Analisis-de-receptores-de-quimiocinas-en-fibroblastos-derivados-de-pulmon-normal-y-con-fibrosis-pulmonar-idiopatica

Vista previa del material en texto

FACULTAD DE CIENCIAS
UNAM
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA
DE MEXICO
FACULTAD DE CIENCIAS
ANALlSIS DE RECEPTORES DE QUIMIOClNAS EN
FIBROBLASTOS DERIVADOS DE PULMON NORMAL y CON
FIBROSIS PULMONAR IDIOPATICA
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:
B O L O G O
P R E S E N T A
GUSTAVO RAMIREZ MARTINEZ
DIREC10RA DE TESIS: DRA. ANNIE PARDO SEMO
2005
FAC ULTAD DE CIENCIAS
SECCION ESC OLARNeevia docConverter 5.1
/. '.1 1 1 1'." .1 .....1 ;d /. ' 1' 'N ."' 1.
i:¡ l l ¡-¡·l ¡·. I I
l. \1 /1 .
ACT. MAURICIO AGUILAR GONZÁLEZ
Jefe de la División de Estudios Profesionales de la
Facultad de Ciencias
Presente
Comunicamos a usted que hemos revisado el trabajo escrito:
IOAn~lisis de Receptores de Quimiocinas en Fibroblastos derivados de pulm6n
normal y con Fibrosis Pulmonar Idiopática lO
realizado por Gustavo Ramírez Martínez
con número de cuenta 09432543-0 , quien cubrió los créditos de la carrera de: Bi 01og1a
Dicho trabajo cuenta con nuestro voto aprobatorio.
Director
Propietario
Propietario
Propietario
Suplente
Suplente
Atentamente
Dra. Annie Pardo Semo
M. en C. Felipe Mendoza Pérez .. ·-- -../(9
Blol. Jorge Antonio Garela Al'are' ~
M. en C. Moisés Selman Lama ~~~~~/
Q.F.B. Lourdes María Barrera ~~mír~ ~
Consejo Departamental de Bi ologí a J'ACULTAO DECIENO" :::
Neevia docConverter 5.1
DEDICATORIA
A mi madre, por su cariño y monumental paciencia.
A mi padre y Diana, por su cariño.
A Cecilia, simplemente por todo.
A mi familia
En especial a Paola y familia, por su valiosa amistad.
AGRADECIMIENTOS
A Dra. Annie Pardo Semo, por todo el apoyo que me ha brindado
desde el momento que llegué a su laboratorio. Ora Annie, muchísimas
gracias.
A mis profesores: Remedios Ramírez, Jorge García, Felipe Mendoza,
Lourdes Barrera, Martha Montaña, Moisés Selman. Siempre por sus
conocimientos y valiosos consejos.
Neevia docConverter 5.1
INDICE
1. INTRODUCCION 1
11. HIPÓTESIS 23
111 • OBJ ETIVOS 24
IV. METODOS 24
V. RESULTADOS 27
VI. DiSCUSiÓN 36
VII. CONCLUSiONES 39
VIII. BIBLIOGRAFíA 40
Neevia docConverter 5.1
1. INTRODUCCION
1.1 Fibroblastos.
Las células del tejido conjuntivo desempeñan un papel fundamental en el sostén y
en la reparación de la mayor parte de los tejidos y órganos.
Los fibroblastos constituyen el mayor componente celular del tejido conjuntivo,
producen y mantienen a la matriz extracelular y tienen un papel crítico en la
homeostasis y en la reparación del tejido . Constituyen tamb ién una fuente
importante de citocinas inflamatorias y quimiocinas. Además, no solo responden a
factores solubles como endotoxinas bacterianas, citocinas y factores de
crecimiento sino también a contacto directo con células del sistema inmune (1).
Los fibroblastos se hallan dispersos en el tejido conjuntivo de todo el cuerpo,
donde producen una matriz extracelular rica en colágena tipo I y 111. Cuando se
lesiona un tejido, estos migran hacia la herida, proliferan y producen grandes
cantidades de colágena, la cual contribuye al aislam iento y cicatrización de los
tejidos dañados. Los fibroblastos son muy versátiles, pues poseen una notable
capacidad para diferenciarse en otros miembros de la familia del tejido conjuntivo.
además no son células únicamente estructurales; también participan en funciones
importantes dentro del tejido en el que residen . Existen subpoblaciones de
fibroblastos que poseen diferencias morfológ icas, tasa de proliferación, síntesis de
colágena, entre otros ; también , los fibroblastos difieren fenotípicamente entre
órganos así como entre tejidos (2,3).
Neevia docConverter 5.1
1.2 Diversos fenotipos.
Una característica esencial de algunos padecimientos fibrosantes y en particular
de la fibrosis pulmonar, que se abordará mas adelante, es la presencia de
fibroblastos en sitios de fibrosis activa. La presencia de "focos de fibroblastos" una
lesión distintiva, compuesta de fibroblastos o células "tipo-fibroblasto" agrupadas y
relativamente bien delimitadas de las células circundantes, ha sido usada como
parte de los criterios histopatológicos para el diagnóstico de la Fibrosis Pulmonar
Idiopática (FPI) (4, 5).
Hay una amplia evidencia que sugiere que las células en esas áreas de fibrosis
activa son la principal fuente celular de la expresión de matriz extracelular que
caracteriza a la fibrosis, así como la heterogeneidad de fenotipos de fibroblastos
aislados de tejido pulmonar derivado de fibrosis (6). En los focos de fibroblastos
la característica fenotípica es que estas células presentan «-actlna de músculo
liso, lo que los caracteriza como miofibroblastos. La relación entre estos distintos
fenotipos no es clara y su conocimiento permitiría entender como surgen en las
lesiones fibróticas y que determina su permanenda y comportamiento.
Se han descrito 4 fenotipos de fibroblastos si se toma en cuenta sus marcadores
de citoesqueleto: los que expresan solo vimentina; los que expresan vimentina y
desmina ; los que expresan vimentina y o-actína de músculo liso y los que
expresan vimentina, desmina y u-actina de músculo liso. (7)
Se ha observado que los miofibroblastos constituyen la fuente primaria de la
expresión del gen para procolágena tipo I observado en un modelo animal de daño
pulmonar y fibrosis. También se ha observado que contribuyen a las propiedades
2
Neevia docConverter 5.1
mecánicas alteradas del pulmón. Sin embargo, está claro que dentro de lesiones
fibr óticas, la población de fibroblastos es bastante heterogénea, al menos en
términos del fenotipo de miofibroblasto y de expresión del gen de colágena (8,9).
El fenotipo de miofibroblasto que emerge en pulmones fibróticos parece ser
probablemente la causa de muchas de las propiedades características de una
lesión fibrótica, encontradas en la fibrosis pulmonar, por lo que pueden ser
considerados como un fenotipo clave en la progresión de la fibrosis pulmonar.
De relevancia en la fibrosis pulmonar es el fenotipo Thy-1+ que tamb ién exhibe
propiedades profibrogénicas (10). Se han encontrado diferencias en las
características fenotípicas de los fibroblastos obtenidos de pulmón fibrótico, en
relación a los obten idos de pulmón de individuos sanos. Por ejemplo, la presencia
de a-actina de músculo liso expresada por miofibroblastos es notable en lesiones
de pulmón fibrótico tanto en modelos en ratones como en humanos. En contraste
con los fibroblastos Thy-f, los Thy-1+ expresan altos niveles de colágena
intersticial, constitutiva y en respuesta a estimulación por citocinas, consistente
con un depósito de matriz, fundamental en la fibrosis. Sin embargo, son los
fibroblastos Thy- t los que mejor responden al tratamiento con citocinas;
expresando IL-6, TGF-13 Y PDGF-a (11-13). No se conoce aun la relación entre
esos fenotipos y miofibroblastos. El modelo experimental mejor caracterizado para
la heterogeneidad de fibroblastos se basa en la expresión superficial de esta
glucoproteína Thy-1 . En fibroblastos de pulmón de rata y ratón se ha observado
que esas subpoblaciones comparten características con criterios morfológicos que
distinguen células normales de las fibróticas.
3
Neevia docConverter 5.1
1.3 Thy-1 (CD90)
Thy-1 denominado también CD90 es una pequeña glucoproteína altamente
glicosilada de 110 aminoácidos que debido a su plegamiento posee una estructura
característica similar a la del dominio variable de una inmunoglobulina. Es el
miembro más pequeño de la superfamilia de inmunoglobulinas de moléculas de
adhesión (14); La molécula tiene unidos 3 carbohidratos en la región amino-
terminal. La composición de estos tres oligosacáridos puede variar entre
organismos y dentro del mismo tejido a distintas fases de diferenciación.
Finalmente, la molécula está anclada a la membrana plasmática a través de un
tallo de glicofosfatidilinositol (GPI), unido covalentemente al extremo carboxilo
terminal de Thy-1 (15)
Exlraeelular
Toligosac.ilrido
....". Ancla¡. GPI
cns cnat
l
e.rrnt Blo109'
Figura 1. Estructura del receptor C090(Thy-1PS!
El gen para Thy-1 (CD90) está localizado en el cromosoma 11q22.3 y contiene
cuatro exones y tres intrones.
4
Neevia docConverter 5.1
Thy-1 fue el primer antígeno de superficie observado en linfocitos y cuya
expresión estaba restringida en ciertas subpoblaciones de linfocitos (como por
ejemplo linfocitos T en ratón), encontrándose que tenía un papel central en el
desarrollo de la inmunidad mediada por células . También fue una de las primeras
moléculas secuenciadas indicando la gran importancia de los domin ios de
inmunoglobulina y los anclajes de GPI como motivos estructurales.
1.4 Distribución Celular y Tisular de Thy-1 (CD90)
Esta molécula constituye uno de los mayores componentes de la superficie de
varios tipos celulares.
En el Humano, Thy-1 (CD90) está altamente expresado en la superficie de
neuronas en ciertas etapas de desarro llo. Es una de las glucoproteínas más
expresadas en mamíferos y su presencia está regulada para ser omit ida de
regiones de crecimiento axonal por lo que es una molécula muy importante en el
control de la diferenciación neuronal (16).
También se ha localizado en varias líneas celulares pertenecientes al tejido
conectivo , principalmente fibroblastos y también en células T y B inmaduras,
células de médula ósea CD34+ (entre un 10-40% de células CD34+Thy-1 +del total)
(17). También se encuentra en algunas líneas celulares derivadas de leucem ias y
Iinfomas (18).
Como miembro de la familia de las inmunoglobulinas, Thy-1 posiblemente
funcione como molécula de adhesión y además de poder modular las vías de
señalización celular a través de su anclaje con GPI (19).
En timo, Thy-1 es probablemente la glucoproteína más abundante en la superficie
de timocitos y se estima que está presente en un millón de moléculas de Thy-1 por
5
Neevia docConverter 5.1
célula comparada con las casi 15,000 moléculas de CD4 por célula. Por ejemplo,
Thy-1 puede abarcar entre el 10 y 20% de la superficie del timocito (20)
1.5 Thy-1 Y Fibroblastos
La expresión de Thy-1 divide a los fibroblastos de varios tejidos, incluyendo
pulmón humano y del tracto reproductor femenino, en dos subpoblaciones:
fibroblastos Thy-1+ y fibroblastos Thy-t, con características funcionales diferentes
pues solo los fibroblastos Thy-1+ expresan CD40, una prote ína de superficie
involucrada en la activación , proliferación de células T así como en la producción
de citocinas . (21,22) .
También se ha observado que Thy-1 esta involucrado en la adhesión de los
fibroblastos a componentes de la matriz extracelular como son la fibronectina y la
colágena. En cuanto a la forma, los fibroblastos Thy-1+ son de morfología alargada
mientras que los fibroblastos Thy-t son de morfología casi esférica (23).
Los fibroblastos poseen altos niveles basales de Thy-1 en su superficie por lo que
es considerado como un marcador para este tipo celular . La expresión de esta
molécula se induce durante etapas tempranas de reparación tisular, se piensa que
por medio de mediadores de la inflamación. (24) También se ha detectado en
procesos como angiogénesis, específicamente en células endoteliales (25).
Además , se ha observado que Thy-1 participa en la adhesión de fibroblastos a
proteínas de componentes de la matriz extracelular, como son fibronectina y
colágena tipo l.
Aunque ha sido implicada en adhesión celular e inhibición de crecimiento de
neuritas, la función de Thy-1 no es muy clara debido a que no se conoce su
ligando.
6
Neevia docConverter 5.1
Otro aspecto relevante para la fibrosis pulmonar idiopática es el reporte de un
fenotipo de fibroblastos pulmonares aislados de pacientes con FPI que expresan
bajos niveles de ciclooxigenasa-2 (COX-2) (26). Las células del pulmón fibrótico
fallan al momento de responder a una variedad de agonistas para la inducción de
la expresión de COX-2. Células con fenotipo similar han sido reportadas en
pulmones con fibrosis inducida con bleomicina (27). En estas últimas, así como en
fibroblastos pulmonares aislados de un ratón knockout para COX-2 , no hay
producción de prostaglandina E2 (PGE2) en respuesta a TGF-131 y no tienen
respuesta a su efecto antiproliferativo (28). Debido a que PGE2 inhibe la
producción de colágena, este fenotipo que expresa COX-2 en bajos niveles puede
contribuir al aumento en el depósito de matriz extracelular y de células en las
lesiones fibróticas. De hecho el ratón knockout para COX-2 tiene una respuesta
fibrót ica incrementada (29). Como con el fenotipo Thy-1+, la relación entre la
disminución de la expresión de COX-2 y miofibroblastos no se conoce .
Ha sido aislado recientemente un fenotipo que expresa telomerasa en pulmones
de rata con fibrosis inducida con bleomicina (30). Este fenotipo también surge de
novo y se correlaciona con el periodo de fibrosis activa en ese modelo animal. El
papel de éste fenotipo de fibroblastos no es claro, aunque se sabe que la
telomerasa es expresada por células con alta capacidad proliferativa y por ciertas
células cancerosas, lo cual sugiere un posible papel en la proliferación celular que
determina el alto contenido celular en las lesiones fibróticas . Parece, sin embargo ,
que el significado de este fenotipo se extiende mas allá del papel conocido que
tiene la telomerasa en la elongación y mantenimiento de la longitud de los
telómeros (31) .
7
Neevia docConverter 5.1
El origen de estos fibroblastos con fenotipos diferentes no es claro pero parecen
ser relativamente estables sugiriendo su posterior diferenciación a partir de las
poblaciones celulares residentes y/o migrac ión dentro del pulmón desde una
fuente extrapulmonar con o sin diferenciación local. El papel de los distintos
fenotipos de fibroblastos se ha asociado a la producción y depósito de matriz
extracelular, característica central de la fibros is y de los sitios de reparación tisular.
Debido a que las células de músculo liso en pulmón fibrótico y otros tipos celulares
no fibroblásticos no parecen expresar colágena intersticial tipo I como
constituyente primario de las regiones de cicatrización, es evidente que este
fenotipo que expresa «-actina de músculo liso (miofibroblasto) juega un papel
central en el depósito de matriz extracelular. También el fenotipo que expresa
bajos niveles de COX-2 puede contribui r en este aspecto porque es menos
propenso al papel inhibitorio de PGE2 (26). Una característica relacionada con la
fibrosis pulmonar es la inflamación, la cual puede estar presente en varios niveles
dependiendo de tres factores: la etiología, el estado de la enfermedad y la
actividad de la enfermedad, sin embargo en la FPI ésta inflamación es mínima. El
papel relativamente poco importante de la inflamación en la FPI se debe a que la
terapia en pacientes con esta enfermedad por medio de anti-inflamatorios es poco
efectiva (32). No obstante, la presencia de células inflamatorias en lesiones
fibróticas tiene el potencial para proporcionar una fuente de citocinas
profibrosantes que pueden promover la fibros is. La habilidad de los miofibroblastos
para producir estas citocinas (como MCP-1 y TGF-13 por ejemplo) sugiere un papel
inflamatorio por parte de esta célula dada la actividad inflamatoria de dichas
8
Neevia docConverter 5.1
citocinas y de hecho los miofibroblastos son una fuente importante en su
producción durante etapas avanzadas de fibrosis. También los fibroblastos Thy-t
producen altos niveles de estas citocinas por lo que también pueden tener un
papel importante en la inflamación.
Otra característica significativa del tejido fibrótico es la alteración de sus
propiedades mecánicas como es la contractibilidad . El miofibroblasto, debido en
parte a su expresión de a-actina de músculo liso exhibe esta propiedad mecánica
como ocurre en la contracción de las heridas, o la contracción in vitro en redes de
colágena pobladas de fibroblastos . Los miofibroblastos juegan un papel mecánico
en la fibrosis pulmonar y pueden ser responsables de las tres característicasde
una lesión fibrótica: depósito de matriz extracelular, inflamación y la alteración de
las propiedades mecánicas (33).
1.6 Origen de los fenotipos de fibroblastos.
El origen de los diferentes fenotipos de fibroblastos reportados en la fibros is
pulmonar es controversial conforme ha ido avanzando el estudio de las células
madre se ha observado al fibroblasto como célula central del tejido conjuntivo que
posee una amplia plasticidad para adquirir diversos fenotipos.
Estudios hechos en modelos animales sugieren que los miofibroblastos primero se
originan de áreas adventicias de pequeños bronquiolos en estructuras vasculares
adyacentes (8). Parece que los miofibroblastos en las lesiones fibróticas pueden
surgir a partir de fibroblastos residentes en la adventicia vascular y aérea, la cual
subsecuentemente se diferencian a miofibroblastos bajo la influencia de algunos
mediadores como TGF-131, IL-4 e IL-13 (34). Los orígenes de los demás fenotipos
9
Neevia docConverter 5.1
de fibroblastos no se conoce pero se asume que se derivan de fibroblastos
residentes en el pulmón bajo la influencia de factores secretados por células
adyacentes, incluyendo células epiteliales, endoteliales e inflamatorias. Se sabe
últimamente que ciertas células pulmonares pueden derivarse de médula ósea.
Recientemente se ha postulado que existen células circulantes, llamadas
fibrocitos , que pueden ser reclutados al pulmón llegando mediante un evento
conocido como "homing" y poder diferenciarse para dar origen a los diversos
fenotipos encontrados en el pulmón. De hecho, los miofibroblastos en sitios de
reparación pueden derivar de estas células circulantes y no residentes, las cuales
son diferentes a las poblaciones de leucocitos circulantes y expresan colágena
tipo 1, CD11b, CD13, CD34, CD45RO, MHC-II Y CD86, y comprenden del 0.1 al
0.5% de las células no-eritrocíticas en la sangre periférica. En cultivo celular, son
adherentes y adquieren una forma alargada, diferenciándose a miofibroblastos en
presencia de TGF-13 como estímulo (35).
Se sabe que el origen de algunos de estos fenotipos esta regulado por una amplia
variedad de factores, los cuales se hacen presentes en tejidos pulmonares con
fibrosis en desarrollo, asi como por un programa ordenado de factores de
transcripción que participen en la regulación de la diferenciación celular.
En un proceso de reparación normal, el número de miofibroblastos se reduce
gradualmente conforme avanza el proceso de curación así como hay una
resolución o terminación exitosa de la fibrosis pero parece persistir en el tejido
pulmonar de pacientes con fibrosis pulmonar progresiva y por lo tanto parece
haber una correlación entre el surgimiento de algunos fenotipos de fibroblastos y
la actividad fibrótica (36). Una cicatrización normal y exitosa va acompañada por la
10
Neevia docConverter 5.1
desaparición de los miofibroblastos después de haberse llevado a cabo un
adecuado depósito de matriz extracelular.
1.7 Quimiocinas.
Las quimiocinas constituyen el grupo mas diverso y numeroso de citocinas ; son
expresadas por una gran variedad de células en respuesta a diferentes estímulos
como: citocinas, antígenos y estímulos policlonales.
La familia de las quimiocinas consíste en un grupo de pequeños péptidos
(aproximadamente entre 8 y 12 kDa) que se caracterizan por la presencia de
cuatro residuos conservados de cisteína en su secuencia primaria de aminoácidos
(37).
Las quimíocinas han sído divididas en dos principales superfamilias de acuerdo al
arreglo que presentan sus dos resíduos de aminoác idos en la porción amino-
terminal, las cuales se denominan CXC y CC, dependiendo de si los primeros dos
residuos de cisteína están separados por otro aminoácido o si ambos residuos de
cisteína se encuentran de manera adyacente . Existen otras dos familias de
quimiocinas: linfotactina (C) y fractalina (CX3C). La primera, no posee los residuos
de cisteína 1 y 3 de la estructura típica de las quim iocinas, mientras que la
fractalina contiene tres aminoácidos entre los dos primeros residuos de cisteína y
es la única quimiocina de unión a membrana por medio de una estructura tipo
mucina . La función predominante de las quimiocinas es inducir la migración y
activación de leucocitos, incluyendo neutrófilos, monocitos, linfocitos, eosinófilos y
células dendríticas. Estas moléculas quimioatrayentes ejercen su efecto biológico
por la formación de gradientes alrededor de las células que las producen. Las
células que responden expresan los receptores de quimiocinas apropiados y son
11
Neevia docConverter 5.1
capaces de migrar bajo la influencia de un gradiente quimiotáctico establecido
(38).
La afinidad con la que los leucocitos migran en respuesta a esas moléculas está
mediada por la producción de los ligandos de las quimiocinas en un sitio
específico así como la expresión select iva de receptores de quimiocinas.
Los efectos de activación y migración de los leucocitos son de vital importancia
para el desarrollo de una defensa efectiva frente a patógenos. Los gradientes
quimioatrayentes provocan ese movimiento rápido y dirigido de las células a través
de los cuales se mueven permitiéndoles servir como la primera línea en la defensa
mediada por células contra los agentes infecciosos.
Además de estos efectos las quimiocinas están involucradas en procesos que
incluyen el desarrollo. homeostasis y función del sistema inmune.
Polarización Th1/Th2
t
Inflamación
Tráfico L1nfolde
Cicatrización
•\
\. ./ /' Anglogénesls/
~,\ / Anglostasis
..---- -_ / '
(~UIMIOC INA~ )
/ / ; - - - - \ ~ Metastasls
Desarrollo de Organos I i
L1nfoldes , \
Reclutamiento
Celular
Figura 2. Procesos en los que Intervienen las Quimiocinas (38)
Las químiocinas son proteínas que presentan dos características únicas: 1) son
producidas en grandes cantídades por aquellas células en donde son encontradas
y 2) son péptidos de bajo peso molecular que contienen una secuencia
característica, como es la de poseer cuatro cisteínas en posiciones conservadas .
12
Neevia docConverter 5.1
El rápido descubrimiento de las químiocinas ha producido problemas debido a que
varíos reportes le asignan múltiples nombres a la misma quimiocina. Es por ello
que se hizo una nomenclatura estándar en la que se toma en cuenta para
nombrarlas, la familia a las que pertenecen, así como los receptores con los que
interactúan. Específicamente, los receptores de quimiocinas son nombrados como
CC (si pertenecen a la familia CC), CXC (para la familia CXC), C (Iinfotactina) o
CX3C (fractalina), respectivamente, seguidas de la letra R de receptor y a
continuación el número, dependiendo de los miembros que tenga cada familia . Al
momento, en humanos, los receptores de quimiocinas incluyen 18 receptores:
CCR1-10, CXCR1-6, XCR1 y CX3CR1 . Para los ligandos se ha propuesto una
nomenclatura similar, donde se usa l (de ligando) sustituyendo a R. los ligandos
conocidos incluyen CCl1-28, CXCl1 -16, XCl1 Y CXC3Cl1 . Esta nomenclatura
esta aprobada ahora por el Comité de la Unión Internacional de Farmacologia
(NC-IUPHAR) y por el Subcomité para la Nomenclatura de Quimiocinas de la
Unión Internacional de Sociedades Inmunológicas (IUIS).
1.8 Producción Celular de las Quimiocinas
las quimiocinas son altamente heterogéneas. Debido a esto se han agrupado
también en subfamilias funcionales denominándose quimiocinas homeostáticas y
quimiocinas inflamatorias. las quimiocinas inflamatorias controlan el reclutamiento
de leucocitos efectores a sitios de infección , inflamación, daño tisular y tumores .
Muchas de estas quimiocinas son altamente selectivas en cuanto a las células
blanco actuando sobre el sistema inmune tanto innato como adaptativo . Por otro
lado, las quimiocinas homeostáticas dirigen leucocitos durante la hematopoyesis
en la médula ósea y timo, durante el inicio de las respuestas inmunes adaptativas
13
Neevia docConverter 5.1
en bazo, ganglios linfáticos y placas de Peyerasí como el mantenimiento de las
condiciones sanas en los tejidos periféricos. Sin embargo se ha visto que existen
quimiocinas que tienen ambas funciones y que no pueden ser agrupadas en
alguna de las dos categorías; estas quimiocinas participan en funciones de
defensa y también tienen como blanco a leucocitos no efectores . La producción y
expresión de las quimiocinas inflamatorias por células de determinado tejido está
mediada por una serie de estímulos del medio como son condiciones de infección.
Esta producción local de quimiocinas tiene importancia en la progresión de la
enfermedad y en la cronicidad . Por otro lado, la expresíón de las quimiocinas
homeostáticas es de manera constitutiva, aunque algunas citocinas pueden
contribuir a la producción de químiocinas (39).
Las quimiocinas inflamatorias se han ubicado en dos grupos en el genoma del
humano ; el primer grupo, el de las quimiodnas CXC se localiza en el cromosoma
4q21 .1 mientras que el grupo de las quimiocinas CC se localiza en el cromosoma
17q11.2.
1.9 Receptores de Quimiocinas.
Las quimiocinas cumplen sus efectos biológicos por medio de la unión a sus
receptores de superficie . Los receptores de quimiocinas pertenecen a la
superfamilia de proteínas compuestas por 7 dominios transmembranales y que
señalizan acoplados con proteínas G heterotriméricas (denominada GPCR). Como
ya se mencionó anteriormente, de los receptores de quimiocinas, se conocen 18.
Dentro de esta superfamilia de receptores acoplados a proteínas G se encuentran
receptores para neurotransmisores, sustancias parácrinas, hormonas, mediadores
de inflamación, proteinasas , etc. Como característ icas principales de los
14
Neevia docConverter 5.1
receptores de quimiocinas están: 1) se componen de aproximadamente 350
aminoácidos; 2) tienen una pequeña región N-terminal ácida en la porción
extracelular y puede estar sulfatada en sus residuos de tirosina y contener sitios
de glicosilación; 3) una región intracelular C-terminal que contiene residuos de
serina y treonina que actúan como sitios de fosforilación para la transducción de
señales; 4) siete dominios a-hélice transmembranales tipo rodopsina (con 3 asas
extracelulares conectadas con 3 asas extracelulares compuestas por aminoácidos
hidrofílicos) que se ubican de manera perpendicular en la membrana plasmática;
5) tienen dos cisteínas altamente conservadas, una en el dominio N-terminal y otra
en la tercera asa extracelular, que forman un puente disulfuro, importante para la
formación de la unión con el ligando ; 6) las proteínas G están acop ladas a través
del segmento C-terminal a través de la tercera asa intracelular y 7) tienen una
secuencia de aminoácidos única, DRYLAIV, en la segunda asa intracelular
(40,41).
La unión de la quimiocina con su receptor inicia una cascada de eventos
intracelulares que culminan en la expresión de efectos biológicos como es la
transcripción de genes involucrados en procesos como movilidad, invasión celular,
interacciones con los elementos de la matriz extracelular y sobrevivencia. La
señalización involucra movimiento celular durante la inflamación así como
procesos homeostáticos tales como el transporte de células madre
hematopoyéticas.
El primer paso en la señalización es la unión de su receptor con su ligando; esto
produce un cambio conformacional que conduce a la disociación del receptor
15
Neevia docConverter 5.1
asociado a la proteína G heterotrimérica en dos subunidades, la a y la !3y; estas
subunidades pueden activar varias enzimas efectoras , incluyendo fosfolipasas,
produciendo inositol fosfato, incrementar el Ca2+ intracelular y activar cinasas. Esta
cascada de transducción de señales no solo puede inducir un efecto quimiotáctico
sino también varias funciones en los leucocitos como es la degranulación ,
fagocitosis y síntesis de mediadores lipídicos.
También es posible definir de acuerdo a la expresión de receptores de quimiocinas
el perfil de linfocitos T colaboradores de acuerdo al tipo de respuesta, ya sea tipo
Th1 o Th2 (42).
Figura 3. Patrón de expresión de receptores de quimiocinas de acuerdo la polarización de la
respuesta de los linfocitos T colaboradores (42) .
1.10 Evolución de la Superfamilia de las Quimiocinas.
La localización cromosóm ica de los genes que codifican para quimiocinas tiene
implicaciones evolutivas interesantes. Desde su descubrimiento, se han mapeado,
para el caso de los humanos en los cromosomas 17 y 4, mientras que en ratones
ha sido en los cromosomas 11 y 5, para las familias CC y CXC, respectivamente.
16
Neevia docConverter 5.1
Estas quimiocinas se encuentran localizadas en grupos que reflejan el
mecanismo de evolución molecular . Originalmente debió existir un gen que
codificara para una quimiocina con características muy generales a partir de la
cual se diversificaran las demás familias. Este gen fue capaz de duplicarse varias
veces, dando origen a la superfamilia de las quimiocinas y aunque se haya
diversificado, mantiene características del gen ancestral, como es el codificar para
los residuos de cisteína altamente conservados. Este mecanismo evolutivo
permitió la generación de un sistema de tráfico de leucocitos más sofisticado y
especializado controlado por las químiocinas . Esto ocurre para las quimiocinas
que pueden unirse a más de un receptor de quimiocinas, variando únicamente la
afinidad con la que se unen y lo mismo pasa con los receptores. Sin embargo y de
forma interesante, existen quimiocinas que se localizan fuera de los grupos CC y
CXC; de hecho, estos ligandos se localizan en sitios cromosómicos discretos
donde se encuentran como genes únicos o en el proceso de formación de
minigrupos. Esas quimiocinas de localización discreta están altamente
conservadas entre las especies y tienden a tener receptores específicos, es decir ,
receptores que no se unen a otras quimiocinas. Se cree que esto es así por el
hecho de que estas quimiocinas se localizan en grupos pequeños y tienen
importantes funciones en el sistema inmune , incluyendo el mantenimiento de la
homeostasis y morfogénesis de los órganos .
Existen quimiocinas que han evolucionado para desempeñar funciones
importantes, pero estas funciones son compartidas por las quimiocinas que forman
parte del grupo, teniendo redundancia funcional. Esto explica por qué esas
proteínas comparten receptores . En estas quimiocinas, la permanencia de sus
17
Neevia docConverter 5.1
funciones efectoras es por lo general debida a su naturaleza de expresión tejido-
específica . Aunque las quimiocinas localizadas en grupos parezcan compartir
funciones que se sobrelapan, poseen una expresión órgano ó tejido específica. La
principal función de las quimiocinas CXC quizá sea atraer neutrófilos durante el
proceso de inflamación mientras que las quimiocínas ce atraen monocitos durante
la inflamación; por otro lado las quimiocínas de localización discreta son
probablemente las que afecten selectivamente a los linfocitos y participen de
manera principal en la organizacíón y desarrollo del sistema inmune o en el control
de las respuestas inmunes.
1.11 Fibrosis Pulmonar Idiopática.
La fibrosis pulmonar es la ruta final común para un conjunto diverso de
desórdenes pulmonares conocidos como enfermedades pulmonares intersticiales
(EPI) y que, aunque son diferentes en varias características, son agrupadas así
debido a que comparten muchas característ icas clínicas y fisiológicas . Algunas de
estas EPI son de etíología conocida como es la exposición a partículas orgánicas
o inorgánicas (neumonitis por hípersensibilidad y asbestosis , respectivamente),
algunas son inducidas por drogas o asociadas a enfermedades colágeno
vasculares como la artritís reumatoíde (43). Sin embargo cerca de la mitad de las
enfermedades pulmonares intersticiales son de etiología desconocida y son
clasificadas en la actualidad como neumonías intersticíales idiopáticas, de las
cuales , una de las más comunes y quizá la masagresiva es la Fibrosis Pulmonar
Idiopática (44), la cual es un desorden pulmonar crónico, progresivo y
generalmente letal de etiología desconocida . Es notable que mientras muchos
pacientes con algún tipo de EPI presentan un comportamiento clínico heterogéneo
18
Neevia docConverter 5.1
en el cual pueden sanar, mejorar, o desarrollar fibrosis, los pacientes con FPI
siempre progresan hacia la destrucción del parénquima pulmonar (32).
1.12 Características Epidemiológicas.
Los pacientes con Fibrosis Pulmonar Idiopática se encuentran generalmente entre
los 50 y 70 años de edad al momento de que se presenta la enfermedad. De
estos, cerca de dos terceras partes son mayores de 60 años de edad. Se estima
que la incidencia de esta enfermedad es de 7 por cada 100,000 habitantes para
mujeres y de 10 por cada 100,000 para hombre. Además la incidencia, prevalencia
y tasa de muerte se incrementa con la edad.
La principal característica de las neumonías intersticiales es una apariencia
heterogénea del pulmón con áreas de pulmón sano, inflamación intersticial, focos
de fibroblastos, fibrosis densa y panalización, así como cambios histológicos que
afectan severamente al parénquima pulmonar.
Se ha sugerido que existen dos vías para la patogénesis de la fibros is pulmonar: la
vía inflamatoria, para la mayoría de las enfermedades intersticiales del pulmón y la
vía epitelial, para la fibrosis pulmonar idiopática (44).
1.13 Vía Inflamatoria
En esta vía la patogénesis se da por una respuesta inflamatoria frente a un daño
en el tejido como es el parénquima pulmonar, la cual conduce a un proceso de
remodelacién del tejido. Aunque la migración e infiltración de leucoc itos al sitio de
daño es diferente dependiendo del agente agresor, existen redes de citocinas
comunes que activan a las células inflamatorias y que regulan el inicio, progreso o
término del proceso.
19
Neevia docConverter 5.1
Se cree que los patrones de secreción de citocinas tipo Th1 o Th2 (terminología
derivada la respuesta de los linfocitos T colaboradores, del inglés T helper cells)
que se presentan durante las respuestas inmunes inflamatorias determinan muy
probablemente la expresión de fenotipos responsables ya sea del progreso o de la
resolución de la fibrosis . De hecho, experimentalmente se ha encontrado que el
fenotipo tipo Th1 tiene un efecto antifibrótico mediado principalmente por en
interferón (IFN) y que disminuye la proliferación de fibroblastos y la síntesis de
matriz extracelular in vitro y reduce la respuesta fibrótica in vivo. Por otro lado, el
fenotipo Th2 representado principalmente por IL-4 e IL-13 activan a los
fibroblastos e inducen la síntesis de proteínas de matriz extracelular, además que
pueden modular el cambio de fenotipo de fibroblasto a miofibroblasto. También las
quimiocinas juegan un papel importante en la patogénesis o resolución de la
fibrosis pulmonar. Se ha observado que la producción de quimiocinas de la familia
CC, importantes en el proceso inflamatorio , está elevada en pacientes con fibrosis
pulmonar por lo que es probable que tengan relevancia en el mantenimiento de la
inflamación y el desarrollo de la fibrosis en ciertas condiciones .
Los receptores de quimiocinas también son importantes ya que pueden determinar
el desarrollo de la respuesta inmune ya sea hacia el tipo Th1 o Th2 y así ayudar a
desencadenar o no el proceso fibrótico. Así, en la respuesta tipo Th2 se
encuentran altamente expresados los receptores CCR4 y CCRB, siendo este
último fundamental para las respuestas funcionales tipo Th2 in vivo. Por otro lado,
la expresión de CCR5 se ha asociado al perfil de respuesta tipo Th1 (45). Además
se ha observado que las quimiocinas de la familia CXC tienen un papel importante
en la formación de nuevos vasos sanguíneos por lo que un desequilibrio en la
20
Neevia docConverter 5.1
producción de estas quimiocinas puede ayudar al desarrollo de la fibrosis , ya que
aunque de manera parcial , en la fibrosis pulmonar existe una angiogénesis
disminuida, la cual involucra el depósito de fibras de colágena sin vascularización .
Sin embargo , también se ha encontrado en modelos experimentales que la
angiogénesis está incrementada. En todos estos procesos el papel de las
quimiocinas es central tanto para la regulación de la respuesta inflamatoria como
para el desarrollo o disminución de los eventos fibróticos los cuales pueden estar
regulados a tres niveles distintos: 1) induciendo y manteniendo la inflamación ; 2)
alterando el proceso de angiogénesis y 3) polarizando la respuesta inmune hacia
la reacción profibrót ica tipo Th2 (44).
1.14 La vía epitelial.
En este proceso no inflamatorio participa activamente el epitelio alveolar , el cual
está compuesto por dos tipos celulares : las células alveola res tipo 1 que
comprenden cerca del 95% del epitelio , de forma alargada y cuya geometria
permite que se realice el intercambio gaseoso, son altamente sensibles a daños
por agentes externos y tienen una capac idad de proliferación altamente reducida ;
cerca del 5% restante lo constituyen las células alveolares tipo 11 , de forma
cuboidal , localizadas hacia los alvéolos , y son metabólicamente muy activas como
células secretoras sintetizando principalmente el surfactante , que da la tensión
superficial en la interfase alveolar aire-líquido, evitando que los alvéolos se
colapsen ; también estas células son capaces de proliferar y diferenciarse en
células alveolares tipo 1.
La característica principal del pulmón con FPI es la presencia de diversos tipos
celulares con alterac iones morfológicas y funcionales. Entre las alteraciones se
21
Neevia docConverter 5.1
encuentra un incremento en las tasas de necrosis y apoptosis de las células
epiteliales alveolares, afectándose la capacidad de las células alveolares tipo 2
para restablecer la población de células alveolares tipo 1. Además las células
epiteliales son capaces de sintetizar mediadores profibróticos como factores de
crecimiento y citocinas que tienen influencia en la migración y proliferación de los
fibroblastos, así como en los cambios en su fenotipo. Lo anterior sugiere que las
células epiteliales son las principales responsables del inicio de los eventos
fibrogénicos.
La característica distintiva a nivel histológico de la fibrosis pulmonar idiopática es
la formación de agregados o focos de fibroblastos y miofibroblastos (que dentro de
las alteraciones fenotípicas, la conversión de fibroblastos en miofibroblastos, es la
que más destaca). Su presencia conduce a una remodelación anormal, un
depósito exces ivo y desordenado de matriz extracelular y la ruptura de la
estructura pulmonar.
De acuerdo a la heterogeneidad que existe en las poblaciones de fibroblastos , se
cree que para la formación de los focos de fibroblastos y el progreso del proceso
fibrótico, los fibroblastos adquieren primero un fenotipo que les facilita la
migración, un fenotipo proliferat ivo en el sitio de la lesión y finalmente una
conversión a miofibroblasto siendo el fenotipo profibrótico que causa la producción
y depósito de matriz extracelular, aunado a que existe un desbalance en la
producción de metaloproteinasas de matriz (MMPs) y de inhibidores tisulares de
22
Neevia docConverter 5.1
metaloproteinasas.
Agente Dañino
Desconocido
JJ.
Alveólo Normal
Desequilibrio en el Metabolismo
de la Matriz Extracelular
Figura 4 . Vía epitelial de la Fibrosis Pulmonar Idiop ática (43 ,44)
En este contexto, siendo los fibroblastos una célula central en la patogénesis de la
FPI el objetivo de este trabajo es analizar y caracterizar posibles diferencias en la
expresión de algunos receptores como el CD9ü y quimiocinas entre fibroblastos
obtenidos de pulmón normal y fibroblastos derivados de pulmón fibrótico.
11. HIPÓTESIS
Los fibroblastos derivados de pulmón normal y pulmón fibrótico presentan
diferencias en la expresión de CD9ü y de receptores de quimiocinas.
23
Neevia docConverter 5.1
metaloproteinasas.Agente Dañino
Desconocido
~ .
Alveólo Normal
Desequilibrio en el Metabolismo
de la Matriz Extracelular
Figura 4. Vía epitelial de la Fibrosis Pulmonar Idiopática (43.44)
En este contexto, siendo los fibroblastos una célula central en la patogénesis de la
FPI el objetivo de este trabajo es analizar y caracterizar posibles diferencias en la
expresión de algunos receptores como el CD9ü y quimiocinas entre fibroblastos
obtenidos de pulmón normal y fibroblastos derivados de pulmón fibrótico.
11. HIPÓTESIS
Los fibroblastos derivados de pulmón normal y pulmón fibrótico presentan
diferencias en la expresión de CD9ü y de receptores de quimiocinas.
23
Neevia docConverter 5.1
111. OBJETIVOS
a) Analizar la expresión de vimentina como un marcador de fibroblastos.
b) Analizar la heterogeneidad de Fibroblastos de acuerdo a la expresión de Thy-1
(CD90) en fibroblastos normales y derivados de Fibrosis Pulmonar Idiopática por
Citometria de Flujo.
e) Analizar la expresión de receptores de quimiocinas en fibroblastos normales y
derivados de Fibrosis Pulmonar Idiopática por Citometria de Flujo.
IV. METOOOS
4.1 Obtención de Fibroblastos
Los Fibroblastos Controles fueron obtenidos de pulmón a partir de biopsias de
pacientes, a los que se realizó una lobectomia para la remoción de tumores
pulmonares primarios . El fragmento pulmonar que se utilizó para la obtención de
fibroblastos fue tomado de tejido sin evidencia histológica de enfermedad y
considerado como normal. Los Fibroblastos Fibróticos fueron aislados a partir de
tejido pulmonar obtenido de pacientes con FPI por medio de una biopsia. La FPI
fue diagnosticada como se describe previamente (4).
Los fibroblastos fueron aislados por tratamiento enzimático con Tripsina-EDTA
(Tripsina-EDTA [1X] 0.5 grs. de tripsina porcina y 0.2 grs. EDTA, SIGMA) (47) a
3rC, 20 mino Posteriormente los fibroblastos se cultivaron en cajas de cultivo
COSTAR T-25 crrr' con medio Ham F-12 (GIBCO Laboratories, Grand Island, NY)
suplementado con Suero Fetal Bovino (FBS) al 10% (GIBCO BRL), 100 U/mL de
penicilina y 100 g/mL de estreptomicina, a 3rC en 5%C02 I 95%02 como se
describió previamente (46).
24
Neevia docConverter 5.1
111. OBJETIVOS
a) Analizar la expresión de vimentina como un marcador de fibroblastos.
b) Analizar la heterogeneidad de Fibroblastos de acuerdo a la expresión de Thy-1
(CD90) en fibroblastos normales y derivados de Fibrosis Pulmonar Idiopática por
Citometria de Flujo.
e) Analizar la expresión de receptores de quimiocinas en fibroblastos normales y
derivados de Fibrosis Pulmonar Idiopática por Citometría de Flujo.
IV. METODOS
4.1 Obtención de Fibroblastos
Los Fibroblastos Controles fueron obtenidos de pulmón a partir de biopsias de
pacientes, a los que se realizó una lobectomía para la remoción de tumores
pulmonares primarios. El fragmento pulmonar que se utilizó para la obtención de
fibroblastos fue tomado de tejido sin evidencia histológica de enfermedad y
/
considerado como normal. Los Fibroblastos Fibróticos fueron aislados a partir de
tejido pulmonar obtenido de pacientes con FPI por medio de una biopsia. La FPI
fue diagnosticada como se describe previamente (4).
Los fibroblastos fueron aislados por tratamiento enzimático con Tripsina-EDTA
(Tripsina-EDTA [1X] 0.5 grs. de tripsina porcina y 0.2 grs. EDTA, SIGMA) (47) a
3rc, 20 mino Posteriormente los fibroblastos se cultivaron en cajas de cultivo
COSTAR T-25 cm2 con medio Ham F-12 (GIBCO Laboratories, Grand Island, NY)
suplementado con Suero Fetal Bovino (FBS) al 10% (GIBCO BRL), 100 U/mL de
penicilina y 100 g/mL de estreptomicina, a 3rC en 5%C02 / 95%02 como se
describió previamente (46).
24
Neevia docConverter 5.1
4.2 Marcaje para Citometría de Flujo
Los fibroblastos se cultivaron hasta llegar a confluencia temprana (80-90%), hasta
pasajes entre 4 y 9; posteriormente se trataron con tripsina para despegar las
células . Se lavaron con PBS a 500 x g, 10 min., a 4°C para eliminar la tripsina.
Posteriormente se contaron en Cámara de Neubauer para marcar 2.5 x 105 células
por tubo y fueron resuspendidas en 50 ¡.tL de Buffer de Teñido (BD Biosciences
Pharmingen , San Diego CA) y 2 ul, de IgG (SIGMA , ST Louis MO). Los
fibroblastos se tiñeron en superficie con 5 ¡.tL/2.5 x 105 células de los siguientes
anticuerpos: anti-CD90-FITC (BD Biosciences Pharmingen , San Diego CA), anti-
CD90-PE (BD Biosciences Pharmingen, San Diego CA), anti-CCR5-FITC (BD
Biosciences Pharmingen, San Diego CA), anti-CCR4-PE (BD Biosciences
Pharmingen , San Diego CA), anti-CXCR4-PE (BD Biosciences Pharmingen, San
Diego CA), anti-CCR7 -PE (BD Biosciences Pharmingen, San Diego CA) y anti-
CXCR3-PE (BD Biosciences Pharmingen , San Diego CA); 20 ¡.tL/2.5 x 105 células
de anti-CCR8-APC (R&D Systems, Minneapolis MN) y anti-CCR9-APC (R&D
Systems, Minneapolis MN). Se incubaron durante 25 mino en la oscuridad.
Posteriormente se lavaron 2 veces con 1.2 mL de PBS, a 500 x g, 10 min a 4°C.
Desechando el sobrenadante, los fibroblastos se fijaron en 500 ul, de p-
formaldehído al 1%.
Para el marcaje intracelular, los fibroblastos se permeabilizaron incubando con
100 ¡.tL/2.5 x 105 células de BD CytofixlCytoperm™ (BD Biosciences Pharmingen,
San Diego CA) durante 15 mino en la oscuridad . Posteriormente se lavaron con 1.2
ul, de BD Perm-Wash" (BD Biosciences Pharmingen, San Diego CA), a 500 x g,
25
Neevia docConverter 5.1
10 min a 4°C; las células te tiñeron con 5 flU2.5 x 105 células de anti-Vimentina-
FITC (Santa Cruz Biotechnology) y se incubaron 25 mino en la oscuridad.
Posteriormente se lavaron 2 veces con 1.2 mL de PBS, a 500 x g, 10 min a 4°C.
Desechando el sobrenadante, los fibroblastos se fijaron en 500 ul, de p-
formaldehído al 1%.
4.3 Adquisición y Análisis por Citometría de Flujo.
Se adquirieron y analizaron 10 000 eventos. Las señales FSC y SSC fueron
adquiridas con amplificación lineal y las de fluorescencia con amplificación
logarítmica, en un Citómetro de Flujo FACS Aria (BD, Palo Alto CA).
Se utilizó el programa FACSDiva para la adquisición y análisis de las muestras. En
todos los casos se delimitó una región R1, sobre la gráfica de FSC vs. SSC, que
muestra tamaño contra granularidad.
4.4 Análisis Estadístico.
Los resultados se analizaron con una prueba de t (no pareada) y se consideraron
significativos con una p<0.05.
26
Neevia docConverter 5.1
V. RESULTADOS
5.1. Heterogeneidad en Fibroblastos
Para estandarizar y analizar el comportamiento de la heterogeneidad existente en
los fibroblastos se hizo una comparación, por citometría de flujo , de fibroblastos
con linfocitos. En la figura 5 se muestra el tamaño (FSe, en el eje de las abscisas)
contra granularidad o complejidad interna (SSe, en el eje de las ordenadas) , y se
observa que los linfocitos son una población totalmente definida, compacta dentro
de un rango determinado de tamaño y complejidad interna . Por otro lado, los
fibroblastos aparecen como una población heterogénea con amplias diferencias en
cuanto a tamaño y complejidad.
10 100 110 lOO 110
FSC.A ,• •.000)
10 100 110 100 2'''''
FSC-A (. 1.000)
Figura 5. Comparat ivo entre la distribución de las poblaciones de fibroblastos y linfocitos de
acuerdo al tamaño y la complejidad interna.
27
Neevia docConverter 5.1
5.2. Expresión de Vimentina en Fibroblastos normales y en fibroblastos
derivados de FPI marcados con anti-vimentina.
Se analizó la existencia de alguna diferencia en cuanto a la expresión de
vimentina en fibroblastos normales y fibróticos, y se marcaron con anti-vimentina-
FITC a una sola concentración (0.5 Ilg). En la figura 6 se observa que la expresión
de vimentina se da prácticamente de la misma forma en ambas líneas celulares.
En este experimento se observó que un porcentaje de cerca del 20% de
fibroblastos fue negativo para vimentina; dado que la viment ina es un marcador
universal de los fibroblastos, este resultado nos sugirió que la concentración de
anticuerpo utilizada era insuficiente,y se realizó la titulación.
Vírnentin ..
.ae.e %
1 U 2 1 0 3 U ) 4
Vunont,n F I T C - A
v .........un -
13..4%
r -Y-l' ·· r -"" ·T""..- r'l .. ...... , .,. J e - ' "" '"l ·T-r ··,--r
1 0 0 t "70 2'00 ;r-....o
FSC~A ¡ . , 000.
Flbrobl_st:os Mor........
(v. .... ntl....ntr.c_'..'.r)
r--"'""';:;:= =-- -....,.-;-:-:-:-- ..-.-, .--- - r-- - - - - - - -- -¡
F.brob os derlvo.dos de FPI
Cvl n_ Intr_c.lular)
- ' .",
_._-=,~-""" 1
~ 1
.».» . , _. 111'1 :__, .1
f O .:). ~O· 10 :'>-
V ,rnenb n FITC~A
Virnet'lltn-
20%
:I;"!.j'o.. ....?
.....?- ,
~:.::,::===- 'H._'-··
, .~.. ;".; o,";" " .
F:lbr.obli~.'lps::: _ · '.
,i;.;:(,¿i;··~~iW;? ~>: ~V: · ; :·
b
Figura 6. Expresión de vimenlina en a) fibroblastos normales y b) fibroblastos derivados de
fibrosis pulmonar idiopática. (Experimento duplicado y a una concentración de anti-vimenlina-FITC
de 0.5 fl9)
28
Neevia docConverter 5.1
5.3. Titulación de Vimentina
Para analizar la expresión de vimentina en fibroblastos, se hizo la titulación del
anticuerpo, marcando fibroblastos normales con anti-v imentina-FITC a tres
diferentes concentraciones. Se observa en la figura 7 que hay un incremento en la
expresión de vimentina que es proporcional al aumento en la concentración de
anticuerpo.
\/ .,. ...-rrt,n f' IT (: ·A
I
v.-· l'
00.&% j ~
-' ~ 8 !.~
V"'T~ F I T C -A
"
Flbrobl• • lo. Norwaal•• con vI__nl'_...FITC Inlr.celul.r
(conc....rac:I... " .0 P II)
¡ - S C -A
Flbrob"stos Norm.'." con .......ntln....F.YC Intrac.lul.r
(c:onc:.ntr.c1-6n 2.0 J&8)
1
-
:. - V wno .....,..."
2 ..7%
~.
W
el. -~
"'0:;--
. ~~ IO ~
V~ FITC ·A V ....~'...,t " e ·p..
Figura 7. Expresión de vimentina en Fibroblastos Normales marcados con anti-vimentina-FITC a
diferentes concentraciones: a) 0.5 J.lg; b) 1.0 J.lg Y e) 2.0 J.lg.
29
Neevia docConverter 5.1
5.4. Especificidad de la interacción de vimentina con anti-vimentina-FITC
Para comprobar la especificidad del anticuerpo anti-vimentina-FITC y que no
existe inespecificidad. se utilizaron fibroblastos normales y se marcaron con anti-
vimentina-FITC a una concentración de 2.0 IJg tanto intracelular como en
superficie. Se observa en la figura 8 que el 90.3% de los fibroblastos son positivos
para vimentina , dato que se confirma con la intensidad de fluorescencia
observada en el histograma.
I
it 1GO HO 2Ct 2"A
;sc.... (o 1«11)
Fibroblastos Normales
(vimentina intracelular)
E
;,
o
«»
lO' I ~I lOS
Vlmenbn File-p.
Figura 8. a) Experimento realizado con fibroblastos normales marcados con anti-vimentina-FITC de
manera intracelular; b) población de fibroblastos positiva para vimentina e e) histograma de
fluorescencia para vimentina-FITC
30
Neevia docConverter 5.1
En la figura 9 se observa que no existe interacción inespecífica del anticuerpo con
la superficie celular pues prácticamente no se observa vimentina en la gráfica de
puntos y tampoco se observa intensidad de fluorescencia en el histograma.
~ 1/10 I~ 2IiO MO
fSC.A (l1,C03)
Fibroblaslos Normales
(vlmentlna en superficie)
10
1
lO'
\flme nlln FITC·A
-c
ÚJ
Q.,.
2
Figura 9. a) Experimento realizado con fibroblastos normales marcados con anti-vimentina-FITC en
superficie; b) población de fibroblastos positiva para vimentina e e) histograma de fluorescencia
para vimenlina-FITC
31
Neevia docConverter 5.1
5.5. Expresión de Thy-1 (C090) en Fibroblastos normales y derivados de FPI
Se estudió la expresión de Thy-1 (CD90) en fibroblastos normales y en
fibroblastos derivados de FPI. En la figura 10 se observa que tanto para
fibroblastos fibróticos como normales, existe una subpoblación de fibroblastos
Thy-1 +que corresponde al 96.5% en fibroblastos normales y 94.4%.
:¡.
~ ,~
~ ~ -c=: ~
lO '
a-
96.5%
cose-
CD90 en Fibroblastos Normales
o-
FITC-A CD90 PE-A
CD90 en Rbroblastos derivados de FPI
l'
J
¡
.\
~ ¡;." +--=9U-"1"...-f-- - Ii-ee!lt!
~ u
94.4%
CD90+
CD90·
...
.;. -
11.
'='
~-~_ -t-----------1
u
FITC·A
C090 PE-A
Figura 10. Expresión de Thy-1 (C090) en a) fibroblastos normales y b) fibroblas tos derivados de
fibrosis pulmonar idiopática. (cinco experimentos).
32
Neevia docConverter 5.1
En la gráfica 1 también es posible observar la expresión de Thy-1 en fibroblastos
normales y fibróticos. No se encontraron diferencias entre fibroblastos fibróticos y
normales para la expresión de Thy-1+(CD90).
120 ,--- - - - - - - - - - - - - - --,
100
20
l1l:I
N12 P.e HIPF 171 P-4 HIPF 173 P-4
Gráfica 1. Expresión de Thy-1 (CD90) en Fibroblastos Normales (N12 P-8) Y fibroblastos derivados
de Fibrosis Pulmonar Idiopática (HIPF 171 P-4 Y HIPF 173 P-4). Los valores expresan la media ± el
error estándar de 5 datos, · ·p<O.01
Por otro lado en la figura 11 se muestra, de un total de 10,000 eventos estudiados,
el porcentaje de fibroblastos Thy-1+ y Thy-t, a partir de una gráfica de puntos de
tamaño contra granularidad. En el histograma se muestra la intensidad de
fluorescencia de los fibroblastos Thy-1+. Tanto en los fibroblastos normales como
fibróticos predomina la subpobladón de fibroblastos Thy-1+.
33
Neevia docConverter 5.1
" 100 150FSC-A 200 2"(l( 1,000)
Fibroblast chemolone-Tube 005 Norm al
E
:J
o
U
C09 0 PE-A
":Jo
U
Figura 11. Comparación en la expresión de Thy-1 (CD90) en Fibroblastos Normales y Fibroblastos
derivados de Fibrosis Pulmonar Idiopática, tanto por porcentaje de células (izq.) como por
intensidad de fluorescencia (der.)
34
Neevia docConverter 5.1
5.6. Expresión de Receptores de Quimiocinas en Fibroblastos Thy-1+ y
Fibroblastos Thy-1"
La expresión de receptores de quimiocinas se estudió en fibroblastos normales y
fibroblastos derivados de FPI. La expresión de receptores de quimiocinas se
evaluó tanto en fibroblastos Thy-1+como en fibroblastos Thy-t. Se observa que
en los fibroblastos de pulmón normal hay una mayor expresión de receptores de
quimiocinas en la subpobladón Thy-1+ respecto a la subpoblación Thy-t. En la
gráfica 2 se observa la expresión de CCR5 en aproximadamente un 15% de las
células Thy-1+ y un 1% en los fibroblastos Thy-t. Hay una expresión de CCR4,
CCR8 y CCR9 de entre 6 y 8% de los fibroblastos Thy-1+ y de entre 1 y 3% en los
fibroblastos Thy-t. El patrón de expresión de estos receptores en fibroblastos
Thy-1+ y Thy-t derivados de FPI, solo se conserva para CCR5, mientras que el
CXCR3 y CXCR4 no detectables. Sin embargo es en los fibroblastos Thy-t (entre
2% Y 10%) donde se encuentra mayor expresión de los receptores CCR4, CCR8 y
CCR9. La expresión de estos receptores en los fibroblastos Thy-1+ desaparece
con una expresión menor al 1%.
I_ : o: oto ·
l rt=J~'.O
Normal Fibrótico
Gráfica 2. Expresión de Receptores de Quimiocinas de acuerdo a los fenotipos CD90+ y CD90- en
Fibroblastos Normales y Fibroblastos derivados de Fibrosis Pulmonar Idiopática.
35
Neevia docConverter 5.1
VI. Discusión
La Fibrosis Pulmonar Idiopática se caracteriza por la proliferación de fibroblastos y
una acumulación excesiva de moléculas de la matriz extracelular (como la
colágena) y cuya distinción principal es la presencia de focos de fibroblastos con
una distribución amplia a lo largo del parénquima pulmonar (4,33), por lo que se
piensa que estos focos de fibroblastos, representando zonas microscópicas de
daño pulmonar, son producto de la migración de fibroblastos donde
posteriormente proliferan, contr ibuyen a la acumulación de moléculas de matriz
extracelular y pueden mantener una arquitectura anormal del pulmón. Con el
objetivo de evaluar en fibroblastos tanto normales como derivados de FPI la
expresión de receptores de quim iocinas se sometieron al análisis por citometría de
flujo con anticuerpos dirigidos contra algunos receptores de quimiocinas
expresados por los fibroblastos, lo cual puede explicar parcialmente sus
características migratorias. Estudios relativamente recientes sugieren que los
fibroblastos no solo son productores sino también son blanco de las quimiocinas.
Se decidió buscar receptores de quimiocinas definidos tantopara una respuesta
tipo Th1 (CCR5 Y CXCR3) como Th2 (CCR4, CCR8, CXCR4) para evaluar la
existencia de una polarización en los fibroblastos de acuerdo a esta expresión de
receptores.
Estos resultados demuestran la heterogeneidad de los fibroblastos. Tomando en
cuenta a Thy-1 (C090) como marcador para definir subpoblaciones de fibroblastos
se encuentra que existe una subpoblación positiva para Thy-1 (C090)
significativamente numerosa con una distribución prácticamente igual tanto en
fibroblastos normales como en fibroblastos derivados de FPI. Aunque no se sabe
36
Neevia docConverter 5.1
la función exacta de Thy-1 (CD90), su similitud estructural con las
inmunoglobulinas hace pensar que puede desempeñar una función importante en
la interacción célula-célula y célula-sustrato como molécula de adhesión .
La expresión de Thy-1 parece regular propiedades celulares que tienen un papel
central en las respuestas fibrogénicas. Tal vez el papel que Thy-1 puede jugar en
fibroblastos es el de señalización , activando a estas células e iniciándose la
síntesis de moléculas de matr iz extracelular como son colágena (cuyo
desequilibrio en su producción provoca una arquitectura aberrante del tejido) y
fibronectina (fundamental en el reclutamiento de células inflamatorias y
fibroblastos a sitios de inflamación). En cuanto a la expresión de receptores de
quimiocinas, en fibroblastos normales , se observa que los fibroblastos Thy-1+
tienen una expres ión mayor de receptores de quimiocinas. Se observa mayor
expresión de CCR4 , CCR8 y CCR9 en la subpobladón de fibroblastos Thy-1+,
mientras que en la subpoblación de fibroblastos Tby-t la expresión se ve
disminuida.
Un resultado interesante es que para la expresión de receptores de quimiocinas
en fibroblastos derivados de FPI, aunque se mantiene la alta expres ión de CCR5
en fibroblastos fibróticos Thy-1". se observa una expresión de receptores de
quimiocinas definidos para una respuesta tipo Th2 principalmente con la expresión
de CCR4 y CCR8 en la subpoblación de fibroblastos Thy-t, mientras que en los
fibroblastos Thy-1+ la expresión de estos receptores se ve disminuida. Este
resultado es interesante pues aunque existe una mayor densidad de fibroblastos
Thy-1+, es posible que en el proceso fibrótico sean los fibroblastos Thy-t los que
tengan un papel importante. También se ha encontrado que los fibrob lastos Thy-t
37
Neevia docConverter 5.1
expresan altos niveles del factor de crecimiento de tejido conectivo , el cual es
importante en los procesos fibrogénicos y es posible que sea la subpoblación
predominante en los focos de fibroblastos debido a la migración a sitios de daño,
para su posterior proliferación y diferenciación a miofibroblastos.
Las redes de quimiocinas son en general muy complejas. Sin embargo, cuando se
involucran a los fibroblastos se convierte en un problema doble, primero por la
amplitud de los cambios en su proliferación y/o en su producción de colágena y
segundo , por su heterogeneidad. In vitro, los fibroblastos muestran amplia
variedad fenotípica de célula a célula, dependiendo del tejido de origen. Con un
estímulo apropiado, los fibroblastos son potentes productores de una variedad de
quimiocinas regulando no solo el tráfico de células circulantes y residentes sino
que también pueden influenciar la remodelación tisular.
El papel de Thy-1 (CD90) en relación a la expresión de moléculas asociadas con
la remodelacián de la matriz extracelular no se conoce con precisión además que
los estudios que existen son escasos y han arrojado resultados contradictorios.
Por un lado se ha sugerido que la expresión de Thy-1 identifica a una
subpoblación de fibroblastos con propiedades profibrogénicas dado que expresan
altos niveles de colágena intersticial de manera constitutiva como en respuesta a
estimulación por citocinas en comparación con fibroblastos que no expresan Thy-1
(10). Por otro lado, en estudios recientes se ha encontrado que ratones knockout
de Thy-1 presentan una fibrosis mucho mas severa con el aumento en la
fosforilación del complejo SMAD 2/3, el cual es un componente de la via de
señalización del TGF-I3, en comparación de ratones control (47). Adicionalmente
se ha observado que los fibroblastos Thy-t responden a diferentes citocinas
38
Neevia docConverter 5.1
aumentándose la actividad de TGF-13 y la expresión de alfa actina de músculo liso
en comparación con los fibroblastos que expresan Thy-1 (48) .
Por otro lado, la citometria de flujo, a diferencia de otras técnicas, puede detectar
de forma rápida y fácil fibroblastos, permitiendo contar muchas células en poco
tiempo, lo que da más confiabilidad y precisión a los resultados. La principal
ventaja que presenta la citometria de flujo frente a otras técnicas de análisis se
encuentra en la capacidad que tiene este instrumento para medir varios
parámetros de miles de células individuales (49).
VII. Conclusiones
1) Existe una heterogeneidad de fibroblastos en cuanto a tamaño .
2) La mayoría de los fibroblastos derivados de pulmón normal y los derivados
de pulmón fibrótico son positivos para el marcador Thy-1 (CD90), y existe
una pequeña proporción de fibroblastos Thy-1 (CD90r,
3) Se observa en los fibroblastos Thy-t una expresión de receptores de
quimiocinas caracter ísticos de una respuesta tipo Th2 y en los fibroblastos
Thy-1+ una expresión de receptores de quimiocinas característicos de una
respuesta tipo Th1.
T
39
Neevia docConverter 5.1
aumentándose la actividad de TGF-13 y la expresión de alfa actina de músculo liso
en comparación con los fibroblastos que expresan Thy-1 (48).
Por otro lado, la citometría de flujo, a diferencia de otras técnicas, puede detectar
de forma rápida y fácil fibroblastos, permitiendo contar muchas células en poco
tiempo, lo que da más confiabilidad y precisión a los resultados. La principal
ventaja que presenta la citometría de flujo frente a otras técnicas de análisis se
encuentra en la capacidad que tiene este instrumento para medir varios
parámetros de miles de células individuales (49).
VII. Conclusiones
1) Existe una heterogeneidad de fibroblastos en cuanto a tamaño.
2) La mayoría de los fibroblastos derivados de pulmón normal y los derivados
de pulmón fibrótico son positivos para el marcador Thy-1 (C090), y existe
una pequeña proporción de fibroblastos Thy-1 (C090)".
3) Se observa en los fibroblastos Thy-T una expresión de receptores de
quimiocinas característicos de una respuesta tipo Th2 y en los fibroblastos
Thy-1+ una expresión de receptores de quimiocinas característicos de una
respuesta tipo Th1.
39
Neevia docConverter 5.1
VIII. Bibliografía
1. Bombara M.P., Webb D.L., Conrad P., Marlon C.w., Sarr T., Ranges G.E.,
Aune T.M., Greve J.M., Blue M.L. Cell contact between T cells and synovial
fibroblasts causes induction of adhesion molecules and cytokines . Journal of
Leukocyte Biology 1993; 54:399-406.
2. Smith T.J., Sempowski G.D., Wang H.S., Del Vecchio P.J., Lippe S.D., Phipps
R.P. Evidence for cellular heterogeneity in primary cultures of human orbital
fibroblast. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 1995; 80:2620-
2625.
3. Falanga V., Zhou L.H., Takagi H., Murata H., Ochoa S., Martin T.A., Helfman T.
Human dermal fibroblast clones derived from single cells are heterogeneous in
the production of mRNAs for alpha 1(1) procollagen and transforming growth
factor-beta 1. Joumal ot investigatian in dermatalagy 1995 ; 105, 27 .
4. Katzenstein A.A., Myers J.L. Idiopathic pulmonary fibrosis : c1inical relevance of
pathologic classification. American Jaurnal ot Respiratary and Critical Care
Medicine 1998; 157 :1301-1315
5. King Jr. T.E., Schwarz M.I., Brown K., Tooze JA, Colby T.V., Waldron Jr. JA,
Flint A., Thurlbeck W., Cherniack R.M. Idiopathic pulmonary fibrosis :
relationship between histopatholog ic features and mortality . American Jaumal
ot Respiratary and Critical Care Medicine 2001; 164:1025-1032
6. Fries K.M.,Blieden T., Looney R.J., Sempowski G.D., Silvera M.R., Willis R.A.,
Phipps R.P. Evidence of fibroblast heterogeneity and the role of fibroblast
40
Neevia docConverter 5.1
subpopulations in fibrosis. Clinical Immunology and Immunopathology 1994;
72(3):283-92
7. Mitchell J.J., Reynolds S., Low R, Leslie K.O., Adler G., Gabbiani G., Omar S.
a-Smooth muscle actin in parenchymal cells of bleomycin-injured rat lung.
Laboratory Investigation 1989; 60:643-650
8. Zhang K.M., Rekhter D., Gordon D., Phan S.H. Co-expression of a-smooth
muscle actin and type I collagen in fibroblast-like cells of rat lungs with
bleomycin-induced pulmonary fibrosis: a combined immunohistochemical and
in situ hybridization study. American Journal of Pathology 1994;145:114-125
9. Adler K.B., Low RB., Leslie K.O., Mitchell J., Evans J.N. Biology of disease:
contractile cells in normal and fibrotic lung. Laboratory Investigation 1989;
60:473--485.
10.Derdak S., Penney D.P., Keng P., Felch ME, Brown D., Phipps RP.
Differential collagen and fibronectin production by Thy 1+ and Thy 1- lung
fibroblast subpopulations. American Journal of Physiology 1992; 263:L283-
L290.
11.Hagood J.S., Mangalwadi A., Guo B., MacEwen v c«; Salazar L., Fuller G.M.
Concordant and discordant interleukin-1-mediated signaling in lung fibroblast
thy-1 subpopulations. American Journal of Respiratory Cell and Molecular
Biology 2002; 26:702-708.
12.Mclntosh J.C., Hagood J.S., Richardson T.L., Simecka J'w. Thy1(+) and (-)
lung fibrosis subpopulations in LEW and F344 rats. European Respiratory
Journa/1994; 7:2131-2138.
41
Neevia docConverter 5.1
subpopulations in fibrosis. Clinical Immunology and Immunopathology 1994;
72: 283-292.
22.Koumas L., King A.E., Critehley H.O., Kelly RW., Phipps RP. Existenee of
funetionally distinet Thy-1+ and Thy-1- human female reproduetive traet
fibroblasts . American Journal of Pathology 2001; 159: 925-935.
23.Cohen F.E., Novotny J., Sternberg M.J.E., Campbell D.G., Williams A.F.
Analysis of struetural similarties between brain Thy-1 antigen and
immunoglobulin domains. Biochemical Journa/1981 ; 195: 31-40.
24.Saalbaeh A., Aneregg U., Bruns M., Sehnabel E., Herrmann K., Haustein U.F.
Novel fibroblast-speeifie monoclonal antibodies: properties and speeificities.
Journal ofinvestigation in dermatology 1996; 106: 1314-1319.
25. Lee, W.S., Jain M.K., Arkonae B.M. Thy-1 , a novel marker for angiogénesis
upregulated by inflammatory eytokines. Circulation Research 1998, 82: 845-
851.
26.Wilborn J., Crofford L.J., Burdiek M.o. , Kunkel S.L., Strieter RM., Peters-
Golden M. Cultured lung fibroblasts isolated from patients with idiopathie
pulmonary fibrosis have a diminished eapacity to synthesize prostaglandin E2
and to express eyclooxygenase-2. Journal of Clinical Investigation 1995;
95:1861-1868.
27.0gushi F., Endo T., Tani K., Asada K., Kawano T., Tada H., Maniwa K., Sone
S. Deereased prostaglandin E2 synthesis by lung fibroblasts isolated from rats
with bleomyein-induced lung fibrosis. International Journal of Experimental
Pathology 1999; 80:41-49.
43
Neevia docConverter 5.1
35. Abe R, Donnelly S.C., Peng T., Bucala R, Metz C.N. Peripheral blood
fibrocytes: differentiation pathway and migration to wound sites. Joumal of
Immunology2001 Jun 15;166(12):7556-62.
36. Darby l., Skalli O., Gabbiani G. o-Srnooth muscle actin is transiently expressed
by myofibroblasts during experimental wound healing. Laboratory Investigation
1990; 63:21-29.
37.Zlotnik A., Yoshie O. Chemokines: a new c1assification system and their role in
immunity . Immunity 2000; 12:121-127.
38. Rossi D., Zlotnik A. The biology of chemokines and their receptors. Annual
Review of Immunology 2000; 18:217-242.
39.Moser B., Wolf M., Walz A., Loetscher P. Chemokines: multiple levels of
leukocyte migration control. Trends in Immunology 2004; 25:75-84.
40. Murdoch C., Finn A. Chemokine receptors and their role in inflammation and
infectious diseases. Bload. 2000; May 15;95(10) :3032-43.
41. Rollins B.J. Chemokines. Blood. 1997 Aug 1;90(3):909-28.
42. Lukacs N.W. Role of Chemokines in the Pathogenesis of asthma . Nature
Reviews Inmmunology2001 ; 1:108-116 .
43. Pardo A., Selman M. Idiophatic Pulmonary Fibrosis: new insights in its
pathogenesis. Intemational Joumal of Biochemistry & Cell Biology 2002;
1344:1-5.
44. Pardo A., Selman M. Molecular Mechanisms of Pulmonary Fibrosis . Frontiers
in Bioscience 2002; 7:1689-1707.
45.Gillitzer R , Goebeler M. Chemokines in cutaneous wound heal ing. Joumal of
Leukocyte Biology. 2001; 69: 513-521.
45
Neevia docConverter 5.1
	Portada
	Índice
	I. Introducción
	II. Hipótesis
	III. Objetivos
	IV. Métodos
	V. Resultados
	VI. Discusión
	VII. Conclusiones
	VIII. Bibliografía