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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO Efecto de la manipulación del fotoperiodo en la reproducción de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss). FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE B I Ó L O G O P R E S E N T A HUMBERTO IVAN LÓPEZ VÁZQUEZ DIRECTOR DE TESIS: M. EN C. GENOVEVA INGLE DE LA MORA MÉXICO, D. F. SEPTIEMBRE DE 2008 ASESOR: DR. ISAÍAS H. SALGADO UGARTE UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. AGRADEMIENTOS Agradezco a mi mamá, hermana y tías por el apoyo para terminar mis estudios y simplemente por estar ahí A mi familia A la Maestra Genoveva por darme la oportunidad de formar parte de su proyecto A mis amigos del proyecto por el apoyo y trabajo realizado para que este saliera adelante Al Dr. Gerardo y Dr. Isaías por sus enseñanzas A todos los profesores por sus aportaciones a este trabajo A todos los profesores que tuve en la carrera A mis amigos, Alfredo, Miguel y Cohetero por todos esos grandes momentos vividos en la carrera y salidas a campo A mis amigos fuera de la carrera, en especial a Ramón que es como mi hermano, con los que he compartido muchas experiencias agradables A la UNAM por ser de las mejores escuelas y gracias a mi carrera MUCHAS GRACIAS INDICE RESUMEN………………………………………………………………………………1 1. Introducción………………………………………………………………………….2 2. Antecedentes……….………………………………………………………………..5 2.1 Clasificación y biología de la especie……………………………………………...5 2.1.1 Familia Salmonidae………………………………………………………………5 2.1.2 Trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss)……………….……………………….6 2.1.3 Diagnósis de la trucha arco iris……………………….……….…………………6 2.1.4 Vida……………………………………………………………………………..…7 2.2 La reproducción en los salmónidos……………………………………………….8 2.2.1 Los óvulos y el líquido folicular….……………………………………………...9 2.3 Factores ambientales y el control de la reproducción….…………………….….9 2.3.1 La aproximación ambiental: las modulaciones del fotoperiodo……………..11 2.4 Importancia económica en México………………………………………………12 2.5 Calidad del agua………………………………………………………….……….14 3 Justificación………………………………………..…………….……………..…...16 4. Objetivos…………………………………..……………………………………….17 5 Materiales y método…………………….…………………………...………………18 5.1 Zona de estudio…………………………………...………………………………..18 5.2 Infraestructura……………………………………………………………………..18 5.2.1 Sala de fotoperiodo……………………………………………………………….19 5.3 Lote experimental………………………………………………………………..…20 5.4 Tratamientos experimentales……………………………………………………...20 5.5 Manejo de los organismos………………………………………………………….22 5.5.1 Alimentación y limpieza de las tinas…………………………………………….22 5.5.2 Monitoreo…………………………………………………………………………22 5.5.3 Salud de los organismos y prevención de enfermedades………………………22 5.6 Medición de flujo de agua………………………………………………………….23 5.7 Determinación de parámetros fisicoquímicos…………………………………….23 5.8 Monitoreo de madurez……………………………….…………………………..…24 5.9 Desove de los organismos…………………………………………….……………..25 5.10 Calidad de óvulo…………………………………………………………………..26 5.10.1 Fecundidad total y relativa……………………………………………………..26 5.10.2 Volumen total de óvulo por hembra……………………………………….…..27 5.11 Calidad de esperma………………………………………….………………....….27 5.11.1 Volumen y peso de esperma…………………………….………………….....…28 5.11.2 Densidad de esperma (Kg/cm3)………………………………………………….28 5.11.3 pH del esperma……………..………………………………………………...….28 5.11.4 Número de espermatozoides/ml……….………………………...………........28 5.12 Análisis Estadístico……………………………………………………….………..29 6 Resultados……………………………………………………………………………..30 6.2 Calidad del agua……………………………………………………….…………..30 6.3 Número y porcentaje de éxito de desoves y ordeñas……………...……………31 6.4 Tiempo de desoves y ordeñas……………………………………………………..32 6.5 Calidad de óvulo………………………………………………………………….35 6.5.1 Fecundidad total………………………………………………………………...35 6.5.2 Tamaño de óvulo……………………………………………………….…….…37 6.6 Calidad de esperma……………………………………………………………….40 6.6.1 Peso y volumen de esperma…………………………………………………….40 6.6.2 Densidad(Kg/cm3). ……………………………..………………………….……42 6.6.3 Número de espermatozoides/ml…….……………………………………….….43 6.6.4 pH del semen…………………………………………………………………….44 7 Análisis de resultados……………………………………………….………………47 8. Conclusiones…….………………………………………………………………….54 Bibliografía…………………………………………………………………………….55 RESUMEN Con el objetivo de demostrar el efecto del fotoperiodo sobre la reproducción de la trucha arco iris y verificar la calidad de huevo y esperma, en la unidad de fotoperiodo en las instalaciones del centro acuícola “El Zarco” se evaluaron dos tratamientos de fotoperiodo, el tratamiento 1 consistió en 18 horas de luz y 6 de oscuridad (18L:6O) por dos meses, desde el 20 de Enero de 2007, seguido de cambio abrupto el 20 de Marzo de 2007 a un fotoperiodo de días cortos de 6 horas de luz y 18 horas de oscuridad (6L:18O) hasta el desove. El tratamiento 2 fue un fotoperiodo de 18L: 6O por 5 meses, desde el 20 de Enero de 2007, seguido de un cambio abrupto el 21 de Junio de 2007 a un fotoperiodo de días cortos de 6L:18O hasta el desove. Estos tratamientos se compararon con un lote de organismos en condiciones de fotoperiodo natural (Lote testigo). Se aplicó un análisis de varianza de una vía con un nivel de significancia de 5% y para comprobar el supuesto de igualdad de varianzas se utilizó una prueba de Bartlett (χ²). En los casos donde existían casos extraordinarios y se violaba la prueba de Bartlett, se analizaron con una prueba de Levene (F) con nivel de significancia de 5%. Los datos que no cumplieron con los supuestos de homoscedasticidad, se analizaron con el método no-paramétrico de Kruskal-Wallis (χ²) con nivel de significancia del 10%. Los resultados mostraron que los primeros organismos en desovar fueron los sometidos al tratamiento 1, estos tuvieron un avance en los desoves de 48 días y 90 días con respecto a los organismos del tratamiento 2 y 3 respectivamente. El número de días desde el 1 de Enero hasta el desove y ordeñas de cada organismo de los tres tratamientos fue significativamente diferente (Levene, Pr >F = 0.43422653 y Pr > F = 0.15775217, en hembras y machos respectivamente). Las fecundidades absoluta y relativa no presentaron diferencia significativa. El diámetro de óvulo (en mm) de los organismos del tratamiento 1 tuvo un diámetro menor al óvulo producido por los organismos del tratamiento 2 y lote testigo (3), los cuales tuvieron diferencia significativa Bartlett Pr> χ²= 0.650. El peso y volumen de semen producidos por los machos de los tres tratamientos no presentaron diferencia significativa (Levene Pr > F = 0.31295346) así como la densidad del semen (Levene Pr > F = 0.36775186). El número de espermatozoides/ml entre el tratamiento 1 y 3 presentó diferencia significativa en la prueba de Kruskal-Wallis (χ²=4.961 Pr=0.0837). Los valores de pH del semen oscilaron entre 7 y 9, existió diferencia significativa con la prueba de Bartlett Prob>chi2=0.824. Con base en los resultados la conclusión general fue que al aplicar el fotoperiodo de días largos seguido del fotoperiodo de días cortos es muy estimulante para el desarrollo gonadal tanto en hembras y machos adelantando así la maduración en comparación con el testigo. 1 1. INTRODUCCIÓN La mayoría de las especies de peces tienenestaciones definidas para el desove como parte de sus interrelaciones reproductoras cronometradas y son generalmente agrupadas como se indica a continuación. Los peces de aguas cálidas desovan durante el verano y los de aguas frías durante el otoño e invierno. Las especies que toleran las temperaturas intermedias desovan generalmente durante la primavera. El ritmo fisiológico interno de la maduración gonadal, que envuelve predominantemente las interacciones pituitario-gonadales, es ajustado de tal modo que asegure la aparición de las actividades sexuales cuando las condiciones ambientales sean más favorables para la supervivencia de la cría. Los cambios que ocurren en la duración de la luz durante el día (fotoperiodo) y la temperatura afectan el ritmo de la maduración gonadal y el desove del pez en la zona templada y las latitudes altas (Lagler et al., 1990). El fotoperiodo y la temperatura son los principales factores ambientales que inciden directamente sobre el sistema nervioso central y, en particular, sobre el eje hipotálamo-hipófisis-gónada de los peces, es el parámetro medioambiental más utilizado en el control de la reproducción de los salmónidos. El adelanto o retraso del proceso de la pubertad y de la reproducción por factores ambientales son aspectos muy importantes por su implicación práctica en la producción controlada y continua de huevos y larvas por parte de las piscifactorías (Ramos et al., 2002). Están reportados resultados positivos de adelanto de desove por tres meses o más con intensidad luminosa de 25 lux (Duston y Bromage, 1986; Duston y Bromage, 1987), 950 lux (Bon et al., (1997).80 lux (Davies y Bromage, 2002), 212129 lux (Taylor et al., 2006), Esto es muy atractivo para muchos criadores de trucha quienes desean modificar la velocidad de maduración y tiempos de desove de especies de importancia comercial, en particular para la producción de huevos en intervalos mas regulares durante el año. El aumento de la demanda de trucha requiere no solo una optimización del potencial reproductivo de los lotes existentes, sino también una extensión de la disponibilidad de huevo fertilizado en cualquier tiempo del año, fuera de los periodos normales de desove de los lotes de criadero (Bon et al., 1997). Cada vez más, la sofisticación del mercado para la trucha demanda continuidad de producto en términos de calidad y tamaño de los peces producidos, así como el mantenimiento del suministro regular durante el año. La completa realización de estos objetivos requiere conocimiento y control de todos los aspectos de la biología de la trucha de la cual el más importante indiscutiblemente es la reproducción. Ciertamente, en trucha como con otros salmónidos, su historia es dominada por la reproducción y esta tiene un problema especial para los productores y científicos pesqueros. Cambios deterioradores en la coloración y textura de la carne junto con la reducción en crecimiento y un 2 incremento de susceptibilidad a enfermedades, particularmente en peces machos, alentaron el desarrollo de métodos de retraso o prevención de la maduración (Bromage et al, 1979). Para las especies salvajes la dependencia sobre los cambios de luz es de considerable importancia adaptativa porque sirve para sincronizar la producción de huevos y crías con la disponibilidad de alimento en los cambios de temporada. Para los lotes de granja la temporalidad impone considerables contrastes sobre la producción, porque huevo y cría pueden solo ser introducidos en las granjas concernientes con el crecimiento del pez, por unos cuantos meses del año. Esto resulta en un ineficaz uso de tanques, estanques, mano de obra y disponibilidad de agua durante los 12-18 meses del ciclo de producción; en algunas ocasiones, particularmente mientras el pez es joven, son fácilmente subutilizados, mientras granjas con peces cercanos a la talla comercial son frecuentemente almacenados en exceso y pueden requerir aireación auxiliar. La introducción temporal de huevos también produce un exceso en el mercado cuando muchos peces alcanzan la talla al mismo tiempo. Todos estos contrastes sirven para reducir el beneficio del cultivo intensivo de trucha. Mucha de la producción y manejo se dificultan por la relación con la temporalidad, esto se evitaría o minimizaría si el suministro de huevo estuviera disponible fuera de los tiempos naturales de desove de las especies. En el presente muchos países realizan la importación de huevo oculado de otros países cuyas truchas tienen diferentes tiempos de desove al suyo. Desafortunadamente cada importación, necesita estricto control, porque lleva un riesgo de introducir enfermedades no endémicas. En vista de este riesgo muchos países ven en la modificación artificial de la reproducción la manera de llevar a cabo la autosuficiencia todo el año de suministro de huevos de trucha arco iris (Bromage y Cumaranatunga, 1988). El establecimiento de medidas de bioseguridad, el uso eficiente del agua y el mantenimiento de la cantidad y calidad de la misma son principios fundamentales del centro acuícola el Zarco. Al no existir el abastecimiento de crías y huevo, se incrementaron las importaciones de huevo de trucha por empresarios privados y con esto se incrementa de manera exponencial el riesgo nacional de introducir otras enfermedades de impacto económico no presentes en nuestro territorio, así como transformar el mapa genético de las poblaciones de trucha en nuestro país, lo cual tiene un costo incalculable. Una alternativa para enfrentar este problema, es modificar la época de desove, variando artificialmente el régimen de fotoperiodo natural para la producción de huevo fuera de temporada normal. Esto tendrá como resultado el ofrecer al sector productivo huevo y crías de calidad fuera de temporada, mayor eficiencia productiva, reducción a corto plazo al menos un 50% de la importación de huevo oculado, incrementar la capacidad de producción del centro acuícola el Zarco y la difusión de la tecnología a los productores de trucha arco iris, para su implementación en las unidades de producción. El impacto 3 ambiental sería, la protección del patrimonio sanitario del país, el estar en condiciones de ofrecer huevo y crías con la periodicidad que demanda el sector y disminuir el riesgo de introducción de enfermedades y utilización racional del agua. El objetivo de la tesis ha sido evaluar el efecto de dos regímenes de fotoperiodo de días largos (18L:6O) durante 2 y 5 meses, seguidos de un cambio abrupto a día corto (6L:18O), comparado con un lote en condiciones de fotoperiodo natural en la reproducción de un lote de truchas arco iris (Oncorhynchus mykiss), 4 2. ANTECEDENTES 2.1 Clasificación y biología de la especie 2.1.1 Familia Salmonidae De acuerdo con la clasificación existente, los salmónidos pertenecen al orden Salmoniformes, suborden Salmonoidei, familia Salmonidae y subfamilia Salmonidae, (Nelson, 1994). Las especies de salmónidos existentes aparecieron en el periodo Terciario tardío, en el Plioceno y se extendieron en el Pleistoceno (Berg, 1948; Vladimirov, 1948; Yakovlev, 1961; Kimmel, 1975; Smith et al., 1982). Sus ancestros probablemente pertenecieron a los peces Cupleiformes (Nikolsky, 1971). La mayor parte de los especialistas están de acuerdo en que los salmónidos se originaron en agua dulce (Berg, 1948, Vladimirov, 1948; Neave, 1958; Vladykov, 1963), aunque otros autores proponen un origen marino (Smith, 1895; Zenkevich, 1933). Los estudios sobre evolución y origen de los salmónidos son numerosos y muchos de ellos proporcionan esquemas de relacionesfilogenéticos entre los géneros, los cuales están basados en morfología comparativa y datos de genética molecular. Los resultados muestran que el género Salmo y el altamente especializado Oncorhynchus son los géneros más evolucionados (Norden, 1961; Simon; 1963; Viktorovsky, 1978; Glubokovsky y Glubokovskaya, 1981). En 1988 la American Fisheries Society´s Comite on Names of Fishes, aceptó Oncorhynchus como nombre genérico más apropiado para designar a las truchas nativas de la cuenca del Pacífico, después de sustentar que los Salmo, truchas nativas en las vertientes del Pacífico Norte, se encuentran genéricamente más cercanas con el salmón del Pacífico Oncorhynchus que con las especies Salmo del Atlántico y Europa. Tal evidencia pone de manifiesto que Rhabdofario, Parasalmo y Oncorhynchus no son distintas a nivel de género. De estos nombres Oncorhynchus tiene prioridad histórica taxonómica para este grupo de peces. Paralelamente se aclaró que la trucha arco iris y la trucha “kamchatkan” Salmo mykiss de Asia, constituyen una única especie y que el nombre mykiss tiene prioridad en la nomenclatura. Por esta razón el Names of Fishes Comite adoptó Oncorhynchus mykiss (Walbaum 1792), como nombre científico de esta especie, sustituyendo al anterior Salmo gairdneri (Richardson 1836) (Smith y Stearley, 1988; Gall, 1990). 5 Actualmente los organismos del género Oncorhynchus viven en la zona norte del Océano Pacífico, alcanzando el Estrecho de Behring y el Océano Glacial Ártico. Cuando les llega la hora de la reproducción, suben por los ríos del norte de China, Siberia, Japón, Alaska, Canadá y los Estados Unidos (hasta el estado de California). Algunas de estas especies han sido aclimatadas en aguas de Nueva Zelanda para poblar las aguas europeas fue importado de América el salmón real o salmón de California (Oncorhynchus tschawytscha) (Lotina y de Hormaechea, 1975). 2.1.2 Trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) Fue descrita primero por Richardson en 1836 de especies colectadas en el río Columbia (Bromage y Cumaranatunga, 1988). Las truchas arco iris, aclimatadas en Europa (Inglaterra) desde el año 1875 y después en otros continentes, son las descendientes de la Salmo irideus shasta de Jordan, que habitan en los ríos y afluentes tributarios del gran río Sacramento, que se encuentra en California al sur del monte Shasta. Es una de las seis variedades o subespecies que el Salmo irideus tiene en América del Norte (Torres-Orozco, 1991). 2.1.3 Diagnósis de la trucha arco iris Pez dulceacuícola de cuerpo alargado y ligeramente comprimido, de 25 a 75 cm de longitud y con peso de 4 a 7 Kg, el tamaño de las truchas arco iris europeas es menor que el de las americanas. La cabeza es grande (sobre todo en los machos sexualmente maduros) y parecida a la de la trucha común. Boca terminal y un tanto oblicua, rebasa el margen posterior de los ojos; estos últimos son de tamaño moderado. Posee dientes bien desarrollados en ambas mandíbulas, así como en el paladar y la lengua. La aleta dorsal se emplaza a la mitad del cuerpo, está formada por 10 a 12 radios, y va seguida de una pequeña aletilla adiposa; la anal es de margen recto, con 8 a 12 radios; la caudal es fuerte, escotada y sinuosa. Las pélvicas son abdominales y las pectorales bajas y puntiagudas, formadas por 11 a 17 radios. El cuerpo está cubierto de pequeñas escamas suaves al tacto, su número varía de 120 a 200 sobre la línea lateral casi recta. El color del pez varía en función del área en que habita y de su estado de madurez sexual. El patrón básico es azul verdoso arriba, blanco plateado en las hembras y grisáceo en el macho adulto en el vientre, con una banda rojiza longitudinal difusa en los costados, tiene numerosas manchas negras en todo el cuerpo y las aletas hialinas o amarillentas. 6 Tiene radios en las aletas pectorales, ventrales y anal (Torres-Orozco, 1991). La figura 1 muestra un diagrama de trucha arcoiris de ambos sexos. ♀ Figura 1. Diagrama de una trucha arco iris Oncorhynchus mikyss hembra y macho respectivamente.Tomadas de: www.todopesca.com/fichas/tarcoiris.htm y www.neuquen.gov.ar/org/cean/animales%20en%20cean.htm respectivamente) 2.1.4 Vida Los salmónidos son peces muy estrictos en cuanto a las condiciones del medio acuático en donde viven y con muy poca capacidad para adaptarse a otras situaciones que no sean las propias naturales. Esto restringe su existencia a aguas claras y cristalinas, de curso rápido y temperatura fría que favorece la oxigenación del agua y que por su cercanía al nacimiento, no sufren las contaminaciones habituales precedentes de los núcleos urbanos y de los vertidos industriales. En el medio natural, la trucha puede defenderse de las modificaciones o agresiones de las aguas mediante refugios temporales o migraciones a lugares idóneos (Blanco, 1995). La trucha arco iris habita en ríos, arroyos e inclusive en lagos, siempre que éstos sean fríos, transparentes y bien oxigenados. Prefiere los fondos de grava o arena, ricos en plantas acuáticas. No es tan voraz como las otras especies de su género y su dieta se basa en insectos, aunque también incluye moluscos, crustáceos, gusanos y otros peces. La trucha arco iris normalmente vive de 5 a 8 años. La distribución original de esta especie comprendía desde el sur de Alaska hasta California y Chihuahua, sin embargo; en la actualidad ha sido introducida artificialmente a casi todos los estados de la República Mexicana en donde existen las condiciones adecuadas para su crecimiento. El dominio de su cultivo ha convertido paulatinamente a la trucha, de una presa deportiva en un producto de abasto 7 ♂ 60 cm 45 cm http://www.neuquen.gov.ar/org/cean/animales%20en%20cean.htm http://www.todopesca.com/fichas/tarcoiris.htm (Torres-Orozco, 1991). Desde 1874, cuando el cultivo artificial de esta especie comenzó, el alcance de la trucha arco iris se ha extendido desde el oeste de Norteamérica hasta incluso aguas en todo el continente excepto la Antártica. Algunos factores limitan esta distribución, se sabe que florecen solo en hábitat donde la temperatura este debajo de 13° C y donde el promedio anual de lluvia exceda 250 mm. La distribución mundial de la trucha arco iris está dada por la habilidad de adaptarse a varias condiciones de granjas, lagos, ríos y otras aguas, siempre y cuando reúnan estrictamente las características ya mencionadas. Esta flexibilidad proporciona un alcance de crecimiento alto y resistencia relativa en otros salmónidos y es atractivo como pez deportivo y un recurso alimenticio, por esto es una especie ideal para su cultivo artificial (Bromage y Cumaranatunga, 1988). 2.2 La reproducción en los salmónidos Presentan dimorfismo sexual este resulta sumamente notable en la época de celo, que ocurre en el invierno, cuando se presentan importantes cambios morfológicos y conductuales. Los machos se vuelven agresivos, su cabeza aumenta de tamaño por la prolongación del hocico y adoptan colores más intensos, con dominancia de tonos azules y rojizos. Los machos maduran a los dos años y las hembras a los tres. Desovan de noviembre a mayo de quinientos a tres mil óvulos de unos 5 mm de diámetro dependiendo del tamaño del animal, el desarrollo de estos toma de 100 a 150 días, en función de la temperatura del agua, con temperaturas bajas el crecimiento es más lento. Los alevines son precoces y fuertes (Torres-Orozco, 1991). En trucha arco iris, la maduración gonadal es característicamente un evento anual, el crecimiento de la gónada comienza en la primavera, en preparación para desovar en los meses de otoño e invierno (Bon et al., 1997). Todos los Salmónidos presentan un ciclo reproductor anual muy definido, con una fase de reposo sexual (calificada así porque las gónadas están poco desarrolladas), dado estecarácter cíclico, tanto el ovario como el testículo sufren, desde esta primera fase de reposo, una serie de modificaciones, tanto morfológicas como estructurales, correspondiendo todo ello al proceso de elaboración de los gametos. Una fase de crecimiento importante de las gónadas es la espermatogénesis en el macho y a la vitelogénesis en la hembra y finalmente, la maduración y liberación de los gametos (espermiación y ovulación) que intervienen espontáneamente en los Salmónidos, incluso en cautividad. Las épocas en que aparecen estas diferentes fases varían según las especies y pueden variar incluso dentro de una misma especie; es el caso de la trucha arco iris, en que la acción del hombre ha llevado a la consecución de cepas que se reproducen en distintas épocas del año (Barnabé, 1991). 8 2.2.1 Los óvulos y el líquido folicular El número de óvulos maduros emitidos o extraídos de las hembras depende de numerosos factores individuales, en términos generales la hembra joven puede desovar de 1000 a 1500 óvulos por kilogramo de peso vivo; hembras de dos años y con un peso de 1 kg pueden desovar aproximadamente 2500 óvulos y hembras de tres años con un peso de 2 kg pueden desovar hasta 3500 óvulos (Vargas 2003). El tamaño de los óvulos depende también de varios factores, aunque es la edad y tamaño o peso de la hembra los factores que más influyen, variando su diámetro entre 3 y 6 mm. Las hembras de dos años de edad producen menor cantidad de óvulos y son de menor tamaño y el porcentaje de fertilidad es menor. El tamaño aumenta con la edad, siendo habitualmente explotadas las hembras de trucha arco iris de 3-4 y 5 años, a partir del cual son eliminadas, pues aunque los óvulos son de mayor tamaño, la cantidad producida por kilo de peso es menor y aumenta, además el índice de infertilidad. El proceso de maduración, realizado en aguas frías, es motivo también de óvulos de pequeño tamaño, que darán origen a larvas con vesícula vitelina de tamaño proporcional. La aptitud de los óvulos para ser fecundados depende de las condiciones ambientales durante el período de la formación de los óvulos, del período de permanencia en la cavidad abdominal después de la ovulación y a ciertos factores individuales, tal como la edad (Blanco, 1995). Las manipulaciones durante el período de maduración, tales como la nutrición adecuada, fotoperiodos largos, el tratamiento hormonal, etc., es decir, todo aquello que favorezca la vitelogénesis, secunda el mayor tamaño de los óvulos (Islam et al., 1973; Campbell et al., 1979). El líquido folicular que acompaña a los óvulos en el momento de la emisión juega un papel muy importante en la fecundación, al modificar el medio donde se realiza, facilitando de esta forma la actividad y movilidad del espermatozoide. No existen criterios decisivos para apreciar la calidad de los gametos. En el macho la motilidad de los espermatozoides, duración e intensidad constituyen una buena prueba global, pero es difícil de cuantificar y no está siempre estrechamente relacionado con el poder fecundante (Goryezko y Tomasik, 1975). 2.3 Factores ambientales y el control de la reproducción Los salmónidos, como la mayor parte de los peces superiores, reciben los cambios ambientales del medio en que viven a través de los órganos de los sentidos. Estas percepciones sensoriales actúan como mecanismo de información al sistema nervioso central el cual integra toda esta información y envía respuesta a través de la médula espinal y nervios periféricos. 9 Existe una gran interdependencia o relación entre el sistema nervioso central y el sistema endocrino, constituido este último por un gran número de glándulas cuya función es la de segregar hormonas, como respuesta a las órdenes procedentes del sistema nervioso central. De esta interconexión entre ambos sistemas depende básicamente la regulación fisiológica del ciclo reproductor. La puesta en marcha del ciclo sexual, en los peces adultos, se inicia fundamentalmente por estímulos en relación con el acortamiento de los períodos diurnos de luz y otros estímulos ambientales (Blanco, 1995). Los estímulos lumínicos son recogidos a través del ojo por las células nerviosas de la retina y transmitidos por la vía óptica a áreas corticales del cerebro. Se conoce hoy en día la existencia de conexiones intermedias de propia función vital, tal como el hipotálamo (Billard, 1978). Es ésta una estructura nerviosa en íntima conexión anatómica y funcional con la hipófisis. La función de esta glándula es la de segregar hormonas que regulan la mayor parte de las funciones vitales del organismo, siendo algunas de ellas las que intervienen directamente en la regulación del ciclo sexual (Whitehead et al., 1978). En la reproducción temporal de algunos peces muchos factores ambientales, fotoperiodo, temperatura y estado nutrimental, están implicados en la iniciación de la reproducción y eventos de maduración. El fotoperiodo es considerado el más efectivo de esos factores ambientales en el control del ciclo reproductor de los salmónidos. La influencia del fotoperiodo sobre la maduración de las gónadas en los salmónidos ya fue demostrada en 1937 por Hoover y Hubbard, quienes consiguieron adelantar quince semanas el período de la puesta en un lote de truchas Salvelinus fontinalis, reduciendo gradualmente, la exposición a la luz. Los efectos positivos del fotoperiodo sobre el desove fueron demostrados por muchos autores entre los que se puede citar a Hoover y Hubbard, (1937); Hazart y Eddy, (1951); Nomura, (1962); Henderson, (1963); Goryczko, (1972); Breton y Billard, (1977); Whitehead et al., (1978); Bromage et al., (1982); Scout y Sumpter, (1983); Whitehead et al., (1983); Scout et al., (1984); Duston y Bromage, (1987), Taylor et al., (2006). El fotoperíodo y la temperatura son los principales factores ambientales que inciden directamente sobre el sistema nervioso central y, en particular, sobre el eje hipotálamo-hipófisis-gónada de los peces. El fotoperíodo es el parámetro medioambiental más utilizado en el control de la reproducción de los salmónidos. El adelanto o retraso del proceso de la pubertad y de la reproducción por factores ambientales son aspectos muy importantes por su implicación práctica en la producción controlada y continuada de huevos y larvas por parte de las piscifactorias (Ramos et al., 2002). El fotoperiodo más estimulante para el desarrollo gonadal es un día largo (≥16 hr luz día-1) o un incremento natural de la luz hasta la primavera o primeros días de verano seguido por días cortos 10 constantes (≤6 hr luz día-1). Estos tipos de régimen de fotoperiodo pueden adelantar la maduración en salmónidos por 3-4 meses (Henderson, 1963; Shiraishi y Fukuda, 1966; Bromage et al., 1984; Takashima y Yamada, 1984). Están reportados resultados positivos de adelanto de desove por tres meses o más con intensidad luminosa de 25 lux por Duston y Bromage (1986), Duston y Bromage (1987) 950 lux, Bon et al., (1997), 80 lux Davies y Bromage (2002) y 212±129 lux Taylor et al., (2006). 2.3.1 La aproximación ambiental: las modulaciones del fotoperiodo y la temperatura del agua Se sabe que en general, la gametogénesis de los Salmónidos tiene lugar en verano y que el factor ambiental responsable es el cambio del fotoperiodo y, más exactamente el ritmo decreciente que pasa de 16 horas de luz por día en junio, a 8 horas en diciembre. Si este régimen de fotoperiodo decreciente se aplica experimentalmente (instalando tubos fluorescentes controlados por un reloj eléctrico en tanques cubiertos) y comienza entre enero y junio, los progenitores están maduros seis meses más tarde. Así es posible adelantar la época de reproducción.Sin embargo, obtener la reproducción de los Salmónidos en período estival implica disponibilidad de agua fría ≤ 12° C para la incubación. Si los progenitores han de estar sometidos a temperaturas estivales elevadas, no se aconseja intentar obtener la reproducción fuera de estación. Se han conseguido retrasos de la reproducción por modulación del fotoperiodo manteniendo a los progenitores con fotoperiodos largos (16 a 24 horas de luz) después de junio (lo que viene a suprimir el régimen decreciente). Sin embargo, hubo que lamentar ovulaciones incompletas, de modo que esta técnica es de alcance más limitado (Barnabé, 1991). La reproducción de los salmónidos es un evento anual comenzando con un crecimiento gonadal en primavera, en preparación para el desove en otoño o invierno. Como en muchos otros vertebrados de latitudes altas, el fotoperiodo es una influencia importante sobre el tiempo de maduración y la temperatura probablemente juega un papel suplementario. El fotoperiodo más estimulante para el desarrollo gonadal es un día largo (≥ 16 hr de luz) o un incremento natural de luz de día hasta la primavera o comienzos del verano seguido de días cortos constantes (≤8 hr de luz). Este tipo de fotoperiodo puede avanzar la maduración en salmónidos de 3-4 meses (Duston y Bromage, 1987). Los cambios hormonales que controlan directamente las funciones reproductivas de peces teleósteos inicialmente señalan y subsecuentemente se modifican por una variedad de factores ambientales y que la luz del día es de importancia primordial en los salmónidos. En general, la trucha arco iris sexualmente madura desova en el otoño e invierno bajo un cada vez menor periodo de horas luz (Bromage et al., 1984). La trucha arco iris normalmente se reproduce una vez al año pero hay varios reportes de peces que 11 completan dos ciclos reproductivos en un año. Esto es relativamente raro; sin embargo, un desove bianual puede ser inducido en trucha arco iris por manipulación del fotoperiodo. En muchos casos, se sugiere el cambio de un largo a un corto periodo de luz de día como un importante factor que estimula el desarrollo gonadal (Scout et al., 1984). Se ha establecido que la reproducción de la trucha arco iris y probablemente en todos los salmónidos es iniciada y subsecuentemente modulada por avisos derivados desde los ciclos de duración del día en los cambios de temporada (Duston y Bromage, 1986). Así, la manipulación del fotoperiodo en el ciclo reproductivo tiene un desarrollo en las granjas comerciales que supera el aspecto de desove por temporada. Muchos experimentos realizados con trucha arco iris han demostrado que la exposición a avanzadas o comprimidas temporadas de ciclos de luz, inducen desarrollo gonadal precoz. Sin embargo, con un avance en el tiempo de desove se obtienen tallas de óvulos pequeñas, las cuales no son aceptables para la venta, por el contrario la calidad del óvulo y el potencial de crecimiento de los alevines producidos no son alterados (Bon et al., 1997). La temperatura del agua tiene en la reproducción de los salmónidos una gran importancia, sobre todo en salmonicultura industrial, pues en esta situación los peces se encuentran confinados en el medio ambiente elegido por el piscicultor, el cual puede no ser el más idóneo. La práctica del fotoperiodo requiere de la aplicación conjunta con la temperatura del agua, es conveniente que las piscifactorías se instalen en cursos de agua cuya procedencia sea de manantial. Es de absoluta necesidad que la temperatura no exceda de 12° C. La fertilidad de los gametos, sobre todo en los procesos de ovulación, así como la espermiación de los machos es favorecida por temperaturas no superiores a la comentada. El fotoperiodo y la temperatura son los principales factores ambientales que inciden directamente sobre el sistema nervioso central y, en particular, sobre el eje hipotálamo-hipófisis-gónada de los peces. El fotoperiodo es el parámetro medioambiental más utilizado en el control de la reproducción de los salmónidos. (Ramos et al., 2002). 2.4 Importancia económica en México Los sistemas de cultivo empleados para cultivar a la trucha arco iris son intensivo y semi-intensivo, la infraestructura usada es estanquería rústica, de concreto, canales de corriente rápida (raceways) y jaulas. Su uso es para cultivo comercial, para la producción de alimento para el consumo humano, pesca deportiva y repoblación de ríos y lagos. La Figura 2 muestra los estados de la República Mexicana donde se explota el cultivo de trucha arco iris. 12 En el Cuadro 1 se muestra la producción de crías de trucha en centros acuícolas de la SAGARPA, el Cuadro 2 muestra el volumen de producción nacional de trucha y el Cuadro 3 la cantidad de huevo oculado importado utilizado en México (SAGARPA, D.O.F. 15-03-07). Cuadro 1. Producción nacional de crías de trucha en Centros Acuícolas de la SAGARPA (2002-2006). Año Millones de crías Número de Centros Acuícolas productores en el año 2002 2003 2004 2005 2006 1.1 0.8 1.0 1.4 0.9 4 4 3 3 2 Fuente: Dirección General de Organizaciones y Fomento de CONAPESCA-SAGARPA (D.O.F. 15-03-07). Cuadro 2. Volumen de la producción acuícola de trucha en México (1997-2006) Año Miles de toneladas 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 1.5 1.6 2.2 2.3 3.2 3.3 3.3 3.9 3.5 5 Fuente: Anuarios Estadísticos de Pesca (1997-2002) SAGARPA y datos 2003 y 2006 de las Subdelegaciones Federales de Pesca de la SAGARPA (D.O.F. 15-03-07). 13 Figura 3. Distribución del cultivo en la República Mexicana (En café) Figura 2. Distribución del cultivo de trucha arco iris en México. (D.O.F. 15-03-07) Cultivo de trucha Cuadro 3. Cantidad de huevo oculado importado a México (2001-2006) Año Millones de huevos oculados 2001 8.1 2002 9.8 2003 7.8 2004 9.9 2005 8.3 2006 14.1 Fuente: Dirección General de Organización y Fomento. CONAPESCA-SAGARPA (D.O.F. 15-03-07). 2.5 Calidad del agua Las propiedades físicas tales como temperatura, pH, oxígeno, amonio, etc., pueden estar sometidas a variaciones bruscas por la influencia de factores externos, fundamentalmente climáticos. Las propiedades químicas sin embargo, son mucho más estables y sus variaciones son mínimas, salvo en casos excepcionales en los que una contaminación puede producir efectos irreversibles. Las propiedades biológicas están condicionadas a la ausencia o presencia de agentes patógenos. Estas propiedades, que influyen en la calidad del agua de cultivo, varían a medida que esta agua es utilizada en la cría intensiva, llegando a un límite tal en el que ya no es apta, consiguiéndose entonces lo que se llama índice de utilización máximo (Blanco, 1995). Los trabajos realizados por numerosos autores tales como Doudoroff y Katz (1950), Marchetti (1962), McKee y Wool (1963) y Jordan et al. (1964) ponen de manifiesto que los valores normales de pH del agua para el cultivo de trucha, varían entre 5 y 9 como se observa en el Cuadro 4. Cuadro 4. Valores de pH del agua para el cultivo de trucha. Valor del pH Incidencia 3.5 – 4 Mortal para los salmónidos 4 – 4.5 Perjudicial para los salmónidos. La resistencia a estos valores aumenta con el tamaño y la edad. 4.5 – 5 Límite de alarma de acidez para los huevos y alevines de salmónidos. La persistencia de estos valores durante largos períodos puede ser causa de mortalidad. 5 – 6 Peligro poco probable para el conjunto de las especies salvo en presencia de concentraciones de anhídrido carbónico libre superior a 20 mg/l. 6 – 6.5 Peligro poco probable para el conjunto de las especies a menos que la concentración de anhídrido carbónico libre no sea superior a 100 mg/l. 6.5 – 9.5 Ningún peligro para lospeces, excepto si al mismo tiempo están presentes compuestos amoniacales. 9.5 – 10 Mortal para los salmónidos al cabo de un cierto período de tiempo. 10 – 11 Mortal. 14 El cuadro 5 muestra los valores óptimos, dudosos y peligrosos de los parámetros fisicoquímicos del agua más importantes para el cultivo de trucha arco iris. Cuadro 5. Valores normales, dudosos y peligrosos de los factores físico-químicos para los salmónidos (Sabaut 1976). Salmónidos Factores Unidad de Media Normal Dudoso Peligroso Temperatura del agua ° C Menor de 20° C 20-22 22 y más % de saturación de O2 disuelto % ≤80% 50-70% 50% pH pH 6<pH<9 pH<6 pH>9.2 pH<5.5 pH>9.5 Alcalinidad en (HCO3-) mg/l Débil 8 Fuerte 400 Calcio mg/l Débil 8-60 Fuerte 60-200 Nitratos (NO3-) mg/l 0-10 -11 ó más Nitritos (NO2-) mg/l 0 - 0.001 0.1 Igual o más de 1 Amoníaco (NH4-) mg/l 0 - 0.001 0.01 – 0.4 Igual o más de 1 Materias en suspensión mg/l Menos de 30 30 - 70 Más de 70 15 3 JUSTIFICACIÓN En México, debido a las condiciones ambientales, los desoves de trucha aro iris (Oncorhynchus mykiss) se limitan a unos cuantos meses (noviembre a febrero), lo que provoca un desabasto en el suministro nacional de huevo. Esto ha obligado al sector productivo a importar huevo oculado con el riesgo de introducción y dispersión de enfermedades. Una alternativa para enfrentar esta problemática, es ampliar la época de desove, variando artificialmente el régimen de fotoperiodo natural para la producción de huevos fuera de temporada, esta tecnología se aplica desde hace varios años en varios países. En marzo del 2006 se aprobó la propuesta “Modificación de la época de desove de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) mediante la regulación del fotoperiodo” con clave de registro 12386 por el Comité Técnico y de Administración para ser apoyado con recursos del “Fondo Sectorial de Investigación en Materia Agrícola, Pecuaria, Acuacultura, Agrobiotecnología y Recursos. 16 4. OBJETIVO GENERAL Evaluar el efecto de la manipulación del fotoperiodo en la maduración de reproductores de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss). 4.1 Objetivos Particulares Determinar el efecto sobre la maduración en reproductores de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) de un régimen de fotoperiodo de día largo (18L:6O) durante 3 meses seguido de un cambio abrupto a día corto (18O:6L) hasta el desove. Valorar el efecto sobre la maduración en reproductores de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) de un régimen de fotoperiodo de día largo (18L:6O) durante 5 meses seguido de un cambio abrupto a día corto (18O:6L) hasta el desove. Comparar el avance del desove con respecto a un lote sometido a fotoperiodo natural. Evaluar el efecto del fotoperiodo en la calidad de huevo. Determinar el efecto del fotoperiodo en la fecundidad total y relativa. Valorar el efecto del fotoperiodo en la calidad del esperma. Comparar la calidad de huevo y esperma con los obtenidos con el lote sometido a fotoperiodo natural (lote de referencia). 17 5. MATERIAL Y MÉTODOS 5.1 Zona de estudio El trabajo se realizó en el Centro Acuícola “El Zarco” perteneciente a SAGARPA-CONAPESCA, localizado en el km. 32.5 de la Carretera Libre México-Toluca, Ocoyoacac, Estado de México, México, dentro del Parque Nacional Miguel Hidalgo y Costilla, también denominado La Marquesa. El Centro esta situado sobre la parte central del Eje Neovolcánico Transversal a 3060 msnm, con coordenadas 19°17’58’’ latitud Norte y 99°22’15’’ longitud Oeste; el Centro está dedicado a la producción de huevo oculado y de crías de trucha Arco iris. Cuenta con una superficie de 8.6 hectáreas. El agua de abastecimiento proviene del manantial denominado Pajaritos y Agua Azul, así como de manantiales ubicados en el mismo Centro. La temperatura promedio del agua oscila entre los 9 °C y 13 °C y concentración de oxígeno disuelto promedio de 7 mg/l. El clima es extremoso con lluvias en verano (Csb, verano suave), actualmente el caudal de agua es de 27 l/seg. Presenta dos tipos de clima: templado, con verano fresco, temperatura media anual entre 12 y 18° C; semifrío, con verano fresco, temperatura media anual entre 5 y 18° C; y el semifrío con verano fresco, temperatura media anual entre 5 y 18° C, en invierno temperatura media menor de 10° C (Vargas, 1997). La figura 3 muestra la localización del Parque La Marquesa. La figura 4 señala un croquis del centro de producción de trucha arcoiris (El Zarco). 18 Figura 3. Localización del centro acuícola El Zarco en la Marquesa. Mapa del Estado de México 2006 SCT. Escala 1:250 000 INEGI. México D.F. N 15°15° 99° 22’ 19°17’ 5.2 Infraestructura 5.2.1 Sala de fotoperiodo El área que se ubica debajo de la sala de incubación, cuenta con una superficie de 83.7 m2. Está subdividida por medio de lonas plásticas de color blanco en seis compartimientos (Fig. 6). Dentro de cada compartimiento se cuenta con un tanque circular de plástico, de la marca Rotoplas, de 2 m de diámetro, 70 cm de altura y 2 m3 de capacidad. Los 6 tanques circulares cuentan con entrada y salida de agua independientes. La fuente de abastecimiento de agua son dos manantiales ubicados dentro del mismo centro, a los cuales se les conoce como estanque “13” y manantial “Cuadrado”, estos se encuentran en un punto más alto que la sala de fotoperiodo, los parámetros de calidad del agua se presentan en el siguiente cuadro. Cuadro 6 Principales parámetros de calidad del agua de las fuentes de abastecimiento. Comunicación personal con el Jefe del Centro (2007). Fuente de abastecimiento Alcalinidad mg/l de CaCO3 Nitrito mg/l de NO2—N Dureza de calcio mg/l de CaCO3 Nitrato mg/l de NO3—N N- Amoniacal mg/l de NH3-N Oxígeno disuelto mg/l Temperatura °C Estanque “13” 13.9 0.005 8.6 1.1 0 7.6-8.0 9-13 Man. Cuad. 13.3 0.004 8.6 1.2 0 7.6-8.0 9-13 Cada tanque tiene un aforo promedio de 25 l/min aproximadamente con un recambio estimado en 1 hora y 20 minutos. El agua es conducida por gravedad, de los manantiales a la sala de fotoperiodo por medio de tubería subterránea de PVC de 4 pulgadas de diámetro y distribuida al interior de la sala por medio de tubería de PVC de 2 pulgadas de diámetro. El suministro de agua es por medio de un tubo de PVC de 1 pulgada, el cual tiene cuatro orificios por donde sale el agua a presión, lo que produce una corriente de agua que promueve la autolimpieza así como mayor oxigenación causado por el burbujeo. Cada tanque también cuenta con dos piedras de aireación conectadas a una tubería de PVC y a una bomba de aire, lo cual produce una mayor oxigenación del agua en la tina. La energía eléctrica utilizada en la sala de fotoperiodo es suministrada por 3 paneles solares marca Shell Solar de 80 watts cada uno. La energía se almacena en 10 baterías marca CA-LE, para posteriormente ser utilizada en las lámparas de fotoperiodo. Cada unidad experimental (U.E.) está iluminada por un foco de luz blanca de 38W, suspendido en el centro del tanque a una altura de 141 cm de la superficie del agua. La intensidad luminosa se midió con un Easy View Digital Light Meter modelo EA30 de la marca 19 2 m 70 cm Extech Instrument que cuenta con una precisión de Lux ±(4% lect + 0.5% FS) sí > 10.000 Lux, y un alcance de 40 a 400 000 Lux. Los focos están controlados por relojes electrónicos independientes de la marca Xantrex con temporizador para su encendido y apagado automático. Al aire libre se encuentran 6 estanques circulares de cemento de 3 metros de diámetro y 5.1 m3 de capacidad. De estos 6 estanques se utilizaron 3 para mantener a los tres lotes de referencia con fotoperiodo natural. 5.3 Lote experimental Se contó con una población de 117 reproductores de trucha arco iris Oncorhynchus mykiss, 83 hembras y 34 machos, con edadesentre 2 y 4 años. A cada organismo se le colocó un chip marca AVID en la base de la aleta dorsal, con el fin de la identificación y seguimiento individual de los organismos y productos. Cada animal se desovó en las instalaciones del Centro Acuícola el Zarco antes de estar bajo la influencia del fotoperiodo. 5.4 Tratamientos experimentales Se obtuvo el registro del peso de los organismos antes y después de desovar, tomando en cuenta el peso post-desove se seleccionaron y dividieron a los organismos en tres bloques de acuerdo a su peso; bloque 1-chicos, bloque 2-medianos, bloque 3-grandes, se dividieron de esta forma para minimizar la competencia por el alimento entre los organismos más grandes con los chicos. En el cuadro 7 se muestran los intervalos de peso por sexo en los que se encontraron los peces para pertenecer al bloque correspondiente. Cuadro 7. Intervalos por peso para hembras y machos Hembras Machos Bloque Peso Mínimo (Kg) Peso Máximo (Kg) Bloque Peso Mínimo (Kg) Peso Máximo (Kg) 1 1.18 2.16 1 0.96 1.63 2 2.16 2.87 2 1.65 2.01 3 2.88 4.02 3 2.15 3.4 Con la identificación individual (Chip) y el registro del peso post-desove se procedió a seleccionar y dividir a todos los organismos. Los organismos ya seleccionados se colocaron en las tinas de la sala de fotoperiodo y estanques exteriores correspondientes (Fig. 5), el 12 de Enero del 2007 y el 20 de Enero del mismo año se comenzó con los tratamientos de fotoperiodo. 20 Tratamiento 1. Fotoperiodo de 18 horas de luz y 6 horas de oscuridad 18L:6O (día largo) por dos meses, desde el 20 de Enero de 2007, seguido de cambio abrupto el 20 de Marzo de 2007 a un fotoperiodo de días cortos de 6 horas de luz y 18 horas de oscuridad (6L:18O) hasta el desove. Bajo este tratamiento estuvieron sometidos 39 reproductores de trucha (28 hembras y 11 machos) divididos en las siguientes tinas ubicadas dentro de la sala de fotoperiodo: Tina 2: Con 8 hembras y 4 machos con pesos correspondientes al bloque 1. Tina 4: Con 9 hembras y 3 machos con pesos correspondientes al bloque 2. Tina 7: Con 11 hembras y 4 machos con pesos correspondientes al bloque 3. Tratamiento 2. Fotoperiodo de (18L: 6O) (días largos) por 5 meses, desde el 20 de Enero de 2007, seguido de un cambio abrupto el 21 de Junio de 2007 a un fotoperiodo de días cortos de (6L:18O) hasta el desove. Bajo este tratamiento estuvieron sometidos 39 reproductores de trucha (27 hembras y 12 machos) divididos en las siguientes tinas ubicadas dentro de la sala de fotoperiodo: Tina 1: Con 8 hembras y 5 machos con pesos correspondientes al bloque 1. Tina 5: Con 9 hembras y 3 machos con pesos correspondientes al bloque 2. Tina 8: Con 10 hembras y 4 machos con pesos correspondientes al bloque 3. Tratamiento 3. Fotoperiodo natural en el cual los organismos utilizados tienen un periodo natural de desove entre Septiembre y finales de Diciembre, algunos organismos tardíos en Enero. Bajo este tratamiento estuvieron sometidos 38 reproductores de trucha (27 hembras y 11 machos) divididos en 3 estanques de concreto: Estanque 3e: Con 7 hembras y 4 machos con pesos correspondientes al bloque 1. Estanque 6e: Con 9 hembras y 3 machos con pesos correspondientes al bloque 2. Estanque 9e: Con 11 hembras y 4 machos con pesos correspondientes al bloque 3. 21 1 2 4 5 8 7 8♀:5♂ 8♀:4♂ 9♀:3♂ 9♀:3♂ 11♀:4♂ 10♀:4♂ 3e 9e 6e 7♀:4♂ 9♀:3♂ 11♀:4♂ Figura 5. Ubicación de las tinas en la Sala de Fotoperiodo y testigos 5.5 Manejo de los organismos 5.5.1 Alimentación y limpieza de las tinas Se alimentaron con 2 raciones diarias a razón de 0.5% del peso total con alimento para trucha REP ¼ (45% proteína-10% lípidos) pigmentado marca Silver Cup, el alimento se guardaba en el almacén del Centro. Las raciones de alimento se pesaban diario con una balanza electrónica marca Excell modelo 986 con una capacidad de 1000 g y se colocaron en bolsas Ziploc para repartir el alimento. La circulación de agua dentro de la tina y su forma inclinada en el fondo promueve la autolimpieza de la tina, por esta razón solo una vez a la semana o cada quince días, se procedía a limpiar con el fin de no molestar tanto a los animales. Dependiendo de lo sucio de la tina, se limpió con 10 ml de formol en 15 l de agua, esto con ayuda de una escoba y esponja se tallaron las paredes y el fondo de las tinas. 5.5.2 Monitoreo Todas las observaciones y datos obtenidos de los monitoreos de temperatura, flujo, alimento consumido, mortalidad se anotaron diario en una bitácora y posteriormente se pasaron a una hoja de cálculo. 5.5.3 Salud de los organismos y prevención de enfermedades Durante el transcurso del proyecto se verificó visualmente la salud de los animales, registrando cualquier comportamiento anormal (si dejaban de nadar, se quedaban en el fondo, o no consumían alimento, si presentaban hongos en alguna parte del cuerpo). Cuando fue necesario y de acuerdo a la sintomatología se evaluaba la aplicación del tratamiento correspondiente. Se aplicó un tratamiento preventivo con 125 ml de formaldehído y 0.1 mg/L de oxalato de verde de malaquita disuelto en agua, estos son usados en peces y camarones para el control de enfermedades causadas por hongos, protozoarios y crustáceos parásitos (Harper, 2006). Si los animales se llegaban a contaminar por hongos, estos se colocaban en una tina con 49 litros de agua, la cual tiene un tamaño adecuado para la talla de los reproductores, y 70 mg de anestésico Finquel MS-222 (contiene metasulfato de tricaina) fabricado por Laboratorios Argent, aprobado para inmovilización de animales de sangre fría (poikilotérmicos) incluyendo peces y anfibios (Harper, 2006). Con un cronómetro se toma el tiempo que el animal tarda en inmovilizarse. Ya anestesiado se talla la parte afectada por el hongo con un cepillo de dientes de cerdas suaves (para bebé) con yodo al 10%. Posteriormente se regresa a la tina o estanque y se toma el tiempo de recuperación. 22 5.6 Medición de flujo de agua Diariamente se midió el flujo del agua por las mañanas de las 6 unidades experimentales de la sala de fotoperiodo, para saber si el abastecimiento de agua estaba disminuyendo o permanecía normal o si había una obstrucción en la tubería que disminuyera el flujo, durante el transcurso del día se inspeccionaba visualmente el flujo. No se midió el flujo de los estanques de referencia porque estos no tenían problemas de abastecimiento de agua y la tubería era muy difícil que llegará a taparse. Para medir flujo se colocaba una tina en el chorro del agua por 10 segundos (medidos con cronómetro), pasado el tiempo se retiraba y con una probeta de 1 litro de capacidad se midió la cantidad de agua, este valor se multiplicó por 6 para sacar los litros por minuto. Estos valores se anotaban en la bitácora. 5.7 Determinación de parámetros fisicoquímicos Cada mes se evaluó la concentración de oxígeno disuelto disponible en las unidades experimentales de la sala de fotoperiodo, manantiales de abasteciendo de fotoperiodo y estanques de referencia, esto se realizó por medio de un oxímetro YSI modelo 51B previamente calibrado para una altitud de 3000 m. Este equipo también registra la temperatura del agua. Ambos valores, temperatura y oxígeno, se anotaron en la bitácora y base de datos. Una vez al mes se evaluaron con un espectrofotómetro portátil modelo DR/2400 marca Hach los parámetros que se muestran en el cuadro 8. Se evaluaron estos parámetros una vez por mes porque el agua disponible era de manantial con una excelente calidad y no presentaba contaminación, también las tinas no sobrepasaron su capacidad de carga así se evitó que se produjeran productos de desecho en exceso que bajaran la calidaddel agua utilizada. Cuadro 8. Parámetros que se midieron en el agua Parámetro Método Periodicidad Oxígeno disuelto Método del intervalo ultra alto, método 8333, intervalo (1.0 a 40.0 mg/L O2), precisión 36 mg/L O2. Mensual Nitritos Método de disociación, método 8507, intervalo (0.002 a 0.300 mg/L NO2- -N), precisión 0.150 mg/L NO2- -N. Mensual Nitratos Método de la reducción del cadmio, método 8039, intervalo Mensual 23 (0.3 a 30.0 mg/L NO3- -N), precisión 10 mg/L NO3- -N. Nitrógeno amoniacal Método Nessler, método 8038, intervalo (0.02 a 2.5 mg/L NH3- N), precisión 1.00 mg/L NH3-N. Mensual Dureza de calcio Usando EDTA, método 8204, intervalo (10 a 4000 mg/L de CaCO3). Mensual Alcalinidad Método total y fenoftaleína, método 8203, intervalo (10 a 4000 mg/L de CaCO3). Mensual Nota: Los métodos mencionados son del manual del espectrofotómetro portátil modelo DR/2400 Hach. 5.8 Monitoreo de madurez A finales de mayo se inició un monitoreo de maduración, en conjunto con los piscicultores, ya que estos tienen años de experiencia en detectar el punto de maduración de los reproductores, mediante el tacto. Primero se rodeaban los reproductores con una red dejándoles muy poco espacio para moverse, posteriormente se arrastraba lentamente la red, con los reproductores dentro, hacia el flujo de agua para minimizar el estrés. Ya con los reproductores atrapados en la red se tomaba una hembra o macho por el pedúnculo caudal y las aletas pectorales, el siguiente método que se describirá es utilizado para ver maduración de los reproductores y para los desoves de estos. Primero se toma con las dos manos al reproductor y se deja que se canse con sus movimientos; con el animal tranquilo, se le dobla ligeramente hacia un lado el pedúnculo caudal y se aplica una ligera presión al abdomen con el pulgar y el índice, comenzando por las aletas pectorales hacia la aleta anal, de esta forma los óvulos fluyen de manera natural, el mismo procedimiento se aplicó a los machos. Si los animales presentaban óvulos o esperma, se anotaba el número de chip y el estanque de procedencia y se separaba a un estanque vacío. Si había más de dos hembras y un macho maduro se procedía a desovar a los organismos al siguiente día. El monitoreo se realizó cada 15 días o cada semana dependiendo del estado de maduración de los organismos, se trató de no hacerse muy seguido para no estresar en exceso a los animales. 5.9 Desove de los organismos El desove manual se realizó de la siguiente forma; los animales seleccionados para ser desovados se 24 transportaron a las piletas de la sala de desove. Posteriormente se colocaron con ayuda de una red de mano en una tina con agua (suficientemente grande para el organismo) con 2 mg de anestésico MS222 (Tricaína metasulfato), que es un compuesto químico de acción tranquilizante. Se tomó el tiempo de efecto del anestésico, ya inmovilizado se anotó el número de chip. Ya anestesiado el animal se saca del agua y se colocó sobre una báscula electrónica marca Avery Berkel con capacidad mínima de 0.2 kg y máxima de 60 kg para registrar el peso del animal antes del desove, inmediatamente se coloca sobre una base de hule espuma sobre la mesa de desove, se tomó al organismo por el pedúnculo caudal y las aletas pectorales, se dobla ligeramente hacia un lado el pedúnculo caudal y se aplica presión al abdomen con el pulgar y el índice, comenzando por las aletas pectorales hacia las aletas anales, de esta forma los óvulos fluirán de manera natural. Los óvulos se recibieron en una coladera para separarlos del líquido celómico y de esta manera obtener el peso por separado. Debajo de la coladera se colocó una charola de plástico seca previamente pesada, para registrar el peso del óvulo y el líquido celómico se coloca con balanza electrónica marca Excell modelo 986 con una capacidad de 1000g exactitud=0.5 g. El procedimiento se efectuó en seco, con el objeto de evitar la activación de los gametos al tomar contacto con el agua. Cuando se obtuvo el peso del líquido y los óvulos estos se juntaron nuevamente. Se vuelve a pesar al organismo ya desovado. Este se transportó a un estanque vacío y se cuidó hasta que se recuperó del efecto del anestésico, normalmente entre 2 y 5 minutos. Se separó una muestra de 25 ml de óvulo en una probeta de 50 ml y se afora a 50 ml con agua, se ve si el agua se enturbia o no, si los óvulos enturbian el agua el óvulo está pasado y se observan sus características. Otra muestra sin agua se coloca en una charola de plástico con peso determinado y se pesa, se cuenta el número de óvulos en 25 ml. Posteriormente se hace el cálculo para saber aproximadamente el número de óvulos que tuvo la hembra en el desove. Se ordeña un macho con la misma técnica, el esperma se recibe en un tubo cónico para centrífuga de 50 ml con peso conocido y se mide el volumen de esperma y su peso. Se coloca en una gradilla dentro de agua a 4 °C, esto porque la vitalidad de los espermatozoides es afectada por la temperatura, viven más tiempo cuando las temperaturas son bajas que cuando son elevadas y, tal como sucede con los espermatozoides humanos, pueden ser conservados bajo refrigeración para ser empleados más tarde en la inseminación artificial; en consecuencia, es posible conservar el esperma de los peces para su utilización posterior (Lagler et al., 1984). Una vez obtenidos los dos productos sexuales se mezclan cuidadosamente con una pluma de ave y la charola con huevo se cubre con papel aluminio y se transporta a la sala de incubación para su manejo. El manejo de óvulo previamente fertilizado fue el que se realiza en el Centro, consiste en el lavado del huevo con agua corriente hasta que no presente impurezas y esperma. Se hidrata por un periodo 25 aproximado de 20 minutos con el propósito de manejarlo adecuadamente. Posteriormente se colocaron en las charolas de incubación por hembra. 5.10 Calidad de óvulo Para valorar calidad de óvulo se analizaron los siguientes parámetros; volumen total de óvulo, fecundidad relativa y total, diámetro de óvulo y huevo. 5.10.1 Fecundidad total y relativa Fecundidad Métodos de estimación de la fecundidad. Métodos para calcular el número de óvulos. Conteo total. La estimación más adecuada de la fecundidad es por medio del conteo total de los óvulos del pez. Como esto puede ser tedioso y requiere de mucho tiempo, algunas estimaciones de la fecundidad son realizadas sobre submuestras. Submuetreo de óvulos. A partir de este método, se distinguen tres tipos; a) Método volumétrico, b) Volumen de número de óvulos conocidos y c) Método gravimétrico (Cailliet et al., 1986; Bagenal, 1978). a) Volumétrico. Consiste en medir el volumen total del ovario, por el líquido que desplaza en una probeta. Del ovario se toman una serie de submuestras de volumen conocido en la que se cuentan el número de óvulos, elevándolas después al volumen total del ovario. Es también un método muy barato, pero muy impreciso. Al igual que el método anterior, no permite obtener información sobre los niveles de atresia ni presencia de folículos postovulatorios (Gallegos 2003). b) Gravimétrico. Consiste en pesar el ovario y contar el número de óvulos en una serie de submuestras del ovario (generalmente tres), de peso conocido. El número medio de óvulos en las submuestras se eleva al peso total del ovario. Tiene la ventaja de ser muy preciso, barato y requiere muy poca tecnología. Tiene la desventaja de que ignora la incidencia de atresia o la presencia de folículos postovulatorios. El número de óvulos maduros que produce un reproductor es denominado fecundidad. La fecundidad puede ser expresada en términos del número de óvulosproducidos por hembra denominado fecundidad total o absoluta, también puede ser expresada por unidad corporal del pez post-desove, el cual es conocido como fecundidad relativa (Gallegos, 2003; Ramos et al., 2002). Fecundidad total (óvulos/hembra). Se realizó de la siguiente forma: se tomaron 4 muestras individuales de 100 huevos ya fertilizados y secos, cada muestra se colocó en una probeta de 50 ml con un volumen 26 de agua establecido y se anotó el volumen de líquido desplazado en la probeta. Posteriormente todo el huevo de la hembra se escurrió y secó en un colador, ya seca la muestra, se pasó a una probeta de 1 l con un volumen de agua conocido y se anotó el volumen de agua desplazado. Posteriormente se realiza la siguiente fórmula (Pankhurts et al., 1996; Gallegos, 2003; Brown et al., 2006). Fecundidad total: Vto*Nom Donde, Vto= Volumen total de óvulo (g) Vom Nom= Núm. de óvulos de muestra Vom= Volumen de óvulos de muestra (g) De esta forma se obtiene el número total de óvulos por hembra. Fecundidad relativa. Se determinó con el valor de fecundidad total en relación con el peso de las hembras post-desovadas (Pankhurts et al. 1996; Gallegos, 2003). Fecundidad relativa: FT Donde, FT= Fecundidad total P P= Peso del individuo post-desove (g) 5.10.2 Volumen total de óvulo por hembra El valor de volumen total de óvulos (l) se tomó de la medición de volumen al calcular fecundidad relativa (Ramos et al., 2002). 5.10. Diámetro de óvulo y huevo Para medir el diámetro de óvulos y huevo (mm), primero se tomó una muestra de 5 óvulos y 5 huevos hidratados de cada hembra desovada. Estas muestras se colocaron en recipientes con formol al 70% para fijarlos. Estas muestras se analizaron con ayuda de un microscopio Olympus modelo SZ61 y el programa Image-Pro Plus Media Cybernetics (Versión 6.2), con los cuales se midió el diámetro (Gallegos, 2003; Brown et al. 2006). 5.11 Calidad de esperma Los parámetros utilizados para medir la calidad de esperma fueron volumen y peso de esperma obtenidos en la ordeña, densidad, pH y concentración de espermatozoides por ml. 5.11.1 Volumen y peso de esperma El volumen de esperma eyaculado se midió en un cilindro para centrífuga graduado de 50 ml (con peso conocido) (Ramos et al., 2002 y Bastardo et al., 2004). Para determinar el peso del esperma se utilizó balanza electrónica marca Excell modelo 986 con una capacidad de 1000g. 27 5.11.2 Densidad de esperma (Kg/cm3) Se obtuvo dividiendo el valor del peso del esperma entre los ml obtenidos. Una vez que se ordeñó al macho el semen se colocó en un tubo cónico para centrífuga de 50 ml con peso conocido y se midió el volumen de esperma así como su peso, posteriormente se evaluó la densidad por medio de la fórmula: D = _W_ V Donde: D = Densidad W = Peso del semen (g) V = Volumen del semen en (ml) 5.11.3 pH del esperma El pH se determinó al momento de la extracción utilizando papel para pH graduado en unidades (1 a 14) (Bastardo et al., 2004). 5.11.4 Número de espermatozoides/ml Enseguida de haber ordeñado al macho se tomó una muestra de 1 ml de esperma por medio de una micropipeta digital marca BRAND*704176 de 10 ml y se colocó en un tubo para centrífuga de 15 ml, posteriormente se colocó en una hielera con agua a una temperatura de 4ºC la cuál se tomó con un termómetro digital de láser marca Fluke 62 Mini. Posteriormente se tomaron por separado tres submuestras de 50 µl de semen y se colocaron dentro de un tubo para centrífuga de 15ml con una solución con 950 µl de suero fisiológico y 500 µl de formol al 4%; después se colocaron las muestras en la hielera a 4ºC. Al siguiente día se realizó el conteo de espermatozoides por medio de un microscopio óptico marca Olympus CX31, se colocaron 950 µl (microlitros) de suero fisiológico en un vial; se le agregaron 10 µl de la muestra, con ayuda de una micropipeta digital Marca Nichyo NPX10 de 0.5 a 10µl y se mezclaron con un Vortex; durante 20 segundos. Para el conteo de espermatozoides se tomaron de 50 a 100 µl de la dilución, cuidado de que no faltara muestra para las 3 repeticiones y se colocaron por capilaridad en una cámara de Neubauer Marca Brand de 0.100 mm de profundidad x 0.0025 mm²; se dejó reposar por 15 minutos para que las células se precipitaran. En el microscopio, se enfocó la cámara de Neubauer con el objetivo de 10x en la cuadrícula central, la cuadrícula que contiene 25 subcuadrículas; se pasó al objetivo 40x se seleccionó al azar 5 subcuadrículas y se contaron los espermatozoides contenidos en cada una de estás, si el número obtenido de los cinco subcuadrículas era 28 similar se procedió a sacar el promedio.Utilizando la fórmula: No. de espermatozoides x 5 x 104 x 102 = No. de espermas/ml Se realizaron 3 repeticiones de cada macho. 5.12 Análisis Estadístico A todos los parámetros de calidad de huevo y esperma se les aplicó un análisis exploratorio de datos (Salgado-Ugarte, 1992). Para comparar los valores medios se utilizó el análisis de varianza de una vía con un nivel de significancia de 5% (Scout et al. 1984) y para comprobar el supuesto de igualdad de varianzas se utilizó una prueba de Bartlett y diagramas de violín para comprobación en forma gráfica (Hintze y Nelson, 1998). En los casos donde existían casos extraordinarios y se violaba la prueba de Bartlett, se analizaron con una prueba de Levene con nivel de significancia de 5%. Los datos que no cumplieron con los supuestos de homoscedasticidad, se analizaron con el método no- paramétrico de Kruskal-Wallis con nivel de significancia del 5%. Se usó el software estadístico Intercooled Stata 9.1 para Windows (StataCorp, 2005). 29 6. RESULTADOS 6.1 Lux El promedio de intensidad luminosa de los diferentes puntos de muestreo de la superficie del agua en cada tina se muestra en el Cuadro 9. Los puntos de muestreo en la tina se señalan en la figura 6. Cuadro 9. Valores puntuales y promedio de lux al espejo de agua de cada tina de la sala de fotoperiodo durante todo el experimento. Lux Posición en la tina Tina 1 Tina 2 Tina 3 Tina 4 Tina 5 Tina 6 Centro 154 172 137 151 148 145 1 127 122 105 136 126 105 2 138 149 130 142 117 94 3 129 139 126 114 126 115 4 104 131 120 119 128 131 5 125 157 129 146 143 143 6 151 167 142 167 141 117 7 156 161 150 147 138 128 8 137 159 133 130 147 148 Promedio 152.5 169.6 146.5 156.5 151.7 141 6.2 Calidad de Agua A continuación se muestra en el cuadro 10 los valores promedio de los parámetros fisicoquímicos del agua durante el transcurso del experimento, de las tinas de fotoperiodo y estanques circulares, donde permanecieron los organismos de los tres tratamientos de fotoperiodo. 30 Figura 6. Puntos de muestreo de luz en las tinas de fotoperiodo. Centro 3 2 1 8 7 5 4 6 Cuadro 10. Valores promedio de los parámetros fisicoquímicos del agua en cada estanque exterior de concreto y tina de fotoperiodo, durante el experimento. Valores promedio Tinas y estanqu es Nitrit osmg/ L NO2- -N Nitrat osmg/ L NO3- -N Nitrógen o amoniac al mg/L NH3-N Dureza de calcio mg/L de CaCO3 Alcalinidad mg/L de CaCO3 Oxígeno disuelto pH TºC Tina 1 0.01 0.94 0.125 10 31 7-8 6 9-11 Tina 2 0.01 0.66 0.13 9 26 7-8 6 9-11 Tina 3 0.01 0.88 0.12 7 30 7-8 6 9-11 Tina 4 0.01 0.83 0.14 9 28 7-8 6 9-11 Tina 5 0.01 0.85 0.141 8 29 7-8 6 9-11 Tina 6 0.01 0.89 0.14 9 28 7-8 6 9-11 Est. Cir. 1 0.01 0.93 0.214 15 28 5-6 5 7-16 Est. Cir. 2 0.01 1 0.18 12 29 5-6 5 7-16 Est. Cir. 3 0.01 0.980.23 13 28 5-6 5 7-16 6.3 Número y porcentaje de éxito de desoves y ordeñas Se realizaron en total 59 desoves y se ordeñaron 20 machos. El número de desoves y ordeñas y porcentaje de éxito de cada tratamiento se muestran en el cuadro 11. Cuadro 11. Número de desoves, ordeñas, porcentaje de éxito y organismos muertos antes de desove u ordeña de cada tratamiento. Hembras Machos # total de org. # org. muertos # de desoves % de éxito # total de org. # org. muertos # de ordeñas % de éxito Trat. 1 28 4 24 85.71 11 3 8 72.2 Trat. 2 27 8 19 70.3 12 5 7 58.3 Trat. 3 27 11 16 59.25 11 6 5 45.5 6.4 Tiempo de desoves y ordeñas Los resultados de esta investigación mostraron que los reproductores de todos los bloques expuestos al tratamiento 1, donde el fotoperiodo fue reducido de 18L: 6O a 6L: 18O el 20 de Marzo iniciaron los desoves el 27 de Junio de 2007 y se extendieron hasta Agosto, solo un organismo desovó el 9 de Septiembre. El mismo efecto se observó en los machos. Los organismos de todos los bloques bajo el tratamiento 2, donde el fotoperiodo fue reducido de 18L: 31 6O a 6L: 18O el 20 de Junio empezaron a desovar el 14 de Agosto de 2007, los desoves posteriores se prolongaron el resto de Agosto y Septiembre, se presentó un caso de una hembra que desovó el 9 de Enero de 2008. Las ordeñas de los machos comenzaron también el 14 de Agosto pero se prolongaron hasta Noviembre y un macho aún produjo semen el 9 de Enero de 2008. Todos los organismos testigo de todos los bloques (tratamiento 3) como se esperaba comenzaron sus desoves el 25 de Septiembre y continuaron en Octubre, Noviembre y una hembra desovó el 9 de Enero de 2008, esta es su temporada normal de desove. Los machos testigo también tuvieron una época de producción de semen similar. Los organismos del tratamiento 1 tuvieron un avance en los desoves de 48 días y 90 días con respecto a los organismos del tratamiento 2 y 3 respectivamente. Los diagramas de violín (Figura 7) muestran la distribución del número de días que tardaron en desovar. En el tratamiento1 los valores estuvieron entre 178 y 254 días, la media fue 191 días. En el tratamiento 2 los valores se registraron entre 226 y 374 días, la media fue de 259 días, y en el tratamiento 3 los valores estuvieron entre 268 y 374 y la media tuvo un valor de 297. Existen tres casos extraordinarios, estos son tres hembras (una de cada tratamiento) que tardaron un mayor número de días (comparadas con las hembras de su tratamiento) para tener óvulo maduro listo para desovar. dias -.059 .059 100 200 300 400 trat: 1 -.070922 .070922 100 200 300 400 trat: 2 -.047781 .047781 100 200 300 400 trat: 3 Figura 7. Distribuciónes del número de días que tardaron en desovar desde el inicio del experimento. Las flechas muestran los casos extraordinarios. En el cuadro 12 se muestran los resultados del análisis de varianza entre tratamientos para los días transcurridos desde el comienzo del experimento hasta los desoves. Como la prueba de Bartlett se violó por la existencia de casos extraordinarios (P < 0.001) se aplicó una prueba robusta (Levene) la cual no 32 es afectada por casos extraordinarios, esta resultó (W50 = 4.93, P = 0.43422653). Con lo cual aplicamos el ANDEVA que señaló diferencia significativa en el avance de los desoves entre los tres tratamientos. Cuadro 12. Resultados del análisis de varianza para número de días trascurridos hasta desoves. Prueba de Bartlett para varianzas iguales: chi2= 7.3652 Prob>chi2_ 0.025 Fuente de variación Suma de cuadrados Grados de libertad Cuadrados Medios Valor calculado de F Valor de P Entre grupos 111520.108 2 55760 90.98 0.0000 Sin grupos 34933.8252 57 612.874126 Total 146453.933 59 2482.27006 Los diagramas de violín (Figura 8) muestran la distribución del número de días que tardaron los machos en producir semen. El número de días en el tratamiento 1 estuvieron en el intervalo de 178 y 219 y la media fue de 195 días. Para el tratamiento 2 el número de días fue entre 226 y 374, la media fue de 270 días. En el tratamiento 3 el intervalo de número de días fue entre 268 y 324 y la media fue de 295 días. Se puede observar un caso extraordinario en el tratamiento 2, este fue un macho que maduró y se le extrajo semen el 9 de enero de 2008. dias -.030545 .030545 100 200 300 400 trat: 1 -.052475 .052475 100 200 300 400 trat: 2 -.03054 .03054 100 200 300 400 trat: 3 Figura 8. Distribución del número de días que tardaron en madurar los machos desde el inicio del experimento hasta extraerles el semen. En el cuadro 13 se muestran los resultados del análisis de varianza entre tratamientos para los días transcurridos desde el comienzo del experimento hasta la maduración de los machos. Como la prueba 33 Caso extraordinario de Bartlett fue violada por la existencia de un caso extraordinario (Nivel de significancia 0.0000) se utilizó una prueba robusta (Levene) resultando W50 = 1.9740674, P = .15775217, con lo cual se utilizó un ANDEVA que indicó diferencia significativa en el avance de la maduración entre los tres tratamientos. Cuadro 13. Resultado del análisis de varianza de los días transcurridos hasta la maduración de los machos. Prueba deBartlett para varianzas iguales: chi2= 14.1131 Prob>chi2_ 0.001 Fuente de variación Suma de cuadrados Grados de libertad Cuadrados medios Valor calculado de F Valor de P Entre grupos 57561.7409 2 28780.8704 41.35 0.0000 Sin grupos 19491.0333 28 696.108333 Total 77052.7742 30 2568.42581 6.5 Calidad de óvulo 6.5.1 Fecundidad total El total de óvulos producidos por las hembras del tratamiento 1 fueron 118,522, las hembras del tratamiento 2 produjeron 90,709 óvulos y 103,373 óvulos las hembras del tratamiento 3. El cuadro 14 muestra los valores mínimos, máximos y mediana de fecundidad total de los tres tratamientos. La Figura 9 muestra la distribución de los valores de fecundidad total en los tres tratamientos. El cuadro 15 muestra el resultado del análisis de varianza donde se puede observar que no existe diferencia significativa entre los valores de fecundidad total de los tres tratamientos. Cuadro 14. Valores máximos, mínimos y media de Fecundidad total de los tratamientos No. de hembras Fecundidad total menor Fecundidad total mayor Media Número de óvulos Tratamiento 1 24 1433 9543 5153 Tratamiento 2 18 1500 7333 5039 Tratamiento 3 17 1667 13011 6080 34 Cuadro 15. Resultado del análisis de varianza de los valores de fecundidad total. Prueba deBartlett para varianzas iguales: chi2= 4.1716 Prob>chi2_ 0.124 Fuente de variación Suma de cuadrados Grados de libertad Cuadrados medios Valor calculado de F Valor de P Entre grupos 11616863.3 2 5808431.66 1.07 0.3501 Sin grupos 298586256 55 5428841.02 Total 310203120 57 5442159.99 fecuntot -.030504 .030504 0 5000 10000 15000 trat: 1 -.031101 .031101 0 5000 10000 15000 trat: 2 -.058213 .058213 0 5000 10000 15000 trat: 3 Figura 9. Distribución de los valores de fecundidad total en los tres tratamientos 6.5.2 Fecundidad relativa Para sacar el valor de la fecundidad relativa se dividió la fecundidad total entre el peso individual de las hembras. El valor de fecundidad relativa para el tratamiento 1 fue 30,689 óvulos/kg de hembra, para el tratamiento 2 fueron 20,848 óvulos/kg de hembra y para el tratamiento 3 fue 22,114 óvulos/kg de hembra. El cuadro 16 muestra los valores mínimos, máximos y media de fecundidad relativa en los tres tratamientos. Cuadro 16. Valores mínimos, máximos y media de fecundidad relativa de los tratamientos Fecundidad relativa menor Fecundidad relativa mayor Media Número de óvulos Tratamiento 1 541
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