Analisis-genomico-de-elementos-de-curvatura-en-secuencias-promotoras-de-escherichia-coli-K12-y-su-aplicacion-al-caso-de-hns

Vista previa del material en texto

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE
MEXICO
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA MOLECULAR
ANALISIS GENOMICO DE ELEMENTOS DE
CURVATURA EN SECUENCIAS PROMOTORAS DE
Escherichia coli K12 Y SU APLICACIÓN AL CASO DE
hns
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR EN CIENCIAS BIOQUIMICAS
P R E S E N T A
NORMA OLIVARES ZAVALETA
CUERNAVACA, MORELOS. 2006
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
INDICE
Página
LISTA DE ABREVIATURAS i
LISTA DE TABLAS Y FIGURAS ii
RESUMEN 1
ABSTRACT 3
INTRODUCCIÓN 5
Análisis de la curvatura. 7
Análisis experimental de fragmentos curvos. 10
La curvatura estática y su participación en la
transcripción. 12
Generalidades de H-NS. 15
En cooperación con la presencia de DNA curvo,
H-NS reprime la activación de su promotor 19
OBJETIVOS 26
MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS 27
RESULTADOS 41
DISCUSION 74
CONCLUSIONES 82
PERSPECTIVAS 83
REFERENCIAS 85
ANEXO 91
1
Resumen.
Diversos estudios han relacionado a la curvatura de DNA dependiente de
secuencia como un mecanismo adicional de regulación de la transcripción en
procariontes. Evidencias experimentales muy puntuales, han demostrado que la
presencia de DNA curvo contribuye en la regulación de la transcripción. Estudios
genómicos realizados por nuestro grupo han demostrado que las regiones no
codificantes, en las cuales están incluidas secuencias promotoras y sitios de
unión a proteínas reguladoras, son significativamente más curvas que regiones
codificantes o secuencias permutadas al azar. Utilizando el algoritmo BEND y
matrices de contribución rotacional y traslacional para la predicción de
elementos de curvatura, realizamos la caracterización in silico de elementos de
curvatura en cada una de las regiones reguladoras (RR) de E. coli K12. Nuestro
estudio reveló que un número importante de estas unidades de transcripción
(UT) (aproximadamente 35%), presentan una curvatura significativa en su
secuencia de regulación. Interesantemente, encontramos que estos UT
presentan una tendencia a ser miembros de regulones en donde los reguladores
correponde a factores de transcripción de tipo globales (identificados en E. coli).
En la misma situación, encontramos regulones controlados por reguladores
específicos tales como PurR, ArgR, FruR y CytR.
Para validar nuestros datos teóricos, realizamos mutagénesis dirigida al
sitio sobre las secuencias 5´ de regulación de las UT: argCBH, aroG, y pyrC,
representativas de nuestro grupo de análisis, las cuales pertenecen a los
regulones: ArgR, TyrR, y PurR respectivamente, así como a la región de regulación
2
del gen hns (el cual lo utilizamos como control). Como parte de este trabajo,
desarrollamos el servidor MUTACURVE que nos permite proponer las
mutaciones puntuales que disminuyen el grado de su curvatura estática. El
efecto de estas mutaciones se evaluó in vivo utilizando fusiones
transcripcionales al gen reportero: cloranfenicol acetil transferasa (cat).
MUTACURVE nos permitió predecir acertadamente, sitios para realizar
mutagénesis dirigida con la intención de disminuir considerablemente el grado
de curvatura en las regiones de regulación de aroG, pyrC, argCBH y hns. Esta
estrategia de análisis redujo considerablemente el riesgo de modificar
importantes regiones de regulación que aún no estén caracterizadas.
2
del gen hns (el cual lo utilizamos como control). Como parte de este trabajo,
desarrollamos el servidor MUTACURVE que nos permite proponer las
mutaciones puntuales que disminuyen el grado de su curvatura estática. El
efecto de estas mutaciones se evaluó in vivo utilizando fusiones
transcripcionales al gen reportero: cloranfenicol acetil transferasa (cat).
MUTACURVE nos permitió predecir acertadamente, sitios para realizar
mutagénesis dirigida con la intención de disminuir considerablemente el grado
de curvatura en las regiones de regulación de aroG, pyrC, argCBH y hns. Esta
estrategia de análisis redujo considerablemente el riesgo de modificar
importantes regiones de regulación que aún no estén caracterizadas.
3
Abstract.
In this work, we present the analysis of the DNA static curvature in some
regulatory regions of Escherichia coli. We used two different approaches in our
study. The first approach was based on a computer analysis of the regulatory
regions of previously characterized E. coli operons. The maximal curvature for
each MUR was calculated using an implementation of the BEND algorithm using
the rotational and translational contribution matrices derived from sequence
periodicity in nucleosome core DNA. Our study indicates that an important
number of these operons (about 35%) present a significant curvature sequence
in their 5’ regulatory regions. Interestingly, we found that these operons
presented a tendency to be members of specific regulons. Such is the case of
the E. coli global transcription factors which presented a significant tendency to
regulate operons with curved DNA sequences. We also found that the regulons
of some specific regulators, such as PurR, ArgR, FruR and CytR present a
similar tendency.
The second approach taken in our study was based on the experimental
verification of our computer analysis for some representative predictions. For this
reason, we performed site directed mutagenesis that reduced the extent of DNA
curvature in the regulatory sequences of the aroG, pyrC, and argCBH operons.
The effect of these mutations was evaluated in vivo by transcriptional fusions to
the chloramphenicol acetyltransferase cat reporter gene. Whit the aim to assist
the design of site directed mutagenesis we developed a web server named
MUTACURVE which evaluates the effect of every double point mutation in a
4
given sequence in order to select those changes that would produce a significant
reduction in the intrinsic DNA curvature. The most common approach previously
used to study the role of curved regions is based on serial deletions or
replacements of the studied sequence with an important risk of modifying
important regulatory regions that might not have been characterized yet. Our
MUTACURVE server, importantly reduces this risk and therefore a much clear
results were obtained by our point mutation analysis.
5
Introducción.
En un genoma, el paso inicial en la expresión de cualquier unidad
transcripcional (UT) es su selección dentro de una gran cantidad de genes. Esta
selección invariablemente requiere de la interacción de moléculas de proteínas
con secuencias específicas o estructuras en el DNA. La capacidad de una
proteína para discriminar entre diferentes regiones de una molécula de DNA
depende primero una secuencia. Y segundo, del hecho de que un segmento no
es una región uniforme. Esta ausencia de uniformidad no sólo es un reflejo
directo de su estructura local si no también de la plasticidad para flexionarse y
asumir diferentes estructuras en el espacio.
La primera propuesta estructural de una molécula de DNA, suponiendo
que la disposición en el espacio entre las pares de bases fueran paralelas, era el
de una doble hélice cuyo eje obedecía a una trayectoria lineal (1). En la segunda
mitad del siglo XX hubo gran interés en estudiar y comprender aquella estructura
helicoidal del DNA propuesta en los años 50’s por Watson y Crick. Los
siguientes añosa su descubrimiento, y con el avance en la síntesis y
cristalización de pequeños fragmentos sintéticos (oligonucleótidos), se demostró
que el DNA no era una estructura monótona y rígida que sólo contenía
información codificada, si no que presentaba una conformación
considerablemente flexible, la cual podía ser altamente significativa para las
interacciones proteínas-DNA.
6
Figura 1. Estructura del DNA. A) Modelo original de la molécula de DNA descrita
por Watson y Crick (1), B) Modelo de una molécula curva de DNA.
En 1980, Wing et al., (2) en su investigación con el dodecámero: C-G-C-
G-A-A-T-T-C-G-C-G mediante cristalografía y análisis de difracción de rayos X,
notaron que la estructura de la doble hélice presentaba una dramática curvatura.
Ellos sugirieron que ciertas combinaciones adyacentes de pares de bases
pueden ser ligeramente no paralelas debido a constricciones estructurales
locales. Por ejemplo, mediante análisis de la energía potencial en el dúplex
ApA/TpT, se puede predecir que existirá un ligero doblez o torsión en su
estructura. Adicionalmente, Marini et al., (1982) (3) mientras estudiaban el patrón
de restricción de los mini-círculos de DNA del cinetoplasto de Leishmania
tarentolae, descubrieron que algunos de los fragmentos presentaban un
B)A) B)A)
7
desplazamiento electroforético extremadamente lento. Estudios subsecuentes
propusieron que esta propiedad física anómala probablemente se debía a una
estructura compacta inusual de la secuencia y no a la unión de proteínas in vivo
al DNA; o bien, a modificaciones intrínsecas ocurridas durante el proceso de
análisis,ya sea durante el proceso de cristalización o durante el desplazamiento
electroforético. Estudios adicionales, como el desplazamiento de fragmentos
mediante electroforesis en geles de poliacrilamida y cinéticas de ciclización
contribuyeron a demostrar que interacciones electromagnéticas entre las bases
modifican la posición de un par de bases con respecto a sus vecinos en una
manera secuencia dependiente (3-7). Estas observaciones demostraron que una
movilidad electroforética anormal con respecto al tamaño relativo se podía
relacionar con la presencia de regiones “curvas” o “torcidas” dentro de la
estructura de una molécula o fragmento de DNA.
Análisis de la curvatura.
Análisis de cristalografía y difracción de rayos X han permitido estudiar las
deformaciones a lo largo de la trayectoria de cada una de las hebras del DNA. El
estudio de variables geométricas como: inclinación (“tilt”), rotación (“roll”) y giro
(“twist”), ha contribuido a entender la relación de un par de bases con respecto a
sus vecinos (Figura 2): Para propósitos de simplificación, consideraremos que
cada par de bases describen un dominio plano, en donde la estructura helicoidal
de la molécula, requiere que cada par de bases sufra un evento de rotación con
respecto a su vecino. Como primer parámetro se encuentra el “Twist” (giro), en
8
donde un par de bases presentan una ligera rotación con respecto a sus vecinos
más inmediatos. Un segundo parámetro lo es el ángulo entre los planos de
pares de bases sucesivas (Roll). La formación de este ángulo se lleva a cabo
por la rotación de un par de bases, resultando en un cambio de dirección del eje
de la molécula, evento que está relacionado directamente con el “bending”
(doblez) de una molécula de DNA. El tercer parámetro: el de la inclinación (“tilt”),
es una versión (aunque más corta) del la rotación (“rol”), y en general es mucho
más pequeño.
Figura 2. Esquema de los términos que definen la geometría entre pares de
bases en un fragmento de DNA de doble cadena. La línea vertical representa el
eje de la molécula.
De este análisis derivan dos términos distintos:
“Doblez” (bending), el cual describe la tendencia de un grupo de pares de
bases sucesivas a ser no paralelas (Figura 3a).
“Curvatura”, este representa la tendencia del eje de la hélice a seguir una
trayectoria no lineal a lo largo de la cadena (Figura 3b).
(Inclinación) (Rotación) (Giro)(Inclinación) (Rotación) (Giro)
9
Figura 3. (A) Normalmente, en un segmento de DNA (no curvo) existen ligeras
desviaciones entre los nucleótidos con respecto al eje de la molécula, las cuales
tienden a contrarrestarse. Este efecto es conocido como: doblez (“bending”). (B)
La curvatura está descrita como la desviación del eje de la molécula hacia un
sentido u otro, resultado de la contribución de segmentos rígidos insertados en
la secuencia, originando que en una región, la trayectoria del eje de la molécula
se desvíe respecto al resto de la molécula.
Un análisis de cristalografía por rayos X no puede mostrar la curvatura,
pero sí puede mostrar las torsiones locales. Por otro lado, la electroforesis en gel
y las cinéticas de ciclización, pueden detectar señales de curvatura pero no
localizar torsiones locales (8-11). Esto colocaba al estudio de la estructura en
serios problemas, ya que el conocer torsiones locales dentro del DNA, podría
permitir el cálculo preciso de curvatura, pero el conocer sólo la curvatura
macroscópica, no permitiría especificar con precisión los elementos de torsión
A)
B)
PLANO
CURVO
A)
B)
A)
B)
PLANO
CURVO
10
que de manera conjunta conforman a la curvatura. A partir de lo anterior, se
desarrollaron otras herramientas que permitieron hacer una detallada
descripción de estos eventos. Inicialmente, se propusieron dos modelos para
estudiar los plegamientos dependientes de secuencia sobre una hebra de DNA
libre:
El modelo de los vecinos más cercanos. Este modelo propone que la
magnitud de curvatura en una región determinada está representada por la
acumulación de un gran número de pequeñas deformaciones locales entre pares
de bases ubicadas en cada giro de la hélice de DNA (12).
En el caso del modelo de unión, se propone que las torsiones ocurren
en interfaces entre dos diferentes variables estructurales de la doble hélice de B-
DNA (8;10). Modificaciones a éstos han conducido al desarrollo de diferentes
modelos, entre los cuales están: El modelo De Santis (13), el de Calladine (14) ,
el modelo de Bolshoy (15), así como el de posicionamiento de nucleosomas
(16). Estos grupos, concluyeron que la conformación estructural que asume un
segmento de secuencia, depende tanto de su secuencia local como de su micro-
ambiente vecino.
Análisis experimental de fragmentos curvos de DNA.
A inicios de los años 80, el estudio y análisis de variaciones en la
estructura del DNA se vio fortalecido por el uso de diferentes estrategias
experimentales. Técnicas como: cinéticas de ciclización y permutación circular
(8-10), electroforesis de campo pulsado (17), han sido las más utilizadas.
11
Adicionalmente, a inicios del siglo XXl, se descubrió que un segmento de DNA
con curvatura intrínseca podía unirse libremente a una superficie plana de cristal
(18). Este hecho, abrió la posibilidad de realizar observaciones in vivo y en
tiempo real, mediante la adhesión dependiente de secuencia a superficies
planas de un fragmento de DNA. Esto marcó la pauta para iniciar aplicaciones
con propósitos nano-tecnológicos entre las cuales se ha aplicado de manera
exitosa en la microscopía de fuerza atómica (19).
Marini y colaboradores descubrieron la existencia de elementos de
curvatura mediante el estudio del patrón electroforético de ciertos fragmentos
extra-cromosomales de Leishmania (2). La electroforesis en gel de
poliacrilamida es una de las técnicas más empleadas y de fácil desarrollo para el
análisis de fragmentos curvos de DNA. Esta se basa en la migración
electroforética anómala que un fragmento curvo exhibe cuando se hace migrar a
través de la matriz del gel en condiciones nativas no-reductoras. Esta técnica no
sólo es útil en la separación de fragmentos con base a su tamaño, si no también,
para analizar variaciones dependientes de secuencia en la estructura y
conformación del DNA. La migración de fragmentos curvos en el gel de
poliacrilamida, va ocurrir máslentamente y se desplazará una distancia menor
que lo que lo haría un fragmento no-curvo y de igual tamaño. La movilidad
anómala observada en geles de poliacrilamida está usualmente atribuida al
hecho de que moléculas curvas presentan una menor distancia de extremo a
extremo, lo que conduce a un incremento en el área que describen. Este
incremento en al área, provoca que el fragmento de DNA se desplace como una
12
proteína globular a través de la matriz del gel. De manera contraria, un
fragmento no-curvo pero de igual longitud, posee una mayor distancia entre los
extremos de la molécula, lo que condiciona a que su volumen de área en su
estructura sea despreciable, y por ende, la resistencia a través del gel. La
movilidad de un fragmento curvo además de depender del tamaño del poro del
gel, está influenciada tanto por la dirección de la curvatura (respecto al eje de la
molécula), como de la posición de ésta dentro de la molécula, en donde, una
curvatura al centro de un fragmento, tendrá mayor efecto sobre su
desplazamiento que si estuviera localizada a los extremos (20).
La curvatura estática y su participación en la transcripción de genes en
procariontes.
En organismos procariontes como en eucariontes, las regiones curvas
localizadas dentro de la secuencia de regulación de genes se han relacionado o
asociado a secuencias de reconocimiento de proteínas de unión a DNA.
Ejemplos de lo anterior son la región que comprende el inicio de replicación del
bacteriófago lambda (λ)(21), el del virus SV40 (22) así como la región del
promotor del gene ompF en Escherichia coli (23), entre otros promotores
bacterianos (24-28) en donde se han identificado alteraciones en la geometría
de la molécula precediendo a las secuencias promotoras, ya sea activando o
reprimiendo la transcripción.
En la última década, se han aportado considerables progresos sobre el
papel de la curvatura estática del DNA. Nosotros y otros grupos, hemos
13
demostrado que la contribución de la curvatura en bacterias mesofílicas muestra
un patrón conservado y revela que una fracción de los promotores se caracteriza
por poseer elementos de curvatura entre 100-200 pb arriba al codón de inicio de
la traducción (29-32). Diversos estudios han demostrado que el DNA curvo
activa la transcripión, ya sea facilitado la unión de la RNA polimerasa a los
promotores, o bien, favoreciendo la interacción de proteínas activadoras (33;34).
El DNA curvo, puede también estar involucrado en la represión de la
transcripción. Sin embargo, en este caso, generalmente desempeña un papel
indirecto, ya que la unión de una proteína represora, estabiliza o incrementa una
asa, impidiendo así el avance de la RNA polimerasa. Recientemente, estudios
realizados sobre el regulador vir F en Shigella, y en el operón ecf localizado
dentro del plásmido de virulencia de E. coli O157:H7 (pO157), demostraron una
nueva función del DNA curvo. En ambos estudios se concluye, que el DNA curvo
podría estar actuando como un termo-sensor, por descubrir gradualmente sitios
blancos de acción para reguladores involucrados en la activación/represión de la
transcripción (24;25). Estos hallazgos describen a la curvatura, como una
estrategia útil para optimizar el control de la expresión de genes en sistemas de
regulación asociados a cambios en las condiciones ambientales.
El estudio detallado de un gran número de reguladores transcripcionales
ha revelado la existencia de un espectro de mecanismos usados para controlar
la transcripción (35). Muchos de estos mecanismos moleculares involucran
plegamientos en el DNA y otro tipo de deformaciones para controlar el inicio de
la transcripcion. Sin embargo, la contribución de la curvatura estática se ha
14
demostrado sólo para algunas proteínas reguladoras tales como IHF (36), H-NS
(37), FNR (38), y HU (33), en las cuales se ha determinado que regiones curvas
en el DNA favorecen la interacción entre el DNA y la RNA polimerasa, así como
la formación del complejo abierto.
A la fecha, existen innumerables evidencias apoyando la participación de
la curvatura estática en la regulación de la transcripción. Esto se ha fortalecido
por la implementación y desarrollo de un gran número de estrategias
experimentales y de cómputo valiosas en el estudio de la topología del DNA,
para la identificación de regiones de curvatura, en un segmento de secuencia de
DNA o inclusive en genomas totalmente determinados.
Escherichia coli, es el organismo más ampliamente estudiado en cuanto a
su fisiología y genómica se refiere. Sin embargo, es relevante destacar la escasa
información referente a la participación de regiones curvas de DNA en el
proceso de la transcripción dentro de su genoma. En este trabajo presentamos
un análisis genómico de la curvatura estática en el DNA de E. coli. Por principio
se realizó la predicción in silico de elementos de curvatura en cada una de las
regiones reguladoras descritas en E. coli. Nuestro estudio reveló que un número
importante de estas UT (aproximadamente 35%), presentan una curvatura
significativa en su secuencia de regulación. Encontramos que estas UT se
agrupan como miembros de ciertos regulones controlados por reguladores
específicos, o por reguladores globales.
La segunda etapa de nuestro estudio consistió en la verificación
experimental de algunos de los resultados obtenidos en nuestro análisis teórico,
15
mediante la caracterización del posible papel de la curvatura estática en la
regulación de UT modelo. Por esta razón, desarrollamos un programa de
cómputo llamado MUTACURVE, el cual nos permite identificar las mutaciones
puntuales dentro de un fragmento de DNA que reducen significativamente su
curvatura estática. Así, predijimos acertadamente sitios para realizar
mutagénesis en las regiones de regulación de aroG, pyrC y argCBH. El efecto in
vivo de estas mutaciones se analizó con fusiones transcripcionales al gen reportero de la
cloranfenicol acetil transferasa (cat).
Interesantemente, los resultados obtenidos en el estudio con la región de
regulación de hns, revelaron importantes inconsistencias respecto a la idea de que FIS
podría estar actuando como un activador transcripcional del gen hns [Falconi et al., (39)].
Paralelamente, los ensayos de actividad de CAT, revelaron que la curvatura, además de
facilitar a H-NS el reconocimiento a sus sitios blanco, está fuertemente vinculada con la
actividad per se del promotor (actividad independiente de la influencia de los
reguladores: FIS y H-NS); a la fecha, un evento desconocido dentro de la regulación de la
expresión del promotor hns.
Generalidades acerca de H-NS
La organización estructural del material genético en cualquier célula es un
evento clave para regular la función, estabilidad e identidad de un genoma.
Particularmente, el proceso de división celular es uno de los eventos fisiológicos
que depende de realizar modificaciones en el empaquetamiento del DNA. Para
que una célula inicie este proceso deberá entre otras cosas, realizar la
duplicación de su material genético. Este hecho involucra efectuar
modificaciones drásticas en la compactación del DNA, y es aquí en donde
16
interviene la participación de proteínas de unión a DNA, para organizar y
mantener la funcionalidad del cromosoma.
En los organismos procariontes, al igual que en los eucariontes, existe
una amplia diversidad de proteínas cromosomales. En E. coli al menos se han
identificado 12 polipéptidos asociados a cromosoma, lo que sugiere que
evolutivamente estos organismos se han valido de diferentes estrategias para
resolver el problema de la nucleación de la cromatina. Hace treinta años, en la
búsqueda de homólogos de histonas eucariontes en bacterias, se encontró la
presencia de proteínas contaminantes en preparaciones de RNA polimerasa de
Escherichia coli (40;41). Posteriormente, una de estas proteínas se caracterizó
como una proteína asociada a cromosoma capaz de condensar DNA in vitro e in
vivo,en una manera similar a las histonas eucariontes. Si bien, no existe
similitud entre las secuencias de las proteínas tipo histonas bacterianas con las
histonas eucariontes, sí comparten la función; es por esto que a una de ellas se
le denominó H-NS (por sus siglas en inglés “Histone-Like Nucleoid Structuring
protein”) (42).
El gen que codifica para la proteína H-NS, se localiza en el minuto 27 del
cromosoma como una unidad transcripcional independiente, entre los genes
galU y tdk de E. coli. hns codifica para una proteína relativamente abundante
(>20,000 moléculas/célula) (43) y pequeña en tamaño, pues sólo consta de 137
aminoácidos (15,500 Daltones) (44). Exhibe un punto isoeléctrico neutro, aunque
17
en su estructura están presentes muchos aminoácidos cargados. H-NS se une a
DNA de un modo independiente de secuencia, tiene una alta afinidad por todos
los tipos de ácidos nucléicos y, sin embargo, se une más fuertemente a DNA de
doble cadena en donde se sabe que H-NS reconoce DNA intrínsecamente curvo
(44). Además, H-NS es capaz de inducir torsiones en la hebra de DNA afectando
su topología, y por ende, la compactación del DNA. Falconi et al., (26),
demostraron que H-NS ejerce un control negativo sobre la expresión
transcripcional de su propio gen y, para ello, H-NS requiere de la presencia de
una región curva río arriba de su promotor.
H-NS es considerado un regulador global, ya que actúa controlando la
expresión de más de 200 genes, algunos de ellos relacionados con la
adaptación a cambios en el medio ambiente (45). Por lo tanto, H-NS no puede
ser considerado un típico regulador transcripcional específico de secuencia. H-
NS siempre actúa reprimiendo la expresión de los genes que regula, sin
embargo, su influencia negativa no sólo está limitada a la transcripción, si no que
también puede actuar inhibiendo la recombinación (46;47). A la fecha, no existen
evidencias claras que manifiesten que H-NS también pueda actuar directamente
como un activador transcripcional (como es el caso de FIS y otros reguladores
con capacidad de regulación dual).
Presumiblemente, la actividad de la proteína H-NS no parece ser
modificada por alguno de los mecanismos comúnmente usados, pues a
diferencia de su parálogo StpA, no está sujeta a degradación proteolítica (48). A
este respecto, no existen evidencias claras de que H-NS se una a un ligando el
18
cual podría actuar alostéricamente y modificar su actividad. Sin embargo, se
tienen reportes donde H-NS se encuentra formando complejos con un lípido de
cadena corta [Poli(R)-3-hidroxibutirato], y a la fecha, no se conoce el significado
biológico de estos complejos (49).
Una mutante en hns muestra varios fenotipos: tiene un crecimiento más
lento que la silvestre, presenta un incremento a la resistencia a bajo pH y a la
alta osmolaridad, exhibe una pérdida en la motilidad, además de presentar
alteraciones en el metabolismo de moléculas de un carbono (45;50-53).
Tanto en E. coli como en Salmonella typhimurium, H-NS participa en la
organización y estructuración del cromosoma bacteriano y, de igual manera en
la regulación de la expresión de genes asociados con la adaptación a
variaciones en el ambiente (41;45). Sin embargo, la función precisa de H-NS en
la fisiología bacteriana aún es desconocida. Algunos estudios in silico realizados
en genomas de otras bacterias, revelaron una conservación en la organización
alrededor de hns, fortaleciendo la idea sobre su función. Precisamente, en
organismos de la familia Pasteurellaceae se encontró que un gen homólogo a
purU de E. coli, se encuentra localizado inmediatamente debajo de hns. purU,
codifica para la enzima formil tetrahidrofolato deformilasa, elemento importante
en el metabolismo de moléculas de un carbono (C. Tendeng, tesis doctoral,
University of Versailles, 2002). De igual manera, sería relevante investigar si la
organización génica de hns en el cromosoma como su función, pudieran estar
relacionadas y, por lo tanto, conservadas en otros genomas bacterianos.
19
En cooperación con la presencia de un segmento de DNA curvo, H-NS
reprime la actividad de su propio promotor
A través de sitios de regulación repartidos corriente arriba a la región
codificante, el gen hns se expresa eficientemente en células de E. coli creciendo
en fase exponencial y se transcribe como un RNA mensajero monocistrónico,
con una vida media aproximada de 1.2 min. H-NS tiene un papel relevante en el
control global de la expresión de una gran cantidad de genes y su expresión está
sujeta a diversos mecanismos de regulación. A la fecha, se conoce que el
promotor se encuentra fuertemente controlado por la acción de tres
mecanismos: uno de ellos, está mediado por variaciones en el medio ambiente
(mecanismo de regulación por “cold shock”), otro es la vía de la auto-represión y,
finalmente, el que ocurre vía la proteína FIS (por sus siglas en inglés: Factor for
Inversion Stimulation). El promotor de hns, uno de los más fuertes en E. coli,
está constituido por los dos elementos estándar: las cajas -10 y -35 (reconocidos
por la subunidad sigma 70 de la RNA polimerasa) los cuales están espaciados
por una región de 17 pares de bases.
20
Figura 4. Mapa de la región que contiene las señales de regulación del
promotor hns.
En la figura se encuentran identificadas: los tres sitios de unión para H-NS
(sitios marcados en rojo) y los siete sitios para FIS (señalados en líneas
discontinuas). Los sitios de unión a H-NS y FIS se obtuvieron mediante
experimentos de protección a DNasa I (“footprinting”). Las letras en negritas
localizadas abajo y hacia la derecha indican: ATG triplete de inicio de la
traducción; GAGA, secuencia Shine-Dalgarno; CCAAT, señal de reconocimiento
para estímulos por baja temperatura (“cold shock”); +1, sitio de inicio de la
transcripción; las cajas -10 y -35 correspondientes al promotor, se muestran
señaladas y subrayadas. Las flechas indican las posiciones de hipersensibilidad
al corte con DNasa I en presencia de la proteína FIS. Los círculos rellenos
representan los sitios importantes para el reconocimiento de la secuencia por la
GCAATACTAAGTCCATGCTCTTATTGCGACTTGTTCTACTTTTCATCATTCGCTTAATAGG
CGTTATGATTCAGGTACGAGAATAACGCTGAACAAGATGAAAAGTAGTAAGCGAATTATCC
GAATTCTCGTAAACACAACTAATACAGAAGACTGAAAGGTCGTCAGCCTACGATAATCTC
CTTAAGAGCATTTGTGTTCATTATGTCTTCAGACTTTCCAGCAGTCGGATGCTATTAGAG
CCCATAAAATGTGACATGAATCAGGAAGTTTTAACCTCACGTGCTGCGAAATCATCGGTG
GGGTATTTTACACTGTACTTAGTCCTTCAAAATTGGAGTGCACGACGCTTTAGTAGCCAC
TAAATAGGGCTATATGCCGCGTCTTTTCTGGCTAATTTTATGAAAAGATATTTATTGGCG
ATTTATCCCGATATACGGCGCAGAAAAGACCGATTAAAATACTTTTCTATAAATAACCGC
GCACAAAATAAAGAACAATTTTGAATTCCTTACATTCCTGGCTATTGCACAACTGAATTT
CGTGTTTTATTTCTTGTTAAAACTTAAGGAATGTAAGGACCGATAACGTGTTGACTTAAA
AAGGCTCTATTATTACCCCAACAAACCACCCCAATATAAGTTTGAGATTACTACAATGAG
TTCCGAGATAATAATGGGGTTGTTTGGTGGGGTTATATTCAAACTCTAATGATGTTACTC
+1
F1F2
H1
-50EcoRl
F3
H2
-100Hgal
F4
H3
Mnll -150Hinfl
F5
-200EcoRl -250
-300Ddel
F7
F6
**
-10
-35
GCAATACTAAGTCCATGCTCTTATTGCGACTTGTTCTACTTTTCATCATTCGCTTAATAGG
CGTTATGATTCAGGTACGAGAATAACGCTGAACAAGATGAAAAGTAGTAAGCGAATTATCC
GAATTCTCGTAAACACAACTAATACAGAAGACTGAAAGGTCGTCAGCCTACGATAATCTC
CTTAAGAGCATTTGTGTTCATTATGTCTTCAGACTTTCCAGCAGTCGGATGCTATTAGAG
CCCATAAAATGTGACATGAATCAGGAAGTTTTAACCTCACGTGCTGCGAAATCATCGGTG
GGGTATTTTACACTGTACTTAGTCCTTCAAAATTGGAGTGCACGACGCTTTAGTAGCCAC
TAAATAGGGCTATATGCCGCGTCTTTTCTGGCTAATTTTATGAAAAGATATTTATTGGCG
ATTTATCCCGATATACGGCGCAGAAAAGACCGATTAAAATACTTTTCTATAAATAACCGC
GCACAAAATAAAGAACAATTTTGAATTCCTTACATTCCTGGCTATTGCACAACTGAATTT
CGTGTTTTATTTCTTGTTAAAACTTAAGGAATGTAAGGACCGATAACGTGTTGACTTAAA
AAGGCTCTATTATTACCCCAACAAACCACCCCAATATAAGTTTGAGATTACTACAATGAG
TTCCGAGATAATAATGGGGTTGTTTGGTGGGGTTATATTCAAACTCTAATGATGTTACTC
+1+1
F1F2 F1F2
H1
-50EcoRl
H1
-50-50EcoRlEcoRl
F3F3F3
H2
-100Hgal
H2
-100-100HgalHgal
F4F4
H3
Mnll -150Hinfl
H3
MnllMnll -150-150HinflHinfl
F5F5
-200EcoRl -250 -200-200EcoRl -250EcoRlEcoRl -250-250
-300Ddel -300-300DdelDdel
F7F7
F6F6
**
-10-10
-35-35
21proteína FIS, los vacíos indican los sitios no involucrados en el reconocimiento
pero que se localizan dentro del consenso. Los asteriscos marcados en verde,
indican el par de nucleótidos sugeridos por el programa MUTACURVE para
mutagenizar la curvatura: el par TT por GC. Figura tomada y modificada de (39).
22
hns es un gen que también se expresa en respuesta a variaciones del medio
ambiente como la temperatura. Es por esta razón que también se le ha
denominado gen de respuesta a estrés frío (“cold shock gene”). Disminuciones
en la temperatura ocasiona que su expresión se incremente aproximadamente
tres veces con respecto a la actividad del promotor cuando la bacteria se
encuentra creciendo a 37oC. Este comportamiento, está influenciado por CspA,
una proteína de unión a DNA, muy abundante en condiciones estándar de
crecimiento, pero que ante un estrés por baja temperatura, incrementa
considerablemente sus niveles (54). La secuencia blanco de CspA, se ubica
dentro de una región de 110 pb. Esta región contiene: las cajas -10 y -35, río
abajo se encuentra un segmento de secuencia constituida por las bases:
CCCCAAT. La presencia consecutiva de los nucleótidos CCCC en esta región,
ocasiona que energéticamente resulte difícil la apertura de la doble cadena para
el proceso de la transcripción. Además de la presencia de esta abrazadera,
existe un probable sitio de unión para CspA (la caja conservada CCAAT).
El control de la transcripción de hns en condiciones estándar de
laboratorio (37oC en medio Luria-Bertani) está fuertemente modulado por la
acción competitiva entre las proteínas H-NS y FIS. Dentro de la región
reguladora existen tres sitios de unión para H-NS y siete sitios para la proteína
FIS (Figura 4). Estudios realizados por Falconi et al., (26) demostraron que H-NS
reprime la expresión de su propio gen a través de la unión a tres sitios ubicados
dentro de la región reguladora. El grado con que H-NS inhibe la transcripción,
23
está vinculado con el estado de crecimiento bacteriano, siendo éste más
pronunciado en etapas intermedias de la fase de crecimiento exponencial. Dos
de estos sitios abarcan de la posición -206 a la -78 (sitios H2 y H3), y el tercero
se encuentra sobrepuesto parcialmente sobre la secuencia del elemento -35
(H1), con respecto al sitio de inicio de la transcripción (26) (Figura 4).
Adicionalmente, experimentos in vivo usando únicamente recortes de la región
de regulación y fusiones transcripcionales al gen cat (cloranfenicol acetil
transferasa) en cepas silvestres y deficientes en hns, demostraron que el control
negativo sobre su promotor depende de la presencia de un elemento de
curvatura estática estratégicamente localizado hacia la posición -150. Este
elemento coincidentemente, se encuentra flanqueado por dos de los sitios de H-
NS (sitios H2 y H3) (26). A la fecha, los datos publicados por Falconi et al., (26)
son la única referencia reconocida y ampliamente citada, acerca de la auto-
regulación negativa del promotor hns mediante curvatura estática.
Antagonizando la acción negativa de H-NS sobre el promotor, se
encuentra FIS. Una proteína relativamente abundante en etapas tempranas del
crecimiento bacteriano y que contribuye a la estructuración del DNA. Dentro de
la región del promotor de hns se han identificado siete sitios de unión para esta
proteína (dos de ellos de muy baja afinidad: F1 y F2) en donde, importantemente
tres de los sitios (F3, F4 y F5) se encuentran sobreponiéndose a los sitios H2 y
H3 (Figura 4). Estos hallazgos, así como ensayos de retraso de banda (EMSA,
por sus siglas en inglés: ensayo de cambio de movilidad electroforética de un
24
fragmento), sugieren una probable interferencia estructural y funcional resultado
de la competencia entre ambas proteínas por los sitios superpuestos
(competencia entre los sitios: H2, H3, y F3, F4 y F5) (39). Los ensayos de
retardo de banda se realizaron con un fragmento de 200 pb conteniendo los
sitios F3, F4, F5, F6, H2 y H3, y al centro el sitio de curvatura tanto en presencia
de ambas proteínas como individualmente. Los experimentos aportaron
importantes evidencias apoyando la idea de que ambas proteínas podrían estar
coexistiendo sobre la misma región donde sus sitios se sobreponen. Estas
observaciones se complementaban con los estudios realizados por Osuna et al.,
y Koch et al., (55;56), quienes reportaron que FIS, a través de su dominio hélice-
vuelta-hélice (HTH), interactúa con el surco mayor del DNA. A diferencia, H-NS
al igual que IHF y HU, podría estar reconociendo el surco menor del DNA. Aún
cuando sus respectivos sitios de unión están parcialmente sobrepuestos, H-NS y
FIS parecen estar uniéndose a lados diferentes de la doble hélice y a la vez,
encontrarse simultáneamente en el mismo segmento de DNA. Además de
reconocer la actividad antagonista de FIS sobre la acción ejercida por H-NS,
algunas evidencias apuntan a que FIS podría actuar como un efector positivo en
ausencia de H-NS (39). Sin embargo, evidencias experimentales mostradas por
el grupo de Dorman Ch. J. (57), cuestionan los datos previamente publicados a
cerca del papel activador de FIS en la expresión del promotor hns. Este grupo,
demostró que la transcripción del promotor está fuertemente vinculada con la
síntesis de DNA. Esto es, cuando en células creciendo activamente se bloquea
la síntesis de DNA, la expresión del gen hns se ve seriamente afectada. De
25
manera contraria, cuando la síntesis de DNA se reestablece, la transcripción se
recupera satisfactoriamente. Sin embargo, no encuentran diferencias
significativas entre el radio de recuperación de la transcripción en células
mutantes de FIS y el fondo genético silvestre. De lo anterior concluyen que la
actividad de FIS no está involucrado (como un regulador transcripcional de tipo
activador) en la recuperación de la transcripción de hns.
26
Objetivo general.
Evaluar el papel global de la curvatura estática del DNA en la regulación
transcripcional en Escherichia coli
Objetivos particulares.
A) Identificar aquellas UT del genoma de Escherichia coli K12 que
presenten una curvatura estática significativa en su región de regulación.
B) Desarrollar programas de cómputo que faciliten la caracterización
experimental de regiones con curvatura estática.
C) Verificar experimentalmente los resultados de la predicción in silico en
algunos ejemplos representativos mediante ensayos de mutación sitio-
específica.
D) Análisis in vivo de la participación de la curvatura en el proceso de
transcripción.
27
Materiales y procedimientos.
Secuencias de DNA, delimitación de regiones regulatorias y cálculo
de curvatura
Basándonos en la base de datos RegulonDB versión 4.0, tomamos las
secuencias río arriba al inicio del primer gen de cada unidad transcripcional del
genoma de E coli K12 (58). Para nuestro estudio, delimitamos una ventana de
400 nucleótidos (nt), la cual comprendió 400 nt río arriba del codón de inicio de
la traducción de cada gen monocistrónico o del gen que inicia a cada operón.
Este grupo de regiones se denominaron MUR´s (por sus siglas en inglés:
Minimal Upstream Region), y su elección estuvo basada en reportes en donde
se describe que la mayoría de la regiones de regulación (>90%) se ubican
dentro de este margen de secuencia (59).
El cálculo de curvatura de cada MUR se realizó usando el algoritmo
BEND (60) y las matrices de contribución de rotación y traslación derivadas de
las periodicidades de secuencia de DNA (16). Entre las matrices de contribución
publicadas, elegimos la matriz de trímeros del modelo de posición de
nucleosoma de Satchwell,S.C et al., (16) debido a que ésta predice de manera
más acertada el valor de curvatura. Los cálculos de curvatura se hicieron como a
continuación se detalla: el programa BEND se basa en el modelo de los vecinos
más cercanos, el cual asume, que la curvatura de DNA es el resultado de la
acumulación sucesiva del desplazamiento rotacionaly espacial entre pares de
28
bases. El programa asigna un valor de curvatura a cada nucleótido expresado
como el ángulo de desviación del eje por cada vuelta de hélice. El valor de
curvatura máxima se determina calculando el ángulo promedio de los vectores
normales en una ventana de 31 pares de bases (tres vueltas hélice) y
asignándolo al nucleótido central (60). Para fines de uso práctico, al programa
BEND se le realizaron algunas modificaciones: se incrementó la capacidad de
análisis del algoritmo; esto es, que en lugar de analizar una secuencia pequeña
(500 nt), ahora posee la capacidad estudiar un genoma completo.
Análisis estadístico de las regiones de regulación con DNA curvo
sobre-representadas en los regulones de E. coli
En la secuencia completa de cada MUR se evaluó la presencia de DNA
curvo. Una región de regulación se consideró ser potencialmente regulada
mediante DNA curvo si su máximo valor de curvatura se ubicaba por arriba de
10 grados/vuelta de hélice. Este valor de corte se eligió con base a que es el
valor mínimo de curvatura cuyo efecto sobre la regulación y su migración
electroforética anómala ha sido demostrado experimentalmente (26). Con base a
la información experimental contenida en la base de datos de RegulónDB, las
unidades transcripcionales se distribuyeron en grupos de regulones con respecto
a las proteínas que regulan su transcripción. Aquellas UT multi-reguladas fueron
agrupados en diferentes regulones con base a las proteínas involucradas en su
regulación transcripcional. Con esta información, determinamos la tendencia
estadística significativa de que un cierto grupo de UT sean potencialmente
29
regulados por curvatura estática. Debido a que el universo de datos a analizar,
contiene familias de regulones en donde la población contenida en cada uno de
los subconjuntos difiere entre sí, decidimos evaluar nuestros datos asumiendo
que exhiben una distribución hipergeométrica.
Construcción de las fusiones transcripcionales al gen cloranfenicol acetil
transferasa (cat).
Con la intención de respaldar los resultados de nuestro análisis de
cómputo, elegimos las siguientes unidades transcripcionales: pyrC, argCBH, y
aroG, como ejemplos representativos de tres de los regulones más significativos
de nuestro estudio estadístico.
Para realizar las construcciones transcripcionales, amplificamos las
MUR´s mediante la técnica de PCR (por sus siglas en inglés: polymerase chain
reaction) y utilizando la enzima polimerasa Taq Gold (Applied Biosystems). Los
oligonucleótidos usados se diseñaron para introducir los sitios de restricción
BamHI-HindIII a los extremos 5´ y 3´ respectivamente, de los productos
amplificados. Los fragmentos se cortaron con las enzimas mencionadas y se
clonaron dentro del plásmido pKK232-8 (Pharmacia Biotech) previamente
digerido, el cual contiene al gen reportero cat y sin su promotor. La ligación se
realizó con la enzima T4 DNA ligasa (Promega), en una proporción 1:3
(vector:inserto) a 16oC durante toda la noche. Los nombres asignados a estos
plásmidos fueron: pKK2-pyrC, pKK2-argCBH y pKK2-aroG y pkk2-hns. Todas
las construcciones se secuenciaron usando el estuche comercial: Termo
30
Sequenase (Amersham, Inc), el cual se basa en el uso de terminadores (dideoxi-
nucleótidos). Todos los oligonucleótidos empleados, se solicitaron a la Unidad
de Síntesis del IBT/UNAM y se presentan en la Tabla 1.
Unidades de
transcripción
correspondientes a
Oligonucleótidos usados para amplificar
y clonar las regiones regulatorias
(5´ a 3´)
ptsHI-crr Fw aaaaggatccaagaattgcaacagtaatgccagcRev aaaaaagcttcattgtatttccccaacttatagc
aroG Fw aaaaggatccctccgctatcggcagccagtgcggRev aaaaaagcttgtctgttccagtgttgccatacttatctt
argD Fw aaaaggatccgcaatggcgcaggcatttggcggtaRev aaaaaagcttctcatgatcaccctgttacgcataaaca
argCBH Fw aaaaggatcctatcggtatgccccgccagcaacaagRev aaaaaagcttaggggctattcaccttcttatgtctgg
purC Fw aaaaggatcctgtctgacagcgactggcaggaactgRev aaaaaagcttctttatcactcctgggtgtgaattaacg
purHD Fw aaaaggatccgaatttcaggatttttctcttcaaccgaacRev aaaaaagcttggtaaatcccctggatttgactattacag
pyrC Fw aaaaggatcctcagaaagcgaccatgaaactgaagctgRev aaaaaagctttaatctctatgctccggctgaagggat
livKHMG Fw aaaaggatccagtggaaccagtgtagcgaaataaRev aaaaaagcttagtcgaaaatccccattcgtgatc
hns Fw: aaaaggatcccctgttgcgcaagtaatagccctctgRev: aaaaaagctttgtagtaatctcaaacttatattggggtgg
Oligonucleótidos usados en la
mutagénesis sitio dirigida
(5´ a 3´)
aroGm Fw: gtttttcgcgacaaGctggcgttGttcttgctaattccRev: ggaattagcaagaaCaacgccagCttgtcgcgaaaaac
argCBHm Fw: gagcgcggtaaatctAgataCatggcggtaatttgRev: caaattaccgccatGtatcTagatttaccgcgctc
pyrCm Fw gccagggcgaagcaatggAgaaaCaactggcgaaaggcattgRev: caatgcctttcgccagttGtttcTccattgcttcgccctggc
Tabla 1. Oligonucleótidos usados en este estudio. Las letras minúsculas y en
negritas señaladas en cada uno de los oligonucleótidos usados para el estudio
de amplificación y clonación de cada una de las RR, describen la secuencia con
la que el iniciador alinea en el DNA. Las letras en mayúsculas y en negritas
indicadas sobre la secuencia de los iniciadores utilizados para el ensayo de
mutagénesis específica de sitio, indican los cambios realizados y sugeridos por
el programa MUTACURVE.
31
Cepas bacterianas, plásmidos y medio de cultivo
Utilizamos la cepa de Escherichia coli JM01, tanto para amplificar las
regiones regulatorias (MUR´s) para nuestro estudio (usando el DNA cromosomal
como molde), como para la determinación de la actividad de la enzima:
cloranfenicol acetil transferasa (CAT). Para la construcción de las diferentes
fusiones transcripcionales silvestres y mutantes, utilizamos la cepa de
Escherichia coli DH5_ (para más detalles revisar la Tabla 2). El DNA
cromosomal de la cepa MC4100 (silvestre) fue empleada como molde para
amplificar la región reguladora de hns. Las cepa MC4100 (silvestre) y sus
derivadas: PC, EM185, EM184 se utilizaron para la determinación de la actividad
de la enzima: cloranfenicol acetil-transferasa bajo el promotor de hns, y las
determinaciones, se llevaron a cabo bajo las condiciones reportadas por Falconi
et al., (1993) (26).
Para el crecimiento de las cepas, se usó el medio de Luria-Bertani o el
medio mínimo M9 suplementado con 0.2% de glucosa, 2 µg/mL de tiamina y,
con/sin, 0.2% de un hidrolizado de caseína (61). Para los ensayos de CAT, las
bacterias se crecieron en el medio mínimo M9, suplementado con un exceso de
la molécula co-represora correspondiente en cada caso. Para la construcción:
pKK2-pyrC, el medio se suplementó con adenina (exceso de purinas), a una
concentración final de 140 µg/mL. Para la cepa transformada con el plásmido:
pKK2-argC, se adicionó L-arginina a una concentración final de 1 mM. En las
transformantes con la construcción: pKK2-aroG, se adicionó L-triptofano y L-
fenilalanina, cada uno a una concentración final de 1 mM. Todas las cepas se
32
crecieron con el antibiótico de selección, ampicilina, a una concentración final de
200 µg/mL.
Tabla 2. Cepas y plásmidos usados en este estudio
Cepas/
plásmidos Características relevantes Fuente o referencia
Cepas
E. coli K12
JM101
F’ traD36 lacIq _(lacZ)M15 proA+B+/supE thi _(lac-
proAB)
(62)
E. coli K12
DH5_
F-_80lacZ_M15 _(lacZYA-argF) U169 endA1 recA1
hsdR17 (rk-,mk+) supE44 thi-1 gyrA96 relA1 phoA
Lab. J.L. Puente/Edmundo
Calva
E. coli K12
MC4100
F- araD139 _(argF-lac) U169 rpsL150 (Strr) relA1
flb5301 deoC1 ptsF25 rbsR (62)
PC Cepa derivada de la MC4100 con un casete dekanamicina sustituyendo el gen hns.
Lab. J.L. Puente/Edmundo
Calva
EM185 Cepa derivada de la MC4100 con un casete dekanamicina sustituyendo el gen fis. Este trabajo
EM184
Cepa derivada de la PC. A esta cepa se le sustrajo el
casete de kanamicina, además de que el gen fis se
reemplazó por el mismo casete.
Este trabajo
Plásmidos
pKK232-8 Plásmido para la construcción de fusionestranscripcionales al gen cat, AmpR. Amersham Inc.
pKK2-aroG Derivado del pKK232-8 conteniendo la región -359 a
+41 pb de aroG entre los sitios BamHI-HindIII
Este trabajopKK2-argC Derivado del pKK232-8 conteniendo la región -284 a
+116 de argC entre los sitios BamHI-HindIII
Este trabajo
pKK2-pyrC Derivado del pKK232-8 conteniendo la región -362 a
+38 de pyrC entre los sitios BamHI-HindIII
Este trabajo
pKK-hns Derivado del pKK232-8 conteniendo la región -364 a+36 de hns entre los sitios BamHI-HindIII Este trabajo
33
Mutagénesis sitio-dirigida
Para realizar los cambios puntuales en la región de máxima curvatura de
cada una de las construcciones, nos basamos en el protocolo comercial: “Quick-
Change” (Stratagene) al cual se le hicieron algunas modificaciones. De manera
breve el procedimiento fue el siguiente: se realizó un PCR inverso utilizando un
par de oligonucleótidos complementarios, los cuales fueron sintetizados con los
cambios sugeridos en nuestro análisis de cómputo de todas las posibles dobles
mutantes (para detalles, ver la descripción de nuestro servidor web
MUTACURVE en la sección de Resultados). Como DNA molde se utilizaron
cada una de las fusiones transcripcionales silvestres y la polimerasa Vent (New
England Biolabs) para la amplificación. Al término de la reacción de PCR, el
DNA molde se digirió con la enzima DpnI (NEB) durante 1 hora a 37°C para
eliminar el DNA templado. Una fracción de la reacción resultante, la cual lleva el
plásmido “mutante” sintetizado, se utilizó para transformar mediante
electroporación células de la cepa E. coli DH5_. Los cambios se verificaron por
secuenciación en cada una de las construcciones mutantes.
Construcción de las cepas: EM185 y EM184 por recombinación homóloga.
Las cepas f i s y hns fis se obtuvieron mediante el método de
recombinación homóloga publicado por Datsenko, K. y Wanner, B.L. (2000) (63).
Básicamente el procedimiento se fundamenta en tratar de reemplazar una
secuencia del cromosoma con un gen de resistencia a un antibiótico utilizando el
sistema de recombinación lambda Red (_ Red). El gen de resistencia (que en
34
nuestro caso fue el de resistencia a kanamicina) es generado por PCR utilizando
un par de iniciadores (P1 y P2), cada uno conteniendo una extensión de 36
nucleótidos homólogos a la región del cromosoma que se desea reemplazar (H1
y H2) (Figura 5). Este producto de PCR es transformado en la cepa a
mutagenizar la cual previamente se ha transformado con el vector plasmídico
que porta el sistema _ Red (plásmido pKD46). Posteriormente, se realiza la
selección de transformantes mediante resistencia al antibiótico, además de
verificar que las bacterias hayan perdido el plásmido pKD46, un vector que
posee un origen de replicación sensible a temperatura y que fácilmente se
puede eliminar incrementando la temperatura de incubación.
Cabe mencionar, que existen dos versiones de vectores descritos para esta
metodología que codifican genes de resistencia para cloranfenicol y kanamicina
[plásmidos: pKD3 y pKD4 respectivamente]. La dificultad que representaba usar
el gen de resistencia a cloranfenicol en la cepa PC para obtener la doble
mutante: hns::km-fis::cat, obedecía a que esta cepa posteriormente la
emplearíamos para transformarla con las fusiones transcripcionales al gen cat,
razón por la cual nos fue impráctico usar el gen de resistencia a cloranfenicol
para reemplazar el gen fis. De esta manera, para la obtención de la EM184 se
realizó un paso adicional (paso 4, Figura 5) y que a continuación de manera
breve se describe.
35
Figura 5. Esquema del proceso para la eliminación de una región en el
cromosoma usando el sistema de recombinación _ Red.
Gen A Gen B Gen C
H1 H2
Paso 1. Amplificación del g en de 
kanamicina (el casete está flanqueado 
por las secuencias FRT y la región 
homóloga a reemplazar).
H1
Gen-kanamicinaFRT FRT
H2
Gen A Gen C
Gen-kanamicina
FRTFRT
Paso 2. Transformación de la cepa con el 
sistema 
ë Red
.
Paso 3. Selección de transformantes 
resistentes a kanamicina.
Paso 4. Eliminación del gen de 
resistencia usando una recombinasa que 
reconoce los sitios FRT.
Gen A Gen C
FRT
Gen A Gen B Gen C
H1 H2
Gen A Gen B Gen C
H1 H2
Paso 1. Amplificación del g en de 
kanamicina (el casete está flanqueado 
por las secuencias FRT y la región 
homóloga a reemplazar).
H1
Gen-kanamicinaFRT FRT
H2
H1
Gen-kanamicinaFRT FRT
H2
Gen A Gen C
Gen-kanamicina
FRTFRT
Gen A Gen C
Gen-kanamicina
FRTFRT
Paso 2. Transformación de la cepa con el 
sistema 
ë Red
.
Paso 3. Selección de transformantes 
resistentes a kanamicina.
Paso 4. Eliminación del gen de 
resistencia usando una recombinasa que 
reconoce los sitios FRT.
Gen A Gen C
FRT
Gen A Gen C
FRT
36
La primera fase consistió en remover de la cepa PC (MC4100 hns::kanamicina),
el gen que codifica para la resistencia de kanamicina, la cual se encuentra
reemplazando al gen hns. Para esto, aprovechamos que la secuencia del gen se
encuentra flanqueada por los sitios FRT, los cuales son específicamente
reconocidos por la recombinasa FLP. Para ello, la cepa PC la transformamos
con el vector pCP20 e incubamos en presencia del inductor arabinosa (debido a
que la recombinasa FLP se encuentra bajo la expresión del promotor de
arabinosa). Debido a que el replicón (al igual que el plásmido pKD46), posee un
origen de replicación sensible a temperatura, el plásmido pCP20 puede
eliminarse fácilmente si las bacterias se incuban a una mayor temperatura.
Seguidamente, comprobamos el fenotipo de la cepa hns, ahora kanamicina y
ampicilina sensible, (este último por la pérdida del pCP20). Una vez alcanzada la
primera fase, se procedió a interrumpir el gen fis siguiendo la estrategia
previamente descrita.
Análisis de curvatura de fragmentos de DNA, mediante ensayos de cambio
de movilidad electroforética a baja temperatura
Para cada unidad transcripcional estudiada, amplificamos mediante PCR,
un fragmento de 400 pb de la fusión silvestre (conteniendo DNA curvo) y su
correspondiente fragmento no-curvo de la construcción mutagenizada. Estos
fragmentos de DNA se sometieron a electroforesis en geles nativos de
poliacrilamida a baja temperatura (4oC), con el propósito de evidenciar
37
diferencias en su movilidad electroforética. Los ensayos de electroforesis a baja
temperatura se llevaron a cabo de acuerdo a datos publicados por Falconi et al.,
(64). De manera breve el protocolo consiste en lo siguiente: las muestras se
separaron en geles de poliacrilamida al 8% y 1.5 mm de espesor (30.0:0.8
acrilamida:bis-acrilamida) en regulador TBE (90 mM Tris-HCl, 90 mM H3BO3, 2.5
mM Na2EDTA, pH 8.6), a 70 volts durante 36 horas a 4°C. Como controles,
utilizamos tanto un marcador de peso molecular comercial previamente
caracterizado como DNA no-curvo (100 Base Pair Ladder, Amersham Inc.),
además de un fragmento no-curvo del gen de lacZ de 400pb. Los geles se
tiñeron con bromuro de etidio y se fotografiaron en un sistema de imágenes
Alpha Imager (Alpha Innotech).
Ensayos de actividad de CAT
La determinación de la actividad de CAT de las fusiones transcripcionales
al gen reportero cat se realizó como se describe en Puente et al., (65). Las
cepas transformadas con los plásmidos de las fusiones, se cultivaron en 50 mL
de LB con ampicilina (200 µg/mL) en un baño agitado durante toda la noche. Los
cultivos se lavaron y se resuspendieron en medio mínimo M9 a una DO600=1.0.
Posteriormente, 1 mL de cada uno de los inóculos ajustados, se adicionó a 50
mL de medio mínimo M9 suplementado y con un exceso, o en ausencia del co-
represor: adenina, arginina, o fenilalanina/triptofano. Los cultivos se incubaron a
37oC en agitación a 200 rpm. La curva de crecimiento bacteriano para cada
38
ensayo se determinó por densitometría a 600 nm y se tomaron alícuotas de 1
mL para la determinación de la actividad de cloranfenicol acetil transferasa.
Las muestras colectadas se centrifugaron (16 000 x g) y se lavaron en 1
mL de la solución amortiguadora: TDTT (50mM Tris-HCl, pH 7.8, y 30 mM DL-
dithiothreitol). Posteriormente, la pastilla celular se resuspendió en 500 µL de
TDTTy se sonicó sobre un baño frío (4oC) hasta que la suspensión se
clarificara. Los restos celulares y bacterias sin romper, fueron removidas por
centrifugación (16 000 x g) durante 15 minutos a 4oC. Posteriormente, los
sobrenadantes fueron transferidos a tubos limpios.
Para el ensayo de CAT, se tomaron 5 µl de cada uno de los extractos y se
colocaron por duplicado en una placa de 96 pozos. A cada extracto, se le
adicionó 200 µL de la siguiente mezcla de reacción: 1mM DNTB [5,5-dithio-bis(2
nitrobenzoic acid, Research Organics)]/0.1 mM acetil-CoA (Pharmacia
Biotech)/0.1 mM cloranfenicol (Sigma Chemical) en 0.1 M Tris-HCl, pH 7.8. La
actividad se determinó usando un lector de microplacas computarizado tipo
Ceres 900 y el programa KC3 (Bio-Tek Instruments).
La concentración de proteínas de los extractos celulares usados para el
ensayo de actividad de CAT, se determinó usando un estuche comercial BCA
(Pierce). La actividad específica de CAT se determinó dividiendo la actividad
obtenida entre la concentración de proteína de cada extracto y se expresó como:
39
µmol/mg/min. Cada valor, representa la actividad promedio obtenida de al
menos tres experimentos con sus correspondientes duplicados y realizados de
manera independiente.
Mapeo del punto máximo de curvatura dentro de la región promotora de
hns.
Básicamente, empleamos fragmentos de 150 nucleótidos de longitud,
desplazados 25 nt cada uno, para cubrir la región de 400 pares de bases de la
región de regulación de hns (ver Figura 14 en la sección de Resultados). La
Tabla 3 muestra los pares de iniciadores utilizados. Posteriormente los
fragmentos se sometieron a electroforesis en geles nativos de poliacrilamida a
baja temperatura (ver la sección de Materiales y procedimientos del capítulo
I).
Tabla 3
No. fragmento/posición
Oligonucleótidos usados para
amplificar fragmentos de 150 pb de
la región de hns
(5´ a 3´)
1/-365 a -215 Fw cctgttgcgcaagtaatagccctctRev tgacgacctttcagtcttctgtatt
2/-340 a -190 Fw gttgacctccaggagatagtgcaatRev attttatggggagattatcgtaggc
3/-315 a -165 Fw actaagtccatgctcttattgcgacRev gttaaaacttcctgattcatgtcac
4/-290 a -140 Fw tgttctacttttcatcattcgcttaatagRev caccgatgatttcgcagcacgtgag
5/-265 a -115 Fw atagggaattctcgtaaacacaactRev agacgcggcatatagccctattta
6/-240 a -90 Fw aatacagaagactgaaaggtcgtcaRev tatcttttcataaaattagccagaaaag
7/-215 a -65 Fw gcctacgataatctccccataaaatRev ttctttattttgtgccgccaataaata
40
8/-190 a -40 Fw gtgacatgaatcaggaagttttaacRev caggaatgtaaggaattcaaaattgt
9/-165 a -15 Fw: ctcacgtgctgcgaaatcatcggRev: gccttaaattcagttgtgcaatagc
10/-145 a -5 Fw: cggtgtaaatagggctatatgccRev: tttgttgaggtaataatagagccttaaa
11/-120 a +31 Fw: gtcttttctggctaattttatgaaaRev: taatctcaaacttatattggggtgg
Tabla 3. Iniciadores usados en los ensayos de permutación circular.
La movilidad relativa se obtuvo del cociente:
Movilidad relativa= Peso real del fragmentoPeso aparente del fragmento manifestado 
en el ensayo de electroforesis
Movilidad relativa= Peso real del fragmentoPeso aparente del fragmento manifestado 
en el ensayo de electroforesis
41
Resultados.
Análisis teórico del papel de la curvatura estática en el genoma de
Escherichia coli
De los 638 UT´s de E. coli caracterizadas experimentalmente según la
base de datos RegulonDB versión 4.0 (58), tomamos los primeros 400
nucleótidos (nt) que preceden al codón de inicio de cada gen u operón. A cada
una de las secuencias, se le determinó su perfil de curvatura utilizando una
versión modificada del algoritmo BEND desarrollado por Goodsell y Dickerson
(60). Para identificar regiones curvas que pudieran tener un efecto sobre la
transcripción, el valor máximo de curvatura de cada secuencia se registró y
comparó con un valor de corte pre-establecido. Nosotros seleccionamos este
valor de corte en 10 grados/vuelta-hélice, ya que representaba el valor más
pequeño registrado en la literatura, el cual presenta una movilidad electroforética
anómala además de estar involucrada en los mecanismos de regulación
negativa de su correspondiente promotor (26). Este valor de corte corresponde a
la magnitud del elemento curvo encontrado en la región de regulación del gen
hns. Adicionalmente, nuestro valor de corte se ubica a 2.9 DS (desviación
estandar) de la media geométrica determinada para la curvatura del genoma de
E. coli: 4.01 grados/vuelta-hélice (Fig. 6). Por lo tanto, todas las unidades
transcripcionales cuyos valores de curvatura se establecieran por arriba de 10
grados/vuelta de hélice, se consideraron regiones potencialmente reguladas
mediante elementos de curvatura.
42
Figura 6. Perfil de curvatura del genoma de Escherichia coli.
La magnitud de curvatura se evaluó para cada una de las 4,639,675
pares de bases de el genoma de E. coli K12, utilizando una versión modificada
del algoritmo BEND (60) y las matrices numéricas de contribución de rotación y
traslación de Satchwell et al., (16). Estos valores se representaron en barras
dentro de un histograma con dimensiones de 0.33 grados/vuelta-hélice. Las
frecuencias se normalizaron y se expresaron como un porcentaje del tamaño del
genoma. El cuadro de la derecha en gris, representa el área del histograma con
valores de curvatura mayores al valor de corte establecido (10 grados/vuelta-
hélice). Las regiones de regulación caracterizadas en este estudio están
ubicados de acuerdo a sus valores de curvatura en sus regiones de regulación.
Como una referencia, también incluimos el operón mtlADR, el cual presenta el
mayor grado de curvatura en su región de regulación (14.3 grados/vuelta-hélice).
El análisis teórico reveló que 225 de los 638 UT (35%) presentaron
valores de curvatura significativos en su región reguladora. De estos datos,
0
1
2
3
4
5
6
7
0
0.
3
0.
7 1
1.
4
1.
7 2
2.
4
2.
7 3
3.
4
3.
7
4.
1
4.
4
4.
7
5.
1
5.
4
5.
8
6.
1
6.
4
6.
8
7.
1
7.
5
7.
8
8.
1
8.
5
8.
8
9.
1
9.
5
9.
8
10
.2
10
.5
10
.8
11
.2
11
.5
11
.9
12
.2
12
.5
12
.9
13
.2
13
.5
13
.9
14
.2
14
.6
14
.9
Curvatura (grados/vuelta hélice)
Fr
ec
ue
nc
ia
 (%
 d
e 
D
N
A
)
aroG
argCBH
pyrC
mtlADR
0
1
2
3
4
5
6
7
0
0.
3
0.
7 1
1.
4
1.
7 2
2.
4
2.
7 3
3.
4
3.
7
4.
1
4.
4
4.
7
5.
1
5.
4
5.
8
6.
1
6.
4
6.
8
7.
1
7.
5
7.
8
8.
1
8.
5
8.
8
9.
1
9.
5
9.
8
10
.2
10
.5
10
.8
11
.2
11
.5
11
.9
12
.2
12
.5
12
.9
13
.2
13
.5
13
.9
14
.2
14
.6
14
.9
Curvatura (grados/vuelta hélice)
Fr
ec
ue
nc
ia
 (%
 d
e 
D
N
A
)
aroG
argCBH
pyrC
mtlADR
43
conformamos una lista de todas las RR cuya regulación transcripcional podría
estar asociada a curvatura estát ica. En la página web:
http://www.ibt.unam.mx/biocomputo/dna_curvature.html, enlistamos estas RR además
de mostrar el perfil de curvatura correspondiente a cada unidad transcripcional.
En la figura 7 se muestra la página principal de nuestro estudio de curvatura, la
cual contiene las ligas de acceso tanto a la lista de genes y operones arriba
mencionada, como al servidor web MUTACURVE.
La unidad transcripcional con el mayor grado de curvatura fue el operón
involucrado con la incorporación de manitol: mtlADR con un segmento curvo de
14.3 grados/vuelta-hélice. Este valor resultó ser el más significativo ya que se
ubicó a más de 5 DS´s de la media genómica de curvatura de E. coli (Fig. 6).
Identificación de familias de regulones con un número significativo de UT
potencialmente regulados por curvatura estática.
Del resultado del análisis teórico, agrupamos en familias de regulones,
(con respecto a su correspondiente regulador), las regiones reguladoras con un
valor máximo de curvatura superior a nuestro valor de corte. Esto sugirió, que
ciertos UT pertenecientes a un determinado regulón, podrían estar
potencialmente siendo regulados por curvatura. Para identificar una posible
correlación de que un cierto grupo de UT se regule por curvatura estática,
agrupamos las 638 UT en 81 diferentes regulones. Aquellas UT multi-reguladas,
se incluyeron tantas veces, como el número deproteínas reguladoras estuvieran
involucradas en su regulación transcripcional. El significado estadístico de la
44
distribución de estas regiones curvas en los diferentes regulones se evaluó
asumiendo una distribución hipergeométrica (tal como lo hemos justificado en la
sección de Materiales y Métodos, página 29) de las señales de curvatura
(Tabla 4).
45
Regulona Cur/Totb
Unidades transcripcionales con DNA curvo en su
región de regulaciónc FT
d Ref. e
ArcA 6/16 icdA (11.5, _), cydAB (11.1, +), hyaABCDEF (10.9,+),betT (10.8, _), glpABC (10.3, _), gltA (10.1, _) G
CRP 28/63
ptsHI_crr (14.1, ±), malS (13.3, +), ubiG (12.8, +),
glgCAP (12.6, +), fixABCX (12.3, +), glpFK (11.7, +),
cyaA (11.7, _), proP (11.6, _), glnALG (11.4, +),
nagBACD (11.2, +), tsx (11.2, ±), tdcABC_yhaQ_tdcDE
(11.1, +), nagE (11.1, +), ompA (10.9, _), fucAO (10.8,
+), ppiA (10.7, ±), fucPIKUR (10.6, +), deoCABD (10.6,
+), srlABDR_gutM_srlE (10.5, +), fadL (10.3, _), udp
(10.3,+), cpdB (10.3, +), glpABC (10.3, +), araE (10.2,
+), glpTQ (10.1, +), gltA (10.1, +),
araFG_b1899_b1898(10.0+), rpoS (10. binding)
G (66)
FIS 9/24
b3796_b3797_b3798_b3799 (12.6, +), b0216 (12.4, +),
b1032 (11.6, +), b0743_b0744_b0745 (11.0, +), b0971
(11.0, +), b3171_nusA_infB (10.6, +),
b0670_b0666_b0665_b0664_b0668_b0673_b0672
(10.2, +) b2396_b2397 (10.2, +) fis_yhdG (9.0, _)
G
FNR 7/17
icdA (11.5, _), cydAB (11.1, _), frdABCD (10.9, +),
hypABCDE (10.5, +), glpABC (10.3, +), nirBDcysG
(10.2, +), fnr (10.0, _)
G
Hns 4/4 rcsA (13.3, _), stpA (11.4, _), hns (10.4, _), fliZ_fliY(10.3, +) G (26)
IHF 8/19
carAB (12.1, ±), hycABCDEFGH (11.9, +), ompC (11.9,
_), himA (11.2, _), tdcABC_yhaQ_tdcDE (11.1, +),
dppABCDF (10.6, binding), hypACBDEF (10.5, +),
himD (10.4, _)
G (23)
Lrp 7/14
lrp (12.9, _), gcvTHP (12.1, +), livKHMG (12.0, _),
ompC (11.9, _), serA (11.5, +), stpA (11.4, +), lysU
(10.1, _)
G
ArgR 6/7 argCBH (13.0, _), argE (12.9,_), argD (12.5, _), argI(10.1,_), argF (10.0, _), argR (10.0, _) E
CytR 4/6 tsx (11.2, ±), ppiA (10.7, _), deoCABD (10.6, _), udp(10.3, _) E
FruR 5/7 ptsHI (14.1, ±), icdA (11.5, +), ppsA (10.4, +), pykF(10.3, _), fruBAK (10.0, _) E
PurR 6/17 purC (13.5, _), purHD (12.7, _), gcvTHP (12.1, _), pyrC(11.4, _), purR (10.4, _), codBA (10.4, _) E
TyrR 4/8 aroG (13.6, _), tyrB (10.6, _), tyrP (10.1, ±), tyrR (9.3, _) E
Tabla 4. Identificación de las principales familias de regulones cuyos
miembros poseen elementos de curvatura en su región de regulación.
46
Tabla 4.
a La descripción de las proteínas reguladoras correspondientes a cada regulón,
es de acuerdo a Martinez-Antonio y Collado-Vides (67) y es como sigue: ArcA:
regulador de la respiración aeróbica. CRP: regulador transcripcional dual de
unión a DNA de una gran número de genes catabólicos, proteína activadora de
catabolito CAP, proteína receptora de AMP cíclico. FIS: proteína de unión a DNA
para sitios específicos de recombinación, transcripción de operones de rRNA y
tRNA y de replicación. FNR: regulador transcripcional de respiración aeróbica,
anaeróbica y balance osmótico. H-NS: regulador transcripcional dual de unión a
DNA. IHF: regulador transcripcional dual de unión a DNA que introduce
plegamientos en el DNA. Lrp: regulador transcripcional para el regulón de
leucina y el sistema de transporte de aminoácidos ramificados. ArgR: regulador
de la síntesis de arginina. CytR: regulador transcripcional dual de unión a DNA
para el catabolismo y reciclamiento de nucleósidos. FruR: represor
transcripcional del regulón de la utilización de fructosa. PurR: regulador de
genes involucrados en el metabolismo de purinas. TyrR: regulador
transcripcional dual involucrado en el metabolismo de aminoácidos aromáticos.
b La columna denota la relación de UT cuyo valor de curvatura se ubicó igual o
por arriba al valor de corte, con respecto al total de UT contenidas en cada
regulón.
c se consideraron aquellos genes y operones con regiones de regulación con
curvatura mayor que 10 grados/vuelta-hélice. También se incluyeron, aquellos
que se auto-regulan transcripcionalmente y cuya magnitud de curvatura supera
los 9 grados/vuelta-hélice. Estos están indicados en negritas. Los signos: (+), (-),
(±); indican el tipo de regulación: activación, represión, y actividad dual,
respectivamente.
d Tipo de factor transcripcional: G: factor transcripcional global; E: factor
transcripcional específico.
e Indica que sólo para tres UT contenidas en la tabla, existen reportes en donde
se ha relacionado al DNA curvo con el proceso de transcripción.
Nuestros datos indicaron que 12 de los 81 regulones presentaron valores
de p más pequeños que 0.1. Estos grupos se consideraron estar potencialmente
regulados por DNA curvo y corresponden tanto a regulones globales (ArcA,
CRP, FIS, HNS, FNR, IHF y Lrp) así como a regulones específicos (ArgR, CytR,
FruR, PurR y TyrR), (Tabla 4).
47
Construcción de un servidor web para la caracterización estructural de
regiones curvas de DNA
N o s o t r o s d e s a r r o l l a m o s u n s e r v i d o r w e b
(http://www.ibt.unam.mx/biocomputo/dna_curvature.html) que permite identificar
elementos importantes en una región curva, así como promover cambios
puntuales para reducirla. Aquí se encuentra la liga de acceso al programa
MUTACURVE así como el acceso a la lista de los genes y operones curvos
encontrados en nuestro estudio. La figura 8 muestra el ejemplo de una
secuencia que se desea analizar. Posteriormente, el programa envía una hoja
de salida (Figura 9) en donde muestra lo siguiente: a) la posición y la magnitud
del punto máximo de curvatura que localizó dentro de la secuencia; b) un
segmento de la secuencia en donde encontró ubicado el punto máximo de
curvatura; c) una tabla de todos los posibles dobles cambios para reducirla y la
magnitud de la curvatura resultante en cada caso; d) a la derecha, muestra las
ligas de acceso a todos los perfiles de curvatura tanto de la secuencia silvestre
como de la mutagenizada, correspondiente a cada doble mutación sugerida por
MUTACURVE (Figura 10).
Este servidor, mediante el algoritmo de Goodsell y Dickerson (60) y las
matrices de contribución rotacional y traslacional de Satchwell et al.,(16), evalúa
la amplitud de curvatura en cada nucleótido de la secuencia. Después de
localizar y centrar el valor máximo de curvatura, el servidor evalúa el efecto de
48
Figura 7. Carátula de la página web.
Figura 8. Página de acceso de los datos para el servidor MUTACURVE.
49
Figura 9. Página de salida de resultados.
Figura 10. Gráfico del perfil de curvatura de una secuencia. Los histogramas
representados por las líneas verde y roja, corresponden al perfil de curvatura de
la secuencia silvestre y mutagenizada, respectivamente.
50
cada doble mutación puntual que va realizando sobre una ventana de 31
nucleótidos (tres vueltas de hélice). El programa muestra todos los posibles
cambios que reducen la curvatura, para después, elegir aquellos cambios que
producen una disminución significativa en la curvatura en un segmento dado de
DNA (Figuras 9 y 11B). Finalmente, el programa genera los perfiles de curvatura
tanto de la secuencia original como de la secuencia con los cambios
seleccionados (Figuras 10 y 11A).
MUTACURVE es la primera herramienta descrita que permite realizar
predicciones de cambios en una secuencia y modificar su estructura. Por lo que
consideramos de gran aporte para el estudio de la contribución de la estructura
en diversos escenarios biológicos.
51
Figura 11. Uso del programa MUTACURVE, para predecir mutaciones
puntuales que disminuyen el grado de curvatura.
Figura 11(A). Se calculó el valor de curvatura de cada nucleótido de una
secuencia dada (en el ejemplo mostramos la región de regulación de aroG) y
con los datos, se realizó un gráfico de la región analizada (línea negra). Se
utilizó una ventana de 31 pares de bases que contuviera al centro, la región con
el valor máximo de curvatura detectado. Posteriormente, el programa evalúa los
doblescambios que podrían reducir significativamente la magnitud de curvatura
del fragmento. Los cambios seleccionados, se introducen en la secuencia
original obteniéndose un nuevo perfil de curvatura (línea gris). De estos gráficos,
A)
Wt cgtttttcgcgacaaTctggcgttTttcttgctaa T T 13.6
Mut cgtttttcgcgacaaGctggcgttGttcttgctaa G G 8.8
1.7
3.4
5.0
6.8
8.5
10.2
11.8
13.5
15.2
B)
A)
Wt cgtttttcgcgacaaTctggcgttTttcttgctaa T T 13.6
Mut cgtttttcgcgacaaGctggcgttGttcttgctaa G G 8.8
1.7
3.4
5.0
6.8
8.5
10.2
11.8
13.5
15.2
1.7
3.4
5.0
6.8
8.5
10.2
11.8
13.5
15.2
1.7
3.4
5.0
6.8
8.5
10.2
11.8
13.5
15.2
B)
52
se puede apreciar que la región de curvatura máxima en nuestro ejemplo, está
localizada hacia la posición -90 del primer codón del gene de aroG (caja con
líneas negras transversales). Las cajas sólidas y blanca, representan las cajas
promotoras: -10 y -35 y el sitio operador, respectivamente (observar el mapa al
borde inferior del histograma). Figura 11B, secuencias de nucleótidos silvestre y
mutagenizada de aroG. Las letras en mayúsculas representan los nucleótidos
mutagenizados (T por G). Los valores predichos de curvatura para cada
secuencia están indicados hacia la derecha.
Validación experimental de las predicciones in silico sobre la curvatura
estática del DNA, mediante ensayos de electroforesis en gel de
poliacrilamida
Para llevar a cabo los ensayos de electroforesis que nos permitirán
evaluar la presencia de elementos curvos en algunos ejemplos representativos y
la validación de los datos obtenidos en el análisis teórico, utilizamos las
condiciones previamente establecidas y reportadas en la literatura (64).
Mediante la técnica de PCR se amplificaron fragmentos de DNA de 400 pb
correspondientes a las regiones río arriba no-codificantes de nueve de los genes
y operones más representativos de nuestro análisis de curvatura. Estos
fragmentos fueron sometidos a electroforesis en geles de poliacrilamida (ver
Materiales y procedimientos). Un fragmento curvo tiene un movimiento
electroforético retrasado. Esto significa que un fragmento curvo de cierta longitud
se desplazará como un segmento de mayor tamaño. De manera contraria, un
53
fragmento no-curvo y de igual tamaño se desplazará una mayor distancia de
acuerdo a su peso molecular esperado.
Figura 12. Análisis de algunos ejemplos representativos mediante ensayos
de electroforesis en gel de poliacrilamida.
Con base en nuestras predicciones in silico, seleccionamos algunos
casos representativos con curvatura significativa. Mediante PCR se amplificaron
los primeros 400 nucleótidos arriba de las regiones codificantes y se sometieron
a ensayos de electroforesis. Se utilizó un marcador de peso de 100 pares de
bases, el cual previamente se estableció que no fuera curvo (M), además de una
región plana del gen de lacZ, de acuerdo a nuestro análisis de cómputo. Los
valores de curvatura correspondientes en cada caso son: ptsHI-crr (14.0), aroG
(13.6), purC (13.5), argCBH (12.9), purH (12.7), argD (12.5), livKHMGF (12.0),
pyrC (11.4), hns (10.4), lacZ (7.6).
Los nueve fragmentos en estudio, mostraron un comportamiento
electroforético anómalo, aún cuando todos son del mismo tamaño [Figura 12;
comparar los carriles: 2-10 con el carril 1 (marcador de peso molecular) y 11
pts
HI
-cr
r
aro
G
pu
rCarg
CB
H
pu
rHarg
D
Iiv
KH
NG
py
rC hn
s
lac
Z
M
400
500
600
700
900
pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
pts
HI
-cr
r
aro
G
pu
rCarg
CB
H
pu
rHarg
D
Iiv
KH
NG
py
rC hn
s
lac
Z
M
400
500
600
700
900
pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
pts
HI
-cr
r
aro
G
pu
rCarg
CB
H
pu
rHarg
D
Iiv
KH
NG
py
rC hn
s
lac
Z
M pts
HI
-cr
r
aro
G
pu
rCarg
CB
H
pu
rHarg
D
Iiv
KH
NG
py
rC hn
s
lac
Z
M
400
500
600
700
900
pb
400
500
600
700
900
pb
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 111 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
54
(fragmento plano del gen lacZ)]. Los resultados de la predicción de curvatura
indicaron que las nueve regiones de regulación se ubicaron entre las más curvas
dentro del genoma de E. coli. Los resultados del análisis electroforético
corroboran que en efecto, los segmentos son curvos.
Los fragmentos en la Figura 12 están ordenados en forma decreciente,
según nuestros datos teóricos de predicción de curvatura. Esto indica que ptsHI-
crr (carril 2) tiene la región de regulación de mayor curvatura y hns (carril 10), la
de menor magnitud de curvatura, de los ejemplos analizados. Si bien la región
de regulación de ptsHI-crr es teóricamente más curva que la de los genes aroG
y livKHNG (carriles: 3 y 8), son evidentes las diferencias entre cada uno de los
perfiles electroforéticos. Por esta razón, suponemos que el desplazamiento
electroforético tan retrasado que mostraron los genes aroG y livKHNG en
comparación a ptsHI-crr, pueda deberse adicionalmente a la posición relativa del
centro de curvatura en cada una de las secuencias, así como al micro-ambiente
estructural que flanquea a las mismas.
Efecto de la curvatura estática de DNA en la transcripción
Adicionalmente al análisis electroforético decidimos observar el efecto in
vivo de la curvatura estática de DNA en las RR de los ejemplos representativos,
mediante la comparación de la actividad de las fusiones transcripcionales al gen
reportero cloranfenicol acetil transferasa (cat) con la de sus correspondientes
versiones no-curvas. La selección de las RR a estudiar estuvo regida bajo el
siguiente criterio: a) aquellos UT, cuya magnitud de curvatura sugiriera
55
fuertemente que su regulación transcripcional estuviera asociada a curvatura
estática; b) aquellos para los cuales no hubiera evidencias publicadas
previamente de la presencia de DNA curvo en su región de regulación; c) que la
ubicación de la región de máxima curvatura, no traslapara los promotores o
algún sitio de regulación importante, y, d) que no existieran evidencias de que
pudieran estar siendo regulados por proteínas (CRP, FIS, H-NS, IHF) que en su
mecanismo involucren la presencia de DNA curvo. Con base en estas
consideraciones, las UT seleccionadas a estudiar fueron: pyrC , como
representativo del regulón de PurR; aroG de TyrR; argCBH de ArgR y a hns
como representante del regulón de H-NS. La figura 13A, muestra
esquemáticamente cada una de las regiones de regulación, así como de la
posición relativa que guarda la curvatura con los sitios de regulación descritos
hasta el momento.
Para localizar los puntos de curvatura máxima (en cada una de las
regiones de regulación previamente seleccionadas), así como los cambios
puntuales necesarios para disminuirla, utilizamos nuestro servidor MUTACURVE
(ver sección de Materiales y procedimientos). Para cada región, el servidor
identifica los correspondientes pares de cambios puntuales, que reducen la
curvatura de manera significativa. Con esta información, clonamos las regiones
regulatorias de pyrC , aroG y argCBH dentro del plásmido pKK232-8. Los
nombres asignados a cada construcción fueron los siguientes: pKK2-pyrC,
pKK2-aroG y pKK2-argC.
56
Figura 13. Validación experimental de nuestro análisis de
mutagénesis in sílico.
(A) Representación esquemática de la región de regulación y estructural
de cada unidad transcripcional en estudio. La descripción de los esquemas, se
mencionó previamente en el pié de Figura 9. (B) se muestra drástico efecto de la
doble mutación puntual introducida, sobre el perfil electroforético de la región de
regulación de aroG y hns. Contrariamente, en pyrC, y argCBH se aprecian
cambios sutiles en su perfil electroforético. Esto se puede apreciar, cuando se
comparan los fragmentos silvestres (líneas 2, 4, 6 y 8), con sus correspondientes
mutagenizados (líneas 3, 5, 7y 9).
Para generar las versiones no-curvas, utilizamos la técnica de
mutagénesis sitio dirigida por PCR inverso (ver sección de Materiales y
B)
-15-30-45-60-75 +1 +15 +30argC
-15-30-45-60-75-90-105 +1aroG -15-30-45-60-75-90-105 +1-120-135pyrC
-15-30-45-60-75 +1 +15 +30argC -15-30-45-60-75 +1 +15