Determinacion-de-sexo-en-las-primeras-semanas-de-gestacion-utilizando-DNA-fetal-a-partir-de-sangre-materna-por-tecnica-en-cadena-de-la-polimerasa-PCR

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES 
CUAUTITLÁN 
 
 
“DETERMINACIÓN DE SEXO EN LAS PRIMERAS SEMANAS 
DE GESTACIÓN, UTILIZANDO DNA FETAL A PARTIR DE 
SANGRE MATERNA POR LA TÉCNICA DE REACCIÓN EN 
CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)” 
 
T E S I S 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
 
QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA 
 
P R E S E N T A: 
ARACELI JIMÉNEZ NOGUEZ 
 
ASESORES: 
 
 
DR. ENRIQUE ANGELES ANGUIANO 
 
M. en C. ANNA BERENICE JUÁREZ ESPINOSA 
 
 
CUAUTITLÁN IZCALLI, EDO. DE MÉX., 2008 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 - 2 -
 
 
ÍNDICE TEMÁTICO Paginas 
 
CONTENIDO 
ÍNDICE GENERAL i 
ABREVIATURAS iv 
ÍNDICE DE TABLAS vii 
ÍNDICE DE FIGURAS viii 
RESUMEN x 
I. INTRODUCCIÓN 1 
II. ANTECEDENTES 2 
 II.1. Relación materno-fetal 2 
 II.2. Circulación placentaria 5 
 II.3. Hematopoyesis embrionaria 7 
 II.4. Aspectos celulares de la hematopoyesis 8 
 II. 5. Células Fetales 11 
 II. 5.1. Linfocitos 11 
 II. 5.2. Trofoblastos 12 
 II. 5.3. Eritrocitos 12 
 II.5.4. Granulocitos 13 
 II.6. DNA fetal libre de células en plasma y suero materno 13 
 II.7. Marcadores Moleculares para la diferenciación sexual fetal 16 
 II.8. Técnicas comunes para la determinación del sexo fetal 17 
 II.8.1. Ultrasonido 17 
 II.8.2. Amniocentesis 18 
 II.8.3. Vellosidades coriónica 19 
 II.8.4. Cordocentesis 21 
 II.8.5. Diagnóstico Genético de Preimplantación (DGP) 22 
 II.8.6. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 
 
23 
 - 3 -
III. JUSTIFICACIÓN 24 
IV. HIPÓTESIS 26 
V. OBJETIVOS 26 
 V.1 General 26 
 V. 2 Particulares 26 
VI. METODOLOGÍA 27 
 VI.1 Materiales y equipo 27 
 VI.1.1. Equipo 27 
 VI.1.2 Materiales 27 
 VI.1.3. Reactivos 28 
 VI.1.4. Material biológico 29 
 VI. 2. Métodos 29 
 VI.2.1. Población de estudio 29 
 VI.2.2. Venopunción 30 
 VI.2.3. Registro de muestras 30 
 VI.2.4. Extracción de DNA 31 
 VI.2.4.1. Parte A 31 
 VI.2.4.2. Parte B 31 
 VI.2.5. Cuantificación de DNA 32 
 VI.2.6. Integridad de DNA 32 
 VI.2.7.Amplificación por PCR (Reacción en Cadena de la 
 Polimerasa) 
32 
 VI.2.8. PCR interna 33 
 VI.2.9. PCR múltiple 33 
 VI.2.10. Reacción de PCR múltiple- interna 33 
 VI.2.11. Condiciones de amplificación 35 
 VI.2.11.1. Las condiciones de amplificación para el método I y II 35 
 VI.2.12. Oligonucleótidos para genes: SRY, β-globina y ATL1 36 
 VI.2.13. Análisis del DNA amplificado por PCR empleando el 
 método I y II mediante electroforesis 
37 
 - 4 -
 VI.3.1. Evaluación de resultados 37 
VII. RESULTADOS 38 
 VII.1. Extracción, cuantificación e integridad del DNA 38 
 VII.2. Amplificación del gen SRY y β-globina por el método I 39 
 VII.3. Diluciones del DNA del control positivo para el gen SRY 
 por el método I 
42 
 VII.4. Amplificación del gen SRY empleando DNA fetal por el 
método I 
 
43 
 VII.5. Amplificación del Gen SRY y ATL1 por el método II 44 
 VII.6. Diluciones de DNA de controles para los genes SRY y 
 ATL1 por el método II 
46 
 VII.7. Amplificación del gen SRY en DNA fetal por el método II 48 
 VII.8. Aplicación del método I a la población interesada en 
 conocer el sexo de su futuro bebé 
49 
VIII. DISCUSIÓN 52 
 VIII.1. Identificación del DNA fetal 53 
 VIII.2. Método I 54 
 VIII.3. Método II 55 
 VIII.4. Comparación entre el método I y II 56 
 VIII.5. Sondeo de población de estudio 57 
 VIII.6. Aplicación de la determinación de sexo fetal en las 
 primeras semanas de gestación 
59 
IX. CONCLUSIONES 61 
X. BIBLIOGRAFÍA 62 
ANEXOS 67 
 
 
 
 
 
 
 - 5 -
 
 
 
 
 
ABREVIATURAS 
 
- negativo 
µL microlitros 
µM micro molar 
-* falso negativo 
+ positivo 
+* falso positivo 
°C grados celsius 
☺ embarazo gemelar 
1D primera dimensión 
3D tercera dimensión 
3N tres nested (sentido del oligonucleótido) 
5N cinco nested (sentido del oligonucleótido) 
BFU-E unidades formadoras de brotes eritroides 
BrdU bromodesoxiuridina 
Ca2+ calcio 2+ 
CFU unidades formadoras de colonias 
CFU-E unidades formadoras de colonias 
eritroides 
CN control negativo 
CP control positivo 
d NTP’S desoxinucleótidos tri-fosfato 
Dil diluciones 
DNA ácido desoxirribonucléico 
DGP diagnóstico genético preimplantatorio 
DO densidad óptica 
 - 6 -
EDTA etilen diamino tetra acético 
F femenino 
FACS separación de células activadas por 
fluorescencia 
FISH hibridación in situ fluorescente 
FIV fecundación in Vitro 
FMR1 gen X frágil 
Forward sentido 
GAPDH gliceraldheido 3-fosfato deshidrogenasa 
Geq/mL genómicos equivalentes por mililitro 
HCl ácido clorhídrico 
HMG proteínas nucleares de alta movilidad 
M marcador 
MACS morfología-anticuerpo-cromosoma 
MgCl2 cloruro de magnésio 
Mg2+ magnesio 2+ 
Mg miligramos 
Min minutos 
mL mililitros 
mM milimol 
Ng nanogramos 
nM nanomolar 
P plasma 
p.c. post-concepción 
Pb pares de bases 
PCR reacción en cadena de la polimerasa 
PCR-RT reacción en cadena de la polimerasa 
tiempo real 
Rh-D rhesus D 
R anti-sentido 
 - 7 -
RNA ácido ribonucléico 
RNAm ácido ribonucléico mensajero 
Rpm revoluciones por minuto 
S suero 
Sdg semanas de gestación 
SF sexo fetal 
SRY gen de determinación sexo en el 
cromosoma Y humano 
Taq thermophilus aquaticus 
TBE tris boratos EDTA 
TDF del inglés testicular determination factor 
U unidades 
USG ultrasonido 
µg microgramos 
UV ultravioleta 
Vf volumen final 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 8 -
 
 
 
 
 
 
ÍNDICE DE TABLAS 
 
Tabla Página 
1 Secuencia de oligonucleótidos para la 
identificación del sexo fetal 
29 
2 Mezcla de reacción de la primera 
amplificación del método I y II 
34 
3 Mezcla de reacción de la segunda 
amplificación del método I y II 
34 
4 Combinación de oligonucleótidos del gen SRY, 
β-globina y ATL1 para la amplificación por PCR. 
36 
5 Resultados del estudio no invasivo para la 
detección de sexo fetal por el método I 
50 
6 Sensibilidad y especificidad del método I 
 
51 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 9 -
 
 
 
 
 
 
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
 
Figura Página 
1 Estadios en la implantación embrionaria 3 
2 Diferentes etapas del desarrollo embrionario humano que
muestran la relación entre el corión y otras membranas 
extraembrionarias 
4 
3 Estructura y circulación materno fetal 6 
4 Etapas en el desarrollo de los islotes sanguíneos en el 
saco vitelino de embriones humanos 
7 
5 Estadios morfológicos durante la diferenciación 
celular del eritrocito a partir de una célula 
madre pluripotencial 
10 
6 RNA y DNA encapsulados en cuerpo apoptóticos 15 
7 Ultrasonido que demuestra el sexo del bebé (femenino 
XX) tomado en la 23º semana de gestación (donación del
IMF) 
18 
8 Representación esquemática de una amniocentesis 19 
9 Representaciónesquemática de una biopsia de 
vellosidades coriónicas 
20 
10 Representación esquemática de una cordocentesis 21 
11 Imágenes de DGP 23 
12 Integridad del DNA obtenido de controles 38 
13 Amplificación del gen SRY del CP empleando 
diferentes combinaciones de oligonucleótidos por 
40 
 - 10 -
el método I 
14 Amplificación del gen SRY de CP por el método I 41 
15 Amplificación del gen β-globina del CN por el método I 42 
16 Diluciones del DNA del CP para amplificar el gen SRY 
por el método I 
43 
17 Amplificación del gen SRY en DNA fetal por el método I 44 
18 Primera amplificación de los genes SRY Y ATL1 del CP 
Y CN mediante el método II 
45 
19 Segunda amplificación del gen ATL1 y SRY de CP y CN 
por el método II 
46 
20 Diluciones empleadas para la amplificación del gen 
ATL1 (261 pb) deL CN por el método II 
47 
21 Diluciones empleadas para la amplificación de los 
genes SRY (198 pb) de CP y ATL1 (261 pb) de CN por 
el método II 
47 
22 Amplificación del gen SRY en DNA fetal por el método II 48 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 11 -
 
 
 
 
 
RESUMEN 
 
 
La amniocentesis, cultivo de vellosidades coriales y cordocentesis son estudios que 
se realizan para detección de aneuploidías y no sólo para la determinación de sexo 
fetal; estos estudios invasivos presentan un riesgo tanto para la madre como para 
el feto. El hallazgo del DNA fetal en suero y/o plasma materno ofrece una 
posibilidad para el diagnóstico prenatal no invasivo. El objetivo de esta 
investigación fue evidenciar el DNA fetal en suero y/o plasma a partir de sangre 
periférica materna y con éste estandarizar una técnica para determinación de sexo 
fetal a partir de la novena semana de gestación. En este estudio se ha establecido 
la metodología más idónea para el análisis de secuencias fetales específicas de los 
cromosomas X (ATL1) y Y (SRY). Se emplearon diferentes oligonucleótidos en una 
PCR múltiple-interna para realizar la detección del sexo fetal en etapas tempranas 
del embarazo obteniendo un 80% de sensibilidad. La técnica permitió detectar 
correctamente el sexo fetal a 8/10 mujeres embarazadas. Por lo tanto el nuevo 
método de diagnóstico prenatal no invasivo de género fetal es confiable y seguro, 
sin embargo se sigue invitando a más mujeres embarazadas que estén interesadas 
en este proyecto para poder tener una población más grande, así como una 
confiabilidad más alta. Esta técnica es la base para el diagnóstico prenatal no 
invasivo futuro de diversas enfermedades como son: la enfermedad de Huntington, 
fibrosis quística, estado Rh-D, entre otras. La detección de secuencias del DNA 
fetal es confiable y reduce el riesgo y costo de las técnicas invasivas. 
 
 
 
 
 
 
 - 12 -
I. INTRODUCCIÓN 
En los últimos años, los métodos no invasivos (PCR convencional y PCR-
RT) para diagnóstico prenatal han atraído la atención de varios médicos e 
investigadores. La ultrasonografía moderna o la medición de los niveles de 
marcadores en suero materno se usan rutinariamente como pruebas de búsqueda 
primarias para el desarrollo de malformaciones. 
Actualmente se practican procedimientos invasivos basados en el análisis 
genético de cromosomas fetales o DNA de muestras de vellosidades coriónicas o 
amniocitos. Sin embargo, la aplicación de esos procedimientos invasivos 
incrementa el riesgo de pérdida fetal. 
 El descubrimiento de ácidos nucleicos fetales presentes en sangre materna 
ha abierto nuevas posibilidades prometedoras para el diagnóstico prenatal no 
invasivo incluyendo determinación de sexo y el estado de Rh solo por mencionar 
algunos. El DNA libre de células es una herramienta potencial para la detección y 
monitoreo de ciertas enfermedades fetales y complicaciones asociadas al 
embarazo. 
Gracias a los métodos de biología molecular, entre ellos la reacción en 
cadena de la polimerasa múltiple-interna, se ha podido evidenciar la presencia del 
DNA fetal al poder amplificar secuencias específicas del cromosoma Y (SRY), la 
cual es una técnica sensible porque permite detectar este gen a partir de 
cantidades muy pequeñas de DNA fetal en las primeras semanas del embarazo. 
Así el sistema de PCR, es fácil rápido y efectivo, que reducir el costo y el número 
de procedimientos invasivos requeridos por el diagnóstico prenatal. 
 - 13 -
 
II. ANTECEDENTES 
 
II.1. Relación materno-fetal 
 
La relación íntima que existe entre el embrión y la madre es la característica 
más típica del desarrollo embrionario humano. Para sobrevivir y crecer durante la 
vida intrauterina, el embrión debe mantener una relación con el cuerpo de la madre 
de forma que pueda conseguir el oxígeno y los nutrientes que necesita, así como 
para eliminar sus desechos. Estos requerimientos se cumplen por medio de la 
placenta y las membranas extraembrionarias que rodean al embrión que actúan 
como la interfase entre éste y la madre. 
 
Los tejidos que constituyen la conexión entre el feto y la madre (placenta-
corion) son derivados del trofoblasto (capa epitelial externa que rodea a la masa 
celular interna del embrión) durante el periodo de segmentación. Cuando la 
implantación del cigoto es completa, el trofoblasto original que rodea al embrión 
experimenta una diferenciación en dos capas: el citotrofoblasto interno y el 
sincitriotrofoblasto externo. En el trofoblasto existenten unas lagunas en expansión 
rápidamente las cuales se llenan con sangre materna y las células del tejido 
conjuntivo endometrial empiezan a tener cantidades abundantes de glucógeno y 
lípidos en respuesta a la infiltración trofoblástica (figura 1), (Carlson, 2005). 
 
Otros tejidos extraembrionarios proceden de la masa celular interna, entre 
ellos se encuentran el amnios (un derivado ectodérmico) que constituye una 
cápsula protectora debido a que contiene un líquido el cual rodea al embrión, el 
saco vitelino (un derivado endodérmico) que tiene la función de eliminar los 
desechos del embrión. La mayor parte del mesodermo extraembrionario lo 
constituye el cordón umbilical, el tejido conjuntivo y los vasos sanguíneos que 
irrigan estas estructuras (figura 2), (Carlson, 2005). 
 
 - 14 -
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1.Estadios en la implantación embrionaria: A) Comienza la invasión del estroma 
endometrial. B) La mayor parte del embrión se encuentra incluido en el endometrio, existe 
una formación incipiente de lagunas trofoblásticas. Surge la cavidad amniótica y el saco 
vitelino. C) La implantación es casi completa, se forman las vellosidades primarias y 
aparece el mesodermo extraembrionario. D) La anidación es completa; se forman las 
vellosidades secundarias. (Modificado de Carlson, 2005). 
 
 - 15 -
 
 
 
 
Figura 2. Diferentes etapas del desarrollo embrionario humano que muestran la relación 
entre el corión y otras membranas extraembrionarias, (Modificado de Carlson, 2005). 
 - 16 -
II.2. Circulación placentaria 
 
Tanto el feto como la madre contribuyen a la circulación placentaria. La 
circulación fetal está contenida en el sistema de los vasos umbilicales y 
placentarios. La sangre fetal alcanza la placenta a través de dos arterias 
umbilicales que se ramifican por toda la placa corial. Las ramas más pequeñas de 
estas arterias llegan a las vellosidades coriales y después forman redes capilares 
en las ramas terminales de las vellosidades coriales, donde tiene lugar el 
intercambio de una gran diversidad de sustancias. A partir de los lechos capilares 
de las vellosidades, los vasos sanguíneos se consolidan en ramas venosas cada 
vez más grandes, las cuales circulan a través de la placa corial hacia la vena 
umbilical y de ahí hacia el feto. 
 
A diferencia de lo que ocurre con la circulación fetal que está contenida por 
completo en los vasos sanguíneos, el aporte vascular de la madre a la placenta es 
una especie de laguna de circulación libre que no estácontenida en las paredes 
vasculares. Debido a la actividad infiltrativa del trofoblasto, entre 80 y 100 arterias 
espirales del endometrio se abren directamente en los espacios intervellositarios y 
bañan las vellosidades con sangre materna, la cual se renueva 3 o 4 veces cada 
minuto. 
 
La sangre materna entra en el espacio intervellositario con una presión 
reducida a causa de los tapones de citotrofoblasto que obstruyen de manera parcial 
las luces de las arterias espirales. No obstante, la presión arterial materna es 
suficiente para forzar a la sangre arterial oxigenada a que se dirija a la base de los 
árboles de vellosidades en la placa corial. A partir de esta placa, la sangre fluye 
sobre las vellosidades terminales a medida que vuelve a las vías de flujo venoso 
localizadas en la placa decidual (materna) de la placenta. Se requiere un flujo 
adecuado de sangre materna a la placenta que es vital para el crecimiento y 
desarrollo del feto, por lo tanto una disminución en el flujo hace que el feto no 
concluya adecuadamente estos procesos. 
 - 17 -
En las vellosidades terminales (flotantes), los capilares fetales se localizan 
cerca de la superficie trofoblástica para facilitar el intercambio entre la sangre fetal y 
la materna. La placenta madura forma una barrera que está constituida por el 
sincitiotrofoblasto, la lámina basal de los capilares fetales y el endotelio capilar. A 
menudo, las dos láminas básales parecen estar fusionadas. En 
los embriones de menor edad hay una capa de citotrofoblasto en la barrera 
placentaria pero hacia el cuarto mes la capa citotrofloblástica comienza a 
desaparecer en un proceso que termina en el quinto mes (figura 3), (Carlson, 
2005). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Estructura y circulación materno- fetal. La sangre se introduce en los espacios 
intervellositarios procedente de los extremos abiertos de las arterias espirales uterinas. Tras 
bañar las vellosidades, la sangre (azul) drena a través de las venas endometriales 
(Modificado de Carlson, 2005). 
 - 18 -
II.3. Hematopoyesis embrionaria 
 
La formación de los componentes celulares sanguíneos se denomina 
hematopoyesis y comienza en el saco vitelino durante la tercera semana de 
gestación (18 días) con la formación de los islotes sanguíneos. Las células 
fundadoras de los islotes sanguíneos, denominados hemagioblastos, tienen una 
capacidad de desarrollo bipotencial y pueden dar origen tanto a células endoteliales 
como a hematopoyéticas, (figura 4). 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Etapas en el desarrollo de los islotes sanguíneos en el saco 
vitelino de embriones humanos (Modificado de Carlson, 2005). 
 - 19 -
Los islotes sanguíneos contienen células madre hematopoyéticas 
pluripotenciales que originan la mayor parte de los tipos celulares presentes en la 
sangre embrionaria. En el día 22 de la gestación, los eritrocitos producidos en el 
saco vitelino son células grandes nucleadas que penetran en la corriente sanguínea 
materna justo antes de que el tubo cardíaco empiece a latir. Durante las primeras 6 
semanas, los eritrocitos circulantes derivan del saco vitelino. 
 
El análisis de embriones humanos ha demostrado que al inicio del día 28, la 
hematopoyesis intraembrionaria definitiva promueve pequeños agregados célulares 
(acúmulos paraaórticos) en el mesodermo esplecnopleural asociado a la pared 
ventral de la aorta dorsal y poco después en la región aorta/cresta 
genital/mesonefros. Hacia la quinta o sexta semana, los focos de hematopoyesis 
son cada vez más destacados en el hígado. Tanto en el saco vitelino como en los 
primeros focos de hematopoyesis embrionaria, las células endoteliales conservan 
durante un breve período la capacidad de dar origen a células productoras de 
sangre (Carlson, 2005). 
 
Hacia la sexta u octava semana de gestación en el humano, el hígado 
sustituye al saco vitelino como principal fuente de células sanguíneas. Aunque el 
hígado sigue produciendo hematíes hasta el período neonatal temprano, su 
contribución empieza a decaer en el sexto mes de la gestación. En este momento, 
la formación de sangre se desplaza hacia la médula ósea, lugar definitivo de la 
hematopoyesis en el adulto. Este desplazamiento está controlado por el cortisol 
secretado en la corteza suprarrenal fetal. En ausencia de cortisol, la hematopoyesis 
permanece confinada en el hígado (Carlson, 2005). 
 
II.4. Aspectos celulares de la hematopoyesis 
 
En fases muy tempranas del desarrollo, la línea celular sanguínea se 
subdivide en células madre linfoide y mieloide: las células madre linfoides a su vez 
 - 20 -
producen dos líneas celulares: los linfocitos B (responsables de la producción de 
anticuerpos) y los linfocitos T (que se encargan de las reacciones inmunes ). Las 
células madre mieloides son las precursoras de otras líneas celulares sanguíneas 
como los eritrocitos, los granulocitos (neutrófilos, eosinófilos y basófilos), los 
monocitos y las plaquetas. Las células de la segunda generación (linfoide y 
mieloide) tienen un desarrollo restringido debido a que ninguna de ellas puede dar 
lugar a descendencia de otro tipo. Las células madre hematopoyéticas se 
denominan a menudo unidades formadoras de colonias (CFU). Los primeros 
estadios de la eritropoyesis se reconocen por el comportamiento de las células 
precursoras en cultivo más que por diferencias morfológicas o bioquímicas. Éstas 
son las denominadas unidades formadoras de brotes eritroides (BFU-E) y las 
unidades formadoras de colonias eritroides (CFU-E); cada una de ellas responde a 
estímulos distintos. 
Una o dos generaciones después del estadío de CFU-E se pueden 
reconocer generaciones sucesivas de precursores de eritrocitos por su morfología. 
El primer estadío reconocible es el proeritroblasto, una célula grande y muy 
basófila, que todavía no produce suficiente hemoglobina. Esta célula tiene un 
nucléolo grande, mucha cromatina nuclear no condensada, numerosos ribosomas y 
una elevada concentración de RNAm para la globina. Estas características 
citológicas son típicas de una célula indiferenciada. Los siguientes estadíos de 
diferenciación eritroide (basófilos, policromatófilos y eritroblastos) se caracterizan 
por cambios progresivos en el balance entre la acumulación de hemoglobina recién 
sintetizada y la disminución de su síntesis. 
 
El tamaño global de la célula disminuye y el núcleo se hace cada vez más 
picnótico (menor y con cromatina más condensada), hasta que al final se expulsa 
en el estadío de eritrocito ortocromático. Tras la pérdida del núcleo y de la mayor 
parte de los organelos citoplasmáticos, las células rojas inmaduras, que aún 
contienen un pequeño número de polisomas, son los reticulocitos. Los reticulocitos 
se liberan al torrente sanguíneo, donde siguen produciendo pequeñas cantidades 
de hemoglobina durante 1 o 2 días. El estadío final de la hematopoyesis es el 
 - 21 -
eritrocito maduro, que representa la célula terminal diferenciada (figura 5). Los 
eritrocitos en los embriones son más grandes que sus equivalentes adultos y su 
vida media es más corta: 50 a 70 días en el feto contra 120 días en los adultos, 
(Carlson, 2005). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Estadios morfológicos durante la diferenciación celular del 
eritrocito a partir de una célula madre pluripotencial (Modificado de Carlson, 
2005). 
 - 22 -
II.5. Células Fetales 
La obtención no invasiva de células fetales a partir de la circulación materna 
ha sido un gran hallazgo que se emplea en los diagnósticos prenatales, 
principalmente para identificar anormalidades genéticas en etapas tempranas del 
desarrollo, ya que actualmente las investigaciones se centran en el aislamiento de 
las células fetales que atraviesan la barrera placentaria y circulan en sangre 
materna. Dichas células al ser nucleadas constituyenuna fuente de obtención del 
DNA fetal para el diagnóstico genético prenatal. 
En los últimos años se han publicado múltiples trabajos sugiriendo primero y 
confirmando después, la presencia de células nucleadas procedentes del feto en la 
circulación periférica de mujeres embarazadas (Gallo, 1992, Bischoff, 2002, Maron, 
2007). Sin embargo, los resultados publicados durante los primeros años de 
investigación fueron poco alentadores (Gallo, 1992). Actualmente, gracias a los 
avances realizados en las áreas de la inmunología (anticuerpos monoclonales), de 
la separación celular, (FACS fluorescence activated cell shorter; separación de 
células activadas por fluorescencia, o MACS magnetic activated cell shorter; 
morfología-anticuerpo-cromosoma) y de la biología y citogenética molecular (PCR 
reacción en cadena de la polimerasa, FISH hibridación in situ fluorescente), resulta 
posible estudiar y caracterizar las diferentes poblaciones celulares fetales presentes 
en la circulación periférica de mujeres embarazadas (Maydata, 1996). 
 Los principales tipos celulares estudiados son: linfocitos, células 
trofoblásticas y eritroblastos los cuales se describen en los siguientes apartados. 
 
II.5.1. Linfocitos 
La primera aparición de linfocitos fetales en sangre materna se detectaron 
entre la 7 y 16 semanas de gestación. Incluso diversos autores han evidenciado 
linfocitos fetales que permanecen aún en torrente sanguíneo de la madre después 
del parto (Johnson-Hopson y Artlett, 2002; Guibert, 2003; Smid, 2003). La 
 - 23 -
proporción de linfocitos fetales en sangre materna oscila entre un 0.01 a un 3.7% 
estimándose que la relación entre linfocitos fetales y maternos varía entre 1/800 y 
1/60.000. (Gallo, 1992). 
 
II.5.2. Trofoblastos 
Los trofoblastos fetales son células multinucleadas localizadas en las 
vellosidades placentarias y están en íntimo contacto con la circulación materna, 
detectados desde la octava semana de gestación en circulación materna. En 1982, 
Goodfellow, publico el aislamiento de células trofoblásticas en sangre periférica 
materna usando un anticuerpo microvellositario antitrofoblástico. Además, este tipo 
celular se ha detectado en los pulmones de la madre y en el esputo. Diferentes 
subpoblaciones trofoblásticas entre los 13 y 15 días del mes de gestación existen 
en una tasa de 100.000 células por día que van desde las vellosidades coriales a la 
circulación materna estimándose que su dilución en la población de leucocitos 
maternos es de 1:10 (Gallo, 1992). 
Las células trofoblásticas son la población celular fetal que se pone en 
contacto con la circulación materna en etapas muy tempranas y probablemente 
también es el grupo celular fetal con mayor representación en el torrente sanguíneo 
materno (Maydata, 1996). 
II.5.3. Eritrocitos 
Se han encontrado eritrocitos fetales en la sangre materna durante el primer 
trimestre del embarazo y a lo largo del mismo aumentando de manera progresiva. 
Su incidencia se ha valorado en un 5 a 7% durante el embarazo. La proporción es 
de más de una célula por 50 maternas, con un promedio de 0.7 ml de sangre fetal 
en la circulación materna y su vida media es de unos 100 a 200 días (Gallo, 1992). 
 
 
 - 24 -
II.5.4. Granulocitos 
Los granulocitos fetales han sido estudiados durante el embarazo por 
diversos autores con resultados opuestos ya que unos refieren que no se 
encontraron granulocitos fetales en sangre materna y otros sí los encuentran a 
partir de las semanas 9 ó 10 de gestación, (Schröder, 1972; Siebers, 1975). 
Actualmente se conoce que después del parto esta línea celular se encuentra 
presente en el 30% de las madres y que desaparecen de la circulación materna en 
la primera semana del puerperio (Gallo, 1992). 
 
II.6. DNA fetal libre de células en plasma y suero materno 
Los primeros estudios que revelaron la existencia de ácidos nucleicos (DNA 
y RNA) en plasma y suero fueron de pacientes con algún tipo de cáncer. En los 
años 80 y 90 varios grupos demostraron que el DNA encontrado en plasma 
derivaba de pacientes con cáncer que mostraban características de tumores-
específicos, además de una disminución en la estabilidad de las cadenas de los 
ácidos nucléicos, mutaciones en los genes Ras y p53, alteración en los 
microsatélites, anormalidades en promotores de hipermetilación de ciertos genes, 
mutación de DNA mitocondrial y DNA viral asociado con tumores, (Bischoff, 2005). 
 
El DNA libre en plasma proveniente de tumores es el resultado de un 
proceso conocido como apoptosis que sufren algunas células (Halicka, 2000, 
Bischoff, 2005). 
 
Se han empleado modelos animales que pueden demostrar el origen, 
mecanismo y naturaleza del DNA fetal encontrado en la circulación materna. Se ha 
demostrado la detección del DNA fetal en suero materno de monos rhesus con una 
cinética similar en el humano, también relacionada con la edad gestacional y las 
características postnatales, (Jiménez, 2003). 
 
 - 25 -
La placenta, las células fetales hematopoyéticas y el mismo feto han sido 
considerados como las principales fuentes de obtención del DNA fetal (Bianchi, 
2004). 
 
Muchos estudios ahora demuestran que la placenta es el origen 
predominante de DNA fetal en circulación materna, pero que no es el único origen 
de DNA fetal, además se sabe que la circulación feto-placentaria es estable hasta 
los 28 a 30 días post-concepción, esto sugiere también que el DNA fetal es 
derivado del trofoblasto (Maron, 2007). 
 
Los estudios de detección de DNA en plasma derivado de tumores de 
pacientes con cáncer, propusieron la demostración de DNA fetal en plasma y suero 
de mujeres embarazadas sanas. Usando PCR-Tiempo Real cuantitativo, 
recuperando sorprendentemente una concentración promedio alta de (6.2% del 
DNA total en plasma) tanto de embarazos tempranos y tardíos (Bischoff, 2005). 
 
La existencia de DNA del feto en plasma materno ha sido demostrada por la 
amplificación de secuencias específicas del cromosoma Y en mujeres 
embarazadas que llevan un feto de sexo masculino. 
En plasma el DNA fetal presenta una concentración promedio de 25.4 de 
equivalentes geonómicos (GEq/mL), en embarazos tempranos y 292.2 GEq/mL en 
embarazos tardíos. Una concentración menor de DNA fetal encontró en suero de 
mujer embarazada saludable (3.4% del DNA total en suero) (Bischoff, 2005). 
 
Mas tarde, se demostró que el DNA fetal comprende en promedio un 3.4% a 
6.2% en gestaciones tempranas y tardías respectivamente (Chan, 2004). 
Las concentraciones de DNA fetal libre de células es estable por arriba de 
las 24 horas (Angert, 2003). 
 
 - 26 -
Aunque no existe evidencia contundente todavía, parece ser que los 
mecanismos principales por el cuál el DNA fetal es liberado a la circulación materna 
es la necrosis y la apoptosis de células de placenta fetales o del mismo feto. 
La forma más común de muerte celular es por medio de la apoptosis, 
proceso que se lleva en etapas tempranas de la embriogénesis. De 1011-1012 
células se dividen diariamente y la misma cantidad puede perderse para mantener 
la homeostasis tisular, aproximadamente 1 a 10 g de DNA pueden degradarse por 
día en el humano. No es sorprendente que algo de DNA escape de la degradación 
final y así pueda llegar al suero y/o plasma en forma de cuerpos apoptóticos. La 
formación de cuerpos apoptóticos de diferentes tipos celulares se ha detectado por 
varias metodologías (inmunocitoquímica de RNA marcado con BrU, Histoquímica 
de DNA y RNA, citometría de flujo), (figura 6). 
 
La apoptosis no es al azar o un proceso caótico sino que esta bajo control. 
Esta formación de cuerpos apoptóticos es una etapa específica de muerte celular y 
en ellos se encuentran encapsulados el DNA o el RNA fetal (Halicka, 2000). 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. RNA y DNA encapsulados en cuerpo apoptóticos. A) RNA (verde 
marcado con un asterisco dentro de cuerposapoptóticos), B) DNA (rojo marcada 
con dos flechas dentro de cuerpos apoptoticos) y C) Se muestran cuerpos 
apoptóticos con un microscopio de contraste (Modificado de Halicka, 2000) 
 
A B C
 - 27 -
La apoptosis es un evento de muerte celular programada irreversible que 
realizan las células para morir, la característica bioquímica de este fenómeno es la 
fragmentación del DNA genómico. Esto ocurre ante cambios de permeabilidad de la 
membrana plasmática (fragmentación prelítica del DNA). En la mayoría de los 
sistemas, esta fragmentación del DNA se debe a la activación de endonucleasas 
nucleares dependientes de Ca2+ y Mg2+ endógenos Estas enzimas rompen 
selectivamente al DNA entre las unidades nucleosomales generando fragmentos de 
DNA de uno o más nucleosomas y así algunas secuencias de DNA son 
relativamente más susceptibles a rupturas, generando tamaños de fragmentos 
predecibles (Bischoff, 2005). 
 
 Las células fetales o placentarias que sufren apoptosis pueden contener 
DNA que es distinguible del DNA materno en plasma basado en características 
moleculares, principalmente debido al tamaño de DNA fetal el cual es mayor a 193 
pares de bases pero menor a 313 pares de bases. El DNA fetal no solo se ha 
podido diferenciar por el tamaño, si no que además se ha detectado en plasma por 
el uso de diferencias genéticas entre la madre y feto, usando marcadores 
epigenéticos para detección específica de DNA fetal en el plasma materno. Algunos 
de estos marcadores son los alelos fetales metilados heredados del padre y que 
han sido diferenciados de alelos metilados de la madre (Poon, 2002). 
 
II.7. Marcadores moleculares para la diferenciación fetal 
En 1990 se identificó el gen SRY (de sus siglas en inglés sex determining 
region on Y-chromosome) que se ha relacionado directamente con la diferenciación 
sexual (Guizar-Vázquez, 2001; Harley, 2003). Este gen se localiza en el brazo corto 
del cromosoma (Yp11.3) y codifica una proteína con un dominio de unión al DNA, 
similar al de las proteínas nucleares de alta movilidad (HMG). 
 
 El gen SRY está constituido por un solo exón con un marco abierto de 
lectura de 614 pb y codifica para una proteína de 204 aminoácidos. Durante el 
 - 28 -
desarrollo normal, este gen es necesario para la formación de los genitales 
masculinos y por otra parte su ausencia permite la formación de genitales 
femeninos (Guizar-Vázquez, 2001). 
 
El gen ATL1 también conocido como X frágil que se encuentra en el intrón 1 
de FMR1, en el brazo largo del cromosoma X (Xq27.3). El gen ATL1 es una 
proteína de unión al RNA e involucra el transporte del RNAm del núcleo al 
citoplasma. (Pubmed 2332). 
 
II.8. Técnicas comunes para la determinación del sexo fetal 
Existen diversas técnicas (ultrasonido, amiocentesis, vellosidades coriónicas, 
cordocentesis, diagnóstico genético de preimplatación) que se utilizan en el 
diagnóstico prenatal para la determinación del sexo, a estas se les puede clasificar 
en invásivas y no invasivas. 
 
II.8.1. Ultrasonido 
El ultrasonido es una técnica no invaisva útil en el diagnóstico prenatal, 
puede utilizarse en obstetricia para la localización de la placenta o el diagnóstico de 
embarazos múltiples y determinación de sexo, además se emplea para el 
diagnóstico de anormalidades estructurales que no están asociados a defectos 
cromosómicos, bioquímicos o moleculares. El ultrasonido es un estudio no invasivo 
y no conlleva ningún riesgo para la madre o el feto. Sin embargo, requiere de un 
equipo costoso y un operador con experiencia. Se recomienda la exploración 
detallada a todas las mujeres embarazadas alrededor de la dieciocho semana de 
gestación (sdg) para detectar anormalidades estructurales, como defectos del tubo 
neural o problemas cardiacos y para la determinación del sexo se puede realizar a 
partir de la 12 sdg con un equipo de 3D o con un ultrasonido normal en la semana 
24 para no tener duda alguna del resultado. Esta técnica puede también identificar 
ciertos caracteres que pueden sugerir la presencia de anormalidades 
cromosómicas (figura 7), (Mueller, 2001; Binns, 2002). 
 - 29 -
 
 
 
 
II.8.2. Amniocentesis 
La amniocentesis consiste en la aspiración de 10 a 20 mL de líquido 
amniótico a través del abdomen de la madre con la ayuda de un ultrasonido. Ésta 
se realiza normalmente alrededor de la 16ª semana de gestación. Cuando los 
padres consideran la amniocentesis como una opción, se les debe informar que 
dicha técnica conlleva un riesgo de aborto del 0.5%-1%. Por lo general este estudio 
siempre es solicitado por el médico debido a que existe algún motivo para 
sospechar de alguna alteración genética. Utilizando metodologías como la 
citogenética convencional (cariotipo), la muestra requiere de cultivos previos y el 
resultado se obtiene después de varios días. Este estudio puede determinar el sexo 
del bebé pero nunca se recomienda solo para esta prueba (figura 8), (Mueller, 
2001). 
 
 
Figura 7. Ultrasonido que demuestra el sexo del bebé (femenino XX) 
tomado en la 23º semana de gestación (donación del IMF) 
 - 30 -
 
Figura 8. Representación esquemática de una amniocentesis. Se muestra como se 
hace la extracción del líquido amniótico mediante una punción abdominal, que luego se 
usa para cultivo y/o estudios bioquímicas (Modificado de Binns, 2002). 
 
 
II.8.3. Vellosidades coriónicas 
 Al igual que la técnica de amniocentesis, la toma de muestra de vellosidades 
coriónicas siempre va acompañada de una orden para detección de aneuploidías y 
por consiguiente el sexo fetal, se realiza durante las semanas 
10-11 bajo la dirección de técnicas de ultrasonido y mediante la aspiración 
transcervical o transabdominal de vellosidades coriónicas, (figura 9). 
 
Estas vellosidades son de origen fetal y se derivan de la capa exterior del 
blastocito es decir, del trofoblasto. El análisis cromosómico se puede realizar 
directamente, observando las metafases de células activas en división o bien 
después de un cultivo. El análisis directo permite un resultado provisional en un 
plazo de 24 horas. En estos análisis suele obtenerse una cantidad de tejido 
suficiente para realizar ensayos bioquímicos o análisis de DNA que permitan la 
detección de desórdenes que involucran a un único gen, sin necesidad de realizar 
cultivos celulares pero la desventaja es el riesgo que conlleva este procedimiento, 
ya que se pueden producir abortos en un 2%-3% de los casos. Así mismo, existen 
 - 31 -
evidencias de que esta técnica puede provocar anormalidades en las extremidades 
del embrión si el ensayo se realiza antes de las nueve semanas de gestación 
(Mueller, 2001). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9. Representación esquemática de una biopsia de vellosidades 
coriónicas. A) Transabdominal, B) Endovaginal. El retiro de la muestra se hace 
dependiendo de la posición uterina, de la placenta, el reacomodo físico del bebé 
y de lo que prefiera la madre (Modificado de Binns 2002). 
 - 32 -
II.8.4. Cordocentesis 
Las indicaciones más frecuentes para emplear esta técnica son los posibles 
diagnósticoS de talasemia, toxoplasmosis o rubéola fetal, valoración y tratamiento 
de isoinmunización por Rh intensa y obtención rápida de cariotipo fetal, mediante 
esta última técnica se puede obtener el sexo del bebé. El estudio citogenético para 
este tipo de muestra (sangre fetal) puede corroborar mosaicismos en muestras de 
vellosidades coriónicas o del líquido amniótico y por sospechas de cromosompatía 
fetal del ultrasonografista al observar malformaciones fetales, retardo en el 
crecimiento y oligohidramnios (disminución de liquido amniótico) o polidramnios 
(aumento de liquido amniótico). Se realiza entre la semana 9 y 10 de gestación y 
tiene un riego de pérdida fetal elevado de hasta un 10% y no se solicita solo para 
conocer el sexo del futuro bebé (Guizar-Vázquez, 2001), (figura 10).Figura 10. Representación esquemática de una cordocentesis. Muestra la 
obtención del DNA fetal mediante la vena umbilical con ayuda de ultrasonido 
(Modificado de Binns, 2002). 
 - 33 -
II.8.5. Diagnóstico Genético de Preimplantación (DGP) 
 El diagnóstico preimplantatorio aparece como un nuevo campo que, unido a las 
técnicas de reproducción asistida, permite obtener un diagnóstico genético precoz 
en los estadíos previos a la implantación. Consiste en la biopsia de uno o dos 
blastómeros de un embrión para su análisis genético antes de la implantación, lo 
que permite seleccionar el embrión que será transferido. Para este estudio puede 
emplearse técnicas de biología molecular (PCR) o citogenética molecular (FISH) 
ambas permiten determinar el sexo del embrión. 
 
 El diagnóstico preimplantatorio se ofrece en la actualidad como un 
procedimiento de elección a aquellas parejas que presentan un riesgo elevado de 
transmitir a su descendencia determinadas enfermedades genéticas, enfermedades 
ligadas al sexo, así como para descartar la presencia de alteraciones 
cromosómicas numéricas y estructurales en los embriones. Esta alternativa resulta 
atractiva, ya que las posibilidades de embarazo son similares a la que ofrece un 
tratamiento de fecundación in vitro (FIV) convencional y resulta éticamente más 
aceptable que un diagnóstico prenatal seguido de aborto selectivo (Verlinsky, 1993; 
Muñoz-Nuñez, 2005). El DGP tiene varias desventajas para saber el sexo del bebé, 
entre ellas se requiere de una biopsia de 1 o 2 blastómeros del embrión (figura 11) 
lo cual puede resultar un poco incómodo para la madre además de que se requiere 
de material sofisticado para el procedimiento. 
 
 FISH es una técnica muy usual para identificación del sexo genético del 
embrión y la presencia o no de anormalidades cromosómicas mediante 
fluorescencia (figura 11), la desventaja que tiene esta técnica es que utiliza sondas 
de marcaje que son de costo elevado así como un microscopio de fluorescencia 
con filtros adecuados, no cualquier laboratorio cuenta con esto, además de que el 
procedimiento es muy tardado y debe ser elaborado por personal muy bien 
capacitado (Verlinsky, 1993;Binns, 2000; Muñoz-Nuñez, 2005). 
 
 - 34 -
 
 
 
 
 
 
 
 
 
II.8.6 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 
 
 Una de las metodologías más utilizadas para amplificar un fragmento de 
DNA específico, es la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). En esta 
reacción se puede amplificar una región específica de DNA, hasta llegar a tener un 
gran numero de copias en poco tiempo, aún y cuando el DNA original se presenta 
en cantidades muy pequeñas. Esta reacción es catalizada por una enzima llamada 
DNA polimerasa que sintetiza una cadena de DNA en dirección 5’ a 3’, usando 
como molde una de las cadenas de DNA. Con esta reacción sólo se amplifica el 
fragmento de interés ya que los oligonucleótidos específicos se complementan con 
las regiones de DNA que limitan dicho fragmento. 
 
 
 
 
Figura 11. Imágenes de DGP. A) Biopsia embrionaria, B) imagen de FISH que 
muestra marcaje del cromosoma 18 (aqua), X (verde) y Y (rojo) (Modificado de 
Verlinsky, 1993; Muñoz-Nuñez, 2005).
A 
B 
 - 35 -
 
 
 
 
 
 
IV. HIPÓTESIS 
 Si el DNA fetal está presente en la circulación materna entonces se podrá 
determinar el sexo del bebé a través de la amplificación de genes específicos de los 
cromosoma X (ATL) y Y (SRY). 
 
V. OBJETIVOS 
V.1. GENERAL 
 Establecer un método de diagnóstico prenatal no invasivo para la 
determinación temprana de sexo mediante la técnica de Reacción en 
Cadena de la Polimerasa (PCR). 
V.2. PARTICULARES 
 Realizar la extracción del DNA de los controles positivo (varón) y negativo 
(mujer) para el gen SRY y establecer las condiciones de amplificación para 
las secuencias de los genes SRY, β globina y ATL1. 
 Lograr extraer el DNA fetal de algunas mujeres embarazadas a partir de la 
novena semana de gestación y comparar la sensibilidad y especificidad del 
método I entre suero y plasma. 
 Determinar la sensibilidad de nuestro método contra la confirmación del sexo 
fetal por ultrasonido. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 36 -
VI. METODOLOGÍA 
 
VI.1 Materiales y Equipo 
 
VI.1.1. Equipo 
 Micropipetas de 1000 µL, 200 µL,100 µL, 20 µL,10 µL, 2 µL 
 Cámara de electroforesis 
 Balanza analítica 
 Vortex 
 Centrifuga 
 Microcentrifuga 
 Incubador 
 Refrigerador de -20 ºC y 4 °C 
 Espectrofotómetro uv-vis 
 Campana para PCR con lámpara UV y flujo de aire 
 Termociclador Mastercycler Eppendor 
 Fuente de poder 
 Transiluminador de luz UV con programa para analizar imágenes 
VI.1.2 Materiales 
 Pipetas Pasteur y bulbos 
 Puntas para micropipetas estériles con y sin filtro 
 Tubos eppendorf de 2.0 mL, 1.5 mL, 0.5 mL, 0.2 mL 
 Probetas de 100 mL y 250 mL 
 Agujas para sistema vacutainer 
 Adaptador para vacutainer 
 Sistema de tubos al vació (vacutainer) con anticoagulante EDTA (tapa 
morada) y sin anticoagulante (tapa roja) 
 Matraz erlenmeyer de 250 mL 
 Puntas para micropipetas estériles con y sin filtro de 1000 µL, 100 µL, 10 µL, 
2 µL 
 Tubos eppendorf de 2.0 mL, 1.5 mL, 0.5 mL, 0.2 mL 
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VI.1.3. Reactivos 
 
 Reactivos para la extracción de DNA genómico QIAamp DNA Blood 
Mini (Qiagen). Contiene: Proteasa, Buffer AL, Buffer AW1, AW2 
 Alcohol (100% puro) 
 RNAasa (100 mg/mL) 
 Solución salina fisiológica 
 Agua Milli-Q estéril 
 Buffer TBE 0.5X (ácido bórico 0.9 M, EDTA 0.09 M, Tris 1.0 M) pH 8.4 
 Bromuro de etidio (5 mg/mL) 
 Agarosa ultrapura (temperatura de gelificación 34.5 a 37.5ºC) 
 Buffer 10X PCR (200 mM Tris-HCl (pH8.4); 500 mM KCl 
 MgCl2 50 mM 
 dNTP’s 10 mM 
 Platinium Taq DNA polimerasa 
 Buffer de carga 10X (65% w/v) sucrosa; 10 mM Tris-HCl (pH 
7.5);10mM EDTA; 0.3% (w/v) azul de bromofenol 
 Marcador de DNA de100 pares de bases 
 Secuencia de oligonucleótidos (tabla 1) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 38 -
 
Tabla 1. Secuencia de oligonucleótidos para la identificación del sexo fetal 
GEN SECUENCIA MÉTODO 
Β-globina F 5’ TCC TGA GGA GAA GTC TGC CG 3’ I 
β-globina R 5’ ACA GCA TCA GGA GTG GAC AG 3’ I 
β- globina F’ 3 Nested 5’ GTG AAC GTG GAT GAA GTT GG 3’ I 
SRY F 5’ GTG TCC TCT CGT TTT GTG AC 3’ I 
SRY R 5’ GAA TCA TCG CTG TTG AAT AC 3’ I 
SRY F’ 5Nested 5’ TGG CGA TTA AGT CAA ATT CGA 3’ I 
SRY R’ 3Nested 5’ CTA GTA CCC TGA CAA TGT ATT 3’ I 
ATLX1 F 5’ CCCTGATGAAGAACTTGTATCTC 3’ II 
ATLX2 F’ 5’ TCGCCTTTCTCAAATTCCAAG 3’ II 
ATLX3 R 5’ GAAATTACACACATAGGTGGCACT 3’ II 
SRY Y1.5 F 5’ CTAGACCGCAGAGGCGCCCAT 3’ II 
SRY Y1.6 R 5’ TAGTACCCACGCCTGCTCCGG 3’ II 
SRY Y1.7 F’ 5’CATCCAGAGCGTCCCTGGCTT 3’ II 
SRY Y1.8 R’ 5’ CTTTCCACAGCCACATTTGTC 3’ II 
 
VI.1.4. Material biológico 
 
1 Sangre periférica de mujer (control negativo) y varón (control positivo) sanos, 
respectivamente para gen SRY. 
2 Suero y plasma extraídos de sangre periférica de mujeres embarazadas con 
un mínimo de nueve semanas de gestación. 
 
VI. 2. Métodos 
 
VI.2.1. Población de estudio 
Se eligieron mujeres embarazadas con un mínimo de nueve semanas de 
gestación, referidas del Instituto Médica Fértil-Querétaro. Al momento de colectar la 
 - 39 -
muestra de sangre periférica se les pidió llenar una solicitud con algunos datos 
personales (nombre completo, edad, semanas de gestación, entre otros), ver anexo 
I. Además a cada una de ellas se les solicitó leer y firmar una carta de 
consentimiento informado, la cual explica de manera general en que consiste el 
procedimiento, los beneficios del mismo, sus derechos como sujetos de 
investigación, así como los nombres de los responsables del proyecto (ver anexo 
II). 
 
VI.2.2. Venopunción 
 La sangre fue extraída de la vena cubital. El sitio de punción se limpió con 
un antiséptico. Posteriormente se colocó una banda elástica alrededor de la parte 
superior del brazo con el fin de aplicar presión enel área y hacer que la vena se 
dilate. Se introdujó la aguja en la vena y se recogió la sangre en dos tubos al vacío, 
uno con anticoagulante y otro sin anticoagulante, rotulados con el nombre de la 
paciente. La banda elástica se retiró del brazo. Una vez que se recolectaron las 
muestras de sangre, se retiró la aguja y se cubrió el sitio de punción con una 
torunda impregnada de alcohol o un parche. 
 
VI.2.3. Registro de muestras 
A los tubos y a las solicitudes de cada paciente se les asignó una clave única 
que consistió en: SF-00-00, donde SF significa sexo fetal, los siguientes dígitos son 
el número consecutivo de las muestras (según el orden de llegada al laboratorio) y 
los últimos dígitos correspondieron al año en que se tomó la muestra, este código 
nos permitió identificar de forma única y práctica a cada muestra. 
 
Por otra parte, todas las muestras fueron registradas en una bitácora donde 
están identificadas por su clave, nombre, resultados, entre otros datos. 
 
 
 
 
 - 40 -
VI.2.4. Extracción de DNA 
 
VI.2.4.1. Parte A 
Una vez que se realizó la recolección de la muestra sanguínea se procedió 
a centrifugar las muestras a 3,000 rpm durante 10 minutos, posteriormente se 
extrajo el suero y el plasma colocándolos en tubos limpios y estériles, 
respectivamente. Seguido de una segunda centrifugación a 3,000 rpm por 10 
minutos, donde se volvió a recolectar por separado el suero y el plasma en tubos 
de 2 mL, los cuales fueron rotulados con su clave única para su fácil manipulación e 
identificación. 
 
VI.2.4.2. Parte B 
En un tubo de 1.5 mL se colocaron 30 µL de proteasa, después se 
agregaron 300 µL de suero y/o plasma obtenidos en la parte A (las muestras de 
suero y plasma siempre fueron procesadas por separado). Después se le adicionó 
1 µL de RNAsa y 300 µL de buffer AL. Se mezcló vigorosamente por 15 segundos, 
para después incubarlos a 56 °C por 10 minutos en un baño maria, después se 
agregaron 300 µL de etanol al 100% puro y se centrifugaron las muestras por 5 
segundos. 
La solución anterior se colocó en las columnas de Qiagen que contenían un 
tubo colector en la parte inferior. Posteriormente se centrifugó a 8,000 rpm durante 
1 minuto y se desechó la solución del tubo colector. Se volvió a colocar el tubo 
colector a la columna, seguido de la adición de 500 µL del buffer AW1 a la 
columna, centrifugándose a 8,000 rpm durante 1 minuto, una vez más se desechó 
la solución del tubo colector y este se colocó nuevamente a la columna donde se le 
adicionaron 500 µL del buffer AW2. Se centrifugó a 14,000 rpm durante 3 minutos. 
La columna se colocó en un tubo limpio y estéril de 1.5 mL agregándole 30 µL de 
buffer AE, se dejaron las muestra 5 minutos a temperatura ambiente y se 
centrifugaron a 8,000 rpm durante 1 minuto, el filtrado que se obtuvo era el DNA, 
mismo que fue almacenado a -20 °C hasta su uso. 
 
 - 41 -
Nota: La muestra para extracción de DNA de los controles positivo y negativo 
fueron a partir de sangre completa, por lo cual solo se emplea la parte V.2.4.B. 
 
VI.2.5. Cuantificación de DNA 
Se cuantificó el DNA de los controles positivo y negativo en un 
espectrofotómetro uv-vis midiendo la densidad óptica (DO) a una longitud de onda 
de 260 nm para DNA y 280 nm para RNA, la dilución que se empleó fue de 1:50. 
Considerando que una DO es igual a 50 µg de DNA/mL. La concentración de DNA 
se calculó con base en la siguiente fórmula: DO260 X 50 X dilución. La relación de 
DNA/RNA debe ser mayor a 1.8 lo que indica la pureza del DNA obtenido. 
 
VI.2.6. Integridad de DNA 
 Para observar la integridad del DNA obtenido de los controles positivo (CP) y 
control negativo (CN), se utilizó el método de electroforesis en geles de agarosa al 
2%, teñidos con bromuro de etidio (5 mg/mL) para poder observar el material 
genético por medio de un transiluminador de luz UV. Las imágenes obtenidas se 
capturaron y analizaron posteriormente con un programa de imágenes (Quantity 
One). 
 
VI.2.7. Amplificación por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) 
 
 El proceso se realizó mezclando el DNA con dNTP’s, oligonucleótidos y DNA 
polimerasa. Inicialmente se desnaturaliza el DNA entre 94°C o 95°C, después se 
baja la temperatura (variable) para que los oligonucleótidos se hibriden a la 
secuencia del DNA complementario y finalmente se aumenta la temperatura a 72°C 
que es la temperatura óptima para la enzima DNA Taq Polimerasa. Así el proceso 
se repite de 30 a 40 ciclos, llegando a obtener 2n moléculas de doble cadena 
(siendo n igual al número de ciclos) a partir de cada molécula molde. La reacción se 
finalizó enfriando la muestra a 4ºC para su conservación. 
 
 - 42 -
VI.2.8. PCR interna 
Existen algunas variaciones de PCR, una de ellas es la PCR interna que se 
empleó en este estudio para el método I y II. Una vez que se realizó la PCR 
convencional, el producto que se obtuvo, se utilizó como molde para una segunda 
reamplificación pero esta vez los oligonucleótidos que se usarón delimitaron aún 
más la región que se amplificó en la reacción. 
 El método de la PCR interna se utiliza sobre todo cuando se tienen 
pequeñas cantidades de DNA de interés ó cuando se quieren evitar amplificaciones 
inespecíficas que a veces se observan con la PCR clásica. 
 
VI.2.9. PCR múltiple 
Otra modificación de la técnica de PCR convencional es cuando se emplean 
dos o más pares de oligonucleótidos en el mismo tubo con el fin de amplificar 
simultáneamente múltiples segmentos de DNA. 
 
VI.2.10. Reacción de PCR múltiple- interna 
La reacción de PCR se realizó en condiciones estériles y todo el proceso se 
llevó a cabo en una campana para PCR, la cual antes de iniciar el procedimiento 
permaneció de 15 a 30 minutos con la luz UV, junto con todo el material que fue 
utilizado para esta metodología (micropipetas, puntas para micropipetas, viales de 
varios tamaños, gradilla, agua, microcentrifuga, marcador indeleble y guantes). La 
reacción de amplificación del DNA se llevó acabo en un volumen final (vf) de 25 µL 
para el método I en ambas reacciones de amplificación, para el método II se 
utilizaron para la primera reacción un (vf) de 50 µL y para la segunda reacción un 
(vf) de 25 µL. En las tablas 1 y 2 se presentan las concentraciones y volúmenes de 
los reactivos utilizados para cada PCR según el método I o método II. 
 Tanto la extracción del DNA, la mezcla para la reacción de PCR, la 
amplificación y el análisis de los productos fueron procesados en áreas separadas 
 - 43 -
para evitar contaminación de material genético. 
 
Tabla 2. Mezcla de reacción de la primera amplificación del método I y II 
PRIMERA REACCION DE AMPLIFICACIÓN 
MÉTODO I MÉTODO II 
REACTIVOS CONCENTRACION CONCENTRACION 
H2O 25 µL 50 µL 
Buffer 1X 1X 
MgCl2 1.5 – 3 mM 2.5 Mm 
dNTP’S 0.2 mM 0.2 Mm 
Platinum Taq DNA 
polimerasa 
1 U/ µL 1 U/ µL 
Oligonucleótidos 0.4 – 0.8 µM 
a) SRY (F+R)(F+3N) 
(5N+3N) 
a) β-globina (F+R) 
0.8 µM 
a) ATL (X1 +X3) 
b) SRY (Y1.5+Y1.6) 
controles paciente Controles Pacientes DNA molde 
CP= (100 µg/mL) 
CN= (82.5 µg/mL) 
3 µL 10 µL 3 µL 10 µL 
CP=Control Positivo 
CN=Control Negativo 
 
Tabla 3. Mezcla de reacción de la segunda amplificación del método I y II 
SEGUNDA REACCION DE AMPLIFICACIÓN 
MÉTODO I MÉTODO II 
REACTIVOS CONCENTRACION CONCENTRACION 
H2O 25 µL 25 µL 
Buffer 1X 1X 
MgCl2 1.5 – 3 mM 2.5 Mm 
 - 44 -
dNTP’S 0.2 mM 0.2 mM 
Platinum Taq DNA 
polimerasa 
1 U/ µL 1 U/ µL 
Oligonucleótidos 0.4 – 0.8 µM 
a) SR Y (5N+3N) 
b) β-globina (R+3N) 
0.8 µM 
a) ATL1 (X2 +X3) 
b) SRY (Y1.7+Y1.8) 
Controles paciente Controles Pacientes DNA molde 
CP =(100 µg/mL) 
CN =(82.5 µg/mL) 
1.5 µL 5 µL 1.5 µL 5 µL 
CP=Control Positivo 
CN=Control Negativo 
 
VI.2.11. Condiciones de amplificación 
 
VI.2.11.1. Condiciones de amplificación para el método I y IIMétodo I. 
Desnaturalización inicial de 94 ºC por 5 minutos, seguida de 30 ciclos de 
94ºC por 30 segundos, 55 ºC por 30 segundos, 72 ºC por 1 minuto, finalizando con 
una extensión a 72 ºC por 7 minutos y enfriando la muestra a una temperatura de 
4 °C para su conservación. Empleándose las mismas condiciones en la primera y 
segunda reacción de amplificación. 
 
Método II. 
 Desnaturalización inicial de 94 ºC por 3 minutos, seguida de 40 ciclos de 
94ºC por 1 minuto, 55 ºC por 1 minuto, 72 ºC por 1 minuto y enfriando la muestra a 
una temperatura de 4 °C para su conservación. Empleándose las mismas 
condiciones en la primera y segunda reacción de amplificación. 
 
 
 - 45 -
 VI.2.12. Oligonucleótidos para los genes: SRY, β-globina y ATL1 
Para el gen SRY se utilizó una secuencia especifica ubicada en el brazo 
corto del cromosoma Y (Zhong, 2000). La secuencia de ATL1 se encuentra en el 
gen FMR1, localizado en el brazo largo del cromosoma X (Warunee, 2003). El gen 
de la β-globina es una secuencia específica que se encuentra en el brazo corto del 
cromosoma 11 (Zhong, 2000). Todas las secuencias fueron confirmadas en la base 
de datos del Gen Bank. Se realizó una serie de diferentes combinaciones de 
oligonucleótidos para poder amplificar el gen SRY, el gen β-globina y ATL1, como 
se muestran a continuación (tabla 3). 
 
Tabla 4. Combinación de oligonucleótidos del gen SRY, β-globina y ATL1 para 
la amplificación por PCR. 
PAREJAS DE OLIGONUCLEOTIDOS 
PARA LA PRIMERA REACCION 
PAREJAS DE OLIGONUCLEOTIDOS 
PARA LA SEGUNDA REACCION 
OLIGONUCLEOTIDOS DEL METODO I 
SRY (F+R) 393pb SRY (5N+3N) 133pb
SRY (F+3N) 174pb SRY (5N+3N) 133pb
SRY (5N+R) 352pb SRY (5N+3N) 133pb
SRY (F+R) 393pb SRY (F+R) 393pb
SRY (5N+3N) 133pb SRY (5N+3N) 133pb
SRY (F+R) (F+3N) (5N+3N) SRY (5N+3N) 
β-globina (F+R) 281pb β-globina (F+3N) 60pb
β-globina (F+R) 281pb β-globina (R+3N) 241pb
OLIGONUCLEOTIDOS DEL METODO II 
ATL (X1+X3) 301pb ATL (X2+X3) 261pb
SRY (Y1.5+Y1.6) 239pb SRY (Y1.7+Y1.8) 198pb
 
 
 
 
 - 46 -
 VI.2.13. Análisis del DNA amplificado por PCR empleando el método I y II 
mediante electroforesis 
 
Para el análisis de los fragmentos amplificados por PCR se utilizaron 10 µL 
de cada muestra y se cargaron en un gel de agarosa al 2.0%, conteniendo TBE 1X 
y bromuro de etidio (5 mg/mL). La electroforesis se llevó a cabo en los primeros 20 
minutos a 100 V y después a 80 V durante 2 horas. Una vez que la muestra migró 
en el gel, se observó el DNA por medio de un transiluminador de luz UV y se 
capturo la imagen, la cual se procesada en un analizador de imágenes (Quantity 
One 1-D). 
 
 
 
 
VI.3.1 Evaluación de resultados 
Nuestros resultados fueron comparados semanas después de la realización 
del estudio molecular con métodos de ultrasonográficos, Los resultados que se 
obtuvieron además de ser entregados a las interesadas también se respaldarón en 
bitácoras y en un archivo electrónico que contiene el reporte, así como las 
imágenes obtenidas de cada muestra. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 47 -
VII. RESULTADOS 
 
VII.1. Extracción, cuantificación e integridad del DNA 
 
 Una vez extraídas las muestras de DNA de los CP, CN y fetales 
posteriormente, se cuantificaron las muestras de DNA de los controles a una 
absorbancia de 280 nm, los valores obtenidos fueron de 82.5 ng/mL de DNA 
genómico para el CN y 100 ng/mL de DNA genómico para el CP. En la literatura se 
reporta que la cantidad de DNA fetal libre de células representa entre un 3.4% 
hasta un 6.2% del total de plasma materno en un embarazo temprano y tardío 
respectivamente (Chan, 2004). Por esta razón en las muestras de suero y plasma 
no se realizó la cuantificación, de tal manera que nos permitió optimizar la muestra. 
 
 Para determinar la integridad de DNA se llevó a cabo una electroforesis en 
un gel de agarosa al 2%. En la figura 12 se muestra la imagen del gel donde se 
pueden observar dos bandas que corresponden al DNA genómico, la primera 
corresponde al CP y la segunda al CN, las cuales nos indican que no existe 
degradación del material, lo que verifica la buena calidad del DNA. 
 
 
Figura 12. Integridad del DNA obtenido de controles. Electroforesis en gel de agarosa al 
2% del DNA genómico del CP (100 ng/mL) y CN (82.5 ng/mL). 
 
 
 - 48 -
VII.2. Amplificación del gen SRY y β-globina por el método I 
 
 Una vez que se verificó la calidad y la cuantificación del DNA de los CP y 
CN, el material genético se utilizó para obtener las condiciones de amplificación de 
los genes SRY y β-globina mediante un ensayo de PCR, en el cual se emplearon 
diversos pares de oligonucleótidos como se muestran en la tabla 1 y 3. Los 
productos amplificados fueron analizados por electroforesis en geles de agarosa al 
2% obteniendo así los 3 fragmentos esperados. 
 
 La figura 13 muestra las amplificaciones que se obtuvieron para el gen SRY 
por el método I, en la Línea 1 (L1) se observó el fragmento de 174 pb. En la Línea 3 
(L3) se observaron los fragmentos de 174 pb y el de 133 pb. En la Línea 5 (L5), se 
observó el fragmento de 133 pb y en Línea 7 (L7) se observó un fragmento de 393 
pb. En la Línea 9 (L9) no observó amplificación. La línea 2, 4, 6, 8,10 muestran los 
blancos de cada reacción. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 49 -
 
 M L1 L 2 L 3 L4 L5 L 6 L7 L8 L9 L10 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 13. Amplificación del gen SRY del CP empleando diferentes combinaciones de 
oligonucleótidos por el método I. Gel de agarosa al 2% mostrando diferentes fragmentos 
empleando los siguientes oligonucleótidos para el gen SRY del método I: L1 (F+R 
393pb/F+3N 174 pb/5N+3N 133pb); L2 blanco; L3 (F+3N 174pb/5N+3N 133pb); L4 blanco; 
L5 (5N+R 352pb/5N+3N 133pb); L6 blanco; L7 (F+R 393pb/ F+R 393pb); L8 blanco; L9 
(5N+3N 133pb /5N+3N 33pb) y L10 blanco. 
 
 Estos resultados nos permitieron identificar las mejores condiciones de 
amplificación para el gen SRY. Por lo tanto, las combinaciones de oligonucleótidos 
con los que se decidió trabajar fueron los siguientes: (F+R de 393 pb) (F+3N de 
174pb) (5N+3N de 133pb) para la primera reacción y (5N+3N de 133pb) para la 
reamplificación, obteniendo así un fragmento final de 174 pb, el cual se muestra en 
la figura 14, donde puede observarse en la Línea (L1) la amplificación del gen SRY 
del CP y en la Línea 2 (L2) se presenta el blanco de la reacción. 
 
 600 
 500 
400 
 300 
 200 
 100 
 174 pb 
 174 pb 
393 pb 
133 pb
133 pb
 - 50 -
 
Figura 14. Amplificación del gen SRY de CP por el método I. Gel de agarosa al 2% que 
muestra la amplificación del gen SRY de 174 pb en la L1=CP, L2=blanco y M=Marcador de 
100 pb 
 
 Para asegurar que cuando no se amplifica el gen SRY se debe a que el 
material genético corresponde a una mujer y no por ausencia de DNA, se realiza la 
amplificación de un gen control (β-globina) que está presente tanto en el genoma 
masculino como en el femenino. 
 
 Para la amplificación del gen β-globina se empleó una PCR-interna, con los 
juegos de primers mencionados en el apartado V.2.12, y el DNA de CN. La figura 
15 muestra en la Línea 1 (L1) la amplificación del fragmento esperado de 281 pb, 
en la Línea 3 (L3) un fragmento de 241 pb y otro de 281 pb que corresponde al gen 
de la β-globina, en la Línea 2 (L2) y Línea 4(L4) se muestra el blanco de la 
reacción. 
 
 
 
 
 600 
 500
 400
 300
 200
 100
M L1 L2 
174 pb 
 - 51 -
 
 
 
 
Figura 15. Amplificación del gen β-globina del CN por el método I. Gel de agarosa al 2 
% que muestra la amplificación del gen β-globina en la L1=DNA CN (F+3N 281 pb), 
L3=DNA CN(R+3N 241 pb), L2 y L4=blancos de reacción y M= Marcado de 100 pb. 
 
VII.3. Diluciones del DNA del Control Positivo para el gen SRY por el método I 
 
Se emplearon una serie de diluciones del DNA del CP para la amplificación 
del gen SRY (L1=100 ng/ µL, L2=10 ng/ µL, L3=1 ng/ µL, L4=0.1 ng/ µL, L5=0.01 
ng/ µL L6=0.001 ng/ µL, L7= blanco), esto se realizo con la finalidad de determinar 
la sensibilidad de la técnica para determinación de sexo fetal en las primeras 
semanas de gestación, obteniendo así que la concentración mínima para poder 
amplificar era de 0.01ng/µL de DNA genómico. Ver figura 16. 
 
 
 
 
 
 
 
 300 
 200 
 100 
M L1 L2 L3 L4 
281 pb 281 pb 
241 pb
 - 52 -
 
Figura 16. Diluciones del DNA del CP para amplificar el gen SRY por el método I. Gel 
de agarosa al 2% mostrando diluciones seriadas de DNA que revela la amplificación del 
gen SRY en el CP, en la L1= 100 ng/µL; L2= dil 1/1; L3 1/10; L4= 1/100; L5= 1/1000; L6= 
1/10,000; L7= blanco y M= marcador. 
 
VII.4. Amplificación del gen SRY empleando DNA fetal por el método I 
 
Se logro extraer el DNA fetal de suero y plasma de todas las mujeres 
embarazadas con un minino de 9 semanas de gestación, las muestras se 
procesarón de acuerdo a las condiciones de mezcla de reacción del método I (ver 
tabla 1 y 2 en la sección (V.2.10). Considerando que el DNA fetal está en 
fragmentos muy pequeños y además la cantidad es muy baja (Angert, 2003), se 
empleo una PCR interna usando los siguientes primers para la amplificación: (F+R, 
393 pb) (F+3N, 174pb)(5N+3N, 133pb) y reamplificación (5N+3N, 133pb). En la 
figura 17 se muestra la amplificación del caso SF-01-07, donde se observó una 
banda de 174 pb que corresponde al gen SRY del feto en la Línea 1 (L1) suero, en 
la Línea 2 (L2) no se amplificó el fragmento esperado con la muestra de plasma y 
en la Línea 3 (L3) hay una banda de 174 pb que corresponde al gen SRY del CP, 
la Línea 4 (L4) corresponde al blanco de reacción. 
M L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 
 600 
 500 
 400 
 300 
 200 
 100 
 - 53 -
 
Figura 17. Amplificación del gen SRY en DNA fetal por el método I. Fotografía de un 
gel de agarosa al 2% donde se muestra la amplificación del gen SRY a partir de suero y 
plasma de una mujer embarazada de 9 sdg. M=Marcador; L1= DNA fetal a partir de suero; 
L2= DNA fetal a partir de plasma; L3= DNA de CP; L4= blanco de reacción. 
 
VII.5. Amplificación de los Genes SRY y ATL1 por el método II 
 
 En la figura 18 se muestran los resultados de la primera reacción de 
amplificación; en el CP se observa un fragmento de 239 pb correspondiente al gen 
SRY y un fragmento de 301 pb que corresponde al gen ATL1, mientras que para el 
CN solo se observa la banda esperada del gen ATL1 de 301 pb, localizado 
únicamente en los cromosomas X. 
 
 
 
 600 
 500 
 400 
 300 
 200 
 100 
M L1 L2 L3 L4 
174 174 
 - 54 -
 
Figura 18. Primera amplificación de los genes SRY Y ATL1 del CP y CN mediante el 
método II. Gel de agarosa al 2% que muestra: B=Blanco de reacción, CP= DNA del 
Control Positivo (fragmentos de 301pb y de 239 pb del gen ATL1 y SRY respectivamente), 
CN=DNA de Control Negativo (fragmento de 301 pb del gen ATL1), M= Marcador. 
 
 Para hacer la reacción de PCR más específica y obtener mayor cantidad de 
fragmentos esperados se efectuó una segunda amplificación empleando 
oligonucleótidos que delimitan aún más las regiones que se desean amplificar (ver 
tabla 2 en la sección V.2.10). Empleando el DNA de la primera reacción como 
molde para la segunda reacción. En la figura 19 se observan los productos 
amplificados para el gen ATL1 con un fragmento esperado de 261 pb y para el gen 
SRY un fragmento de 198 pb que corresponden al CP confirmando la presencia de 
material genético correspondiente de un varón y para el CN solo se observa un 
fragmento de 261 pb que pertenece al gen ATL1 que identifica la presencia de 
material genético femenino y la ausencia del gen SRY, esto confirma que el DNA 
analizado corresponde al genotipo de una mujer. 
 
239 
301 301
SRY 
ATL1 
 - 55 -
 
 
Figura 19. Segunda amplificación del gen ATL1 y SRY de CP y CN por el método II. 
Gel de agarosa al 2% que muestra la segunda amplificación de los genes SRY y ATL1, CP 
amplifica para el gen SRY (198pb) y ATL1 (261pb) y por ultimo el CN que amplifica solo al 
gen ATL1 (261 pb). 
 
VII.6. Diluciones del DNA de controles para los Genes SRY Y ATL1 por el 
método II 
 
 Se emplearon una serie de diluciones del DNA tanto del CP como del CN 
que corresponden a las siguientes concentraciones: L1=blanco, L2=10 ng/µL, L3=1 
ng/µL, L4=0.1 ng/µL, L5=0.01 ng/µL, L6=0.001 ng/ µL, L7=0.0001 ng/ µL. Las 
cuales se emplearon para la amplificación de los genes SRY (198 pb) y ATL1 (261 
pb), con la finalidad de determinar la sensibilidad que tenía nuestro método de 
determinación de sexo fetal en las primeras semanas de gestación. La 
concentración más baja en la cual se observa la amplificación de los genes SRY y 
ATL1 en el CP y CN fué de 0.0001 ng/µL, ver figura 20 y 21. 
 
 
 
300 
200 
100 
 M CP CN 
 261 pb 261
 198 pb 
ATL1 
SRY 
 - 56 -
 
Figura 20. Diluciones empleadas para la amplificación del gen ATL1 (261 pb) deL CN 
por el método II. El gel de agarosa al 2% muestra las amplificaciones del gen ATL1 en la, 
L2= DNA concentrado (100 ng/µl), L3= dil 1/1, L4=1/10, L5=1/100, L6=1/1000, L7= 10, 000, 
L1= blanco y M= marcador. 
 
 
 
 
Figura 21. Diluciones empleadas para la amplificación de los genes SRY (198 pb) de 
CP y ATL1 (261 pb) de CN por el método II. El gel de agarosa al 2% que muestra en la 
L2=DNA concentrado 82.4 ng/µl, L3=dil 1/1, L4=1/10, L5=1/100, L6=1/1000, L7=10, 000, 
L1=blanco y M= marcador. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 600 
 
 300 
 
100 
 M L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7
500
 400 
 200 
ATL1 
SRY 
600
500
400 
300
200
100
 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 M
ATL1 
 - 57 -
VII.7. Amplificación del Gen SRY a partir de DNA fetal por el método II 
 
Se extrajó el DNA fetal de suero y plasma de una mujer embarazada con 28 
semanas de gestación, la muestra se proceso de acuerdo a las condiciones de 
mezcla de reacción del método II (ver tabla 2 y 3), empleando los siguientes 
primers: ATL1 (X1+X3 301 pb), SRY (Y1.5+Y1.6 239 pb) para la primera reacción 
de amplificación; ATL1 (X2 +X3 261 pb) y SRY (Y1.7+Y1.8 198 pb) para la segunda 
reacción de reamplificación. 
 
La figura 21 muestra las amplificaciones del gen SRY (198 pb) y ATL1 (261 
pb) empleando el DNA fetal de suero Línea 2 (L2) y de plasma Línea 3 (L3) de una 
mujer embarazada con 28 sdg. En Línea 4 (L4) se observa el fragmento que 
corresponde a los genes del CP. 
 
 
Figura 22. Amplificación del gen SRY en DNA fetal por el método II. Fotografía de un 
gel de agarosa al 2% muestra la amplificación del gen SRY a partir de suero y plasma de 
una mujer embarazada con 28 sdg. L1 blanco de reacción, L2= DNA fetal a partir de suero, 
L3= DNA fetal a partir de plasma, L4= DNA de CP, M=Marcador. 
 
 
 600 
300
200
 100 
 400 
 500 
ATL1 
SRY 
M L1 L2 L3 L4 
 - 58 -
VII.8. Aplicación del método I a la población interesada en conocer el sexo de 
su futuro bebé 
 
 Todas las muestran fueron recolectadas en el Instituto Médica Fértil 
Querétaro y procesadas inmediatamente, excepto el caso SF-004-07 que se dejo 
intencionalmente tres horas después derecolectada la muestra con la intención de 
saber si el DNA fetal podría detectarse sin que se degradará, sin embargo se 
requiere de un número de muestras mas grande para determinar el tiempo de vida 
media del DNA fetal una vez que se extrajo la muestra. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 59 -
 
 
Tabla 5. Resultados del estudio no invasivo para la detección de sexo fetal 
por el método I 
 
 Número sdg Secuencia especifica 
 de caso del cromosoma Y 
 S P USG PCR / USG 
 
SF-001-07 9 + - M M/ M 
SF-002-07 17 - - F F/F 
SF-003-07☺ 22 - - F F/F 
SF-004-07 24 - -* M F/M 
SF-005-07 12 - +* F M/F 
SF-006-07 18 - + M M/M 
SF-007-07 11 - + M M/M 
SF-008-07 12 + + M M/M 
SF-009-07 13 - +* F M/F 
SF-010-07 12 - - F F/F 
+= Presencia del gen SRY 
-=Ausencia del gen SRY 
☺= Embarazo gemelar 
+*=Falso Positivo 
-*=Falso Negativo 
M= Masculino 
F= Femenino 
USG= 
Ultrasonido 
sdg= semanas de gestación 
S = Suero 
P= Plasma 
 60
 
Tabla 6. Sensibilidad y Especificidad del método I 
 Sensibilidad Especificidad 
Genero No total de muestra SRY 
M 5 4 4/5 (80%) 
F 5 3 3/5 (60%) 
 
M= Masculino 
F=Femenino 
SRY=gen de determinación de sexo en el cromosoma Y en humanos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 61
 
VIII. DISCUSIÓN 
 
Los resultados obtenidos en este trabajo confirman la existencia del DNA 
fetal en sangre periférica materna, al poder amplificar secuencias especificas: del 
cromosoma Y (SRY), del cromosoma X (ATL1) y de la β-globina empleando 
herramientas de biología molecular, específicamente mediante PCR interna y 
múltiplex, las cuales nos permitieron determinar el sexo del bebé en etapas 
tempranas del embarazo (González-González, et al., 2005; Zolotukhina, 2005; Lo 
et al., 2006). 
 
Actualmente para conocer el sexo del futuro bebé de manera segura tanto 
para la madre como para el feto, se emplea el estudio ultrasonográfico, pero esté 
tiene la desventaja de que solo puede visualizarse el sexo del bebé hasta la 
décima octava semana de gestación y en algunas ocasiones se dificulta observar 
los genitales debido a la posición, esto también se dificulta cuando existe un 
embarazo gemelar. Las otras técnicas para conocer el sexo del bebé son 
mediante técnicas invasivas en donde se obtiene líquido amniótico, biopsia de 
vellosidades coriales o sangre de cordón umbilical. 
 
Ambas técnicas incrementan el riesgo de provocar la pérdida fetal y son 
solicitadas principalmente para la detección de anormalidades genéticas, nunca 
únicamente para conocer el sexo del bebé. (Elias et al., 1993; Jackson, 1993). Sin 
embargo durante los últimos años los métodos de diagnóstico prenatal no invasivo 
han atraído la atención de médicos e investigadores (Zhong, 2000; Zolotukhina, 
2005; Lo, 2006). En este trabajo se ha mostrado que se desarrollaron nuevas 
estrategias para el diagnóstico prenatal no invasivo para la madre y el bebé, 
haciendo uso del descubrimiento del DNA fetal libre de células contenido en el 
suero y/o plasma materno (Lo, 1997; Bischof, 2005). 
 
 
 
 62
 
VIII.1 Identificación del DNA fetal 
 
 Para evidenciar el DNA fetal varios grupos de investigación pudieron 
detectar secuencias específicas del cromosoma Y en circulación de sangre 
periférica materna en mujeres que portaban un feto masculino mediante técnicas 
de PCR (Lo, 1990; Suzumori, 1992; Chan, 2004). Además se amplificaron 
secuencias especificas del cromosoma Y en dos muestras de mujeres que fueron 
sometidas a técnicas de reproducción asistida al décimo noveno día post-
concepción (p.c) (Thomas, 1994). Posteriormente se detectaron secuencias de 
SRY en plasma materno en la semana siete de gestación en un pequeño número 
de pacientes usando PCR –Tiempo Real (PCR- RT) (Lo, 1989). 
 
 Sin embargo, por varios años se tenía un desconcierto del origen del DNA 
fetal pero en fechas recientes se presume que el origen de este material genético 
en circulación materna proviene de cuerpos apoptóticos o necróticos del feto en 
desarrollo (Guibert, 2003; Bianchi, 2004). 
 
Por otra parte la apoptosis es el mecanismo más evidenciado por el cual se 
libera el DNA fetal a la circulación materna. Una de varias características de la 
apoptosis es la disposición ordenada de las células remanentes. Esta disposición 
toma lugar a través de la fragmentación celular dentro de cuerpos apoptóticos que 
contienen DNA o RNA (Sekizawa, 2000; Wijk, 2000; Halika, 2000; Hristoskova, 
2001), con la fragmentación celular en apoptosis también se puede predecir el 
tamaño del DNA fetal el cual mide arriba de 193 pb pero no excede de 313 pb. Un 
reporte reciente demostró que el DNA derivado de la madre basado en la 
amplificación de secuencias de genes de leptina fue más grande que el DNA fetal 
basado en la amplificación de secuencias del gen SRY, estos estudios sustentan 
la hipótesis que el DNA fetal puede ser distinguible de DNA materno (Chan, 2004; 
Bischoff, 2005). Por otra parte las células placentarias y/o fetales pueden contener 
DNA que es distinguible del DNA materno en plasma basándose en características 
 63
moleculares, tales como alelos fetales heredados del padre y la madre que 
pueden identificarse mediante patrones de metilación (Poon et al., 2002). 
 
 Se ha propuesto que para asegurar la obtención del DNA fetal, se realice 
una centrifugación, seguida de una filtración o micro centrifugación para obtener el 
DNA fetal libre de células (Chiu, 2001). Sin embargo, este mismo autor reporta 
que hay una diferencia significativa en la obtención de DNA fetal más grande 
cuando se hace una micro centrifugación que cuando se usan filtros. Nosotros 
decidimos realizar dos centrifugaciones de 3,000 rpm durante 10 minutos (Tufan, 
2005), por cuestiones de fácil y rápida obtención de DNA fetal, además de que 
una segunda centrifugación es mejor que emplear filtros, debido a que en este 
último método se llega ha perder DNA fetal, la mayoría de los grupos que trabajan 
con DNA fetal usan una segunda centrifugación obteniéndo de manera eficiente el 
DNA fetal libre de células (Siva, 2003; Warunee, 2003; Chan, 2004; González-
Gonzáles, 2005; Zhu, 2005; Tufan, 2005). 
Cabe mencionar que el DNA fetal libre de células permanece estable 
aproximadamente 24 horas después de la toma de muestra y tiene una vida media 
en circulación de 16.3’, en un rango de 4 – 30´ (Lo, 1999), sin embargo, las 
muestras se procesaron de inmediato ya que el DNA fetal tiende a degradarse 
(Angert, 2003). Además también se recomienda que la muestra sea procesada por 
personal femenino para evitar contaminaciones de falsos positivos cuando es 
procesada por personal masculino, ya que esté último tiene el gen de SRY 
(Zhong, 2002). 
 
VIII.2 Método I 
 
 De acuerdo a los resultados obtenidos en este estudio se confirmo la 
presencia de DNA fetal en sangre periférica materna a partir de suero y/o plasma 
desde la novena semana de gestación, usando una PCR interna para detectar 
secuencias específicas del cromosoma Y (SRY) en suero y plasma (Lo, 1997, 
1993,1996; Honda, 2001). 
 64
 
Una variedad de marcadores del cromosoma Y se han empleado para 
determinar el sexo prenatal en sangre materna: DYZ1 (Lo, 1998; Merel, 1991; 
Arinami, 1991), DYS14 (Lo, 1990; Wachtel, 1991) y ZFY (Kao, 1992), ahora 
conocido como SRY (Zhong, 2000). Sin embargo nosotros utilizamos el marcador 
SRY y el gen de la β-globina para asegurar