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1 Resumen Los biofilms son estructuras complejas formadas por microorganismos que se fijan firmemente a una superficie mediante una matriz extracelular (conocida como EPS “extracelular polymeric substance”), generada por secreciones de los propios microorganismos y compuesta principalmente por polisacáridos, proteínas, lípidos y ADNe (ADN extracelular). La formación de los biofilms es un proceso ampliamente conocido, aunque sigue siendo objeto de estudio para profundizar todavía más en los mecanismos concretos que lo componen. El proceso se inicia cuando células plantónicas empiezan a adherirse en una superficie (metálica, plástica) y secretan sustancias viscosas (EPS) que fortalecen la adhesión y cohesión, a la vez que favorecen el crecimiento y la incorporación de nuevos microorganismos al sistema. Las deficiencias en los procesos de limpieza y desinfección, originados por una disminución de la frecuencia de higienización, presencia de puntos de difícil acceso, diseño higiénico deficiente de las instalaciones, falta de pericia de los operarios, etc., propician la presencia de restos de suciedad y la aparición de biofilms, que en un primer momento están constituidos por unas pocas capas de células bacterianas con uniones inicialmente débiles a las superficies y que, en el transcurso del tiempo, se adhieren más fuertemente e incrementan su biomasa, así como el número de especies microbianas que lo constituyen hasta alcanzar el rango de un biofilm multiespecie maduro, que actúa como reservorio de microorganismos patógenos, entre ellos Listeria monocytogenes. Esta bacteria ha demostrado su habilidad para colonizar biofilms formados originariamente por otros microorganismos, como Pseudomonas spp., y constituirse en parte relevante de dicho biofilm. De todos modos, un buen programa de limpieza y desinfección ha demostrado ser el mejor método de mantener la carga microbiana en unos niveles mínimos. Palabras claves: Biofilms, industria alimentaria, bacteria, limpieza y desinfección. LOS BIOFILMS EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA Inés Eusebio Cabell; Melany Guzmán Cervera; Thania Meza Pinedo; Florisa Yance Llimpe; Danilo Sánchez Vasquez; Alen Oscanoa Cuadros https://www.betelgeux.es/blog/2019/11/08/biofilms-multiespecie-en-la-industria-alimentaria/ 2 ABSTRACT Biofilms are complex structures formed by microorganisms that are firmly attached to a surface by means of an extracellular matrix (known as EPS “extracellular polymeric substance”), generated by secretions of the microorganisms themselves and composed mainly of polysaccharides, proteins, lipids and DNA (DNA extracellular). The formation of biofilms is a widely known process, although it is still the object of study to further delve into the specific mechanisms that compose it. The process begins when plantonic cells begin to adhere to a surface (metallic, plastic) and secrete viscous substances (EPS) that strengthen adhesion and cohesion, while favoring the growth and incorporation of new microorganisms into the system. The deficiencies in the cleaning and disinfection processes, caused by a decrease in the frequency of sanitization, the presence of points of difficult access, poor hygienic design of the facilities, lack of skill of the operators, etc., favor the presence of remains of dirt and the appearance of biofilms, which at first consist of a few layers of bacterial cells with initially weak bonds to the surfaces and which, over time, adhere more strongly and increase their biomass, as well as the number of microbial species that constitute it until it reaches the rank of a mature multispecies biofilm, which acts as a reservoir of pathogenic microorganisms, among them Listeria monocytogenes. This bacterium has demonstrated its ability to colonize biofilms originally formed by other microorganisms, such as Pseudomonas spp., And to become a relevant part of said biofilm. Still, a good cleaning and disinfection program has proven to be the best method of keeping microbial load to a minimum. Keywords: Biofilms, food industry, bacteria, cleaning and disinfection. 3 INTRODUCCIÓN La contaminación bacteriana de los alimentos representa un constante peligro al provocar brotes de enfermedades que afectan a millones de personas cada año, considerándose un problema emergente de salud pública. Estos brotes se originan por inadecuadas prácticas higiénicas del personal, contaminaciones cruzadas, materia prima contaminada y problemas ambientales, entre las principales causas. Dentro de ese contexto, en la industria de los alimentos las superficies son una de las vías de contaminación bacteriana más frecuentes. Cuando las condiciones son adecuadas, las bacterias se adhieren a las superficies formando biofilms, los cuales son difíciles de eliminar incluso con las mejores prácticas de higiene, ya que las bacterias cuando se encuentran dentro de estas estructuras son mucho más resistentes a cambios ambientales externos. Así, los biofilms pueden sobrevivir en entornos de plantas alimentarias, constituyendo un importante problema de higiene. Así, una mayor comprensión de los mecanismos utilizados por los microorganismos en sus procesos de adhesión a las diferentes superficies proporcionará una base para el desarrollo de mejores materiales, métodos y estrategias que permitan remover, prevenir o potenciar activamente la formación de biofilms, según sea la necesidad. BIOFILMS Los biofilms se definen como comunidades complejas de microorganismos que crecen embebidos en una matriz orgánica polimérica autoproducida y adherida a una superficie viva o inerte, y que pueden presentar una única especie microbiana o un abanico de especies diferentes. Los biofilms constituyen un mecanismo de protección de los microorganismos frente a los productos biocidas utilizados habitualmente en las industrias alimentarias. La persistencia de Listeria monocytogenes, Salmonella spp. y otros microorganismos patógenos en las plantas de procesado de alimentos se encuentra muy relacionada con la presencia de biofilms, que son estructuras formadas por una matriz de material segregado por las células, compuesto por proteínas, lípidos, polisacáridos. Fases de desarrollo de biofilm. El biofilm bacteriano empieza a formarse cuando alguna célula individual se une inicialmente a una superficie. La capacidad de la célula para realizar este ataque inicial depende de factores ambientales como la temperatura y el PH, y de factores genéticos que codifican las funciones motrices, la sensibilidad ambiental, las adhesinas y otras proteínas. Aunque la combinación de los factores que influyen en el desarrollo del biofilm depende en principio de la especie, algunas características son 4 comunes a la mayoría de bacterias estudiadas hasta ahora. La formación de un biofilm, no es un proceso aleatorio sino que sigue una sistemática que permite su predicción. Se han identificado cinco fases: una adsorción reversible de la bacteria a la superficie, una unión irreversible, una primera fase de maduración con crecimiento y división, la segunda fase de preduccion del exopolimero, y el desarrollo final de la colonia con dispersión de células colonizadoras (Calvente, 2021). Acondicionamiento de la superficie Las bacterias son capaces de formar biofilms sobre muchas superficies bióticas y sobre todas las abióticas probadas. La capacidad de unirse a diversos plásticos, cristal y metales depende de las proteínas específicas de su cubierta y de los apéndices motrices. Los estudios muestran que el acero inoxidable puede ser tan susceptible como el plástico (Pedersen, 1990). La acción del aire o de la humedad sobre el acero inoxidable,poco a poco crea una capa de óxido de cromo sobre el que se pega la suciedad orgánica. Así se pre-acondiciona el sustrato para la adhesión de las bacterias. El biofilm puede desarrollarse sobre casi cualquier tipo de superficie, gracias a que previamente entra en contacto la materia orgánica presente en el agua. En la interfase agua/superficie se deposita una capa orgánica, que cambia las propiedades químicas y físicas de la superficie y mejora las posilidades de fijación de las bacterias. Adsorcion y Fijación La adhesión de los microbios a un sustrato puede ser activa (por los flagelos, pili, adhesinas, cápsulas y cargas de superficie) o pasiva (por gravedad, difusión y dinámica de fluidos). En condiciones normales, las células bacterianas son repelidas por la superficie ya que presentan cargas eléctricas iguales. En unos minutos, las bacterias libres que encuentran la superficie acondicionada forman con ella una unión reversible que depende de las cargas eléctricas de la bacteria. Son atracciones de tipo electrostático o hidrófobo y fuerzas de Van der Waals, sin unión química. Si esta unión se mantiene suficiente tiempo, aparecen nuevas estructuras químicas y físicas que la harán permanente y irreversible 5 En casos de gran densidad de población o ante la precariedad de nutrientes que hay en el agua potable, algunos microorganismos son capaces de responder individualmente con una alteración de su pared celular para hacerla hidrófoba y, por lo tanto, con más afinidad hacia las superficies (Mayette 1992). Cuando llegan a la capa base, más próxima a la pared de la tubería y casi sin flujo de agua, son atraídos por la superficie donde tantearán una unión y intentarán fijarse a ella. Durante la etapa de unión reversible las células bacterianas aún muestran movimiento Browniano, y se eliminan fácilmente al fregar. La unión irreversible significa el anclaje de apéndices bacterianos y la producción de exopolímeros. La acción mecánica necesaria para desengancharlo será mayor cuanto más tiempo lleve activo el biofilm. Para adaptarse a la vida del biofilm, una bacteria ha de sufrir cambios radicales. El cambio del medio donde se encuentra activa diferentes genes que codifican nuevas proteínas estructurales y enzimas. Estos genes y proteínas son los que explican la fijación y la resistencia de las bacterias incluidas en los biofilms ante los antibióticos o los desinfectantes. A partir del año 2000, los avances en proteómica y en genómica han permitido avanzar en el estudio de sistemas complejos como los biofilms. Se han podido identificar 800 proteínas que cambian de concentración a lo largo de las cinco fases de desarrollo. Maduración La tranquilidad que reina en este ambiente, favorece el crecimiento y la división de las células y permite iniciar la fabricación de una mezcla de polímeros polianiónicos, limosa y pegajosa, que excreta al exterior para mantener unidas las células, entre ellas y con la superficie. La composición del exopolímero es poco conocida, pero consta de polisacáridos o glicoproteínas de diversos azúcares, como glucosa, fructosa, manosa, N- acetilglucosamina y otros. También puede contener proteínas libres, fosfolípidos y ácidos nucleicos o teicoicos .Se sirven de ellos para retener los nutrientes y para proteger a las bacterias de los diversos biocidas. El glicocalix de material polimérico se excreta desde la pared celular bacteriana en una formación radicular que recuerda la de una araña. Se estructura a partir de grupos de polisacáridos neutros o portadores de cargas 6 eléctricas, que suman a la adherencia la capacidad de actuar como un sistema de intercambio iónico para atrapar y concentrar los nutrientes que encuentre. Cuando los nutrientes se concentran, las células primitivas se reproducen con menos limitaciones; las células hijas producirán su propio glicocalix y aumentará exponencialmente la superficie de intercambio iónico y el volumen de una próspera colonia bacteriana.En un biofilm maduro, la mayor parte de su volumen está ocupado por la matriz laxamente organizada (75- 95%) alrededor de unas pocas bacterias (5-25%) , que proporciona una cubierta gelatinosa y deslizante a la superficie colonizada, con un considerable volumen de agua disponible. A pesar de todo, los estudios que han permitido descubrir esta estructura han sido realizados en agua y aguas residuales. Pero en la industria alimentaria se dan niveles muy altos de nutrientes junto a depósitos macroscópicos y microscópicos de residuos alimentarios, el estrés frecuente de la limpieza y desinfección, y otros factores cuya influencia no ha sido aún considerada. Cooperación de especies Al cabo de pocos días de la primera colonización, otros microbios quedan atrapados en el glicocalix por captación física y atracción electrostática. Hongos o bacterias sin movilidad propia serán capaces de aprovechar materiales residuales de los primeros habitantes, y de producir sus propios residuos que serán aprovechados por otros microbios, a su vez. Desde el biofilm más simple (por ejemplo, una colonia bacteriana en agar nutritivo) al más complejo (las interacciones de los microorganismos patógenos con las células huéspedes, o las poblaciones bacterianas que viven naturalmente en el lodo), la comunidad metabólica coopera de una manera compleja, como el tejido vivo de un organismo multicelular. Las diferentes especies viven en un nicho mínimo, super especializado y hecho a medida. Si una especie genera residuos tóxicos, otra los devorará con avidez. Así se consigue coordinar los recursos bioquímicos de todos los habitantes del biofilm; se reúnen los diferentes enzimas de los que disponen numerosas especies de bacterias para abastecerse de aportes nutritivos que ninguna especie sola podría digerir. También servirán para 7 responder al ataque de diversos biocidas. La estructura se permeabiliza con una red de canales atravesados por agua, residuos bacterianos, enzimas, nutrientes, metabolitos y oxigeno. Los gradientes de iones y moléculas que se establecen entre les diversas zonas, proporcionan el impulso necesario para derivar las sustancias hacia los alrededores del biofilm (vg. Figura 3). Es precisamente en la periferia de la estructura donde se localizan la mayoría de células viables, cuyo número se reduce con la edad del biofilm; en un biofilm joven se han detectado cerca de un 80% de células viables, y tan solo un 50% en un biofilm antiguo. Tenemos muchos ejemplos de cooperación entre las bacterias que han originado el biofilm y otros organismos. Incluso pueden colaborar con especies superiores, como la rizosfera, que envuelve les raíces de muchos árboles para protegerles de la infección fúngica. O las bacterias del rumen, que fermentan la celulosa vegetal permitiendo su digestión al huésped mamífero. También representan el alimento básico de la cadena alimentaria global, el plancton. Crecimiento y Dispersión La colonia, en división continua, libera periódicamente unas pocas células que se repartirán corriente abajo. Estos nuevos colonizadores lo tienen más fácil que los iniciales porque desde el biofilm original se le liberaran residuos y nutrientes que podrán usar para preparar la nueva superficie con la cubierta orgánica de acondicionamiento y para alimentar otras células. Esta colonización está relacionada con la evolución y la supervivencia de la bacteria a largo plazo. Si las condiciones de flujo hídrico lo permiten, el equilibrio que se establece entre el crecimiento de la colonia y el movimiento del agua libera pocas células. Con un flujo intenso o turbulentose pueden liberar muchas más, incluso desenganchar partes enteras del biofilm. El nivel de estrés ambiental y la transición entre entornos diferentes son unos de los factores principales que influyen en esta liberación celular (Serra, 2002- 2003). BIOFILM EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA Los biofilms pueden formarse en todo tipo de superficies en la industria alimentaria, incluyendo plástico, cristal, madera, metal y sobre los alimentos. Puesto que pueden contener microorganismos patógenos y presentar una mayor resistencia a la desinfección, incrementan las probabilidades de contaminación del producto y de provocar infecciones alimentarias, razón 8 por la que se considera que la presencia de biofilms en las superficies de contacto de la industria alimentaria constituye un evidente riesgo para la salud. Uno de los principales problemas en la industria alimentaria está representado por la supervivencia de microorganismos patógenos o alterantes debido a una desinfección insuficiente de las superficies o de los instrumentos en contacto con los alimentos. Los biofilms formados en las superficies que están en contacto con los alimentos son la causa principal de contaminación del producto final. Las consecuencias de esta contaminación pueden conducir a pérdidas económicas dado el necesario rechazo del producto o incluso, a enfermedades si intervienen patógenos (Piera, 2016). En la industria alimentaria es muy común la presencia de biofilms microbianos. Esto supone un gran coste económico para las empresas, por la contaminación de las materias primas y los alimentos procesados, por parte de microorganismos alterantes o de patógenos, procedentes de las superficies. La contaminación de los equipos y las instalaciones se ha relacionado con el 40% de las ETAs bacterianas.Sin embargo, a pesar de todas las barreras tecnológicas, es imposible procesar alimentos sin ningún contenido en microorganismos, dada la ubicuidad de microorganismos y, especialmente, por la resistencia de los biofilms para ser eliminados. Sólo es posible si existe una etapa de esterilización completa. MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE BIOFILM En condiciones normales de limpieza y desinfección, los biofilms que puedan estar presentes en las superficies son indetectables a simple vista debido a su tamaño microscópico. Además, éstos suelen aparecer con mayor frecuencia en puntos de difícil acceso para los operarios de limpieza o incluso para los detergentes y desinfectantes (zonas altas, recodos, esquinas, etc.), de manera que es difícil acceder a ellos también para el muestreo e inspección higiénica. Los biofilms también se forman en defectos de las superficies, como grietas, ralladuras u oquedades, que son difíciles de inspeccionar por métodos tradicionales. Actualmente, el control de la contaminación microbiológica se realiza empleando métodos enfocados a la detección de patógenos viables o de componentes celulares o de residuos orgánicos (Piera, 2016). 9 CONTROL DE LOS BIOFILMS Sin duda la prevención es la mejor herramienta para controlar de manera eficaz la formación de los biofilms en los procesos alimentarios. Por ello, es muy importante una implantación correcta del Sistema de Análisis de Peligros y Puntos de Control Críticos (APPCC) para disponer de controles eficaces y seguros. Control por luminiscencia de ATP La bioluminiscencia de ATP es una técnica rápida para evaluar el estado higiénico de las instalaciones, y permite medir los niveles residuales de restos orgánicos o microbiológicos en superficies y aguas. Esta técnica está basada en la reacción de las moléculas de ATP, presentes en restos celulares con enzimas de tipo luciferasa, que resulta en la emisión de luz con una intensidad proporcional a la cantidad de ATP presente en la muestra. Esta metodología requiere el uso de hisopos o escobillas para muestrear las superficies o aguas y recoger los residuos orgánicos allí presentes. A continuación, estos hisopos se introducen en un medio reactivo y se introducen en un aparato diseñado para la medida de la bioluminiscencia emitida. Se pueden obtener así resultados rápidos (entre 5 y 10 minutos) cuantitativos sobre el estado higiénico de las instalaciones. Sin embargo, esta técnica está más bien orientada a la evaluación de la eficacia de los procesos de limpieza y desinfección, ya que la señal medida proviene tanto de microorganismos activos o inactivos como de residuos de alimentos (Rodríguez & Badiola, 2017). Control por muestreo de superficies y cultivo Los métodos más comunes de control de la contaminación microbiológica en superficies están basados en el muestreo de las mismas, en la incubación en un medio de cultivo y en el recuento para determinar los niveles de contaminación. El muestreo puede llevarse a cabo bien mediante el uso de escobillas o esponjas humedecidas o mediante la aplicación directa de placas con agar solidificado sobre la superficie. En el primer caso, el líquido recogido se incuba en un medio para el posterior recuento e identificación de colonias. El empleo de medios de cultivo selectivos permite la identificación de microorganismos específicos, si esto es necesario. En el caso de la utilización de placas de contacto, los microorganismos son transferidos directamente de la superficie al medio de cultivo, simplificando el proceso de análisis y reduciendo el tiempo necesario 10 para la obtención de resultados. Sin embargo, este método limita la selectividad del análisis por el empleo de medios genéricos y la reproducibilidad del muestreo por la influencia de la presión aplicada, el tiempo, la adherencia de los distintos microorganismos y las características de la superficie (Cervantes, 2017) Nuevas tecnologías para la detección rápida de biofilms Los métodos de control microbiológico anteriormente reseñados implican un elevado coste de muestreo en el caso de la bioluminiscencia de ATP o largos tiempos de análisis, superiores a las 24 horas, en el caso del cultivo de muestras de superficies. Las especiales características de los biofilms, que requieren un protocolo específico para su eliminación, y su potencial peligrosidad como foco de contaminación microbiológica hacen necesaria la utilización de técnicas que permitan determinar con certeza la presencia de biofilms. En los últimos años, se han desarrollado nuevas metodologías para la detección de biofilms generalmente basadas en inmunoensayos, PCR, microscopía con focal o técnicas de fluorescencia. Sin embargo, estas técnicas requieren procedimientos Este proyecto, subvencionado por el CDTI, ha estado enfocado al desarrollo de nuevas herramientas para la detección y eliminación de biofilms que mejoren las soluciones disponibles actualmente para el control de la contaminación por biofilms. El diseño de una técnica para la detección selectiva de biofilms se basó en el empleo de agentes de tinción capaces de teñir la matriz extracelular que forma parte de la estructura de los biofilms. Estos colorantes se seleccionaron en función de su capacidad para teñir biofilms formados por algunos de los patógenos más comunes en la industria alimentaria (Pseudomonas fl uorescens, Bacillus aureus, Staphylococcus aureus, Salmonella enteriditis y Listeria monocytogenes) y la ausencia de coloración en presencia de residuos habituales en las industrias alimentarias (grasa, proteínas, aceites, etc. La identificación de la presencia de biofilms se produce tras el aclarado con agua de la superficie analizada, eliminando la espuma colorante y revelando zonas de crecimiento de biofilm que muestran una coloración permanente de color fucsia (Lorenzo, Oribuel, Navarro,& López, 2018). 11 LAS SOLUCIONES INNOVADORAS PARA EL CONTROL Y ELIMINACIÓN DE BIOFILMS Las soluciones innovadoras para el control y eliminación de biofilms pasan por: 1. El cuidado y desarrollo de estrategias de diseño higiénico de procesos, Acciones preventivas que permitan disponer de unas condiciones de trabajo higiénicas de manera que se minimice el riesgo de contaminación del producto. Por ejemplo, ángulos que faciliten la limpieza, evitar zonas muertas, uniones estancas e higiénicas, maquinarias autodrenables. 2. Sistemas de gestión eficaz de limpieza y desinfección. De manera que todos los equipos se mantengan en adecuado estado de conservación removiendo los residuos y suciedades que puedan ser fuente de contaminación. 3. La monitorización y análisis riguroso de la estructura y topografía de los biofilms Para ello es necesario analizar la composición en cuanto a microorganismos y sustancias que los sostienen, así como la disposición y viabilidad celular. Para ello se recurre a métodos noveles como: • La tinción con marcadores fluorescentes. • La observación microscópica de los biofilms. • Sensores de superficie y biosensores. 4. Evaluación de la eficacia de tratamientos biocidas frente a biofilms, entre otros: • Detergentes químicos o enzimáticos específicos para la eliminación de biofilms. • Nuevos materiales de mayor resistencia a la proliferación de biofilms y/o con propiedades antimicrobianas. • Procedimientos o estrategias antimicrobianas: radiación, UV, desecación, ozono. • La monitorización de la aplicación de microorganismos bacteriófagos (fagos) que los eliminen. Prevención de la formación y el desarrollo de biofilms Limpieza y desinfección • Prever e identificar dónde se forman los biofilms: sitios con agua, materia orgánica y microorganismos contaminantes y lugares con limpieza y desinfección insuficiente https://youtu.be/nV5zY4Bp3hw https://youtu.be/nV5zY4Bp3hw 12 • Poner a punto programas de limpieza y desinfección para la eliminación de los mismos • Cumplir rigurosamente todas las etapas del proceso de limpieza y desinfección en cada tratamiento • Rotar los productos químicos para evitar adaptación de los microorganismos • Evitar aerosoles y dispersión de la suciedad mezcladas con las soluciones de lavado (barrer, usar mangueras de presión) • Inspección de los equipos tras la limpieza, tanto visual como microbiológica • Verificar periódicamente la eficacia de los métodos de limpieza y desinfección Diseño de los equipos e instalaciones Seleccionar equipos cuyo diseño minimice los puntos, internos o externos, donde puedan desarrollarse los biofilms y elegir equipos diseñados para reforzar la higiene: • Todas las áreas y partes deberían ser accesibles para la limpieza manual e inspección o fácilmente desmontables • Incluir suelos impermeables a la humedad y fáciles de limpiar • No emplear falsos techos con paneles desunidos que permiten incorporar fácilmente la suciedad • Los equipos incluidos en las líneas productivas deberían ser tan fáciles de limpiar como sea posible • Las soldaduras deben ser lisas y continuas • Los equipos deben incorporar sistemas de vaciado y drenado • Las superficies en contacto con los alimentos deben ser inertes, lisas y no porosas Programa de mantenimiento de equipos • Las unidades dañadas, con picaduras o corroídas deben ser reparadas o sustituidas • Reparar los equipos, o sus componentes, para prevenir la deposición de alimentos que más tarde podrían ser difícilmente eliminables • Utilizar herramientas específicas y limpias para la reparación de maquinaria • Limpiar las herramientas antes de cada uso • Si se utiliza aire comprimido, mantener y sustituir regularmente los filtros 13 Cumplimiento de las BPM La presencia de biofilms en la industria alimentaria constituye un importante problema tanto tecnológico como de salud pública. La característica propia de esta forma de crecimiento bacteriano implica un comportamiento diferente ante los procesos de limpieza y desinfección frente a las que se han ensayado la mayoría de los agentes. Por lo tanto, dada la dificultad existente para eliminar estas formaciones una vez instauradas, la prevención es la estrategia de elección a la hora del control de los biofilms (Rodríguez & Badiola, 2017). REMOCIÓN DE BIOFILMS Según (Lorenzo, Oribuel, Navarro, & López, 2018) La presencia de biofilms en superficies de la industria de alimentos es la causa principal de contaminación del producto final. Estos pueden actuar como vehículo de transmisión y como fuente de contaminación microbiológica. Ocasionando inseguridad en la calidad de los alimentos y pérdidas económicas. La presencia de los biofilms en la instalación, y su relación causa-efecto con la presencia de microorganismos patógenos como Listeria monocytogenes y Salmonella, hace imprescindible que entre las estrategias de control de estos patógenos una de las destacadas sea el control de biofilms y el establecimiento de procedimientos de detección y de remoción de biofilms ( Navia, Villada, & Mosquera , 2010). Según (Chmielewsky y Frank, 2003). La restricción de agua y nutrientes, el diseño del equipo y el control de temperaturas son factores fundamentales en el control de biofilm. Sin embargo, habitualmente no es posible reducir la disponibilidad de agua, rediseñar el equipo o reducir la temperatura de actuación, por lo que su control se centra en una limpieza y desinfección efectivas de los lugares con mayor potencial para su crecimiento. El tratamiento de limpieza y desinfección del biofilm comprende un tratamiento físico que incorpora una limpieza mecánica y el uso de agua caliente, y un tratamiento químico que implica el uso de biocidas. Para Australian Food Safety Centre of Excellence (AFSCE, 2007) un proceso correcto de limpieza higiénica de una instalación alimentaria debe incluir las siguientes etapas: 1. Retirada de residuos y limpieza en seco. 2. Pre-lavado. 3. Lavado (aplicación del agente detergente). https://www.betelgeux.es/blog/2017/02/14/539/ 14 4. Enjuague y posterior eliminación del exceso de agua. 5. Desinfección (aplicación del biocida o de agua a más de 80 ºC) y enjuague posterior si es recomendado por el fabricante. 6. Secado higiénico. 7. Verificación de la eficacia y monitorización del sistema. Biocidas que ayudan a la remoción de biofilms Según (AESAN, 2010), los divide en biocidas oxidantes y no oxidantes: ▪ Biocidas oxidantes Cloro Es el biocida más efectivo y menos caro. No solo elimina las bacterias de biofilms, también destruye el polímero extracelular. Son necesarias concentraciones más elevadas de cloro para eliminar los biofilms que las bacterias libres. Altas concentraciones de cloro durante cortos periodos de tiempo son más efectivas que bajas concentraciones durante un tiempo elevado. Hay, sin embargo, una limitación al uso del cloro y la concentración empleada teniendo en cuenta que el cloro corroe el acero inoxidable. Dióxido de cloro Tiene una actividad similar al cloro. Presenta la dificultad de su inestabilidad, lo que le exige ser preparado in situ. Es también corrosivo de metales. Ozono Es aproximadamente dos veces más efectivo que el cloro a la misma concentración. Presenta el problema de su inestabilidad, debiéndose generar in situ, y el de su baja solubilidad en agua. Debe emplearse en materiales que sean resistentes al ozono. Peróxido de hidrógeno (10% v) Es utilizado como biocida contra bacterias por su rápida degradación a agua y oxígeno. Su efectividad contra biofilms requiere de más estudios. ▪Biocidas oxidantes Compuestos de amonio cuaternario Son efectivos surfactantes que ayudan a remover los biofilms de la superficie. Presenta el inconveniente de que su eliminación requiere un exhaustivo aclarado. Formaldehido Se ha utilizado principalmente en la industria farmacéutica. Su efectividad contra los biofims es todavía cuestionada. No es corrosivo para el acero inoxidable. 15 El hipoclorito sódico y los desinfectantes aniónicos Han demostrado ser más efectivos que los compuestos de amonio cuaternario para la eliminación de las sustancias poliméricas extracelulares excretadas por Listeria y Salmonella en acero inoxidable. Según (AESAN, 2010) Existen métodos biológicos que han demostrado también un cierto éxito en la prevención y eliminación de biofilms, así la nisina, un péptido antimicrobiano aprobado para su uso en quesos, se ha empleado con éxito en la reducción del ataque de L. monocytogenes a la superficie. Productos para el control de biofilms: Betelgeux-christeyns Desarrolló el test TBF300, que es un sistema rápido, simple y específico para teñir exclusivamente la matriz del biofilm, no interfiriendo en los resultados la presencia de restos de suciedad procedente de productos lácteos, cárnicos o pesqueros (Lorenzo 2019). Con esta técnica, pueden visualizarse las zonas con presencia de biofilms y de este modo establecer procedimientos con productos específicos para su control, como (BETELGEUX- CHRISTEYNS 2020): ✓ MIDA SAN 327 BF , elimina matriz en superficies abiertas. ✓ o MIDA SAN 328 EC , elimina matriz en en circuitos. Itram higiene (Ylla, 2020) Ha desarrollado una gama de productos para el control de los biofilms (detección e eliminación) en la industria alimentaria. El objetivo de su trabajo se centra en buscar moléculas antibiofilms producidas de forma natural para el desarrollo de productos de higienización. Desarrollando BioFinder, una solución innovadora para la detección de biofilms en superficies abiertas y una herramienta eficaz para el control de la higiene. BioFinder reacciona al detectar los biofilms. Basta con pulverizar BioFinder sobre las superficies de la instalación para revelar de manera inmediata las zonas contaminadas mediante una simple inspección visual. ✓ La gama de productos enzimáticos espumantes de ITRAM para superficies abiertas incluye: ENZYJET, ENZYJET PLUS: BIOJET, ENZYBASIC, ENZYBAC, ENZYCOLD FOAM ✓ Para eliminar biofilms en circuitos CIP ITRAM disponemos de TENSIOCIP, BIOCIP, ENZYCIP, ENZYCOLD CIP https://biofilmtest.com/deteccion/ https://biofilmtest.com/eliminacion/ https://biofilmtest.com/eliminacion/ https://biofilmremove.com/deteccion-de-biofilms/ https://biofilmremove.com/deteccion-de-biofilms/ https://itramhigiene.com/productos-quimicos-limpieza/superficies-abiertas/ https://itramhigiene.com/productos-quimicos-limpieza/superficies-abiertas/ https://biofilmremove.com/circuitos-cip/ https://biofilmremove.com/circuitos-cip/ 16 RESISTENCIA A LOS DESINFECTANTES La resistencia de los microorganismos a múltiples sustancias es un problema de salud pública observado a nivel mundial, debido a ello se ha incrementado el uso de agentes antimicrobianos, como los biocidas, que incluyen a los antisépticos y a los desinfectantes, estos agentes son usados extensivamente para una gran variedad de tópicos y aplicaciones. En general, biocida es un término que describe un agente químico, de origen sintético o semisintético, que, a ciertas concentraciones críticas y bajo condiciones definidas, puede inactivar o destruir células vivas de microorganismos, en tiempos específicos. Los biocidas, de acuerdo a su blanco de acción, han sido clasificados en preservativos, esterilizantes, antisépticos y desinfectantes. Estos últimos son productos químicos capaces de inhibir o destruir los microorganismos presentes sobre objetos inanimados y/o superficies. Los desinfectantes constituyen la primera línea de defensa para evitar la diseminación de patógenos resistentes. Entre estos agentes se encuentran un grupo de compuestos que ha tenido gran auge en la actualidad,estos son los agentes iónicos y anfóteros, que tienen la propiedad de lesionar la integridad de la membrana celular, tales como los compuestos de amonio cuaternario (QAC), como el bromuro de lauril-dimetil- bencil-amonio, agente activo de la mayoría de los desinfectantes. Este tipo de agentes se caracterizan por no presentar olor, son de pH neutro, solubles en agua, de acción polivalente, soportan cambios de temperatura sin alterar su estructura, no son inflamables ni emiten vapores, son inalterables por la luz solar, se mantienen estables a temperatura ambiente y no necesitan de recipientes ni de almacenamientos especiales. Debido a todas las propiedades que poseen estos compuestos y los biocidas en general, existe la tendencia al aumento en el uso de estos agentes en las medidas de control de superficies inertes y vivas, además de su uso cotidiano y habitual, lo cual ha conllevado a la selección de cepas bacterianas resistentes. Una bacteria puede resistir a la acción de los biocidas mediante una propiedad natural (resistencia intrínseca), o una propiedad adquirida, por mutación o por la adquisición de plásmidos, transposones o integrones. El mecanismo de resistencia a los desinfectantes que generalmente está codificado en plásmidos es el mediado por bombas de eflujo. Se ha reportado 17 que las reducciones en la susceptibilidad de las cepas bacterianas a agentes como el bromuro de etidio, la acriflavina, la cetrimida, el cloruro de benzalconium, y las diaminas, está mediada por plásmidos que codifican para bombas de eflujo, activas también contra compuestos de amonio cuaternario. Tipos de microorganismos de interés en la industria alimentaria En la industria alimentaria es posible encontrar cuatro grupos microbianos que pueden causar toxiinfecciones en los consumidores: • Mohos y levaduras. • Micobacterias. • Virus (Encapsulados o no) • Bacterias (Gram +, Gram – y en forma esporulada). Cada uno de estos grupos de microorganismos tiene características biológicas específicas que influyen sobre su capacidad para adaptarse a la presencia de agentes desinfectantes. Los microorganismos: bacterias, micoplasmas, mohos y virus están envueltos por una membrana citoplasmática. Esta membrana delimita al microorganismo del medio externo, y tiene gran importancia en los intercambios moleculares entre el interior de la célula y el exterior, además de ejercer un efecto protector de la misma. La membrana citoplasmática está compuesta, fundamentalmente, por una doble capa lipídica en la que se insertan proteínas, y está formada por fosfolípidos. En la parte central de la bicapa de lípidos se encuentra una zona hidrófoba y en la periferia presenta una parte hidrófila. Estas características influyen sobre la resistencia a los principios activos biocidas. Características de los microorganismos • Bacterias Gram + y Gram – Las bacterias tienen capacidad de sintetizar una pared anexa a la membrana citoplasmática. Esta pared presenta diferencias entre distintos tipos de bacterias y permite diferenciarlas en bacterias Gram + y bacterias Gram -. Una primera diferencia entre ellas se aprecia al comparar el espesor de la pared en ambos tipos de bacterias, en las bacterias Gram +, como en Estafilococos aureus, el espesor oscila entre 20-80 nm; en tanto que en bacterias Gram -, como Escherichia coli, su espesor oscila entre 10-15 nm. Sin embargo, la pared de las bacterias Gram – es más compleja que las de las bacterias Gram +. Este mayor complejidad proporciona a la pared un mayor 18 grado de impermeabilidada las sustancias, excepto para aquellas que pueden penetrar por los poros de las células. Por tanto, las bacterias Gram – son menos sensibles a los desinfectantes que las bacterias Gram +. Además, ciertas bacterias, como Bacillus spp y Clostridios spp, son capaces de formar esporas cuando el medio que les envuelve les es hostil. Las esporas constituyen, de este modo, un medio de resistencia de las bacterias a los agentes antimicrobianos, y pueden causar contaminaciones de los alimentos, resistir los tratamientos térmicos o de conservación y ocasionar toxiinfección alimentaria, puesto que cuando las condiciones son favorables pueden volver al estado vegetativo con sus características iniciales y tienen la posibilidad de multiplicarse de nuevo. • Mohos y levaduras Las levaduras son hongos microscópicos, generalmente, unicelulares. Pueden provocar alergias y en ciertos casos infecciones sistémicas. Su pared celular está formada por un esqueleto de quitina que la protege de las agresiones físico- químicas Los mohos son hongos microscópicos, presentes principalmente en medios húmedos. Los principales problemas de salud que ocasionan son debidos a los compuestos orgánicos volátiles que producen, las micotoxinas, y la contaminación del aire por esporas que pueden ser inhaladas. Tanto los mohos como las levaduras poseen una resistencia a los compuestos biocidas intermedia entre las bacterias Gram + y las bacterias Gram -. • Virus En los virus, su membrana está formada fundamentalmente por proteínas. Una primera distinción entre los virus está basada en la presencia o no de una envoltura lipídica. Los que la poseen se denominan virus encapsulados, frente a los virus no encapsulados que carecen de esta envoltura. Paradójicamente, la resistencia a las materias activas biocidas es mayor en los virus no encapsulados, pues los agentes químicos alteran la envoltura lipídica y los vuelve más sensibles a su acción. Los virus 19 no encapsulados se adaptan mejor a los desinfectantes al carecer de esta envoltura, ser fisiológica y morfológicamente más sencillos, y por tanto más flexibles. • Micobacterias Las micobacterias son organismos ubicuos que se pueden encontrar en la tierra, aguas, alimentos, en la superficie de suelos y maquinaria. Algunas son muy conocidas, como el Mycobacterium tuberculosis, causante de la tuberculosis. Las micobacterias, además de poseer una pared compleja, producen una pared de naturaleza cérea, que proporciona gran resistencia a la desecación, y por tanto la posibilidad de sobrevivir en el medio ambiente durante años, además de incrementar su resistencia a los desinfectantes. Factores de resistencia de los microorganismos a los desinfectantes El factor de mayor incidencia en la resistencia de los microorganismos a las materias activas biocidas es la composición de la pared celular. Esta resistencia tiene un carácter innato y determina el espectro de actividad de los desinfectantes. En función de las características morfológicas de los microorganismos, descritas en el punto anterior, cada grupo microbiano reacciona de distinto modo a los desinfectantes. Russel (1997) estudia esta diferencia entre diferentes microorganismos, observando que los virus encapsulados son muy sensibles a los desinfectantes, en tanto que las esporas son extremadamente resistentes. Después de los virus encapsulados, la mayor sensibilidad es, por este orden, para las bacterias Gram +, mohos, bacterias Gram - , virus no encapsulados, y micobacterias. Además de la resistencia innata en función de los factores morfológicos, los microorganismos pueden desarrollar resistencia a los productos biocidas, denominada resistencia adquirida. La incidencia de este tipo de resistencia a los desinfectantes es muy inferior a la que se presenta frente a los antibióticos, debido a que la actividad antimicrobiana que realizan estos últimos se ejerce sobre una zona objetivo de la célula, en tanto que la acción biocida de los desinfectantes es más difusa y no puede señalarse un único punto de actuación, lo que minimiza en cierto modo la presencia de microorganismos resistentes a los principios activos desinfectantes. La resistencia adquirida es el resultado de un cambio a nivel del genoma, que 20 provoca una mutación y posterior selección de los microorganismos por el desinfectante, es decir, se produce una selección natural de los microorganismos que han adquirido el nuevo carácter genético. Una mutación espontánea a nivel de un cromosoma puede otorgar a un organismo un carácter que le proporcione resistencia a una materia activa biocida, posteriormente, al multiplicarse transmite el gen de la resistencia, este carácter será cada vez más dominante en la población presente en la industria, siempre que se efectúe la desinfección de sus instalaciones con el mismo principio activo, y se vayan eliminando los microorganismos que no posean la mutación. Las modificaciones en el material genético que permiten a los microorganismos adaptarse, actúan a distintos niveles: producción de nuevos enzimas resistentes, cambios en la estructura interna de la célula, modificación de la permeabilidad de la membrana citoplasmática y modificación de la estructura de la pared celular. Estos cambios producen un incremento de la resistencia de los microorganismos, a las concentraciones usuales de empleo de los desinfectantes. En ocasiones, además, una disminución de las dosis utilizadas del producto desinfectante puede comportar una mayor supervivencia de las bacterias. En este sentido, se ha demostrado que la utilización sistemática de concentraciones subletales de desinfectantes puede potenciar este problema (Underwood et al, 2007), facilitando en ciertos casos la formación de esporas. Con el objetivo de mantener una concentración efectiva del desinfectante, es importante corregir las causas que pueden disminuir su eficacia: presencia de materia orgánica y suciedad sobre las superficies a tratar, la caducidad del producto (ej. Clorados) con la consiguiente pérdida de concentración y eficacia, reducido tiempo de actuación antes del enjuague final, utilizar las dosis recomendadas por el fabricante, monitorizar periódicamente las dosis reales aplicadas, etc. Todo ello justifica, en ocasiones, la necesidad de efectuar rotaciones entre las desinfectantes con distintas materias activas. INCIDENCIA DE CEPAS RESISTENTES EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA. Las estadísticas de los EE.UU. (2013) reflejan un incremento de la resistencia a antibióticos a lo largo de las últimas décadas, tanto en bacterias responsables de enfermedades transmitidas por alimentos como en las asociadas a infecciones nosocomiales. Por lo tanto la presencia de cepas 21 resistentes a los desinfectantes aplicados puede presentar un desafío económico para la industria alimentaria además de tener implicaciones en la salud humana. La resistencia de algunas cepas quedó demostrados como los de Staphylococus hacia los amonios cuaternarios, concretamente que más del 13% de las cepas eran resistentes al cloruro de benzalconio. En otro estudio realizado con Listeria monocytogenes aislada de una industria alimentaria observaron que el 4% de las cepas asiladas eran tolerantes a la concentración mínima inhibitoria (MIC 3 µg/ml) y un 13% eran resistentes (MIC 4-7 µg/ml) a los amonios cuaternarios. Otro estudio realizado a las cepas de Staphylococus aureus en la superficie de un equipo mostraron más resistencia a los productos clorados que las aisladas en piel de pavos sacrificados. El resultado de aislar cepas más resistentes en la superficie fue graciasa la selección de cepas que desarrollaron la capacidad de adherirse a la superficie y producir limo. De acuerdo estos resultados el uso de desinfectantes puede conducir a la selección de cepas bacterianas que son intrínsecamente resistentes a los agentes antibacterianos aplicados. A sí mismo la exposición a desinfectantes en concentraciones subletales producen una resistencia más estable. (Nuria, 2006) Por lo tanto las bacterias pueden adherir resistencia más alta a los desinfectantes a través de la adaptación, adquisición de los elementos resistentes a nivel genético, respuestas del estrés o formación de biofilms. Por otra parte para evitar la aparición de las resistencias es fundamental aplicar los principios básicos y elementales de la higiene: por ejemplo realizar una buena limpieza antes de la desinfección, utilizar la concentración y el tiempo de contacto adecuado y finalmente aclarar y secar las superficies tras la desinfección. En resumen la resistencia de cepas es un grave problema global que amenaza la efectividad de las terapias antimicrobianas existentes y se ha convertido en una de las prioridades a enfrentar y resolver. Uno posible solución a estos fenómenos es la rotación entre distintos desinfectantes que no estén relacionados, en esencia esta práctica conlleva a que cada cierto tiempo, se cambie el tipo de desinfectante creando un ciclo con dos o tres productos de desinfectantes diferentes. CONCLUSIONES La presencia de biofilms en la Industria alimentaria puede suponer un importante problema tanto tecnológico como de Salud Pública. Las características propias de esta forma de crecimiento bacteriano, que implica un 22 comportamiento diferente ante los procesos de limpieza y desinfección de las células planctónicas frente a las que se han ensayado la mayoría de los agentes. Por lo tanto, la dificultad existente para eliminar estas formaciones una vez instauradas hace que la prevención sea, una vez más, la estrategia de elección a la hora de controlar este problema. Los problemas ocasionados por la formación de biopelículas en la industria de alimentos pueden ser prevenidos mediante la correcta implementación y aplicación de sistemas de calidad y el uso de técnicas de remoción. La falta de control y prevención en la formación de biopelículas puede generar problemas de salubridad y pérdidas económicas por daños en instalaciones, equipos y aditamentos. 23 REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA Lorenzo Cartón, F., Orihuel Iranz, E., Bertó Navarro, R., & López Tormo, C. (diciembre de 2011). 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