Evaluacion-del-efecto-de-ciclosporina-y-tacrolimus-en-la-expresion-de-proteinuria-en-ratas-con-Sindrome-Nefrotico-Experimental

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FACULTAD DE MEDICINA 
 
DIVISIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO 
 
HOSPITAL INFANTIL DE MÉXICO FEDERICO GÓMEZ 
 
EVALUACIÓN DEL EFECTO DE CICLOSPORINA Y 
TACROLIMUS EN LA EXPRESIÓN DE PROTEINURIA EN 
RATAS CON SÍNDROME NEFRÓTICO EXPERIMENTAL 
 
T E S I S 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE LA ESPECIALIDAD EN: 
PEDIATRÍA 
P R E S E N T A : 
DRA. MARICELA LUNA SANDOVAL 
 
TUTOR DE TESIS 
DRA. MARA MEDEIROS DOMINGO 
 
COTUTORA DE TESIS 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
MÉXICO, D. F. FEBRERO 2009 
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TESIS 
EVALUACIÓN DEL EFECTO DE CICLOSPORINA Y TACROLIMUS EN LA 
EXPRESIÓN DE PROTEINURIA EN RATAS CON SÍNDROME NEFRÓTICO 
EXPERIMENTAL. 
 
 
 
------------------------------------------------------ 
Dr. José Ignacio Santos Preciado 
Director General 
 
 
--------------------------------------------------------------- 
Dra. Yolanda Rocío Peña Alonso 
Directora de Enseñanza y Desarrollo Académico 
 
 
------------------------------------------------- 
Dra Mara Medeiros Domingo 
 Asesora de tesis. 
 
 
 ---------------------------------------------- 
Biol: Ana María Hernández Sánchez 
Cotutor de tesis 
 
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AGRADECIMIENTOS 
 
A Dios por darme la vida y la oportunidad de estar en esta gran institución, y 
contribuir con un granito de arena y poder ayudar a esas personitas que tanto nos 
necesitan. 
A mi Padre que en gran parte es la fuerza que me mantiene al pie de mi objetivo y 
aunque físicamente ya no esta conmigo, se que me apoya y cuida de mi. 
A mi madre linda y querida, que no cuestiona mis decisiones y simplemente me 
apoya y esta ahí para darme ánimos y dejarme ser. 
A mis hermanos Lupi, Ani, Tere, Toni y Pepe gracias por todo el cariño y apoyo 
incondicional que siempre me brindan, y se que siempre puedo contar con 
ustedes. 
A mis sobrinos gracias por existir y ser mi primer estímulo en este largo pero 
hermoso camino. 
A ti por ser parte de mi vida, por hacer cada momento maravilloso e inolvidable, 
por tu apoyo, por no dejarme caer en momentos de flaqueza y por amarme tanto. 
A mis suegros también gracias por todo el cariño y apoyo brindado, y por estar 
siempre al pendiente de mi desarrollo profesional. 
 Dra. Mara, muy en especial a usted, mil gracias por aceptar ser mi asesora en 
este proyecto, por su paciencia, apoyo y enseñanza, en verdad la admiro mucho, 
y es el mejor ejemplo a seguir. 
Anita también gracias por todo el apoyo en la realización de este trabajo, pues sin 
ti, simplemente no lo hubiese logrado. 
A todos simplemente gracias. 
Maricela. 
 
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ÍNDICE 
 
 
1. Introducción y Marco teórico .……………………………………………………... 1 
2. Planteamiento del problema ……………….. ……………………………........... 10 
3. Justificación …….…………………………………………………………………… 11 
4. Objetivos ……. ……………………………………………………………………… 11 
5. Hipótesis …….…….. ……………………………………………………………… 11 
6. Variables …………………………………………………………………………… 12 
7. Descripción de variables …………………………………………………. ……… 12 
8. Diseño Metodológico .………………….. ………………………………………… 13 
9. Consideraciones éticas …………………………………………………………… 16 
10. Análisis estadístico ……………………………………………………………… 17 
11. Resultados …………………………………………………………………….…. 18 
12. Discusión …..…………………………………………………………………….. 22 
13. Conclusiones ……………………………………………………………………... 23 
14. Referencias …..…………………………………………………………………… 24 
 15. Anexos………………………………………………………............................. 27 
 
 
 
 
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1. INTRODUCCIÓN Y MARCO TEÓRICO 
 
Síndrome nefrótico 
 
 
El síndrome nefrótico (SN), es un estado clínico caracterizado, por proteinuria 
masiva, (>40mg/m2sc/h ó relación proteina/Cr >2.0), hipoalbuminemia (<25 g/l), 
hiperlipidemia (colesterol > 200mg y triglicéridos > 200mg) y edema. El edema es 
el resultado del desbalance entre la presión hidrostática y la presión osmótica 
coloidal en los compartimentos intravascular y extracelular. Con la albúmina sérica 
por debajo de 20 g/l, los mecanismos compensatorios se alteran, tales como la 
activación del eje renina-angiotensina-aldosterona, con incremento de 
reabsorción tubular de sodio, ocasionando aumento en la formación de edema 
(1). El síndrome nefrótico, puede ser primario o secundario, el primero se a 
relacionado a alteraciones genéticas, y el segundo debido a infecciones, drogas, 
alérgenos, venenos, inmunizaciones, enfermedades sistémicas, metabólicas, 
hereditarias y neoplasias (2). 
 
En el síndrome nefrótico idiopático el 80% de los niños responden al tratamiento 
con esteroides, denominándose corticosensibles, siendo la lesión histológica más 
frecuente la de cambios glomerulares mínimos en un 80%, con fusión de los 
podocitos al ser observados en la microscopía electrónica (ME), sin depósitos en 
la inmunofluorescencia. Mientras que entre el 5 - 10% de los niños con SN no 
responden al tratamiento con esteroides por lo que se les denomina 
corticorresistentes, y la principal lesión histopatológicas encontrada es la 
glomeruloesclerosis focal y segmentaria en 75% de los casos (3), estos 
pacientes pueden presentar complicaciones extrarrenales del Síndrome Nefrótico, 
además del riesgo de desarrollar Insuficiencia Renal Crónica Terminal (IRCT). 
Otras alteraciones histopatológicas que podemos encontrar en el síndrome 
nefrótico se describen en el siguiente cuadro con sus respectivos porcentajes de 
presentación: 
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Cuadro I. Hallazgos histopatológicos en el Síndrome Nefrótico idiopático. 
 
Tipo de lesión Glomerular Porcentajes % 
Lesiones Glomerulares Mínimas 77 
Glomeruloesclerosis Focal y Segmentaria 10 
Glomerulonefritis Membrano proliferativa 5 
Proliferación Mesangial Difusa 3 
Glomerulonefritis Endo y Extracapilar Focal o Difusa 3 
Glomerulonefritis Membranosa 2 
 
Las enfermedades que causan el síndrome nefrótico pueden ser divididas en tres 
categorías: 
1.- Enfermedades donde el mecanismo del daño es mediado por anticuerpos 
como ejemplo, (Lupus, Glomerulonefritis membranoproliferativa, y nefropatía 
membranosa) 
2.- Enfermedades que están asociadas con desordenes metabólicos, y como 
ejemplo (Diabetes, Amiloidosis, y enfermedad de Fabry) 
3.- Enfermedades que son causadas por la función anormal celular glomerular. 
En la actualidad se sugiere que prácticamente en todos los casos de esta última 
categoría inician con el daño o disfunción del podocito. Por esta razón estas 
enfermedades han sido clasificadas como Podocitopatías (4), Siendo la 
característica principal la proteinuria. 
La proteinuria supone una falla de la barrera de filtración glomerular, esta barrera 
limita el paso de macromoléculas fundamentalmente en función del tamaño (5). 
 
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Esta barrera de filtración glomerular esta compuesta por tres capas: 
 1 - El endotelio fenestrado. 
 2.- La membrana basal glomerular (MBG). 
 3.- La hendidura del diafragma que es la zona que queda entre los procesos 
pedicelares de los podocitos. 
 
El endotelio es donde se encuentranlos poros o fenestraciones, que permiten la 
separación mecánica de los elementos de la sangre y el plasma, estos poros 
miden aproximadamente de 70 a 100 nm. de diámetro. La superficie de la célula 
endotelial esta cargada negativamente por la presencia de una glucoproteina 
polianiónica, la podocalixina (PCX), que es la principal proteína glomerular. 
 
La membrana basal glomerular se compone de dos capas finas, la lámina rara 
interna y la lámina rara externa y una capa central gruesa llamada lámina densa. 
 
Las células endoteliales y epiteliales adyacentes secretan moléculas tales como 
colágeno tipo IV, laminina, fibronectina, nidogen y proteoglicanos de heptarán 
sulfato que forman una estructura, semejante a un enrejado donde hay sitios 
aniónicos los glucosaminoglicanos de heptarán sulfato en las tres capas que 
componen la MBG si alguno de ellos se altera hay un incremento de la 
permeabilidad de la membrana basal glomerular (5). 
 
El tercer elemento de la barrera de filtración glomerular lo constituyen las células 
epiteliales viscerales o podocitos estas se derivan del mesénquima, son células 
altamente diferenciadas debido a la inactividad del ciclo celular dada por la 
regulación de los inhibidores de las ciclinkinasas durante la glomerulogénesis (6), 
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por lo que se dice que existe un número de podocitos inicial, que se pierden en 
forma progresiva e irreversible en el transcurso de la lesión glomerular. Sus 
funciones principales son las siguientes: 
 
1.- Crear una barrera de tamaño para proteínas. 
2.- Crear una barrera de carga. 
3.- Mantenimiento de la forma del asa glomerular. 
4.- Contrarrestar la presión intraglomerular. 
5.- Síntesis y mantenimiento de la MBG. 
6.- Productor del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). 
 
La superficie del podocito puede ser dividida en tres dominios con diferentes 
localizaciones, componentes proteicos y funcionales (6). En cada dominio existen 
proteínas que son fundamentales para el mantenimiento y la integridad del mismo, 
y para la estabilidad global de la arquitectura del podocito (7). 
 
Dominios proteícos de los podocitos. 
 
Dominio apical o Proteínas estructurales: este corresponde a las proteínas del 
vértice superior del podocito estas proteínas son, la podocalixina, ezrina, complejo 
NHERF-2 
Dominio del diafragma de filtración o Proteínas de la barrera de filtración: la 
principal responsable de la propiedad de selectividad del diafragma es la nefrina. A 
este nivel también encontramos la P-cadherina, neph-1, podocina, CD2AP, ZO-1, 
filtrina. 
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Dominio basal de anclaje o Proteínas de anclaje: es el encargado de fijar al 
pedicelo a la membrana basal glomerular, encontramos al distroglicano, el 
complejo integrina αβ, y la megalina (7, 8). Se ha comprobado que el defecto de 
alguna de estas proteínas es causa de proteinuria en humanos y/o animales de 
experimentación (5). 
 
La proteinuria es un factor de riesgo para la progresión de la insuficiencia renal y 
para mortalidad cardiovascular, en la actualidad disponemos de fármacos 
capaces de disminuir la proteinuria como los inhibidores de la enzima 
convertidora de la angiotensina (IECA), antagonistas de receptores de 
angiotensina II (ARA II), esteroides e inhibidores de calcineurina como la 
ciclosporina (CsA) y tacrolimus (FK). Sin embargo no se conoce claramente la 
patogenia de la proteinuria y sobre el mecanismo de acción de estos fármacos (5). 
 
Figura 1. Estructura del podocito y del diafragma de filtración 
TACROLIMUS Y CICLOSPORINA EN SÍNDROME NEFRÓTICO. 
 
 
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La ciclosporina y tacrolimus ejercen sus propiedades inmunosupresoras en 
caminos similares de transducción intracelular al ser ambos inhibidores de 
calcineurina. 
 
La ciclosporina produce una inhibición reversible de la activación linfocitaria 
específica de los linfocitos T. En la superficie del linfocito la CsA se une a un 
receptor de membrana y penetra en la célula; es transportada al citoplasma donde 
se une a la ciclofilina posteriormente este complejo se une a la calcineurina e 
inhibe la actividad de la fosfatasa de calcineurina, para luego penetrar a 
continuación en el núcleo donde altera la transcripción del RNA mensajero 
codificado para linfocinas. Así, inhibe específicamente la producción de IL-2 y 
disminuye la respuesta del linfocito precitotóxico a la IL-1. Por este mecanismo, 
disminuye la proliferación de los linfocitos T activados por la IL-2 y suprime la 
proliferación de linfocitos T citotóxicos; también bloquea la producción del factor 
inhibitorio de migración de los macrófagos, del interferón y del factor de 
crecimiento de las células B (9). 
 
El tacrolimus (FK506), al igual que la ciclosporina, se une a inmunofilinas 
citoplasmáticas pero en vez de unirse a la ciclofilina, se une a la fugifilina también 
conocida como FKBP12 (FK biniding protein 12) El complejo tacrolimus-fugifilina 
se une a los complejos calcineurina/calmodulina y bloquea su actividad como 
fosfatasa, de esta manera evita la desfosforilación y translocación del factor 
nuclear de activación de linfocitos, con lo que impide la transcripción del gen de 
interleucina IL 2, IL 3, IL 4, IL 5, factor estimulante de granulocitos, factor de 
necrosis tumoral alfa e interferón gama; el efecto final es una inhibición en la 
activación y proliferación de células T citotóxicas. También puede alterar la función 
de la célula epitelial renal tubular, ya que el neurotransmisor en los nervios 
simpáticos renales, norepinefrina, regula la actividad de la Na+, K+ - ATPasa en el 
túbulo proximal en una manera bidireccional que estimula adrenorreceptores alfa y 
beta que es mediada por la calcineurina. 
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La ciclosporina A (CsA) ha demostrado ser útil en el manejo del síndrome nefrótico 
idiopático tanto de primera intención como en los casos de corticorresistencia, 
corticodependencia y recaídas frecuentes y el porcentaje de remisión se informa 
de 36-87%, según la serie (10) También la CsA es capaz de disminuir la 
proteinuria en ratas nefróticas, aún cuando en el modelo animal el síndrome 
nefrótico se debe al efecto tóxico de un fármaco y no a un trastorno inmunológico 
como puede suceder en la práctica clínica, de esta manera hay dos acciones de la 
CsA en el síndrome nefrótico, la primera es la acción inmunológica, 
presumiblemente dirigida al factor de permeabilidad glomerular secretado por 
linfocitos T, la segunda acción no es inmunológica y se debe tanto a una 
disminución en la velocidad de filtración glomerular como a la disminución de la 
permeabilidad a la albúmina por la pared capilar glomerular (11-14). En el caso 
específico del modelo nefrótico por ANP se ha postulado que la CsA tiene efecto 
benéfico al aumentar la expresión de enzimas antioxidantes(15). En contraste con 
la ciclosporina, el tratamiento de síndrome nefrótico con tacrolimus ha sido 
reportado en pocos casos con buenos resultados aún en pacientes que no habían 
respondido a ciclosporina, también se han documentado casos por diversos 
grupos de trasplante en donde pacientes con proteinuria masiva mejoran al ser 
convertidos de ciclosporina a tacrolimus (16-20). 
 
 En un estudio realizado para valorar la biodisponibilidad de la ciclosporina en 
ratas con síndrome nefrótico experimental observamos que el síndrome nefrótico 
incrementa la biodisponibilidad de CsA en 40% comparado con el grupo control 
debido a disminución en la distribución y en la eliminación del fármaco. El aumento 
en el área bajo la curva de concentración plasmática vs. Tiempo se relacionó con 
los niveles de colesterol, ya que la ciclosporina es un fármaco altamente lipofilico 
(21). 
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SÍNDROME NEFRÓTICO EXPERIMENTAL 
 
Existen diferentes modelos animales de síndromenefrótico utilizando nucleótidos 
como aminonucleósido de puromicina (ANP) o adriamicina la secuencia de 
eventos clínicos e histopatológicos se han caracterizado detalladamente (22, 23), 
en el caso del ANP en ratas se emplea una dosis única subcutánea de 150 mg/Kg 
diluida al 2% en solución salina isotónica, la evolución en el tiempo se ha descrito 
de la siguiente manera: las ratas desarrollan proteinuria en los días 4 a 30 y 
presentan hipoproteinemia en los días 4 a 16, que se considera la etapa nefrótica, 
posteriormente la proteinuria va desapareciendo después del día 30, también hay 
incremento en los lípidos séricos incluyendo colesterol, triglicéridos, lipoproteínas 
de alta y de baja densidad durante la etapa nefrótica (22, 24). 
 
Se sabe que existe cambio en la expresión de las proteínas del diafragma 
glomerular en el síndrome nefrótico experimental. El RNAm de nefrina disminuye 
desde las dos horas después de la administración de ANP. En el día 1 hay cambio 
en el patrón de localización de la podocina de linear a granular. La cantidad de 
nefrina y podocina disminuyen significativamente en la etapa nefrótica (25). 
 
Nakoul y colaboradores reportaron que en animales con síndrome nefrótico 
inducido por adriamicina hay diminución de nefrina en el tejido renal y que el 
tratamiento con enalapril y mofetilmicofenolato reducen la proteinuria y aumentan 
la expresión de nefrina en estos animales. 
 
Los cambios morfológicos en nefrosis por aminonucleósido de puromicina incluye 
pronunciada ineficacia y fusión de procesos pedicelos, lo cual es consistente con 
las características morfológicas del síndrome nefrótico tipo Filandés (1). 
Después de la administración de ANP se observa que antes de iniciar la 
proteinuria hay cambios en la distribución de nefrina y podocina; la podocina 
disminuyó y los procesos pedicelos se hincharon. Los cambios cuantitativos en 
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podocina fueron más tempranos que nefrina (podocina al segundo día, mientras 
que nefrina al quinto día) (26). 
 
La Hsp27 es una proteína de bajo peso molecular identificada en los podocitos, 
Smoyer y Ransom encontraron que esta proteína es capaz de regular 
morfológicamente la actina del citoesqueleto ante la repuesta de los podocitos al 
daño inducido por PAN. En la nefrosis por aminonucleósido de puromicina en 
ratas, parece ser que la α-actinina-4 es una proteína blanco para toxicidad por 
PAN (27). 
 
Se ha observado una redistribución de nefrina, podocina, CD2AP y α actinina-4 
en pacientes con síndrome nefrótico con mutaciones en el gen NPHS2 y en ratas 
nefroticas con aminonucleósido de puromicina (28) 
 
En ratas también se ha observado cambios relacionados con borramiento de los 
pedicelos ocurre en minutos ante la infusión intrarrenal de sulfato de protamina, y 
la morfología normal del podocito puede ser restaurada en minutos ante la infusión 
de heparán sulfato (26). 
 
 
 
 
 
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2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 
   
El síndrome nefrótico es una entidad frecuente en niños, reportándose en el 
hospital infantil de México 35-40 casos nuevos anualmente, representando 26% 
de las admisiones al departamento de nefrología. 
 
Para su tratamiento se han propuesto diferentes líneas de tratamiento, como 
primera opción se han utilizado esteroides del tipo de la prednisona, con la cual 
observamos disminución de la proteinuria a partir de las 4-6 semanas de 
tratamiento, pero un grupo reducido de pacientes no responden a tratamiento 
esteroideo, y es necesario buscar otras alternativas terapéuticas como son los 
inhibidores de calcineurina, ciclosporina y tacrolimus, Diversos estudios confirman 
que estos fármacos disminuyen de forma importante la proteinuria, aunque se 
desconoce la acción especifica ejercida en el diafragma de filtración, La 
ciclosporina A (CsA) ha demostrado ser útil en el manejo del síndrome nefrótico 
idiopático tanto de primera intención como en los casos de corticorresistencia, 
corticodependencia y recaídas frecuentes. En contraste con la ciclosporina, el 
tratamiento de síndrome nefrótico con tacrolimus ha sido reportado en pocos 
casos con buenos resultados aún en pacientes que no habían respondido a 
ciclosporina. Una de las preocupaciones del uso de estos fármacos es que pueden 
ocasionar nefrotoxicidad. 
 
 
 
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3. JUSTIFICACIÓN 
 
La ciclosporina, un inhibidor de calcineurina menos potente que el tacrolimus, es 
capaz de disminuir la proteinuria tanto en pacientes como en modelos animales de 
síndrome nefrótico. Existen reportes clínicos que sugieren que el tacrolimus 
puede ser de utilidad en el manejo de los pacientes con síndrome nefrótico. 
 
No se conoce el efecto del tacrolimus sobre ratas con síndrome nefrótico 
experimental. 
 
 
4. OBJETIVOS 
 
 OBJETIVO GENERAL 
Evaluar el efecto de tacrolimus y ciclosporina sobre la proteinuria de ratas con 
síndrome nefrótico experimental. 
 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: 
-Evaluar los valores de albúmina sérica en ratas con síndrome nefrótico 
experimental. 
-Evaluar los valores de colesterol sérico en ratas con síndrome nefrótico 
experimental.. 
-Evaluar los valores de triglicéridos séricos en ratas con síndrome nefrótico 
experimental. 
 
 
5. HIPÓTESIS 
La administración de los inhibidores de calcineurina tacrolimus y ciclosporina 
reducen la proteinuria en ratas con síndrome nefrótico experimental. 
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6. VARIABLES 
 6.1 Variables independientes: 
-Tacrolimus 
-Ciclosporina 
 6.2 Variables dependientes: 
-Proteinuria 
-Colesterol 
-Triglicéridos 
-Albúmina 
 
 
7. DESCRIPCIÓN DE VARIABLES 
Tacrolimus: Medicamento inhibidor de calcineurina, variable cualitativa expresada 
en mg. 
Ciclosporina: Medicamento inhibidor de calcineurina, variable cualitativa 
expresada en mg. 
Proteinuria: Cantidad de proteínas filtradas por el riñón, mayor de 40mgm2schra, 
Variable cuantitativa, expresada en mg/dL. 
Colesterol: Variable cuantitativa, expresada en mg/dL. 
Triglicéridos: Variable cuantitativa expresada en mg/dL 
Albúmina: Variable cuantitativa expresada en g/dL. 
 
 
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8. DISEÑO METODOLÓGICO. 
 
Se realizó un estudio experimental, prospectivo y comparativo, con seis grupos de 
ratas, Wistar macho, de 10-12 semanas de edad, las que se colocaron en jaulas 
metabólicas para recolección de orina de 24 horas, con acceso libre al agua y 
alimentos, y ciclos de luz/obscuridad de 12 horas. 
 
Se formaron seis grupos de la siguiente manera: 
 
Grupo I.- Nueve ratas a quienes se les inyectó ANP 150 mg/kg vía subcutánea, 
diluido al 2% en solución salina isotónica, dosis única. Cuatro días después de la 
inyección de ANP se les administró tacrolimus 0.3mg/kg/día vía oral diluido en 
0.3ml de aceite de maíz durante diez días. 
 
Grupo II.- Nueve ratas a quienes se les inyectó ANP 150 mg/kg vía subcutánea, 
diluido al 2% en solución salina isotónica, dosis única. Cuatro días después de le 
inyección de ANP recibieron ciclosporina en microemulsión 20 mg/kg/día, diluida 
en 0.3ml de aceite de maíz durante diez días. 
 
Grupo III.- Nueve ratas a quienes se les inyectó ANP 150 mg/kg vía subcutánea, 
diluido al 2% en solución salina isotónica, dosis única. Cuatro días después de la 
inyección de ANP recibieron 0.3ml de aceite de maíz durante diez días. 
 
Grupo IV. Nueve ratas testigo "puro" a las que se les administró 0.3ml de 
solución fisiológica salina isotónica vía subcutánea sin ANP y 0.3 ml de aceite de 
maíz vía oral durante 10 días. 
 
Grupo V: Seis ratas testigos a quienes se les administró tacrolimus 0.3mg/kg/día 
vía oral diluido en 0.3ml de aceite de maíz durante diez días. 
 
Grupo VI: Seis ratas testigos a las que se le administró ciclosporina en 
microemulsión 20 mg/kg/día, diluida en 0.3ml de aceite de maíz durante diez días,como se indica en el siguiente cuadro: 
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Cuadro II. Grupos de tratamiento 
 
 
Vía subcutánea/ Día 1 Vía oral/ Día 6-14 GRUPOS 
Sol. 
Fisiológica 
ANP-sol. 
fisiológica 
Aceite 
de maíz 
CsA dil. Aceite 
de maíz 
FK dil. Aceite 
de maíz 
SN+ FK - 150mg/kg - - 0.3mg/kg/día 
SN+ CsA - 150mg/kg - 20mg/kg/día - 
Control SN - 150mg/kg 100µL - - 
Control puro 1.5ml - 100µL - - 
Control+ FK 1.5ml - - - 0.3mg/kg/día 
Control+CsA 1.5ml - - 20mg/kg/día - 
 
 
 
 LUGAR DE ESTUDIO 
 
El estudio se realizó en el Hospital Infantil de México Federico Gómez, con apoyo 
para el procesamiento de las muestras del laboratorio de investigación de 
Nefrología, laboratorio central y servicio de patología. Las jaulas metabólicas y las 
ratas se mantuvieron en el bioterio de la UNAM, ubicado en el Hospital General 
de México. 
 
 
 POBLACIÓN DE ESTUDIO 
Se incluyeron48 ratas, Wistar machos, entre 10-12 semanas de edad, con peso 
entre 180-230g, con acceso libre al agua y alimento, ciclos de luz/obscuridad de 
12horas. 
 
 
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 METODOLOGÍA 
 
En todos los grupos se cuantificó proteinuria de 24 horas durante 14 días, las 
muestras se trasladaron al laboratorio de nefrología para su lectura y 
procesamiento. En el día 14 se sacrificaron los animales, previa sedación con 
éter, y se realizó toma de muestra sanguínea por punción cardiaca directa, para la 
determinación de colesterol, triglicéridos, albumina, las cuales se procesaron en el 
laboratorio central del Hospital Infantil de México, posterior a la extracción 
sanguínea, los animales ya no despertaron. 
 
 
 
Método cuantitativo de proteinuria por el método del Ácido Sulfosalicílico. 
Fundamento: 
La proteína es precipitada por el ácido Sulfosalicílico; este precipitado desarrolla 
una turbidez homogénea, la cual es comparada colorimétricamente con la 
producida por cantidades conocidas de albúmina en una curva estándar. 
 
Reactivos: 
1) Ácido Sulfosalicílico (ASS) al 3%. Se disuelven 30g de ASS en cantidad 
suficiente y aforar a 1000 ml de agua destilada. 
2) Solución salina isotónica. 
 
Material: 
1) Tubos de vidrio de 150 x 15 mm. 
2) Celdillas para leer en Coleman Jr. 
3) Fotocolorímetro Coleman Jr. 
4) Pipetas de vidrio y automáticas de dos pasos 
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Procedimiento: 
1) A 4.0 ml de orina agregar 6.0 ml de ASS al 3 %. Mezclar bien. 
2) Preparar un testigo, usando 4.0 ml. de orina y 6.0 ml. de solución salina. 
3) Leer después de 5 minutos a 660 nm en fotocolorímetro Coleman Jr, llevando 
al testigo al 100% de transmitancia. 
 
Curva de calibración: 
1) Determinar el contenido de proteínas de una solución conocida (suero humano, 
 Albúmina Armour). 
2) Preparar estándares de 10 a 100 mg/dl. por disolución con solución salina. 
3) Hacer una gráfica comparando porciento de transmitancia versus 
concentración. 
 
La determinación de colesterol, Triglicéridos, albúmina. Se realizó en el laboratorio 
central con el analizador Dimesion X/PAND (DADE BEHRING), que realiza 
método colorimétrico de punto final. 
 
9. CONSIDERACIONES ÉTICAS 
Los animales fueron tratados conforme las guías institucionales del cuidado y uso 
de animales de laboratorio (Ley General de Salud). 
Los animales se anestesiaron con éter antes de sacrificarlos. 
El personal que participó en este proyecto, cuenta con el adiestramiento necesario 
para el manejo de muestras biológicas, así como de tejidos. 
Neevia docConverter 5.1
  17
Las muestras de orina, sangre y tejidos fueron procesadas en laboratorio de 
nefrología, laboratorio central y patología y posteriormente colocadas y 
descartadas en los contenedores de RPBI destinados a este fin. 
Todo el material desechable utilizado fue depositado en bolsas especiales de 
residuos peligrosos sólidos-biológico-infeccioso, el cual fue depositado en un 
contenedor especial para este propósito, posteriormente personal de RPBI se 
encargó de su tratamiento para su destino final. 
 
 
10. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 
 Se recolectaron los datos en hojas previamente diseñadas, y luego se pasan a 
hojas del programa de Microsoft Excel. 
Análisis con software Graph Pad version 4.0 
Estadística descriptiva (promedio ± DS) de proteinuria, albúmina sérica, colesterol, 
triglicéridos. 
Comparación por ANOVA. Post test Prueba de Comparaciones múltiples de 
Tukey’s. 
 
 
Neevia docConverter 5.1
  18
11. RESULTADOS 
 
De las 48 ratas incluidas en el estudio, se eliminaron cuatro, una del grupo 
control de síndrome nefrótico, una del grupo síndrome nefrótico con 
ciclosporina y dos del grupo síndrome nefrótico con tacrolimus, por 
fallecimiento durante el estudio, el estudio post-mortmen demostró que 
cursaban con septicemia, frecuente en los estados nefróticos. 
 
Todos los animales tratados con PAN presentaron proteinuria nefrótica desde 
el 4º. día posterior a su aplicación, tal y como se reporta en la literatura. 
 
En el grafico 1 se ve la evolución temporal de la proteinuria en los diferentes 
grupos. Los animales control (no nefróticos se muestran el grafico 1A, los 
animales nefróticos en el 1B y todos en el 1C). Puede observarse que los 
animales nefróticos (PAN solo o PAN+ inhibidor de calcineurina) tuvieron 
proteinuria masiva desde el cuarto día hasta el termino del estudio. 
 
No observamos diferencia significativa al comparar la proteinuria del grupo 
control nefrótico, contra grupos nefróticos con medicamentos: Sin embargo los 
inhibidores de calcineurina disminuyeron en forma significativa la proteinuria en 
los grupos no nefróticos. Control puro vs grupo control con CsA (p<0.03), grupo 
control puro vs grupo control con FK (P<0.01). Grafica 1A. 
Neevia docConverter 5.1
  19
 Gráfico 1. Proteinuria en los diferentes grupos: 1 A control puro, control CsA, 
control FK, 1 B Nefrotico puro, Nefrotico + CsA, Nefròtico + FK, 1 C Todos los 
grupos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
CONTROL
CSA
FK
Dias
Pr
ot
ei
nu
ri
a 
(m
g/
m
2 s
c/
h)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314
0
25
50
75
100
NEFROTICO
N+CSA
N+FK
Dias
Pr
ot
ei
nu
ri
a 
(m
g/
m
2 s
c/
h)
2 4 6 8 10 12 14
0
25
50
75
100
CONTROL
NEFROTICO
CSA
FK
N+CSA
N+FK
DIAS
Pr
ot
ei
nu
ri
a 
(m
g/
m
2/
h)
Neevia docConverter 5.1
  20
En el Cuadro 3 se muestran los parámetros bioquímicos de colesterol, 
triglicéridos, albúmina y colesterol en los diferentes grupos estudiados. Los grupos 
nefróticos elevaron en forma significativa la cifra de triglicéridos en sangre, 
también es notoria la elevación de triglicéridos en animales control tratados con 
CsA. (Gráfico 2) 
 
Gráfico 2. Comparación de triglicéridos en los diferentes grupos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 P<0.05. Prueba de comparaciones Tukey’s. 
 
El colesterol también aumento en forma significativa en los animales nefróticos, 
siendo mayor en el grupo tratado con CsA. (Grafico 3). 
 
Grafico 3. Comparación de colesterol sérico en los diferentes grupos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 P< 0.001. Prueba de comparaciones Tukey’s 
0
100
200
300
400
FK
Nefrotica
Nefrotica + CsA
Nefrotica + FK
Control
CsA
C
ol
es
te
ro
l t
ot
al
 (m
g/
dL
)
0
250
500
750
1000
1250
Control
CSA TG
FK TG
N TG
NCSA TG
NFK TG
Tr
ig
lic
er
id
os
 (m
g/
dL
)
Neevia docConverter 5.1
  21
Con respecto a la albúmina sérica, observamos disminución significativa en los 
grupos nefróticos. 
 
Grafico 4. Albúmina en los diferentes grupos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 P>0.05. Prueba de comparaciones Tukey’s 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
0.0
0.5
1.0
1.5
Control
CsA
Nefroticas
Nefroticas+CsA
Nefroticas + FK
FK
A
lb
um
in
a 
(m
g/
dL
)
Neevia docConverter 5.1
  22
12. DISCUSIÓNObservamos que a la administración de ciclosporina y tacrolimus no resultó en 
disminución significativa de la proteinuria en los animales con síndrome nefrótico 
experimental, en el modelo de adriamicina se ha reportado que la CsA es capaz 
de disminuir la proteinuria en ratas nefróticas, aún cuando en el modelo animal el 
síndrome nefrótico se debe al efecto tóxico de un fármaco y no a un trastorno 
inmunológico como puede suceder en la práctica clínica (13-15). 
 
Sin embargo llama la atención que tanto CsA como Tacrolimus disminuyeron la 
proteinuria de animales control, si bien permanece dentro de valores considerados 
normales la diferencia es estadísticamente significativa. 
 
La administración de ciclosporina ocasiono un incremento en los triglicéridos tanto 
en animales no nefróticos como en animales nefróticos. 
 
Este a pendiente el estudio histopatológicos con inmunohistoquímica para nefrina 
y podocina, para determinar el efecto de los inhibidores de calcineurina sobre 
estas proteínas 
 
 
 
 
 
Neevia docConverter 5.1
  23
13. CONCLUSIONES 
 
El uso de ciclosporina en síndrome nefrótico no redujo la proteinuria y si 
incremento significativamente los niveles de triglicéridos y colesterol, en 
comparación con todos los grupos. El tacrolimus no redujo la proteinuria en ratas 
nefróticas y no incrementó los niveles de colesterol y triglicéridos esto comparado 
con el grupo control de síndrome nefrótico. El tacrolimus y la ciclosporina 
incrementan los niveles de albúmina en animales con síndrome nefrótico. Los dos 
inhibidores de calcineurina disminuyeron en forma significativa la proteinuria en 
animales no nefróticos. 
 
 
 
 
 
Neevia docConverter 5.1
  24
14. REFERENCIAS 
 
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12. Medeiros M, Perez-Urizar J, Mejia-Gaviria N, Ramirez-Lopez E, Castaneda-
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Neevia docConverter 5.1
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13. Sharma R, Sharma M, Ge X, McCarthy ET, Savin VJ. Cyclosporine protects 
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Antiproteinuric effect of ciclosporin A in adriamycin nephropathy in rats. Nephron 
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of antioxidant enzyme suppression and proteinuria in cyclosporin-treated 
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aminonucleoside in rats. III. Effect of captopril, an angiotensin converting enzyme 
inhibitor, on proteinuria and sodium retention. Rev Invest Clin 1990;42(3):210-6. 
 
Neevia docConverter 5.1
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Nephrin and podocin expression around the onset of puromycin aminonucleoside 
nephrosis. J Pharmacol Sci 2005;97(2):234-41. 
 
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puromycin aminonucleoside nephrosis rats. Pathol Int 2004;54(9):703-11. 
 
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Kidney Int 2006;69(7):1207-15. 
 
 
 
 
 
 
Neevia docConverter 5.1
  27
15. ANEXOS 
 
 Cuadro 3. Variables bioquímicas estudiadas en los diferentes grupos. Los datos 
están expresados como Promedio ± Error estándar. 
Grupo. Colesterol 
mg/dL 
Triglicéridos 
mg/dL 
Albúmina 
mg/dL 
Proteinuria 
mg/m
2
SC/dia 
Control sano 64.1 ±4.3 60± 11.4 1.25±0.04 2.5 ± 0.4 
Control 
nefrótico 
253 ± 18.9 418 ± 115 0.23 ± 0.04 57.2 ± 12 
Control CsA 65.3 ± 3.88 154.6 ± 84.2 1.36 ± 0.06 0.24 ± 0.17 
Control FK 58.7 ± 2.88 33.6 ± 3.07 1.4 ± 0.05 0.5 ± 0.18 
Nefrótico CsA 355±42 1025±286 0.20±0.07 61.16 ± 12 
Nefrótico FK 266 ± 15.9 412 ± 38.3 0.33 ± 0.08 55.3 ± 10 
 
 
 
Cuadro 4. Valor de p en la comparación de la proteínuria entre los diferentes 
grupos mediante t de Student. 
Grupos 
 
Valor de P 
Control puro vs 
Control CsA 
<0.005 
Control puro vs 
Control FK 
<0.01 
SN vs SN + 
CsA 
>0.05 
SN vs SN + 
FK 
>0.05 
SN + CsA vs 
SN +FK 
>0.05 
 
 
 
Neevia docConverter 5.1
  28
Cuadro 5. Valor de p en la comparaciónde triglicéridos séricos entre los 
diferentes grupos controles mediante t de Student. 
 
Grupos 
 
Valor de P 
Control puro vs 
SN 
>0.05 
Control puro vs 
Control + CsA 
>0.05 
Control puro 
vs Control FK 
>0.05 
Control puro 
vs SN +CsA 
<001 
Control vs 
SN+FK 
>0.05 
 
 
 
 
Cuadro 6. Valor de p en la comparación de triglicéridos séricos entre los diferentes 
grupos nefróticos mediante t de Student . 
Grupos 
 
Valor de P 
SN vs Control 
CsA 
>0.05 
SN vs Control 
FK 
>0.05 
SN vs SN +CsA >0.05 
SN vs SN +FK >0.05 
 
Neevia docConverter 5.1
  29
 Cuadro 7. Valor de p en la comparación de triglicéridos sericos entre los 
diferentes grupos con inhibidores de la calcineurina mediante t de Student. 
 
Grupos Valor de P 
Control CsA vs 
Control FK 
>0.05 
Control CsA vs 
SN +CsA 
<0.01 
Control CsA vs 
SN +FK 
>0.05 
Control FK vs 
SN +CsA 
<0.01 
Control FK vs 
SN +FK 
>0.05 
SN+CsA vs SN 
+FK 
>0.05 
 
 
 
Cuadro 8. Valor de p en la comparación de colesterol sérico entre los diferentes 
grupos controles mediante t de Student. 
Grupos Valor de P 
Control puro vs 
SN 
<0.001 
Control puro vs 
Control CsA 
>0.05 
Control puro vs 
Control FK 
>0.05 
Control puro vs 
SN+CsA 
<0.001 
Control puro vs 
SN+FK 
<0.001 
 
 
Neevia docConverter 5.1
  30
Cuadro 9. Valor de p en la comparación de colesterol sérico entre los diferentes 
grupos nefróticos mediante t de Student. 
 
Grupos 
 
Valor de P 
SN vs Control 
CsA 
<0.001 
SN vs Control 
FK 
<0.001 
SN vs SN+CsA <0.001 
SN vs SN+FK >0.05 
 
 
 
 
Cuadro 10. Valor de p en la comparación de colesterol serico entre los diferentes 
grupos con inhibidores de calcineurina, mediante t de Student. 
Grupos Valor de P 
Control CsA 
vs Control FK 
>0.05 
Control CsA vs 
SN+CsA 
<0.001 
Control CsA vs 
SN+FK 
<0.001 
Control FK vs 
SN+CsA 
<0.001 
Control FK vs 
SN+FK 
<0.001 
SN+CsA vs 
SN+FK 
<0.05 
 
 
 
Neevia docConverter 5.1
  31
HOJA DE VACIAMIENTO DE DATOS 
Rata:____________ Fecha:______Grupo:______ Tratamiento :______________ 
 
 Días 
 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 
Dosis 
Peso 
Volumen 
Urinario 
 
Proteinuria 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dia 14 
Albumina 
Colesterol 
Triglicéridos 
Neevia docConverter 5.1
  32
FOTOS RATAS 
 
 
Foto 1. Jaula metabólica y recolección de orina. 
 
 
Foto 2. Aplicación de medicamentos. 
Neevia docConverter 5.1
	Portada
	Índice
	Texto
<<
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 /ENU (Use these settings to create Adobe PDF documents for quality printing on desktop printers and proofers. Created PDF documents can be opened with Acrobat and Adobe Reader 5.0 and later.)
 >>
 /Namespace [
 (Adobe)
 (Common)
 (1.0)
 ]
 /OtherNamespaces [
 <<
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 /ErrorControl /WarnAndContinue
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 /IncludeNonPrinting false
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 /Namespace [
 (Adobe)
 (InDesign)
 (4.0)
 ]
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 /OmitPlacedPDF false
 /SimulateOverprint /Legacy
 >>
 <<
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 /AddCropMarks false
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 >>
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 /MultimediaHandling /UseObjectSettings
 /Namespace [
 (Adobe)
 (CreativeSuite)
 (2.0)
 ]
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 /UntaggedCMYKHandling /LeaveUntagged
 /UntaggedRGBHandling /LeaveUntagged
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 >>
 ]
>> setdistillerparams
<<
 /HWResolution [2400 2400]
 /PageSize [612.000 792.000]
>> setpagedevice
<<
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 /AutoRotatePages /All
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 /CalCMYKProfile (U.S. Web Coated \050SWOP\051 v2)
 /sRGBProfile (sRGB IEC61966-2.1)
 /CannotEmbedFontPolicy /Warning
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 /CompressObjects /Tags
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 /ConvertImagesToIndexed true
 /PassThroughJPEGImages true
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 /DetectCurves 0.0000
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 /EmbedAllFonts true
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 /ParseICCProfilesInComments true
 /EmbedJobOptions true
 /DSCReportingLevel 0
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 /EndPage -1
 /ImageMemory 1048576
 /LockDistillerParams false
 /MaxSubsetPct 100
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 /OPM 1
 /ParseDSCComments true
 /ParseDSCCommentsForDocInfo true
 /PreserveCopyPage true
 /PreserveDICMYKValues true
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 /PreserveOverprintSettings true
 /StartPage 1
 /SubsetFonts true
 /TransferFunctionInfo /Apply
 /UCRandBGInfo /Preserve
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 /ColorSettingsFile ()
 /AlwaysEmbed [ true
 ]
 /NeverEmbed [ true
 ]
 /AntiAliasColorImages false
 /CropColorImages true
 /ColorImageMinResolution 300
 /ColorImageMinResolutionPolicy /OK
 /DownsampleColorImages true
 /ColorImageDownsampleType /Bicubic
 /ColorImageResolution 300
 /ColorImageDepth -1
 /ColorImageMinDownsampleDepth 1
 /ColorImageDownsampleThreshold 1.50000
 /EncodeColorImages true
 /ColorImageFilter /DCTEncode
 /AutoFilterColorImages true
 /ColorImageAutoFilterStrategy /JPEG
 /ColorACSImageDict <<
 /QFactor 0.15
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 >>
 /ColorImageDict <<
 /QFactor 0.15
 /HSamples [1 1 1 1] /VSamples [1 1 1 1]
 >>
 /JPEG2000ColorACSImageDict <<
 /TileWidth 256
 /TileHeight 256
 /Quality 30
 >>
 /JPEG2000ColorImageDict <<
 /TileWidth 256
 /TileHeight 256
 /Quality 30
 >>
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 /GrayImageMinResolution 300
 /GrayImageMinResolutionPolicy /OK
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 /GrayImageDownsampleType /Bicubic
 /GrayImageResolution 300
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 /GrayImageDownsampleThreshold 1.50000
 /EncodeGrayImages true
 /GrayImageFilter /DCTEncode
 /AutoFilterGrayImages true
 /GrayImageAutoFilterStrategy /JPEG
 /GrayACSImageDict <<
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 >>
 /GrayImageDict <<
 /QFactor 0.15
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 >>
 /JPEG2000GrayACSImageDict <<
 /TileWidth 256
 /TileHeight 256
 /Quality 30
 >>
 /JPEG2000GrayImageDict <<
 /TileWidth 256
 /TileHeight 256
 /Quality 30
 >>
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 /MonoImageMinResolution 1200
 /MonoImageMinResolutionPolicy /OK
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 /MonoImageDownsampleType /Bicubic
 /MonoImageResolution 1200
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 /K -1
 >>
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 /None
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 0.00000
 ]
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 0.00000
 0.00000
 0.00000
 0.00000
 ]
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 /PDFXOutputCondition ()
 /PDFXRegistryName ()
 /PDFXTrapped /False
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 /ENU (Use these settings to create Adobe PDF documents for quality printing on desktop printers and proofers. Created PDF documents can be opened with Acrobat and Adobe Reader 5.0 and later.)
 >>
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 (Adobe)
 (Common)
 (1.0)
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 (Adobe)
 (InDesign)
 (4.0)
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 (Adobe)
 (CreativeSuite)
 (2.0)
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 >>
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