Establecimiento-de-un-sistema-de-activacion-in-vitro-de-los-receptores-tipo-toll-2-y-4-en-bovinos

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE 
MÉXICO 
MAESTRIA EN CIENCIAS DE LA 
PRODUCCiÓN Y DE LA SALUD ANIMAL 
"Establecimiento de un sistema de activación in 
vitro de los receptores tipo toll (2 y 4) en 
bovinos" 
TES I S 
PARA OBTENER El GRADO DE MAESTRO EN C1ENC1AS 
PRESENTA 
JACOBO JOSÉ GUTIÉRREZ 
TUTOR: GABRIELA BARCENAS MORALES. 
COMITÉ TUTORAL: JUAN ANTONIO MONTARAZ CRESPO. 
CLARA 1. ESPITIA PINZÓN. 
CUAUTITLÁN IZCALLI, EDO. DE MÉXICO. 2009 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS. 
A Dios por su infinita bendición, por permitirme realizar un sueño 
más en mi vida. 
A la FESC (UNAM) por todas las oportunidades brindadas y el 
apoyo para la realización de este trabajo. 
A mis padres Mario y Leoba que jamás han escatimado esfuerzo 
alguno para apoyarnos en alcanzar nuestras metas. 
A Jairo mi hermano por que siempre me ha apoyado y ha sido un 
amigo en todo momento. 
Al Dr. Juan Antonio Motaraz Crespo por apoyarme en todo 
momento y brindarme la oportunidad para realizar la maestría. 
A la Dra. Gabriela Barcenas Morales mi asesora por el apoyo 
brindado para realizar este trabajo y por ser una persona 
humanamente excepcional. 
A la Dra. Clara Inés Espitia pinzón por su gran apoyo en mi trabajo 
y la donación de los antígenos que ocupe en él. 
A mi jurado el apoyo que me brindo en para la realización de este 
trabajo. 
A Bibiana por ser esa excelente amiga que me apoyo 
incondicionalmente en todo momento. 
1 
A todos y cada uno de aquellos que de una u otra forma 
participaron en mi vida para llegar a este momento. 
Al consejo nacional de ciencia y tecnología (CONACyC) por el 
apoyo económico proporcionado. 
II 
Esta tesis fue financiada parcialmente por los proyectos 
- Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación 
Tecnológica (PAPIIT), UNAM. 
Clave del Proyecto: IN207908. 
Titulo: "Autoinmunidad a moléculas del sistema inmune como una causa 
de susceptibilidad selectiva a enfermedades infecciosas en humanos". 
- Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), Fondo 
Sectorial de Investigación en Salud y Seguridad Social, 
SSNIMSS/ISSSTE-CONACYT S0008-2007-1. 
Clave del Proyecto: SALUD-2007-C01-69001. 
Titulo: "Autoinmunidad a componentes del sistema inmune y su 
implicación en enfermedades infecciosas". 
III 
DEDICATORIA. 
CON TODO MI AMOR. 
A MI MAMÁ LEOBA GUTIÉRREZ OSORIO. 
A MI PAPÁ MARIO JOSÉ ROJAS. 
A MI HERMANO JAIRO JOSÉ GUTIÉRREZ. 
A MI TIA MARGARITA GUTIÉRREZ OSORIO, DONDE ESTES. 
IV 
RESUMEN. 
Los receptores tipo TolI (TLRs) han sido identificados en mamiferos, 
como receptores importantes funcionalmente para el reconocimiento de 
patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) en microorganismos. 
Estudios en varias especies muestran que alteraciones en la señalización de 
los TLRs predispone a una variedad de enfermedades infecciosas. Los TLRs 
han sido poco investigados en bovinos. 
El objetivo del presente trabajo es realizar el análisis de los niveles de 
expresión y de estimulación de los TLRs en bovinos, en respuesta a algunos 
antígenos micobacterianos. 
El sistema consistió en la activación de células mononucleares 
adherentes obtenidas de sangre periferica mediante un gradiente de densidad, 
se emplearon como estimulos a diferentes antígenos micobacterianos (PPO 
bovino, PE-PGRS33, proteina de 38 kOa) y ligandos para TLR-2 y TLR-4 
(controles: LPS y Zymosan). La actividad se evaluó por la capacidad en la 
inducción de los niveles de expresión de mRNA correspondiente para algunas 
citocinas (IL-6, IL-12, TNF-a, Y INF-y) Y TLRs (2 y 4) mediante la técnica de RT-
PCR. 
Los resultados obtenidos de la estandarización de la técnica de la RT-
PCR para la amplificacción del fragmento del gen de IL-6 bovina mostraron 
que, aunque las tres concentraciones probadas de MgCI2 (2.5, 5 Y 10 mM) 
fueron adecuadas, la de 5 mM resultó ser la óptima, razón por lo que se opto 
trabajar con ésta para la amplificación de las demás citocinas. Para llevar a 
cabo la amplificación de los fragmentos de los genes correspondientes a TLR-2 
y TLR-4, también la concentración de 5 mM del MgCb mostró ser la más 
adecuada. 
Con respecto al sistema de estimulación in vitro para las PBMCs, se 
puede mencionar que a nivel de RNA de las PBMCs adherentes no 
estimuladas y estimuladas con antígenos micobacterianos fue posible observar 
los productos de transcripción correspondientes a las citocinas IL-6 (378 pb), 
v 
IL-12 (261pb), INF-y (261pb), Y a los TLR-2 (504 pb), TLR-4 (621 pb), 
empleando la técnica de la RT-PCR. 
Realizando el análisis de los resultados en forma individual, se pudo 
observar que solo de un animal, las PBMCs adherentes estimuladas con PPO 
bovino, fueron capaces de incrementar los niveles de expresión del mRNA para 
la IL-6, IL-12 e INF-y. Así mismo, en dos muestras de PBMCs adherentes la 
proteína PE-PEGR33 de M. tuberculosis tuvo la capacidad de incrementar los 
niveles de expresión del mRNA para estas mismas citocinas; y solo con las 
PBMCs de un animal fue capaz de incrementar los niveles de expresión del 
mRNA para TLR-2 y TLR-4, en comparación al control negativo. Con respecto 
a la glicoproteína de 38 kOa solo se observo en PBMCs de dos animales que 
presentaron mayores niveles de expresión del mRNA para IL-12, y de un 
animal para IL-6, en comparación a las PBMCs adherentes no estimuladas. 
Sin embargo, el análisis con los valores promedio de cinco animales, 
indicó que las PBMCs adherentes estimuladas con PPO bovino y zymosan, 
presentaron altos niveles de expresión de mRNA para la síntesis de TLR-4 en 
comparación con las PBMCs no estimuladas, control negativo (resultado 
estadísticamente significativo, P<0.005); lo cual nos permite especular que 
alguno de los componentes del PPO podría fungir como ligando para el TLR-4 
bovino. 
Es importante la continuación de este tipo de estudios donde se puedan 
manejar condiciones más precisas y controladas, para la obtención de más 
información, con respecto a los TLR y su estimulación por diferentes antígenos 
micobacterianos en la especie bovina. 
Palabras claves: Tuberculosis, TLR-2, TLR-4, citocinas, Mycobacterium bovis, 
bovinos, inmunidad innata, RT-PCR. 
VI 
ABSTRACT. 
The TolI-like receptors (TLRs) have been identified in mammals, as 
functionally important receptors for the recognition of microbial pathogen-
associated molecular patterns (PAMPs). Studies in several species have shown 
that impaired signaling through TLRs may predispose infectious diseases. The 
TLRs in bovines have been little investigated so faro 
The purpose of this study is the analysis of expression level and the 
stimulation of TLRs in bovines, in response to certain microbial TLRs-ligands. 
This system is based on the activation of adherents mononuclear cells 
which are derived from peripheral blood by density gradient. using as stimulus 
the mycobacterial antigens PPO (from M. bovis), PE-PGRS33 and 38 kOa 
protein were used as activators. Ligands for TLR-2 and TLR-4 (LPS and 
Zymosan, respectvely) were used as control stimuli. Their activity was 
evaluated by measuring their capacity to induce the mRNA expression of 
certain cytokines including IL-6, IL-12, TNF-a, and IFN-y, and of TLR2 and 4 
usingthe RT-PCR technique. 
RT-PCR standarization of the bovine IL-6 fragment using three different 
concentrations of MgCI2 (2.5, 5 Y 10 mM) yielded best results at 5 mM. This 
concentration was therefore used for the rest of the cytokines investigations. 
Equally, for the amplification of the TLR-2 and TLR-4 gen fragments the 5 mM 
concentration of MgCI2 gave the best results. 
Considering the results from the PBMCs stimulation system in vitra, is 
possible to mention that at RNA level in the adherent PBMCs, not stimulated 
and stimulated, with the micobacterial antigens was possible to observe the 
corresponding transcription products to cytokines IL-6 (378 pb), IL-12 (261 pb), 
IFN-y (261 pb), and to TLR-2 (504 pb), TLR-4 (621 pb), using the RT-PCR 
technique. 
The individual analysis showed up-regulation of the mRNA expression 
levels of IL-6, IL-12 and IFN-y by adherent PBMCs from one animal after 
stimulation with PPO. Similarly, there was significant up-regulation, in two 
samples in response to the PE-PEGR33 protein of M. tuberculosis show. 
VII 
PBMCs of one animal showed increase of mRNA express ion levels of TLR-2 
and TLR-4 when compared to the negative control. PBMCs from two animals 
showed higher mRNA expression levels of IL-12 in response to the 38kd 
glycoprotein. In one case 38kd also increased IL-6 xpression. 
Analysis of the mean values of five animals, showed that the adherents 
PBMCs, when stimulated with bovine PPO and zymosan, showed higher 
expression levels of mRNA for the synthesis of TLR-4 in comparison with the 
negative control of non stimulated PBMCs (statistically significant; P<O.005); 
this allowes to speculate, that some of the components of the PPO mayas 
agonists of the bovine TLR-4. 
Is important to continue with this type of studies, considering the 
possibility of manage better control and precise working condictions, in order to 
obtain more information about the signaling through TLRs by differents 
micobacterial antigens in the bovine species. 
Key Words: Tuberculosis, TLR-2, TLR-4, cytokines, Mycobacterium bovis, 
bovines, inmunidad innata immunity, RT-PCR. 
VIII 
íNDICE DE TABLAS 
Tabla 1.1 Nombre de los TLR y sus ligandos 17 
Tabla 5.1. Estimulantes y antígenos micobacterianos utilizados para la estimulación in 
vitro de PBMCs adherentes. 30 
Tabla 5.2. Iniciadores empleados para la amplificación de citocinas y 
receptores tipo Tal! (2 y 4) de bovinos. 35 
Tabla 5.3. Iniciadores de ~-Actina para la estandarización de la PCR. 36 
Tabla 5.4 Condiciones estándares de volúmenes y concentraciones de cada uno de 
los reactivos para los iniciadores de las citocinas bovinas y 0-actina bovina. 37 
Tabla 6.1. Valores de promedios, (error estándar) de las intensidades de cada uno de 
los productos amplificados en la RT-PCR, para cada uno de los estimulantes 
empleados en las PBMCs. 57 
IX 
íNDICE DE FIGURAS. 
Figura 1.1. Resumen de ligandos reconocidos por la familia TLR. 15 
Figura 5.1. Representación esquemática de los pasos que 
conforman a la técnica de la PCR. 
Figura 5.2. Número de amplicones obtenidos en la PCR. 
Figura 6.1. Corrimiento electroforético en gel agarosa al 2% 
para la detección de RNA bovino. 
Figura 6.2. Electroforesis de los resultados obtenidos de las muestras 
de cONA en gel agarosa al 2 % teñido con bromuro de etidio. 
Figura 6.3 Análisis electroforético para la detección del producto 
especifico de ~-actina bovina (313 pb) en gel de agarosa al 2% 
teñido con bromuro de etidio, empleando dos concentraciones 
diferentes de MgCb. 
Figura 6.4 Análisis electroforético en gel de agarosa al 2% 
teñido con bromuro de etidio de los productos de ~-Actina 
humana (274 pb) Y ~-Actina bovina (313 pb); utilizando tres 
diferentes pares de iniciadores. 
Figura 6.5. Análisis electroforético de gel agarosa al 2% teñido 
con bromuro de etidio para la detección del producto especifico 
de IL-6 bovina utilizando tres concentraciones de MgCI2, 
empleando gONA bovino. 
33 
34 
42 
43 
44 
45 
46 
x 
Figura 6.6. Análisis electroforético para la detección 
TLR-2 y TLR-4 bovino empleando 2 concentraciones 
de MgCI2. utilizando como molde gDNA bovino. 
Figura 6.7. Electroforesis en geles de agarosa 
a12% de los productos obtenidos en la RT-PCR de PBMCs 
47 
adherentes bovinas no estimuladas (control negativo). 50 
Figura 6.8 Electroforesis de productos obtenidos por la 
RT-PCR de PBMCs adherentes bovinas estimuladas con Zymosan. 51 
Figura.6.9. Corrimiento electroforético en gel de agarosa 
a12% de productos obtenidos por la RT-PCR de 
PBMCs adherentes estimuladas con LPS. 
Figura 6.10. Corrimiento electroforético en gel agarosa 
al 2%, teñido con bromuro de etidio de los productos 
obtenidos por la RT-PCR de PBMCs adherentes 
estimuladas con PPD bovino. 
Figura.6.11. Corrimiento electroforético de gel de agarosa 
al 2%, teñido con bromuro de etidio de productos 
obtenidos por la RT-PCR de PBMCs adherentes 
estimuladas con PE-PGRS33. 
Figura 6.12. Análisis electroforético de gel agarosa 
al 2% teñido con bromuro de etidio para los productos 
obtenidos por la RT-PCR de PBMCs adherentes 
estimuladas con glicoproteína de 38kDa. 
52 
53 
54 
55 
XI 
íNDICE 
PÁGINA 
AGRADECIMIENTOS 
DEDICATORIA IV 
RESUMEN V 
ABSTRACT VII 
íNDICE DE TABLAS IX 
íNDICE DE FIGURAS X 
1. INTRODUCCiÓN 1 
1.1. Definición de la tuberculosis. 1 
1.2. Importancia de la tuberculosis en México. 2 
1.3. Etiología. 4 
1.3.1. Características generales de las micobacterias 4 
1.4. Vías de transmisión de la tuberculosis. 6 
1.5. Patogenia de la tuberculosis. 8 
1.6. Respuesta inmune a la tuberculosis bovina. 12 
1.7. Receptores tipo Toll. 13 
1.7.1. Papel de los TLRs en el reconocimiento 
de componentes microbianos. 
1.7.2. TLR-2. 
1.7.3. TLR-4. 
1.8. Antígenos Micobacterianos. 
1.8.1. PPD bovino. 
1.8.2. Proteína PE-PGRS33. 
1.8.3. Glicolipproteína de 38 kDa. 
2.0. JUSTIFICACiÓN. 
3.0. HIPÓTESIS. 
4.0 OBJETIVOS. 
4.1. Objetivo general. 
4.2. Objetivos específicos. 
5.0. MATERIAL Y MÉTODOS. 
5.1. Colección y tratamiento de muestras. 
16 
17 
19 
20 
20 
20 
20 
22 
24 
25 
25 
25 
26 
26 
5.2. Prueba de viabilidad celular por exclusión de azul de tripan. 26 
5.3. Obtención de PBMCs adherentes. 27 
5.4. Antígenos. 28 
5.4.1 Lipopolisacárido. 28 
5.4.2 Zymosan. 
5.4.3 Derivado proteico purificado de 
Mycobacterium bovis (PPD bovino). 
5.4.4 PE-PGE33. 
5.4.5 Glicolipoproteína de 38 kDa. 
5.5 Estimulación in vitre de PBMCs adherentes. 
5.6 Extracción de RNA de PBMCs adherentes. 
5.7 Síntesis de cONA. 
5.8 Técnica de Reacción de la Polimerasa de 
Transcriptasa Reversa (RT-PCR). 
5.8.1 Estandarización de la técnica de reacción en 
cadena de la polimersa (PCR) para citocinas 
y TLR bovinos. 
5.8.2 Condiciones de trabajo de la PCR. 
5.9. Electroforesis en geles de agarosa. 
5.10. Análisis estadístico. 
6. RESULTADOS 
6.1. Colección y tratamiento de muestras 
bovinas para la obtención de PBMCs. 
6.2. Obtención de células adherentes a partir 
de PBMCs de sangre periférica. 
6.3. Estimulación in vitre de PBMCs adherentes 
28 
29 
29 
29 
30 
30 
32 
33 
35 
36 
38 
39 
40 
40 
40 
con antígenos micobacterianos. 41 
6.4. Extracción de RNA a partir de PBMCs adherentes. 41 
6.5. Síntesis de cONA a partir de células adherentes. 42 
6.6. Reacción en cadena de la polimerasa de 
transcriptasa reversa (RT- PCR). 43 
6.6.1. Amplificación del gen para ~-actina. 44 
6.6.2. Amplificación de citocinas. 45 
6.6.3. Amplificación del gen para TLR-2 y TLR-4. 46 
11 
6.7. Análisis de citocinas y TLRs bovinos mediante RT-PCR. 48 
6.8. Determinación semicuantitativa de la intensidad 
de los productos amplificados por RT-PCR. 
7. DISCUSiÓN 
8. CONCLUSIONES 
9. BIBLIOGRAFíA 
55 
58 
65 
67 
III 
1. INTRODUCCiÓN. 
1.1. Definición de la tuberculosis. 
La tuberculosis (TB) es primeramente una enfermedad del aparatorespiratorio que se transmite en diversas especies de mamíferos 
principalmente por vía aérea (López-Artuño, 1997). La TB es una enfermedad 
infecciosa crónica y progresiva de distribución mundial, causada por bacterias 
del complejo Mycobacterium que afecta a un gran amplio numero de 
hospederos incluyendo al hombre (Chatterjee, 1997). 
La TB es una de las más importantes infecciones que afecta al ganado 
bovino. Es ampliamente conocida como una enfermedad crónica, pero sus 
efectos sobre la producción animal y salud pública se han hecho notorios con el 
desarrollo ganadero (Kantor, 1991). 
La tuberculosis es causada por Mycobacterium spp, considerándose una 
enfermedad crónica progresiva, que se ha reportado en aves y varias especies 
mamíferas como humanos, bovino, cerdos y ocasionalmente carnívoros (Jae, 
2001). Mycobacterium bovis (M. bovis) es el agente causal de la tuberculosis 
en una gran variedad de animales domésticos y salvajes, dicha bacteria junto 
con Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum y Mycobacterium 
microtí, entre los mas conocidos forman parte del complejo Mycobacterium 
tuberculosis (Aguirre, et al., 2007). Aunque actualmente están consideradas 
otras especies como M. Canettí y M. caprae (Cousins, et al., 2003). 
La infección del ganado domestico con M. bovis, que produce la 
tuberculosis bovina (TBB), que es hoy en día una problemática global por sus 
enormes costos y por ser un riesgo de salud publica (Kao, et al., 2007). 
La TBB es causada por M. bovis, un bacilo gram-positivo con potencial 
zoonótico que esta altamente relacionado genéticamente a M. tuberculosis, el 
agente causal de la tuberculosis humana (TB). A pesar de que el bacilo 
tuberculoso bovino y humano puede ser diferenciado por su rango de 
hospederos, las bases genéticas de su virulencia y características fisiológicas 
para esta diferencia se desconocen. 
El medio actual del control de TBB es la estrategia de "prueba y 
sacrificio", donde los animales que dan una reacción positiva en piel a una 
preparación cruda de un antígeno micobacteriano, son considerados infectados 
y por lo tanto son sacrificados (Garnier, el al., 2003). 
1.2. Importancia de la tuberculosis en México. 
La TB en humanos es causada por M. tuberculosis o M. bovis. 
Clínicamente, radiológicamente y patológicamente la TB causada por estas 
micobacterias es indistinguible una de otra (Biet, et al., 2005). 
La TBB es uno de los principales problemas a los que se enfrenta la 
ganadería mexicana, ya que además de ser un riesgo para la salud animal y 
salud publica, causas enormes perdidas económicas. Aunado esto a la 
presencia de la enfermedad se convierte en uno de los grandes obstáculos 
para la movilización y la comercialización nacional e internacional del ganado 
(Milián, et al., 2000). 
El problema de la TBB es grave, la prevalencia en la parte norte de 
México, se ha estimado en 2.1 % para el ganado lechero y en un 0.1 % para el 
ganado de carne. En la zona centro y sur de México, los valores de prevalencia 
de TBB es mayor. En estás regiones se han detectado establos lecheros con 
prevalencias mayores al 25% (Milian y Gallegos, 2001). La TBB es responsable 
de grandes pérdidas económicas en la industria pecuaria. Limitaciones en la 
movilización de animales, tanto interna como hacia los Estados Unidos; a 
donde se exportan aproximadamente 1.4 millones de becerros al año, pueden 
causar grandes perdidas (SAGARPA, 2006). 
2 
La Organización Panamericana de la Salud (OPS) calcula que en 1995 
la tuberculosis fue la causa de muerte de más de 75,000 personas en 
Latinoamérica y el Caribe, y que cada día 1,100 personas se enferman y más 
de 200 mueren debido a la tuberculosis. Los países con tasas severas (> 85 X 
100,000 habitantes) son: Bolivia, Republica Dominicana, Ecuador, El Salvador, 
Guatemala, Haití, Honduras, Paraguay y Perú (Moran-López, 2001). 
La TB ha sido identificada por la organización mundial de la salud (OMS) 
como una de las 5 pandemias que ocasionan mayor carga de la enfermedad, a 
nivel mundial la TB ocupa el octavo lugar como causa de muerte, pero solo de 
un 5 al 10% de esta población tiene riesgo de desarrollar TB activa entre 1 a 2 
años después de la infección (tuberculosis primaria) o (tuberculosis 
posprimaria). Hoy en día se estima que la tercera parte de la población esta 
infectada con el bacilo tuberculoso significando que es un problema de salud 
pública (Moran-López, 2001). 
Los datos en nuestro país, indican que la TB es la única enfermedad 
infecciosa ocasionada por un agente etiológico y que se encuentra entre las 20 
principales causas de muerte, solo superada por las enfermedades infecciosas 
intestinales, la neumonía e influenza. Cada año se notifican en promedio 
10,000 casos con subregistros del 45% estimándose la cifra real de casos 
activos en 30,000 de los cuales 80% son de localización pulmonar (García-
Garcia, et al., 1999). 
Se estima que en América latina y el Caribe se producen un total de 
7000 nuevos casos anuales (Aguirre, et al., 2007). En América latina la TB y la 
TBB constituyen un problema difícil de erradicar. Cerca de 350,000 casos de 
TB activa y más de 50,000 muertes en humanos fueron los estimados para la 
región durante el 2004 (Ritacco, 2006). 
3 
1.3. Etiología. 
1.3.1. Características generales de las micobacterias. 
Las micobacterias son anaerobias, muchas especies de este género son 
capaces de sobrevivir dentro de los fagocitos y causar la enfermedad. La pared 
de las micobacterias se encuentra por debajo de la cápsula separada por el 
espacio periplásmico. La característica química más importante de las 
micobacterias, es el alto contenido de lípidos (20% y 40% del peso seco), la 
pared celular tiene 60% de lípidos de su peso seco, por lo que con esto se 
explica lo hidrófobo de los organismos (Chen, et al., 2006). 
El genero Mycobacterium está integrado por bacilos de 3 a 5 flm de 
longitud o curvos en forma de maza, inmoviles, no esporulados con abundates 
granulos citoplasmáticos, que poseen una mayor resistencia a la tinción por los 
colorantes comunes, pero una vez teñidos son resistentes a la decoloración 
con una mezcla de alcohol ácido (Pfyffer, et al., 1998). 
Aunque este orden comprende microorganismos diversos, las 
micobacterias y taxones emparentados con ellas se distinguen fácilmente del 
resto por su capacidad de sintetizar ácidos micólicos. Morfológicamente son 
bacilos o cocobacilos ligeramente curvados o rectos, no forman esporas, no 
presentan flagelos ni cápsula. Las micobacterias son bacilos inmóviles, 
aerobios y no formadores de esporas, de crecimiento lento, presentan una 
cubierta cérea que les hace retener la tinción roja después de ser tratadas con 
ácido, de ahí que se nombren también bacilos alcohol ácido resistentes; estas 
bacterias se inactivan con rayos ultravioletas y a temperaturas mayores de 
60°C (Moran-López, 2001), crecen en medios especiales complejos, donde el 
más común es el de Lowenstein-Jensen. De acuerdo con su crecimiento, hay 2 
grupos: de crecimiento rápido o de crecimiento lento. El lento tarda más de 7 
días en formar una colonia, y el rápido tarda menos de 7 días en formarla 
(Rastogi, 2001). 
4 
El genoma del M. bovis tiene una secuencia de longitud de 4, 345,492 
pares de bases (pb), colocado en un cromosoma circular G + C en un promedio 
de 65.63 %. El genoma contiene 3,952 genes codificados y 42 elementos IS. El 
genoma de M. bovis es > 99.95% idéntico a los niveles de nucleótidos de M. 
tuberculosis, (Garnier et al., 2003). 
La envoltura de las micobacterias consta de tres componentes 
esenciales: una membrana plasmática unida por enlace covalente al ácido 
micólico (Monahan 2001), que son ácidos grasos ¡3-hidroxi con cadena larga a-
alkil. Se han encontrado tres diferentes estructuras de ácidos micólicos (alfa-
ácidos micólicos, metoxi- ácidos micólicos y ceto-ácidos micólicosGuilleron, et 
a/. , 2005) 
La membrana celular micobacteriana es una estructura compleja, con 
una elevada proporción de lípidos (de un 30% a un 40% del peso total). 
Abundan lípidos en su pared celular como: micósidos, ácidos micólicos, factor 
formador de cordones o factor cuerda (del inglés, Cord Factor) y los sulfolípidos 
(Moran y Lopéz, 2001). 
La pared celular de las micobacterias está localizada en el interior de la 
membrana citoplásmica que contiene grandes cantidades de lípidos, muchos 
de ellos con estructura original. La mayor porción de la pared celular está 
ocupada por ácidos micólicos. Con cadenas largas de ácidos grasos 
conteniendo de 70 a 90 carbonos. El péptidoglicano, el cual contiene ácido N-
glicolilmurámico en lugar del usual ácido N-acetilmurámico, está unido a la 
arabinogalactama por medio de un enlace fosfodiéster. Cerca del 10% de los 
residuos de arabinosa de arabinogalactama son sustituidos por ácidos 
micólicos, produciendo la estructura unida covalentemente a la pared celular. 
La pared celular también contiene diversos tipos de "Iípidos extraíbles" no hay 
unión covalente en su esqueleto basal; esos incluyen glicolípidos conteniendo 
trehalosa, glucósidos fenol phthiocerol y glicopéptidolípidos (Liu, el al. 1995). 
El lípido característico de las micobacterias, conocido como factor 
cuerda, parte del thiocerol dimicocerosato (DIM) que es un micósido 
5 
identificado como treha/osa 6,6-dimico/ato, siendo un complejo formado por 
tres macromoléculas: pétidoglicano, arabinogalactana y micolatos.EI factor 
cuerda, es un glucolípido de superficie que in vitro hace que crezca en 
cordones con configuración de serpentina y sólo lo presentan las cepas 
virulentas; la virulencia está dada por la capacidad de formar cordones.EI factor 
formador de cordones inhibe la migración de leucocitos. Además, la inyección 
del factor cordonal induce la aparición del granuloma característico (Moran-
López, 2001). 
El factor cuerda es la molécula mixta que se encuentra en la capa 
periférica de la envoltura y es mayor componente de la pared celular 
característico del bacilo. El factor cuerda es muy abundante en todas las 
micobacterias patógenas. Recibe este nombre por que en los cultivos, las 
bacterias forman agregados semejantes a cordones. En diversas especies y 
cepas de micobacterias esta molécula presenta pequeñas variaciones en 
ciertos grupos químicos (Moran-López, 2001). 
El factor cuerda estimula la actividad enzimática que hidroliza al 
dinucleótido de nicotidamida y adenina (NAOasa) en el huésped, dando como 
resultado la disminución de coenzima NAO. Esta coenzima es muy común en 
reacciones catabólicas de oxido reducción; la ausencia de NAO irrumpe la 
cadena respiratoria en las mitocondrias.EI factor cuerda es inmunogénico y se 
ha intentado usarlo en la prevención de la tuberculosis; por su naturaleza 
favorece a la inflamación crónica y ayuda a la formación de granulomas en los 
pulmones (Rhoades et al., 2003). 
1.4. Vías de transmisión de la tuberculosis bovina. 
La bacteria M. bovis es el agente causal de la tuberculosis en un rango 
amplio de animales que incluyen bovinos (Serge, et al. 2005), y otros animales 
domésticos como ovejas, cerdos, llamas, perros, gatos y algunas veces 
equinos (Phillips; et al. 2003), focas, cabras, búfalos, tejones, babuino, bisonte, 
coyote, hurón leopardo, león, zorro, mapache, antílope (Biet, et al. 2005) y en 
6 
humanos a partir de productos no pasteurizados de origen bovino. Por lo que 
esta patología es aun en día altamente enzoótica en algunas partes del mundo 
(Martineau, et al., 2007). 
El agente causal de la TBB M. bovis, es considerado un patógeno 
intracelular obligado, aunque en estudios realizados se ha demostrado que 
esta bacteria puede sobrevivir fuera del huésped por largos periodos. El éxito 
del bacilo tuberculoso como patógeno se debe principalmente a la habilidad de 
persistir largo tiempo dentro del huésped causando la enfermedad superando 
la respuesta inmune del huésped (Biet, et al., 2005). Hoy en día, M. bovis 
representa el mayor patógeno para los animales domésticos que se desarrollan 
en el campo especialmente en ganado bovino y caprino de pastoreo, lo que 
dificulta la erradicación de esta enfermedad. La leche cruda y los subproductos 
de esta son la principal fuente de infección de la tuberculosis en humanos, en 
algunos países M .bovis es la responsable del 5 al 10 % de la tuberculosis en 
humanos. (Milián et al., 2000). 
Existen varias vías de transmisión de la tuberculosis en el ganado, que 
están influenciadas por factores como la edad, el medio ambiente, genéticos y 
practicas de manejo, deficiencias nutricionales, estado inmunológico (Pollock 
and Neill 2002). En humanos el factor de riesgo de infección micobacteriana se 
relaciona principalmente al contacto con M. tuberculosis, en la que los factores 
de riesgo son intensidad de la exposición, edad, sistema inmune, coinfección 
con VIH, factores genéticos, estado de vacunación, y también factores 
socioeconómicos (Flynn and Chan, 2001). 
La mejor evidencia de la vía de transmisión de M. bovis en bovinos es la 
presencia de las lesiones observadas al momento del sacrificio de los 
animales, en donde los hallazgos post mortem muestran lesiones que se 
enfocan principalmente en los nódulos retrofaríngeos y en algunos casos muy 
crónicos las lesiones se pueden apreciar en la cavidad torácica lo que hace 
manifiesto que la principal vía de transmisión de esta enfermedad es por 
inhalación de aerosoles (Biet, et al., 2005), considerando con esto que entre el 
80 y el 90% de los casos la transmisión ocurre por la vía aerógena por medio 
7 
de la tos o la respiración de un animal infectado que libera gran cantidad de 
aerosoles contaminadas con el bacilo (Moran y Lazo, 2001). 
Otra vía de infección es la vía digestiva que ocurre cuando los animales 
entran en contacto con M. bovis a través de saliva, secreciones nasales, orina y 
heces. La vía digestiva es de gran importancia en aquellos becerros que son 
alimentados con calostro o leche cruda de vacas infectadas pues estas 
eliminan al la bacteria por medio de la leche (Pollock and Nelly, 2002). Por lo 
tanto, lesiones en nódulos mesentéricos sugieren que la infección fue por vía 
digestiva. En ganado la mayoría de las lesiones se localizan en el tracto 
respiratorio alto como bajo y esta asociado a nódulos linfoides (Biet, et al. 
2005). 
Otras vías de infección de M. bovis entre ganado poco usuales pueden 
ser, la vía la transmisión vertical que puede ocurrir congénitamente vía 
umbilical a través de los vasos sanguíneos como secuela de la infección 
uterina. (Phillips, et al. 2003). 
1.5. Patogenia de la tuberculosis. 
Hay que distinguir dentro de la patogenia de la tuberculosis si se trata de 
una primoinfección, en la que M. bovis entra en contacto por primera vez con 
un organismo, o bien de un fenómeno secundario, en el cual ha existido un 
contacto previo y por tanto el animal presenta inmunidad (Moran-López, 2001). 
El bacilo tuberculoso no elabora endotoxinas ni exotoxinas, en su lugar, 
la enfermedad en sí y la destrucción de los tejidos son ocasionados por 
productos que elabora el huésped durante la respuesta inmunitaria a la 
infección (Moran-López, 2001). 
Se desencadena en el organismo una respuesta inmunitaria, mediada 
por células, que se desarrolla en un tiempo que oscila entre 2 y 10 semanas 
(Bass, et al., 1990). 
8 
Cuando la micobacteria entra a los tejidos prolifera localmente. Esta 
proliferación en los tejidos esta asociada con una respuesta inflamatoria por 
infiltración de macrófagos y otras células del sistema inmune a los tejidos 
(FSAI, 2003). El evento inicial después de la infección involucra multiplicación 
de bacilos en el interior del macrófago hospedero (Couture, et a/., 1999). 
Cuando un macrófago alveolar envuelve a un bacilo tuberculoso,al 
principio le suministra el ambiente nutricional que necesita dentro de su 
fagosoma, donde el bacilo sobrevive y se multiplica. También, en la 
primoinfección, una o más micobacterias son rápidamente fagocitadas por 
macrófagos alveolares que intentarán lisarlas sintetizando distintas enzimas: 
lipasas, fosfolipasas, proteasas y lisozimas, sin lograrlo en la mayoría de las 
ocasiones (Pollock, 2001). 
La capacidad de estos macrófagos para erradicar por sí solos al bacilo 
tuberculoso en estas primeras etapas, parece ser muy escasa, quizás porque 
su función se ve interferida por factores que han sido atribuidos a diversos 
componentes de la pared celular que le permite a este patógeno escapar de la 
destrucción inducida por las defensas del organismo (Buddle, et a/.,2005). 
Las lipoarabinomananas (LAM) son lipoglicanos compuestos por tres 
dominios y un esqueleto formado por polisacáridos. LAM corresponde a una 
población heterogénea de moléculas que tiene una distribución gausiana de los 
diferentes componentes de glicosilación y acetilación (Nigou, et a/., 2003). 
El LAM también hace que los macrófagos secreten el factor de necrosis 
tumoral alfa (TNF-a), que causa fiebre, pérdida de peso y lesión tisular, y la 
interleucina 10 (IL-10), que suprime la proliferación de las células T inducida 
por las micobacterias (Alderwick, et a/2007). 
El complemento activado en la superficie de las micobacterias puede dar 
lugar a la opsonización del Mycobacterium y facilitar su captación por el 
receptor del complemento CR3 existente en los macrófagos (integrina Mac-1). 
Así la micobacteria ocupa una posición intracelular en los macrófagos, con lo 
9 
que aumenta la resistencia microbiana y dificulta la quimioterapia (Hope, et al. 
2004). 
También presenta una proteína llamada proteína de choque térmico 
como la HSP65, HSP60 que es intensamente inmunogénica y puede 
desempeñar un papel importante en las reacciones inducidas por el 
Mycobacteríum, el cual reside en los fagosomas, que no son acidificados por 
los lisosomas. La inhibición de la acidificación se ha asociado con la ureasa 
secretada por el Mycobacteríum. Sin embargo, el macrófago infectado libera 
una sustancia que atrae a los linfocitos T, a continuación los macrófagos 
presentan los antígenos de los bacilos fagocitados a estos linfocitos con lo que 
se inicia una serie de reacciones efectoras inmunitarias. A su vez los linfocitos 
elaboran citocina que activan a los macrófagos, y aumentan su potencial 
antimicrobiano. Después de algunas semanas aparece la inmunidad mediada 
por células T, demostrable por ser positivas a la prueba cutánea con derivado 
proteico purificado (PPD) (Flynn and Chan, 2001 ).Las células T activadas por 
las micobacterias interactúan con los macrófagos de tres formas: 
Primera, las células T colaboradoras CD4+ secretan IFN-y que activa a 
los macrófagos para producir una destrucción intracelular de las micobacterias 
a través de nitrogenados como NO, N02, y NH03 (Moran-López, 2001). 
Segunda, las células T CD8+ destruyen los macrófagos infectados por 
las micobacterias y de esta forma también son eliminadas estas últimas 
(Moran-López, 2001). 
Tercera, las células T doblemente negativas (CD4- y CD8-) lisan los 
macrófagos sin destruir las micobacterias. De esta forma, las defensas del 
huésped se fortalecen a través de las interrelaciones complejas que incluyen a 
los fagocitos mononucleares y distintos subgrupos de células T. En 
consecuencia aparecen macrófagos mas competentes que inhiben la 
multiplicación intracelular de las bacterias al fragmentarse los macrófagos 
facilitan la multiplicación bacilar, engloban a las micobacterias y limitan el 
crecimiento (Moran-López, 2001). 
10 
La lisis de los macrófagos da lugar a la formación de granulomas 
caseificantes (reacción de hipersensibilidad retardada). Estos granulomas 
están constituidos por macrófagos transformados en células epiteloides, que 
tiene una mayor capacidad microbicida, y en células gigantes multinucleadas 
tipo Langhans, que son macrófagos cuyos núcleos se disponen periféricamente 
rodeado al antígeno tuberculoso. Las células epíteloides segregan una 
sustancia estimuladora de los fibroblastos que producen colágeno y 
contribuyen a limitar la periferia del granuloma mediante una área de fibrosis. 
La toxicidad directa de las micobacterias sobre los macrofagos también puede 
contribuir a la aparición de centros necroticos Las micobacterias no son 
capaces de sobrevivir en medio extracelular ácido carente de oxigeno, con lo 
que la infección queda controlada. El residuo final de la infección primaria es 
una cicatriz calcificada en el parénquima pulmonar y en el ganglio linfático -
hiliar conjunto denominado complejo Ghon (Chiu, et a/.2004). 
Se conocen 2 formas de infecciónes tuberculosas: la primera que 
corresponde a la infección inicial por el bacilo, la que se ha explicado 
anteriormente y la secundaria o reactivación, que es el resultado de la 
reinfección exógena o de la reactivación de la infección primaria. Esto puede 
deberse a que a la cepa del Mycobacterium sea particularmente virulenta o que 
el huésped sea especialmente suceptible. Los granulomas de la tuberculosis 
secundarias suelen localizarse en el vértice de los pulmones, aunque también 
puede estar ampliamente diseminados en pulmon, meninges, médula osea y 
otros órganos (Moran-López, 2001). 
Los granulomas que no consiguen contener la expansión de la infección 
de la bacteria son la causa principal de la lesión tisular en la tuberculosis y 
reflejan una hipersensibilidad de tipo retardada. Dos características de la 
tuberculosis secundaria son la presencia de necrosis caseosa y de cavidades, 
que al romperse los vasos sanguíneos diseminan a las micobacterias por todo 
el organismo y cuando se abren las vías respiratorias liberan micobacterias 
infecciosas en aerosoles (Moran-Lopez ,2001). Se ha comprobado en las 
lesiones primarias que experimentan fibrosis parcial e incluso calcificación, la 
persistencia de bacterias viables por muchos años y de hecho esto puede 
provocar, en cualquier momento, la reinfección endógena (Polloc y Neill, 2002). 
11 
1.6. Respuesta inmune a la tuberculosis bovina. 
La formación de los granulomas se debe a una serie de mecanismos de 
la respuesta inmune produciendo la activación y diferenciación de los 
macrófagos dicha respuesta es mediada principalmente por el factor de 
necrosis tumoral alfa (TNF-a) deteniendo la diseminación de la bacteria. El 
factor cuerda ha sido relacionado con la inhibición de la fusión de los lisosomas 
con los fagosomas dentro de los macrófagos fenómeno que es indispensable y 
clave para la sobrevivencia de Mycobaclerium (Chiu, el a/.2004). 
Las micobacterias tienen la capacidad de producir amoniaco y con ello 
evadir el ambiente toxico que existe dentro de la vacuola lisosomal por medio 
de la alcalinización. Existen dos enzimas que pertenecen al metabolismo del 
amoniaco, la urea micobacteriana y la glutamino sintetasa han sido asociadas 
en la interrupción de la fusión fagolisosomal y permitir la sobrevivencia de la 
bacteria (Harth, el al., 1994). 
Un punto importante para los eventos de la micobacteria patógena es su 
estructura poco usual de la pared celular y su interacción con el sistema 
inmune (Asselinau and Lanéelle, 1998). 
Los lípidos de la membrana externa son los componentes 
micobacterianos que interactúan con el huésped, estos lípidos ocasionan una 
respuesta inflamatoria, los monósidos fosfatidilinositol y LAM, activan la 
señalización para la producción de citocinas y quimiocinas en células 
mononucleares como macrófagos y células dendríticas (CD). LAM es un 
lipoglicano de 17 kDa, compuesto de tres dominios, un núcleo polisacárido 
formado por unidades de D-manana, D-arabinomanana, un dominio 
fosfatidilinosistol anclado a la membrana y un polisacárido terminal no 
reducidos que contienenel disacárido beta-D-Araf( 1-2)-alfa-D-A-araf 
(Alderwick, et a/2007). 
En humanos LAM inhibe la proliferación de células T, desecha radicales 
libres de oxigeno, bloquea la activación transcripcional de genes que activan la 
síntesis de IFN-y, inhibe la actividad de la proteína cinasa, también altera la 
12 
producción de citocinas en los macrófagos. LAM esta implicado en la inducción 
de la fiebre, en la necrosis de tejido (Glataman, el al., 2000). Los lípidos de la 
pared celular están asociados a carbohidratos (glicolipidos), fosfolípidos 
glicosilados y carbohidratos complejos sustituidos con ácido micólico y 
péptidos. Las porciones glicosiladas de estas moléculas son importantes en la 
interacción con los componentes de la respuesta inmune innata y especifica del 
huésped en complejo de péptidoglicanos llamado proteína cinasa activada por 
mitógenos (MAPc) que son moléculas unidas a arabinogalactana (AG) y una 
cápsula rica en polisacáridos. Esta complejidad que muestra la pared celular de 
las micobacterias es lo que le permite interactuar con diversos receptores de 
los macrófagos que le permiten a la bacteria tener una gran capacidad de 
adaptación intracelular (Alderwick, et al 2007). 
1.7. Receptores tipo Toll. 
El sistema inmune detecta y elimina la invasión de microorganismos 
patógenos por la capacidad de distinguir entre aquello que es propio y ajeno. 
En las especies mamíferas el sistema inmune se divide en dos ramas: la 
inmunidad innata y la inmunidad adquirida. Por lo tanto, el mecanismo por el 
cual la inmunidad innata reconoce lo no propio permaneció desconocido hasta 
muy recientemente. Los avances en inmunología han marcado la gran 
importancia de los mecanismos de la inmunidad innata ambos en el control 
directo de infecciones y en la iniciación de los mecanismos de la inmunidad 
adquirida; con la reciente identificación de los receptores tipo TolI (TLR), en 
mamíferos ha indicado a los inmunólogos de que la inmunidad innata juega un 
papel importante en la detección de patógenos invasivos (Takeda, 2003). 
El punto central de la inmunidad innata es la habilidad del 
reconocimiento celular de patrones moleculares, los cuales distinguen grupos 
de patógenos; en este contexto los TLRs juegan un papel crucial. Estos 
receptores reconocen patrones específicos de los componentes microbianos, 
especialmente aquellos que pertenecen a patógenos; y también regulan la 
activación de la inmunidad innata y de la adquirida. Estudios en varios sistemas 
de mamíferos, incluyendo principalmente al humano y al ratón, han mostrado 
13 
que alteraciones en la señalización de los TLRs predispone a una variedad de 
enfermedades infecciosas (Nicolle, 2004). 
Actualmente es de mucho interés la función y señalización de los TLRs 
en inmunología. La proteína TolI es homologa a la proteína transmembranal 
tipo 1 de los mamíferos. Los TLRs son proteínas que derivan de Drosophila 
melanogaster, inicialmente la proteína TolI fue descrita con un importante papel 
en el desarrollo dorsoventral del embrión de Drosophila. En adición a lo 
anterior, la falta de TolI en Drosophila, por una deficiencia genética, provoca 
severos problemas de defensa en contra de hongos y bacterias gram positivas 
hoy se sabe que es un receptor; un patrón para el reconocimiento asociado a la 
defensa en contra de hongos, e infecciones bacterianas. Subsecuentemente 
los TolI fueron observados también en mamíferos y fueron nombrados 
receptores tipo TolI, por lo que podemos decir que son receptores del sistema 
inmune innato que se han conservado tanto en invertebrados como en 
mamíferos e incluso en plantas. En la actualidad se tienen identificados 10 
tipos de TLRs en humanos (Vaseselon, 2002; Fenton, 2004; Damo, 2005). 
Todos los TLRs tienen una estructura larga en su dominio extracelular 
que están constituidos de unidades repetidas de leucina (550 a 980 
aminoácidos) y un dominio citoplasmático llamado TIR (Toll/lL-LR) con una 
longitud aproximada de 200 aminoácidos. El dominio extracelular tiene alta 
capacidad de unión a ligandos y los dominios TIR son mediadores de señales 
intracelulares (Hallman, et al., 2001). 
La familia de los receptores TolI se ha conservado a través de la 
evolución. Los receptores TolI juegan un papel importante tanto en la 
inmunidad innata como en la adquirida. Las células del sistema inmune innato 
pueden reconocer a patrones moleculares de patógenos invasores a través de 
estos TLRs (ver Figura 1.1.) (Vaseselon, 2002). 
14 
Imida:zoqulnoUnes 
1109"111" (anti-viral compounds) 
peplldoglycan ~ 6i~ 
1 J 
Inflammatory cytoklnes 
Figura 1.1. Resumen de ligandos reconocidos por la familia TLR (Akira, 
et al., 2003) 
Una comparación en la secuencia de aminoácidos de los TRLs humanos 
revelan que dicha familia puede dividirse en 5 subfamilias: TLR3, TLR4, TLR5, 
TLR2 Y TLR9. La subfamilia de los TLR2 está compuesta por TLR1, TLR2, 
TLR6 Y TLR10; la subfamilia TLR9 esta compuesta por TLR7, TLR8 Y TLR9. En 
la subfamilia TLR2, se encuentra que TLR1 y TRL6 son altamente similares en 
sus proteínas y exhiben un 69% de similitud general en la secuencia de sus 
aminoácidos, pero los dominios TIR de ambos receptores son altamente 
conservados, con una identidad por encima del 90%. La división de los TLR en 
5 subfamilias esta basada también sobre la estructura genomica. El gen TLR2 
tiene dos exones pero todas las secuencias codificadas están contenidas 
dentro del exon 2. En contraste, los miembros de la subfamilia TLR9 son 
codificados por estos dos exones. Los genes para TLR7 y TLR8 muestran un 
42.3% de identidad y un 72.7% de similitud en sus secuencias de aminoácidos, 
tienen una estructuras genómicas similares y son localizados cercanamente 
uno al otro en el cromosoma X. Los genes de TLR4 y TLR5 tienen cuatro y 
cinco exones, respectivamente. TLR3 tiene una sola estructura (Takeda, 2003). 
15 
1.7.1. Papel de los TLRs en el reconocimiento de componentes 
microbianos. 
El TLR-4 fue el primer TLR identificado en el humano y se mostró que 
este receptor causaba la inducción de genes de varias citocinas inflamatorias y 
moléculas coestimulatorias. Por lo tanto se previó que los TLRs están 
fuertemente involucrados en la respuesta inmune especialmente en la 
activación de la inmunidad innata. En 1998 se demostró que TLR-4 esta 
involucrado en el reconocimiento de lipopolisacáridos (LPS), componente 
mayor de la pared celular de bacterias Gram negativas; posteriormente, se dio 
a conocer que otros miembros de la familia TLR son esenciales en el 
reconocimiento de una amplia gama de componentes microbianos (Seabury, et 
al., 2007) como se muestra en la Tabla 1.1. Al parecer la estructura de los 
TLRs refleja una función común en el reconocimiento de componentes 
microbianos. 
16 
Nombre del TLR Ligandos 
TLR1 Lipopéptidos triacil (bacteria, micobacteria). 
Factores solubles (Neisseria meningitides). 
Lipoproteínas/lipopéptidos (en varios patógenos). 
Péptidoglicano (bacterias gram positivas). 
Lipoarabinomana (mycobacterium). 
Modulina fenol soluble (Staphylococcus epidermidis). 
TLR2 
Glicoinositolfosfalipidos (Trypanosoma cruzi). 
Glicolipidos (Treponema maltophilum). 
Porinas (Neisseria). 
Zymosan (fungi). 
LPS atipicos (Leptospira interrogans). 
LPS atipicos (Porphyromonas gingivalis). 
HSP70 (Huspéd). 
TLR3 Doble hebra de RNA (Virus). 
LPS (Bacterias). 
Taxol (Plantas). 
Proteínas de fusión (RSV). 
TLR4 Proteína de superficie (MMTV). 
HSP60 (Clamydia pneumoniae). 
HSP60 (Huésped). 
Oligosacáridos de ácido hialurónico (Huésped). 
Fibrinógeno (Huésped). 
TLR5 Flagelina (Bacteria). 
TLR6 Diacetillipopéptidos (micoplasma). 
TLR7 
Imidazoquinolina (Compuesto sintético). 
Loxobirina (Compuesto sintético). 
Bropirimina (Compuesto sintético). 
TRL8 ? 
TRL9 CpG DNA (Bacterias). 
TRL10 ? 
Tabla 1.1. Nombre de los TLR y sus hgandos (Vaseselon, 2002; Takeda, 2003). 
1.7.2. TLR-2. 
TLR-2reconoce una variedad de componentes procedentes de los 
microorganismos, que incluyen lipoproteínas de patógenos tales como 
bacterias Gram negativos, mycoplasma y espiroquetas, péptidoglicano y ácido 
lipoteicoico de las bacterias Gram positivas, lipoarabinomano de 
mycobacterias, glicoinositolfosfolipidos de Trypanosoma cruzí, modulina fenol-
soluble de Staphylococcus epídermídís, zymosan de hongos, glicolipidos de 
Treponema maltophílum y porinas que constituyen la membrana exterior de 
Neíssería (Fenton, 2004). El análisis en ratones con deficiencia de TLR-2 
muestra que éste es critico para el reconocimiento de péptidoglicano y 
17 
lipoproteínas, por consiguiente ratones con deficiencia de TLR-2 muestran una 
alta susceptibilidad a infecciones por bacterias gram positivas como S. aureus 
en ratones normales que no muestran esta deficiencia. En cepas de ratones 
deficientes de TLR-2 muestra una deficiencia en la respuesta a espiroquetas 
después de la infección con Borrelia burgdorferi (Takeda, 2003). 
También TLR-2 reconoce a varios tipos de LPS atípicos de Leptospira 
interrogans y Porphyromonas gingivalis, en contraste a TLR-4, el cual reconoce 
LPS de enterobacterias como Escherichia coli y Salmonella spp. En particular 
estos LPS estructuralmente difieren en el número de cadenas acetil en los 
componentes del lípido A. Los TLR-2 y TLR-4 reconocen las variaciones 
estructurales de los LPS (Takeda, 2003). 
Un aspecto del ligando de TLR-2 para reconocimiento involucra la 
cooperación de otros miembros de la familia de los TLRs, en particular TLR-6 y 
TLR-1 que confiere una discriminación entre diferentes compuestos 
microbianos. El papel de TLR-6 fue analizado introduciendo dominio negativo 
en una línea celular de macrófagos de RAW264.7. El péptidoglican y la 
modulina de S. aureus son ligandos de TLR-2 que induce producción de TNF-a 
células RAW264.7, pero esta respuesta esta suprimida por la expresión de un 
dominio negativo de TLR-6. Los coinmunopresipitados de TLR-2 y TLR-6, 
sugieren que hay una interacción física en la célula (Takeda, 2003). 
Un análisis en ratones deficientes de TLR-6 demostró que este receptor 
coopera con TLR-2 en la función de reconocimiento de lipopéptidos 
microbianos. Por ejemplo, los lipopéptidos bacterianos tienen un residuo de 
cisteina en su porción NH2-terminal que esta triacetilado, en contraste los 
macrófagos son activados por lipopedtidos 2 (MALP-2) micoplasmales el cual 
solo esta diacetilado. Los macrófagos de ratones deficientes de TLR-6 no 
muestran una respuesta inflamatoria a MALP-2, mientras que estas células 
responden normalmente a lipopéptidos. Los ratones con macrófagos 
deficientes de TLR-2 no muestran respuesta a ninguno de los dos lipopéptidos. 
De forma TLR-2 y TLR-6 son requeridos para la respuesta a MALP-2, la 
función de TLR-6 esta asociada con TLR-2 para conferir una especificidad en el 
18 
reconocimiento a las diferencias entre lipopéptidos triacetilados y acetilados 
(Takeda, 2003). 
1.7.3. TLR-4. 
El TLR-4 es un receptor esencial para el reconocimiento del LPS, 
también sirve para identificar varias proteínas de choque térmico las cuales 
incluyen HSP70 y HSP60. También el reconocimiento de LPS por parte de 
TLR-4 requiere de otras moléculas. LPS se une a una proteína de unión, 
presente en suero y este complejo, LPS-LPS-Proteína de unión es reconocido 
por CD14 anclado a una molécula de glicosilfosfatidilinosistol expresado 
preferentemente en macrófagos y neutrófilos. La estimulación por LPS es 
seguida por un aumento en la proximidad física entre CD14 y TLR-4, sugiriendo 
que CD14 y TLR-4 quizá interactúan en la señalización LPS. MD-2 se identifico 
como una molécula asociada con la porción extracelular de TLR-4 y 
responsable del enlace con los LPS. Ratones deficientes de MD-2 demuestran 
que esta proteína es esencial para la respuesta de los LPS. Ratones 
deficientes de MD-2 en macrófagos, células dendríticas y células B muestran 
problemas a la respuesta de LPS. (Takeda, 2003; Vaseselon, 2002). 
Activación de células B por retrovirus murinos es dependiente de TLR-4. 
Las proteínas de envoltura de virus (p.e. virus de la leucemia murina Moloney, 
proteína F del virus respiratorio sincitial) fueron reportadas por co-
inmunoprecipitar con TLR-4. Así, TLR-4 esta posiblemente involucrado en el 
reconocimiento de un cierto grupo de virus; tambien en productos de plantas 
como el taxol (Fenton, 2004). 
El dominio extracelular de TLR-4 contiene 22 copias de repeticiones 
ricas en leucina (LRR), el dominio extracelular contiene 9 sitios de enlace-N 
glicosilados. La glicosilación es importante para la transportación de la proteína 
a la superficie de la célula y mantiene la integridad funcional del complejo 
receptor LPS. La señal del TLR-4 esta mediada por el dominio TIR (Takeda, 
2005). 
19 
La expresión de TLR-4 se encuentra en tejidos como corazón, pulmón, 
piel fetal, cerebro fetal, placenta, ileon y otros tejidos. La cantidad de este 
receptor en la célula es muy pequeña (poco mas de 1000) (Takeda, 2005). 
1.8. Antígenos Micobacterianos. 
1.8.1. PPD bovino. 
El derivado proteico purificado (PPO), es extracto antigénico derivado del 
cultivo de un bacilo tuberculoso en un medio sintetico. Los derivados proteicos 
purificados que se producen son tres, utilizados ya sea de M. tuberculosi, M. 
bovis y M. avium. De ellas sólo las tuberculinas bovinas y aviar tienen 
aplicación veterinaria (Torres, 2005). 
1.8.2. Proteína PE-PGRS33. 
El papel multigen de la familia proteica PE es muy singular en la 
patogénesis de las micobacterias, pero que aun no esta bien entendidos; sin 
embargo ciertos genes PG-PGRS parecen estar vinculados a la virulencia. 
Uno de los papeles de estas proteínas es la inducción de la producción de 
TNF-a. Varias proteínas PE-PGRS están localizadas en la superficie celular de 
M. tuberculosis. Una de estas es la PE-PEGRS33 (Basu, et al., 2007). 
1.8.3. Glicolipoproteína de 38 kDa. 
La respuesta inmune a M .tuberculosis es activada a través de ciertas 
proteínas que son secretadas por esta bacteria, en consecuencia estas 
proteínas son punto de estudio para el desarrollo de vacunas e 
inmunodiagnoticos. Entre varios antígenos proteicos micobacterianos se 
encuentra la glicolipoproteína de 38 kOa, que es activamente secretada en 
cultivos celulares. Este antígeno induce una fuerte respuesta inmunológica a M. 
20 
tuberculosis como a M. bovis y provoca una fuerte protección en animales y 
humanos (Jung, et al., 2006). 
21 
2. JUSTIFICACiÓN. 
En México como en muchos países del mundo la tuberculosis es un 
padecimiento grave que afecta, tanto a humanos como al ganado bovino, y con 
ello al sector salud y al de la producción pecuaria, respectivamente. 
En el contexto de inmunidad, el sistema inmune en los mamíferos se 
divide en dos importantes ramas la cuales son: la inmunidad adquirida y la 
inmunidad innata. Esta última ha tenido poca atención en el ámbito de la 
inmunología. 
La importancia del papel que juega la inmunidad innata en respuesta a la 
invasión del bacilo tuberculoso es fundamental para controlar y evitar la 
infección. 
En el contexto del sistema inmune innato existe una familia de 
receptores que han permanecido a través de la evolución que se conocen 
como receptores tipo TolI (TLR). Estos receptores pertenecen a un grupo de 
receptores conocidos como receptores de reconocimiento de patrones (PRRs). 
Los TLR tienen la capacidad de reconocer estructuras comunes de una amplia 
variedad de patógenos, como por ejemplo: LPS, que se encuentra en una 
diversidad de bacterias gram negativas, zymosan presente en especies 
pertenecientes al reino fungi, lipoproteínas de varias bacterias, RNA virales. 
Existe una amplia variedad de estudios, principalmente realizados en 
humanos y ratones, acerca de la interacción que hay entre estructuras de 
patógenos y éstos. Algunos de losantígenos micobacterianos estudiados en 
ratones y humanos han sido: PPO humano, la proteína PE-PGRS33 y 
glicolipoproteína de 38 kOa. En bovinos antígenos micobacterianos como el 
PPO bovino y la glicolipoproteína de 38 kOa, han sido poco estudiadas las 
interacciones que existen con los TLRs bovinos; en tanto que la interacción de 
la proteína PE-PGRS33 no se tienen reportes en las que se mencione el 
reconocimiento de dicha proteína por alguno de los TLRs bovinos. 
22 
Debido a la importancia de la tuberculosis bovina en el ámbito de la 
salud publica por su carácter zoonótico y el resurgimiento de ésta en las 
ultimas décadas por la asociación que existen en aquellas personas con alguna 
inmunodeficiencia; como la importancia pecuaria por las grandes perdidas 
económicas que representa para la industria del ganado lechero y productor de 
carne es necesario desarrollar investigación a para la compresión de los 
mecanismos de defensa del huésped hacia M. bovis que es el agente etiológico 
de la tuberculosis bovina. Teniendo en cuenta que en los últimos años se le ha 
dado mas importancia a la inmunidad adquirida que a la inmunidad innata y 
que ésta ha retomado interés nuevamente al ver la importancia de los 
mecanismos de defensa que tienen los receptores tipo Tol! en plantas, insectos 
y mamíferos, se necesario el estudio de los TLRs que como se menciono 
anteriormente son parte del sistema inmune innato; los resultados obtenidos 
nos permitirán comprender mejor la interacción de algunos antígenos 
micobaterianos con componentes del sistema inmune innato como son los 
TLRs y que permitan abrir nuevos puertas de investigación relacionadas a la 
tuberculosis. 
Por lo que en el presente trabajo se realizó la estandarización de un 
sistema bovino in vitro para tratar de analizar la posible interacción de algunos 
antígenos micobacterianos con TLR-2 y TLR-4. La estimulación in vitro de 
PBMCs adherentes con antígenos que se sabe estimulan a TLRs específicos 
como son: (zymosan que se estimula a TLR-2 y LPS que estimula a TLR-4); así 
mismo se analizaron PBMCs adherentes estimuladas con (PPD bovino, 
glicolipoproteína de 38 kDa y la proteína PE-PGRS33. 
Por medio de la técnica de RT -PCR se realizó la evaluación de los 
niveles de expresión de citocinas como IL-6, IL-12, TNF-a IFN-y, que se saben 
se producen en respuesta a antígenos micobacterianos y cuya producción es 
regulada por las vías de señalización de TLR-2 y TLR-4. 
23 
3. HIPÓTESIS. 
Algunos de los antígenos de origen micobacterianos como PPO, 
proteína PE-PGRS33 y glicoproteína de 38 kOa son capaces de estimular los 
niveles de expresión del RNA mensajero correspondiente a algunas citocinas 
como IL-6, IL-12, TNF-a e INF-y, y a los TLR-2 y TLR-4, de en células 
mononucleares de sangre periférica de bovinos. 
24 
4. OBJETIVOS. 
4.1. Objetivo general. 
Establecer un sistema in vitro para el análisis de la estimulación de los 
TLRs (2 y 4) en bovinos en respuesta a antígenos micobacterianos. 
4.2. Objetivos específicos. 
);.- Obtener las PBMCs adherentes bovinas empleando un sistema de 
gradiente de densidad. 
);.- Realizar la extracción de gONA y RNA a partir de PBMCs, y la sintesis 
de cONA. 
);.- Estandarizar las condiciones de trabajo para el desarrollo del sistema 
bovino de estimulación in vitro de PBMCs adherentes con antígenos 
micobacterianos y lectinas que permitan el análisis de los niveles de 
estimulación de TLR-2 y TLR-4. 
);.- Analizar mediante la técnica de RT-PCR los niveles de expresión de 
mRNA correspondiente a algunas citocinas y TLRs bovinos, de PBMCs 
adherentes estimuladas in vitro con antígenos micobacterianos. 
25 
5. MATERIAL Y MÉTODOS. 
5.1. Colección y tratamiento de muestras. 
Se trabajo con becerras de raza Holstein Friesian, de las cuales se 
colectaron 10 mL de muestra sanguínea en tubos vacutainer con heparina 
(Becton, Dickinson and Company No. Cat 367874); de aquí se obtuvieron 
células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) mediante la técnica de 
gradiente de densidad que se describe a continuación. 
Cada 5 mL de sangre se diluyó en 5 mL PBS pH 7.2 (GIBCO No. Cat 
20012), mezclándose de forma suave, posteriormente esta suspensión se 
agrego de manera lenta por la pared de un tubo cónico de 15 mL que contenía 
4 mL de Histopaque (Sigma Diagnostics No. Cat. 10831), después se 
centrifugo a 1,500g durante 30 minutos, la interfase obtenida con el anillo de 
PBMCs se transfirió a otro tubo del mismo volumen, la suspensión de células 
obtenidas se lavo 2 veces con PBS pH 7.2, ajustándose el volumen a 15 mL y 
centrifugando a 1500g durante 15 minutos. Después del ultimo lavado se 
decanto el sobrenadante y las PBMCs se resuspendieron en 2 mL de medio de 
cultivo para tejido (TCM) que consistía en RPMI-1640 con glutamax I (GIBCO 
BRL No- Cat. 22400-89), suero fetal bovino (FCS) (GIBCO-BR No. Cat. 16000-
036) Y antibiótico estreptomicina/penicilina. A partir de esta suspensión celular 
se procedió a realizar la cuantificación de células viables. 
5.2. Prueba de viabilidad celular por exclusión de azul de Tripan. 
Para medir la viabilidad celular se empleo la prueba de exclusión de la 
tinción de azul de Tripan. El objetivo de esta técnica es determinar el número 
de células viables en una suspensión. El principio esta basado en que las 
células vivas tienen su membrana celular integra y pueden excluir ciertas 
tinciones como el azul de Tripan. 
26 
Para realizar esta técnica se tomaron 10 ¡JI de la suspensión celular de 
PBMC y se mezclaron con 10 ¡JI de azul de Tripan al 0.4% (GIBCO BRL No. 
Cat. 15250-061), se dejo reposar esta mezcla durante 3 minutos para permitir 
al colorante penetrar en aquellas células muertas; posteriormente se tomaron 
10 ¡JI Y se depositaron en la cámara de Neubauer. Enseguida, se observaron 
las células al microscopio utilizando el objetivo 100X para la localización de los 
cuadrantes, después se cambio al objetivo de 40X y se procedió a realizar el 
conteo de las células vivas. Se contabilizaron los 4 cuadrantes para sacar el 
número de células viables empleando la siguiente formula: 
Células totales = Numero de células viables (104 X 2 X volumen total en mL). 
Numero de cuadrantes. 
5.3. Obtención de PBMCs adherentes. 
La suspensión estéril de PBMCs se ajustó a 3X106 células/mL, de esta 
suspensión celular se depositaron 4 mL en cada caja petri de un diámetro 5 cm 
(Becton, Dickinson and Company No. Cat 3002). Las PBMC se mantuvieron 
durante 2.5 horas en una incubadora (Nauire CO2 Water Jacket Incubator) a 
una atmósfera de 5% de C02 y a una temperatura de 37° C (Covert el al., 
1995., Werling el al., 1999). Transcurrido el tiempo de incubación se decanto el 
sobrenadante y se procedió a realizar la cosecha de las células adherentes con 
un raspador de células de 23 cm (Nunc No. Cat. 179695), llevando a cabo una 
serie de tres lavados con 3 mL PBS (pH 7.2) por caja en cada ocasión; todo el 
volumen se colecto en un tubo de 15 mL y se centrifugo a 11,500 g durante 5 
minutos. El botón de células obtenidas se resuspendió en aproximadamente 7 
mL de medio TCM. Dicha suspensión se ajusto a una concentración de 1 X1 07 
células/mL realizando el conteo mediante la técnica de exclusión de azul de 
Tripan. 
27 
5.4. Antígenos. 
Los antígenos empleados como estímulos controles para las PBMCs 
adherentes se mencionan a continuación, así como los antígenos de origen 
micobacterianos que se evaluaron para la estimulación in vitro de las PBMCs 
adherentes. 
5.4.1. Lipopolisacárido (LPS) de Salmonella minesota. 
El liofilizado de LPS (Sigma No. Cat. L4391) fue resuspendido en agua 
estéril ajustando a una concentración a 1 mg/mL, de este stock, se hicieron 
alicuotas de 20 ).11 quedando así la solución de de trabajo a una concentración 
de 10 ).1g/mL. 
El LPS es un componente característico de la pared celular de las 
bacterias gram negativas y que noesta presente en bacterias Gram positivas, 
el LPS esta localizado en la capa externa de las bacterias. El LPS es un 
antígeno altamente inmunogénico que tienen también la propiedad de 
aumentar la respuesta inmune. Se sabe que el LPS estimula al TLR-4 humano 
por lo que se empleo como un control positivo para este receptor tipo ToII. 
5.4.2. Zymosan. 
Se empleó el liofilizado de Zymosan de Saccharomyces cerevisiae 
(Sigma No. Cat. 4250), que fue resuspendido en PBS estéril ajustando la 
concentración del stock a 1 mg/mL, de este stock se hicieron alicotas de 50 ).11 
quedando así la solución de trabajo a una concentración final de 133 ).1g/mL. 
El Zymosan es un polisacárido preparado a partir de la pared celular de 
Saccharomyces cerevisiae que se sabe estimula al TLR-2 humano. 
28 
5.4.3. Derivado proteico purificado de Mycobacierium bovis (PPD 
bovino). 
El PPD bovino es un extracto de proteínas obtenido de filtrados de 
cultivo de Mycobacterium bovis cepa AN5 previamente inactivadas por calor. El 
stock del PPD (Pronavibe) estaba a una concentración de 1 mg/mL, a partir de 
esta se hicieron alicuotas de 25 ¡.tI, que fueron almacenadas a -8 oc. La 
concentración final por pozo utilizada fue de 10 ¡.tg/mL. 
5.4.4. Proteína PE-PGRS33. 
La PE-PGRS33 es una proteína que pertenece a la familia de proteínas 
PE-PGRS, este tipo de proteínas se encuentran localizadas en la superficie 
extracelular de M. tuberculosis. 
Este estimulante se encontraba a una concentración de 1 ¡.tg/¡.tl, estaba 
resuspendido en tris 80 mM pH 8.0. De este stock se hicieron alicuotas de 10 ¡.tI 
utilizando una concertación de 5 ¡.tg/mL. (Antígeno proporcionado por la Dra. 
Clara Inés Espitia Pinzón del Instituto de Investigaciones Biomédicas de la 
UNAM). 
5.4.5. Glicolipoproteína de 38-kDa. 
Este antígeno es activamente secretado por M. tuberculosis. Este 
estimulante se encontraba resuspendido en NaH2P04H20 al 50 mM y estaba a 
una concentración de 280 ¡.tg/mL. Para usos del experimento se empleo una 
concentración final de 5 ¡.tg/mL. (Antígeno proporcionado por la Dra. Clara Inés 
Espitia Pinzón del Instituto de Investigaciones Biomédicas de la UNAM). 
En la Tabla 5.1. Se resumen algunos aspectos de los estimulantes y 
antígenos micobacterianos mencionados anteriormente. 
29 
Estimulante Concentración Citocina que Ligando Final Induce 
Zymosan 133.3 f.lg/MI 
TNF-a, IFN-y 
TLR-2 
IL-6, IL-12 
LPS 10 f.lg/MI 
TNF-a, INF-y TLR-4 
IL-6,IL-12 
PPD 10 f.lg/mL IFN-y 
PE-PGR33 5 f.lQ/mL TNF-a TLR-2 
Proteína de 38 KD 5 f.lg/mL TNF-a, IL-6, TLR-2 Y TLR-4 
Tabla 5.1. Estimulantes y antígenos micobacterianos 
utilizados para la estimulación in vitro de PBMCs 
adherentes. 
5.5. Estimulación in vitro de PBMCs adherentes. 
Se utilizaron placas de cultivo celular de seis pozos (Sarstedt No. Cat. 
83.1839). De la suspensión de PBMCs adherentes ajustada a 1X107 
células/mL se tomaron 600 ¡.tI Y se depositaron en cada uno de los pozos. 
Posteriormente, en cada pozo diferente se colocaron volúmenes de las 
soluciones de trabajo de cada uno de los antígenos estudiados (20 ¡.tI de 
zymosan, 15 ¡.tI de LPS, 15 ¡.tI de PPD bovino, 7.5 ¡.tI de PE-PGRS33 y 27 ¡.tI de 
la glicolipoproteína de 38-kDa; y posteriormente se ajustó el volumen final de 
cada pozo a 1.5 mLlpozo con medio TCM, las células control (no estimuladas) 
solamente se ajustaron a 1.5 mL con el mismo medio. Finalmente, se dejaron 
incubar los cultivos celulares a 37° C en una atmósfera al 5 % de CO2 durante 
36 horas, transcurrido este tiempo de cada uno de los pozos se realizó la 
colección de 500 ¡.tI de sobrenadante que se fueron depositados en tubos 
cónicos de 1.5 mL los cuales fueron identificados y se conservaron a -70 oC. 
Finalmente, las células fueron cosechadas para llevar a cabo la extracción del 
RNA. 
5.6. Extracción de RNA de PBMCs adherentes. 
Mediante la técnica de TRlzol (Invitro gen No. Cat. 155996-026), se 
realizó la extracción de RNA a partir de los cultivos de PBMCs adherentes 
30 
descritos anteriormente. Para el primer paso, fue hacer el cosechado de las 
PBMCs adherentes que se realizó empleando un raspador de células (Nunc 
No. Cal. 179695), fue necesario dejar transcurrir 36 horas de incubación de los 
cultivos de PBMCs adherentes y posteriormente cada uno de los pozos fueron 
lavados con PBS pH 7.2 (500 ~I) tres veces, empleando el raspador para 
células con el objetivo obtener un mejor cosechado; el volumen de los tres 
lavados fueron colectados en tubos cónicos de 1.5 mL libres de RNasas 
(Rainin No. Cal. 3-HT15-N) y por medio de una centrifugación a 2,000 g 
durante 30 segundos se obtuvo el botón de células. 
Posteriormente se realizó la lisis celular agregando un 1 mL del reactivo 
de TRlzol (volumen recomendado para 1X107 células) y mezclando por pipeteo 
suavemente; las muestras fueron incubadas por 5 minutos a 23° C para 
permitir la lisis completa de las células, y enseguida se agregaron 200 ¡JI de de 
cloroformo isoamilico 24:1 grado biología molecular (Amresco NO.Cal. X205) y 
se agito fuertemente por 15 segundos dejándose incubar 23 oC durante 3 
minutos. Después se realizó una centrifugación a 11,600 g durante 15 minutos 
a una temperatura de 5° C. 
Como resultado de la centrifugación de la mezcla se observaron las 
siguientes fases; en la parte superior del tubo una fase acuosa (incolora), una 
interfase y una última fase fenal cloroformo (rojiza) en el fondo del tubo. A otro 
tubo libre de RNasa fue transferida la fase acuosa que es la que 
exclusivamente contiene el RNA recuperando un volumen aproximado de 600 
¡JI de esta fase acuosa que representa el 60% del volumen total de TRizol 
usado; a esta fase acuosa se le agregaron 500 ¡JI de alcohol isopropilico grado 
biología molecular (Sigma No. Cat. 19516) por cada mL de TRlzol empleado y 
se homogenizo de manera suave con la micropipeta, se incubaron las muestras 
por 10 minutos a una temperatura de 23 oC y se centrifugo a 11,600 g durante 
10 minutos a 5 oC, se observó un botón gelatinoso en cada muestra. El 
sobrenadante obtenido por cada tubo fue desechado y al botón se le agregó 1 
mL de etanol al 75% por mL de TRlzol empleado, agitándose suavemente por 
inversión aproximadamente 15 segundos; después se centrifugo a 11,600 g 
durante 5 minutos a 5 oC, se decanto el sobrenadante y la pastilla obtenida se 
31 
dejó secar a temperatura ambiente por 10 minutos. Y finalmente, se 
resuspendió la pastilla en 20 1-11 agua tratada con OEPC. 
5.7. Síntesis de cONA. 
La síntesis del cONA se hizo a partir del RNA extraído de las PBMC 
adherentes estimuladas y no estimuladas utilizando el kit de SuperScript III 
First Strand (Invitrogen No. Cat. 18080-51). Las reacciones para la síntesis se 
trabajaron en tubos de 0.2 mL (Sarstedt No. Cat 72.7). Se uso una 
concentración de RNA entre 10 pg - 5 I-Ig (recomendada en el kit) que se 
mezclo con 2 ¡..,tI del mix de dNTP y 1 1-11 de los iniciadores proporcionados en el 
kit y se ajusto a un volumen de 12 1-11 con agua tratada con DEPC. Esta primera 
mezcla fue incubada en el termociclador (Biometra, Tgradient) a 57 oC por 10 
minutos y después se coloco en hielo. 
A la par de la incubación anterior se preparó una segunda mezcla la cual 
contenía 4 ¡..,tI de buffer de síntesis cONA 5X, 1 ¡..,tI, OTT 0.1 M, 1 1-11 de RNase 
OUT (40 Ufl-ll), 1 1-11 agua tratada con OEPC, 1 1-11 Cloned AMV RT (15 Uf 1-11) 
para un volumen total de 8 1-11 (se preparó el volumen necesario para cubrir la 
demanda del número de tubos trabajados). Por lo tanto, un volumen de 8 ¡..,tI de 
esta segunda mezcla se ocupó para cada una de las muestras, que se agregó 
a cada uno de los tubos que contenían 12 ¡..,tI de la primera mezcla donde se 
encontraba el RNA, y de esta forma se obtuvo un volumen final de 20 1-11 para 
cada reacción. Posteriormente el vial de reacción se incubo en el temorciclador 
a una temperatura de 57° C durante 60 minutos. Por ultimolas muestras fueron 
almacenadas a 4 oC. 
32 
5.8. Técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa de 
Trapscriptasa Reversa (RT -peRlo 
La técnica de reacción en cadena de la polimerasa de transcriptasa 
reversa es una variante de la PCR tradicional. La RT-PCR emplea el RNA 
mensajero para realizar la síntesis de cONA. 
La reacción en cadena de la polilmerasa (PCR) es una técnica que 
permite amplificar o producir un gran número de copias de un fragmento de 
DNA o cONA especifico. 
Se trata de de un proceso cíclico que comprende los siguientes los 
pasos que se mencionan a continuación: Desnaturalización, complementación 
y síntesis de DNA o cONA como se aprecia en la Figura 5.1. Cada ciclo dura 
aproximadamente entre 3 a 5 minutos en el que para conseguir una cantidad 
útil de DNA se requieren de 35 a 40 ciclos (ver Figura 5.2.). 
Paso1: 
100 
/ Desnaturalización del DNA 
¡ , , .---
90 Paso3: 
Síntesis de DNA 
\ 80 
Temperatura (OC) 
70 
60 
50 \"02' Complementación de los "primers" 
40 ~n "Ciclo" I 
30 I 
O 2 10 12 14 16 
Minutos 
~-- ---------- -----------
Figura 5.1. Representación esquemática de de los paso que conforman la 
técnica de la peRo 
33 
1 ciclo = 2 Amplicones 
~"q~~;;<i~#t ~~ 
2 ciclos = 4 Amplicones 
q~"( :O~ ~~ ~~ 
3 ciclos = 8 Amplicones 
~.~~.~ 
5 ciclos = 32 Amplicones 
6 ciclos = 64 Amplicones 
7 ciclos 128 Amplicones 
~. 
Figura 5.2. Número de amplicones obtenidos en la PCR. 
La PCR se lleva a cabo en un aparato nombrado termociclador en el que 
se obtienen un clonaje rápido de fragmentos de DNA o cDNA. 
La técnica de la PCR se empleó para llevar a cabo la amplificación de 
fragmentos de cada uno de los genes que codifican para las siguientes 
citocinas bovinas: Interleucina-6 (IL-6), Interleucina-12 (IL-12), Factor de 
necrosis tumoral alfa (TNF-a) e Interferón gama (IFN-y) (Coussens el al., 
2004); y receptores tipo TolI bovinos, TLR-2 y TLR-4 (Menzies el aJ., 2006). Los 
iniciadores para 13-actina bovina se emplearon como control interno del sistema 
debido a que este gen es constitutivo en las células y se expresa tanto en 
células estimuladas como no estimuladas. Además el producto amplifica en un 
rango amplio de temperatura y de concentraciones de los componentes de la 
técnica. 
34 
En la Tabla 5.2. se enlistan los iniciadores utilizados en el presente 
estudio, indicando la clave, nombre, secuencia de los iniciadores y el tamaño 
del producto amplificado. 
Clave Iniciador Secuencia de Iniciador Producto 
~-Actina BB 
~-Actina TGCGGCATTCACGAAACTACC 313 pb 
Bovina AGAAGCATTTGCGGTGGACG 
IL-6 IL-6 TGCAGTCTTCAAACGAGTGG 378 pb ACATTCAAGCCACATAGCCA 
IL-12 IL-12 AACACGCCCCATTGTAGAAG 261 pb AAGCCAGGCAACTCTCATTC 
TNF-a TNF-a AGAAGACAGAGGCAGGTCCA 295 pb AGAATCCCTTCTCCCTCCAA 
IFN-y IFN-y AGCCAAATTGTCTCCTTCTACTTC 261 pb 
CTGACTTCTCTTCCGCTTTCTG 
TLR-2 TLR-2 GCTCCTGTGACTTCCTGTCC 504 pb 
CCGAAAGCACAAAGATGGTT 
TLR-4 TLR-4 
GCCCAGACAGCATTTCACTC 621 pb 
GCCACCCCAGGAATAAAGTC 
Tabla 5.2. Iniciadores empleados para la amplificación de citocinas y 
receptores tipo Tol! (2 y 4) de bovinos. 
5.8.1. Estandarización de la técnica de Reacción en Cadena de la 
Polimerasa (PCR) para citocinas y TLRs bovinos. 
El establecimiento de las condiciones óptimas de trabajo para la PCR 
incluyo la definición de la mejor concentración de MgCl2 que fue titulado a 
concentraciones finales por vial de 5 y 10 Mm para p-actina, para IL-6 las 
concentraciones que se manejaron fueron 2.5, 5 Y 10 Mm; mientras que para el 
TLR-2 se emplearon concentraciones de 3 y 5 mM. 
Las concentraciones finales de cada uno de los iniciadores de p-actina, 
IL-6 y TLR-2 por vial fueron 4X10-8 M; se inició la estandarización de la técnica 
35 
de PCR utilizando gDNA bovino como templete empleando concentraciones de 
DNA de 2 ~g por vial. 
Para la estandarización de la amplificación del fragmento del gen de ~­
actina se uso como templete gDNA humano y bovino en concentraciones de 2 
~g de cada uno de estos gDNA, así como, tres diferentes iniciadores W-actina 
H, ~-actina BA y ~-actina BB), el primer par de iniciadores estaba diseñado a 
partir de la secuencia del gen de ~-actina humana y los dos últimos iniciadores 
fueron diseñados a partir de la secuencia del gen de ~-actina bovina. En la 
Tabla 5.3. se muestran las secuencias de los iniciadores utilizados. 
Clave Iniciador Secuencia del iniciador Producto 
GGAAATCGTGCGTGACATTAAGG 
~-Actina H ~-Actina humana 
TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTACG 
274 pb 
GGAAATTCGTCCGTGACATCAAGG 
~-Actina AS ~-ActinaSovina-
CGTGTTGGCGTAGAGGTCCTTGCG 
274 pb 
TGCGGCATTCACGAAACTACC 
~-Actina SS ~-ActinaSovina 
AGAAGCATTTGCGGTGGACG 
313 pb 
Tabla 5.3. Iniciadores de ~-Actina empleados para la estandarización de la PCR. 
5.8.2. Condiciones de trabajo de la PCR. 
A continuación se mencionan las condiciones óptimas de trabajo 
establecidas para cada uno de los componentes de la PCR. Las 
concentraciones de los componentes para las reacciones de la PCR fueron: 
buffer de reacción fue de 1X (Invitrogen No. Cat. Y02028), de cloruro de 
magnesio MgCI2 fue de 5 Mm (Invitrogen No Cat. Y02016), la concentración de 
todos los iniciadores empleados fue de 4X10-8 M, la mezcla de dNTP's fue de 
0.5 Mm, es decir 125 ~M de cada uno de los dexoinucleótidos (dATP, dTTP, 
dCTP, y dGTP) (Invitrogen no Cat. 10297-018), y de la enzima Taq polimerasa 
fue de 2.5 unidades (Invitro gen No Cat. 18038-042); ver Tabla 5.4. el volumen 
final de la reacción fue de 50 ~I/vial. 
36 
A los tubos con la reacción se le realizó un precalentamiento a 95 oC 
durante 5 minutos antes de agregar Taq polimerasa para posteriormente llevar 
acabo los ciclos de la PCR en el termociclador; de acuerdo a los ciclos 
establecidos que se describen a continuación, las condiciones de la PCR 
fueron un precalentamiento inicial a 92 oC durante 5 minutos con 40 ciclos 
posteriores, donde cada uno de ellos consistió en una desnaturalización inicial 
a 92 oC durante 30 segundos, un alineamiento a 53 oC durante 30 segundos, 
una extensión a 72 oC durante 30 segundos y un último pasó de extensión final 
a 72° C durante 10 minutos. Finalmente, después de los ciclos de la PCR los 
tubos con las muestras fueron almacenados a 4 oC para después realizar la 
electroforesis. 
La PCR se realizó para cada muestra de cONA sintetizado a partir del 
mRNA extraído de células adherentes estimuladas (con cada uno de los 
antígenos) y no estimuladas. 
Componentes Volumen (!JI) Concentración final 
Buffer PCR stock (1 OX) 5 1X 
MgCI2 (50 mM) 5 5mM 
dNTP's (10 mM) 2.5 0.5 Mm 
Iniciador Sen ~-actina 10-5M 2 4X10-8 M 
Iniciador Anti ~-actina 10-5M 2 4X10-8 M 
Iniciador Citocina Sen 10-5M 2 4X10-8 M 
Iniciador Citocina Anti 10-5M 2 4X10-8 M 
Iniciador TLR Sen10-5M 2 4X10-8 M 
Iniciador TLR Anti 10-5M 2 4X10-8 M 
Taq Polimerasa 5U/1l1 0.4 2.5 U 
Agua estéril Cbp 50 
Cbp cuanto baste para. 
Tabla 5.4. Condiciones estándares de volúmenes y concentraciones de cada uno de 
los reactivos para lo iniciadores de las citocinas bovinas, TLRs y ~-actina bovina. 
37 
5.9. Electroforesis en geles de agarosa. 
Para confirmar la integridad del gDNA RNA Y cDNA. Así como de los 
productos amplificados de las citocinas y de los TLRs resultantes de la PCR se 
realizaron corrimientos electroforeticos de las muestras en geles de agarosa 
(Sigma No. Cat. A-9539) al 0.7% para gDNA, RNA Y cONA, y al 2% para los 
productos de la PCR (citocinas y receptores tipo TolI). 
El gel fue preparado empleando una solución de TBE (0.5X) 
disolviéndola por calor aproximadamente 1 minuto en el microondas. Después 
de disminuir la temperatura de la solución de agarosa a aproximadamente 37° 
C, a 50 mL de esta solución se le adiciono 1.5 \JI de una solución stock de 
bromuro de etidio preparada a 10 mg/mL, posteriormente la solución de 
agarosa se vertió en el molde de la cámara de electroforesis, colocándose 
finalmente el peine correspondiente. Una vez polimerizado el