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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA COMPORTAMIENTO VISCOELÁSTICO Y MECÁNICO EN REGÍMENES DE BAJA Y GRAN DEFORMACIÓN DE GELES FORMADOS POR MEZCLAS DE GELANA CON LECHE DESCREMADA EN POLVO T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE QUÍMICA DE ALIMENTOS P R E S E N T A M ARÍ A DE L C ARMEN OR TIZ T AF OY A MÉXICO, D.F. 2007 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Jurado asignado: Presidente MARIA DE LOS ÁNGELES VALDIVIA LÓPEZ Vocal ALBERTO TECANTE CORONEL Secretario AMELIA MARÍA DE GUADALUPE FARRÉS GONZÁLEZ SARAVIA 1er. Suplente MARICARMEN QUIRASCO BARUCH 2do. Suplente JUDITH JIMÉNEZ GUZMÁN Sitio donde se desarrolló el tema: Laboratorio 313, Departamento de Alimentos y Biotecnología. Conjunto E, Facultad de Química. UNAM Asesor Dr. Alberto Tecante Coronel Sustentante María del Carmen Ortiz Tafoya AGRADECIMIENTOS A mi asesor de Tesis, Dr. Alberto Tecante Coronel por brindarme la oportunidad de recurrir a su capacidad y experiencia científica en un marco de confianza, afecto y amistad, por compartir su conocimiento conmigo e inspirar en mi mucha admiración y por acompañarme en este camino que hoy culmina en el presente proyecto. A la I. A. Mariana Ramírez Gilly, Técnico Académico de la Facultad de Química–UNAM, por su disposición, apoyo y todo el tiempo invertido en la realización de las pruebas reológicas. A la Biol. Rosa María Picaso, Técnico Académico Asociado y a la Dra. Araceli Patrón, Jefa de la Unidad de Microscopia del Instituto de Fisiología Celular de la UNAM, por su apoyo durante las observaciones en el microscopio electrónico de barrido. A la Q. Araceli Tovar, Responsable del Laboratorio de Absorción Atómica de la Unidad de Servicios de Apoyo a la Investigación de la Facultad de Química–UNAM, por el apoyo brindado para la realización del análisis de iones metálicos. Al Subprograma 127 “Formación Básica en Investigación” de la FQ-UNAM por el apoyo brindado para la conclusión de mis estudios de licenciatura. A la M. en C. María de los Ángeles Valdivia López y a la Dra. Amelia María de Guadalupe Farrés González Saravia, por sus valiosos comentarios y acertados aportes en la corrección de este trabajo. DEDICATORIAS Primero y antes que nada, a Dios, por estar conmigo en cada paso que doy, por fortalecer mi corazón e iluminar mi mente y por haber puesto en mi camino a aquellas personas que han sido mi soporte y compañía durante todo la vida. A mi mamá por brindarme un hogar cálido y enseñarme que la perseverancia y el esfuerzo son el camino para lograr objetivos. A mi hermano Julio, que aunque no esta conmigo ahora físicamente siempre esta en mi corazón, por darme su apoyo durante todo este tiempo y por confiar en mi. A mi hermana Guadalupe, por enseñarme que siempre se puede salir adelante si de verdad se quiere. A mi tio Javier, q. e. p. d., por darme siempre un motivo para querer salir adelante. A mi hermosa sobrina Mariana por haber llegado a iluminar y alegrar mis días. A Rubén, por ser la persona que ha compartido el mayor tiempo a mi lado, porque en su compañía las cosas malas se convierten en buenas, la tristeza se transforma en alegría y la soledad no existe; por ser mi fuente de inspiración y motivación para superarme cada día más y así poder luchar para que la vida nos depare un futuro mejor y porque sin él hoy no estaría aquí. Igualmente agradecer a Serge y Christian, por brindarme su apoyo, ánimo y colaboración en todo momento y sobre todo cuando más necesitaba de ellos, sin poner nunca pretextos o darme negativas. A mis compañeros del Laboratorio 313: Laura, Melissa, Yolotli, Sonia, Rodrigo y Anayely; por su continuo y afectuoso aliento, su calidez, compañerismo y por compartir éxitos y fracasos durante la realización de los experimentos. A mis amigos de la universidad: Ana Karina, Ximena, Daniela, Paloma, Andrés, Fernando, Israel, Esteban, Karina, Martha, Sergio, Nayely, Mitzi, por permitirme conocerlos y ser parte de su vida. Por ayudarme y estar conmigo a lo largo de la carrera, y aún después... En general quisiera agradecer a todas y cada una de las personas que han vivido conmigo la realización de esta tesis, con sus altos y bajos y que no necesito nombrar porque tanto ellas como yo sabemos que desde lo más profundo de mi corazón les agradezco el haberme brindado todo el apoyo, colaboración, ánimo y sobre todo cariño y amistad. ÍNDICE DE CONTENIDO Pág. RESUMEN 1 INTRODUCCIÓN 2 1. OBJETIVOS 4 1.1. Objetivo General 4 1.2. Objetivos Particulares 4 2. COMPONENTES DE LOS GELES 5 2.1. Gelana 5 2.1.1. Estructura y mecanismo de gelificación 5 2.1.2. Estudios de transición sol-gel 8 2.2. Leche 13 2.2.1. Composición de la leche de vaca 13 2.2.2. Componentes de la leche 14 2.2.2.a. Carbohidratos 14 2.2.2.b. Lípidos 14 2.2.2.c. Sales 15 2.2.2.d. Proteínas 16 3. ESTUDIOS PREVIOS 26 3.1. Estudios de mezclas polisacáridos-proteínas lácteas 26 4. METODOLOGÍA 33 4.1. Diagrama general 33 4.2. Materiales 33 4.3. Métodos 33 4.3.1. Análisis Proximal de la leche 34 4.3.1.a. Proteínas 34 4.3.1.b. Cenizas 34 4.3.1.c. Grasa 34 4.3.1.d. Humedad 34 4.3.1.e. Carbohidratos 34 4.3.1.f. Absorción atómica 34 4.3.2. Análisis de la gelana 34 4.3.2.a. Humedad 34 4.3.2.b. Absorción atómica 34 4.3.3. Diseño del experimento (Arreglo Ortogonal) 36 4.3.4. Preparación de geles de gelana y las mezclas gelana-proteínas lácteas 38 4.3.5. Determinaciones reológicas 39 4.3.6. Determinaciones mecánicas 41 4.3.7. Microscopia electrónica de barrido 42 4.3.8. Análisis estadístico 42 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 43 5.1. Propiedades reológicas 43 5.2. Propiedades mecánicas 57 5.3. Microscopia electrónica de barrido 61 6. CONCLUSIONES 68 REFERENCIAS 70 APÉNDICE A 74 APÉNDICE B 76 APÉNDICE C 77 APÉNDICE D 78 RESUMEN Mediante pruebas de cizalla de baja amplitud, compresión uniaxial y microscopia electrónica de barrido, se estudió el comportamiento de geles preparados a 75 y 90 °C con mezclas de gelana y sólidos lácteos, usando cloruro de sodio para inducir la gelificación del polisacárido. Las formulaciones de los geles se definieron usando un arreglo ortogonal L8. El análisis estadístico mostró diferencias significativas entre ellas. A mayor concentración de gelana los geles fueron más elásticos y la temperatura afectó su comportamiento cuando se incluyeron sólidos lácteos. A 90 °C y una concentración de 5% de sólidos lácteos los geles fueron más rígidos que los correspondientes con 2% de sólidos lácteos. A 75 °C el comportamiento fue opuesto al de 90 °C, es decir, a mayor concentración de sólidos lácteos la rigidez de los geles fue menor. Los geles con sólidos de leche son térmicamente irreversibles, no así los preparados con gelana únicamente. En las pruebas de compresión, los geles con mayor concentración de gelana tuvieron esfuerzos de fractura mayores. En general las formulaciones mostraron el mismo comportamiento con la temperaturaque el observado en las pruebas reológicas. La microscopia electrónica de barrido mostró que la microestructura de los geles con sólidos lácteos es diferente de aquélla con gelana sola. En el gel con 0.5% de gelana, 5% de leche descremada en polvo, 0.5% de sal preparado a 90 °C, se apreció una microestructura formada al parecer por gelana y micelas de caseína. Además se apreciaron diferencias en la microestructura, entre los geles con las mismas formulaciones pero preparados a diferentes temperaturas. INTRODUCCIÓN Las mezclas de proteína-polisacárido son ampliamente utilizadas en la industria de alimentos debido a sus propiedades funcionales. En estos sistemas las proteínas contribuyen a la formación de emulsiones y espumas, mientras que los polisacáridos están presentes como espesantes o agentes capaces de ligar agua (Hemar et al., 2002). Las proteínas y los polisacáridos son dos tipos de biopolímeros usados en tecnología de alimentos para controlar la estructura, la textura y la estabilidad. En ningún caso, las moléculas que constituyen las proteínas pueden ser atraídas por los polisacáridos (formación de complejos) o repelidas por éstos (segregación). El carácter polielectrolítico de las proteínas de la leche y de hidrocoloides estabilizadores como la carragenina y la pectina supone que las interacciones electrostáticas juegan un rol importante en la determinación del comportamiento de las mezclas de estos biopolímeros. El total de las interacciones entre los biopolímeros está formado por el promedio de un gran número de fuerzas intermoleculares diferentes, presentes entre varios segmentos, y las cadenas laterales de dos macromoléculas. Dependiendo de las condiciones ambientales acuosas y de la distribución de los diferentes tipos de grupos (cargas, puentes de hidrógeno, enlaces hidrofóbicos, principalmente) el total de las interacciones proteína-polisacárido puede ser de atracción neta o de repulsión neta. Las interacciones de repulsión no son específicas y típicamente transitorias. Se presentan principalmente por efectos de volumen excluido y fuerzas iónicas entre cargas iguales, y éstas tienden a ser débiles excepto en un intervalo cerrado (interacciones hard-sphere) o a una fuerza iónica muy baja (unscreened electrostatic interactions). Las interacciones de atracción varían extensamente en fuerza y especificidad. El caso extremo más simple es el enlace covalente que es obviamente muy fuerte y altamente especifico (esencialmente permanente). Los enlaces no covalentes se presentan por combinaciones de interacciones iónicas y no-iónicas, ambas especificas o no-especificas, que pueden producir una total atracción entre proteína-polisacárido que puede ser débil (reversible) o fuerte (difícilmente reversible), dependiendo de las condiciones del medio ambiente acuoso como calidad del disolvente, pH y contenido de Ca2+, principalmente. La manipulación de las interacciones proteína-polisacárido ofrece la oportunidad de un control sensible de la estabilidad y de la textura en sistemas alimenticios que tienen multicomponentes en su estructura. La asociación compleja entre las proteínas y los polisacáridos cargados se presenta principalmente como resultado de interacciones electrostáticas, pero esto no significa que los polímeros deben tener cargas para que la asociación ocurra (Dickinson, 1998). Las interacciones entre proteínas y polisacáridos son importantes, pero debido a la naturaleza química y estructural de las mismas se ven afectadas en gran medida por las condiciones ambientales en las que se encuentran los componentes, principalmente los siguientes factores: a) la proporción de los componentes, b) la fuerza iónica (presencia de iones), c) el tipo de iones (mono, divalentes), d) el pH y e) la temperatura. En este trabajo se prepararon mezclas de gelana (polisacárido aniónico) con proteínas de la leche, para conocer de qué manera los factores que influyen en las interacciones proteína- polisacárido, afectan las propiedades viscoelásticas de dichas mezclas y de esta manera determinar el potencial de aplicación de estos productos en la tecnología alimentaria. El conocimiento de este comportamiento es de gran utilidad e importancia práctica. Por ejemplo, en leche con chocolate, se ha visto que la red débil provista por la adición de pequeñas cantidades de carragenina, previene la sedimentación de las partículas de cacao (Oakenfull et al., 1999). Se busca particularmente encontrar las formulaciones que produzcan sistemas térmicamente estables, para ello es necesario encontrar la relación entre la composición y el comportamiento mecánico y reológico de las mezclas. 2. COMPONENTES DE LOS GELES 2.1 GELANA La gelana es un polisacárido de descubrimiento relativamente reciente (1978) y es un agente gelificante multifuncional aun a niveles de uso muy bajos. Algunas características de la gelana son: propiedades de gelificación, compatibilidad con otros hidrocoloides, puede proveer un amplio intervalo de propiedades funcionales y reológicas dependiendo de la estructura de la molécula de gelana, la concentración de gelana y de los cationes dispersos, alta sensibilidad a sales, facilidad de modificar los atributos de textura del gel modificando la concentración del polisacárido y la de los iones que favorecen la gelificación, buena estabilidad sobre un amplio intervalo de pH en el medio (3.5 a 8.0), factibilidad de obtener geles a concentraciones tan bajas como 0.05% y de convertir sus geles de termo-reversibles a termoirreversibles con sólo modificar la concentración del polisacárido y la fuerza iónica (Rodríguez, 1997). 2.1.1 Estructura y mecanismo de gelificación La gelana es un polisacárido aniónico extracelular secretado por la bacteria Sphingomonas paucimobilis (anteriormente Pseudomonas elodea ATCC31461). La gelana consiste en unidades repetidas de un tetrasacárido (Figura 1), formado por residuos de glucosa, ácido glucurónico y ramnosa en una relación molar de 2:1:1, respectivamente, unidos en una cadena lineal [→3)-β-D-glucosa-(1→4)-β-D-ácido glucurónico-(1→4)-β-D-Glucosa-(1→4)-α-L-ramnosa- (1→]n (Nickerson et al., 2004). En su forma nativa hay aproximadamente un y medio residuos O-acilo por unidad repetida. Originalmente se pensó que el sustituyente O-acilo era un O-acetilo, dando como resultado diversas formas de la gelana a las que se referían como alto y bajo acetilo. Estudios posteriores (Kuo et al.,1986) sugieren que la gelana contiene ambos sustituyentes, el O-acetilo y el O- glicerilo en cada tercera glucosa enlazada en el polímero, la forma tentativa los asigna en la posición 6 y en la posición 2 respectivamente, predominando este último (Sanderson. 1990). Figura 1. Estructura química de la gelana nativa (Sanderson, 1990) Comercialmente la gelana ha sido clasificada en dos categorías: gelana de alto acilo (HA) y gelana de bajo acilo (LA). De las dos, sólo la gelana de alto acilo tiene grupos de glicerato y acetato en los residuos de glucosa. Las diferencias estructurales entre la gelana de alto acilo y la gelana de bajo acilo resultan en una gran disparidad en las propiedades reológicas y funcionales de estos dos productos (Huang et al., 2004). Un estudio de rayos X de una sal de Li-gelana (Chandrasekaran y Radha, 1995), mostró que la estructura molecular es una doble hélice, la cual está formada por el entrelazamiento de dos pliegues helicoidales hacia la izquierda y tres pliegues hacia la derecha con una longitud de 54.6 Å (5.64 nm) en forma paralela. Esta asociación se fortalece por puentes de hidrógeno intercadena a lo largo de la hélice, entre los grupos hidroximetil del enlace 4-glucosil de una cadena y los grupos carboxilato de la otra. Debido a la baja energía en rayos X del ión Li+, las posiciones de los cationes y las moléculas de agua no fueron reveladas. Sin embargo, una investigaciónposterior confirmó la morfología de la sal de potasio de la gelana y se reveló la posición de los iones K+, los cuales se encuentran en la vecindad del grupo carboxilato de cada unidad del tetrasacárido. Este ión está coordinado octaédricamente, rodeado por tres ligandos en una cadena (los dos átomos de oxígeno de carboxilato y un grupo hidroxilo), dos ligandos de la otra cadena (dos grupos hidroxilo) y una molécula de agua. Este arreglo confiere excelente estabilidad estructural a la doble hélice de la gelana. COO- M ... o H Oi~-t--C><p!) OH O OH >JT2 º" n La gelana requiere de la presencia de cationes para promover la gelificación (Figura 2), los cationes divalentes promueven una gelificación más fuerte y a mayor temperatura en comparación con los cationes monovalentes, aunque se ha observado que a concentraciones superiores de 1% masa se forman geles débiles en ausencia de iones (Rodríguez, 1997). Tanto los cationes monovalentes como los divalentes estabilizan la red tridimensional a través de entrecruzamiento de las dobles hélices de la gelana vía los grupos carboxilato de las moléculas de gelana. Sin embargo, los cationes monovalentes y divalentes siguen mecanismos diferentes para la gelificación de la gelana. Los cationes divalentes (M++) forman entrecruzamiento de las dobles hélices directamente (doble hélice-M++-doble hélice) mientras que los cationes monovalentes (M+) lo hacen de forma indirecta (doble hélice-M+-agua-M+-doble hélice). Como resultado de los diferentes mecanismos de gelificación, los cationes divalentes son más efectivos en la formación del gel que los cationes monovalentes, debido a que se generan enlaces hélice-hélice más cortos y con menor número de cationes involucrados, lo cual explica la capacidad de los cationes divalentes de generar geles de fuerza y textura similar a los formados a partir de cationes monovalentes pero con fuerza iónica significativamente menor (Huang et al., 2004). La gelana débilmente acilada es parcialmente soluble en agua fría, se disuelve por calentamiento de las dispersiones acuosas a temperaturas superiores a los 70 ºC, la solubilidad aumenta reduciendo el contenido iónico del agua; es decir, se requiere de temperaturas superiores conforme la fuerza iónica del medio dispersante es mayor (Rodríguez, 1997). Figura 2. Representación esquemática para predecir la conformación y la interacción funcional de la gelana gobernada por procesos de calentamiento y enfriamiento en presencia y en ausencia de cationes. Un catión monovalente se asocia con un grupo carboxilato en cada unidad repetida del tetrasacárido (Nakajima, 1996). 2.1.2 Estudios de transición sol–gel Las propiedades es disolución de la gelana no han sido todavía dilucidadas del todo. Se sabe que la temperatura de transición sol-gel depende del peso molecular, de la concentración del polisacárido así como de la concentración y tipo de iones presentes en el medio. Por otra parte como en la mayoría de los hidrocoloides con conformación helicoidal en el estado sólido, la transición sol-gel se ha identificado como una transición hebra-hélice producto de una desnaturalización y ruptura de asociaciones de cadenas, originando propiedades en solución (Rodríguez, 1997). Se ha sugerido (Miyoshi et al., 1996) que durante el enfriamiento, la transición sol-gel de gelana en disolución acuosa sin sales añadidas, examinada por medio de pruebas reológicas y térmicas, involucra la formación a cierta temperatura de hélices individuales de gelana con posterior agregación de estas hélices con el descenso de temperatura (Figura 3). A bajas concentraciones de gelana, la formación de hélices y su agregación parcial tal vez forman una estructura ordenada, pero esto no lleva a la formación de gel. De este modo la dependencia del módulo de pérdida (G”) con la temperatura para estas disoluciones muestra un cambio con la temperatura de transición hebra-hélice Tch (por las siglas en inglés). Figura 3. Representación esquemática de la estructura de la gelana, que muestra varios cambios durante el calentamiento y el enfriamiento. a) Primer paso, incremento de G” en enfriamiento, b) segundo incremento de G” en enfriamiento, c) Primer paso, disminución de G” en calentamiento, d) segunda disminución de G” en calentamiento (Miyoshi et al., 1996). Sin embargo, para disoluciones concentradas de gelana (> 2.0%) donde el número de agregados de hélices excede el valor crítico en enfriamiento, el comportamiento reológico cambia de sol a gel, y éste aparece como el segundo aumento de G” en la temperatura de transición sol-gel Tsg. En el caso de las disoluciones concentradas de gelana a concentraciones por debajo de 3.2%, el primer aumento de G” en el enfriamiento (a), casi coincide con la segunda disminución de G” durante el calentamiento (d), mientras que el segundo aumento de G” durante el enfriamiento (b) casi coincide con la primera disminución de G” durante el calentamiento (c). Con el aumento progresivo de la concentración de gelana las hélices individuales se forman e inmediatamente ocurre la agregación de las hélices en el proceso de enfriamiento, de modo que para la disolución con 3.5% de gelana, G” muestra un solo aumento en el enfriamiento. Sin embargo, en el calentamiento, la dependencia de G” con la temperatura de disoluciones de gelana con concentraciones superiores de 3.2% muestra gran histéresis con dos picos en la curva de calentamiento de DSC (Calorimetría diferencial de barrido por sus siglas en inglés). Los resultados reológicos y los térmicos muestran que para disoluciones con concentraciones superiores de 3.2%, la temperatura de transición conformacional en el calentamiento no coincide con la de enfriamiento. La gelificación de la gelana depende tanto de la naturaleza del catión como de su fuerza iónica (Grasdalen y Smidsrod, 1987). Para iones monovalentes a una I = 0.1M, la rigidez del gel se incrementa en el orden: TMA+ < Li+ < Na+ < K+ < Cs+ < H+ Para iones divalentes la dependencia es: Mg2+, Ca2+, Sr2+, Ba2+ < Zn2+ < Cu2+ < Pb2+ Mediciones de rotación óptica y espectroscopia NMR indicaron que la asociación de cadenas y la gelificación son fenómenos relacionados. La gelificación ocurre en dos pasos, llamados ordenación y asociación de cadenas. El polímero se comporta diferente en tres diferentes intervalos de fuerza iónica, I, II y III. En la zona I, (I = 0.00125 a I = 0.005) la viscosidad intrínseca disminuye con el incremento de la fuerza iónica como sucede para muchos otros polielectrolitos que experimentan la contracción sin transición conformacional. En la zona II (I = 0.005 a I = 0.05) la viscosidad intrínseca disminuye por un factor de cerca de tres, indicando alguna conformación ordenada de cadenas simples o un número limitado de cadenas. En la zona III (I = 0.05 a infinito) ocurre nuevamente una pequeña disminución en la viscosidad intrínseca con el incremento de la fuerza iónica. En otros estudios (Huang et al.,2004) se determinaron las temperaturas de gelificación de dispersiones de 1% de gelana de alto acilo que contenían cationes monovalentes, 10 a 200 mM, y cationes divalentes, 2 a 80 mM, usando análisis reológico dinámico. Se observó que la temperatura de gelificación aumenta con la concentración de los cationes. Los cationes divalentes exhiben mejores efectos en la temperatura de gelificación que los cationes monovalentes a una concentración equivalente, pero los efectos entre los cationes divalentes y los cationes monovalentes no son significativos. También se observó que las dispersiones de gelana de alto acilo exhiben un carácter de sol (G’ < G”) a temperaturas superiores de 70 ºC y un carácter de gel (G’ > G”) a temperaturas iguales o menores de 70 ºC, tanto G’ como G” son constantes y no hay un cambio abrupto en estos módulos con el cambio en la deformación. Esto indica que entre0.25 y 25% de deformación las dispersiones de 1% de gelana están dentro de la zona de viscoelasticidad lineal. A altas temperaturas (85 y 90 ºC), tanto G’ como G” disminuyen con el incremento de la deformación y después alcanzan un valor constante a bajas deformaciones (<2%). En estos experimentos, la temperatura de gelificación de los geles que contienen cationes divalentes fue más alta que aquéllos que contienen cationes monovalentes. Utilizando cationes divalentes se requirieron concentraciones más bajas de gelana que para aquéllos en donde se emplean sales de metales monovalentes, para la formación de geles. Esto significa que los cationes divalentes son más efectivos que los monovalentes. Los cationes monovalentes apantallan la repulsión electrostática de los grupos carboxilos lo que da lugar a enlaces compactos y por ende agregación de las hélices. Con la presencia de cationes divalentes forma un enlace iónico entre el átomo de oxígeno carboxilo de una molécula y con el oxígeno carboxilo de otra molécula de gelana. Por otra parte, la gelificación de disoluciones de gelana sin sales es promovida por la agregación de hélices dobles y simples de las moléculas. También se encontró que los geles poseen zonas de unión de cadenas flexibles y los extremos de éstas están enlazadas a dos zonas de unión por interacciones débiles secundarias tales como enlaces de hidrógeno. Martínez-Cruz (2002) observó que el efecto de la fuerza iónica sobre la temperatura de gelificación es que a mayor fuerza iónica mayor temperatura de gelificación. La explicación de este comportamiento sería que al existir más cadenas, la probabilidad de los entrecruzamientos aumenta, lo que reduce el tiempo de gelificación y por ende incrementa la Tg. Por otra parte la influencia que tiene la concentración de la gelana sobre la temperatura de gelificación conservando la fuerza iónica constante, es que es mayor Tg con el incremento de la concentración y el aumento de la fuerza iónica. La influencia de cosolutos en la agregación de la gelana durante la transición sol-gel fue descrita reológicamente por Nickerson et al. (2004) utilizando TTS (Superposición Tiempo- Temperatura por sus siglas en inglés) MCC (análisis modificado Cole-Cole por sus siglas en inglés) y barridos de temperatura. Sus resultados muestran que bajos niveles de cosoluto (0 a 50% masa) tienen un efecto estabilizador en la gelana durante el enfriamiento, donde la temperatura de transición sol-gel (Tgel) y la fuerza del gel se incrementan mientras aumentan los niveles de cosoluto. A temperaturas menores que Tgel, G’ es mayor que G”, como es característico en un gel. El aumento rápido en G’ significa la formación de una estructura tridimensional ordenada. Durante el calentamiento, la cantidad de histéresis térmica (la diferencia entre Tgel y la temperatura de fusión Tm) aumenta con el incremento de la concentración de sacarosa hasta llegar a ser térmicamente irreversible en la escala de tiempo experimental para a concentraciones ≥ 50% masa. La histéresis proporciona evidencia de que existe una red entálpica, compuesta de agregados ensamblados, estabilizados por interacciones polímero-polímero (i.e. regiones extremadamente densas y permanentes de entrecruzamientos) que forman zonas de unión rígidas. La presencia de zonas de unión, incluso en el caso de muestras sin adición de sal, sugiere que la red es mas estable que si estuviera presente una asociación de cadenas simples. Se cree que el perfil de enfriamiento es un proceso bimodal donde el sistema se comporta como un material simple (i.e. los mecanismos de relajación son independientes de la temperatura) en temperaturas cercanas al segundo aumento en G’, y como un material termorreológicamente complejo (i.e. los mecanismos de relajación cambian con la temperatura) a temperaturas menores. La presencia de niveles intermedios de cosoluto permite que la transición sea más extensa y por lo tanto el perfil bimodal es visible. Se propuso que a altas concentraciones de cosoluto los polímeros de gelana son extremadamente deficientes en agua y forman “partículas de gel” o “islas”. Además no se forma una red continua de gelana. 2.2 LECHE La leche de vaca para consumo humano es el producto proveniente de la secreción natural de las glándulas mamarias de las vacas sanas. Se excluye el producto obtenido 15 días antes del parto y 5 días después de éste o cuando tenga calostro (NOM-091-SSA1-1994). Es el líquido secretado por las glándulas mamarias, tanto del ser humano (leche de mujer o leche humana), como de los animales mamíferos, cuyo fin es servir de alimento al recién nacido. En alimentos, el concepto de leche se refiere únicamente a la leche de vaca, obtenida como materia prima (leche cruda) en las explotaciones agrícolas y que se ha de tratar en las centrales lecheras (Spreer, 1991). 2.2.1 Composición de la leche de vaca La leche se puede considerar un líquido blanco y opaco, aunque puede presentar una tonalidad ligeramente amarillenta. Su composición y caracteres organolépticos varían considerablemente a lo largo de los aproximadamente 300 días que dura el periodo de lactación (Spreer, 1991). En el Cuadro 1 se muestran los porcentajes aproximados de los componentes principales de la leche. Cuadro 1. Composición aproximada de la lechea Componente Contenido medio (% masa) Intervalo (% masa)b Promedio de materia seca (%) Agua 87.3 85.5 a 88.7 Grasa de la materia seca 31 21 a 38 Grasa 3.9 2.4 a 5.5 31 Extracto seco magro 8.8 7.9 a 10.0 69 Lactosa 4.6 3.8 a 5.3 36 Proteína 3.25 2.3 a 4.4 26 Caseína 2.6 1.7 a 3.5 20 Sustancias minerales 0.65 0.53 a 0.80 5.1 Ácidos orgánicos 0.18 0.13 a 0.22 1.4 Varios 0.14 1.1 a Datos de la leche holandesa típicos de la leche de razas de tierras bajas, como frisona, roja danesa, Holstein, Ayrshire. b Rara vez se superan estos valores: por ejemplo, en el 1-2% de las muestras de ordeños separados de vacas individuales, excluidos el calostro y la leche extraída muy poco antes del parto (Walstra, 1984). 2.2.2 Componentes de la leche 2.2.2.a Hidratos de carbono El hidrato de carbono característico de la leche es la lactosa, el cual es un disacárido de fórmula general C12H22O11⋅H2O. Según la posición que ocupe el grupo OH del átomo C1 se habla de un isómero α (a la derecha) y un isómero β (a la izquierda). La lactosa se presenta tanto en forma α como β existiendo en disolución acuosa entre ambas formas un equilibrio (Spreer, 1991). La lactosa ordinaria (azúcar de leche comercial), que se obtiene por cristalización por debajo de la temperatura crítica de 94 °C, se encuentra bajo la forma α- hidratada: C12H22O11⋅H2O; la forma α-anhidra se obtiene por desecación al vacío con calentamiento moderado. La forma β-anhidra cristaliza a partir de las disoluciones concentradas a una temperatura superior de 94 °C. Las condiciones de cristalización influyen sobre la forma de los cristales. La cristalización forzada y rápida (con siembra de lactosa o leche en polvo) da solamente pequeños prismas en forma de paralelepípedo; si es lenta permite observar formas variadas: pirámides, “tomahawks”. El cristal completamente desarrollado es un prisma cuya complejidad resulta de la velocidad de crecimiento que no es la misma para las diferentes caras (Alais, 1985). Entre 110 y 130 °C la lactosa pierde su agua de cristalización. Más allá de 150 °C se torna amarillenta y hacia 175 °C se oscurece y carameliza. Antes del oscurecimiento se forma un complejo entre la caseína y la lactosa (por ejemplo, por calentamiento durante 1 h a 97 °C). A mayor temperatura este complejo se destruye y aparece el oscurecimiento (e.g. durante 10 minutos a 120 °C). La descomposición de la lactosa en el curso del calentamiento de la leche, conduce a la formación de productos ácidos (Alais, 1985). 2.2.2.b Lípidos De todos los componentesde la leche, la fracción que más varía es la formada por las grasas, que oscila entre el 3.2 y 6%. La materia grasa se encuentra en forma de glóbulos grasos de forma esférica que tienen un tamaño de 2.5 a 5 mm y constan de un núcleo y una envoltura. El núcleo de los glóbulos grasos está compuesto por triglicéridos formados por un éster de un alcohol trivalente, el glicerol o propanotriol, con ácidos grasos. La envoltura denominada también membrana es una formación compleja formada por varias capas. La capa que envuelve directamente al núcleo está formada por triglicéridos de alto punto de fusión que penetran en la capa de fosfolípidos. Los fosfolípidos constan principalmente de lecitina (factor importante para la síntesis del sistema nervioso) y de cefalina. No obstante también existe vitamina A y colesterol que a su vez, y por sus grupos hidrofílicos, establecen una unión con la zona hidratada de la siguiente capa. La capa de fosfolípidos está envuelta por otra capa formada por la denominada proteína de membrana, cuya estructura recuerda la de las globulinas y que ocasionalmente contiene euglobulina. A la proteína de membrana y al agua unida a la capa hidratada se les atribuye una gran influencia sobre la capacidad de dispersión de la grasa en la leche (Spreer, 1991). La cristalización de la materia grasa conduce a mezclas “isomorfas”. A causa del fenómeno de la intersolubilidad se forman cristales mixtos que contienen no sólo uno, sino varios glicéridos que presentan una cierta similitud química: número de carbono no muy diferente y tipo saturado o insaturado. La cristalización es un fenómeno de dos fases: la nucleación y el crecimiento del cristal. La presencia del núcleo inicia la cristalización a través de una nucleación heterogénea. En la materia grasa láctea no es necesario realizar una refrigeración importante para poner en marcha la cristalización; en los glóbulos grasos no ocurre lo mismo, ya que en este caso se exige una “sobrerrefrigeración” (Alais, 1985). 2.2.2.c Sales En el Cuadro 2 se muestran las sales más importantes de la leche. No todas las sales se encuentran en disolución ya que las micelas de caseína contienen fosfato cálcico sin disolver y un poco de citrato. Al primero se le denomina corrientemente “fosfato cálcico coloidal”. Algunos cationes y especialmente el Ca2+ y el Mg2+ se asocian con las proteínas cargadas negativamente, también pueden encontrarse unidas a las proteínas pequeñas cantidades de iones (e.g. Cl-). La leche está siempre saturada de fosfato cálcico, gran parte de la cual no está disuelto. Si todo el fosfato cálcico lo estuviera, la concentración hipotética sería 2 x 10-4 mM. La concentración actual es aproximadamente 10-5 mM, en consecuencia la leche está probablemente sobresaturada de fosfato dicálcico. De hecho está incluso más sobresaturada de Ca4H(PO4)3 (fosfato octacálcico) y de Ca5OH(PO4)3 (hidroxiapatita). Expresado en mol por mol de caseína hay aproximadamente 18.0 mol de calcio asociados con las micelas de caseína; 1.4 de Mg+2; 2.0 de K+; 0.9 de Na+; 9.1 de fostato y 0.7 de citrato (Walstra, 1984). Cuadro 2. Composición salina aproximada de la leche. Catiónicos mmol/kg Aniónicos mmol/kg Sodio (23)a 17 a 28 Cloruro (35.5) 22 a 34 Potasio (39.1) 31 a 43 Carbonatob (60) ≈2 Calcio (40.1) 26 a 32 Sulfato (96.1) ≈1 Magnesio (24.3) 4 a 6 Fostafoc (95) 19 a 23 Aminas ≈1.5 Citratod (189) 7 a 11 Ácidos orgánicose ≈2 Esteres fosfóricosf 2 a 4 Nota: Las cifras incluyen la mayoría de los datos bibliográficos, excluidos los del calostro, leche del final de la lactación y leches mastíticas. Las muestras de vacas individuales presentan una mayor variación. a (peso atómico o el del radical) b Incluido el C2. c Sólo el inorgánico. d Aproximadamente el 1% es isocitrato. e Distintos del ácido cítrico. f Algunos contienen también un grupo básico (Walstra, 2001). 2.2.2.d Proteínas Las proteínas más simples de la leche son las holoproteínas, que no contienen más que α- aminoácidos, las más importantes del lactosuero son: β-lactoglobulina y α-lactoalbúmina. Las proteínas más abundantes de la leche son las fosfoproteínas: caseína α y caseína β; la caseína κ es una fosfoglicoproteína. En la leche, las proteínas tienen una estructura definida, que puede modificarse bajo la acción de diversos tratamientos aplicados en el laboratorio o en la industria, especialmente calentamiento a más de 70 ºC, también por reactivos desnaturalizantes variados como ácidos, álcalis, urea y detergentes. La desnaturalización es una modificación sin ruptura de los enlaces covalentes, ni separación de fragmentos que consiste en una ruptura de enlaces que aseguran las estructuras secundarias y terciarias, seguida de reagrupamiento que conduce a una nueva conformación. La disminución de la solubilidad y la pérdida de la actividad son las consecuencias de una modificación estructural profunda de la molécula, que en general, es irreversible y corresponde con el paso de un estado de orden superior a un estado de orden inferior. Este fenómeno parece que no concierne a las caseínas. Las sales añadidas a las disoluciones de proteína tienen efectos variables según su naturaleza y concentración. Si la concentración es pequeña, las sales no desnaturalizantes se disocian en iones, que se ligan a la molécula proteínica, aumentando así su afinidad por el agua. Por el contrario, una fuerte concentración de sal cuyo anión se encuentra fuertemente cargado (sulfato, cloruro) orienta las moléculas de agua y de ello resulta una competición entre estos iones y los grupos polares de las proteínas, lo que provoca la floculación. La floculación puede lograrse también por la adición de un disolvente miscible con el agua (e.g. alcohol o acetona), pues disminuye la constante dieléctrica y reduce la atracción de los grupos polares por el agua (Alais, 1985). Caseínas La caseína entera es el complejo proteínico fosforado, de carácter ácido, que precipita a pH 4.6 (Alais, 1985). Las caseínas son hidrofóbicas; tienen una carga bastante elevada, muchos residuos de prolina y pocos de cistina. Sólo forman hélices α cortas y casi no presentan estructura terciaria. Esto no significa que las moléculas estén enrolladas al azar, pero en disoluciones diluidas las cadenas están parcialmente desplegadas. Como quedan expuestos muchos grupos hidrofóbicos, se establecen fácilmente enlaces hidrofóbicos entre las moléculas. Por ello, las caseínas muestran amplias asociaciones, tanto en el interior de una misma molécula como entre ellas. Las moléculas de caseína prácticamente no pueden ser desnaturalizadas porque casi no tiene estructura terciaria ni secundaria. Por esta razón, la caseína no se vuelve insoluble por el calentamiento a temperaturas inferiores de 100 °C y sí lo hace a temperaturas más altas, aunque a esas condiciones pueden tener lugar un gran número de reacciones. La alta carga de las proteínas se debe en parte a los grupos fosfato, que están en su mayoría esterificados con los residuos de serina; a pH próximo al de la leche, se encuentran fundamentalmente ionizados. Los grupos ligan fuertemente iones divalentes como el Ca2+, especialmente a pH más alto. Por esta razón, las caseínas αs1 y β precipitan a concentraciones de actividad de calcio iónico bastante bajas (Walstra, 2001). En la leche, casi todas las caseínas están presentes en forma de agregados que se conocen como micelas. Cada micela contiene diferentes moléculas de caseína: αs1-, αs2-, β- y κ-caseína, la última casi exclusivamente localizada en la superficie de la micela de caseína y cuya proporción molar es de 4:1:4:1.6 (van Vliet, 2004). Las dos fracciones mas abundantes, αs1 y β, o sea el 70% del conjunto, forman un bloque insoluble en presencia de calcio. La caseína κ es una fracción menor (13%) que permite la existencia del estado disperso. Los pesos moleculares están muypróximos unos a otros; se trata de pequeñas proteínas, pero estos “monómeros” no existen en disolución mas que en condiciones particulares, especialmente en medio alcalino (Alais, 1985). La caseína ααααs1 presenta la carga más alta y el mayor contenido de fosfato, se asocia fuertemente en dos fases a pH 6.6 y una fuerza iónica de 0.05 M. Existen diversas variantes de la caseína ααααs2 que difieren en el número de ésteres de fosfato, contienen dos residuos de cisteína (que forman puentes disulfuro –S-S-) y ningún grupo carbohidrato. Son bastantes sensibles al Ca2+. La caseína ββββ es la más hidrofóbica y contiene un gran número de residuos de prolina, además la carga esta heterogéneamente distribuida. Las micelas están formadas por 20 o 30 moléculas, cuya asociación es muy dependiente de la temperatura y de la fuerza iónica. La caseína κκκκ es muy distinta del resto de las caseínas. Sólo contiene dos residuos de cisteína capaces de formar puentes disulfuro intermoleculares y, por esta razón, la caseína κ se encuentra en la leche en forma de oligómeros que contienen 5-11 monómeros. Aproximadamente dos tercios de las moléculas contienen un grupo carbohidrato que está esterificado a una de las treoninas y tiene galactosamina, galactosa, y uno o dos residuos de ácido N-acetil-neuramínico; cada uno de estos grupos puede tener una o dos cargas negativas y son bastante hidrofílicos. La caseína κ se asocia fuertemente para formar micelas que contienen más de 30 moléculas, entre las que se incluyen grupos hidratos de carbono protuberantes. La asociación se parece de alguna forma a la de la caseína β (Walstra, 2001). Como consecuencia de sus características estructurales diferenciales, existe una serie de propiedades reservadas a la κ-caseína, que condicionan sus interacciones y su funcionalidad: (1) Interacción con las caseínas sensibles al calcio para formar micelas, ya que actúa estabilizándolas frente al Ca2+; (2) Presenta estructura anfipática, pero con un dominio polar inerte que no precipita en presencia de Ca2+. (3) Presencia de una secuencia de reconocimiento específica para la proteolisis limitada por la enzima quimosina, que permite la eliminación selectiva del dominio polar, induciendo la coagulación de las micelas. Estas tres características morfofuncionales son la base que permite la formación de las micelas de caseína nativa por interacción de las caseínas en presencia de calcio, regulando la estabilidad micelar en función de determinados factores desestabilizantes, que determinan el estado sol/gel de la leche (Castillo, 2001).Las micelas de caseína son muy estables en su ambiente natural. Las micelas de caseína son estructuras sólidas y esponjosas de tamaño coloidal dispersas en un medio acuoso (hidrosol), que por presentar gran variabilidad de tamaño se clasifican como sistema polidisperso. Las micelas de caseína son básicamente de naturaleza proteínica (92%), si bien contienen 8% de sales, principalmente fosfato cálcico y cantidades significativas de Mg2+ y citrato. Estos componentes iónicos se conocen conjuntamente como fosfato cálcico coloidal o CCP (Castillo, 2001). La estabilización interna de la micela es debida principalmente a interacciones específicas de caseínas con fosfato cálcico coloidal, a la hidrofobicidad y a repulsiones electrostáticas (Schorsch, 2000). Recientemente, se ofrece una visión clara y rigurosa de las interacciones tan peculiares que presentan las caseínas entre sí y con los iones de calcio y las sales cálcicas, que contribuyen a la formación de la micelas de caseína y definen sus propiedades funcionales. Las estructuras primaria y terciaria singulares de estas proteínas, dan lugar a la formación de agregados (clusters) aniónicos en las “caseínas sensibles al calcio”, mientras que en la κ-caseína, “insensible al calcio” sólo aparece un único residuo fosforilado. La unión del Ca2+ a los agregados aniónicos neutraliza la carga en dichas regiones, con la consiguiente deshidratación, que altera el equilibrio de las interacciones hidrofóbicas y de fuerzas de repulsión electrostática, facilitando su interacción (Castillo, 2001). La estructura primaria de las caseínas revela otra característica singular de estas proteínas, la distribución de residuos hidrofóbicos y polares. La agrupación de los residuos polares y de los hidrofóbicos en regiones separadas de la secuencia primaria sugiere la formación de distintos dominios de naturaleza polar e hidrofóbica, que genera una estructura anfipática. En disoluciones aisladas de caseínas, tanto las β-caseínas como las κ-caseínas se autoasocian para formar grandes complejos esféricos muy similares a una micela de detergente. Los dominios polares de las caseínas sensibles al calcio presentan una alta proporción de residuos fosfoserilo que, al pH de la leche, portan una gran carga negativa neta. La κ-caseína, insensible al calcio, es también muy anfipática por la presencia de distintos dominios individuales hidrofóbicos y polares, sin embargo, el dominio polar de esta caseína no contiene ningún agrupamiento aniónico (Castillo, 2001). En ausencia de caseína κ y presencia de calcio, no se forman micelas con las otras caseínas; los caseinatos insolubles precipitan. La caseína κ actúa como hidrocoloide protector; se dice que tiene “poder estabilizador”, impidiendo la precipitación de la caseína αs hasta la relación κ/αs = 1/10. El calcio contribuye a la formación de micelas cuando está presente en pequeña proporción, como en la leche (0.03 M). Una concentración diez veces mayor, provoca, por el contrario, la disolución del complejo Ca-αs-β-κ, y la precipitación de las caseínas sensibles al calcio. Por muchas décadas, se desarrolló un modelo para la estructura de la micela de caseína el cual fue aceptado por muchos autores. Varios trabajos contribuyeron con este modelo. El modelo está basado en un amplio intervalo de observaciones y consideraciones. Algunos elementos importantes del modelo son: (1) La micela de caseína es una esfera rugosa; (2) está construida por pequeñas unidades, llamadas submicelas, las cuales contienen principalmente caseína; (3) las submicelas varían en su composición, hay dos tipos principales, el sobre todo compuesto de α's y β caseínas, el otro de α’s y κ caseínas; (4) las submicelas pueden unirse por medio de pequeños agregados (clusters) de fosfato de calcio; (5) las submicelas se agregan de esta manera hasta que forman la micela, donde la κ caseína está afuera y (6) consecuentemente, los cambios moleculares del C terminal de la κ caseína son las protuberancias de la superficie de la micela, formando una “capa pilosa” que previene – por repulsiones estéricas y electrostáticas – cualquier agregación de las submicelas. Figura 4. Modelo esquemático, (seccionado transversalmente), de una micela de caseína (Walstra, 1999). La capa pilosa es responsable también de la estabilidad de la micelas contra la floculación. Esto nos lleva a la Figura 4 (Walstra. 1999), en la que se observa un modelo basado en otro previamente propuesto por van Dijk que es básicamente un modelo submicelar tradicional con la salvedad de que el CCP se encuentra dentro de las submicelas en lugar de actuar como cemento intermicelar (Castillo, 2001). Las micelas son partículas bastante estables en su forma y en su volumen, cuando el pH no varía. La pasteurización y la ebullición de la leche no las modifican sensiblemente. A las temperaturas clásicas de esterilización (120 ºC, 15 min.) se producen desintegraciones y hay formación de fibrillas. La homogeneización de la leche bajo presión elevada, lo mismo que la concentración de la leche por evaporación al vacío, provoca deformaciones de las micelas y la aparición de aglomerados; además en la leche completa se produce un fenómeno importante: el enlace con los glóbulos grasos; el complejo prótido-lípido que seestablece en estas condiciones tiene interés en las queserías que utilizan leche condensada. Para los biofísicos las micelas de caseína poseen una apreciable estabilidad, que las distingue de los demás sistemas proteínicos conocidos. Es cierto que persisten en la leche tras una larga conservación y con los tratamientos térmicos habituales. Sin embargo, es preciso hacer constar que el estado micelar puede destruirse fácilmente. Las principales causas de inestabilidad son: (1) El calentamiento bajo presión a temperatura elevada, por ejemplo a 130 ºC durante 10 o 15 minutos. La Figura 5 muestra la relación entre la temperatura y la duración del calentamiento que provoca la floculación de la caseína nativa, en la leche de vaca normal; (2) La presencia de iones minerales tiene una concentración crítica, que provoca un descenso de la curva de la Figura 5. A concentraciones relativamente débiles (hacía 0.2 M), el cloruro de sodio destruye las micelas y precipita parcialmente la caseína, sin fraccionamiento, a la temperatura ordinaria; (3) El descenso de la temperatura modifica la estructura de las micelas; el enlace de la caseína β es el más frágil y puede liberarse en el plasma β-caseinato de calcio soluble, al mismo tiempo que fósforo y calcio inorgánicos. De ello se sigue una disminución del tamaño de las micelas y una mayor hidratación. Se aumenta la estabilidad de la fase micelar de la leche; se manifiesta especialmente por el alargamiento del tiempo de coagulación por el cuajo, en las condiciones de la quesería (Alais, 1985). Figura 5. Floculación de la caseína nativa, en función de las condiciones de calentamiento de la leche de vaca fresca y normal (pH 6.5-6.7, concentración de calcio 26-32 mmol/kg) , valores medios (Alais, 1985). La mayoría de los geles a base de leche dependen de una de las siguientes características del sistema de la caseína: (1) insolubilidad en la región del punto isoeléctrico (ca. pH 4.6) el cual es muy utilizado en la producción de leches fermentadas y algunos quesos frescos; (2) inestabilidad en presencia de Ca2+ seguida de una proteólisis específica por la acción de proteasas, lo cual es muy utilizado en la manufactura de muchos quesos (Fox, 1990). Proteínas del suero Las proteínas del lactosuero forman una fracción compleja. Son las sustancias no dializables contenidas en el “suero isoeléctrico” (obtenido tras la precipitación de la caseína a pH 4.7) y en el “suero de la cuajada” (aunque éste también contiene caseinoglicopéptido). Si se exceptúa una parte de las glicoproteínas, las proteínas del lactosuero precipitan casi en su totalidad con el ácido tricloracético al 12%. Estas proteínas representan 17% de las materias nitrogenadas de la leche de vaca. Esta proporción es mucho más elevada en la leche de los mamíferos monogástricos; en la leche humana se acerca al 50% (Alais, 1985). Las proteínas principales del suero son: β-lactoglobulina y α-lactoalbúmina. La β-lactoglobulina es una proteína globular de 162 residuos de aminoácidos en una cadena simple, mientras que la α-lactoalbúmina es una proteína globular de 123 residuos de aminoácidos con una conformación muy estable entre pH 5.4 y 9 (Bottomley, 1990). En la leche de vaca la ββββ-Lactoglobulina es la proteína del suero más abundante (2.5 a 3.1 g/L). Es una pequeña proteína cuyo peso molecular es próximo a 18,360. Este peso es de hecho el de un monómero; en la zona de pH que va de 3 a 7 se encuentra un dímero poco asociado que justifica el valor de PM = 36,000. Se conocen cuatro variantes genéticas de la β-lactoglobulina de la leche de vaca. Las variantes A y B son las más frecuentes. Muestran diferencias notables en sus propiedades fisicoquímicas; la variante B es mucho más soluble en el agua en el punto isoeléctrico (B = 3.1 y A = 0.6 g/L). La estructura primaria de la β-lactoglobulina se conoce completamente. La molécula está formada por una sola cadena peptídica de 162 restos de aminoácidos. La cadena está replegada sobre sí misma, estando asegurada la estructura terciaria por dos puentes S–S y queda un grupo sulfhidrilo libre. A la temperatura ordinaria de la leche, la β-lactoglobulina no parece estar ligada a otras fracciones proteicas, por el contrario, en el curso del calentamiento, forma un complejo con la caseína κ. Este complejo es más estable que sus componentes separados; el enlace se realiza mediante un puente disulfuro. La β-lactoglobulina es el principal portador de grupos sulfhidrilo, que son modificados o separados en el curso de la desnaturalización y que intervienen en la formación del “gusto cocido” de la leche tratada térmicamente. La αααα-lactoalbúmina es el componente proteínico más característico del suero lácteo, pues parece estar presente en la leche de todos los mamíferos. Desde el punto de vista funcional, la α-lactoalbúmina es el factor de regulación de un sistema enzimático original: la proteína A, que es en sí misma una enzima que transfiere galactosa sobre la glucosamina (para formar lactosamina u otros derivados); la proteína B es idéntica a la α-lactoalbúmina; se enlaza con la proteína A por simple adsorción y tiene el papel de modificador de la especificidad; las dos proteínas reunidas transfieren la galactosa sobre glucosa, asegurando así la síntesis de la lactosa. La α-lactoalbúmina es una pequeña proteína de un peso molecular próximo a 14,200 que contiene 4 puentes –S–S–. Se ha observado la presencia de dos variantes genéticas A y B. La variación no se refiere más que a un aminoácido. Esta proteína es considerablemente rica en triptofano: cuatro restos por mol, o sea, alrededor de 6%. Puesto que la α-lactoalbúmina no contiene grupos –SH libres no debería poder ligarse a otras proteínas por puentes disulfuro; a pesar de ello, ciertos autores admiten que puede tomar parte en la formación de complejos con la caseína κ, como la β-lactoglobulina, lo que implicaría una modificación estructural (Alais, 1985). La gelificación de las proteínas del suero es el resultado de dos tipos de interacciones; físicas (electrostáticas e hidrofóbicas) y químicas (puentes disulfuro) entre las moléculas constitutivas de la proteína. La desestabilización del plegamiento terciario nativo de las proteínas aumenta sus interacciones a un nivel que cause en última instancia la formación de una red y gelificación estables. La desestabilización puede inducirse por la adición de químicos, presión hidrostática, calentamiento, enfriamiento e hidrólisis enzimática parcial. Cada uno de estos procesos induce un parcial o total desdoblamiento resultando en la agregación de las proteínas y finalmente la formación del gel (van Vliet, 2004). 3. ESTUDIOS PREVIOS 3.1 ESTUDIOS DE MEZCLAS POLISACÁRIDOS–PROTEÍNAS LÁCTEAS No existen en la literatura abierta trabajos en los que se reporten las propiedades de mezclas gelana-proteínas lácteas. Debido a esto se presentan antecedentes de sistemas similares a los de estudio. Schorsch et al. (2000), estudiaron el comportamiento del sistema micela de caseína pura/κ- carragenina/agua usando técnicas de turbidimetría, microscopia y reología. El diagrama de fases de estos sistemas fue establecido para temperaturas de 5 y 60 ºC y se encontró que existen diferencias significativas entre ellos en relación con la concentración de carragenina. A 5 ºC, los resultados muestran que, dependiendo de la cantidad relativa de cada componente, el sistema se comporta como un líquido, que puede ser estable o inestable. Se sugiere la absorción del polímero en la micela de caseína a bajas concentraciones de carragenina. Este fenómeno es seguido de un agotamiento a altas concentraciones. A 60 ºC, cuando las cadenas de carragenina adoptan una conformación de anillo, ocurre un fenómeno llamado “agotamiento por floculación” (depletion-floculation) cuando la concentración de carragenina es cercana a 0.3% masa. Losexperimentos muestran claramente que el estado conformacional de la macromolécula de carragenina determina el comportamiento del sistema caseína/carragenina, sugiriendo una diferencia especialmente en relación con las micelas de caseína. El efecto de sinergia a pH 6 a 7 es atribuido a las interacciones electrostáticas entre una región con carga predominantemente positiva en la cadena peptídica de la κ-caseína y una región con carga negativa de los grupos sulfato de la κ-carragenina. La interacción ocurre a pesar de que la proteína está en su punto isoeléctrico y lleva una carga neta negativa. La carragenina en forma de hebra se fija por adsorción a las micelas de caseína y en la transición hebra-hélice induce la formación de una red mezclada vía dobles hélices. En la Figura 6, en el esquema a 60 °C, se puede observar que mientras la concentración de caseína excede la concentración de las hebras de carragenina, el sistema tiene el comportamiento de una dispersión normal de caseína y permanece estable y cuando hay un incremento drástico en la concentración de carragenina (cerca de 0.3% p/p) puede haber adsorción de la carragenina en las micelas de caseína, pero el exceso de cadenas de carragenina libres, es suficiente para agotar las micelas de caseína y guiarlas a la precipitación o al agotamiento por floculación. Figura 6. Representación esquemática de las interacciones de las micelas de caseína y la κ-carragenina a 60 y 5 °C (Schorsch, 2000). Mientras, en el esquema para 5 °C, las cadenas de κ-carragenina pueden formar hélices y experimentar asociaciones. A esta temperatura, cuando la carragenina puede asociarse en agregados, hay una competencia entre las interacciones carragenina/carragenina y las interacciones carragenina/caseína lo que lleva a la adsorción en la superficie. El comportamiento del sistema es controlado y manejado por cantidades relativas de proteína y carragenina y por dos situaciones extremas: (1) A bajas concentraciones de carragenina (menos de 0.03% masa), el sistema siempre es un líquido, pero el líquido puede ser estable o inestable dependiendo de la concentración de proteína; (2) Si la concentración de carragenina aumenta, el agotamiento por floculación todavía ocurre pero el sistema se atrapa en estado de gel. En este estado, ha sido claramente demostrado que, en todos los niveles de carragenina cercanos a 0.05% masa, los sistemas en gel, llevan a la formación de una red de carragenina. Las partículas de proteínas dispersas se incorporan dentro de la red de carragenina como “relleno” de refuerzo. Las partículas son inmovilizadas, y así se estabiliza contra la sedimentación, por medio de esto la fuerza del gel de carragenina aumenta. Recientemente (Sedlmeyer et al., 2003) estudiaron las características de geles hechos a partir de mezclas de proteínas lácteas y κ/ι carragenina, variando en estas cuatro factores: la relación proteínas de suero-caseína, la concentración de carragenina y la adición de KCl y CaCl2 en el sistema lácteo. Estas características se determinaron por medio de reometría oscilatoria. En el modelo en el que se usaron todos los ingredientes como parámetros se observó que el módulo de almacenamiento G’ es linealmente dependiente de los ingredientes minoritarios, KCl y CaCl2. La influencia de la concentración de carragenina muestra un comportamiento no lineal. Se mantuvo un contenido total de proteína constante e igual a 5%, el incremento lineal de G’ debido a las cantidades altas de caseína se puede explicar por el conocimiento de las interacciones caseína y carragenina. Estas interacciones fueron estudiadas posteriormente por Spagnuolo et al. (2005), quienes mencionan dos propuestas para explicar las interacciones de la κ-carragenina con las micelas de caseína. La primera propuesta postula que las cargas negativas de la κ-carragenina interaccionan con la región cargada positivamente de la κ-caseína y debido a esto la κ-carragenina se adsorbe en la superficie de la micela de caseína. Sin embargo, la superficie de la micela está cargada negativamente y estabilizada estéricamente por la porción del glicomacropeptido de la caseína, la llamada “capa pilosa”. Así, por razones estéricas y electrostáticas, la prevención de la separación por la absorción de la κ-carragenina a la superficie de la micela parece inusual. La segunda propuesta postula que la separación se previene vía la formación de un gel débil de κ- carragenina, que mantiene las micelas de caseína suspendidas, aunque las concentraciones que se requieren para estabilizarlas están por debajo de la concentración crítica de gelificación (0.03%). Figura 7. Micrografías de las micelas de caseína, κ-carragenina y su mezcla (Spagnuolo et al., 2005). En este trabajo se estudió el mecanismo por medio del cual la κ-carragenina estabiliza las micelas de caseína y se previene la separación de las fases, las interacciones se observaron por medio de micrografías (FE-SEM, Figura 7). Los datos sugieren que la κ-carragenina en su forma de hélice interactúa con la superficie de la micela de caseína, quizá por el grado de sulfatación y el incremento en la densidad de cargas cuando está en la forma de hélice. Los experimentos de separación de fases (en los que se utilizó goma algarrobo, como polisacárido estabilizante) sugirieron que tanto la interacción de κ-carragenina con las micelas de caseína como la agregación de la hélice de κ-carragenina se requieren para prevenir la separación de la micela de caseína y para suministrar estabilidad visual. La interacción de las hélices de κ- carragenina con la superficie de las micelas de caseína también parece razonable cuando el polímero está en la forma helicoidal rígida puesto que las micrografías sugieren que la superficie de la micela de caseína es porosa. Por lo tanto la habilidad de un polímero de 20 nm de diámetro para penetrar la capa pilosa y adsorberse en la superficie parece posible. Los autores sugieren que la macroestructura para estos sistemas se estabiliza después de la pasteurización y durante el enfriamiento (Figura 8). Cuando la temperatura es cercana a la transición hebra-hélice, (A) la incompatibilidad existe entre las micelas de caseína y el polisacárido primario (goma algarrobo), pero también entre las micelas de caseína y la carragenina, por esto la κ-carragenina es forzada hacia el espacio interparticular de las micelas de caseína. La incompatibilidad entre los polisacáridos no adsorbidos conducirá, vía el mecanismo de agotamiento por floculación, a la exclusión de la κ-carragenina, resultando en la presencia de κ-carragenina en el suero alrededor de los microdominios (B). Una vez que la temperatura disminuye y la doble hélice se forma, ocurren las interacciones entre la κ- carragenina y las micelas de caseína en la periferia de los microdominios (C). Subsecuentemente, la agregación de las hélices estabiliza los dominios y los previene de la coalescencia. Por lo tanto, se inhibe la separación de fases (D). En otro trabajo (Trčková et al., 2004), se estudió la influencia de la concentración de las proteínas lácteas en las propiedades reológicas de la carragenina (0.1 a 0.5%) en permeado (0% de caseína) y retenido (2.7 a 8.3% de caseína). Estos últimos fueron preparados vía ultrafiltración de leche homogeneizada (cerca de 1.6% de grasa). Las propiedades viscoelásticas fueron determinadas por medio de reometría dinámica oscilatoria y por la medición de la fuerza de fractura y profundidad de fractura de los geles. Se encontró que en presencia de las micelas de caseína, la longitud del intervalo de viscoelasticidad aumenta de 1 Pa (0% masa de caseína) a 200 Pa (8.3% masa de caseína). A bajas concentraciones de carragenina y sin caseína (en permeado) se formaron geles débiles con módulos de almacenamiento G’ bajos y un alto ángulo de desfase δ. El módulo de almacenamientoG’ mostró una dependencia lineal con la concentración de carragenina y una dependencia cuadrática con la concentración de proteína. Figura 8. Diagrama esquemático del mecanismo de estabilización de la κ-carragenina. (A) A altas temperaturas la κ-carragenina está en la conformación de hebra y se distribuye a través de la disolución. Las micelas de caseína están concentradas por la incompatibilidad con el algarrobo. La κ-carragenina tal vez está atrapada dentro de estos dominios. (B) Cuando la relación de las micelas de caseína/hebras de κ-carragenina dentro de los dominios comienza a ser desfavorable hay una exclusión de la κ-carragenina vía agotamiento por floculación o agregaciones segregativas. (C) Una vez que la temperatura desciende, la κ-carragenina, ahora en la periferia de los dominios, cambia su conformación a la forma helicoidal. (D) Las interacciones entre las dobles hélices de κ-carragenina y las micelas de caseína en la periferia de los dominios ocurren y subsecuentemente las interacciones entre las dobles hélices de la κ-carragenina vecinas a los dominios estabilizan éstos contra la floculación y la coalescencia previniendo la eventual separación. El ángulo de desfase disminuyó en presencia de proteínas lácteas (a tan δ ≈ 0.12). La fuerza de fractura del gel aumentó con la concentración de carragenina y caseína y fue posible concluir que la fuerza de fractura del gel aumenta con la concentración de carragenina para 0.0 a 5.7% masa de caseína linealmente y para 8.3% masa no linealmente. La profundidad de fractura disminuye con altas concentraciones indicando que el gel comienza a ser más frágil. En un estudio previo (Hemar et al., 2002), se observó el comportamiento reológico de mezclas de proteínas de leche comercial/κ-carragenina en disoluciones acuosas a pH neutro. Se consideraron cuatro tipos de ingredientes de leche; leche descremada en polvo, concentrado de proteína de leche, caseinato de sodio y aislado de proteínas del suero. Observaciones en microscopia confocal láser, las mezclas de κ-carragenina con leche descremada en polvo, concentrado de proteína de leche, y caseinato de sodio mostraron separación de fases, pero no se advirtió la separación de fases en mezclas que contenían aislado de proteínas de suero. Para concentraciones de κ-carragenina superiores de 0.5%, la viscosidad de las mezclas a bajas velocidades de cizalla aumentó marcadamente en el caso de la adición de leche descremada en polvo y concentrado de proteína de leche, pero no hubo cambio por la adición de caseinato de sodio y aislado de proteínas del suero. Para concentraciones de κ-carragenina de 1 a 2.5%, se realizaron mediciones reológicas a baja y gran deformación, en geles de proteínas de leche/κ-carragenina, mostrando que la leche descremada en polvo, el concentrado de proteína o el caseinato de sodio mejoran marcadamente la fuerza de los geles resultantes, pero el aislado de proteínas del suero no tiene efecto sobre la fuerza del gel. Estos estudios muestran que la interacción entre un polisacárido aniónico y las proteínas de la leche es determinante para el desarrollo de las propiedades fisicoquímicas y particularmente las propiedades reológicas. Por ello se espera que en el caso de nuestro estudio tales interacciones jueguen también un papel importante. 1. OBJETIVOS 1.1 GENERAL Desarrollar formulaciones térmicamente estables de mezclas gelana-proteínas lácteas, por medio de un arreglo ortogonal y evaluar el comportamiento reológico y mecánico para conocer el efecto de la concentración de gelana, la concentración de sólidos lácteos y la temperatura. 1.2 PARTICULARES 1. Examinar el comportamiento viscoelástico de geles de mezclas gelana-proteínas lácteas preparados con diferentes concentraciones de polisacárido y sólidos lácteos para conocer el intervalo de propiedades mecánicas de dichos geles. 2. Examinar las propiedades viscoelásticas de los geles de las mezclas de gelana-proteínas lácteas sometidos a una cinética preestablecida de calentamiento-enfriamiento para determinar su estabilidad térmica. 3. Conocer la temperatura de transición sol-gel de geles de mezclas gelana-proteínas lácteas preparados con diferentes concentraciones de polisacárido y sólidos lácteos mediante determinaciones reológicas para determinar el efecto de las proteínas lácteas sobre dicha temperatura en relación con la gelana sola. 4. Conocer el comportamiento mecánico de los geles bajo un régimen de compresión uniaxial para conocer su resistencia a la deformación y la cantidad de energía necesaria para fracturarlos. 1 4. METODOLOGÍA 4.1 DIAGRAMA GENERAL Figura 9. Diagrama general de la investigación 4.2 MATERIALES Gelana (Kelcogel grado alimenticio, CPKelco, Lote No. 07254A, USA), leche en polvo descremada (Altecsa, México), cloruro de sodio cristal (J. T. Baker, Lote No. A51C71, USA) y agua desionizada. 4.3 MÉTODOS Previo a la mezcla de los componentes fue necesario conocer la composición proximal de la materia prima. Para el caso de la gelana, sólo fue necesario conocer su humedad y contenido de iones mono y divalentes, principalmente sodio, potasio, calcio y magnesio. En el caso de la leche descremada fue necesario conocer su composición (Proteínas, grasa, hidratos de carbono, humedad, cenizas y contenido de iones mono y divalentes). Caracterización de la materia prima: • Leche (Análisis Proximal). • Gelana (Humedad, contenido de iones mono y divalentes). Preparación de los geles con las formulaciones obtenidas del AO. Pruebas Reológicas. Desarrollo del diseño de experimentos (AO: Arreglo Ortogonal) para determinar las formulaciones de estudio. Pruebas Mecánicas. Microscopia electrónica de Barrido 2 4.3.1 Análisis proximal de la leche 4.3.1.a Proteínas (AOAC Official Method 930.29 Protein in Dried Milk). Se determinó en 0.1 a 0.2 g de muestra por el método Micro-Kjeldahl (proteína = N x 6.38). (Nota: El ácido bórico debe contener la siguiente mezcla de indicadores fenolftaleína, rojo de metilo y verde de bromocresol). Lo demás se realizó según el método mencionado. 4.3.1.b Cenizas (AOAC Official Method 930.30 Ash of Dried Milk) 4.3.1.c Grasa Valoración de rutina de grasa en leche por el proceso volumétrico de Gerber (Pearson, 1993). En un butirómetro para leche se agregaron 10 mL de ácido sulfúrico Gerber enfriado a no más de 15 ºC, después se adicionaron 11 mL de leche en polvo rehidratada (se agregaron 5.0077 g de leche en polvo a un matraz aforado de 50 mL y se llevó al aforo con agua destilada) y 1 mL de alcohol isoamílico. Después se realizó como el procedimiento indica. 4.3.1.d Humedad (AOAC Official Method 927.05 Moisture of Dried Milk) 4.3.1.e Hidratos de carbono El porcentaje de los hidratos de carbono presentes en la muestra se obtuvo por diferencia. 4.3.1.f Absorción atómica (Método de flama). Este análisis fue realizado en la Unidad de Servicios de Apoyo a la Investigación (USAI), en el Laboratorio de Absorción Atómica con un espectrofotómetro Varian SpectrAA 220. 4.3.2 Análisis de la gelana 4.3.2.a Humedad Se pesó 1 g de muestra en un crisol metálico con tapa, a peso constante, se colocó en una estufa de secado a una temperatura de 90 ºC ± 1 ºC, durante 2 h y después hasta peso constante. Se tomó el peso de la muestra y por diferencia de pesos se calculó el contenido de humedad (%). 4.3.2.b Absorción atómica Se utilizó el procedimiento de determinación de iones metálicos (Martínez-Cruz, 2002), pero se hicieron las siguientes modificaciones. 3 Patrones de Magnesio: Para obtener una disolución madre con 1000 ppm de magnesio, una masa de 398.7 mg de la sal se disolvió en agua y se aforó a 100 mL. En cuatro matraces aforados se vertieron con micropipetas, 10, 20, 40 y 80 µL de la disolución madre y se aforó a 10 mL, paraobtener patrones de 1, 2, 4 y 8 ppm. Patrones de Calcio: Una masa de 279.4 mg se disolvió y se aforó a 100 mL. A partir de esta disolución madre de 1000 ppm, se colocaron 30, 60, 90 y 120 µL en matraces aforados y se llevó a un volumen final de 10 mL. Se obtuvieron así patrones de 3, 6, 9 y 12 ppm. La determinación de sodio y potasio se hizo en un espectrofotómetro de absorción atómica y se usó como blanco agua. Fueron determinados con el quemador de aire-acetileno; el sodio a una longitud de onda de 330.2 nm y una ranura o ancho de ventana (slit) de 0.7 nm; mientras que el potasio se determinó a una longitud de onda de 404.4 nm y una ranura (slit) de 0.7 nm. Para este análisis se utilizó el Atomic Absorption Spectrometer 3110 Perkin Elmer. Los resultados obtenidos para la caracterización de las materias primas se muestran en las Cuadros 3 y 4: Cuadro 3. Resultados del análisis proximal de la leche descremada en polvo Parámetro Promedio (%) C. V. (%) Humedad 4.75 3.43 Cenizas 6.93 0.083 Proteína 31.3 1.48 Grasa 0.998 0 Hidratos de carbono 56.0 - Calcio 0.349 - Sodio 0.131 - Potasio 0.610 - Magnesio 0.310 - El análisis proximal se realizo por triplicado, la absorción atómica fue por quintuplicado Cuadro 4. Resultados del análisis de la gelana Parámetro Promedio (%) C. V. (%) Humedad 8.27 3.58 Calcio 0.374 2.09 Sodio 1.10 5.0 Potasio 4.50 4.95 Magnesio 0.173 2.91 Todas las determinaciones se realizaron por triplicado 4 4.3.3 Diseño del experimento (Arreglo ortogonal) En el diseño de experimentos se utilizan arreglos ortogonales (AO) tanto para los arreglos internos (factores de control) como para los externos (factores de ruido). Una gran ventaja del procedimiento de Taguchi es el uso de arreglos ortogonales que permite minimizar el número de ensayos o prototipos necesarios para la experimentación. Un problema asociado con los diseños factoriales es el aumento exponencial de las experimentaciones necesarias cuando se añaden variables al diseño. El arreglo ortogonal es una fracción del diseño factorial donde, solamente, se tienen en cuenta ciertas combinaciones de los niveles de las variables de entrada, de tal forma que se optimiza la cantidad de información extraída utilizando un número menor de ensayos (ver Cuadro 5). Cuadro 5. Arreglos ortogonales más usuales Arreglo Ortogonal N° de factores N° de niveles por factor N° de ensayos requeridos en el arreglo ortogonal N° de ensayos en el clásico diseño factorial completo L8(27) 7 2 8 128 L9(34) 4 3 9 81 L12(211) 11 2 12 2048 L16(215) 15 2 16 32768 L18(21x37) 1-7 2-3 18 4374 Fuente: http://www.aeipro.com/congresos/2000_1/pdf/BB06.pdf Además, esta estrategia limita el uso de datos de prueba cuando se evalúa el efecto de los factores, ya que la principal limitación de tener varios factores en un experimento al mismo tiempo es que no se puede observar la no interacción entre dichos factores. La ortogonalidad significa que los factores pueden ser analizados independientemente de los otros; el efecto de uno de los factores no afecta la estimación del efecto de otro factor (Ross, 1989). Por ello, las formulaciones que se analizaron se obtuvieron aplicando el arreglo ortogonal que se muestra en el Cuadro 6. 5 Arreglo Ortogonal (Matriz L8) Factores (3) A) Concentración de gelana B) Concentración de sólidos lácteos C) Temperatura Niveles (2) A1 = 0.1% A2 = 0.5% B1 = 2.0% B2 = 5.0% C1 = 90 ºC C2 = 75 ºC Cuadro 6. Matriz L8 del arreglo ortogonal. Factores e Interacciones A B A*B C A*C B*C Formulación Columna 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 2 2 2 3 1 2 2 1 1 2 4 1 2 2 2 2 1 5 2 1 2 1 2 1 6 2 1 2 2 1 2 7 2 2 1 1 2 2 8 2 2 1 2 1 1 2 Se realizaron pruebas preliminares para determinar las concentraciones de gelana y sólidos lácteos mostradas anteriormente. En el Cuadro 7 se muestran las formulaciones analizadas, obtenidas a partir del arreglo y de dos sistemas tomados como control. Cuadro 7. Formulaciones de los geles analizados. Formulaciones Condiciones 1 GLN 0.1%, SL 2.0%, 90ºC 2 GLN 0.1%, SL 2.0%, 75ºC 3 GLN 0.1%, SL 5.0%, 90ºC 4 GLN 0.1%, SL 5.0%, 75ºC 5 GLN 0.5%, SL 2.0%, 90ºC 6 GLN 0.5%, SL 2.0%, 75ºC 7 GLN 0.5%, SL 5.0%, 90ºC 8 GLN 0.5%, SL 5.0%, 75ºC 9 GLN 0.1%, 90ºC 10 GLN 0.5%, 75ºC Nota: Todos los geles tienen una concentración constante de NaCl de 0.5% masa. 3 4.3.4 Preparación de geles de gelana (Rodríguez-Hernández, 1997) y las mezclas gelana-proteínas lácteas Figura 10. Esquema de la preparación de geles. Preparación La gelana y la leche descremada en polvo se dispersaron de manera conjunta en agua desionizada a temperatura ambiente en una parrilla con agitación continua (Thermolyne, Type 1000 Stir plate). Para evitar la formación de grumos la gelana se adicionó muy lentamente esparciéndola alrededor del vórtice generado por la agitación del agua, la gelana fue adicionada en primer lugar y después de 10 minutos aproximadamente, siguiendo la misma técnica, se adicionó la leche descremada; la mezcla se mantuvo en agitación para permitir la hidratación del polímero y lograr así una buena dispersión (el tiempo promedio para crear una dispersión adecuada fue alrededor de 30 minutos). Para lograr la completa disolución de los hidrocoloides, especialmente la gelana, las dispersiones se calentaron desde temperatura ambiente hasta 90 ºC o 75 ºC según el caso, con una velocidad de calentamiento de 1.5 ºC/min (en un baño Cole- Parmer, Polystat, Constant temperature circulator) para favorecer su disolución. Cuando se llegó a la temperatura deseada, se agregó el cloruro de sodio en cantidad adecuada para tener una concentración de 0.5% y entonces la disolución se mantuvo en esta temperatura durante 10 minutos. Se vaciaron las disoluciones calientes en moldes de 26.1 mm de diámetro interno y 114 mm de longitud. Los moldes se dejaron enfriar hasta temperatura ambiente y después se colocaron en el refrigerador por 24 horas para su análisis posterior. Calentamiento hasta la temperatura de trabajo (90 o 75 ºC) Estabilización por 10 min. Dispersión de hidrocoloides en agua desionizada (T ambiente) Vaciado en moldes Enfriamiento y refrigeración Realización de las pruebas Adición de NaCl (0.5% masa) 4 4.3.5 Determinaciones reológicas Se llevaron a cabo pruebas de cizalla oscilatoria de baja amplitud a 25 ºC en un reómetro de deformación controlada (ARES-RFS III, TA Instruments, USA), usando geometrías de placas paralelas estriadas. Los discos de gel se obtuvieron de los moldes cortándolos de un espesor de 3 mm. Para la formulación 4 y los geles de gelana 0.1 y 0.5% el espesor fue de 2 mm, debido a que estas mezclas formaron un “gel débil” incapaz de autosostenerse. Los discos se colocaron en la placa inferior del reómetro y la placa superior se hizo descender lentamente. Las pruebas reológicas se realizaron a los geles de gelana/proteínas lácteas sometidos a una cinética de calentamiento-enfriamiento, durante el cual se tuvo especial cuidado de pesar el gel antes y después para conocer la pérdida de agua al calentar. Cuando fue necesario se repuso la misma. Debido a que las formulaciones se prepararon a 90 y 75 ºC se incluyeron geles de gelana 0.1 y 0.5% con 0.5% de NaCl preparados a ambas temperaturas con el fin de observar si existen cambios en el polisacárido por efecto de la temperatura. Las determinaciones realizadas fueron: (1) Barrido de deformación para verificar que las mediciones se llevaran a cabo en la zona de viscoelasticidad lineal (ZVL), es decir, en la zona en la cual la relación esfuerzo-deformación es lineal y por lo tanto las funciones materiales son constantes. Para esto, se impuso un movimiento oscilatorio de frecuencia constante (6.28 rad/s o