Analisis-de-la-estructura-de-la-cromatina-y-la-contribucion-del-factor-nuclear-CTCF-en-el-dominio-[alfa]globina-de-pollo

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UNIVERSIDAD NACIONAL
AUTÓNOMA DE
MÉXICO
 FACULTAD DE QUÍMICA
PROGRAMA DE MAESTRÍA Y DOCTORADO
EN CIENCIAS BIOQUÍMICAS
ANÁLISIS DE LA ESTRUCTURA DE LA
CROMATINA Y LA CONTRIBUCIÓN DEL
FACTOR NUCLEAR CTCF EN EL
DOMINIO α-GLOBINA DE POLLO.
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
MAESTRA EN CIENCIAS (BIOQUÍMICAS)
P R E S E N T A:
ERIA ALAIDE REBOLLAR
CAUDILLO
Tutor: DR. FÉLIX RECILLAS TARGA
MÉXICO, D. F. MARZO 2006
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
ANÁLISIS DE LA ESTRUCTURA DE LA CROMATINA Y LA CONTRIBUCIÓN DEL
FACTOR NUCLEAR CTCF EN EL DOMINIO α-GLOBINA DE POLLO
RECONOCIMIENTOS
Esta tesis de Maestría se realizó bajo la dirección del Dr. Félix Recillas Targa en el
Departamento de Genética Molecular del Instituto de Fisiología Celular en la
Universidad Nacional Autónoma de México.
El Comité Tutoral que asesoró el desarrollo de esta tesis estuvo formado por:
Dr. Félix Recillas Targa Instituto de Fisiología Celular, UNAM
Dr. Mario Zurita Ortega Instituto de Biotecnología, UNAM
Dr.Luis Vaca Domínguez Instituto de Fisiología Celular, UNAM
Se reconoce la asesoría técnica de la Biol. Georgina Guerrero Avedaño durante la
realización de diversos experimentos para el estudio de los transcritos intergénicos en
el dominio α-globina de pollo y para el resto de las técnicas realizadas en este trabajo.
Se reconoce la colaboración de la Unidad de Biología Molecular del Instituto de
Fisiología Celular, en cuyo laboratorio se llevó a cabo todo el análisis de muestras
marcadas con fósforo.
Se reconoce la asesoría del Dr.Héctor Rincón Arano para la realización de
inmunoprecipitaciones de cromatina. A Martín Escamilla del Arenal para la realización
del ensayo de hipersensibilidad a la DNasa I y a Mayra Furlan Magaril por su asesoría
y colaboración a lo largo de todo el proyecto.
El proyecto fue apoyado parcialmente por Proyecto apoyado por: DGAPA-UNAM
(IN2030200, IX230104 y IN209403), CONACyT (33863-N y 42653-Q), Third World
Academy of Science (01-055 RG/BIO/LA), Fundación Miguel Alemán. Durante los
estudios de maestría gocé de una beca otorgada por CONACyT para la realización de
la presente tesis.
Esta tesis fue defendida en examen presentado el día 21 de Marzo del 2007.
El Jurado de Examen Doctoral estuvo constituido por:
Presidente Dr. Jorge Vázquez Ramos Facultad de Química, UNAM
Vocal Dr. Mario Enrique Zurita Ortega IBT, UNAM
Secretario Dr. Enrique Reynaud Garza IBT, UNAM
Suplente Dra. Maria Imelda López Villaseñor IIB, UNAM
Suplente Dra. Tzvetanka Dimitrova Dinkova Facultad de Química, UNAM
AGRADECIMIENTOS
Quisiera agradecer a Félix, por su excelente asesoría en este trabajo, porque gracias a
él han sido los años más enriquecedores de mi carrera y porque esta tesis es el
resultado de su gran dedicación hacia nosotros los alumnos.
Muchas gracias a Geito, porque su presencia y cariño me ayudó en los momentos
buenos y en los malos, por ser una persona maravillosa y una excelente colaboradora
de trabajo. Te voy a extrañar mucho!!!
A Mayra por ser mi compañera inseparable, porque la gran experiencia de aprender y
trabajar juntas me ha iluminado el camino.
A Martín, Inti, Neto, Héctor, Angelito, los tocayos, Abrahan, Edgar, Meche, Estela y
Gianelli por ser el mejor grupo de trabajo. Por ayudarme y enseñarme, hacerme reír
muchas horas de mi vida y crear una gran amistad en estos años juntos. Los tengo a
todos en mi corazón.
A mi mamá por acompañarme en el camino, por enseñarme y ser mi apoyo
incondicional. Porque las largas horas por teléfono me hacen la vida más feliz y con su
consejo me ayudan siempre a ser una mejor persona.
A mi papá porque su alegría y cariño me fortalecen todos los días, porque su talento y
creatividad me hacen ver la vida de otros colores y disfrutar cada momento de la vida
intensamente.
A Ursu por ser una persona maravillosa y la mejor hermana, porque al final me hace
feliz el pensar que compartiremos nuestras vidas y seguiremos creciendo juntas.
A Alice por quererme y apoyarme en estos años, porque tu amistad me fortalece y me
alimenta de ánimo y esperanza en la vida. Eres una mujer maravillosa.
A mi tío Luis y a la tía Pola por su gran ayuda y cariño. Porque su apoyo ha sido
fundamental durante todos estos años para continuar trabajando y mejorando.
A los Caudillos y a Jorgito porque desde lejos, o no tan lejos, su apoyo es
indispensable y porque su cariño constante me han ayudado a seguir siempre.
A Victor y a Velia les agradezco su apoyo incondicional. Su presencia y apoyo ha sido
un regalo de la vida y les doy gracias por sus consejos y su cariño siempre.
A Pablo por ser el mejor cuñado y por ser siempre tan cariñoso. Te agradezco los
momentos divertidos y tu apoyo e interés en todo momento.
A Reina, Tomás y Victor Hugo que son ya parte de mi familia. Les agradezco su gran
ayuda y su cariño en los años que hemos convivido y ojalá sigan siendo muchos más.
A Mayri de nuevo porque su apoyo y su amistad han sido lo más grande que he
encontrado. Te agradezco todos los momentos de risas y lágrimas juntas que me
hacen más fuerte cada día. Aunque se acaba una gran etapa juntas estoy segura de
que seguiremos unidas y compartiendo los nuevos momentos que llegarán. Gracias por
tu maravillosa amistad.
A Juls porque a la distancia tu cariño y apoyo está siempre conmigo, y porque el tiempo
no pasa para las grandes amistades. Porque eres una mujer increíble y estoy féliz de
seguir nuestro camino siempre juntas a pesar de la distancia.
A Hele por su gran amistad y por ser una amiga incondicional. Todas las experiencias
que hemos vivido juntas me hacen quererte y admirarte cada día más. Tu amistad me
ha hecho crecer y ser una mejor persona.
A Andre porque estoy féliz de que seas de nuevo parte de mi vida y de que
compartiremos los nuevos caminos que las dos estamos iniciando. Muchas gracias por
tu ayuda y amistad siempre.
A Julita Reyes le agradezco su gran amistad y los muchos momentos tan divertidos
que hemos pasado y que hacen de este mundo un lugar mejor.
A Brain que desde lejos le agradezco su apoyo y su amistad. Por ser una gran persona
y un gran amigo. Te agradezco los viejos momentos y los muchos que vendrán y que
estoy segura que viviremos juntos. Por ser el Mariachi más guapo.
A Javi por ser un gran amigo y una persona increíble. Tu amistad ha sido muy
importante estos años y me alegra haberla construido juntos. Gracias por tus consejos
y tu compañía.
A Diego le agradezco su amor y su paciencia todos estos años. Por apoyarme y
quererme y por haber construido juntos un camino lleno de momentos félices. Porque
su amor me ha dado las fuerzas de seguir adelante, de no desesperar y de disfrutar la
vida. Sigamos así siempre juntos y siempre creciendo.
ÍNDICE
Resumen………………………………………………………………………………..1-2
Abreviaturas…………………………………………………………………………….3-4
1.Introducción…………………………………………………………………………...5
1.1 La estructura de la cromatina……………………………………………………5-6
1.1.2 Eucromatina y heterocromatina………………………………………..7-8
1.1.3 Los mecanismos de remodelación de cromatina…………………….8-14
1.2 La organización del genoma en el núcleo……………………………………..14-19
1.3 Los dominios cromosómicos…………………………………………………….19-221.3.1 LCRs…………………………………………………………………::….22-23
1.3.2 Modificaciones postraduccionales de histonas………………………23-28
1.3.3 Los límites de los dominios y las secuencias tipo “insulators”……..28-31
1.3.4 Transcritos intergénicos y cromatina………………………………….31-35
2. Antecedentes………………………………………………………………………..36
2.1 Estructura y regulación del dominio β-globina…………………………………36-39
2.1.1 El dominio β-globina de pollo…………………………………………..39-42
2.2 Estructura y regulación del dominio α-globina…………………………………42-44
2.2.1 El dominio α-globina de pollo…………………………………………..44-47
3. Planteamiento del problema………………………………………………………..48-49
4. Hipótesis………………………………………………………………………………49
5. Objetivos generales………………………………………………………………….49
5.1 Objetivos Particulares………………………………………………………………49-50
6. Materiales y métodos…………………………………………………………………51
6.1 Cultivo de líneas celulares………………………………………………………….51
6.2 Anticuerpos utilizados……………………………………………………………….51
6.3 Extracción de eritrocitos de pollo…………………………………………………..52
6.4 Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)…………………………………………52-53
6.5 PCR duplex…………………………………………………………………………..53-54
6.6 Oligonucleótidos utilizados…………………………………………………………54-55
6.7 Extracción de RNA…………………………………………………………………..56
6.8 RT-PCR……………………………………………………………………………….56
6.9 Ensayo de transfección transitoria…………………………………………………56-57
6.10 Ensayo de Hipersensibilidad a la DNasa I………………………………………57-58
6.11 Diferenciación de células HD3……………………………………………………58
7. Resultados……………………………………………………………………………..59
7.1 Sistema biológico utilizado………………………………………………………….59-60
7.2 El patrón de las modificaciones de histonas del dominio α-globina
de pollo a lo largo de la diferenciación eritroide y el desarrollo…………………….60
7.2.1 Las modificaciones de histonas en el extremo 5´ del dominio………..60-65
7.2.2 Las modificaciones de histonas en el extremo 3´ del dominio………..65-68
7.3 El factor CTCF en el dominio α-globina de pollo a lo largo de
la diferenciación eritroide y el desarrollo………………………………………………68
7.3.1 La presencia y abundancia de CTCF en el extremo 5´
del dominio………………………………………………………………………...68-72
7.3.2 La presencia y abundancia de CTCF en los “insulators” 5´HS4 y
3´HS del dominio β-globina de pollo…………………………………………….72-74
7.3.3 La presencia y abundancia de CTCF en el extremo 3´
del dominio…………………………………………………………………………75-76
7.4 Los transcritos intergénicos en el extremo 5´ no-codificante del dominio
α-globina de pollo………………………………………………………………………...76
7.4.1 La presencia de los transcritos sentido y antisentido
en el extremo 5´ a lo largo de la diferenciación eritroide y el
desarrollo del pollo………………………………………………………………..76-78
7.4.2 La presencia de la RNA polimerasa II asociada a la cromatina
en el extremo 5´ no-codificante del dominio…………………………………..78-79
8. Discusión………………………………………………………………………………80
8.1 La estructura de la cromatina en los extremos del dominio α-globina
de pollo se modula durante la diferenciación eritroide y el desarrollo…………….80-83
8.2 La unión de CTCF en el “insulator“ αEHS-1.4 y su relación con
la estructura de la cromatina…………………………………………………………..83-89
8.3 La transcripción intergénica del extremo 5´ del dominio……………………….89-91
9. Conclusiones…………………………………………………………………………92-93
10. Perspectivas…………………………………………………………………………94
10.1 La función de CTCF en el “insulator” αEHS-1.4 y su relación
con los cambios en la cromatina del dominio α-globina de pollo………………….94
10.2 Los transcritos intergénicos en el dominio α-globina de pollo……………….95
11. Referencias…………………………………………………………………………96-104
12. Anexo 1…………………………………………………………………………….105-106
12.1 Introducción……………………………………………………………………...106-107
12.2 Antecedentes…………………………………………………………………….107-109
12.3 Objetivo General…………………………………………………………………109
12.3.1 Objetivos particulares………………………………………………….109
12.4 Resultados………………………………………………………………………..109-113
12.5 Discusión………………………………………………………………………….114
12.6 Conclusiones……………………………………………………………………..114
12.7 Perpectivas……………………………………………………………………….115-116
13. Anexo 2…………………………………………………………………………….117-127
RESUMEN
Los dominios cromosómicos en eucariontes requieren de una regulación
independiente de su entorno para permitir la expresión fina de los genes a lo largo de la
diferenciación celular y el desarrollo de los organismos. La estructura de la cromatina,
así como la presencia de “insulators” y transcritos intergénicos son esenciales para
mantener la independencia y la regulación de los dominios genómicos. El dominio α-
globina de pollo es un excelente modelo biológico para estudiar todos estos
mecanismos. Este dominio tiene una extensión aproximada de 40 kb dentro del cual se
localizan un gen embrionario π y dos adultos αA y αD. Los genes α-globina se expresan
diferencialmente a lo largo del desarrollo eritroide, en donde el gen embrionario se
transcribe en etapas tempranas y los genes adultos en etapas avanzadas del desarrollo.
Río arriba de los genes se localizan tres sitios de hipersensibilidad (HS) que
corresponden a dos elementos “insulators” (αEHS-1.4 y αCHS-1.2) y un posible
silenciador αEHS-1.0. En este proyecto se caracterizaron los cambios en la estructura
de la cromatina de estos elementos regulatorios a lo largo de la diferenciación eritroide y
el desarrollo del pollo. Asi mismo, caracterizamos la presencia in vivo del factor nuclear
CTCF ya que éste se considera un elemento esencial para la actividad “insulator”. Por
otra parte se determinó la presencia de transcritos intergénicos en esta zona del
dominio. Por medio de inmunoprecipitaciones de cromatina se determinó que las
marcas postraduccionales de histonas sufren cambios dramáticos conforme avanza la
diferenciación eritroide y el desarrollo favoreciendo una apertura gradual de la cromatina
del dominio. Por otra parte, se determinó que el enriquecimiento en marcas de apertura
se concentra principalmente en el “insulator” αEHS-1.4 en etapas previas a la madurez
eritroide. Esta observación correlaciona directamente con la presencia y abundancia de
CTCF en este elemento.
Para ampliar esta caracterización se evaluó la región 3´ del dominio, en el cuál
estudios recientes del laboratorio han determinado la presencia de tres nuevos sitios de
HS. En esta región el comportamiento es similar a lo observado en la región 5´, lo que
sugiere una apertura global del dominio durante el proceso de diferenciación eritroide.
Con base en los resultados obtenidos podemos concluir que a lo largo de la
diferenciación y el desarrollo eritroide existen cambios en la estructura de la cromatina
esenciales para la estructuración adecuada del dominio α-globina de pollo, en la cual el
“insulator” αEHS-1.4 debe tener una función regulatoria muy importante.
De manera adicional se logró determinar la presencia de transcritos intergénicos
que deben contribuir a la regulación y estructuración del dominio de manera coordinada
con otros componentes epigenéticos. Los datos obtenidos en este proyecto apoyan la
importancia de los mecanismos epigenéticos en la regulación de la expresión génica y
estructuración de los dominios cromosómicos a lo largo de la diferenciación y el
desarrollo de los organismos.
ABREVIATURAS
ACH: Nodo de cromatina activa
AcH3: Acetilación global de la histona H3
AcH4: Acetilación global de la histona H4
ADN: Ácido desoxiribonucléico
ARN: Ácido ribonucléico
cDNAs: DNA complementario
ChIP: Inmunoprecipitación de cromatina
CpG: dinucleótido CG
dsRNA: RNA de doble hebra
EIC: Espacios Intercromosómicos
FISH: Hibridación in situ por fluoresencia
HATs: Acetiltransferasas de histonas
HDACs: Desacetilasas de histonas
HDMTs: Desmetilasas de histonas
HMTs: Metiltransferasas de histonas
HP1: Proteína de heterocromatina 1
HS: Sitio de Hipersensibilidad a la DNasa I
H3K9me3- Trimetilación de la lisina 9 de la histona H3
H3K27me: Metilación de la lisina 27 de la histona H3
H3K36me: Metilación de la lisina 36 de la histona H3
H4K20me3: Trimetilación de la lisina 20 de la histona H4
H3K4me2: Dimetilación de la lisina4 de la histona H3
H3K79me2: Dimetilación de la lisina 79 de la histona H3
LCR: Región de control del locus
PcG: Proteínas del complejo Polycomb
RISC: Complejo de silenciamiento inducido por RNA
RITS: Complejo de Iniciación del silenciamiento transcripcional dependiente de RNA
RDRC: Complejo de RNA Polimerasa dirijido por RNA
RNAi: RNA de interferencia
RNA TRAP: Marcaje y recuperación de proteínas asociadas a RNA
RNA Pol II: RNA polimerasa II
rRNAs: RNA ribosomal
siRNA: RNA pequeño interferente
TC: Territorios cromosómicos
tRNAs: RNA de transferencia
TrX: Proteínas del complejo Trithorax
3C: Captura conformacional de cromosomas
5HS4: Sitio de hipersensibilidad 4 en la región 5´ del dominio b-globina de pollo.
3´HS: Sitio de hipersensibilidad en la región 3´ del dominio b-globina de pollo.
α-MRE: elemento de reconocimiento a proteínas MAF en el dominio α-globina
1. INTRODUCCION
1.1 La estructura de la cromatina
El DNA de las células eucariontes se encuentra organizado con un alto grado de
compactación para poder ser contenido al interior del núcleo. Esta organización se da
gracias a que el DNA se asocia con proteínas básicas llamadas histonas formando lo
que conocemos como cromatina. La cromatina tiene diversos niveles de estructuración
siendo la unidad básica de organización el nucleosoma.
El centro o “core” de un nucleosoma está formado por un octámero con dos
copias de las histonas H2A, H2B, H3 y H4, alrededor de las cuales se enrollan
aproximadamente 147 pares de bases de DNA (Figura1).
Figura 1
Representación de la estructura de un nucleosoma basada en la estructura cristalográfica
obtenida en años recientes. Diagrama visto de frente (izquierda) o visto del lado derecho
(derecha). El DNA se muestra en gris, H2A en amarillo, H2B en rojo, H3 en azul y H4 en verde
(Darnell et al. 2004).
Cada nucleosoma se une con el siguiente mediante un fragmento de DNA o
secuencia inter-nucleosomal (“linker DNA” en inglés) que varía de 15 a 55 pares de
bases dependiendo de la especie (Darnell et al. 2004). Esta estructura conocida como
“collar de perlas” se puede observar sólo en ausencia de H1 y constituye el primer nivel
de organización de la cromatina con un diámetro aproximado de 10 nm (Figura 2).
Figura 2
Foto de microscopía electrónica después de un tratamiento de descondensación de cromatina
que propicia la pérdida de H1 y por ende se desensambla la cromatina (modificada de Alberts
et al. 2002)
El siguiente nivel de estructuración es conocido como solenoide, en donde los
nucleosomas se asocian a la histona H1 formando una fibra de 30 nm. La estructura
de la cromatina después de este nivel es extremadamente complicada y poco
conocida, sin embargo se piensa que la fibra de 30 nm se ensambla sobre un
andamiaje formado por proteínas distintas a las histonas, permitiendo la formación de
estructuras con el mayor nivel de compactación como el caso de los cromosomas
metafásicos (Figura 3; Darnell et al. 2004).
Figura 3
Esquema de los distintos niveles de compactación de cromatina, desde la doble hélice de DNA
hasta los cromosomas metafásicos (modificada de Darnell et al. 2004).
1.1.2 Eucromatina y heterocromatina
Por medio de tinciones que marcan la cromatina, Emil Heitz fue el primero en
observar que la cromatina de las células eucariontes se encontraba en dos
conformaciones distintas a las que denominó heterocromatina y eucromatina (Helmut,
1995). La heterocromatina se definió en ese entonces como regiones compactas del
núcleo que no se descondensan durante la interfase, mientras que la eucromatina es la
región de la cromatina que está descompactada durante la interfase (Cheung y Lau,
2006).
En la actualidad, tenemos más información acerca de las características
moleculares de estas dos formas de cromatina. La heterocromatina corresponde a
cromatina altamente compactada sin accesibilidad a nucleasas, en donde la densidad
génica es baja y se duplica tarde en la fase S (Cheung y Lau, 2006). Por otra parte, las
histonas se encuentran hipoacetiladas, no presentan metilación de la lisina 4 de la H3
(H3K4me) y predomina la metilación de la lisina 9 de la histona H3 (H3K9me) que a su
vez se asocia con proteínas silenciadoras como HP1 (“Heterochromatin Protein 1“).
Esta conformación genera un arreglo compacto y homogéneo de los nucleosomas y
previene la activación transcripcional en estas regiones (Valenzuela y Kamakaka,
2006).
La heterocromatina a su vez se puede dividir en constitutiva o facultativa. La
heterocromatina constitutiva se compone en gran parte de secuencias repetidas de
DNA y se encuentra en regiones que requieren un estado compacto de manera
estable, tal es el caso de los telómeros (los extremos de los cromosomas) y alrededor
del centrómero (heterocromatina pericentromérica) (Tremethick, 2006), asi como
algunas regiones dispersas a lo largo de los cromosomas. Se llama heterocromatina
facultativa a las regiones de eucromatina que son silenciadas a lo largo del desarrollo y
en muchos casos su silenciamiento es mediado por procesos epigenéticos entre los
cuales se encuentra la participación de los complejos de proteínas polycomb (PcG)
(Valenzuela y Kamakaka, 2006).
La eucromatina por el contrario se encuentra relajada, es decir que el arreglo
nucleosomal es más laxo, accesible a factores nucleares y sensible al corte de
nucleasas (Kuhn y Geyer, 2003). Estas regiones son las primeras en ser duplicadas en
la fase S y los genes transcripcionalmente activos se encuentran inmersos en ésta.
Los modelos actuales para explicar los diversos estados de la cromatina proponen
que existen modificaciones postraduccionales de las histonas característicos de cada
estado (Tremethick, 2006). Por otra parte, la compactación de la cromatina depende de
factores de regulación que propician la remodelación de ésta según la actividad
transcripcional del genoma, sin embargo la mayor parte del genoma se encuentra
inmersa en cromatina compactada ya que el arreglo nucleosomal tiende de manera
intrínseca a la compactación.
1.1.3 Los mecanismos de remodelación de cromatina
Gracias a los avances en la investigación de la última década, la cromatina ya no
es considerada sólo el elemento estructural responsable de organizar la información
genética en el núcleo, sino se considera una estructura altamente dinámica que se
modifica de manera constante permitiendo todos los procesos celulares que se dan al
nivel del DNA.
La remodelación de la cromatina es uno de los procesos indispensables para
la correcta regulación génica en cualquier eucarionte, ya que de esta remodelación
dependen la activación o represión de genes de manera diferencial y específica.
Por otro lado, la descondensación de la cromatina es un proceso necesario para
permitir la entrada de los factores nucleares al templado de DNA y por lo tanto a la
información genética codificada en esta molécula. Estos factores son esenciales en los
procesos de transcripción, duplicación, recombinación y reparación del DNA y por lo
tanto es un proceso altamente regulado a múltiples niveles.
Existen al menos tres mecanismos por los que la cromatina puede ser remodelada
(Lisuka et al. 2003):
A. Complejos de remodelación ATP-dependientes
Para contrarrestar la naturaleza compacta de la cromatina, existen una variedad
de factores remodeladores que utilizan la hidrólisis de ATP para reorganizar la
cromatina, facilitando así la interacción de otras proteínas con el DNA nucleosomal y de
esta forma ocultar o exponer secuencias (Fyodorov y Kadonaga, 2001). Existen
diversas familias de complejos remodeladores dependiendo del tipo de subunidad
ATPasa que presentan y subunidades que los conforman, las cuales están
conservadas a lo largo de la evolución (Figura 4). Por otro lado, numerosos complejos
remodeladores han sido caracterizados durante distintos procesos como la
transcripción, la reparación acoplada a la transcripción y la recombinación homóloga
entre otros (Fyodorovy Kadonaga, 2001).
Figura 4
Complejos remodeladores ATP-dependientes y sus subunidades conservados en eucariontes y
purificados hasta el 2004. Estos complejos se dividen en varias clases con base en la identidad
de su dominio ATPasa: Swi/Snf2 (morado). ATPasas ISWI (rojo), Mi-2 (naranja), DOMINO-Like
(blanco). Subunidades conservadas de Swi/Snf2 (rosa), y específicas de cada complejo (rosa
claro), proteínas relacionadas a actina (verde), subunidades conservadas en Drosophila y
humano (amarillo), DNA helicasas (azul), subunidad ACF conservada en Drosophila y humano
(Sif 2004).
Los complejos remodeladores ATP-dependientes son capaces de movilizar y
reposicionar nucleosomas para permitir diversos procesos en el contexto de la
cromatina. Para llevar a cabo estas funciones, estos complejos remodeladores
presentan subunidades (además de las encargadas de la hidrólisis de ATP) que son
responsables de la interacción con otras proteínas. Este es el caso de complejos como
NuRD en mamíferos, en donde desacetilasas de histonas (HDACs) forman parte del
complejo remodelador (Lusser y Kadonaga, 2003). Asi mismo, en complejos como
Levadura
Drosophila
Humano
NURF en Drosophila contienen subunidades como NURF301 capaces de interactuar
con factores transcripcionales (Lusser y Kadonaga, 2003). Estas múltiples
interacciones le dan a estos complejos la especificidad para actuar de manera regulada
en los procesos de transcripción, recombinación, reparación del DNA entre otros.
B. Las modificaciones post-traduccionales de histonas
Las histonas son proteínas relativamente pequeñas y extremadamente
conservadas en el curso de la evolución. Los dominios C-terminales de las histonas,
presentes al interior del nucleosoma, tienen conformaciones específicas que son
indispensables para el ensamblaje del nucleosoma ya que propician uniones muy
estables histona-histona e histona-DNA. Por otra parte, los dominios N-terminales de
las histonas, comúnmente denominados “colas“ de histonas están menos estructurados
que los dominios C-terminales y no son esenciales para la integridad de la estructura
de los nucleosomas, pero como veremos más adelante, son críticos para modular la
estructura de la cromatina (Figura 5; Cheung et al. 2000).
Figura 5
Estructura de un nucleosoma en donde las histonas se encuentran altamente estructuradas en
el centro, mientras que las regiones N-terminales son flexibles y están expuestas al ambiente
nuclear (Darnell et al. 2004).
Debido a su flexibilidad y accesibilidad a factores nucleares, los extremos N-
terminales de las histonas constituyen blancos fáciles de modificación post-
traduccional.
Estas modificaciones pueden alterar la estructura de la cromatina de dos maneras.
La primera ocurre debido a que las histonas sufren cambios en su carga electrostática
y por lo tanto alteran la carga local de los nucleosomas. Este evento puede cambiar las
propiedades estructurales de las histonas, modificando así la interacción de éstas con
el DNA y con las histonas adyacentes.
La segunda ocurre cuando distintas combinaciones de estas modificaciones
funcionan como plataformas para reclutar diversos factores nucleares que reconocen
de manera específica dichas modificaciones y así ser capaces de modificar la
estructura de la cromatina (Lisuka et al. 2003). A esta última propiedad de las histonas
se le denominó “código histónico” (Strahl y Allis, 2000).
La hipótesis del código histónico propone que las regiones N-terminales de las
histonas son modificadas post-traduccionalmente por complejos remodeladores, y que
las combinaciones de estas modificaciones covalentes reversibles, propician
respuestas en sitios específicos en el genoma (Strahl y Allis, 2000). Mas adelante, se
amplió este concepto al nivel de la estructura global del cromosoma, proponiendo que
los distintos dominios de eucromatina y heterocromatina están determinados por la
combinación diferencial y por la concentración de estas modificaciones en los
nucleosomas (Figura 6; Jenuwein y Allis, 2001). Lo anterior apoya el modelo de “cross-
talk” o de intercomunicación entre nucleosomas permitiendo así la definición y
acotamiento de zonas genómicas bien definidas con funciones regulatorias específicas
(Jenuwein y Allis, 2001).
Figura 6
Representación esquemática de la eucromatina y la heterocromatina como grupos de
nucleosomas relajados o condensados dependiendo de la presencia diferencial de
acetilaciones (Ac), metilaciones (Me) y fosforilaciones (P) (modificada de Jenuwein y Allis,
2001).
Las modificaciones post-traduccionales conocidas a la fecha son las acetilaciones
de lisinas, las metilaciones de lisinas y argininas, la fosforilación de serinas, la
ubiquitinación de lisinas, la sumoilación y la ADP-ribosilación (Nightingale et al. 2006).
Existen en la naturaleza diversos complejos responsables de generar estas
modificaciones covalentes en las histonas, conservados desde la levadura hasta los
humanos, así como proteínas responsables de borrar estas marcas y reprogramar el
estado de la cromatina (Figura 7). La regulación de estas marcas consiste en mantener
un equilibrio de estos dos procesos para así permitir la expresión fina y regulada de los
genes.
Figura 7
Modificaciones post-traduccionales en el extremo N-terminal de las histonas. Se muestran
acetilaciones (Ac), metilaciones (Me), fosforilaciones (P) y ubiquitinaciones (Ub). A la izquierda
se muestran las metiltransferasas de histonas responsables de cada metilación (Volkel, 2006).
Sustrato Metiltransferasas de histonas
C. Variantes de histonas
Durante la fase S se lleva a cabo la duplicación del DNA, así como la síntesis e
incorporación de las histonas que formarán los nuevos nucleosomas. Por lo anterior, al
concluir la etapa de duplicación del DNA, todas las modificaciones de histonas se
reestablecen. Existen un grupo de histonas denominadas “variantes de histonas” que
presentan variaciones en su composición en algunos casos de un solo residuo. A
diferencia de las histonas canónicas, las variantes de histonas son codificadas por un
grupo de genes huérfanos que se expresan antes, durante y después de la fase S
(Sarma y Reinberg, 2005). La existencia de este mecanismo de ensamblaje
independiente de la fase S implica que el estado de la cromatina es también regulado
por medio del reemplazo de los nucleosomas viejos por nucleosomas nuevos (Ahmad y
Henikoff, 2003).
Figura 8
Histonas canónicas y sus variantes. Dominio de plegamiento (HFD). Sitios bien establecidos de
metilación (banderas rojas), fosforilación (círculos verdes). Diferencias entre H3 y H3.3
(amarillo). Las funciones propuestas para cada variante se muestran en el lado derecho (Sarma
y Reinberg, 2005).
Core de la histona canónica
Activación transcripcional
Ensamblaje del cinetocoro.
Core de la histona canónica
Reparación de DNA,
recombinación, histona más
frecuente en levadura.
Expresión génica y
segregación cromosomal
Inactivación del cromosoma
X. Represión transcripcional.
Activación transcripcional?
Core de la histona canónica
Core de la histona canónica
Se han encontrado diversas variantes de las histonas H1, H2A, H3, en menor
variedad de la histona H2B y ninguna variante de la histona H4. En la figura 8 se
muestran las variantes principales de cada una de las histonas, así como su función
caracterizada.
El intercambio de histonas por sus variantes puede tener dos tipos de funciones.
Por un lado es uno de los mecanismos necesarios para remover marcas epigenéticas
de una región y así promover la reprogramación epigenética de la estructura de la
cromatina con distintos efectos como la regulación transcripcional de los genes. En
segundo lugar, es el mecanismo que permite reemplazar histonas por variantes
específicas que ejerzan una función particular en un momento determinado (Sarma y
Reinberg, 2005).
Las variantes de histonas han sido involucradas en diversas funciones tales como
activación transcripcional, silenciamiento,detección de daño al DNA, organización de
centrómeros y meiosis (Bernstein y Hake, 2006).
1.2 La organización del genoma en el núcleo
Estudios sobre la organización de la cromatina dentro del núcleo han mostrado
que el genoma se encuentra dividido en territorios cromosómicos (TC) (Cremer y
Cremer, 2001). Estos territorios se observan en un núcleo en interfase y corresponden
a cada uno de los cromosomas. Mediante la técnica de hibridación in situ por
fluorescencia (FISH) utilizando diversos fluoróforos, se han realizado estudios
detallados del espacio que ocupa la cromatina de cada cromosoma en distintos
organismos como es el caso del pollo (Figura 9; Habermann et al. 2001).
Figura 9.
Núcleo de fibroblastos de pollo utilizando hibridación in situ de fluorescencia en donde se
observa el TC de cada cromosoma así como la presencia de los cromosomas homólogos en
diferente ubicación dentro del núcleo (Modificada de Habermann et al . 2001).
Entre cada TC existen espacios o compartimentos intercromatínicos (EIC) que
parecen contener complejos macromoleculares requeridos para la replicación, el
empalme o “splicing“, la transcripción y la reparación del DNA (Figura 10). Este modelo
de organización nuclear es conocido como el modelo TC-EIC (Cremer y Cremer, 2001).
Estudios más detallados mediante microscopía de fluorescencia han mostrado que los
TC tienen una estructura irregular dentro de los cuales existen canales y espacios sin
cromatina. El análisis de la distribución de los cromosomas en el núcleo ha permitido
sugerir que los cromosomas están estructurados en el núcleo dependiendo de la
densidad de genes que contengan. Esto significa que los cromosomas ricos en genes
se encuentran hacia el interior del núcleo, mientras que los cromosomas con baja
densidad génica se localizan hacia la periferia nuclear (Cremer y Cremer, 2001). El
modelo TC-EIC sugiere que la organización nuclear es un fenómeno extremadamente
dinámico, en donde los genes contenidos en cada territorio deben localizarse de
manera diferente dependiendo de sus niveles de expresión. Las secuencias
codificantes y los elementos reguladores de los genes activos deben relocalizarse
hacia la periferia del TC para así poder estar en contacto con la maquinaria
transcripcional o formar asas hacia el EIC (Figura 10; Cremer y Cremer, 2001).
Figura 10.
Modelo TC-EIC. Imagen del núcleo de una célula Hela. a) grupos de genes activos forman un
asa que sobresale del TC hacia el EIC para su transcripción. b) genes con respecto al
centrómero (*). Cuando los genes están activos (blanco) se encuentran lejos de la
heterocromatina centromérica (HC), mientras que cuando están silenciados (negro) se localizan
próximas a la HC. c) diferentes densidades de cromatina dentro de un TC. d) La cromatina
densa en genes (verde) se encuentra al interior del núcleo y la cromatina baja en genes (rojo)
se encuentra hacia la periferia nuclear cerca de la lámina basal (amarillo). e) genes activos
(puntos blancos) se localizan en la periferia del TC mientras que genes inactivos se encuentran
al interior del TC. f) el EIC contiene cúmulos de complejos transcripcionales (puntos naranja)
entre otro tipo de complejos responsables de la activación de los genes (blancos). g) el EIC
(verde) y el TC (rojo) (Cremer y Cremer, 2001).
Por otra parte, los genes que deben ser silenciados de manera permanente se
localizan hacia el interior del TC. Un ejemplo claro de esta propuesta se observa en el
caso del cromosoma X inactivo en mamíferos, en donde los genes que escapan de la
inactivación del cromosoma se encuentran localizados en la periferia del TC, formando
posiblemente asas que sobresalen hacia el EIC (Chaumeil et al. 2006).
Uno de los fenómenos que parecen tener amplia relevancia en la organización del
genoma en el núcleo es la actividad transcripcional del mismo. El proceso de
transcripción se da no sólo sobre los genes que codifican para proteínas sino en
amplias regiones intergénicas, intrónicas y repetidas. En la actualidad se ha propuesto
que los RNAs no-codificantes tienen un papel importante en la regulación de la
expresión genética por medio de la remodelación de cromatina o el reclutamiento de
factores nucleares (ver capítulo 1.3.4).
La actividad transcripcional en el núcleo esta altamente compartamentalizada; por
medio de técnicas de inmuno-FISH se ha podido observar la presencia de RNA Pol II
en cúmulos que correlacionan con RNA naciente denominados fábricas
transcripcionales (Chakalova et al. 2005; Figura 11A). Adicionalmente, se ha
observado que genes activos muy distantes entre si colocalizan en la misma fábrica
transcripcional, mientras que genes que se encuentran silenciados nunca colocalizan
con estas fábricas transcripcionales (Osborne et al. 2004). Ésta y muchas otras
evidencias dan pauta para sugerir que las fábricas transcripcionales son
megacomplejos asociados a la matriz nuclear a los cuáles se incorporan en un
momento dado los diversos grupos de genes que deben ser activados, es decir que los
genes son relocalizados hacia las fábricas que muy probablemente se localizan en
zonas inter-cromatinianas del núcleo.
Este modelo propone que los dominios que deben ser transcritos en un momento
específico, protruden de sus territorios cromosómicos y se estabilizan por medio de
elementos reguladores como los LCRs para poder localizarse en las fábricas
transcripcionales. Por otra parte, se propone que la actividad intergénica es la que
permite la formación de este engranaje en las fábricas transcripcionales mediante la
actividad transcripcional (Chakalova et al. 2005; Figura 11B).
Figura 11
(A) Modelo de fábricas transcripcionales en donde los dominios se movilizan hacia los EIC
fuera de sus territorios para contactar con los complejos transcripcionales. Este movimiento
favorecería la interacción de elementos distales tanto en cis como en trans. (B) Los cúmulos de
RNA Pol II organizan los genes y sus elementos regulatorios por medio de la transcripción
intergénica de los mismos. En vez de que la RNA polimerasa se deslice sobre la cromatina, la
cromatina se mueve a la fábrica transcripcional. Promotores (flechas negras), movimiento de la
cromatina (flechas azules) y promotores intergénicos (flechas rojas) (Modificada de Chakalova
et al. 2005).
Genes en trans
Genes en cis
Fábrica
Transcripcional
Complejo 
Gen-LCR
Transcrito 
enhancer 3´
Transcrito LCR
Gen inactivo
Transcrito intergénico
Transcrito intergénico antisentido
Elementos
LCR
enhancer 3´
Gen activo por 
enhancers 3´distal
Insulator
A
B
La propuesta sobre las fábricas transcripcionales se complementa con el modelo
TC-EIC, sin embargo nos faltan todavía evidencias contundentes de ambos modelos
regulatorios. Lo que es claro, es que existe una regulación extremadamente dinámica
de la cromatina en el núcleo, y que en ésta se encuentran involucrados diversos
elementos estructurales del núcleo, así como complejos proteínicos responsables de
los procesos nucleares como la transcripción y la duplicación.
Por lo anterior, es indispensable considerar la dinámica nuclear como un elemento
esencial en la regulación transcripcional, por lo que los procesos epigenéticos deben
también ser estudiados a la luz de todos los eventos nucleares necesarios en la
regulación génica.
1.3 Los dominios cromosómicos
Los procesos celulares esenciales para la diferenciación celular y el desarrollo de
un organismo requieren de rearreglos cromatínicos a gran escala dentro del núcleo. Sin
embargo, la relocalización de regiones cromosómicas implica un trabajo
extremadamente complejo si consideramos la gran cantidad de genes que deben ser
regulados. En la actualidad sabemos que en muchos casos los genes presentan un
orden lineal y un acomodo que podría simplificar la regulación coordinada del
transcriptoma en el contexto del núcleo (Kosak y Groudine, 2004a), por lo que se ha
propuesto la existencia de dominios cromosómicos.
Diversos estudiossobre la organización del genoma eucarionte han sugerido que
éste se encuentra organizado en dominios cromosómicos que contienen uno o varios
genes. Estos dominios contienen genes cuya expresión es constitutiva y necesaria para
el metabolismo celular, así como de genes cuya expresión depende de momentos
específicos del desarrollo o tejido específico (Laat de y Grosveld, 2003).
Este arreglo del genoma se sugirió inicialmente a raíz de observaciones citológicas
y bioquímicas del genoma. A partir de observaciones de cromosomas politénicos en
Drosophila melanogaster se determinó la existencia de regiones de cromatina
compactadas (bandas) y regiones de cromatina relajadas (interbandas), así como de
regiones extremadamente abiertas conocidas como “puffs” cromatínicos. Mas adelante
se observó que estos “puffs” correlacionan con grupos de genes que se expresan en
altos niveles de manera coordinada en un momento específico del desarrollo y que el
genoma de Drosophila se encuentra estructurado en cúmulos de genes que deben ser
expresados de manera coordinada en momentos específicos de diferenciación y
desarrollo (Kosak y Groudine, 2004a). Por otra parte, estudios bioquímicos han podido
determinar mediante ensayos de hipersensibilidad a nucleasas que existen amplias
regiones que se caracterizan por numerosos sitios de hipersensibilidad seguidos de
regiones que carecen por completos de estos sitios. Esto sugiere un arreglo del genoma
que se caracteriza por regiones accesibles seguidos de regiones compactadas (Razin et
al. 2003).
Mas recientemente, los dominios cromosómicos se han podido verificar por medio
de estudios bioinformáticos en donde se correlacionan los niveles de expresión con la
localización de los genes en el genoma humano. Estos estudios han revelado que el
genoma está estructurado en dominios cromosómicos en donde los genes contenidos
se expresan de manera conjunta y regulada a lo largo de los cromosomas, es decir, que
existen regiones de alta expresión génica seguidos de regiones de baja expresión
(Caron et al. 2001).
Los dominios se han definido de diferentes maneras dependiendo de sus
características. Con respecto a su expresión se pueden dividir en dominios
transcripcionalmente activos o dominios inactivos. Con respecto al corte por la DNasa I
se pueden encontrar tanto los sensibles como los resistentes al corte de esta enzima.
Por otra parte los dominios se han podido definir con respecto a las diferentes marcas
de las histonas, la presencia de variantes de histonas y la distribución y abundancia de
factores nucleares específicos (Valenzuela y Kamakaka, 2006).
Se ha observado que los dominios activos son sensibles al corte por la DNasa I y
presentan altos niveles de acetilación de histonas mientras que los dominios inactivos
se caracterizan por presentar marcas específicas de metilación de histonas y presentan
una cromatina compactada (Orphanides y Reinberg, 2000).
Los dominios reúnen todos los elementos necesarios para promover la expresión
regulada de los genes contenidos y por lo tanto, requieren de una regulación
independiente de su entorno, permitiendo así la expresión fina de los genes a lo largo de
la diferenciación y el desarrollo de un organismo (Figura 12). Por otro lado, este arreglo
en dominios podría favorecer la localización simultánea de grupos de genes a regiones
nucleares específicas dependiendo de su regulación (Kosak y Groudine, 2004b)
Figura 12
En diferentes organismos eucariontes los genes están organizados de manera lineal en grupos
de genes o dominios con diferentes características dependiendo del organismo (Kosak y
Groudine, 2004a)
Los dominios IgH y β-globina son ejemplos clásicos de grupos de genes con una
expresión coordinada. Ambos dominios se generaron a partir de eventos de duplicación
y se encuentran acomodados de manera lineal, sin embargo existen dominios
cromosómicos que contienen genes no relacionados en secuencia pero que se
encuentran coregulados en su expresión (Kosak y Groudine, 2004a). El dominio génico
Hoxb es otro de los ejemplos de dominios regulados a lo largo del desarrollo cuyos
genes están estructurados de manera lineal. Los patrones de expresión de los genes de
este dominio son determinantes para establecer el patrón antero-posterior. Este dominio
pasa de un estado inactivo a uno activo por medio de cambios en la estructura de la
cromatina y relocalización nuclear por medio de la formación de un asa que sobresale
del territorio cromosómico (Chamberyon y Bickmore, 2004).
A lo largo de la evolución han surgido diversos mecanismos que se encuentran
conservados en los organismos eucariontes encargados de promover la independencia
y la regulación específica de los dominios cromosómicos. La organización topológica del
DNA es uno de los posibles mecanismos que promueven la formación de dominios
funcionales mediante la separación espacial de distintos grupos de genes (ver capítulo
Núcleo Territorio
cromosómico
Cromosoma
metafase
Levadura
Gusano
Mosca
Ratón
Humano
Célula
eucarionte
Expresión tejido-específica
Expresión tejido-específica y coordinada
Expresión tejido-específica/
cromosomas compartidos
Región densa en genes/
Expresión genes constitutivos
1.2). Asi mismo, existen elementos reguladores que mantienen un estado específico de
la cromatina dentro de un dominio y evitan que elementos externos a éste ejerzan una
influencia en la expresión de los genes dentro del dominio.
A continuación se profundizará sobre cuatro elementos esenciales para la
regulación específica de los dominios cromosómicos.
1.3.1 LCRs
Uno de los componentes esenciales en la regulación de los dominios
cromosómicos son los LCRs (Locus Control Regions). Los LCRs son elementos que
generalmente presentan varios sitios de hipersensibilidad a la DNasa I (HS). Un ejemplo
clásico de LCR es el que regula la expresión de los genes β globina de humano.
Mediante transfecciones estables de un transgen en presencia de este LCR se
determinó que estos elementos son capaces de mantener altos niveles de expresión
dependiente del número de copias sin importar el sitio de integración en el genoma
(revisado en Razin et al. 2003). Esta última propiedad y el presentar más de un HS los
distingue de los “enhancers” (Dean, 2006). Por esta y otras evidencias el LCR es
considerado un elemento esencial para la expresión de los genes actuando al nivel de
un dominio completo. Existen varias propuestas sobre los mecanismos de acción de los
LCRs con base en numerosas evidencias observadas en distintos modelos
experimentales (Razin et al. 2003; Dean, 2006).
Uno de los modelos mejor sustentados propone que el LCR debe interactuar
directamente con los promotores como el caso de algunos “enhancers”, en donde se
genera un asa de cromatina permitiendo el contacto físico entre el elemento regulador y
el promotor (modelo del “looping”; Li et al. 2002).
Se sabe que diversos factores de unión a los LCR son capaces a su vez de
reclutar funciones remodeladoras de la cromatina como los complejos ATP
dependientes y los modificadores de las histonas. Este modelo propone que el LCR
funciona como un centro de nucleación de factores que van a comenzar a abrir la
cromatina iniciando en el LCR y “abriendo” la cromatina del dominio hasta la región de
los genes (modelo del “tracking”).
Otro de los modelos sugiere que la transcripción intergénica a partir del LCR
favorece la apertura del dominio y la activación de los genes correspondientes (Gribnau
et al. 2000; y ver capítulo 1.3.4).
La dinámica nuclear tiene una contribución importante en la regulación de los
dominios cromosómicos. Se ha propuesto que el LCR es uno de los elementos
responsables de relocalizar los dominios de regiones compactadas a zonas relajadas
permisivas para la transcripción, sin embargo esta propuesta requiere todavía de futuros
estudios que la sustenten (revisado en Razin et al. 2003 y Dean, 2006).
Además de los LCRs, existen diversoscomponentes epigenéticos involucrados en
la estructuración e independencia de los dominios tales como las modificaciones post-
traduccionales de histonas y los transcritos intergénicos que se explicarán a
continuación.
1.3.2 Modificaciones post-traduccionales de histonas
Uno de los componentes epigenéticos esencial en la regulación de los dominios
cromosómicos son las modificaciones post-traduccionales de las histonas. Estas
modificaciones provocan alteraciones en la cromatina a corto o largo plazo, de manera
tal que las células sean capaces de modificar la expresión de los genes frente a
cambios ambientales y las condiciones específicas de crecimiento y diferenciación, así
como de mantener programas de expresión génica heredables a las siguientes
generaciones celulares, manteniendo así una identidad específica (Jenuwein, 2001).
a) La acetilación de histonas
La acetilación de histonas es un proceso altamente reversible catalizado por
acetilasas de histonas (HATs) y desacetilasas de histonas (HDACs) (Calestagne-Morelly
y Ausió, 2006). La acetilación se ha asociado con cromatina transcripcionalmente activa
y relajada (principalmente la acetilación de las histonas H3 y H4) y las histonas
desacetiladas con cromatina inactiva (Grant, 2001).
La presencia de acetilaciones en las histonas puede debilitar los contactos histona-
DNA e histona-histona con los nucleosomas adyacentes, generando un ambiente
permisivo para la transcripción (revisado en Roth et al. 2001). La acetilación de histonas
puede actuar a dos niveles. El primer nivel se da en elementos reguladores como los
promotores y “enhancers” (entre otros), en donde la combinación de lisinas acetiladas
puede reclutar o mediar la interacción de factores reguladores a estos elementos. El
segundo nivel se da a lo largo de amplias regiones de cromatina (dominios activos) que
generalmente colocalizan con sitios de hipersensibilidad a la DNasa I en donde la
cromatina se encuentra en una conformación abierta (Schubeler et al 2000; Eberharter y
Becker, 2002). Estos dominios hiperacetilados pueden incluir uno o varios genes con
funciones específicas, constitutivas, y a lo largo del desarrollo (Calestagne-Morelly y
Ausió, 2006). La acetilación global de H3 y H4 en los dominios tiene como consecuencia
la descondensación de la cromatina formando un contexto permisivo para la activación
transcripcional (Eberharter y Becker, 2002).
En diversos loci de vertebrados existen regiones de hasta 100 kb con altos niveles
de acetilación de las histonas, que correlacionan con dominios funcionales. Este evento
se ha observado en diversos dominios tales como el β-globina de pollo (Litt et al. 2001a)
y el α -globina en diversos organismos (Anguita et al. 2001). En el presente trabajo
pretendemos entender los cambios en las modificaciones de histonas presentes en el
dominio α-globina de pollo a lo largo de la diferenciación eritroide y el desarrollo y así
poder determinar si es un dominio constitutivamente abierto o regulable.
Los patrones de hiperacetilación presentes en los dominios cromosómicos se
caracterizan por tener patrones no uniformes, en donde se observan picos y valles de
estas marcas (Figura 13). Tal es el caso de los dominios globina ya mencionados, así
como el caso del dominio murino HoxB en células de carcinoma embrionario
(Chamberyon y Bickmore, 2004) entre muchos otros ejemplos, como el del dominio β-
globina de ratón y el dominio de la hormona de crecimiento en humano (Figura 13).
Figura 13
Niveles de acetilación de histonas medidos por ChIP en las histonas H3 y H4 a lo largo de dos
dominios cromosómicos. a) El dominio β-globina de ratón y sus patrones de acetilación (línea
roja) b) El dominio de la hormona de crecimiento en humano y sus patrones de acetilación (línea
roja) así como los patrones en el caso de la deleción del HSI (línea azul) (Dean, 2006).
En el dominio β-globina de ratón se muestra un patrón de acetilación de picos y
valles en donde los picos de enriquecimiento coinciden con los elementos reguladores y
los genes que son activados por éstos. En el caso del dominio de la hormona de
crecimiento, la acetilación se concentra en los sitios de hipersensibilidad responsables
de la expresión del gen GHN en tejido pituitario de ratón (HSI y HSII). La deleción de
HSI provoca la pérdida del domino acetilado en H3 y H4.
Estudios globales de mapeo genómico han mostrado que las regiones ricas en
genes correlacionan con niveles altos de acetilación de la histona H3. En este caso, los
sitios de mayor enriquecimiento de acetilaciones de histonas se localizan sobre
elementos regulatorios como promotores, “enhancers” y LCRs (Roh et al. 2005).
Dentro de un dominio, existen diversos elementos reguladores como los LCRs y
los “insulators” que se han encontrado constitutivamente acetilados independientemente
de la expresión de los genes. Se ha propuesto que a partir de estos elementos el estado
acetilado de las histonas se extiende hasta abrir por completo el dominio cuando los
genes deben expresarse, es decir, que funcionan como centros de reclutamiento de
remodeladores de la cromatina (Litt et al. 2001a; West et al. 2004).
A una mayor escala, la acetilación está involucrada en procesos como la
compensación de dosis del cromosoma X del macho en Drosophila, en donde el
cromosoma completo se encuentra hiperacetilado, específicamente en la K16 de la
histona H4 (revisado en Grant, 2001).
En resumen, las acetilaciones de histonas son una marca que actúa a diversos
niveles sobre el genoma, tanto a nivel de elementos reguladores como al nivel de
dominios completos e incluso en cromosomas completos. En todos los casos la
acetilación de histonas es una marca que favorece la activación transcripcional y la
relajación cromatínica, favoreciendo así diversos procesos involucrados en la regulación
génica, como es el caso de la apertura regulada de los dominios cromosómicos.
b) La metilación de histonas
Además de las acetilaciones, las metilaciones de histonas han mostrado tener un
papel esencial en la regulación transcripcional. A diferencia de las acetilaciones, las
enzimas que catalizan la metilación (HMTs) y desmetilación (HDMTs) son altamente
específicas (Figura 7) y forman parte de diversas familias como el caso de Trithorax
(TrxG) y Polycomb (PcG) cuya función se explicará mas adelante.
Las lisinas (K) presentes en las histonas, son uno de los blancos principales de
metilación. Estos aminoácidos pueden presentar de uno a tres grupos metilo, agregando
un mayor nivel de complejidad al código histónico. Las primeras marcas caracterizadas
de metilación de histonas se han asociado a silenciamiento génico y formación de
heterocromatina, sin embargo existen ya varios ejemplos de metilaciones asociadas a
activación transcripcional (Figura 14).
Figura 14
Resumen de cuatro de los cinco residuos metilados en la histona H3, las enzimas responsables
de la metilación y sus efectos en la estructura de la cromatina y la transcripción (Modificada de
Cheung y Lau, 2006).
La H3K9me ha sido ampliamente caracterizada en mamíferos, levadura y
Drosophila (revisado en Jenuwein y Allis, 2001). Esta marca es reconocida por la
proteína HP1 que a su vez recluta la HMT Su(var)3-9 en Drosophila (que trimetila a la
H3K9) generando un mecanismo en cadena de formación de heterocromatina (Grewal
y Rice, 2004). Los componentes de esta maquinaria de represión se encuentran
conservados en eucariontes y constituyen un mecanismo esencial para mantener la
cromatina condensada tanto en la heterocromatina facultativa como en la constitutiva
(Rea et al., 2000). Además de la H3K9me, la H4K20me se ha asociado también a
regiones de heterocromatina consititutiva (Hampsey y Reinberg, 2003).
La H3K27me3 es una marca de represión cuya presencia está asociada a grupos
de proteínas Polycomb (PcG), mientras que la H3K4me es generada y reconocida por
proteínas del complejo Trithorax (TrxG). Las proteínas PcG y TrxG,y sus marcas de
histonas están involucradas en mecanismos de represión y activación transcripcional
respectivamente (Cheung y Lau ,2006).
A diferencia de las marcas ya mencionadas, la H3K79me es una de las marcas
localizadas en el core de la histona H3. Esta marca se ha propuesto como una señal
importante para evitar que las proteínas represoras Sir en la levadura se unan a
regiones eucromáticas (Ng et al. 2003). En resumen, en la eucromatina
transcripcionalmente activa se pueden encontrar H3K4me, H3K36me y H3K79me,
además de las marcas de acetilación ya mencionadas (Valenzuela y Kamakaka, 2006).
Por otro lado, las regiones de cromatina silenciada suelen presentar H3K27me,
H4K20me y H3K9me (Hampsey y Reinberg, 2003).
1.3.3 Los límites de los dominios y las secuencias tipo “insulators”
La independencia de los dominios cromosómicos depende en muchos casos de los
límites establecidos en cada dominio. Los límites de los dominios muchas veces se
observan como fronteras cromatínicas (Eberharter y Becker, 2002; Litt et al. 2001A).
Éstas últimas son transiciones físicas entre un estado compactado y represivo de la
cromatina y un estado abierto y permisivo para la transcripción como el observado en el
extremo 5´ del dominio β-globina de pollo (Prioleau et al. 1999).
Las fronteras de un dominio pueden ser el resultado de un balance entre factores
nucleares con funciones opuestas que generan un gradiente entre un estado de
apertura y uno de compactación de la cromatina (West y Fraser, 2005, Kimura y
Horikoshi, 2004). Estas fronteras no son fijas sino que están constantemente fluctuando
a lo largo de una región dependiendo de la actividad de los factores remodeladores
involucrados.
El mecanismo principal de estas fronteras no fijas se da, al menos en parte, a partir
del balance entre modificadores postraduccionales de histonas como acetilasas (HATs)
y desacetilasas (HDACs) (Kimura y Horikoshi, 2004). Estas actividades pueden ser
reclutadas por dos elementos de DNA, uno a cada lado de la frontera.
Por otra parte, estas fronteras pueden estar definidas por elementos llamados
“insulators”. Los “insulators” son secuencias de DNA neutras que se localizan en los
limites de algunos dominios cromosómicos. Mediante estudios funcionales se ha
encontrado que los “insulators” tienen dos propiedades funcionales: Por un lado, son
capaces de bloquear el efecto de un “enhancer”o un silenciador cuando éste se
encuentra entre el elemento regulador y un promotor (Figura 15; Kuhn y Geyer, 2003).
Esta característica les confiere la capacidad de asegurar la independencia de la
expresión génica a través de la protección de los genes de las señales vecinas
inespecíficas (Capelson y Corces, 2004).
Por otra parte, si los “insulators” se encuentran flanqueando un gen, éstos protegen
su expresión independientemente del contexto cromatínico en el que se encuentre
(Figura 15). Por lo anterior, los “insulators” son capaces de definir zonas de transición en
la estructura de la cromatina funcionando como supresores del efecto de posición (Litt et
al. 2001a).
Figura 15
La propiedad de barrera propone que la presencia de proteínas que se unen a los “insulators”
delimitan regiones de cromatina evitando la propagación de heterocromatina en regiones donde
los genes tienen que estar activos. La función de bloqueo de “enhancer” evita que señales
externas actúen sobre la expresión de los genes (modificada de Kimura y Horikoshi 2004).
Gracias a estas dos propiedades, los “insulators” se han considerado como
elementos responsables de estructurar el genoma en dominios cromosómicos
independientes y por lo tanto estar involucrados en los patrones de expresión génica
(Fourel et al. 2004).
Estudios en los “insulators” del dominio β-globina de pollo han determinado que
algunos “insulators” presentan sólo una de las dos propiedades caracterizadas y otros
poseen ambas (Sección 2.1.1). Este es el caso del “insulator” 5´HS4 que posee ambas
propiedades funcionales (Recillas-Targa et al. 2002), a diferencia del “insulator” 3´HS
que sólo posee la capacidad de bloqueo de “enhancer” (Saitoh et al. 2000 y Recillas-
Targa et al. 2002).
Se han propuesto varios mecanismos por los cuales los “insulators” tienen estas
funciones, y en particular la propiedad de barrera. El primero es un mecanismo pasivo
en donde los “insulators” estructuran la cromatina en forma de “loops” o asas que
delimitan espacialmente los dominios (Capelson y Corces, 2004). Esto se lleva a cabo
por la interacción de las proteínas unidas a los “insulators” con elementos perinucleares
o de la matriz nuclear (Kimura y Horikoshi, 2004). Este mecanismo ha sido ampliamente
caracterizado en el “insulator” Gypsy de Drosophila (Capelson y Corces, 2004). En este
“insulator” se ha observado que los factores unidos a éste tienen la capacidad de
“Insulator”
Barrera
Bloqueo de
Enhancer
relocalizar secuencias a la periferia nuclear, formando asas de cromatina que tienen un
efecto sobre la regulación de la expresión génica (Figura 16A; Gerasimova et al. 2000).
El segundo modelo pasivo propone que en el “insulator” se forma una región sin
nucleosomas que impide la propagación en cadena de la heterocromatina. Esto se da
por la unión de factores nucleares que desplazan los nucleosomas (Figura 16B). Este
modelo ha sido observado en el locus del “mating-type“ en levadura, en el que una de
las barreras contra la expansión de la cromatina se localiza en un gen de tRNA que se
caracteriza por la ausencia de nucleosomas (Oki y Kamakaka, 2002).
Un tercer modelo observado en levadura se da por la unión de factores nucleares a
los “insulators” que a su vez interaccionan con las histonas adyacentes impidiendo la
propagación de la heterocromatina (Figura 16C).
Figura 16
Modelos de los mecanismos de acción de los “insulators”. A) La formación de asas por medio de
la unión a estructuras de la matriz nuclear evita la expansión de la heterocromatina
(nucleosomas azules) sobre la eucromatina (nucleosomas verdes) B) La unión de factores
nucleares evita la que las señales de heterocromatina se propaguen. C) La interacción de
factores con las histonas oculta el templado para la propagación de heterocromatina. D) Los
factores unidos al “insulator” reclutan actividades de HAT las cuales compiten con las marcas de
compactación (West y Fraser, 2005).
El cuarto modelo plantea que los “insulators” funcionan como zonas de
reclutamiento de factores remodeladores de la cromatina (West et al. 2004) que
mantienen la cromatina del dominio accesible a factores nucleares para la expresión
regulada de los genes (Figura 16D). Un ejemplo claro de este mecanismo se observa
en el “insulator” 5´HS4 del dominio β-globina de pollo en el que se une el factor USF,
que a su vez recluta de manera activa a HATs (West et al. 2004).
Los “insulators” son secuencias que contienen sitios de unión a diversos factores,
que son en realidad los responsables de la actividad aislante. Uno de los más
caracterizados en vertebrados es el factor transcripcional CTCF, el cuál fue aislado
inicialmente como un factor transcripcional con funciones de “enhancer” o silenciador
dependiendo del contexto en el que se encontrara. CTCF es una proteína con 11 dedos
de zinc que se une a la mayoría de los “insulators” en vertebrados, como el caso del
5´HS4 del dominio β-globina de pollo, en donde CTCF es responsable de la actividad de
bloqueo de “enhancer” (Recillas-Targa et al. 2002). Se han encontrado secuencias
“insulators” que unen a CTCF en diversos modelos como el dominio α-globina de pollo
(Valadez-Graham et al. 2004), el gen Tsix involucrado en la inactivación del cromosoma
X de ratón (Chao et al. 2002), así como en el dominio β-globina en mamíferos (Bulger et
al. 2003).
En resumen, los elementos “insulator” son esenciales para establecer la
independencia de los dominios cromosómicos. Las propiedades de los “insulators” están
dadas por la unión de proteínas como CTCF enmamíferos que parecen estar
involucradas en la estructuración de los dominios. Lo anterior permite que los dominios
cromosómicos se estructuren de la manera correcta para expresarse en momentos muy
específicos y evitar el efecto de señales vecinas inespecíficas.
1.3.4 Transcritos intergénicos y cromatina
Todos los genomas (procariontes y eucariontes) están constituídos por secuencias
que codifican y secuencias que no codifican para proteínas. En eucariontes, existe una
gran cantidad de secuencias no-codificantes que son transcritas y que ejercen diversas
funciones como moléculas de RNA (43% en el genoma humano; Shabalita y Spiridonov,
2004). Además de los tRNAs y rRNAs, existe una gran cantidad de transcritos no-
codificantes que podrían tener un papel importante en la regulación génica. En
humanos, todos estos transcritos corresponden a un 98% de todos los transcritos
celulares, entre los cuales se encuentran RNAs intrónicos de secuencias codificantes,
RNAs exónicos e intrónicos de genes no-codificantes (como los de tRNAs y rRNAs) así
como RNAs intergénicos (Mattick y Makunin, 2005).
La transcripción intergénica fue considerada durante mucho tiempo el resultado de
una actividad sobrante de las RNA polimerasas, sin embargo existen cada vez más
evidencias de que estos transcritos tienen un papel fundamental en la regulación de la
expresión génica tanto a nivel de la cromatina como en la regulación espacial de los
genes dentro del núcleo (Chakalova et al. 2005).
Los transcritos intergénicos pueden poseer diversos tamaños y formar diversas
estructuras secundarias. Los transcritos más estudiados hasta la fecha son los RNAs
pequeños ya que sus mecanismos de acción se encuentran altamente conservados en
eucariontes (Matzke y Birchler, 2005).
Existen dos tipos de RNAs pequeños que han sido ampliamente estudiados en los
últimos 5 años, llamados RNAs de interferencia (RNAi) y microRNAs. Ambos son
procesados e interactúan con diferentes maquinarias que conducen a un silenciamiento
génico.
El RNA de interferencia o RNAi es un mecanismo evolutivamente conservado que
utiliza RNAs pequeños (siRNA) derivados de precursores de doble cadena (dsRNA)
para degradar mRNAs de manera específica. Los dsRNAs son procesados por la
enzima DICER y el complejo enzimático RISC (“RNA induced silencing complex“) que
interactúa con las siRNAs y cuya función es degradar los transcritos (Matzke y Birchler,
2005).
Recientemente se observó que el RNAi es uno de los mecanismos involucrados en
la formación de heterocromatina desde la levadura hasta los mamíferos (Volpe et al.
2002, Maison et al. 2002).
El silenciamiento génico mediante este mecanismo parece ser dependiente de la
transcripción intergénica. Esta propuesta ha sido generada principalmente mediante
evidencias obtenidas en Schizosaccharomyces pombe. En este modelo, la transcripción
intergénica promueve la formación de dsRNAs que son procesados por DICER para
formar siRNAs. Estos siRNA se asocian a un complejo llamado RITS que recluta al
complejo RDRC (en el que se encuentra la RNA polimerasa dependiente de RNA) al
transcrito naciente. La propagación del silenciamiento parece estar mediada por la
interacción de Clr4(Suv-3-9h) con la RNA Pol II. Esto permite la metilación de la histona
H3K9 conforme avanza la transcripción y por ende la unión consecutiva de Swi6 (HP1),
lo que conlleva a la formación de heterocromatina.
Tanto RITS como RDRC son esenciales para la formación de heterocromatina
dependiente de la transcripción intergénica (Figura 17; Talbert y Henikoff, 2006).
Figura 17
Modelo de propagación de heterocromatina acoplada a la transcripción. La maquinaria de RNAi
está acoplada a la actividad transcripcional de la RNA Pol II (Talbert y Henikoff, 2006).
Además de este mecanismo, los RNAi interactúan con otras maquinarias
remodeladoras propiciando la metilación del DNA en regiones de secuencias repetidas
del genoma como los centrómeros y telómeros, así como la eliminación del DNA en el
caso de Tetrahymena, en donde después de la conjugación entre dos organismos se
forma un nuevo macronúcleo y el viejo macronúcleo es degradado gracias al
reclutamiento de un complejo mediado por moléculas de RNA (Matzke y Birchler, 2005).
Evidencias muy recientes han demostrado que los transcritos intergénicos están
involucrados en eventos de dinámica cromosomal, modificación de cromatina, memoria
epigenética en genes improntados (en el que se expresa un solo alelo de un gen),
metilación del DNA y silenciamiento génico (Mattick y Makunin, 2005).
Estos transcritos se encuentran delineando dominios cromosómicos en los que se
incluyen los genes así como sus elementos reguladores. Además, se pueden encontrar
en el sentido o antisentido de los genes e incluso se sobrelapan con genes codificados
en el sentido opuesto (Chakalova et al. 2005). Se pueden observar algunos ejemplos
claros de esta transcripción intergénica en ciertos dominios de genes improntados como
el caso del locus IGF2/H19, sin embargo, la función de estos transcritos en la expresión
diferencial de los genes es desconocida en la mayoría de los casos (O´Neil, 2005)
(Figura 18).
Figura 18
Modelos de dos loci en ratón y sus elementos de regulación en donde se involucran RNAs no-
codificantes. El locus Xic está involucrado en la regulación del proceso de inactivación del
cromosoma X en mamífero y el locus IGF2/H19 contiene dos genes improntados que se
expresan diferencialmente en el linaje paterno o materno. ICR es el centro de control de
impronta. Flechas curvas muestran la acción del “enhancer” sobre los genes improntados
(Figura modificada de Spencer y Lee, 2006).
Por un lado, existen transcritos largos no-codificantes involucrados en la
inactivación del cromosoma X en mamíferos, (revisado en O´Neil, 2005), así como en la
activación del cromosoma X en Drosophila (Gilfillan et al. 2004). En ambos casos el
RNA no-codificante es capaz de interactuar con la maquinaria de remodelación y
modificación postraduccional de histonas causando la formación de heterocromatina o
eucromatina en cada caso.
Además de la función de estos transcritos en los mecanismos ya mencionados, se
ha propuesto que la actividad transcripcional en una región no codificante es en realidad
la responsable de mantener un dominio abierto, más que la molécula de RNA en si. Se
ha visto que la RNA Pol II interactúa con maquinaria de remodelación como es SWI/SNF
y acetilasas de histonas (o HATs) (revisado en Gribnau et al. 2000) y se ha sugerido que
las marcas de acetilación pueden propagarse a lo largo de los dominios por medio de la
interacción de HATs con la maquinaria transcripcional (Wittschieben et al. 1999). Por
otra parte, se han propuesto modelos en donde la transcripción intergénica es un
componente esencial de las fábricas transcripcionales, para la correcta expresión de los
genes (Chakalova et al. 2005).
En estudios recientes se ha demostrado la presencia de transcritos intergénicos en
el dominio β-globina de humano al igual que en otros dominios, y se ha observado que
la actividad transcripcional a lo largo de los dominios juega un papel importante en la
remodelación de cromatina y el mantenimiento de un dominio activo in vivo (Gribnau et
al. 2000).
La regulación y la organización del genoma eucarionte son procesos esenciales
para el destino celular y el desarrollo de los organismos. Esta regulación está dada por
la dinámica nuclear, así como por elementos genéticos y epigenéticos al nivel de los
dominios cromosómicos. La coordinación de los elementos reguladores contenidos en
un dominio permite la expresión regulada de los genes y la independencia de las
señales contenidas en éstos. En este trabajo pretendemos caracterizar y entender
algunos de los elementos que contribuyen a la regulación del dominio α-globina de pollo
tomando en consideración todos los aspectos planteados en este capítulo.
2. ANTECEDENTES
2.1 Estructura y regulación deldominio β-globina
El dominio β-globina en vertebrados ha sido hasta ahora el modelo más estudiado
para entender la regulación de los dominios cromosómicos. Este dominio está
conformado por los genes que codifican para las cadenas β-globina de la hemoglobina,
molécula transportadora de oxígeno en la sangre. La regulación del dominio β-globina
ha sido intensamente estudiado en mamíferos, principalmente en ratón y humano
(figura 19; Gribnau et al. 2000; Bulger et al. 2003) ya que se encuentra altamente
conservado y diversas deleciones a lo largo del dominio conllevan a enfermedades
como las anemias conocidas como β-talasemias (Rooks et al. 2005). Tanto en el ratón
como en los humanos el orden de los genes en el dominio corresponde con la etapa
del desarrollo en que deben expresarse. Se ha observado que este dominio presenta
cambios secuenciales a lo largo de la diferenciación eritroide según la expresión de los
genes. Asi mismo, ambos dominios se encuentran delimitados por genes que codifican
para receptores olfatorios y sus elementos regulatorios (Figura 19).
Figura 19
Esquema representativo del dominio β-globina en mamíferos en el que se muestran los
genes globina embrionarios y fetales (cajas rosas) y los genes adultos (cajas rojas), así como
sus elementos regulatorios altamente conservados (flechas rojas). Tanto río arriba como río
abajo del dominio se localizan genes de receptores olfatorios (cajas azules). Cajas abajo de la
línea son transcritos de derecha a izquierda y cajas por arriba de la línea son transcritos de
izquierda a derecha (Figura modificada de De Laat y Grosveld, 2003).
8 7 6 5
4 3 2 1 1 2 3
OR β-globina OR
-90HSs 5 4 3 2 1 3´HS1
ε Gγ Aγ δ β
Dominio β-globina de humano
Dominio β-globina de ratón
OR β-globina OR
εy βh1 βmaj βmin
-62.5/-60.7 6 5 4 3 2 1 3´HS1
Se han evaluado diversos aspectos de la regulación de este dominio, entre los
cuáles se encuentra la remodelación de la cromatina y las modificaciones post-
traduccionales de histonas a lo largo del dominio.
En mamíferos se han observado altos niveles de acetilación de histonas en el LCR
a lo largo del desarrollo, mientras que el incremento en la acetilación de histonas en los
genes corresponde directamente con la etapa de activación génica (Figura 9; revisado
en Li et al. 2006). El enriquecimiento en la acetilación de histonas está dado por el
reclutamiento de HATs a sitios específicos del dominio. Los factores responsables de
este reclutamiento son eritroide-específicos como el caso de NF-E2 y GATA-1 al LCR
(Dean, 2006).
El dominio β-globina en humanos abarca alrededor de 100 kb en el cromosoma 11
y contiene cinco genes regulados por un LCR río arriba del dominio (Li et al. 2006).
Este dominio se encuentra en una conformación cromatínica cerrada y se replica tarde
en la fase S en todos los tipos celulares a excepción del eritroide. En éste último el
dominio tiene una conformación abierta y se replica temprano en la fase S (Chakalova
et al. 2005).
La expresión de los genes globina presenta al menos tres etapas con el fin de
sintetizar las distintas hemoglobinas en el momento específico del desarrollo en el que
son necesarias. En la primera etapa se expresan los genes embrionarios, en la etapa
fetal se coexpresan los embrionarios y adultos, y en la tercera etapa se expresan sólo
los adultos. Estudios recientes han determinado que la expresión sucesiva de los
genes está determinada por la formación de tres subdominios de cromatina, y que
estos subdominios parecen estar delineados por la presencia de transcritos
intergénicos. En este trabajo se plantea que la transcripción intergénica es un
componente esencial para la remodelación de la cromatina en los dominios por medio
del reclutamiento de remodeladores por la RNA Pol II (Gribnaud et al. 2000).
Por medio de diversas técnicas como el RNA TRAP y la captura conformacional
de cromosomas (3C) se ha determinado la conformación espacial del dominio β-globina
de ratón (Carter et al. 2002, Palstra et al. 2003). Ambas técnicas permiten determinar,
mediante dos acercamientos diferentes, qué elementos dentro de un dominio se
encuentran en contacto con otros y por lo tanto permiten reconstruir un arreglo espacial
de una región del genoma. Estos dos estudios se realizaron con el objetivo de entender
si la regulación del dominio β-globina de ratón está dada por contactos directos entre
los elementos reguladores y sus genes blanco y se logró determinar que los HS del
LCR contactan con los genes que se encuentran activos en células eritroides de ratón.
Por medio de la técnica del 3C se logró determinar que existe una estructura
denominada nodo de cromatina activa (ACH por “Active Chromatin Hub“)(Figura 20;
Palstra et al. 2003).
Figura 20
Modelo de estructuración del ACH (nodo de cromatina activa) en diferentes etapas de
diferenciación eritroide. Cajas rojas (genes eritroides primitivos o embrionarios), cajas verdes
(genes eritroides definitivos o adultos) y rectángulos negros (genes silenciados). En células
progenitoras eritroides se forma una subestructura a partir de los elementos reguladores del
dominio (HS-60/-62, HS4-6, HS1-3 y 3´HS1). En células eritroides se estructura el ACH
funcional ya sea en eritrocitos primitivos o definitivos para la correcta transcripción de los genes
β-globina (Figura tomada de Palstra et al. 2003).
Esta estructura permite la interacción directa de los elementos del LCR con sus
genes blanco en células adultas eritroides. Es interesante que en células progenitoras
eritroides existe un nodo de cromatina conformado sólo por los HS del LCR lo que
sugiere que existe una estructura preparatoria para la formación posterior del ACH
(Figura 20). La estructura del ACH depende de la unión de factores eritroides a sus
sitios blancos, como es el caso de EKLF, GATA-1 y FOG (Drissen et al. 2004 y Vakoc
et al. 2005). El ensayo de 3C fue realizado también en el dominio β-globina de humano
obteniendo resultados muy similares. En este estudio se observó que la presencia de
los HS del LCR es esencial para la formación del ACH in vivo (Patrinos et al. 2004).
Progenitor eritroide Diferenciación Célula eritroide
Glóbulo rojo
primitivo Glóbulo rojo
definitivo
Por otra parte, el dominio β-globina en mamíferos se encuentra delimitado por tres
sitios de unión a CTCF. En el caso del ratón se encuentran dos en el extremo 5´ y uno
en el extremo 3´. Estudios recientes utilizando la técnica de 3C lograron determinar que
los sitios de unión a CTCF en el dominio β-globina de ratón contribuyen a la formación
de la fase preparatoria del ACH en precursores eritroides murinos (Splinter et al.
2006).
El mecanismo por el cuál CTCF tiene la capacidad de estructurar dominios es
desconocida, sin embargo existen evidencias de que CTCF puede interactuar con
proteínas nucleolares que son parte de la matriz nuclear propia del nucleolo (Yuzufsai
et al. 2004). Por otra parte, CTCF tiene la capacidad de interactuar consigo mismo y
formar homo-polímeros (Klenova y Ohlsson, 2005).
Todos los datos anteriores sugieren que además de los factores EKLF y GATA-1,
CTCF juega un papel fundamental en la estructuración y regulación del dominio β-
globina. Esta reciente evidencia constituye una nueva propuesta sobre el papel de
CTCF en la estructuración, formación y regulación de un dominio, así como de su papel
como “insulator”.
2.1.1 El dominio β-globina de pollo
El estudio del dominio β-globina de pollo (Gallus gallus) ha permitido entender
cada vez más qué factores están involucrados en la regulación de un dominio
cromosómico. Este dominio se localiza en el cromosoma 1 y abarca