Desarrollo-de-un-metodo-analitico-espectrofotometrico-UV-para-la-cuantificacion-de-destrometorfano-en-jarabe-por-medio-de-minimos-cuadrados-parciales

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ASESO
CUAUTITLÁN IZCALLI, EDO
Desa
espec
Dextr
cuadr
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA
DE
R: Q.F.B JOSÉ ANTONIO GARDUÑO ROSAS.
. DE MÉXICO. 2008
rrollo de un método analítico
trofotométrico u.v. para la cuantificación de
ometorfano en jarabe por medio de mínimos
ados parciales.
MÉXICO
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:
QUÍMICO FARMACÉUTICO BIOLOGO
P R E S E N T A:
JOSÉ SALVADOR GÓMEZ PÉREZ
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES
CUAUTITLÁN
 
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AGRADECIMIENTOS.
A Esthela y José:
A quienes la ilusión de su vidas ha sido convertirme en persona de
provecho, a quienes nunca podré pagar todos los desvelos ni aun con las
riquezas mas grandes del mundo. Porque gracias a su apoyo y consejo he
llegado a realizar la mas grande de mis metas, la cual constituye; la herencia
mas valiosa que pudiera recibir.
Deseo de todo corazón que mi triunfo profesional lo sientan como
suyo.
A mis hermanas:
Por darme aliento para seguir adelante y apoyarme en momentos
difíciles.
A mi nueva familia:
Porque son el pilar de mi vida y la luz de mis ojos.
A Bety:
Porque fue una persona muy importante en mi vida y me daba fuerzas
para seguir adelante, gracias rata. Y a su papá por darme consejo y confianza
cuando se necesitaba.
A mis amigos:
Adrián, Fernando, Julio, Miguel; Yuritzi y Claudia, por compartir
tantos momentos inolvidables conmigo durante toda la universidad y espero
sea por siempre.
NUNCA CONSIDEREDES AL
ESTUDIO COMO UNA OBLIGACION
SI NO COMO UNA OPORTUNIDAD
PARA PENETRAR EL BELLO Y
MARAVILLOSO MUNDO DEL SABER.
A. EINSTAIN
LA DUDA SUELE SER EL PRINCIPIO DE
LA SABIDURÍA…
ÍNDICE
OBJETIVOS………………………………………………………………………………1
INTRODUCCIÓN………………………………………………………………………...2
DIAGRAMA DE FLUJO…………………………………………………………………5
CAPÍTULO I.- GENERALIDADES
.- Calibración multivariante…………………………………………………...7
1.1.1.- Fundamento del método de análisis multicomponentes…………...7
1.1.2.- Mínimos cuadrados parciales (MCP )…………………………….11
1.1.2.1.- Algoritmo para MCP…………………………………12
1.1.3.- Validación del método de calibración……………………………15
1.1.3.1.- Validación cruzada……………………………………..15
1.1.3.2.- Selección del número optimo de factores (SCERP)……16
1.1.3.3.- Curva de calibración……………………………………17
1.1.3.4.- Detección de muestras desechables (OUTLIERS)……..18
1.1.3.5.- Selección de longitudes de onda………………………..18
1.2.- Características del Dextrometorfano……………………………………….20
1.2.1.- Descripción y propiedades………………………………………..20
1.2.2.- Indicaciones farmacológicas……………………………………...22
1.2.3.- Jarabe de dextrometorfano………………………………………..24
1.3.- Validación de métodos analíticos…………………………………………..27
1.3.1.- Parámetros y criterios de aceptación……………………………..27
CAPÍTULO II.- DESARROLLO DEL MÉTODO ANALÍTICO
2.1.- Reactivos equipos y programas utilizados………………………………….32
2.1.1.- Reactivos…………………………………………………………32
2.1.2.- Equipos…………………………………………………………...32
2.1.3.- Programa de computación………………………………………..32
2.2.- Búsqueda de condiciones experimentales………………………………….33
2.2.1.- Determinación de concentraciones experimentales………………33
2.2.2.- Determinación del medio de solución……………………………34
2.2.3.- Selección de longitudes de onda………………………………….36
2.3.- Estudio de las propiedades espectrofotométricas para el desarrollo del
método analítico...38
2.3.1.- Aditividad………………………………………………………...38
2.3.2.- Interferencia………………………………………………………39
2.3.3.- Interacción………………………………………………………..39
2.4.-Desarrollo y validación del modelo MCP…………………………………39
2.4.1.- Determinación y selección de las longitudes de onda…………..39
2.4.2.- Selección del número óptimo de factores……………………….41
2.4.3.- Curva de calibración…………………………………………….42
2.4.3.1.- Elaboración de soluciones estándar……………………42
2.4.3.2.- Análisis del modelo de mínimos cuadrados parciales…43
2.4.4.- Detección de muestras desechables………………………………45
2.5.- Condiciones para el análisis ……………………………………………….46
2.5.1.- Preparación de la calibración……………………………………..46
2.5.2.- Ensayo analítico………………………………………………….46
2.5.3.- Predicción………………………………………………………...48
CAPÍTULO III.- VALIDACIÓN DEL METODO ANALÍTICO.
3.1.- Evaluación del sistema……………………………………………………..50
3.1.1. Linealidad…………………………………………………………50
3.1.2. Precisión …………………………………………………………..51
3.2.- Evaluación del método
3.2.1. Precisión …………………………………………………………..53
3.2.2. Exactitud…………………………………………………………..53
3.2.3. Linealidad…………………………………………………………59
3.2.4. Repetibilidad………………………………………………………60
3.2.5. Reproducibilidad…………………………………………………..60
3.2.6. Especificidad………………………………………………………64
3.2.7. Tolerancia…………………………………………………………65
3.2.8. Robustez………………………………………………………...…66
3.3.- Estabilidad de la muestra procesada………………………………………..67
OBSERVACIONES……………………………………………………………………68
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN……………………………………………………………69
CONCLUSIONES……………………………………………………………………...71
BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………...74
OBJETIVOS:
 Desarrollar un método espectrofotométrico por medio de mínimos cuadrados
parciales para la cuantificación de dextrometorfano en jarabe.
 Determinar las condiciones experimentales que permitan la
cuantificación de dextrometorfano en jarabe
 Seleccionar las condiciones en el método de mínimos cuadrados
parciales para la cuantificación de dextrometorfano en la muestra
problema.
 Validar el método desarrollado
 Determinar la precisión y exactitud del método y del sistema.
 Evaluar la linealidad del método y del sistema.
 Evaluar repetibilidad y reproducibilidad.
 Evaluar tolerancia y robustez del método
 Determinar el tiempo máximo que la muestra procesada es estable.
2
INTRODUCCION.
Hoy en día es necesario elaborar análisis mucho más rápidos y confiables dentro de
la industria farmacéutica; por ejemplo la determinación de uno a más principios activos en
un medicamento por lo tanto es necesario desarrollar técnicas confiables que permitan un
análisis fisicoquímico rápido y confiable. El método más utilizado dentro de la industria
farmacéutica es la cromatografía de líquidos de alta resolución (CLAR ó HPLC) pero su
costo es muy elevado debido a la alta calidad de los reactivos y el equipo, mano de obra
además del tiempo que se requiere para dicho análisis. Una alternativa importante es el uso
de la espectrofotometría, sistema de análisis mucho más barato y rápido que el CLAR, pero
tiene ciertas desventajas ya que no es tan sensible como lo es la cromatografía, además que
presenta una mayor variabilidad para la cuantificación de analitos en las formas
farmacéuticas.
La determinación del contenido químico de un medicamento, se efectúa para
evaluar la calidad del producto farmacéutico y el desarrollo de nuevas formulaciones; por
tal motivo es necesario desarrollar técnicas que nos permitan cuantificar al principio activo
de una manera sencilla y rápida. Sin embargo no es fácil trabajar con los productos
farmacéuticos ya que el principio activo contiene excipientes en la formulación, por lo que
a veces es necesario separar al analito de todos estos para su posterior cuantificación. En
este trabajo se desarrolla un método utilizando la espectrofotometría uv en la cual se tiene
la característica de que el principio activo no es separado de los excipientes que lo
acompañan.
Algunas veces no es posible cuantificar a un principio activo por espectrofotometría
directa ya que se pueden presentar interferenciaso interacciones por parte de los
excipientes. Por este motivo sucede un problema, ¿cómo eliminar estas interferencias o
interacciones? Una de las soluciónes está en la utilización de un modelo matemático que
nos ayude a encontrar una proporcionalidad entre la concentración del analito y la respuesta
del mismo.
3
Una alternativa para poder simplificar las técnicas de análisis de productos
farmacéuticos es el análisis de multicomponentes por espectroscopía. Por este método se
han reportado análisis de mezclas de dos1,2 o tres componentes sin necesidad de su
separación. Los análisis se realizan utilizando dos o más longitudes de onda para la lectura
de las muestras y con los resultados obtenidos efectuar pruebas estadísticas de variancia. La
estadística en este caso es una colección de herramientas matemáticas muy poderosas que
pueden ser aplicadas al análisis químico cuando se requiere de más de una medición.
En años recientes los métodos de calibración multivariante, como el de mínimos
cuadrados parciales, han llegado a ser una importante herramienta para la cuantificación
simultánea de uno o más analitos en un medicamento.3 Ese método es utilizado en este
trabajo experimental utilizando un jarabe como forma farmacéutica y siendo el
dextrometorfano el analito de interés.
El problema principal para la cuantificación de un analito en un jarabe es el
contenido de excipientes que presentan una respuesta espectrofotometrica importante al
momento de someterlos al análisis por lo que tenemos que encontrar un modelo matemático
que permita eliminar estas interferencias y así tener una proporcionalidad directa entre la
concentración del analito y la respuesta analítica, para su posterior validación.
Una vez encontradas las condiciones óptimas experimentales de análisis es
necesario la validación del método desarrollado. La validación es el proceso establecido
para la obtención de pruebas documentadas y demostrativas de que un método de análisis
es lo suficientemente confiable y reproducible para producir el resultado dentro de
intervalos definidos.4
1 ISLAS HERNANDEZ, José.Alejandro (2004) “ Desarrollo de un método analítico espectrofotométrico uv para la obtención del perfil de disolución de una
forma farmacéutica que contenga Trimetoprim y Sulfametoxazol” México Tesis Licenciatura (Q.F.B.) UNAM FES-Cuautitlan Izcalli campo 1.
2 BARRERA GALICIA, Mauricio (2004) “ Aplicación de métodos de calibración multivariante en la cuantificación simultanea, por espectrofotometría uv
de Acetaminofen y Naproxeno presentes en un medio de disolución “ México pp 135-137 Tesis Licenciatura (Q.F.B.) UNAM FES-Cuautitlan Izcalli campo
3,4 BRERETON, R.G(2000) “ Introduction to multivariate calibration in analytical chemistry” Analyst, vol 125, pp2125-2154
4
La validación proporciona un alto grado de confianza y seguridad del método
analítico. Se realiza con carácter obligatorio cuando se desarrolla un nuevo método. Es
necesario señalar que los métodos descritos en farmacopeas u otros textos oficiales se
consideran validados, aunque debe aclararse que ellos se refieren solamente a métodos
generales y a materias primas. Estos no precisan de validación, aunque deben ser
comprobados antes de su utilización rutinaria con la verificación en las condiciones de
laboratorio. Sin embargo, para el caso de las formas farmacéuticas terminadas, que pueden
variar su composición cualitativa o cuantitativa según el fabricante, habrá que proceder en
cada caso a la validación del método analítico. Para demostrar la aplicabilidad de estos
métodos que no tienen en cuenta todos los posibles excipientes de una forma farmacéutica,
será necesario, por lo menos, efectuar una validación abreviada que evalúe que la
especificidad, exactitud y precisión son adecuadas
5
DIAGRAMA DE FLUJO.
Búsqueda bibliografica y hemerografica sobre calibración multivariante
Búsqueda de propiedades físicas, químicas y fisicoquímicas de Bromhidrato de
dextrometorfano
Desarrollo del método analítico
Medio de dilución Longitudes de onda Curva de
calibración, numero
óptimo de factores
Validación del método analítico
Linealidad del sistema
Tolerancia
Precisión y exactitud
Linealidad del método
Repetibilidad y
reproducibilidad
Robustez
Estabilidad de la muestra procesada
Ensayo
analítico
6
CAPITULO 1
GENERALIDADES
7
GENERALIDADES.
1.1.Calibración multivariante.
1.1.1. Fundamento del método de análisis de multicomponentes.
El método de mínimos cuadrados parciales (MCP) es relacionado con otros métodos
multivariados tales como los mínimos cuadrados clásicos (MCC), los mínimos cuadrados
inversos (MCI) y la regresión del componente principal (RCP). Estos métodos han sido
usados en análisis cuantitativo de espectro completo. El método de MCP analiza uno ó más
componentes químicos dentro de una mezcla por medio de un algoritmo matricial. Este
método se puede llamar híbrido ya que contiene pasos tanto de los mínimos cuadrados
clásicos como de los mínimos cuadrados inversos además de que tiene la característica de
ser un método de espectro completo, lo cual significa que es posible ocupar todo el espectro
de absorción de un compuesto químico para su cuantificación; así, MCP tiene propiedades
que combinan algunas de las ventajas de MCC y de MCI. La información cualitativa y
cuantitativa directamente disponible del análisis de MCP es superior a la obtenida de MCC
y MCI. Los MCP son una poderosa herramienta estadística multivariada que ha sido
utilizada en años recientes para análisis cuantitativos en detecciones de UV, infrarrojo,
cromatografía y electroquímica.1
La calibración multivariante es una herramienta de reconocida selectividad y
confiabilidad en el análisis cuantitativo. Es aplicable en la determinación de macro y
microcomponentes, con diversas características y bajo distintos métodos de análisis. Entre
las principales ventajas que ofrece esta herramienta matemática están la simplificación en la
preparación de las muestras reales así como el incremento en la capacidad analítica y
confiabilidad de los instrumentos tradicionales.
1 HAALAND M. D., THOMAS E.V.(1988) “Partial Least Squares Methods for Espectral Analysis 1. Relation to other quantitative calibration methods
and the extraction for quantitative information” Analytical Chemistry, Vol 60 (II) pp. 1202-1208
8
Puede decirse que calibrar consiste en usar datos empíricos y conocimientos previos
para establecer como predecir información cuantitativa desconocida Y a partir de
mediciones disponibles X, a través de alguna función matemática de transformación. La
calibración multivariante significa utilizar muchas variables medidas simultáneamente para
cuantificar una variable Y. De hecho, la calibración multivariante implica modelos a
diferentes niveles, el más importante es el modelo mental que explica la relación entre las
numerosas variables en X y Y. Por otro lado, algún modelo matemático abstracto que
represente el fenómeno existente entre las variables, con coeficientes desconocidos.
Durante la calibración, se estiman los parámetros a partir de los resultados obtenidos, con el
propósito de establecer el modelo de calibración que contiene la función predictiva deseada
Y= f(x). Este modelo de calibración se usa en la predicción, teniendo en cuenta que los
objetos a estimar obedecerán a la misma estructura del modelo utilizado en la calibración.2
Para poder predecir la información Y a partir de las mediciones X, debe
identificarse la fórmula de predicción y= f(x) a través de alguno de los distintos métodos
existentes de calibración multivariante. Para la expresión Y= f(x), los datos X son
registrados en el instrumento y transformados en Y por un programa determinado; la
función tiene una forma matemática particular basada en un modelo que establece la
relación entre Y y X. También debe considerarse que el modelo propuesto será afectado por
varias fuentes de ruido incontrolables que siempre contaminan las mediciones.La calibración multivariante es una técnica quimiométrica que requiere de una
modelación matemática multivariante y los parámetros de los modelos deben estimarse
estadísticamente a partir de datos empíricos.3
2
BRERETON R. G.(2000) “ Introduction to Multivariate Calibration in Analitycal Chemistry “ Analyst, vol 125, pp 2152-2154
3 LÓPEZ DE ALBA P. L., LÓPEZ M. L., AMADOR H. J.(1996) “ Métodos de Calibración Multivariante”Sociedad Química de México A.C., 41 (1)
pp.445-475
9
En el análisis cuantitativo se busca una relación lineal entre la medición y la
concentración de un componente en particular. En espectroscopía, la ley de Beer define una
relación entre la absorbancia y la concentración; así, para una trayectoria de luz constante a
través de la disolución.
A1 = C1 K1 ………………………….. ec. (1)
K1= lξ
Donde A1 es la absorbancia a cierta longitud de onda, C1 la concentración y K1 el producto
del coeficiente de absortividad por la longitud del paso óptico. Esto implica que es posible
conocer la concentración de cualquier especie tras medir simplemente la absorbancia de
una muestra de concentración conocida y deducir la K1. Como se observa, la ecuación
puede resolverse estudiando una sola muestra; sin embargo; ante limitaciones por ruido,
error instrumental, error en la manipulación de soluciones, etc., se recomienda analizar
muestras de distinta concentración, expresar los resultados en forma gráfica y determinar
la línea recta que mejor se ajuste a los puntos. Esto se conoce matemáticamente como
análisis de regresión lineal por mínimos cuadrados.
Si la mezcla contiene dos componentes y se obtiene su absorbancia a dos longitudes
de onda sin que haya interferencia, es posible establecer dos ecuaciones:
A1 = C1 K1 + E1……………………. ec (2)
A2 = C2 K2 + E2 ……………………. ec (3)
Donde A1 y A2 son las absorbancias a dos longitudes de onda diferentes, K1 y K2 (siendo el
la longitud del paso óptico = 1) los coeficientes de absortividad de los dos componentes a
esas longitudes de onda, E1 y E2 los errores residuales obtenidos a partir de la línea ajustada
por mínimos cuadrados y las absorbancias reales.
10
Considerando que la ley de Beer es aditiva, también es posible resolver las
ecuaciones simultáneamente y así manejar el caso donde exista interferencia entre las dos
absorbancias dentro de un espectro
A1 = C1 K11 + C2 K21 + E1 ……………….. ec (4)
A2 = C2 K12 + C2 K22 + E2 ……………….. ec (5)
Una forma particularmente eficiente para resolver ecuaciones simultáneas es utilizar
métodos matriciales. En términos matriciales las ecuaciones anteriores se expresan:
A (n,p) = C (n,m) K (m,p) + E (n,p) ………………………… ec (6)
Donde n, es el número de disoluciones patrón, p el número de longitudes de onda y m el
número de componentes,
O en notación matricial:
A = CK + E …………………………………………… ec (7)
Una vez resuelta la matriz de los parámetros K, puede utilizarse para predecir
concentraciones de muestras desconocidas. Tal método de análisis cuantitativo se conoce
como matriz K o mínimos cuadrados clásicos
A 11 = C11 K11 + C12 K21 + E11
Nótese que la ecuación anterior está dada para dos componentes y dos longitudes de
onda; la absorbancia de cierta muestra a una longitud de onda en particular resulta de la
suma de las concentraciones de los componentes, multiplicadas por sus coeficientes de
absortividad. Si se omite la concentración de alguno, las concentraciones predichas serán
incorrectas.
11
1.1.2. Mínimos Cuadrados Parciales.
La calibración multivariante permite analizar sistemas con interferencias químicas,
aunque no estén definidas, sin necesidad de manipular excesivamente la muestra8. Un tipo
de interferencia en la espectroscopía es la turbidez del sistema que se debía eliminar pero
con este modelo se corrige ese efecto matemáticamente.
Deben considerarse la presencia de fuentes de error que no pueden ser previstas en
el momento de efectuar la calibración original, sin importar qué tan cuidadoso sea el
analista. Con la calibración multivariante muchas de las anomalías en la preparación de las
muestras son fácilmente identificables para eliminarlas posteriormente.
El método de mínimos cuadrados parciales es popular en el análisis cuantitativo, ya
que ha sido utilizado con diversos tipos de análisis como los espectroscópicos4. Tales
técnicas son superiores a otras de uso común e igualmente aplicables a sistemas con bandas
bien definidas o bien, con interferencias severas y bandas solapadas. En el análisis
cuantitativo, tras establecer una serie de condiciones para el análisis, se preparan estándares
cuya composición sean similares a las muestras reales y abarquen cierto intervalo de
concentraciones para la especie, o especies a determinar. Las unidades de absorbancia o
unidades proporcionales a la concentración se registran con los instrumentos adecuados y
se obtienen los espectros correspondientes.
Este método se puede dividir en varias fases:
1. Selección de el número de componentes en la calibración.
2. Selección del número de concentraciones con sus respectivas replicas.
3. Determinación de la región espectral que proporcione la mayor información
sobre el comportamiento del sistema.
4. Planteamiento de la matriz de calibración que servirá para la predicción de
la concentración de la muestra real que se analice.
5. Selección de el número óptimo de factores.
6. Detección de las muestras desechables.
7. Predicción.
4 ISLAS HERNANDEZ, José.Ale jandro (2004) “ Desarrollo de un método analítico espectrofotométrico uv para la obtención del perfil de disolución de
una forma farmacéutica que contenga Trimetoprim y Sulfametoxazol” México Tesis Licenciatura (Q.F.B.) UNAM FES-Cuautitlan Izcalli campo 1.
12
1.1.2.1. Algoritmo para MCP5
Este algoritmo es una serie de cálculos matriciales los cuales se dividen en dos
etapas. La primera es etapa de calibración y la segunda, etapa de predicción. El primer paso
en la calibración es un pretratamiento de los datos el cual consiste en un centrado de los
mismos, esto es calcular la media de cada serie de datos y a cada valor individual restarle la
media.
El segundo paso está dado por:
A = c wh´ + Ea
que se resuelve como:
wh = A´c / c´c
Este paso es una calibración de MCC en el cual el análisis es formado asumiendo
que las concentraciones de un solo analito son conocidas en las muestras de calibración, wh
es un vector n x 1 del componente puro espectral de interés también llamado vector peso.
Ya obtenido el vector peso se tiene que hacer una normalización esto es, obtener la razón
de wh dividido entre la raíz cuadrada de la suma de sus cuadrados.
El paso tres es la formación de la variable latente:
A = th wh + Ea
que se resuelve como:
th = A wh / wh´ wh = Awh
El vector th representa las intensidades del primer peso del vector cargador en las
muestras de calibración para un nuevo sistema coordinado de MCP, el vector th representa
un ensayo de primer orden para determinar las intensidades del analito puro, por ejemplo;
la concentración, en cada espectro de calibración.
5 HAALAND M. D., THOMAS E.V.(1988) “Partial Least Squares Methods for Espectral Analysis 1. Relation to other quantitative calibration methods
and the extraction for quantitative information” Analytical Chemistry, Vol 60 (II) pp. 1202-1208
13
El paso 4 está dado por:
c = vh th + ec
que se resuelve como:
vh = th´c / th´th
En este paso encontramos una variable espectral que puede ser relacionada con las
concentraciones usando una regresión de mínimos cuadrados lineal. La estimación de vh es
la regresión escalar del coeficiente relacionado para la concentración del componente de
interés.
En el paso 5 se trata de formar el vector cargador y se da mediante la siguiente
ecuación:
A = th bh´ + Ea
que se resuelve como:
bh = A´th / th´ th
En el paso 6 se calculan los residuales para la matriz de absorbancias y para la
matriz de concentraciones.
Ea = A – th bh´
Ec = c – vh th
Con estos resultados de obtienen las matrices residualesde absorbancias y
concentraciones.
En el último paso la matriz residual de absorbancias (Ea) es sustituida en la matriz
original centrada de absorbancias (A) y la matriz residual de concentraciones (Ec) es
sustituida en la matriz original centrada de concentraciones (c), para así repetir el proceso
hasta el número óptimo de factores.
14
La etapa de la predicción se efectúa con las siguientes ecuaciones;
Paso 1
th = wh´ a
Donde a es la matriz de absorbancias y wh´ es el vector peso obtenido del paso 2 de la
etapa de calibración para obtener un nuevo vector de intensidades (th) para ser utilizado en
el siguiente paso
Paso 2
c h = c h – 1 + vh th
Donde th es el vector calculado del paso anterior, vh es la variable espectral calculado en el
paso 4 de la calibración y c h – 1 es la matriz de concentraciones al efectuar este paso para el
primer factor la matriz de concentraciones esta dada por la media de todos los valores de
concentración, mientras que para los factores siguientes será la nueva matriz de
concentraciones calculada en este paso.
Paso 3
e h = e h - 1 - bh th
Donde th es el vector calculado en el primer paso de la predicción, bh es el vector cargador
del paso 5 de la calibración y e h – 1 es la matriz de absorbancias.
Paso 4
Sustituir eh por a y repetir el primer paso hasta completar el número óptimo de factores
Existe otra ecuación en el algoritmo que nos ayuda a encontrar información sobre
las longitudes de onda que poseen la mayor información cuantitativa del análisis por MCP,
y está dada por
Kw = W ( B W´ ) -1 V
Donde:
W = matriz conformada por los wh de cada factor
B = matriz compuesta por los bh de cada factor
V = matriz compuesta de los vh de cada factor
W´ = matriz transpuesta de los wh de cada factor
15
1.1.3. Validación del método de calibración
1.1.3.1. Validación cruzada6
La validación de un modelo que consiste en establecer sus capacidades de
reconocimiento y predicción. Un modelo es estable si la eliminación de un objeto, de
pocos objetos o la sustitución de unos objetos por otros en los conjuntos de entrenamientos
y predicción no hacen variar su capacidad de reconocimiento y predicción. Existe un
modelo que es llamado del objeto excluído el cual se establece con todos los objetos menos
1. El conjunto de entrenamiento queda constituido por n-1 objetos, el proceso se repite con
todos los objetos, excluyendo uno distinto cada vez. El método construye n modelos casi
iguales entre sí, y muy similares al que se construirá finalmente con los n objetos,
Cuando se tienen muchos objetos, es posible excluir varios a la vez, en lugar de uno
solo. Así si se excluyen p objetos seleccionados siguiendo un plan sistemático, se pueden
obtener numerosos modelos con n – p objetos. De este modo, la estabilidad del modelo y su
capacidad de predicción se pueden conocer sobre una base estadística más completa y
rigorosa.
La capacidad de reconocimiento es un concepto análogo al de variancia explicada
de calibración y la capacidad de predicción lo es al de variancia explicada de validación
estas técnicas se engloban bajo la expresión de técnicas de validación cruzada.
Para mejorar las capacidades de reconocimiento y predicción, se deben buscar
nuevas variables con mayor poder discriminante; o también, utilizar el algoritmo
clasificatorio que se adapte mejor a las particularidades del problema. Para mejorar la
estabilidad del modelo se debe ampliar el número de objetos del conjunto de entrenamiento.
Especialmente se deben añadir nuevos objetos a las categorías que tienen pocos, o que los
tienen muy dispersos, además es importante eliminar los posibles objetos anómalos, que
están claramente alejados de cualquiera de las categorías reconocidas.
6
RAMIS RAMOS Guillermo (2001) “Quimiometria”. Ed. Síntesis. España. pp 200-230
16
1.1.3.2. Selección del número óptimo de factores (SCERP)
El camino más efectivo para establecer el número óptimo de factores es la
aplicación del SCERP por sus siglas Suma de Cuadrados de los Errores Residuales de
Predicción ( PRESS en ingles que es Prediction Residual Error Sum of Squares). Si
conceptualmente la técnica es simple, requiere de numerosos cálculos por computadora. A
continuación se muestran los pasos a seguir:
1. Separación de la respuesta. Ejecución de la descomposición con las disoluciones
restantes para un factor y cálculo de la matriz de calibración mediante la regresión.
2. Uso de la matriz de calibración para la predicción de la concentración de la muestra
cuyo dato quedó fuera.
3. Establecer la diferencia entre la concentración real y la calculada y elevarla al
cuadrado. El resultado será un valor de SCERP simple.
4. Separación de otra muestra de la serie de calibración e incorporación al grupo de la
que se había excluído anteriormente, para repetir el proceso hasta que todas las
disoluciones hayan sido separadas y computadas para h = 1. Entonces sumar los
cuadrados de los errores residuales calculados a los errores previos.
5. Retorno al inicio del procedimiento utilizando h = 2 y así sucesivamente hasta un
valor de SCERP razonable.
Los valores de SCERP son un indicador de qué tan bien se están evaluando las
concentraciones de las soluciones patrón con cada número de factores. Con estos valores de
PRESS se puede elaborar un gráfico de el valor de SCERP en función del número de
factores. La tendencia de este gráfico es conforme aumenta el número de factores
disminuye el error en la predicción, alcanza un mínimo en un punto determinado y
comienza a ascender nuevamente al integrar al modelo vectores ruido. El incluir vectores
ruido en la matriz de calibración se conoce como sobreajuste (overfitting). Por eso es
recomendable elegir el número de factores donde el SCERP alcance el mínimo. Sin
embargo, mientras ésta puede ser la mejor elección en la determinación del número de
factores que modelarán un número finito de soluciones patrón, no siempre será el óptimo en
la predicción de concentraciones en muestras reales, ya que en algunas ocasiones el mínimo
17
valor de SCERP está sobreajustado. La solución de este problema es comparar los valores
de SCERP con número de factores menores que el mínimo y éste. Basándose en la cantidad
de muestras analizadas en la serie de calibración, se establece la relación entre estos valores
y se les asigna un significado estadístico. El número de factores donde la relación esté por
debajo del nivel predefinido determina el modelo óptimo para la predicción de muestras
reales; esta prueba estadística se conoce como prueba F.
1.1.3.3. Curva de calibración
Un aspecto importante en la obtención de matrices de calibración válidas es el
diseño de la serie de calibración o conjunto de soluciones patrón. Por ello, las prácticas de
laboratorio adecuadas, muestras representativas y métodos de muestreo apropiados son
críticos en la obtención de resultados exactos.
Primero, como en todos los métodos cuantitativos, las disoluciones deberán cubrir el
intervalo de concentraciones esperadas en todo el estudio posterior. Además, debe haber
por lo menos tantas muestras como componentes de interés, y generalmente muchas más
que éstos, ya que es vital un número de soluciones estadísticamente representativas tanto en
la evolución de los análisis y en la estadística. Para sistemas simples con uno o dos
componentes se recomienda por lo menos 10 muestras, si los sistemas son complejos; con
más componentes o más variaciones se sugieren por lo menos 40 muestras.
Uno de los puntos más importantes en el diseño de la serie de calibración es evitar
que las concentraciones de las muestras sean colineales, es decir; que la concentración de
uno de los componentes aumenta mientras la otra disminuye en cantidades proporcionales.
Cuando ocurre esto, la descomposición espectral no puede identificar diferencias entre los
dos componentes a lo largo de la serie y entonces los modela como un factor simple. Al
igual que la matriz con una sola longitudde onda, este hecho puede arrojar calibraciones
erróneas y por lo tanto predicciones falsas. Una forma de detectar este problema es graficar
la concentración de un componente en función de la concentración del otro. Si los puntos
caen en una línea recta, las concentraciones están linealmente correlacionadas; sin embargo
lo ideal será obtener una distribución simétrica.
18
1.1.3.4. Detección de muestras desechables (OUTLIERS)
Dentro de la curva de calibración una o más soluciones patrón pueden tener un valor
de concentración incorrecto debido a equivocaciones en la calibración primaria
(outliers), o la medición del espectro por una manipulación inadecuada de la muestra u
otros errores relacionados. Una poderosa herramienta para la detección de muestras
desechables es el cálculo del SCERP; tras seleccionar el número óptimo de factores, cada
una de las muestras se separa del grupo y se efectúa la calibración para posteriormente
predecir su concentración, tras aplicar este procedimiento a todas las disoluciones, se
comparan las diferencias entre las concentraciones calculadas y esperadas y, finalmente; se
identifican las muestras desechables.
Los residuos constituyen otra alternativa para identificar las muestras desechables.
Una vez determinado el número óptimo de factores para modelar el sistema, el espectro
sospechoso es separado del grupo para aplicar el método de la detección de outliers y
calcular su concentración a través de la combinación de vectores. Tras ajustar el espectro;
siempre queda información residual adicional fuera, este residuo es un indicador de cuanta
información no ha sido modelada. Si el residuo de la muestra sospechosa es
excepcionalmente alto comparado (que su dispersión con respecto a las demás soluciones
sea por arriba del 2.0&) con los otros datos, puede tratarse de una muestra desechable.
1.1.3.5. Selección de longitudes de onda
Una de las ventajas de utilizar el método de MCP es que se puede utilizar el
espectro completo para la construcción del modelo con sólo el conocimiento de los
espectros de los componentes puros de interés. En estos casos el número de longitudes de
onda puede ser muy grande y el tiempo para realizar los cálculos de la calibración puede ser
largo y laborioso, además ciertas longitudes de onda pueden contener un gran valor de
ruido espectral o simplemente no contienen información relevante que pueda ayudar a
construir un modelo robusto.
19
Por tal razón, se pueden escoger sólo un pequeño número de longitudes de onda que
aseguren una buena capacidad predictiva, además de construir un modelo más fácil de
interpretar. Sin embargo, pocos procedimientos son apropiados para la selección o
eliminación de longitudes de onda para el método de MCP.
Otro parámetro más fundamentado para la elección o eliminación de las longitudes
de onda es el cálculo de Kw ya descrito anteriormente esta constante nos ayuda a
determinar que longitudes de onda proporcionan información cuantitativa útil y aquellas
que no la proporcionan. Esto es, entre más grandes sean los valores de Kw y positivos, las
longitudes de onda son más significativas y por el contrario los valores calculados de Kw
negativos y muy alejados de cero estas longitudes de onda no aportan información
cuantitativa para el modelo.
Otro criterio para seleccionar las longitudes de onda es determinar aquella región
espectral en donde el analito de interés se manifieste más pronunciadamente que los demás
componentes, o que presente una tendencia distinta a las otras sustancias presentes en la
muestra.
20
1.2. Características del dextrometorfano
1.2.1 Descripción y propiedades7
El dextrometorfano es un fármaco que tiene propiedades calmantes de la tos, ya que
posee acción inhibitoria pronunciada y específica del centro antitusígeno. Su prestigio
como fármaco se apoya en que combate eficazmente los accesos de tos, sin efectos
narcóticos ni analgésicos. No afecta la tos voluntaria ni interfiere con la expectoración
necesaria para mantener limpias las vías respiratorias; su propiedad antitusiva es superior
en relación con la codeína. Por todas estas razones es que alcanza gran aceptación en el
mercado.
En el mercado internacional se le conoce con diferentes nombres: pectobron,
cosylan, romilar, robidex, sedatuss, dexphan, entre otros. También es frecuente encontrarlo
en forma de tableta, cápsula o jarabe, combinado a otros principios activos de acción
analgésica, expectorante y descongestionante.
Su fórmula condensada es C18H25NO HBr.H2O con una masa molecular de 370.33 g/mol,
y como base libre 271.4 g/mol que contiene 79,66 % de carbono; 9,28 % de hidrógeno;
5,16 % de nitrógeno y 5,9 % de oxígeno (fig. 1). Es un polvo cristalino blanco e inodoro,
parcialmente soluble en agua y soluble libremente en cloroformo, alcohol y glicerol,
prácticamente insoluble en éter.
7
GOODMAN and GILMAN (1996)“ Las bases farmacológicas de la Terapéutica “ 9a edición Interamericana. México
21
FIG. 1. Fórmula estructural del bromhidrato de dextrometorfano.
Especificaciones.12
pKa 8.3
PH en solución acuosa 5.2 – 6.5
Espectro IR Picos similares al estándar
HCl 0.1 N Absorción máxima 276 nm – 280nm
absorción mínima 243 nm – 247 nm
(1% 1 cm) al máximo 54.9 – 58.3
Pérdida por secado(4 hrs. 80° C en
vacío sobre p205)
4 – 5.5 %
Resíduo de ignición Máx. 0.1 %
Metales pesados Máx. 20 ppm.
Dimetilanilina Máx. 10 ppm.
Compuestos fenólicos Pasar la prueba N. F.
Rotación específica +- 1 % del estándar N.F.
Ensayo (HClO4) 99 – 101 % ( sobre material seco)
HBr *H2O
22
Descripción.- Polvo blanco o ligeramente amarillo, cristalino; prácticamente sin olor, con
sabor amargo; funde alrededor de 125 ° C con descomposición.
Solubilidad.- Parcialmente soluble en agua (aprox. 2 g / 100 ml), soluble en alcohol y
glicerol, prácticamente insoluble en éter.
Estabilidad.- Bastante estable al aire, calor y humedad, pero es parcialmente sensible a la
luz. En el empaque original y a una temperatura bajo 25° C puede ser almacenado 12
meses. Soluciones acuosas son estables a un pH entre 4 y 6, pero deben estar protegidos de
la luz.
1.2.2. Indicaciones farmacológicas.8
Indicaciones terapéuticas: Alivio contra la tos debida a irritaciones menores de garganta o
bronquios.
Farmacocinética y farmacodinamia: El dextrometorfano es un antitusivo sintético de
acción central, relacionado con la codeína; no tiene efectos analgésicos, sedantes o
constipantes. Se absorbe bien en el tracto digestivo, no se conocen con exactitud los
procesos de biotransformación que sufre tanto el principio, como sus productos de
biotransformación que se excretan principalmente por el riñón. Tiene una vida media
plasmática de 3 a 4 horas.
El dextrometorfano inhibe el reflejo de la tos con una potencia equivalente a la de la
codeína. Su acción central, deprime al centro de la tos que está situado en el bulbo
raquídeo.
Contraindicaciones: Este producto no debe administrarse a: niños menores de 6 años.
Pacientes diabéticos, pacientes con asma, gastritis, úlcera péptica, tos crónica, asma,
enfisema o enfermedad hepática.
Hipersensibilidad a cualquiera de los componentes de la fórmula.
Precauciones generales: La administración a niños con fiebre alta o tos persistente, debe
hacerse considerando la utilidad terapéutica.
8 “ Diccionario de Especialidades Farmacéuticas “ Edición 2000 Ediciones PLM S.A. de C.V.
23
Restricciones de uso durante el embarazo y la lactancia: A pesar de que el
dextrometorfano ha sido tomado por un largo número de mujeres embarazadas o mujeres
en edad fértil con ningún incremento comprobado en la frecuencia de malformaciones u
otros efectos nocivos directos o indirectos sobre el feto, como la mayoría de los
medicamentos, no se recomienda para mujeres embarazadas a menos que los beneficios
esperados sobrepasen cualquier riesgo potencial.
No se sabe si el dextrometorfano se excreta en la leche humana o si tenga efecto nocivo en
el recién nacido, por loque no se recomienda en la lactancia a menos que los beneficios
esperados sobrepasen cualquier riesgo potencial.
Reacciones secundarias y adversas: En algunos pacientes puede provocar sequedad de
boca, contracción pupilar, náusea, vómito, anorexia, mareos, leves molestias
gastrointestinales y somnolencia, que ceden rápidamente al disminuir la dosis o suprimir su
administración. En dosis mayores a las recomendadas, puede causar depresión nerviosa y
disnea intensiva.
Interacciones medicamentosas y de otro género: No debe administrarse con
medicamentos tranquilizantes, antidepresivos o que contengan furazolidona o quinidina ni
con inhibidores de la MAO.
Alteraciones en los resultados de pruebas de laboratorio: El dextrometorfano puede
producir elevación de la amilasa sérica y transaminasa.
Precauciones en relación con efectos de carcinogénesis, mutagénesis, teratogénesis y
sobre la fertilidad: Las precauciones y la relación de estos efectos con el dextrometorfano
no han sido evaluados específicamente.
Dosis y vía de administración: Oral. No se recomienda a niños menores de 6 años.
Manifestaciones y manejo de la sobredosificación o ingesta accidental: A dosis
elevadas el dextrometorfano produce confusión, mareo, náusea o vómito, excitación aguda
inusual, nerviosismo, intranquilidad o irritabilidad. La suspensión de su administración
revertirá los efectos indeseables. A muy altas dosis puede provocar síntomas neuropsiquiá-
tricos (euforia, intranquilidad, pérdida de la percepción, alucinaciones, reacciones
esquizofrénicas) que son similares a los efectos del agente alucinógeno fenciclidina. No se
ha establecido si estos problemas están relacionados al fenotipo metabólico individual.
24
1.2.3. Jarabes
Un jarabe es una solución concentrada de azúcares, como sacarosa; en agua o en
otro liquido acuoso. Si se utiliza agua purificada para preparar la solución de sacarosa, la
preparación se conoce como jarabe simple. Además de la sacarosa pueden agregarse otros
polioles, como la glicerina o el sorbitol, para retardar la cristalización de la sacarosa o
aumentar la solubilidad de los componentes agregados. A menudo se incluye el alcohol
como conservador y también como solvente de las esencias aromatizantes; la incorporación
de parabenos puede resistir el ataque microbiano. Si la preparación acuosa contiene una
sustancia medicinal es llamado jarabe medicado. Un jarabe aromatizado consiste por lo
general en un jarabe no medicado pero que contiene diversas sustancias aromáticas o de
sabor agradable y suele utilizarse como vehículo o agente aromatizante en ciertas
prescripciones.9
Los jarabes aromatizados son adecuados como vehículos en compuestos
extemporáneos y son aceptados sin inconvenientes por niños y adultos. Dado que estas
preparaciones contienen una cantidad mínima de alcohol, son los vehículos de elección
para muchos fármacos. La ausencia de alcohol los convierte en solventes superiores para
las sustancias hidrosolubles. Sin embargo, la administración continúa de medicamentos a
base de sacarosa se asocia con un aumento en la incidencia y caries dentales y gingivitis en
los niños; en consecuencia, deben considerarse otras formulaciones del fármaco, sean no
edulcoradas o edulcoradas con sustancias no cariogénicas. El conocimiento del contenido
de azúcar en los medicamentos líquidos es importante en el caso de pacientes que deben
restringir la ingesta calórica.
9 GENNARO A.(2000) “ Rémington Farmacia “ 20a edición Ed. Panamericana pp 848-850
25
Los jarabes son muy eficaces para enmascarar los sabores de los fármacos amargos
o salados. Esta propiedad se atribuyó a su naturaleza coloidal y a su doble capacidad
edulcorante; la dulzura inmediata del azúcar y la dulzura persistente de la glicerina. Este
jarabe también sirve para enmascarar el sabor amargo de preparaciones que contengan
vitaminas del complejo B. El jarabe de goma arábiga, debido a la naturaleza coloidal es útil
para enmascarar el sabor desagradable de numerosos medicamentos. El jarabe de
frambuesa BP es uno de los agentes saborizantes mas efectivos y resulta útil sobre todo
para enmascarar el sabor amargo de varios fármacos, sin embargo existen varios factores
que deben considerarse para elegir el sabor adecuado.
Para la elaboración de un jarabe es importante seleccionar con mucho cuidado la
sacarosa y usar agua purificada desprovista de sustancias extrañas, vasos y recipientes
limpios. Esta operación debe ser conducida con cuidado para evitar la contaminación y
asegurar la estabilidad del producto.
Es importante que la concentración de sacarosa se aproxime al punto de saturación
pero sin llegar a él. En las soluciones diluidas la sacarosa es un excelente medio de cultivo
para hongos, levaduras y otros microorganismos, pero en concentraciones del 65 % en peso
o más, la solución retardará el desarrollo de estos microorganismos. Sin embargo, una
solución saturada puede conducir a la cristalización de una fracción de la sacarosa al
modificarse la temperatura.
Si se utiliza calor en la preparación de los jarabes es casi inevitable que se produzca
la inversión de una pequeña porción de la sacarosa. Las soluciones de sacarosa son
dextrorotatorias, pero a medida que avanza la hidrólisis la rotación óptica disminuye y se
torna negativa cuando se completa la reacción. Este proceso se conoce con el nombre de
inversión debido a la formación de azúcar invertido. El azúcar invertido es más fácilmente
fermentable que la sacarosa y su color es más oscuro. Sin embargo, los dos azucares
reductores presentes en el azúcar invertido contribuyen a retardar la oxidación de otras
sustancias. El jarabe invertido se prepara hidrolizando sacarosa con HCl y neutralizando la
solución con carbonato de calcio o de sodio.
26
Los jarabes se preparan de diversas maneras, y la selección del método adecuado
depende de las propiedades físicas y químicas de las sustancias que forman parte de la
formulación.
a) Solución con calor.- Este es el método habitual para preparar jarabes cuando el
componente principal no es volátil ni termolábil y cuando se desee una preparación
rápida.
b) Agitación sin calor.- Este proceso se utiliza en los casos en que el calor se asocia
a la a perdida de componentes volátiles importantes.
c) Agregación de un líquido medicinal al jarabe.- Este método se utiliza en aquellos
casos en los que el jarabe se medica con extractos líquidos, los jarabes preparados
de este modo generalmente desarrollan precipitados dado que a menudo el alcohol
es un componente de los líquidos utilizados con esta finalidad, y las sustancias
resinosas y oleosas disueltas por el alcohol precipitan cuando se mezclan con el
jarabe, lo que da lugar a preparaciones antiestéticas,
d) Percolación.- En este procedimiento, se deja pasar lentamente agua purificada o
una solución acuosa a través de un lecho de sacarosa cristalina, lo que determina la
disolución de la sacarosa y la formación de un jarabe.
e) Reconstitución.- Para mejorar la estabilidad y minimizar la contaminación
microbiana pueden prepararse formulaciones de jarabe seco con el agregado de agua
purificada USP inmediatamente antes de ser usadas.
Estos métodos se utilizan en la preparación de una amplia cantidad de
formulaciones que se designan genéricamente con el nombre de jarabes. Por ejemplo, la
mayoría de los jarabes antitusivos contienen sacarosa y uno o más componentes activos.
27
Los jarabes son saborizados y coloreados, y se recomiendan en aquellos casos en los cuales
el paciente es incapaz de deglutir la forma farmacéutica sólida.
Para la cuantificación del dextrometorfano en esta forma farmacéutica es necesario
conocer los excipientes presentes en el jarabe, entre los cuales podemos encontrar al
metilparabeno, propilparabeno, el saborizante y el colorante que posiblemente presenten
respuestas analíticas en el mismo rango espectral que el analito así que será necesario tomar
en cuenta estos excipientes parael desarrollo del método.
1.3. Validación de métodos analíticos10
1.3.1. Parámetros y criterios de aceptación
Una vez que se ha desarrollado un método analítico, es conveniente validarlo. La
validación del método establece que sus características son adecuadas para el uso que se
pretende. La validación se realiza llevando a cabo una serie de experimentos en los que se
emplean condiciones específicas del método y el mismo tipo de matriz que el que se espera
en las muestras. Ello implica la evaluación de parámetros de calidad tales como precisión,
exactitud, linealidad, repetibilidad, reproducibilidad, sensibilidad, selectividad, sensibilidad
y sensitividad. La realización de un método de validación completo es una tarea que puede
ser tediosa, pero las consecuencias de no hacerlo es seguro de pérdida de tiempo, dinero y
recursos.
A partir del criterio de que no existe un modelo único para validar y de que existe
una gran variedad de métodos analíticos, la validación de los métodos se fundamenta en la
determinación de diversas características, que se aplican de acuerdo con una de las
siguientes categorías a la que pertenezca:
10 Requisitos Minimos para la Validación de Métodos Analíticos” Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos Biólogos México A. C. 1993.
28
 Categoría I.- Métodos analíticos para la cuantificación de los componentes
mayoritarios o principales de los fármacos a granel ó principios activos en
productos farmacéuticos terminados
 Categoría II.- Métodos analíticos para la determinación de impurezas en fármacos a
granel o productos de degradación en el producto farmacéutico terminado. Estos
métodos incluyen ensayos cuantitativos o pruebas límite
 Categoría III.- Métodos analíticos para la determinación de características de
desempeño (disolución, medicamentos de liberación, etc.)
 Categoría IV.- Pruebas de identificación
Para el desarrollo químico farmacéutico de un nuevo medicamento es imprescindible la
utilización de un método analítico que permita cuantificar el producto mayoritario en forma
de materia prima o como ingrediente activo de una formulación. Mediante un proceso de
validación, ya sea de carácter prospectivo, retrospectivo o de revalidación, se comprueba si
el método es lo sufientemente confiable y si los resultados previstos se obtienen dentro de
las condiciones prefijadas.
Para el cumplimiento de las buenas prácticas de laboratorio la validación es un requisito
imprescindible que está establecido por agencias regulatorias y por comisiones
farmacopéicas para el registro de nuevos medicamentos.
Las características que se evalúan son:
1.- Linealidad del sistema: Es la capacidad del mismo para asegurar que las respuestas
analíticas son directamente proporcionales a la concentración del analito dentro de un rango
determinado. Se debe construir una curva de calibración conteniendo 5 niveles de diferente
concentración por duplicado, preparadas a partir de una solución patrón. Este parámetro
debe ser evaluado por una inspección visual de un gráfico de la respuesta analítica en
función de la concentración del analito. Así mismo debe considerarse el coeficiente de
correlación (r), el coeficiente de determinación (r2), el intercepto, y el coeficiente de
variación global.
29
2.- Exactitud: Es el grado de concordancia entre el valor obtenido experimentalmente y el
valor de referencia. La exactitud mide el error sistemático y generalmente se expresa como
el porcentaje de recobro obtenido del análisis de muestras a las que se les ha adicionado
cantidades conocidas del analito, en general se requiere que el valor medido no difiera
significativamente del valor de referencia. La exactitud debe ser evaluada realizando la
determinación de la concentración de tres diferentes muestras, con seis ensayos cada una.
3.- Precisión: La precisión está relacionada con la dispersión de los datos alrededor de su
valor promedio y corresponde al grado de concordancia entre los resultados analíticos
individuales que se han obtenido dentro de una serie de mediciones efectuadas a una
muestra homogénea bajo las mismas condiciones de análisis. La precisión mide el error
aleatorio de un análisis y se expresa en términos de desviación estándar, variancia o
coeficiente de variación. La precisión del sistema debe ser evaluada realizando la
determinación de la concentración de 3 diferentes soluciones por sextuplicado, las cuales
deben estar incluidas en el intervalo establecido (80, 100 y 120%). La precisión del método
debe ser evaluada realizando la determinación de la concentración de 3 diferentes muestras,
con 6 ensayos cada una.
4.- Repetibilidad: Es la precisión de un método analítico expresado como la concordancia
obtenida entre determinaciones independientes realizadas bajo las mismas condiciones de
análisis pero en diferentes días.
5.- Reproducibilidad: Es la precisión de un método analítico expresado como la
concordancia obtenida entre determinaciones independientes realizadas bajo diferentes
condiciones de análisis. Para determinar la repetibilidad y la reproducibilidad, se debe
evaluar el efecto de los eventos aleatorios en la precisión del método analítico. Debe
analizarse una muestra homogénea del producto, por lo menos por triplicado para probar
cada condición.
30
6.- Linealidad del método: Es la capacidad del mismo para asegurar que la relación
establecida entre la concentración real y la estimada son directamente proporcionales y
lineales. Se debe construir una calibración con un mínimo de 5 muestras de placebos
cargados, con 3 ensayos cada una. Este parámetro se evalúa por medio del coeficiente de
correlación (r), el coeficiente de determinación (r2), el coeficiente de regresión (m), la
ordenada al origen y el coeficiente de variación del factor de respuesta
7.- Especificidad: Es la capacidad del método desarrollado para separar la sustancia de
interés de cualquier interferencia presente, en caso de métodos analíticos no selectivos, la
especificidad es sustentada con los datos de exactitud, precisión y linealidad del método,
siempre y cuando el método cumpla con los criterios de aceptación para estos parámetros.
8.- Tolerancia.- Son aquellos factores instrumentales (longitud de onda) y no instrumentales
(valores diferentes de pH, diferentes reactivos o pureza de los mismos), relacionados al
propio método que considere que pueden presentar diferentes cambios durante las
condiciones normales de operación. En cada condición de operación distinta que se desee
evaluar, así como en la condición normal, se analiza por triplicado una muestra de placebo
cargado a una concentración cercana del 100% de la muestra procesada para su medición.
Para evaluar la tolerancia del método se estima la concentración del analito presente en
cada uno de los placebos preparados y se calcula el porcentaje de recobro del mismo. La
diferencia absoluta entre la media aritmética de condición normal de operación y de la
condición de operación diferente no debe ser mayor al 2.0 %.
9.- Robustez: Es la capacidad del método para soportar cambios críticos en la operación
como por ejemplo, cambio de equipo, diferentes laboratorios. Experimentalmente se
seleccionan 2 condiciones de uso diferentes y la condición normal, posteriormente se
analiza por triplicado una muestra de placebo cargado a una concentración cercana al
100%.
10.- Estabilidad de la muestra procesada: Es la propiedad de una muestra procesada sin que
presente cambios significativos en la concentración del analito de interés después de
almacenarse durante un tiempo determinado bajo condiciones específicas.
31
CAPITULO 2
DESARROLLO DEL METODO
ANALITICO
32
DESARROLLO DEL METÓDO ANALÍTICO
2.1.1. Reactivos
Para el desarrollo del método se utilizaron los siguientes reactivos.
 Estándar de bromhidrato de dextrometorfano pureza 94.61%
 Metilparabeno materia prima proporcinado por I.M. Bruluart
 Propilparabeno materia prima proporcinado por I.M. Bruluart HCl 0.1 N
 Placebo de dextrometorfano jarabe proporcinado por I.M. Bruluart
 Brudex jarabe
Bromhidrato de Dextrometorfano………………..15 mg
Vehículo cbp ………………………………………5 ml
2.1.2. Equipo
El equipo utilizado se encuentra en el Laboratorio de Estudios Multidisciplinario
(LEM) Farmacia, en la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán Campo 1, UNAM.
Tiene las siguientes características:
EQUIPO No. INVENTARIO MARCA
Balanza Analítica 1581170 Ohaus, modelo Plus
Espectrofotómetro 95031303 Varian, modelo Cary 13E
Computadora 1969861 Pentium 3 GenuineIntel
2.1.3. Programas utilizados
Los datos se recolectan utilizando los programas “ Cary Simple Reads” y “ Cary
Scan”, cuya versión es 01.00 para ambos programas.
Para el tratamiento de los datos de MCP, se utilizó tanto el programa de ISHEJA
INC. Versión 1.0.0 soportado en ambiente Windows 981 (el cual utiliza el algoritmo
NIPALS para Mínimos Cuadrados Parciales establecido por Haaland), y el programa de
Excel de la paquetería de Microsoft Office.
1 ISLAS HERNANDEZ, José.Alejandro (2004) “ Desarrollo de un método analítico espectrofotométrico uv para la obtención del perfil de disoluc ión de
una forma farmacéutica que contenga Trimetoprim y Sulfametoxazol” México Tesis Licenciatura (Q.F.B.) UNAM FES-Cuautitlan Izcalli campo 1.
33
2.2. BÚSQUEDA DE CONDICIONES EXPERIMENTALES.
2.2.1. DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIONES EXPERIMENTALES
Para empezar a desarrollar un método es necesario tener condiciones tanto de
concentración, medio de solución y las longitudes de onda en que se efectuarán los análisis.
Por primera parte se debe conocer los parámetros de concentración y esto se hace mediante
la obtención de un barrido espectrofotómetrico
.
A continuación se muestra un barrido espectrofotómetrico de 200 a 400 nm en HCl
0.1 N 2
DEXTROMETORFANO
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
210 230 250 270 290
Longitud de onda
A
bs
or
ba
nc
ia
Fig. 1.- Barrido de estándar de dextrometorfano desde una longitud de
onda de 210 hasta 300 nm
En el espectro de la fig. 1 se observan 2 picos del dextrometorfano el pico máximo
reportado en literatura es alrededor de 275-280 nm y otro que va de 215-240 nm. En base a
este barrido las concentraciones de dextrometorfano son alrededor de 60 mcg/ml.
2 “ Clarke´s Isolation and Identification of Drugs”(2004) 2a Edicion. The Pharmaceutical Press Inglaterra pp 890.
34
2.2.2. DETERMINACIÓN DEL MEDIO DE SOLUCIÓN
En base a la literatura3 el bromhidrato de dextrometorfano es soluble en agua y en
HCl 0.1 N, así que se procede a elaborar barridos espectrofotómetricos en los dos diferentes
medios y tenemos lo siguiente:
Dextrometorfano
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
0.35
0.4
210 230 250 270 290
Longitud de onda
A
b
so
rb
a
n
ci
a
en H2O
en HCl
Fig. 2.- Barrido de dextrometorfano con 2 diferentes medios de
dilución agua y HCl 0.1 N
3 “ Clarke´s Isolation and Identification of Drugs”(2004) 2a Edicion. The Pharmaceutical Press Inglaterra pp 890.
35
En la muestra real también se debe de analizar su comportamiento espectral, así
como los excipientes que posiblemente nos puedan dar una interferencia. En nuestro caso
son el metilparabeno y el propilparabeno principalmente debido a la proporción que se
encuentran en el jarabe. En la siguiente figura se muestran los barridos de los componentes
del jarabe y la muestra real en medio ácido y en medio acuoso respectivamente.
Barridos en Agua
-0.5
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
190 210 230 250 270 290
metilparabeno
dextrometorfano
jarabe
Fig. 3.- Barridos de metilparabeno estándar de dextrometorfano y de una
muestra real en H2O como medio de dilución.
BARRIDOS EN HCl
0
0.5
1
1.5
2
2.5
190 210 230 250 270 290
metilparabeno
dextrometorfano
jarabe
Fig. 4.- Barridos de metilparabeno estándar de dextrometorfano y de una muestra
real en HCl 0.1 N como medio de dilución.
36
En base a las figuras 3 y 4 tenemos que los comportamientos de todas las sustancias
son muy similares en ambos medios, pero el HCl tiende a mantener un pH constante y
controlar esta variable dentro del análisis y el agua no posee esta propiedad y por este
motivo se eligió el HCl 0.1 N como medio de solución, otra aspecto importante por el cual
se eligió este medio es que se nota una mayor diferencia entre el estándar de
dextrometorfano y el metilparabeno en la región de 215 a 240 nm que en el medio acuoso y
esto nos puede ayudar para la selección de longitudes de onda.
2.2.3. SELECCIÓN DE LONGITUDES DE ONDA
Uno de los aspectos importantes en el método de MCP es que puede utilizar toda la
región espectral, para obtener las longitudes de onda que son incluidas en el modelo se
extraen del barrido correspondiente. También se puede cuantificar el componente de interés
presente en la mezcla aun cuando se presenten los fenómenos de interacción e interferencia
Dextrometorfano en HCl 60 mcg/ml
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
215 220 225 230 235 240
ESTANDAR
JARABE
Fig. 5.- Espectros de estándar de dextrometorfano y de muestra real de 215 nm a
240 nm a una concentración de 60 mcg/ml en HCl 0.1 N como medio de dilución
37
En la región de 215 a 240 nm está dada por el dextrometorfano y el metilparabeno
con un comportamiento diferente entre ellos mientras las absorbancias del dextrometorfano
van ascendiendo las absorbancias del metilparabeno van descendiendo(fig. 6), lo cual nos
puede servir para la selección de longitudes de onda dentro del método de mínimos
cuadrados parciales, ya después de 240 nm el analito de interés ya no presenta una
respuesta significativa; la mayor parte esta dada por los dos parabenos y por lo tanto esta
región no es útil para el modelo.
En la figura 6 observamos que el propilparabeno da lecturas bajas pero deben ser
tomadas en cuenta para la modelación de los datos para MCP.
BARRIDOS EN HCl 0.1 N
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
215 220 225 230 235 240
Longitud de onda
A
b
so
rb
an
ci
a
metilparabeno
propilparabeno
estandar
jarabe
Fig. 6.- Gráfico que muestra el comportamiento espectral de los excipientes y de la muestra
real en las longitudes de onda seleccionadas.
El espectrofotómetro puede determinar absorbancias de 1 en 1 nm entonces las
longitudes de onda para los siguientes análisis son 240, 239, 238, 237, 236, 235, 234, 233,
232, 231, 230, 229, 228, 227, 226, 225, 224, 223, 222, 221, 220, 219, 218, 217, 216 y 215
nm.
38
2.3. ESTUDIO DE LAS PROPIEDADES ESPECTROFOTOMETRICAS
PARA EL DESARROLLO DEL MÉTODO ANALÍTICO.
2.3.1. ADITIVIDAD.
Para determinar si existe aditividad entre la respuesta analítica del dextrometorfano
con el metilparabeno se presenta, en la figura 7, el espectro obtenido por la mezcla de
dextrometorfano-metilparabeno, este se comparo con la suma de los espectros individuales
de dextrometorfano y de metilparabeno.
SUMA DE ESPECTROS
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
190 210 230 250 270 290
Longitud de onda
A
b
ss
mezcla física
metilparabeno +
dextrometorfano
Fig. 7.-Gráfico que muestra los espectros de la suma de espectros individuales y la mezcla
física.
Los barridos espectrales al ser sumados presentan el mismo espectro a lo largo de
200 a 300 nm por lo que se comprueba que existe aditividad entre el dextrometorfano y el
metilparabeno dado que Atotal = Adextrometorfano + Ametilparabeno
39
2.3.2. INTERFERENCIA E INTERACCIÓN
Como se puede ver en las figuras 4 y 7 existe una interacción en la respuesta del
dextrometorfano por parte del metilparabeno a longitudes que van de 210 hasta 190 nm, y
una interferencia en todo el espectro por parte del metilparabeno. con lo cual no es posible
cuantificar directamente al analito, además que no se encontró una longitud en la cual la
absorbancia solo este dada por el dextrometorfano y por lo tanto es necesario utilizar el
modelo de MCP, que como antes se mencionó este es capaz de cuantificar a un analito de
interés aunque haya interferencias e interacciones.
2.4. DESARROLLO Y VALIDACIÓN DEL MODELO MCP
2.4.1. DETERMINACIÓN Y SELECCIÓN DELAS LONGITUDES DE ONDA
Las longitudes de onda que se van a utilizar son desde 215 nm hasta 240 nm en
intervalos de 1 nm, para evaluar la calidad y cantidad de información del modelo se
preparan 10 mezclas de dextrometorfano y metilparabeno siendo preparadas con 5 niveles
de concentración de dextrometorfano y 2 niveles de concentración de metilparabeno y se
determina la absorbancia a las 26 longitudes de onda ya señaladas, para que con esto
obtener el número óptimo de factores; y por consecuencia calcular el valor de Kw.
40
SCERP
0.00E+00
5.00E-02
1.00E-01
1.50E-01
2.00E-01
0 5 10 15 20 25
Número de factores
Fig. 8.- Gráfico que muestra el valor de SCERP para 10 soluciones de
dextrometorfano-metilparabeno.
Con ayuda de este gráfico podemos decir que el número de factores óptimo es de 11
porque en el cual se encuentra el cambio brusco de pendiente y el error residual es el
menor.
Con esta serie de datos es posible calcular Kw siguiendo el método II del algoritmo
de haaland (3).
Kw
-120
-100
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
80
215 220 225 230 235 240
Longitud de onda
V
al
o
r
ca
lc
u
la
d
o
Fig. 9.- Gráfico de Kw con h=11 y con 10 soluciones estándar.
41
El valor de Kw es calculado con el algoritmo de Haaland 4, en base a la figura 9, se
evaluaron las 26 longitudes de onda utilizadas en la matriz de calibración en donde la
mayoría de estas, tienen un valor grande y positivo; esto significa que proporcionan una
gran información cuantitativa, en el sistema propuesto y solo 3 de ellas tienen valores
negativos y alejados de cero lo que es un indicativo de que no tienen información
cuantitativa útil; para tener un modelo más robusto se consideraron las 26 longitudes de
onda para los siguientes análisis.
2.4.2. SELECCIÓN DEL NÚMERO ÓPTIMO DE FACTORES.
En base a la primera curva de calibración elaborada con 10 soluciones estándar y
utilizando el programa de mínimos cuadrados parciales obtenemos los diferentes valores de
SCERP siendo estos representados en la figura 8. Analizando los datos numéricos y
gráficos tenemos que el valor de SCERP en el cual hay un cambio significativo en la
pendiente es en h=11 después de este no se encontró otro cambio de pendiente y al utilizar
un h mayor que 11 el modelo podría tener un sobreajuste y arrojar datos relativamente
falsos, este valor será el ocupado para los siguientes análisis.
4 HAALAND M. D., THOMAS E.V.(1988) “Partial Least Squares Methods for Espectral Analysis 1. Relation to other quantitative calibration methods
and the extraction for quantitative information” Analytical Chemistry, Vol 60 (II) pp. 1202-1208
42
2.4.3. CURVA DE CALIBRACIÓN
Originalmente se trabajó con una curva de 10 soluciones estándar que a
continuación se muestra su preparación:
Preparar una solución stock de dextrometorfano 300 mcg/ml y otra solución stock
de metilparabeno de 216 mcg/ml y por último una solución stock de propilparabeno de 100
mcg/ml de acuerdo a la siguiente tabla:
SISTEMA SOLUCIÓN A
(ml)
Dextrometorfano
SOLUCIÓN B
(ml)
Metilparabeno
SOLUCIÓN C
(ml)
Propilparabeno
Volumen
de
Aforo
(ml)
1 8 7 1 100
2 9 7 1 100
3 10 7 1 100
4 11 7 1 100
5 12 7 1 100
6 8 10 1 100
7 9 10 1 100
8 10 10 1 100
9 11 10 1 100
10 12 10 1 100
Tabla No. 1 Preparación del sistema de calibración 5 niveles de
concentración para dextrometorfano, 2 niveles de concentración para
metilparabeno y 1 nivel de concentración para propilparabeno
43
Con esta curva se efectuó el análisis de mínimos cuadrados parciales teniéndose los
siguientes resultados.
SCERP DEXTRO REGRESIÓN DEXTRO MP
h 1 0.0349 PROMEDIO 1 1
h 2 0.1340 DESVEST 0 0
h 3 0.0681 C.V. . 0 0
h 4 0.0278 INTERCEPTO 0 0
h 5 0.0122 PENDIENTE 1 1
h 6 0.0034 COEF.CORR. 1 1
h 7 0.0004 Tabla No. 3 Estadística del sistema de calibración
h 8 0.0001
h 9 2.42E-27 OUTLIERS DEXTRO
h 10 5.55E-28 CONC. 1 0.20%
h 11 5.55E-28 CONC. 2 -0.10%
h 12 5.55E-28 CONC. 3 -0.09%
h 13 5.55E-28 CONC. 4 -0.14%
h 14 5.55E-28 CONC. 5 0.16%
h 15 5.55E-28 CONC. 6 0.62%
h 16 5.55E-28 CONC. 7 -0.27%
h 17 5.55E-28 CONC. 8 0.01%
h 18 5.55E-28 CONC. 9 -0.09%
h 19 5.55E-28 CONC. 10 0.05%
h 20 5.55E-28 Tabla No. 4 Detección de muestras desechables
Tabla No. 2 Análisis de la suma de
los errores de predicción
Para tener un sistema de calibración mas amplio y robusto se agregaron sistemas a la curva
de calibración, incrementando a 8 niveles de concentración del analito de interés
(dextrometorfano), el metilparabeno con dos niveles y el propilparabeno se incremento, un
nivel más. La preparación se indica en la siguiente tabla:
44
SISTEMA SOLUCIÓN A
(ml)
Dextrometorfano
SOLUCIÓN B
(ml)
Metilparabeno
SOLUCIÓN C
(ml)
Propilparabeno
Volumen
de
Aforo
(ml)
1 5 7 1 100
2 6 7 1 100
3 7 7 1 100
4 8 7 1 100
5 9 7 1 100
6 10 7 1 100
7 11 7 1 100
8 12 7 1 100
9 5 10 1 100
10 6 10 1 100
11 7 10 1 100
12 8 10 1 100
13 9 10 1 100
14 10 10 1 100
15 11 10 1 100
16 12 10 1 100
17 5 7 3 100
18 6 7 3 100
19 7 7 3 100
20 8 7 3 100
21 9 7 3 100
22 10 7 3 100
23 11 7 3 100
24 12 7 3 100
25 5 10 3 100
26 6 10 3 100
27 7 10 3 100
28 8 10 3 100
29 9 10 3 100
30 10 10 3 100
31 11 10 3 100
32 12 10 3 100
Tabla No 5 Sistema de calibración para la cuantificación de dextrometorfano en
jarabe 8 niveles para Dextrometorfano, 2 niveles para metilparabeno y 2 niveles
para propilparbeno.
45
2.4.4. DETECCIÓN DE MUESTRAS DESECHABLES (OUTLIERS).
En base al análisis de MCP, es indispensable obtener las muestras desechables para
que el modelo de calibración tenga una absoluta confiabilidad en la predicción bajo las
condiciones de análisis siendo que todas las muestras deben estar en un rango de desviación
no mayor al 2 %, y por consiguiente si una muestra fue mal preparada simplemente se retira
de la matriz de calibración.
SCERP Dextrometorfano H 11 OUTLIERS C.V
h 1 55.6 REGRESIÓN CONC. 1 -0.66%
h 2 3.08 PROMEDIO 1 CONC. 2 -0.20%
h 3 0.835 DESVEST 0.00199 CONC. 3 -0.08%
h 4 0.465 C.V. . 0.19884 CONC. 4 0.65%
h 5 0.352 INTERCEPTO 0.00107 CONC. 5 -0.50%
h 6 0.2 PENDIENTE 0.99996 CONC. 6 -0.16%
h 7 0.158 COEF.CORR. 0.99996 CONC. 7 -0.61%
h 8 0.129 CONC. 8 0.21%
h 9 0.0933
Tabla No. 7 Estadística del sistema de
calibración CONC. 9 0.47%
h 10 0.0742 CONC. 10 1.79%
h 11 0.0641 CONC. 11 0.43%
h 12 0.0543 CONC. 12 0.15%
h 13 0.0502 CONC. 13 -1.05%
h 14 0.0431 CONC. 14 -0.28%
h 15 0.0387 CONC. 15 0.12%
h 16 0.0363 CONC. 16 -0.85%
h 17 0.0349 CONC. 17 0.33%
h 18 0.0345 CONC. 18 -0.81%
h 19 0.0343 CONC. 19 -0.34%
h 20 0.0342 CONC. 20 0.32%
CONC. 21 0.43%Tabla No. 6 Análisis de la suma
de los errores de predicción CONC. 22 0.52%
CONC. 23 0.72%
CONC. 24 -0.17%
CONC. 25 0.33%
CONC. 26 0.80%
CONC. 27 -0.88%
CONC. 28 0.17%
CONC. 29 0.67%
CONC. 30 1.07%
CONC. 31 -0.21%
CONC. 32 -0.39%
Tabla No. 8 Coeficientes de
variación de cada una de las soluciones
que conforman el sistema de calibración.
46
2.5. CONDICIONES DE ANÁLISIS.
2.5.2. Ensayo analítico.
PREPARACIÓN DE ESTÁNDARES DE CALIBRACIÓN
1. Pesar en un vaso de pp. 150 mg de dextrometorfano SR
2. Hacer la corrección de peso con respecto a la pureza de dicho
estándar
3. Disolver el polvo con ayuda de un agitador magnético en 20 ml de
HCl 0.1 N
4. Vaciar la solución en un matraz volumétrico de 500 ml
5. Lavar el vaso con 10 ml de HCl 0.1 N 3 veces y vertir en el matraz
volumétrico
6. Llevar a la marca de aforo con HCl 0.1 N ( Solución A)
7. Pesar en un vaso de pp. 108 mg de metilparabeno
8. Disolver el polvo con ayuda de un agitador en 100 ml de HCl 0.1 N
9. Vaciar la solución en un matraz volumétrico de 500 ml
10.Lavar el vaso con 20 ml de HCl 0.1 N 3 veces y vertir en el matraz
volumétrico
11.Llevar a la marca de aforo con HCl 0.1 N ( Solución B)
12.Pesar en un vaso de pp. 10 mg de propilparabeno
13.Disolver el polvo con ayuda de un agitador en 50 ml de HCl 0.1 N
14.Vaciar la solución en un matraz volumétrico de 100 ml
15.Lavar el vaso con 10 ml de HCl 0.1 N 3 veces y vertir en el matraz
volumétrico
16.Llevar a la marca de aforo conHCl 0.1 N ( Solución C)
17.Preparar las soluciones de acuerdo a la siguiente tabla:
47
SISTEMA SOLUCIÓN A
(ml)
Dextrometorfano
SOLUCIÓN B
(ml)
Metilparabeno
SOLUCIÓN C
(ml)
Propilparabeno
Volumen
de
Aforo
(ml)
1 5 7 1 100
2 6 7 1 100
3 7 7 1 100
4 8 7 1 100
5 9 7 1 100
6 10 7 1 100
7 11 7 1 100
8 12 7 1 100
9 5 10 1 100
10 6 10 1 100
11 7 10 1 100
12 8 10 1 100
13 9 10 1 100
14 10 10 1 100
15 11 10 1 100
16 12 10 1 100
17 5 7 3 100
18 6 7 3 100
19 7 7 3 100
20 8 7 3 100
21 9 7 3 100
22 10 7 3 100
23 11 7 3 100
24 12 7 3 100
25 5 10 3 100
26 6 10 3 100
27 7 10 3 100
28 8 10 3 100
29 9 10 3 100
30 10 10 3 100
31 11 10 3 100
32 12 10 3 100
TABLA No. 9 Sistema de estándares de calibración
48
18. Obtener las absorbancias a las siguientes longitudes de onda
utilizando HCl 0.1 N como blanco de ajuste. 240, 239, 238, 238, 237,
236, 235, 234, 233, 232, 231, 230, 229, 228, 227, 226, 225, 224, 223,
222, 221, 220, 219, 218, 217, 216 y 215 nm
 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA.
1. Pesar en una balanza analítica 1 ml de jarabe dentro de un matraz
volumétrico de 100 ml.
2. Diluir con 40 ml de HCl 0.1 N
3. Agitar mecánicamente durante 5 minutos
4. Llevar a volumen con HCl 0.1 N
5. Obtener las absorbancias a las siguientes longitudes de onda
utilizando HCl 0.1 N como blanco de ajuste. 240, 239, 238, 238, 237,
236, 235, 234, 233, 232, 231, 230, 229, 228, 227, 226, 225, 224, 223,
222, 221, 220, 219, 218, 217, 216 y 215 nm.
 TRATAMIENTO NUMÉRICO
6. Predecir la concentración de dextrometorfano en el programa de
mínimos cuadrados parciales con los datos de absorbancia utilizando
los estándares de calibración con un numero de factores óptimo
(h) = 11
7. Calcular el % de dextrometorfano en el jarabe mediante la siguiente
ecuación:
  xDensidadx
mg
mlxx
gaPesomuestr
mlxestimadarfanoDextrometo %100
3
1
1000
1
)(
100% 
49
CAPÍTULO 3
VALIDACIÓN DEL MÉTODO
ANALÍTICO
50
VALIDACIÓN DEL METODO ANALÍTICO
Para la validación del método analítico desarrollado se utilizó una sola curva de
calibración para todos los análisis efectuados esto es para facilitar el trabajo experimental y
disminuir la variabilidad entre ensayos, pero en cada sesión experimental se preparó un
estándar externo a la curva de calibración de dextrometorfano, para determinar la capacidad
predictiva de la curva de calibración en cada análisis y corrigiendo todos los resultados
experimentales con este estándar.
3.1.1. LINEALIDAD EL SISTEMA
La siguiente característica del método a evaluar es la linealidad del sistema y esto se
elaboró de la siguiente manera:
1. Se preparó una solución stock de dextrometorfano a una concentración de 300
mcg/ml
2. Se elaboraron sistemas al 80, 90, 100, 110 y 120 %, se obtuvieron los datos de
absorbancias en el espectrofotómetro, y se hizo el tratamiento numérico bajo las
condiciones de análisis antes descritas.
3. Se registraron los datos obtenidos y se hizo un análisis estadístico de regresión
lineal teniendo como variable “X” la concentración real y como variable “Y” la
concentración estimada, el coeficiente de la ordenada al origen debe pasar por cero
y el coeficiente de la pendiente debe pasar por 1.
4. Para la precisión del sistema se evaluó el coeficiente de variación a los 5 niveles de
concentración de dextrometorfano el cual debe ser menor al 2.0 % los resultados se
muestran en la tabla No. 10.
51
PREDICCIÓN Dextrometorfano [REAL] % RECOBRO
CONC. 1 24.0332 23.9477 100.36 MEDIA 100.45
CONC. 2 24.0486 23.9477 100.42 DESVIACION 0.11
CONC. 3 24.0835 23.9477 100.57 C.V. 0.11%
80%
CONC. 4 27.5563 26.9411 102.28 MEDIA 100.87
CONC. 5 26.9061 26.9411 99.87 DESVIACION 1.26
CONC. 6 27.0647 26.9411 100.46 C.V. 1.25%
90%
CONC. 7 30.1779 29.9346 100.81 MEDIA 100.80
CONC. 8 30.1331 29.9346 100.66 DESVIACION 0.13
CONC. 9 30.2103 29.9346 100.92 C.V. 0.13%
100%
CONC. 10 33.2265 32.9281 100.91 MEDIA 101.66
CONC. 11 33.7999 32.9281 102.65 DESVIACION 0.90
CONC. 12 33.3933 32.9281 101.41 C.V. 0.88%
110%
CONC. 13 36.0134 35.9215 100.26 MEDIA 100.74
CONC. 14 36.2722 35.9215 100.98 DESVIACION 0.42
CONC. 15 36.2802 35.9215 101.00 C.V. 0.42%
120%
Tabla No. 10 Linealidad del sistema
REAL
STD(mg) 158.2 80% 23.9477
PUREZA*(%) 94.61 90% 26.9411
STOCK (mcg/ml) 299.34604 100% 29.9346
peso real std 149.67302 110% 32.9281
Tabla No 11 Cálculos de concentración
120% 35.9215
Tabla No 12
Concentraciones reales para linealidad del
sistema
52
Estadísticas de la regresión
Coeficiente de
correlación
múltiple
0.9988
Coeficiente de
determinación R^2
0.9977
R^2 ajustado 0.9975
Error típico 0.2231
Observaciones 15
Tabla No 13 Estadística de linealidad del sistema
ANÁLISIS DE VARIANCIA
Grados de
libertad
Suma de
cuadrados
Promedio de los
cuadrados
F Valor crítico de F
Regresión 1 280.25 280.25 5629.5 1.55982E-18
Residuos 13 0.64 0.04
Total 14 280.90
Coeficientes Error típico Estadístico t Probabilidad Inferior 95% Superior 95%
Intercepción -0.35 0.41 -0.85 0.40 -1.24 0.53
Variable X 1 1.02 0.01 75.03 1.55982E-18 0.99 1.05
Tabla No. 14 Obtención de los valores de intercepto y la pendiente mediante un análisis de variancia.
53
PRECISIÓN Y EXACTITUD DEL MÉTODO.
La siguiente cualidad del método fue la precisión y la exactitud; para esto fue
necesaria la preparación de placebos cargados y se elaboraron de la siguiente manera:
 PLACEBO CARGADO 80%
1. Pesar directamente en un matraz volumétrico de 100 ml 240 mg de
Bromhidrato de dextrometorfano SR corrigiendo el peso con la
pureza del mismo.
2. Vaciar al matraz 50 ml de placebo de jarabe.
3. Mezclar hasta disolución completa
4. Llevar a volumen con placebo de jarabe
5. Vaciar en un recipiente adecuado, etiquetar y almacenar a
temperatura ambiente
 PLACEBO CARGADO 90%
1. Pesar directamente en un matraz volumétrico de 100 ml 270 mg de
Bromhidrato de dextrometorfano SR corrigiendo el peso con la
pureza del mismo.
2. Vaciar al matraz 50 ml de placebo de jarabe.
3. Mezclar hasta disolución completa
4. Llevar a volumen con placebo de jarabe
5. Vaciar en un recipiente adecuado, etiquetar y almacenar a
temperatura ambiente
 PLACEBO CARGADO 100%
1. Pesar directamente en un matraz volumétrico de 100 ml 300 mg de
Bromhidrato de dextrometorfano SR corrigiendo el peso con la
pureza del mismo.
2. Vaciar al matraz 50 ml de placebo de jarabe.
3. Mezclar hasta disolución completa
4. Llevar a volumen con placebo de jarabe
5. Vaciar en un recipiente adecuado, etiquetar y almacenar a
temperatura ambiente
54
 PLACEBO CARGADO 110%
1. Pesar directamente en un matraz volumétrico de 100 ml 330 mg de
Bromhidrato de dextrometorfano SR corrigiendo el peso con la
pureza del mismo.
2. Vaciar al matraz 50 ml de placebo de jarabe.
3. Mezclar hasta disolución completa
4. Llevar a volumen con placebo de jarabe
5. Vaciar en un recipiente adecuado, etiquetar y almacenar a
temperatura ambiente
 PLACEBO CARGADO 120%
1. Pesar directamente en un matraz volumétrico de 100 ml 360 mg de
Bromhidrato de dextrometorfano SR corrigiendo el peso con la
pureza del mismo.
2. Vaciar al matraz 50 ml de placebo de jarabe.
3. Mezclar hasta disolución completa
4. Llevar a volumen con placebo de jarabe
5. Vaciar en un recipiente adecuado, etiquetar y almacenar a
temperatura ambiente
Para evaluar precisión y exactitud de hicieron 6 ensayos a cada nivel de
concentración. El método es exacto si la media experimental calculada esta dentro del
limite inferior y el limite superior de la prueba estadística t de student y es preciso si el
coeficiente de variación global es menor al 2 % los resultados se muestran en la siguiente
tabla
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PREDICCIÓN DEXTRO. EST. REAL % RECOBRO
CONC. 1 24.8887 24.86 100.13
CONC. 2 24.8061 24.86 99.80 MEDIA 100.47
CONC. 3 24.8512 24.86 99.98 DESVIACION 0.75
CONC. 4 24.9183 24.86 100.25 C.V. 0.75%
CONC. 5 25.313 24.86 101.84
CONC. 6 25.0636 24.86 100.84
CONC. 7 27.7384 27.96 99.20
CONC. 8 28.0289 27.96 100.24 MEDIA 100.37
CONC. 9 28.6925 27.96 102.61 DESVIACION