y 6.0 en la transconjugante. En la técnica de PCR tanto la clona original 
como la transconjugante amplificaron para los genes blaSHV , blaSHV-5 y blaTEM. 
La betalactamasa con pI 8.2 corresponde a SHV-5, mientras que la de 5.4 
podría pertenecer al tipo TEM. Con los estudios realizados, no se puede 
precisar aún a que tipo de betalactamasas corresponden las enzimas con pI 
6.0 y 7.5. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 40
 
3. JUSTIFICACIÓN 
 
 La incidencia de Klebsiella pneumoniae productora de BLEEs es un grave 
problema que afecta a muchos hospitales en todo el mundo incluido México, a 
partir de la década de los 80 y poco después de la introducción de las oxiimino 
cefalosporinas, que llegaron a ser ampliamente utilizadas. Desde entonces, el 
incremento en la resistencia a cefalosporinas de tercera y cuarta generación es 
un obstáculo para el control de las infecciones nosocomiales así como 
comunitarias causadas por Klebsiella pneumoniae productora de BLEEs. En 
México, se han realizado pocos estudios enfocados a la caracterización de 
estas enzimas. La determinación de las características bioquímicas y 
moleculares de una betalactamasa con pI 6.0 producida por Klebsiella 
pneumoniae, aislada en el Hospital Civil de Guadalajara y asociada a 
bacteremia nosocomial en dicho centro de salud, es una contribución que 
permitirá ampliar el conocimiento que se tiene acerca de la prevalencia y el tipo 
de betalactamasas en nuestro país; lo que permitirá establecer las opciones 
terapéuticas más viables de cara al grave problema de la resistencia a 
antimicrobianos, así como subrayar la necesidad de establecer programas de 
prevención y control de infecciones intrahospitalarias más eficientes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 41
4. OBJETIVOS 
 
 
4.1 Objetivo general 
 
Caracterizar bioquímica y molecularmente una betalactamasa con pI 6.0 
producida por una cepa de Klebsiella pneumoniae resistente a ceftazidima 
(CAZR) (cepa 468, clona G18), que fue aislada en el Hospital Civil de 
Guadalajara procedente de un caso de bacteremia nosocomial. 
 
 
4.2 Objetivos particulares 
 
 
a) Confirmar el punto isoeléctrico (pI) de las betalactamasas 
producidas por la cepa de Klebsiella pneumoniae resistente a 
ceftazidima (CAZR), así como de aquellas presentes en la cepa 
de E. coli transconjugante (CAZR/RIFR). 
b) Purificar a la betalactamasa con pI 6.0 presente en la cepa 
transconjugante mediante técnicas de cromatografía de exclusión 
por tamaño y de intercambio iónico. 
c) Determinar el peso molecular de la betalactamasa con pI 6.0 
purificada. 
d) Evaluar espectrofotométricamente la actividad hidrolítica de la 
betalactamasa purificada contra los antibióticos betalactámicos 
bencilpenicilina, ceftazidima, cefotaxima e imipenem. 
e) Determinar por PCR y secuenciación el tipo de betalactamasa al 
que corresponde la enzima purificada (pI 6.0). 
 
 42
5. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
5.1 Diseño experimental 
 
 
Escherichia coli ATCC J53-2 (CAZR/RIFR) transconjugante (468TR) de la cepa de 
K. pneumoniae resistente a ceftazidima (CAZR), (468, clona G18). 
 
Determinar el punto isoeléctrico de las betalactamasas presentes en la cepa 468, así 
como de las que se encuentren en la cepa transconjugante 468 TR; determinar por 
bioensayo de hidrólisis de CAZ la actividad de BLEEs de las enzimas. 
Aplicar el precipitado a una columna de cromatografía de exclusión por tamaño. 
Obtener el extracto crudo de la cepa transconjugante. 
Determinación de proteínas en el extracto crudo mediante el método de Bradford. 
Precipitación de proteínas en el extracto crudo con sulfato de amonio al 40 y 80%. 
Determinación de proteínas en el precipitado. 
Detección de la actividad de betalactamasa en las fracciones obtenidas empleando 
nitrocefina, mezclar todas aquellas fracciones con esta actividad. 
Concentración por ultrafiltración de la mezcla de fracciones con actividad de 
betalactamasa. Determinación de proteínas de la mezcla concentrada. 
Aplicar la mezcla concentrada a una columna de cromatografía de intercambio iónico. 
Detección de la actividad de betalactamasa en las fracciones obtenidas empleando 
nitrocefina. 
43 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Determinación del punto isoeléctrico de las betalactamasas purificadas. 
Evaluar espectrofotométricamente la hidrólisis de los sustratos: bencilpenicilina, 
ceftazidima, cefotaxima e imipenem, empleando las betalactamasas purificadas. 
Determinación de la masa molecular relativa de las betalactamasas purificadas 
mediante electroforesis en gel desnaturalizante. 
Mezclar las fracciones que contienen a la misma betalactamasa. Determinación de 
proteínas de la mezcla. 
Determinar mediante PCR y secuenciación el tipo de betalactamasa al que 
corresponde la enzima purificada con pI 6.0 
Confirmación de punto isoeléctrico y masa molecular relativa en un gel de 
electroforesis en dos dimensiones. 
 44
 5.2 Cepas Bacterianas 
 
Se utilizaron las siguientes cepas: 
K. pneumoniae resistente a ceftazidima (CAZR), aislada de un caso de 
bacteremia nosocomial en el Hospital Civil de Guadalajara (cepa 468, clona 
G18). 
 Escherichia coli ATCC J53-2 resistente a ceftazidima y rifampicina 
(CAZR/RIFR) transconjugante de la cepa anterior (468 TR). 
 Escherichia coli ATCC J53-2 resistente a rifampicina (RIFR). 
 
 
5.3 Punto isoeléctrico 
 
El punto isoeléctrico fue determinado de acuerdo al método descrito por 
Matthew50, que consistió en crecer la cepas bacterianas (468y 468 TR) en 5 
mL de caldo LB suplementado con CAZ 10 µg/mL o RIF 200 µg/mL /CAZ 10 
µg/mL e incubar a 37 °C durante 16-18 horas; posteriormente se centrifugó a 
13 000 rpm durante 2 minutos, se eliminó el sobrenadante y el paquete celular 
se resuspendió en 1 mL de solución amortiguadora de fosfatos (PBS) 0.1 M pH 
7.4. Las células fueron lisadas mediante sonicación en hielo en un equipo 
Vibra cell Sonics aplicando 2 ciclos de 15 pulsos cada uno por 30 s hasta que 
el sobrenadante se aclaró centrifugándose nuevamente a 13 000 rpm por 30 
minutos a 4 ° C. Una alícuota del sobrenadante anterior y los controles 
positivos TEM-1 (pI 5.4), SHV-3 (pI 7.0), SHV-4 (pI 7.8), SHV –5 (pI 8.2) , TLA-
1 (pI 9.0) así como un marcador preteñido con pI de 4.45-9.6 (IEF Standars 
BIO- RAD) se corrieron en geles de poliacrilamida (PhastGel TM IEF 3-9 de 
Amersham Pharmacia Biotech AB) impregnados de anfolinas con rangos de 
pH 3-9 en un equipo de PhastSystem (Pharmacia Biotech). También se 
determinó el punto isoeléctrico de las betalactamasas purificadas. 
Para determinar la actividad de betalactamasa de las proteínas se utilizó el 
antibiótico nitrocefina (500 µg/mL), el cual al ser hidrolizado por las 
 45
betalactamasas da una señal colorimétrica, por lo que se adicionó sobre el gel 
de IEF, revelando únicamente el pI de las proteínas con actividad de 
betalactamasa. Para revelar un gel se añadieron 500 µL de una mezcla 
nitrocefina (500 µg/mL)/ CAZ (5 µg/mL). El antibiótico, se agregó para llevar a 
cabo la prueba biológica señalada a continuación. 
 
 
5.4 Prueba biológica de hidrólisis de CAZ. 
 
Se realizó una prueba biológica de hidrólisis de CAZ sobre los geles de IEF, 
que consistió en crecer a E. coli J53-2 RIFR en 4 mL de medio LB adicionado 
de rifampicina 200 µg/mL, se incubó a 37 ° C durante 2-4 h, para garantizar 
que se tenía esta cepa en fase de crecimiento logarítmico se realizaron 
lecturas de absorbencia en espectrofotómetro a 600 nm permitiéndose el 
crecimiento del cultivo hasta obtener una lectura de entre 0.40-0.45; 
posteriormente se tomaron 400 µL de este cultivo y se adicionaron a 3 mL agar 
LB suave mantenido líquido a 50 °C que se virtió sobre el gel de IEF. El gel se 
incubó a 37 °C durante 16-18 h. Un resultado positivo se interpretó a través del 
crecimiento de la cepa señalada sobre la superficie de agar de IEF, debido a la 
hidrólisis de CAZ, lo cual determinó si las betalactamasas en estudio 
presentaban actividad de BLEEs75. 
 
 
5.5 Obtención del extracto crudo 
 
La cepa de Escherichia coli ATCC J53-2 resistente a ceftazidima y 
rifampicina (CAZR/RIFR) transconjugante (468 TR) se sembró en 3 L de medio 
BHI adicionado con CAZ (10 µg/mL ) y se incubó a 37 °C por 16-18 h. 
Posteriormente, la suspensión bacteriana se centrifugó a 5000 x g por 30 min, 
se eliminó el sobrenadante y el paquete celular fue lavado una vez con 
solución amortiguadora de fosfatos (PBS) 0.05 M pH 7.0, se centrifugó 
 46
nuevamente a 5000 x g por 30 min, y se resuspendió en ~20 mL de PBS 0.05 
M pH 7.0, para después lisar las células empleando una prensa de French 
(SIM-AMINCO Spectronic Instruments) a 1500 psi; el extracto lisado fue 
centrifugado por 1 h a 48 000 x g a 4 ° C. Los ácidos nucleicos fueron 
removidos por precipitación con espermina (Sigma) 0.2 M (7% vol/vol) toda la 
noche a 4 °C y ultracentrifugación a 100 000 x g por 1 h a 4 ° C. El extracto 
obtenido fue conservado a –70 ° C para su utilización posterior29, 39, 61, 69. 
 
 
5.6 Purificación de la betalactamasa con pI 6.0 
 
El extracto crudo fue sometido a precipitación con sulfato de amonio al 
40% en hielo, centrifugado a 10 000 rpm por 10 min a 4 ° C y el precipitado 
obtenido resuspendido en 0.5 mL de solución amortiguadora de fosfatos 0.05 
M pH 7.0. Al sobrenadante, (en el cual se detectó la actividad de 
betalactamasa empleando una solución de nitrocefina 500 µg/mL )se le añadió 
la cantidad necesaria de sulfato de amonio para ir del 40 al 80% de saturación 
en hielo, se centrifugó a 10 000 rpm por 10 min a 4 ° C y el precipitado fue 
resuspendido en 1 mL de solución amortiguadora de fosfatos 0.05 M pH 7.0. 
El precipitado anterior, en el cual se detectó la actividad de betalactamasa 
empleando una solución de nitrocefina 500 µg/mL fue aplicado a una columna 
Superdex 75 (10 x 300 mm; Pharmacia Biotech) preequilibrada con solución 
amortiguadora de fosfatos 0.05 M pH 7.0. Las fracciones que presentaron 
actividad de betalactamasa, detectada con nitrocefina fueron mezcladas y 
concentradas por ultrafiltración con membranas Centriprep-10 (Amicon), para 
ser aplicadas posteriormente a una columna Mono-Q (0.5 x 5 cm; Pharmacia 
Biotech) preequilibrada con trietanolamina 0.02 M pH 7.7; las proteínas fueron 
eluidas con un gradiente lineal de NaCl (0-1 M). La detección de la actividad de 
betalactamasa en las fracciones obtenidas se llevó a cabo de la manera ya 
señalada72. 
 
 
 47
 
5.7 Determinación de la masa molecular relativa 
 
La masa molecular relativa de la betalactamasa con pI 6.0 fue estimada 
mediante electroforesis en gel de poliacrilamida 12% - dodecil sulfato de sodio 
(SDS-PAGE). Los extractos enzimáticos y las proteínas marcadoras fueron 
calentadas a 80 ° C durante 10 min en una solución 1% SDS – 3% beta-
mercaptoetanol, sometidas a la electroforesis y reveladas posteriormente 
mediante tinción con azul de Coomasie61, 73. 
 
 
5.8 Determinación de proteínas 
 
La determinación de proteínas en las muestras se llevó a cabo empleando 
el sistema Bio-Rad Protein Assay en microplaca que se basa en el método de 
Bradford, de acuerdo a las instrucciones del fabricante, por triplicado. Se 
realizó una curva patrón de albúmina sérica bovina (Sigma) a partir de una 
solución de 1 mg/mL, incluyendo las siguientes concentraciones: 0.05, 0.1, 0.2, 
0.25 y 0.3 mg/mL. Las lecturas de absorbencia se efectuaron con un equipo 
Microplate reader Thermo max, Molecular Devices a una longitud de onda de 
595 nm. 
 
 
5.9 Electroforesis en dos dimensiones 
 
Esta técnica fue realizada de acuerdo a lo reportado por O’Farrell54. 
Inicialmente se llevó a cabo el corrimiento en una primera dimensión, para lo 
cual se preparó un gel de isoelectroenfoque en un tubo de vidrio de 130 x 2.5 
mm de diámetro interno sellado en la parte inferior con parafilm. Para preparar 
10 mL de gel se mezclaron 5.5 g de urea, 1.33 mL de solución de acrilamida 
30 % (28.38% (m/v) acrilamida y 1.62% bis-acrilamida), 2 mL de solución de 
NP-40 al 10% m/v en agua, 1.97 mL de agua + 0.4 mL de anfolinas con un 
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rango de pH de 5-7 + 0.1 mL de anfolinas de pH 3-10. Se agitó hasta disolver 
la urea, entonces se añadieron 10 µL de persulfato de amonio al 10% y 7 µL 
de TEMED. Inmediatamente el tubo fue llenado 11 cm con la mezcla anterior, 
empleando una jeringa. En la parte superior del gel se agregó solución de urea 
8 M, dejándose de 1 a 2 h, después esta solución se removió y se reemplazó 
con 20 µL de solución amortiguadora de lisis, que contiene urea 9.5 M, 2% 
(m/v) NP-40 y 2% de una mezcla de anfolinas (1.6% rango de pH 5 a 7 y 0.4% 
rango de pH 3-10) y encima de ésta una pequeña cantidad de agua. Se dejó 
reposar de 1-2 h más. Posteriormente el parafilm fue removido, así como el 
agua y la solución de lisis, añadiéndose 20 µL de esta última fresca y NaOH 
0.02 M hasta formar un menisco invertido. A continuación el gel fue colocado 
en una cámara de electroforesis cuyo reservorio inferior fue llenado con H3PO4 
0.01 M, y el superior con NaOH 0.02 M. El gel fue precorrido a 200 V por 15 
min, a 300 V por 30 min y a 400 V durante 30 min. Después, tanto la solución 
amortiguadora de lisis como el NaOH fueron removidos de la superficie del gel 
y reemplazados primero con solución amortiguadora de lisis, después 50 µL de 
la solución de enzima purificada y 2 µL de solución de