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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE PSICOLOGÍA ~ecto de la Lesión del Núcleo Dorsal del Rafé sobre el Aprendizaje del Condicionamiento Aversivo al Sabor T ES 1 S Normafp_~rtugal Bouza __ DIRECTOR DE TESIS Dr. César Casasola Castro REVISOR: Dr. David N. Velázquez Martínez México, D. F. Noviembre 2006 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Z5053.0? UNf/M. :J.60 ;1.rJ06 ~.2 ÍNDICE Resumen ... Introducción 1. Serotonina .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. . .. . .. .. .. .. .. .. .. .. . .. .. .. .. .... .. 1.1. Historia .. .. .. .. . . .. . . .. . .. .. .. .. . . .. . .. .. .. .. . .. . .. ...... .. ..... . 1.2. Síntesis, liberación, degradación y recaptura .... .. .. .. ....... ... .. ... ... .. . 1.3. Núcleos del Rafé........... . ... .. ...... ..... .. .. ... ...... .... .... .. . 1.4. Receptores serotonérgicos 1.5. Serotonina y cognición 2. Condicionamiento aversivo al sabor .. .. .. .. .. .. . .. . . .. .. .. .......... . 2.1 . Definición y tipos de aprendizaje ....... .... ..... .. .... .. . 2.2. Condicionamiento.................................................... ... . ..... ..... ... . 2.3. Historia y modelo del condicionamiento aversivo al sabor ...... .... .. .. 2.4. Condicionamiento aversivo al sabor y serotonina... .. .... .... ...... . 2.5. Condicionamiento aversivo al sabor y a~tilcolina ... 3. Justificación 2 3 3 5 7 10 11 17 17 18 20 21 23 25 4. Objetivos .. .. ... . .. .. ... .. .... . . .... .. .. .. .. .. ... .. .... .. ....... .... ... . .... ... .. ..... 27 4.1. Objetivo general. .............. .. .............. .... ........ ... .. ........... .. . .. .. ........... 27 4.2. Objetivos particulares..... .. .. ............. .. .... ..... .. ..... ... ....... ..... ........ ... .. .. 27 5. Método .. . . . .. . . .. .. ... . . . . . ... .... . .. .. ............. ... .. ... 27 5.1. Sujetos . . . . .. . . . . . . . . . .. . .. .. . .. .. .. 27 5.2. Materiales.. .. .... ... ... .... .. .... ... . ..... ..... ..... 28 5.3. Procedimiento .. . .. .. . .. . . . . .. . . .. ... .. . . .. .. .... .... .. .. . .. .. .. ... .. . ... . 28 5.3.1 Procedimientos quirúrgicos .............. ..... ... ... ............. 30 5.3.2. Habituación al consumo de agua .. .. ...... .. .... .. .. .. 32 5.3.3. Entrenamiento en Condicionamiento Aversivo al Sabor. .. .. ......... .. .. ... .. .... .. .. .. .......... ................. 32 5.3.4. Sesión prueba.. ........ ........... .... .. .. ... .. ....... .. ........... .. ....... ......... ....... 32 5.3. 5. Verificación Histológica............... ... .... ... .. .... ... .... .. .. .. .. ..... .. ... ..... .. ... 33 5.3.6. Fármacos.. ................ ............ .... ........... .... ........ ..... .. ... .. .. .... . 35 5.3.7 Análisis de datos.. ...... .. ............. ................ ...... ....... .. ...... .. 35 6. Resultados 35 7. Discusión 44 8. Referencias .. 50 RESUMEN A pesar de la evidencia sobre la participación de la serotonina en el aprendizaje asociativo, actualmente no se ha estudiado si el sistema serotonérgico esta involucrado en la adquisición del condicionamiento aversivo al sabor (CAS). El presente estudio evaluó la participación de las vías ascendentes serotonérgicas, a través de la lesión del núcleo dorsal del rafé (NDR), sobre la adquisición del CAS. Los resultados de la lesión del núcleo dorsal del rafé son comparados con el bloqueo de la transmisión colinérgica metabotrópica durante el aprendizaje del CAS. Se utilizaron 41 ratas macho de la cepa Wistar, con un peso entre 350-400 g al inicio del experimento. Las ratas fueron asignadas aleatoriamente a cuatro condiciones experimentales: 1) grupo control (n=9), el cual no recibió manipulaciones quirúrgicas ni farmacológicas, 2) grupo sham (n= 12), al que se le realizó solo el procedimiento quirúrgico pero sin lesión electrolítica, 3) grupo lesión (n= 12), el cual recibió la lesión electrolítica en el núcleo dorsal del rafé y 4) grupo escopolamina (n=8), al que se le administró escopolamina (2.0 mg!Kg, i.p. ) durante el entrenamiento en CAS. Posteriormente se tomó el registro basal de consumo de agua por 1 O días ( 1 O min. diarios), se realizó el entrenamiento en CAS durante 3 días y se llevaron a cabo las ses iones de prueba para evaluar el efecto de las manipulaciones experimentales. Por último se analizaron histológicamente las manipulaciones quirúrgicas. En la fase de adquisición del CAS, los grupos sham y les ión presentaron una disminución en la pendiente de la curva de aprendizaje en comparación con el grupo control (p<0.05), mientras que los grupos sham y lesión no mostraron diferencias significativas entre si en ninguna de las ses iones de adquisición. Durante la sesión prueba, se observó una tendencia en los grupos sham y les ión a consumir más sacarina comparados con el grupo control , sin embargo, ésta diferencia no resultó estadísticamente significativa. El grupo al cual se le administró el antagonista muscarínico escopolamina, presentó un incremento significativo en el consumo de sacarina comparado con el grupo control (p = 0.009), mientras que al comparar los resultados del grupo lesión con el efecto de un agente amnés ico, la escopolamina, no se encontraron diferencias significativas. No obstante, la similitud entre los resultados de los grupos sham y lesión y el hecho de que ambos grupos no presentaronen diferencias significativas con respecto al control en la sesión prueba, sugieren que el NDR no es una estructura determinante para el aprendizaje del CAS. Se propone que los cambios observados en los grupos sham y les ión posiblemente se deban a la afección de s istemas circundantes posiblemente relacionados con el CAS, en particular la sustancia gris periacueductal y núcleo parabraquial, los cuales se han asociado con el condicionamiento aversivo. Se sugiere analizar la participación de estas estructuras en el aprendizaje de respuestas adaptativas ante est ímulos aversivos. 2 INTRODUCCIÓN 1. SEROTONINA. 1.1. HISTORIA. En 1933, Vialli y Ersparmer (citados en Goodman y Gilman, 1995), observaron la presencia de una sustancia que teñía con un agente para indoles. Las concentraciones más altas se encontraron en la mucosa gastrointestinal, a ésta sustancia se le denominó enteramina. Posteriormente, Rapport (citado en Goodman y Gilman, 1995) en 1947 reportó la existencia de una sustancia vasotónica en el suero, por lo que la llamó serotonina. Una comparación entre la serotonina y la enteramina mostró que estas sustancias eran química y farmacológicamente idénticas. Durante 1954, Amin y sus colaboradores mostraron que la distribución de ésta sustancia era heterogénea en el cerebro de perro (Zifa y Fillion, 1992). Fue a mitad de los años 50's, cuando se sugirió que la serotonina podía funcionar como un neurotransmisor en el cerebro (Goodman y Gilman, 1995). La aceptación de la serotonina como neurotransmisor ocurrió cuando se demostró que la sustancia se distribuía heterogéneamente en el cerebro, se identificaron poblaciones específicas de células, cuyas proyecciones nerviosas contenían serotonina, se demostraron las vías metabólicas para su síntesis e inactivación en el cerebro bajo condicionesfisiológicas y, por último, se observó su acción como un transmisor en sinapsis identificadas (Feldman et al., 1997). La serotonina se puede encontrar en muchas células que no son neuronas, como las plaquetas en la sangre o las células enterocromafines en el intestino, ésta se obtiene de la dieta, sin embargo, como no puede cruzar la barrera hematoencefálica, la serotonina central debe ser sintetizada en el Sistema Nervioso Central, en donde sus concentraciones sólo alcanzan del 1 % al 2% disponible en el organismo (Cooper, 1996). La serotonina participa en diversas respuestas fisiológicas como lo son la cicatrización, vasoconstricción, motilidad de músculo liso gástrico e intestinal, etc. 3 (Goodman y Gilman, 1995). En el sistema nervioso, juega un papel importante en la regulación del estado de ánimo, ritmos circadianos, control de ingesta, ciclo sueño-vigilia, regulación de la temperatura y en la regulación del dolor, entre otras (Carlson, 2001; Goldman, 1996). Actualmente, uno de los campos de mayor estudio de la serotonina es en la Psiquiatría , ya que se ha encontrado evidencia de la participación del sistema serotonérgico en la patogénesis de algunos trastornos afectivos, en particular en la depresión, la cual , se caracteriza por alteraciones en el estado de ánimo, disminución del interés o de la capacidad para obtener placer durante la realización de diversas actividades, pérdida de apetito y peso corporal, agitación o enlentecimiento, sentimientos de inutilidad o culpa excesivos o inapropiados, alteraciones cognitivas como la disminución de la capacidad de pensamiento y concentración, indecisión y pensamientos recurrentes de muerte, así como trastornos del sueño (American Psychiatric Association, 1994; Gorzalka et al., 2003) . La investigación neuroquímica establece que la depresión se asocia con concentraciones bajas de serotonina . La disminución de los almacenes de serotonina, de su precursor el triptófano o la inhibición de la síntesis, precipitan los síntomas de la depresión y la mayoría de las sustancias antidepresoras actúan incrementando la función serotonérgica (Maes y Meltzer, 1995; Goldman, 1996). No obstante, no todos los antidepresivos actúan sobre la serotonina, por ejemplo, el tratamiento crónico con algunos antidepresivos hace reversibles los cambios debidos a la alteración de la actividad de la tirosin-hidroxilasa, enzima que regula la producción de norepinefrina al convertir a la tirosina (precursor) en DOPA (Huang et al. , 1980). En lo que respecta a la terapéutica farmacológica de la depresión, existen varias clases de agentes antidepresivos que se encuentran disponibles. Dos grupos clásicos de antidepresivos, incluyen a los inhibidores de la monoaminooxidasa (IMAO) y los antidepresivos tricíclicos (ATC), más recientemente se dispone de tres categorías más de antidepresivos modernos que se basan en la inhibición de la recaptura de serotonina, dopamina y/o norepinefrina. Otras clases adicionales incluyen a los inhibidores de los receptores 5HT1A y antidepresivos bloqueadores de los receptores a2 (Stahl y Grady, 2003) . 4 Existen antidepresivos que no afectan, o tienen baja afinidad hacia otros tipos de receptores y por lo tanto evitan los efectos adversos de los antidepresivos triciclicos, por ejemplo, los fármacos inhibidores selectivos de la recaptura de la serotonina y norepinefrina (ISRSN o agentes de acción dual), estos no afectan a los receptores colinérgicos, histaminérgicos o a-adrenérgicos (Stahl y Grady, 2003). Algunos antidepresivos no serotonérgicos, han mostrado tener efectos benéficos en el tratamiento de la depresión, tal es el caso de los antidepresivos noradrenérgicos como la Riboxetina, la cual ha mostrado ser particularmente efectiva mejorando la autopercepción negativa y aumentando la motivación hacia las acciones, lo que resulta en una mejor calidad de remisión en términos de funcionamiento social (Dubini et al., 1997). Una de las estrategias que se utilizan para estudiar la función del sistema serotonérgico es la disminución de la ingesta de triptófano, el cual es el aminoácido precursor de la serotonina. Este modelo está basado en la hipótesis de que su reducción en plasma produce una disminución consecuente en la síntesis de la serotonina (Bell et al., 2001 ). Para esto se otorga una dieta que no contiene triptófano , pero sí grandes cantidades de otros amino ácidos neutrales como la valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, etc. La eliminación por completo de éste amino ácido de la dieta tiene como consecuencias cambios en el procesamiento cognitivo y emocional comparables a los de la depresión mayor, tal es el caso de la aparición de un efecto de interferencia emocional (stroop) en personas en esta condición (Hayward et al. , 2005) . 1.2. SÍNTESIS, LIBERACIÓN, DEGRADACIÓN Y RECAPTURA DE LA SEROTONINA. La serotonina es una indolealquiilamina que se designa químicamente como 3-(-2- aminoetil) - 1 H - indol-5-ol, pero comúnmente lleva el nombre de 5- hidroxitriptamina ó 5-HT. Ésta se sintetiza, como se mencionó anteriormente, a partir del aminoácido triptófano, el cual es un aminoácido esencial, lo que significa que no puede ser sintetizado por los humanos, debido a esto tiene que ser 5 suministrado en la dieta ; las proteínas animales y vegetales son la mayor fuente de triptófano en la dieta (Feldman et al. , 1997). El triptófano, se convierte en 5-hidroxitriptofano (5-HTP) por acción de la triptófano hidroxilasa, enzima que se produce en las células serotonérgicas. La enzima descarboxilasa de los ácidos aromáticos (AADC) actúa sobre el 5-HTP descarboxilándolo para que se convierta en 5-hidroxitriptamina o 5-HT (Rang et al ., 1999). Esta nueva serotonina, se almacena en vesículas por medio de una proteína membrana! denominada transportador. Se asume que el mecanismo de liberación de la 5-HT es por medio de exocitosis; una vez liberada hacia el espacio sináptico, llega a los receptores serotonérgicos de la célula postsináptica para realizar la transmisión sináptica . La acción de la 5- HT en el espacio sináptico termina por medio de un proceso de recaptura (Fig.1), el cual es llevado a cabo por medio de un transportador, capaz de trasladar la serotonina hacia el espacio intracelular de la célula presináptica (Feldman et al ., 1997). / ). Transportador • ¿ Hendidura sináptica .t # .!~ .;!2i;f?' ' Receptor de serotonina · ·"'i F Célula post~tiiápt)ca Fig. 1. Proceso de la sinápsis serotonérgica. 1) Almacenamiento en vesícul as, 2) liberación del neurotransmisor, 3) unión a receptores serotonérgicos y 4) recaptura de serotonina existente en el espacio sináptico. Il ustrac ión mod ificada de Rozados, 2001. La ruta que sigue el metabolismo de la serotonina es la desaminación por acción de la enzima monoamino oxidasa (MAO) . El producto de esta reacción , el 5- hidroxindoleacetaldehído, el cual, es oxidado y se convierte en ácido 5- 6 hidroxindoleacético ó 5-HIAA (Cooper, 1996). Un gran número de mecanismos de control operan para regular la síntesis de serotonina , algunos involucran el estado de la triptófano hidroxilasa, el cual es el paso imprescindible en las síntesis de la 5-HT. La actividad de la triptófano hidroxilasa y la tasa de formación de la 5-HT están moduladas por el nivel de disparo de las neuronas serotonérgicas (Feldman et al. , 1997). 1.3. NUCLEOS DEL RAFÉ. En el sistema nervioso central , los cuerpos de las neuronas serotonérgicas se localizan principalmente en los núcleos del rafé, particularmente los núcleos dorsal y medial , las células de éstos núcleos proyectan terminales nerviosas hacia regiones del cerebro anterior como la sustancia nigra, hipotálamo, tálamo, el área amigdaloide-hipocampal, el núcleo caudado, el putamen, el acumbens y hacia áreas cerebrales corticales incluyendo la cortezafrontal, occipital, insular, parietal , temporal y la corteza cerebelar (Staley et. al. , 1998). Los núcleos del rafé , son colecciones de neuronas con límites citoarquitectónicos pobremente definidos, que contienen poblaciones neuronales heterogéneas con morfología, proyecciones y características neuroquímicas distintas; los núcleos del rafé se distribuyen cerca de la línea media del tallo a lo largo de su extensión rostro caudal (Hornung , 2003) . Según Tork (1990) estos núcleos se clasifican en nueve núcleos del B, al Bs (Fig . 2), que están divididos a su vez en un sistema caudal y un sistema rostral (citado en Feldman et al., 1997). 7 Córtex cerebral \' Fase. med. Fig. 2. La ilustración muestra las vías serotonérgicas en el cerebro de rata, se observan los nueve grupos celulares que conforman a los núcleos del rajé situados a lo largo de la linea media del tallo cerebral en posición rostro-caudal. !lustración modificada de Cooper, 2003. El sistema caudal consiste en los grupos celulares del 81 al 84. Dos de los núcleos más importantes del sistema caudal son el núcleo pálido (NRP) y el núcleo oscuro (NRO), éstos proyectan principalmente a núcleos secretores motores y premotores del tallo cerebral y de la médula espinal. Las estructuras Diana identificadas de éstos núcleos son: núcleos del trigémino, del facial, del hipogloso, núcleo ambiguo, núcleo dorsal motor del nervio vago, el asta ventral de la médula espinal, formación reticular, el grupo respiratorio ventral, la columna celular intermediolateral de la médula espinal, la médula rostral ventrolateral y sus regiones circundantes, por último a motoneuronas y neuronas preganglionares. Dentro de las funciones relacionadas con los núcleos NRP y NRO, encontramos a la respiración, conductas orofaciales, locomoción, ciclo cardiaco y presión sanguínea (Ribero-do-Valle y Lucena, 2001). Por otra parte, el sistema rostral comprende los grupos celulares del 85 al 8s, el cual posee la mayoría de sus proyecciones hacia casi todas las regiones neocorticales, entre ellas el cerebro anterior, siendo los núcleos dorsal y medio las principales fuentes de innervación serotonérgica hacia dicha regiones. Ambos núcleos contienen el 85% de todas las neuronas serotonérgicas en el cerebro (Verles, 1991; Hornung, 2003; Abrams et al., 2004). Aunque estos dos núcleos 8 contienen serotonina principalmente, tanto sus proyecciones como sus características celulares difieren entre si. Los dos tienen vías hacia el sistema límbico, pero el núcleo medial del rafé (NMR) proyecta hacia estructuras como el septum medial, el cíngulo y el hipocampo dorsal , y el núcleo dorsal del rafé (NDR) desvía sus proyecciones hacia corteza cerebral , septum lateral y amígdala, cabe destacar que estas estructuras han sido relacionadas con el aprendizaje (Azmitia y Segal , 1978; Mollivel , 1987; Buhot, 1997). Fig. 3. Localización del núcleo dorsal del rafé a disti ntos niveles (-7.04, -7.8, -9.0 mm) con respecto a Bregma (Il ustración modificada de Paxinos y Watson, 1998; Abrams et al. , 2004). El NDR está involucrado en algunas otras funciones como el estado de ánimo, sensación y motricidad y contiene al grupo más grande de neuronas serotonérgicas en el sistema nervioso central. Tanto el núcleo medial del rafé como el núcleo dorsal , contienen también una población significativa de neuronas no serotonérgicas, como las GABAérgicas, dopaminérgicas y glutamatérgicas, sin embargo no está muy claro cuáles son las tareas de éstas neuronas en los núcleos del rafé (Marinelli, et al., 2004; Patel , et al. , 1987). 9 El núcleo dorsal del rafé se extiende desde el nivel del núcleo oculomotor hacia la mitad del puente (Fig 3) . La mayoría de las neuronas serotonérgicas del rafé dorsal (RO) se localizan en la mitad rostral (Baker et al. , 1990). De acuerdo con los mapas estereotáxicos del cerebro de rata de Paxinos y Watson, el rafé dorsal rostral comprende niveles anatómicos desde -6.92 a -7.64 mm; el rafé dorsal medial desde -7.73 a -8.45 mm y el rafé dorsal caudal abarca desde -8.54 a - 9.25 mm, todos con respecto a Bregma (Abrams et al. , 2004) . Dentro de las diferencias estructurales entre el núcleo dorsal y medial del rafé se encuentran las siguientes: Núcleo Medial Núcleo Dorsal Fibras lar~as y toscas Fibras pequeñas y finas Varicosidades esféricas Varicosidades pleomórficas Las neuronas serotonérgicas y las no Las neuronas serotonérgicas y las no serotonérgicas están bien diferenciadas serotonérgicas tienen características entre si muy similares entre si Las células se observan desorganizadas Las células son cohesivas y organizadas entre si (Sheryl et al. , 2004; Molliver, 1987). 1.4. RECEPTORES SEROTONÉRGICOS. Los receptores sinápticos, son proteínas complejas constituidas por largas cadenas de aminoácidos dispuestas de manera helicoidal alojadas en la membrana celular (Stahl , 1999). Su función consiste en recibir al ligando apropiado , es decir, reconocer a los transmisores específicos y propagar o inhibir una señal reguladora en la célula postsináptica. Entre los principales receptores en la membrana neuronal encontramos a los receptores ionotrópicos o canales iónicos regulados por ligando, en los cuales, la molécula receptora contiene a su vez un canal iónico. Otro tipo de receptores son los metabotrópicos, en los cuales el receptor se asocia con una proteína G y cadenas intracelulares de señalización (Goodman y Gilman , 1996; Kandel et al. , 2001) . 10 Los receptores de la membrana neuronal pueden ser clasificados tomando en cuenta tres criterios: 1) el operacional, que comprende a los datos farmacológicos y funcionales, así como las áreas de unión de los ligandos 2) el transduccional , que toma en cuenta a los diferentes sistemas de transducción que acompañan al receptor y, por último, 3) el estructural , que es el conocimiento de la secuencia de nucleótidos del gen de un receptor (Hoyer y Martín, 1997). Una vez clasificados a través de los criterios antes mencionados, los receptores serotonérgicos se agruparon en 7 familias que comprenden al menos 14 subtipos diferentes: 5-HT w1B11011 E11 F. 5-HT 2N2B12c . 5-HT 3N3B, 5HT 4N4Bi4C/4D. 5-HT sNs B, 5-HT 6 y 5-HT 7N7Bl7Ct7o (Meneses 1999; Alhander-Lüttgen et al. , 2003; Hoyer y Martín, 1997). Los receptores de 5-HT se localizan ampliamente distribuidos en el cerebro, principalmente en estructuras como: núcleos del rafé , hipocampo, amígdala , sustancia nigra, hipotálamo, cuerpos mamilares y área postrema (Zifa y Fillion, 1992). No todos los subtipos de receptores de serotonina actúan del mismo modo ni se localizan en el mismo lugar, por ejemplo: los receptores 5-HT1A (hallados en grandes cantidades en los núcleos dorsal y medial del rafé), al ser estimulados, actúan como autorreceptores disminuyendo la tasa de disparo de las células serotonérgicas, mientras que los receptores 5-HT 3 (distribuidos en la corteza y en algunas porciones del hipocampo), aumentan la liberación de serotonina cuando reciben estimulación (Goodman y Gilman, 1995; Zifa y Fillion, 1992; Buhot, 1997). Algunos receptores pueden interactuar con la liberación de otros neurotransmisores como es el caso de los 5-HT 2 (localizados en áreas como el núcleo basal de Meynert, hipotálamo, cuerpos mamilares y algunas zonas de la corteza), éste tipo de receptor ha demostrado que puede modular la liberación de acetilcolina. Asimismo, la estimulación de los receptores 5-HT 4 , incrementa la excitabilidad neuronal y la liberación de la acetilcolina en el córtex frontal (Buhot, 1997). 11 1.5. SEROTONINA Y COGNICIÓN. La participación de los diferentes neurotransmisores en procesos cognitivos como el aprendizaje y la memoria ha sido estudiada por muchos años. En el caso de la serotonina. Se han formulado hipótesis que sostienen que las vías serotonérgicas, la recapturay los propios receptores serotonérgicos, muestran una distribución regional en áreas implicadas en el aprendizaje y la memoria (Tabla 1 ), sin embargo el papel específico de la 5-HT en dichos procesos no ha sido establecido por completo. Algunos autores proponen que la activación de los receptores de serotonina o el incremento en la liberación de este neurotransmisor, es capaz de favorecer a procesos cognitivos como el aprendizaje, mientras que la disminución en los niveles centrales de serotonina produce un deterioro en tal proceso. No obstante, algunos autores han descrito fenómenos opuestos proponiendo que también se puede favorecer el aprendizaje al disminuir la cantidad cerebral disponible de serotonina (Meneses, 1999). En la siguiente tabla se resumen algunas de las funciones asociadas con la neurotransmisión serotonérgica, el tipo de receptor y su localización en el cerebro: Tabla 1. RECEPTOR LOCALIZACION FUNCION 5-HT1A Hipocampo lngesta de alimento Núcleo dorsal del Termorregulación rafé Conducta sexual Septum Aprendizaje (1•2) Amígdala Memoria Algunas patologías como: Trastorno obsesivo-compulsivo Depresión Agresión Esquizofrenia Alcoholismo Ansiedad 5-HT1B Núcleos del rafé Aprendizaje 101 Hipocampo Memoria (subículo dorsal) Termorregulación Globo pálido Respiración 12 Sustancia nigra lngesta de alimento Actividad sexual Locomoción Algunas patologías como: Trastorno obsesivo-compulsivo Migrañas Ansiedad S-HT10 Sustancia nigra Actúan en procesos como los receptores 5-HT 18 Estriado Núcleo acumbens Núcleo dorsal del rafé Núcleo putámen Núcleo caudado Sustancia nigra Globo pálido Hipocampo (CA 1) Cerebelo (células de Purkinje) 5-HT1E Corteza cerebral De ambos se sabe poco pero se les ha (parietal) relacionado con procesos patológicos como la Corteza entorrinal migraña Corteza motora frontoparietal Núcleo caudado Núcleo putamen Bulbo olfatorio amígdala Corteza estriada S-HT1F Corteza Tálamo Bulbo olfatorio Cerebro anterior Hipocampo Médula espinal 5-HT2A Corteza prefrontal Actividad sexual Bulbo olfatorio Sueño Neocorteza Aprendizaje (4, s¡ Hipocampo Memoria Estriado Algunas patologías como: Médula espinal Migraña Epilepsia Ansiedad Depresión Esquizofrenia Alucinaciones S-HT2s Corteza cerebral Conducta motora 13 Amígdala Apetito Septum lateral Disminuyen la actividad theta al ser bloqueados Núcleo caudado Hipotálamo 5-HT2c Plexos coroideos Sustancia nigra Puente Estriado hipotálamo Globo pálido Neocorteza Hipocampo (CA, y CA3) 5-HT3 Núcleos del tracto Sue;o solitario Nociocepción Área postrema Émesis Corteza cerebral Incrementa la atención y la memoria!5l al Hipocampo sobreexpresarse 5-HT4 Hipocampo Aprendizaje 141 Estriado Tallo cerebral Tálamo Hipocampo Bulbo olfatorio Sustancia niqra 5-HTs Hipocampo (CA1, Se les ha relacionado con el desarrollo cerebral CA3 y giro dentado) Córtex cerebelo (capa granular) Bulbo olfatorio Habénula Núcleos del rafé 5-HT6 Núcleo caudado Se ha encontrado su participación en algunos Núcleo putamen procesos neuropsiquiátricos como la Bulbo olfatorio esquizofrenia Núcleo acumbens Hipocampo (CA,, CA3 y giro dentado) Corteza cerebral Sistema límbico Estriado 5-HT1 Núcleo talámico Conducta afectiva medial Procesos sensoriales Hipocampo (CA1 y Ritmos circadianos CA2) 14 Colículos superiores Hipotálamo Núcleo dorsal del rafé Sustancia nigra Tabla J. Cuadro explicativo de los diferentes receptores de serotonina, su localización y las funciones con las que se han relacionado en el sistema nervioso central (Gerharth y Heerikhuizen1, 1997; Meneses y Hong', 1997a; Pawe/s3, 1997; Hoyer y Martin4, 1997; Uphouse5, 1997; Meetier et al, 2006'; Sari et al., 1997; Stam, l 99;). los autores que se encuentran señalados con el numero en supra índice, son aquellos en donde se encuentra la ir¡formación relacionada con el aprendizaje y/o la memoria, sin embargo, los otros proveen información general del sistema serotonérgico. El estudio de la participación de los diferentes subtipos de 5-HT en procesos cognitivos se ha llevado a cabo a través de diferentes modelos conductuales, de manera que poco a poco se ha podido incrementar la información sobre la función específica de diversos subtipos serotonérgicos en dichos procesos cognitivos. Así , algunos estudios indican que la disminución de la síntesis de serotonina por medio del fármaco PCA (p-cloroanfetamina) produce deterioro en la memoria en el laberinto radial (Santucci et al., 1996), asimismo, la disminución de triptófano y por consiguiente de la síntesis de 5-HT, incrementó la capacidad de resolver el laberinto de Biel (González-Burgos et al., 1998). Por otra parte, la disminución de los niveles de 5-HT al estimular los receptores 5- HT1A por medio de 8-hidroxi-2-(di-n-propilamino) tetralina (8-0H-DPAT) en ratas, mejoró la consolidación de la memoria y la adquisición del aprendizaje en una tarea de automoldeamiento (Meneses y Hong, 1994). También se han observado efectos perjudiciales en la memoria de trabajo en ratas (Herremans et al., 1995). De igual forma, la memoria de referencia se ha visto deteriorada al administrar agonistas de los receptores 5-HT 18 (Buhot, 1997). En cuanto a la familia de los receptores 5-HT2, los antagonistas de los 5-HT 2N2C (Ritanserina y Ketanserina) han mostrado favorecer la consolidación de la memoria, mientras que el antagonista 5-HT 2c (Mesulgerina) produce disminución en la consolidación en el automoldeamiento (Meneses y Hong 199h). Asimismo, los agonistas 5-HT 2AJ2c demostraron aumentar la memoria en el aprendizaje asociativo de la respuesta de evitación en ratas (Harvey, 1996). 15 Dentro de los estudios que han relacionado a los 5-HT3 con la cognición , se ha demostrado que al ser antagonizados, se produce un efecto favorecedor mejorando el aprendizaje y la memoria , por ejemplo, los antagonistas 5-HT 3 (ondansetron y tropisetron) mejoraron el aprendizaje en una tarea de automoldeamiento (Pitsikas y Borsini, 1996). Por su parte el antagonista 5-HT 3 (itrasetron) mejoró la retención de la memoria en tareas de evitación (Pitsikas y Borsini , 1997). Por el contrario, la administración del agonista 5-HT3 (mCPBG) es capaz de deteriorar el aprendizaje (Meneses y Hong, 1994). No obstante, los antagonistas 5-HT 3 son capaces de antagonizar los efectos de la pérdida de memoria inducida por anticolinérgicos o por la edad en roedores y primates (Buhot, 1997). Acerca de los receptores 5-HT 4 no existen tantos estudios como de los demás receptores, sin embargo se ha probado que el agonista (RS 17017) mejora la ejecución de los macacos en una tarea de igualación retardada a la muestra (Terry et al., 1998). Algunos fármacos han probado tener efectos diferenciales en función de la dosis (Meneses, 1997c). tal es el caso del antagonista 5-HT18110 (GR127935) , el cual deteriora la consolidación a dosis bajas (1 .0 mg/kg) e incrementa la consolidación a dosis altas (10 mg/Kg). Se han obtenido algunos resultados al lesionar las principales fuentes de serotonina a nivel central (núcleos del rafé dorsal y medial) con toxinas como la 5,7-dihidroxitriptamina, se observó que la discriminación temporal de estímulos se altera, produciendo una sobreestimación del tiempo con respecto a los sujetos controles en una tarea de condicionamiento operante (Graham et al., 1994). La siguiente tabla (Tabla 2) se resumen algunos de los hallazgos que relacionan cambios en los niveles de actividad serotonérgica y su efecto sobre procesos de aprendizaje y memoria en diferentes paradigmas conductuales : Tabla 2. SEROTONINA RECEPTOR Y EFECTO MODELO FÁRMACO INCREMENTO Agonistas 5-HT10110 Dosis dependiente Automoldeamiento (GR127935) Bajas dosis: deterioro en la 16 consolidación Altas dosis: aumenta consolidaciónAgonista 5-HT18 Deteriora ejecución Laberinto radial (CP93129) Agonista 5-HT4 Mejora ejecución Igualación con (RS17017) demora a la muestra Agonista 5-HT 3 Deterioro de Automoldeamiento (mCPBG) aprendizaje DISMINUCION Disminución de Deterioro memoria Laberinto radial síntesis de 5-HT con PCA Incrementa capacidad Laberinto de Biel Disminución de para resolver síntesis de 5-HT al disminuir triptófano Mejora aprendizaje y Automoldeamiento Antagonistas 5-HT 3 retención de memoria ( ondansetron, tropisetron e itrasetron) Mejora consolidación Automoldeamiento Agonista 5-HT1A de memoria y (8-0H-DPAT) adquisición del aprendizaje Favorecen Automoldeamiento Antagonista 5-HT 2A12c consolidación (ritanserina y ketanserina) Disminución en Auto moldeamiento Antagonista 5-HT 2c consolidación (Mesul!=jeri na) Tabla 2. Cuadro que explica los efeclos del incremenlo o la disminución de los niveles de serolonina, los fármacos y el modelo conduclual que fueron lllilizados para cada es1udio mencionado (González-Burgos et al., 1998; Meneses y Hong, 1994; Meneses y Hong, 1997b; Meneses y Hong, 1997c; Pitsikasy Borsini, 1996; Pitsikas y Borsini, 1997; Santucci el al., 1996 y Terry el al. , 1998). 17 2. CONDICIONAMIENTO AVERSIVO AL SABOR. 2.1. DEFINICIÓN Y TIPOS DE APRENDIZAJE. El aprendizaje puede definirse como un cambio relativamente permanente de la conducta debido a la experiencia, que no puede explicarse por un estado transitorio del organismo, por la maduración o por tendencia de respuesta innatas (Klein , 1994; Anderson, 2001) . Los diferentes tipos de aprendizaje se pueden dividir inicialmente en dos grandes grupos: A) El aprendizaje no asociativo como la habituación, que es la forma más simple de aprendizaje, un organismo aprende a disminuir o suprimir por completo una respuesta a un estímulo neutral recurrente, es decir, un estímulo que no es reforzante ni dañino. Por otro lado encontramos a la sensibilización , en la cual, la magnitud de una respuesta a un estímulo neutral aumenta cuando es precedido por un estimulo nocioceptivo (Rains, 2002). B) El aprendizaje asociativo consiste en el desarrollo de una respuesta a un estímulo anteriormente neutral como resultado de una asociación temporal , implica la conexión entre representaciones de dos o más acontecimientos (por ejemplo, dos estímulos o un estímulo y una respuesta) de tal manera que la ocurrencia de uno de los acontecimientos activa la representación del otro (Domjan, 1998). 2.2. CONDICIONAMIENTO. Al mencionar el aprendizaje asociativo no se puede dejar de lado al condicionamiento clásico y al operante. En el condicionamiento operante, el aprendizaje se basa en las consecuencias de la respuesta (Fig . 4). Cada vez que se da una respuesta , es posible que la siga un reforzador, un castigo o nada. Estas consecuencias determinan la probabilidad de ocurrencia posterior de una respuesta. 18 ¡--- 1 l)E1 ... R SI: 2)E ,__. R IH .. R' ENTONCES: 3)E 1~ Rj Fig. 4. Esquema explicativo del condicionamiento operante. 1) A un estímulo (E) , le sigue una respuesta (R) , 2) si 11n reforzador -R '- se presenta después del estímulo y la respuesta, 3) entonces incrementa la probabilidad de que fa respuesta ocurra en presencia del estímulo. El condicionamiento clásico, en cambio , está basado en lo que sucede antes de una respuesta, en él , los eventos antecedentes se asocian entre sí. Existen cuatro componentes básicos en el procedimiento de condicionamiento clásico (Fig . 5): 1) el estímulo incondicionado (El) , 2) la respuesta incondicionada (RI) , 3) el estímulo condicionado (EC) y 4) la respuesta condicionada (RC) . Antes del condicionamiento, el estímulo incondicionado provoca la respuesta incondicionada. Durante el condicionamiento, el estímulo incondicionado es emparejado con un estímulo inicialmente neutro (EN). Tras el condicionamiento, el estímulo neutro es capaz de provocar la respuesta condicionada por lo tanto se le denomina ahora como estímulo condicionado (EC). La relación entre el estímulo incondicionado y la respuesta incondicionada (El-RI) se denominó originalmente reflejo incondicionado; la relación entre el estímulo condicionado y la respuesta condicionada (EC-RC) se llamó reflejo condicionado (Klein, 1994; Coon, 1998). 19 1) El El + EN 2) SI: EN U>'x+~ RI 3) ENTONCES: EN IO~ RI 1 1 EC llMiNit!'!P RC RI RI Fig. 5. Esquema explicativo del condicionamiento clásico. 1) Un estímulo incondicionado (El) provoca una respuesta incondicionada (Rl), 2) al asociar el El con un estímulo neutro (EN) se presenta la respuesta incondicionada, 3) si después de la asociación, el EN desencadena la RI, entonces al EN se le llama estímulo condicionado (EC) y a la RI ahora se le denomina respuesta condicionada (RC). 2.3. HISTORIA Y MODELO DEL CONDICIONAMIENTO AVERSIVO AL SABOR. A mitad de los años 1950's John García y sus colaboradores, en el Radiological Defense Laboratory en San Francisco, reportaron que las ratas expuestas a una radiación ionizante evitaron subsecuentemente el consumo de soluciones que estuvieron presentes en el momento de la radiación. Esta conducta de evitación refl ejó la asociación del sabor de la solución con los efectos aversivos de la radiación y fue llamada condicionamiento aversivo al sabor (CAS). También demostraron que estas conductas aversivas fueron adquiridas, a veces, en un solo ensayo de condicionamiento y eran selectivas al estímulo gustativo aún cuando demoras largas separaban el acceso a la solución y la exposición a la radiación (Riley y Freeman, 2004). De cualquier manera, al incrementar la demora entre el estímulo condi cionado y el estímulo incondicionado, la aversión al estímulo condicionado disminuye gradualmente (Welzl et al., 2001 ; Riley y Freeman , 2004) . 20 Los roedores, al igual que muchas otras especies, incluyendo al hombre, son capaces de asociar un sabor nuevo con un malestar y como consecuencia evitan tomar fluidos con ese sabor (Welzl et al., 2001 ). Aprender las consecuencias aversivas asociadas con sabores tiene fuerte significado para la supervivencia animal ya que el reconocimiento de estas consecuencias puede prevenir la ingestión de venenos o de morir (Gutiérrez et al., 2003). El CAS es un paradigma bien establecido de aprendizaje y memoria. Se considera que es una forma especial de condicionamiento clásico. La adquisición del CAS (ver Fig . 6) representa un condicionamiento inducido por una sustancia que produce malestar como estímulo incondicionado (El) y la náusea como respuesta incondicionada (RI). Un estímulo neutro "sabor" (EN) se asocia con el estímulo incondicionado. El estímulo neutro se denomina estímulo condicionado (EC) cuando éste es capaz de elicitar por sí solo la respuesta condicionada (RC) . En el condicionamiento aversivo al sabor, la conducta de evitación al EC es usualmente tomada como un signo de una respuesta condicionada establecida exitosamente, por lo que se dice que el animal ha desarrollado un condicionamiento aversivo al sabor (Welzl et al., 2001). 1) ANTES DEL CONDICIONAMIENTO LiCI ~ 2) DURANTE EL CONDICIONAMIENTO ~~-~~-~~ ¡ LiCI 3) DESPUÉS DEL CONDICIONAMIENTO Fig. 6. Modelo del condicionamiento aversivo al sabor. 1) Un estímulo incondicionado aversivo (El) como fa inyección i.p. de cloruro de litio (LiCI) causa una respuesta incodicionada (Rl), tal es el caso del malestar gástrico. 2) El estímulo incondicionado se asocia con un estímulo neutro (EN) como un sabor novedoso. 3) 21 Después el EN provoca una respuesta de evitación llamada respuesta condicionada (RC) por lo que al estímulo neutro ahora se le denomina estímulo condicionado (EC). El CAS se ha convertido en una herramienta sensible en la investigación en farmacología y conducta debido a que posee diversas ventajas: es adquirido rápidamente, su uso es extensoy es altamente replicable; además, se cuenta con una amplia cantidad de datos anatómicos y farmacológicos, que implican la participación de distintas estructuras cerebrales, neurotransmisores, receptores y procesos celulares vinculados con la adquisición del CAS (Welzl et al. , 2001 ; Riley y Freeman, 2004) . 2.4. CONDICIONAMIENTO AVERSIVO AL SABOR Y SEROTONINA. Se han llevado a cabo estudios para esclarecer la participación de diversas estructuras cerebrales y sistemas de neurotransmisión en la adquisición del condicionamiento aversivo al sabor. Algunas de estas estructuras son : el núcleo del tracto solitario, tálamo, amígdala, área gustativa cortical , núcleo parabraquial y el cerebro anterior, el cual involucra el área septal medial , corteza insular y núcleo basal de meynert (Yamamoto et al. , 1998; Miranda et al. , 2003; Bermudez-Rattoni et al., 2005). Varios autores apoyan la idea de que los sitios cerebrales responsables de la fo rmación del CAS, deben ser aquellos en donde las interacciones entre las señales gustativas y viscerales tienen lugar. Algunos estudios neuroanatómicos sugieren que esas áreas son el núcleo parabraquial, la corteza insular y la amígdala (Yamamoto y Fujimoto, 1991; Sakai y Yamamoto , 1999; López-Grancha et al. , 2002). También se ha reportado que no todas las estructuras que intervienen en el CAS, participan de la misma manera ni con una misma función siempre. Por ejemplo, la administración de serotonina por medio de microinyecciones cerebrales en la amígdala, aumenta el tiempo de ingesta de sacarina (como estímulo aversivo) , pero no altera la adquisición del CAS, mientras que la lesión electrolítica de dicha estructura , disminuye la neofobia hacia los estímulos novedosos, incrementa el tiempo de ingesta de sacarina y altera la 22 adquisición del CAS, mostrando una mayor ingesta de suerosa en la sesión prueba en comparación con los sujetos no lesionados (Borsini y Rolls , 1984). El número de estudios que explican la participación de la serotonina en el condicionamiento aversivo al sabor es escaso. Meneses en 1999, concluyó que los receptores 5-HT 3 , localizados principalmente en áreas límbicas y en varios de los núcleos del tallo encefálico que proyectan hacia el cerebro anterior, están implicados en la conducta aversiva (Meneses, 1999). De igual forma , el indorrenato (5-methoxitriptamina ~-metilcarboxilato , INDO), agonista serotonérgico afín a los receptores 5-HTw 1812c, es capaz de ejercer control discriminativo sobre la preferencia de la sacarina , no obstante, en este estudio no se mide la adquisición del CAS (Miranda et al. , 2001) . La serotonina ha demostrado tener un papel importante en distintos procesos cognitivos y en diferentes tareas, sin embargo, la literatura existente sobre su participación en el condicionamiento aversivo al sabor es escasa. Algunos autores han hecho uso de fármacos que ayudan a disminuir las concentraciones centrales de serotonina con el fin de evaluar a los sujetos después de haber ejecutado algunas tareas y observar de esta forma las consecuencias de la alteración del sistema serotonérgico sobre la ejecución de la tarea. Por ejemplo, se ha reportado que el disminuir los niveles centrales de serotonina a través de la participación de receptores presinápticos , con el agonista serotonérgico de los receptores 5-HT1 A. el 8-0H-DPAT, anterior al entrenamiento en CAS, no altera la adquisición de éste (Limbeer y Parker, 2003), el mismo resultado se obtuvo ante la administración de paraclorofenilalanina (PCPA inhibidor de la triptófano hidroxilasa) antes del entrenamiento en CAS (Wegener y Smith , 1997). Sin embargo la administración de nefazodona (antidepresivo que antagoniza a los receptores 5-HT 2A) bloquea el CAS adquirido anteriormente (Gorzalka et al. , 2003) . A pesar de que se ha reportado que la alteración del sistema serotonérgico con fármacos no se han encontrado resultados definitivos que afirmen que la serotonina tiene un rol importante en el aprendizaje del CAS. Adicionalmente, la interacción del sistema serotonérgico con el CAS se ha estudiado en diferentes niveles, por ejemplo, se han conducido estudios con el fin 23 de evaluar si fármacos agonistas o antagonistas serotonérgicos pueden utilizarse como estímulo incondicionado para inducir CAS, se ha visto que los agonistas de los receptores 5-HT 1 y 5-HT 2 , pueden funcionar como sustancia inductora del condicionamiento aversivo al sabor, dependiendo de la dosis. Aunque no queda claro si el efecto es por un malestar inducido por la droga o por un efecto hipofágico mediado por saciedad; de igual forma se reportó que la fluvoxamina, un inhibidor de la recaptura de la serotonina, funciona como estímulo incondicionado para desencadenar el condicionamiento aversivo al sabor (Olivier et al. , 1999; De Vry et al., 2000) . 2.5. CONDICIONAMIENTO AVERSIVO AL SABOR Y ACETILCOLINA. Como se comentó anteriormente, muchos sitemas de neurotransmisión están involucrados en los procesos cognitivos . Uno de los sistemas de neurotransmisión que con mayor frecuencia se ha relacionado con la cognición es el colinérgico. La acetilcolina (ACh) es una molécula que se deriva a partir de la unión de la acetil-coenzima A, a través de varios pasos metabólicos y de la colina, que debe proceder de la dieta ya que el tejido nervioso no puede sintetizarlo por sí solo. Es en las células nerviosas en donde la enzima acetiltransferasa se encarga de catalizar a ambos precursores para producir la acetilcolina. Finalmente, ésta molécula es degradada por la acetilcolinesterasa (Kandel , 2001 ; Ganong, 1992). Los receptores de acetilcolina se dividen en dos grandes grupos: los nicotínicos y los muscarínicos. A diferencia de los receptores nicotínicos, los llamados muscarínicos (M) poseen una mayor cantidad de subtipos que van del 1 al 5 (M 1, M2, M3, M4 y M5) , estos tienen su participación tanto fuera del SNC (ganglios autónomos, corazón, músculo liso y glándulas secretoras) así como dentro de él. Las principales estructuras cerebrales en donde se ha demostrado su participación se identifican en el cuadro 7. 24 Cerebro anterior Banda diagonal de Broca { Área septal medial (Principales) Núcleo Basal de Meynert (Humanos); Di encéfalo Puente Sustancia nigra Hipocampo Amígdala Corteza insular Magno celular (otros mamíferos) Núcleo Basal Figura 7. Diferentes estructuras cerebrales en donde se han encontrado grandes cantidades de receptores muscarínicos (/lus tración modificada de Miranda el al., 2003). Las manipulaciones de la neurotransmisión de los receptores muscarínicos han demostrado afectar diversos aspectos del condicionamiento aversivo. Los experimentos farmacológicos han demostrado alteraciones al administrar antagonistas muscarínicos en la adquisición , consolidación y la evocación de la información en diferentes de las tareas, incluyendo al condicionamiento aversivo al sabor (Tinsley et al. , 2004). Existe evidencia de que las lesiones excitotóxicas en el Núcleo Basal Magnocelular (una de las principales fuentes de acetilcolina en el cerebro) antes del entrenamiento, produce alteraciones significativas en el aprendizaje del CAS. No obstante , la lesión del núcleo basal magnocelular posterior al entrenamiento en CAS, no produce cambios en el aprendizaje (González et al., 2000; Miranda et al., 2000) . Se ha propuesto que la acetilcolina puede modular el procesamiento de los estímulos gustativos novedosos ya que ante la presentación de un estímulo gustativo novedoso, el Núcleo Basal Magnocelular activa sus proyecciones hacia la corteza insular, sitio en donde se observa un incremento significativo de liberación de acetilcolina, fenómeno que no se observa ante la presentación de un estímulo gustativo familiar. Este incremento de acetilcolina en la corteza insular se pierdeprogresivamente más ante la presentación subsecuente del estímulo 25 gustativo. (Naor y Dudai , 1996; Miranda et al ., 2000; Ferrerira et al ., 2002; Miranda et al ., 2003; Ramírez-Lugo et al ., 2003; Bermudez-Rattoni et al ., 2005). Otros estudios han demostrado que el bloqueo de los receptores muscarínicos por medio de escopolamina, es capaz de alterar el aprendizaje del CAS, por ejemplo cuando la escopolamina es administrada directamente en la corteza insular previamente al proceso de la adquisición del éste (Gutiérrez et al., 2003; Miranda et al ., 2003; Amani , 2004). La evidencia experimental refleja una importante regulación colinérgica del CAS, por lo cual , el efecto negativo de anticolinérgicos sobre la adquisición del CAS, representa un adecuado marco de comparación para evaluar la participación de otros sistemas de neurotransmisión durante el CAS. 3. JUSTIFICACIÓN. En el sistema nervioso, la serotonina es un neurotransmisor que juega un papel importante en la regulación de diversos procesos cerebrales como el ciclo sueño- vigilia , la ingesta de alimento , la regulación del dolor y del estado de ánimo, entre otros (Goldman, 1996; Carlson , 2001). Se ha demostrado que tiene un papel importante en los procesos cognitivos, particularmente en el aprendizaje y la memoria. Como se resume en la tabla numero 2, algunos estudios apoyan la postura de que la reducción de los niveles centrales de serotonina puede deteriorar algunos procesos cognitivos . De manera contraria , evidencia diferente manifiesta que la serotonina puede favorecer estos procesos, finalmente también existen reportes que afirman que no existen alteraciones al manipular las concentraciones de dicho neurotransmisor, por lo que el papel de la 5-HT en los procesos cognitivos como el aprendizaje y la memoria , no se ha comprendido por completo, y este tema se encuentra actualmente en estudio (Meneses, 1999). Se sabe que la fuente principal de la serotonina se encuentra en los núcleos del rafé , particularmente en el dorsal y el medial , estos tienen proyecciones tanto a áreas corticales como subcorticales, específicamente, el núcleo dorsal tiene proyecciones hacia áreas como la corteza cerebral y la amígdala, las cuales han 26 sido relacionadas con el aprendizaje, particularmente con el condicionamiento aversivo al sabor (Goldman, 1996; Staley et al., 1998; Yamamoto et al., 1998; Carlson , 2001; Miranda et al., 2003). Aunque algunos estudios han argumentado que la disminución de los niveles centrales de serotonina no altera la adquisición del CAS (Limbeer y Parker, 2003; Wegener y Smith, 1997), no existen suficientes estudios que apoyen esta teoría, además de que los métodos experimentales con los que se ha llegado a estos resultados han sido escasos. Por lo tanto la presente investigación tiene como objetivo evaluar el efecto de la lesión del núcleo dorsal del rafé, sobre la adquisición del condicionamiento aversivo al sabor, de manera que se puedan confirmar o rebatir los hallazgos previos . Asimismo, los resultados serán comparados con el efecto de un anticolinérgico amnésico clásico, la escopolamina la cual ha demostrado en varios estudios su capacidad para alterar la adquisición del condicionamiento aversivo al sabor (Gutiérrez et al., 2003; Miranda et al., 2003; Amani, 2004). 4. OBJETIVOS. 4.1. OBJETIVO GENERAL. Evaluar el efecto de la lesión electrolítica del núcleo del rafé dorsal sobre la adquisición del condicionamiento aversivo al sabor. 4.2. OBJETIVOS PARTICULARES. a) Evaluar el efecto de la lesión electrolítica del núcleo del rafé dorsal sobre la ingesta de agua. b) Valorar el efecto de la administración intraperitoneal del antagonista colinérgico muscarínico, escopolamina, sobre el aprendizaje del condicionamiento aversivo al sabor. 27 c) Comparar el efecto de la lesión del núcleo dorsal del rafé con la administración de escopolamina sobre la adquisición del condicionamiento aversivo al sabor. 5. MÉTODO. 5.1. SUJETOS. Se utilizaron ratas machos de la cepa Wistar (Facultad de Psicología UNAM, N=41) sin experiencia experimental previa, con un peso corporal entre 350 y 400 g al inicio del experimento. Desde el principio, las ratas fueron alojadas individualmente en cajas de acrílico de 32x22x14 cm. Con acceso libre al alimento sólido (Roedent Laboratory Chow) y líquido. Las ratas se mantuvieron en un cuarto con temperatura ambiental de 22ºC ± 1 ºC. bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 hrs. 5.2. MATERIALES. Las sesiones experimentales se llevaron a cabo en cajas de acrílico de 32x22x14 cm. Dependiendo de la condición experimental , las ratas tuvieron acceso a los líquidos a través de una o dos probetas graduadas (25ml), las cuales se colocaron frente a la pared anterior de la caja . Las ratas fueron pesadas en una balanza granataria (Scout, EUA). Las cirugías se llevaron a cabo utilizando un aparato estereotáxico (David Kroff) , cama térmica, un electrodo de acero inoxidable calibre 22, aislado con esmalte a excepción de las últimas 500µm de la punta, pieza de mano (ARATHON, SAEYANG CORPORATION, Korea), estimulador de corriente directa (GRASS, EUA). Para la veri ficación histológica se requirió un histokinette (Sakura Finetechnical CO., L TO., Tokio, Japón) , microtomo (Reichert-Jung 2030, lowa, EUA), baño de flotación (Leica , China), microscopio (ZEISS, Alemania) . 28 5.3. PROCEDIMIENTO. Se registró el peso inicial de las ratas a la llegada al laboratorio, antes de la cirugía (para los grupos sham y lesión) y antes del entrenamiento en CAS. Posteriormente, los sujetos fueron asignados aleatoriamente en cuatro grupos: 1) Control íntegro (n=9). 2) "Sham" ó Lesión falsa (n=12) . 3) Lesión del núcleo del rafé (n=12) . 4) Escopolamina (n=8). En la figura 8, se muestra un diagrama que representa a los cuatro grupos, así como el procedimiento que se llevó a cabo para cada uno de ellos. 29 CAS CONTROL SHAM LESIÓN SACARINA+ LiCI RATAS MACHO CEPA WISTAR (N = 41) CIRUGÍA HABITUACIÓN (LÍNEA BASE) 10 dias ENTRENAMIENTO 3 sesion es SESIÓN PRUEBA AGUA VS SACARINA CAS ESCOPOLAMINA ESCO + SACARINA + LiCI VERIFICACIÓN HISTOLÓGICA Fig.8. Diagrama del procedimiento experimenta/ para los cuatro grupos. 41 Ratas macho de la cepa Wistar se dividieron en 4 grupos. Sólo los grupos sham y /esiónji1eron sometidos a cirugía. Posteriormente, se llevó a cabo una fase de habituación durante I O días en Jos cuatro grupos, en la cual las ratas ji1eron entrenadas a 30 consumir agua por JO minutos, asimismo, se obwvo Ja línea base de ingesta de agua. Una vez estabilizada la línea base, el entrenamiento en CAS se realizó en los cuatro grupos: los grupos control, sham y lesión recibieron la inyección de cloruro de litio LiCI (2 ml/Kg, i.p.) inmediatamente después de la ingesta de sacarina, mientras que al gnipo escopolamina se le administró bromuro de escapo/amina (2 ml/Kg, i.p.) antes de la ingesta de sacarina y posterior a Ja ingesta de sacarina se le administró el cloruro de litio en la concentración antes mencionada. Se realizó una sesión pnteba en los cuatro grupos, la cual consistió en oji'ecer una probeta con agua simple y la otra con sacarina, de manera que las ratas pudieran escoger entre ambas opciones. Se registró el consumo total de agua y de sacarina. Por último se realizaron las histologías correspondientes, con el fin de verificar el sitio y el tamaíio de la lesión. 5.3.1. PROCEDIMIENTOS QUIRÚRGICOS. Una vez asignados a sus grupos experimentales, las ratas del grupo de lesión fueron sometidas a cirugía estereotáxica con el fin de realizar una lesión electrolítica en el núcleo dorsal del rafé. El grupo sham siguió el mismo procedimiento quirúrgico pero sin efectuar la lesión electrolítica (Fig. 9) . Para los grupos control íntegro y escopolamina no se realizó ningún procedimientoquirúrgico. Las cirugías se realizaron bajo anestesia con hidrato de cloral , en dosis 400 mg/kg, administrado intraperitonealmente (i.p.). Las ratas ya anestesiadas, fueron rasuradas de la parte superior de la cabeza y se les montó en el aparato estereotáxico de manera que quedaran fijas sin posibilidad de movimiento, el cuerpo descansó sobre una cama térmica. Después se llevó a cabo la antisepsia limpiando la piel con Yodopovidona (Laboratorios Manuel, SA, México) y se administró 0.1 mi de Xilocaína por vía subcutánea al 2% (Astra Chemicals SA, México) como anestésico local ; posteriormente, se realizó una incisión longitudinal en la piel de la cabeza en sentido antero-posterior; se colocaron separadores para piel de tal manera que el cráneo quedara expuesto, éste se limpió con una gasa estéril hasta que las suturas craneales quedaran claramente visibles y la superficie craneal estuviera seca. En las condiciones anteriores, se identificaron Bregma y Lambda y la barra de los incisivos fue nivelada de manera que la altura de ambos puntos fuera la misma. Se identificó el sitio en donde se realizó el trepano en el cráneo de la rata con una pieza de mano según las coordenadas estereotáxicas (AP -7.5 mm, L ±O.O y V - 6.3) con respecto a bregma (Paxinos y Watson , 1998). Las lesiones electrolíticas se llevaron a cabo introduciendo un electrodo que liberó una descarga equivalente 31 a 1.0 mA durante 50 segundos . La punta del electrodo se colocó con la técnica estereotáxica (AP - 7.5, L ±O, V - 6.3) con respecto a Bregma (Paxinos y Watson, 1998) como lo muestra el siguiente esquema: Fig. 9. Esquema representativo de la dirección de la entrada del electrodo (A y B) al NDR; así como la extensión de la lesión en el grupo lesión (B). Después de realizar la lesión, se extrajo el electrodo y el trepano se rellenó con gelfoam, los separadores de piel se retiraron y se suturó la piel con sutura de nylon 3-0 . Por último, se les inyectó 0.5 mi de Bencilpenicilina procaínica (Penprocilina 800 000 unidades, Lakeside, México) vía intramuscular (i .m.), con objeto de prevenir algún proceso infeccioso que pudiera tener lugar a raíz de la cirugía y se les regresó a su caja en donde se les proporcionó alimento sólido (Roedent Laboratory Chow) y líquidos ad libitum, así como cuidados de higiene por tres días antes de comenzar con la fase de habituación al consumo de agua. 32 5.3.2. HABITUACIÓN AL CONSUMO DE AGUA. Para los cuatro grupos, los bebederos fueron retirados de las cajas y los sujetos sólo tuvieron acceso al agua en su caja una vez al día durante 1 O min , entre las 15:00 y 15: 1 O hrs, por un periodo de 1 O días consecutivos. Lo anterior con la finalidad de que las ratas se habituaran al consumo en las probetas, al horario de ingesta de líquidos y con el objetivo de registrar la cantidad de líquido ingerido diariamente. 5.3.3. ENTRENAMIENTO EN CONDICIONAMIENTO A VERSIVO AL SABOR. Al día siguiente de terminar la fase de habituación al consumo de agua, se realizaron las 3 sesiones de entrenamiento en CAS, las cuales se alternaron con días de ingesta de agua simple (sesiones de descanso), de igual forma que en la fase de habituación. La finalidad de las sesiones de descanso fue evitar la deshidratación de los sujetos. El entrenamiento en CAS consistió en sustituir el agua por una solución de sacarina diluida en agua al 0.15% a la cual las ratas tuvieron acceso durante 1 O minutos, inmediatamente después se les inyectó cloruro de litio -LiCI- (2.0 ml/kg, i.p.) en una concentración de 0.38 M. Dos horas después de la inyección, se les ofreció agua por un periodo de tiempo de 10 min , también con el fin de evitar la deshidratación de los sujetos. Los grupos control íntegro, sham y lesión completaron el entrenamiento en CAS como se mencionó anteriormente, mientras que al grupo escopolamina se le inyectó hidrocloruro de escopolamina (2.0 ml/kg, i.p.) 20 minutos antes de la ingesta de sacarina en los días de entrenamiento y se continuó con el entrenamiento en CAS del mismo modo que en los demás grupos. 5.3.4. SESIÓN PRUEBA. Al concluir el último día de entrenamiento en CAS, se dio una sesión de descanso y al día siguiente se realizó la sesión prueba, la cual consistió en ofrecer a cada 33 rata 2 probetas al mismo tiempo, una de ellas contenía agua simple y la otra la solución de sacarina, con la finalidad de que la rata pudiera escoger entre ambas, 10 min después se registró la cantidad de ingesta de agua y sacarina respectivamente . 5.3.5. VERIFICACIÓN HISTOLÓGICA. Para la obtención de los cerebros de las ratas, se realizó una perfusión intracardiaca a los sujetos de los grupos sham y lesión. Inicialmente se les administró una sobredosis (800 mg/kg , i.p.). de hidrato de cloral (Productos químicos Monterrey, México) . Una vez anestesiadas, se llevó a cabo una incisión longitudinal de manera que quedaran expuestos los órganos de la caja torácica . Inmediatamente después, se introdujo una venoclisis en el ventrículo izquierdo del corazón , a través de la cual se administraron 250-450 mi de solución salina isotónica al 0.9% y después 250-450 mi de formaldehído diluido en agua al 4.0%; la aguja se sujetó con una pinza Alisan . Posteriormente se decapitó a la rata y se abrió la cavidad craneal para obtener una biopsia exicional del cerebro utilizando una espátula para ayudar a disecar los tejidos adyacentes. Los cerebros extraídos se dejaron fijar por 24 horas sumergidos en un frasco con formaldehído al 4.0%. Al concluir el tiempo de fijación , los cerebros se lavaron con agua hasta que se eliminaron los residuos de formaldehido. A continuación se procesaron con ayuda del histokinette de tal manera que los tejidos completaran tres pasos: el primero fue deshidratar los tejidos, para lo cual se les dieron baños con alcohol etílico en distintas concentraciones: 2 de alcohol al 80%, 2 de alcohol al 96% y tres de alcohol al 100% (alcohol absoluto) ; cada baño fue de 1 hr. El siguiente paso fue aclarar el tejido utilizando xileno llevando a cabo 3 baños de 1 hr. Por último, se infiltraron en parafina Histosec dando dos baños con duración de 2 hrs respectivamente. Después los tejidos se incluyeron en bloques de parafina. Una vez incluidos, se realizaron cortes histológicos de 7.0 µm de espesor con el microtomo, se dejaron estirar en el baño de flotación que contenía agua a 50ºC con 0.5g de grenetina diluida y se recogieron en un portaobjetos (Corning , México) . 34 Se realizó una tinción de rutina : Hematoxilina-Eosina de acuerdo con los lineamientos del manual de histotecnología (Armed Forces In Pathology, 1992) para identificar los cuerpos celulares de las demás estructuras y verificar el sitio de la lesión. Los cortes se desparafinaron con ayuda de calor y xileno (J.T. Baker, México), se hidrataron pasando por 4 lavados utilizando alcoholes graduales (100%-96%-80%) hasta llegar a agua, al tener hidratado el tejido, se tiñó dando un baño de 5 minutos de duración con Hematoxilina, los excesos de Hematoxilina se quitaron con baños rápidos de agua y alcohol ácido (en dilución 99% alcohol al 80% : 1% ácido clorhídrico <HCL>), los residuos de alcohol ácido se eliminaron con tres lavados rápidos en agua y posteriormente la Hematoxilina se viró con agua amoniacal (en dilución 99% agua : 1 %), se enjuagaron en agua y después se bañaron en alcohol al 90%. Después se sumergieron en Eosina Amarillenta en dilución 50% sol. Stock: 50% alcohol al 80% y 1 mi de ácido acético glacial. Finalmente se deshidrataron dando 4 baños rápidos de alcoholes graduales (80%-90%100%) y 2 baños rápidos en Xi len o. Los tejidos se montaron con un cubreobjetos, utilizando como medio de montaje ENTELLAN (Merk, Alemania) , para ser observados al microscopio utilizando distintos aumentos: 5X, 10X y 40X. El sitio de la lesión se ubicó siguiendolas referencias del atlas estereotáxico (Paxinos y Watson, 1998). Una vez identificado el sitio de la lesión, se escogieron cortes representativos y se decoloraron con alcohol ácido y agua para realizar una tinción especial que diferencia los cuerpos celulares de la mielina < Luxol-Fast- Blue ó Kluver-Barrera> (Armed Forces in Pathology, 1992), con el fin de verificar la extensión de la lesión. Las laminillas con los cortes se colocaron en la solución de luxol fase blue en un horno a 56º C toda la noche, al día siguiente se quitó el exceso de colorante con alcohol etílico al 95% y se enjuagaron en agua destilada, se diferenciaron en carbonato de litio por 30 segundos y se deshidrataron en alcohol etílico al 70% hasta que la materia gris quedara clara y la materia blanca se definiera completamente; se colocaron en agua destilada y se contrastaron con cresyl violeta por 6 minutos, posteriormente, se enjuagaron en agua destilada y por último se llevó a cabo la deshidratación por 35 medio de alcoholes graduales (96%-100%) hasta llegar a xileno y se montaron utilizando ENTELLAN. Se excluyeron todos aquellos casos en donde la lesión no acertó en el núcleo del rafé dorsal , o bien cuando la extensión de la lesión fuera menor al 75% del área del núcleo dorsal del rafé. 5.3.6. FÁRMACOS. Bencilpenicilina procaínica disuelta en agua inyectable (4 mi) administrada vía intramuscular (i .m.), dosis 400,000 unidades por kilogramo, hidrato de cloral , dosis 400mg/kg , escopolamina HCL, dosis 2.0 mg/kg, SIGMA, St. Louis, EUA), cloruro de litio -LiCI-, dosis 2.0 mg/kg de una solución 0.38M(BAKER, México) disueltos en solución salina isotónica (0.9% NaCI) e inyectados intraperitonealmente (i .p.); sacarina (Eli Lilly, México) disuelta en agua al 15%, administrada por vía oral ; Yodopovidona, administración cutánea, Xilocaína al 2% administrada subcutáneamente. 5.3. 7. ANÁLISIS DE DA TOS. Se recolectaron los datos de la ingesta de líquidos en todas condiciones. Posteriormente los datos se analizaron utilizando la prueba ANOVA de dos vías. Para las comparaciones post hoc se utilizó la prueba de Tukey. Cabe mencionar que el nivel de significancia que se tomó fue p ::; 0.05, cualquier p mayor a este valor , se consideró como no significativo. 6. RESULTADOS. Verificación histológica de los grupos sham y lesión. La verificación histológica de las lesiones se llevó a cabo tomando en cuenta las referencias del atlas estereotáxico (Paxinos y Watson, 1998). Los sujetos en los 36 que la lesión no se realizó correctamente o no se acertó en el núcleo dorsal del rafé, fueron eliminados del estudio. Las lesiones fueron localizadas mediante el uso de una tinción de rutina : Hematoxilina y Eosina (HE), con los aumentos 10X, 20X y 40X (Fig . 11) . Una vez identificadas, se delimitó la extensión de las mismas por medio de la tinción de Luxol Fast Blue (L-F-B) , la cual, diferencia las fibras mielinizadas de los cuerpos celulares. En los cortes histológicos del grupo sham, se distingue sólo la presencia de un trayecto fino debido al paso del electrodo a través del núcleo dorsal del rafé , no se observaron células inflamatorias ni datos de hemorragia (Fig . 10). Fig JO. Fotomicrografia representativa del núcleo dorsal del rajé en el grupa sham. Obsérvese el paso del electrodo a través del núcleo (A), así como la presencia casi total de las neuronas de l NDR (8). Luxo/ Fas/ 8/ue (l-F-8) I O X En el grupo lesión , se hizo evidente la presencia de células histiocíticas (macrófagos) ocupando el espacio causado por la lesión electrolítica, éstos mostraron restos de hemosiderina en su interior, lo cual sugiere la presencia de hemorragia antigua (Figs. 11 y 12) . 37 Fig. I 2. Fotomicrografia representativa que muestra la lesión del núcleo dorsal del rajé pe1fectamente delimitada gracias a la linción de luxol-Fast-Blue (D), la cual diferencia la mielina de los cuerpos celulares. 40X. Fig. I l. Fotomicrografia representativa de la lesión del núcleo dorsal del rajé (C). Se observan macrójagos ocupando el espacio ocasionado por la descarga electrolitica. H-E 40X. 38 Habituación al consumo de agua. Posterior a los procedimientos quirúrgicos en los grupos sham y lesión y a la ausencia de manipulaciones experimentales por los días correspondientes en el grupo control y escopolamina se evaluó el consumo basal de agua: no se obtuvieron diferencias significativas entre los cuatro grupos, durante los diez días de habituación [F (3, 37) = 1.26; p > 0.05], es decir, la ingesta de agua se mantuvo siempre homogénea entre los grupos, independientemente de las manipulaciones quirúrgicas en los grupos sham y lesión (Gráfica 1). Al final de la línea base, todos los grupos presentaron un consumo similar de agua (p>0.05) . Éste análisis demuestra que ni las manipulaciones quirúrgicas ni la lesión afectan el consumo basal de agua. Cabe destacar que durante la línea base, las ratas del grupo escopolamina no recibieron la administración del fármaco, sino hasta el entrenamiento en CAS. 20 ~¡ssei ~ ~~a I <l'. 15 • ::> i ' C) <l'. w ! o 10 o :::2: • CIRUGÍA LESIÓN Y SHAM ::> • LESIÓN (f) z 6. SHAM o 5 D CONTROL o VI ESCOPOLAMINA o o 2 4 6 8 10 12 14 Cx LESIÓN LÍNEA BASE Y SHAM Gráfica J. Ingesta de agua durante los JO días de habituación anteriores al entrenamiento en CAS (línea base). No existen diferencias significativas en el consumo de agua ente los cuatra grupos (p > 0.05). Para el 39 final de la línea base, todos los grupos estabilizaron el consumo de agua. Los datos son medias ± error Standard. Adquisición del CAS en los grupos control, sham y lesión. El entrenamiento en GAS se llevó a cabo en tres sesiones sustituyendo el agua con la solución de sacarina al 0.15% y administrando inmediatamente después de cada sesión una inyección de cloruro de litio LiCI (2ml/Kg , i.p.). En el primer dia de entrenamiento, la cantidad promedio de solución de sacarina consumida fue de 20.1 mi , entre los tres grupos; mientras que el promedio del consumo en el décimo día de línea base fue de 19.83 mi, es decir, la diferencia promedio en el consumo tanto de agua como de sacarina fue mínima, por ende no fue significativa estadisticamente [F (2,30)= 1.43; p>0.05]. Lo anterior indica que el consumo de los tres grupos no se afectó por la introducción de un sabor novedoso (neofobia). En cuanto a la adquisición del condicionamiento aversivo al sabor (Gráfica 2) , el grupo control presentó una curva de aprendizaje muy pronunciada, el consumo de sacarina disminuyó desde el segundo día , alcanzando una disminución del 69% en el tercer día comparado con el primer día de entrenamiento. Las diferencias del segundo y tercer día son significativas con respecto al primero, lo que sugiere un gran aprendizaje por parte del grupo control. Por el contrario, los grupos lesión y sham, tienen una curva diferente a la del grupo control, siendo estas menos pronunciadas. Al tercer día de entrenamiento, los grupos lesión y sham redujeron su consumo de sacarina de manera significativa , aunque esta disminución sólo fue de menos del 30% aproximadamente, comparada con el primer día de entrenamiento. Cabe destacar que el hecho de que los sujetos con la lesión electrolítica del NDR, así como aquellos en los que se practicó solamente el procedimiento quirúrgico (sham) se mantuvieran iguales entre sí a lo largo de toda la curva (p > 0.05) , lo que demuestra que la alteración en la curva de adquisición del GAS no se explica específicamente por la lesión electrolítica del NDR (Gráfica 2) . 40 20 I < 15 z ii: < u < 10 en w e • LESIÓN o :E -b SHAM ::::l 5 en z D CONTROL o u o o 1 2 3 ÚLTIMO DIA ENTRENAMIENTO EN CAS LÍNEA BASE Gráfica 2. Adquisición del condicionamiento aversivo al sabor. la gráfica muestra el último día de ingesta de agua y los tres días del entrenamientoen CAS para los grupos control, sham y lesión. No existen diferencias significmivas entre el ultimo día de la línea base y el primer día de entrenamiento en CAS (p > 0.05). El grupo control disminuyó la cantidad de ingesta de sacarina significativamente a partir de l segundo día de entrenamiento con respecto al primer día; mientras que los grupos lesión y sham lo hicieron hasta el tercer día de entrenamiento (p = 0.041 y O. 0001). Al final, los gnipos lesión y sham, mostraron diferencias significativas con el grupo control (p = O. 057 y O. 02, respectivamente). Sesión prueba de los grupos control, sham y lesión. La sesión prueba se realizó ofreciendo a los sujetos dos probetas: una con agua y la otra con la solución de sacarina al 0.15%, de manera que pudieran escoger entre los dos sabores. El consumo de sacarina se registró en los tres grupos y se compararon entre sí. Los resultados muestran una ligera tendencia a consumir más sacarina en los grupos lesión y sham (4.8 y 4 mi , respectivamente) en comparación con el grupo control (1 mi) como se puede observar en la gráfica 3. No obstante, cuando se realizó el análisis estadístico, se observó que no existen diferencias significativas en el consumo de sacarina entre los tres grupos [F (2,30) 41 = 2.58; p = 0.09]. Lo anterior indica que la lesión del NDR o las manipulaciones quirúrgicas per se, no son capaces de afectar significativamente el aprendizaje del CAS. Además, el hecho de que se observe una tendencia similar en el consumo de sacarina tanto en el grupo sham como en el lesión , sugiere que este fenómeno no fue causado específicamente por la lesión del NDR, por lo que se podría deducir que ésta estructura , por si misma, no es determinante para el aprendizaje del condicionamiento aversivo al sabor. 6 I <( z a: 4 <( ü <( (/) w o o ::¡¡¡ 2 => (/) z o ü o LESIÓN SHAM CONTROL Gráfica 3. !ngesta de sacarina de los grupos control, shom y lesión. la gráfica muestra el consumo promedio de sacarina de cada grupo durante la sesión prueba. No existen diferencias estadísticamente significativas entre los tres grupos (p > 0.05). El grupo lesión consumió 4.8 mi, mientras que el grupo 4.04 mi y finalmente, la ingesta del grupo control fue del mi. Adquisición del CAS en los grupos control, lesión y escopolamina. Con el objetivo de analizar con mayor profundidad los datos anteriores, se comparó el efecto de la lesión del núcleo dorsal del rafé con el de un control negativo, utilizando un agente farmacológico amnésico clásico, la escopolamina, la cual fue administrada 20 minutos antes de cada sesión de entrenamiento en CAS (2.0 mg/Kg, i.p.). Finalmente , ambos grupos fueron comparados con el grupo control. 42 Como se puede observar en la gráfica 4, la administración de escopolamina tampoco creó neofobia , ya que el consumo de agua en el último día de línea base no tuvo diferencias significativas con el primer día de entrenamiento con la solución de sacarina al 0.15%. Por otra parte, el grupo escopolamina muestran diferencias en su curva de aprendizaje, en comparación con el grupo control. Las ratas inyectadas con escopolamina sólo muestran una reducción del 32.72% en el tercer día de entrenamiento comparado con el primero. En el caso del grupo control , esta disminución fue del 69% como ya se había mencionado anteriormente. En lo que respecta al grupo escopolamina, comparado con el grupo lesión, ambos grupos sólo muestran diferencias significativas en el segundo día de entrenamiento [F (3,37) = 4.39; p = 0.009] . ~ 20 I en o o 15 s o ':J w o 10 o ::!: :::> en z o 5 (..) o • LESIÓN -D CONTROL ..s;¡¡- ESCOPOLAMINA 1 * 2 3 ÚLTIMO DIA LÍNEA BASE ENTRENAMIENTO EN CAS Gráfica 4. Última día de habituación al consuma de agua y entrenamiento y de los grupos control, lesión y escapo/amina. No se observan diferencias significativas entre el último día del consumo basal de agua y el primer día de entrenamiento entre los tres grupos (p > 0.05). El grupo escapo/amina difiere del grupo lesión en el segundo día de entrenamiento (p = O. 02), sin embargo, en el tercer día no muestra diferencias con ninguno de los otros dos grupos (p > O. 05). 43 Sesión prueba de los grupos control, lesión y escopolamina. En la sesión prueba se llevó a cabo el mismo procedimiento de elección entre dos probetas, en este caso se observó que en promedio, el grupo con escopolamina consumió 1 O mi de sacarina, lo que comparado con el grupo control, el cual, consumió 1 mi de sacarina, representa una diferencia del 90%. El análisis de varianza mostró diferencias significativas sólo entre el grupo control y escopolamina [F (3,37) = 4.36; p = 0.009], los resultados anteriores confirman una vez más que la escopolamina es un fármaco capaz de alterar el aprendizaje del CAS cuando se administra antes de parear el estímulo neutro con el estímulo incondicionado (sabor de la sacarina I inyección de cloruro de litio), por lo que se puede utilizar confiablemente como control negativo, es decir, como parámetro de comparación de alteración en el aprendizaje del CAS. Cuando se compararon los tres grupos (Gráfica 5), el grupo lesión no mostró diferencias con el grupo control (p > 0.05) y aunque tampoco se observan diferencias significativas entre el grupo lesión y el grupo escopolamina, este último consumió en promedio aproximadamente 100% más sacarina que el grupo lesión. Los resultados anteriores no permiten afirmar contundentemente la participación del NDR en el aprendizaje del CAS, mientras que la similitud de los resultados entre los grupos sham y lesión que se mencionó en el experimento anterior, sugiere que la disminución en el consumo de sacarina en el grupo con lesión no fue ocasionada específicamente por la lesión del NDR. 44 14 I 12 < z ii: < (.) < (/) w o o ~ ::> (/) z o (.) 10 8 6 4 2 o * CONTROL LESIÓN ESCOPOLAM INA Gráfica 5. lngesta de sacarina de los grupos control, lesión y escapo/amina durante la sesión prueba El grupo conrrol difiere estadísticamente con el grupo escapo/amina (p = O. 009), sin embargo, el grupo lesión no muestra diferencias con ninguno de los otros grupos (p > O. 05). El consumo promedio de la ingesta de sacarina en la sesión prueba del grupo escopolaminafue de 9.68 mi. 7. DISCUSIÓN. Los resultados de la presente investigación muestran que la lesión del NDR no afecta el consumo basal de agua, es decir, no altera la regulación de la ingesta de líquidos. De igual forma, no provoca aversión a estímulos gustativos novedosos (neofobia). En cuanto a la curva de adquisición del CAS, los sujetos control disminuyeron significativamente la ingesta de sacarina (69% aprox.). Por el contrario, en los sujetos con lesión en el NDR, la disminución del consumo de sacarina desde el primer día de entrenamiento hasta el tercer día no fue tan marcada (25.6% aprox.), sin embargo, durante el segundo día se observaron diferencias con respecto al grupo control , conservándose así hasta el tercer día. Cuando se comparó el grupo control con el grupo sham, se encontraron diferencias significativas entre ambos grupos a partir del segundo día, al igual que como sucedió con el grupo lesión. Por su parte, los sujetos del grupo sham siguieron el 45 mismo patrón de adquisición que aquellos con la lesión en el NDR, ya que no tuvieron diferencias entre sí a lo largo de toda la curva. En la sesión de prueba del aprendizaje, se observó en promedio una ligera tendencia a consumir más sacarina en el grupo con lesión y en el grupo sham, en comparación con el grupo control, no obstante, no se observaron diferencias estadísticamente significativas en la ingesta de sacarina entre los tres grupos. Por otra parte, los sujetos que recibieron escopolamina, difirieron de los sujetos que recibieron la lesión en el NDR sólo en el segundo día de la
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