Efecto-in-vitro-del-EGF-IGF-y-FGF-en-la-proliferacion-y-produccion-de-matriz-extracelular-sobre-condrocitos-obtenidos-de-cartilago-hialino-y-elastico-de-conejo

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UNIVERSIDAD NACIONAL 
AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 
 FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES 
 “ZARAGOZA” 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“EFECTO IN VITRO DEL EGF, IGF Y FGF EN LA 
PROLIFERACIÓN Y PRODUCCIÓN DE MATRIZ 
EXTRACELULAR SOBRE CONDROCITOS 
OBTENIDOS DE CARTÍLAGO HIALINO Y 
ELÁSTICO DE CONEJO”. 
 
DIRECTORES: DRA. ATLÁNTIDA M. RAYA RIVERA 
M. EN C. ALBERTO PARRA BARRERA 
ASESOR: Q.F.B. ENRIQUE ESCALERA ZUÑIGA 
 
 
 
 
PARA OBTENER EL TITULO DE: 
QUIMICO FARMACEUTICO BIOLOGO 
P R E S E N T A: 
LEONARDO FERMIN ACEVEDO OLVERA 
 
 
MEXICO, D. F . 2008 
T E S I S 
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UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
EL PRESENTE TRABAJO SE REALIZO EN EL LABORATORIO DE INGENIERIA 
DE TEJIDOS DEL HOSPITAL INFANTIL DE MÉXICO “FEDERICO GOMEZ”. 
BAJO LA DIRECCIÓN DE LA DRA. ATLANTIDA MARGARITA RAYA RIVERA Y 
EL M. EN C. ALBERTO PARRA BARRERA Y COMO ASESOR INTERNO. Q.F.B. 
ENRIQUE ESCALERA ZUÑIGA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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AGRADECIMIENTOS 
 
A DIOS, por permitirme llegar hasta este momento tan importante de mi vida y lograr otra 
meta más en mi carrera. 
 
A MIS PADRES HILDA Y LEONARDO, a quienes agradezco de todo corazón, porque 
gracias a su cariño, guía y apoyo he llegado a realizar uno de los más grandes anhelos, 
terminar mis estudios profesionales y por lo cual les viviré eternamente agradecido. 
 
A MIS HERMANOS SELENE Y FABIÁN, por la compañía y el apoyo que me brindan. 
 
A LA MEMORIA DE MIS ABUELITAS, por los momentos felices que pase a su lado y 
que hoy son recuerdos. 
 
A LA FAMILIA GUTIÉRREZ IGLESIAS, porque han sido como una segunda familia 
para mi, en los cuales he encontrado apoyo y comprensión mil gracias. 
 
A ELY, CARI, BETO Y GIS, como un testimonio de gratitud y eterno reconocimiento, por 
el apoyo brindado y con el cual he logrado terminar mi carrera profesional. 
 
A ELY, como un pequeño testimonio por el gran apoyo y comprensión brindado durante 
los años más difíciles y más felices de mi vida, en los cuales he logrado terminar mi carrera 
profesional, la cual constituye un aliciente para continuar con mi superación. 
 
A MIS ASESORES, a quienes con su ayuda, apoyo y comprensión me alentaron a lograr la 
realización de esta tesis. 
 
A LA DRA. RAYA, por permitirme ser parte del grupo de trabajo, y adentrarme en los 
proyecto de investigación. 
 
A BETO, porque gracias a su amistad, apoyo, confianza y estímulos brindados he llegado a 
realizar una de mis metas. 
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A LOS MIEMBROS DEL JURADO: DR. EDELMIRO SANTIAGO OSORIO, DRA. 
ATLÁNTIDA M. RAYA RIVERA, Q.F.B. ENRIQUE ESCALERA ZUÑIGA, Q.F.B. 
CARINA GUTIÉRREZ IGLESIAS, M. EN C. JUANA ROSADO PÉREZ, por sus valiosas 
sugerencias, las cuales enriquecieron este trabajo. 
 
AL GRUPO DE DIVULGACIÓN DE LA CIENCIA: MAESTRA ANGELES Y 
ESTELITA, por los momentos agradables que pase con ustedes. 
 
A LOS AMIGOS DEL HIM: DR. ESQUILIANO, DRA. SÁNCHEZ, Q. EMA, RAÚL, 
MARCO, LEONEL, IVAN, MA. ELENA, JOSÉ, ALEJANDRA, FRANCISCO por todo el 
apoyo brindado durante la realización de esta tesis. 
 
A MIS MAESTROS, gracias a cada uno de los maestros que participaron en mi desarrollo 
profesional durante mi carrera, sin su ayuda y conocimientos no estaría en donde me 
encuentro ahora. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A TODOS ELLOS “GRACIAS” 
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INDICE 
 
1 Introducción………………………………………………………..................... 1 
2 Marco teórico……………………………………………………………………. 3 
 2.1 Cartílago……………………………………………………………................... 3 
 2.2 Formación del cartílago………………………………………………………... 4 
 2.3 Componentes de la matriz extracelular………………………………………. 5 
 2.3.1 Colágeno……………………………………………………………….. 5 
 2.3.2 Proteoglicanos……………………………………………................... 6 
 2.3.3 Glicoproteínas………………………………………………................ 8 
 2.4 Factores de crecimiento………………………………………………………... 8 
 2.4.1 Definición………………………………………………………………. 9 
 2.4.2 Mecanismo de acción………………………………………………… 10 
 2.4.3 Función en los condrocitos…………………………………………… 10 
 2.4.4 Familia del factor de crecimiento tipo insulina (IGF)…………….... 10 
 2.4.5 Factor inhibidor de la leucemia (LIF)……………………………….. 11 
 2.4.6 Factor de crecimiento derivado del endotelio vascular (VEGF)…. 11 
 2.4.7 Interleucinas (IL)………………………………………………………. 12 
 2.4.8 Factor de necrosis tumoral alfa (TNF- α)....................................... 12 
 2.4.9 Familia del factor de crecimiento fibroblástico (FGF)……………... 13 
 2.4.10 Factor de crecimiento epidérmico (EGF)…………………………… 13 
 2.5 Tipos de cartílago………………………………………………………………. 14 
 2.5.1 Cartílago hialino……………………………………………………….. 14 
 2.5.2 Cartílago elástico……………………………………………………… 14 
 2.5.3 Cartílago fibroso………………………………………………………. 15 
 2.6 Fisiopatología del cartílago y terapia celular………………………………… 16 
 2.7 Ingeniería de tejidos……………………………………………………………. 17 
 2.7.1 Principios básicos en la ingeniería de tejidos………………………. 18 
 2.7.2 Biomateriales………………………………………………………….. 19 
 2.7.3 Cultivo de condrocitos……………………………………….............. 21 
 2.7.4 Biorreactores…………………………………………………………… 22 
 2.8 Antecedentes……………………………………………………………………. 23 
3 Planteamiento del problema…………………………………………………… 25 
4 Objetivos…………………………………………………………………………. 27 
5 Hipótesis…………………………………………………………………………. 28 
6 Material y método……………………………………………………………….. 29 
7 Resultados………………………………………………………………………. 35 
8 Análisis de resultados………………………………………………………….. 51 
9 Conclusiones……………………………………………………………………. 57 
10 Glosario………………………………………………………………………….. 59 
11 Anexos…………………………………………………………………………… 60 
12 Bibliografía………………………………………………………………………. 75 
 
 
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 1 
1.- INTRODUCCION 
 
El transplante de órganos, es un procedimiento muy utilizado en la actualidad 
pero tiene los siguientes inconvenientes: 1) es un método costoso, 2) es 
deficiente por la falta de donadores, 3) se requieren medicamentos para evitar 
el rechazo inmune, y 4) la vida media de un órgano transplantado es de 8 años; 
por lo que muchos países, han invertido dinero en la búsqueda de nuevos 
métodos que sustituyan o mejoren los transplantes de órganos1, surgiendo así 
la Ingeniería de Tejidos, o bien, la hoy llama Medicina Regenerativa, con la cual 
se pueden fabricar diferentes tejidos autólogos que evitarían el rechazo del 
órgano transplantado. Desafortunadamente, la mayoría de estos tejidos son 
proyectos que solo se realizan a nivel experimental en animales. 
El Laboratorio de Ingeniería de Tejidos que pertenece al área de urología del 
Hospital Infantil de México “Federico Gómez”, es uno de los pocos laboratorios 
en donde actualmente se realizan investigaciones para la restauración de 
diferentes tejidos, tanto en niños como en niñas, como son el reemplazo de 
uretra y vagina respectivamente. Uno de los tejidos, en el que se ha enfocado 
esta investigación es la formación de “neo-cartílago”, ya que es un tejido que se 
podría utilizar para corregir los defectos físicos de oreja y/o nariz, e incluso para 
la fabricación de prótesis testiculares (proyectodel laboratorio ya puesto en 
marcha), con lo cual, se espera en un futuro no muy lejano, que se puedan 
reparar los tejidos de pacientes pediátricos de este hospital. 
Para llevar a cabo este procedimiento en la clínica, es necesario establecer y/o 
estandarizar ciertos parámetros o aspectos en el cultivo de condrocitos, con la 
finalidad de evitar su desdiferenciación a fibroblastos y así llegar a formar un 
tejido muy semejante al cartílago. 
En base a su estructura e histomorfológia, el cartílago está formado por 
condrocitos y una compleja matriz extracelular, sintetizada por ellos mismos, la 
cual esta en remodelación continua, y a su vez se encuentra regulada por 
factores anabólicos (factores de crecimiento) y catabólicos (interleucinas). 
Los factores de crecimiento mas importantes, que intervienen en la biología del 
cartílago son: Factor inhibidor de la Leucemia (LIF), Factor de crecimiento del 
Endotelio Vascular (VEGF), Factor de necrosis Tumoral alfa (TNF-α), Factor de 
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 2 
Crecimiento tipo Insulina-1 (IGF-1), el Factor de Crecimiento de los 
Fibroblastos básico (FGFb o FGF-2) y el Factor de Crecimiento Epidérmico 
(EGF). De los cuales, el EGF, IGF-I y FGFb, promueven la síntesis de matriz 
extracelular ya que tienen efectos anabólicos sobre esta. 
En la literatura existen reportes relacionados con el uso de factores de 
crecimiento para aumentar la proliferación de los condrocitos en cultivos en 
monocapa y en tercera dimensión. Sin embargo, se desconoce el porcentaje de 
condrocitos bioactivos se están utilizando. En el presente proyecto, se 
analizaron los cultivos in vitro, para conocer, cual es el porcentaje de 
condrocitos biológicamente activos están sintetizando matriz extracelular de 
forma individual, y al compararse con los controles correspondientes se podrá 
establecer, si es posible generar neo-cartílago estimulando su proliferación y 
síntesis de colágeno tipo II y proteoglicanos con factores de crecimiento (EGF, 
IGF y FGFb); lo cual tendría la ventaja de obtener un neo-tejido en un menor 
tiempo de cultivo in vitro, y con una menor probabilidad de alterar su 
maquinaria genética. 
Por otro lado, en este proyecto se pretende comparar las diferencias entre los 
dos cartílagos más propicios para la ingeniería de tejidos: el cartílago hialino, y 
el cartílago elástico; para conocer cual tejido y que factores de crecimiento, 
serian los mas adecuados para su uso en los proyectos del laboratorio de 
ingeniería de tejidos de este hospital. 
 
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 3 
Fig. 1 Formación de lagunas (ver 
flechas). 
2.- MARCO TEÓRICO O FUNDAMENTACIÓN. 
2.1 CARTILAGO 
El tejido cartilaginoso o cartílago (lat. cartílago; gr. chondros) es un tejido conectivo 
denso y especializado que forma el esqueleto transitorio en el embrión y persiste 
en el adulto en articulaciones, tracto respiratorio, costillas y orejas. 
En el ser humano adulto hay relativamente poco cartílago, pero en el feto y la 
infancia desempeña un papel muy importante, ya que forma la mayor parte del 
esqueleto. Es un componente que crece con gran rapidez, el cual Posee 
aproximadamente un 80% de agua, un 6% de sales minerales y un 14% de 
sustancias orgánicas. La flexibilidad y resistencia del cartílago a la compresión 
permiten que funcione como un absorbedor de choques y su superficie lisa, 
permite un movimiento de las articulaciones del cuerpo casi sin fricción. 
Tiene un origen embriológico mesodérmico, aunque a diferencia de otros tejidos 
conectivos, el cartílago no contiene vasos ni terminaciones nerviosas, por lo que, 
sus células se nutren con el material que se difunde desde de los capilares 
sanguíneos del tejido conjuntivo adyacente. Esta constituido por células, 
denominadas condrocitos, y por una matriz extracelular (MEC) flexible que 
contiene fibras elásticas y colágenas que 
aumentan la fuerza tensora y elástica del 
tejido y en la cuál los condrocitos se 
ubican en espacios llamados lagunas 
(Fig. 1). 
Salvo los cartílagos articulares, todos los 
demás están rodeados por una capa de 
tejido conectivo de colágeno denso, 
denominado membrana del cartílago o 
pericondrio. Éste ultimo esta formado por fibras elásticas, por colágena tipo I, y 
células fusiformes de aspecto semejante al de los fibroblastos; además se 
distingue una capa externa fibrosa y una capa interna celular en la cual se ubican 
las células que pueden dar origen a los condroblastos, los cuales son los 
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 4 
Fig. 2 Estructura del Condroblasto 
Fig. 3 Estructura del Condrocito 
precursores de los condrocitos y difieren de ellos solo en su edad y en su mayor 
síntesis de componentes de la matriz extracelular. 
La capa fibrosa, esta adyacente a los 
vasos sanguíneos del tejido conectivo 
circundante, con el cual se fusiona; y la 
capa interna, también llamada capa 
condrógena, la cual es más celular. 
Los condroblastos (Fig. 2) presentan un 
ergastoplasma y un aparato de Golgi muy 
desarrollados y presentan vesículas y 
granos de secreción, lo cuál guarda 
relación con su rol de sintetizar y secretar 
los distintos componentes de la matriz 
extracelular cartilaginosa que está formada 
principalmente por colágeno tipo II, 
proteoglicanos de condroitín y 
queratansulfato, ácido hialurónico (en 
forma de hialuronato) y glicoproteínas. 
Al disminuir su actividad de síntesis 
disminuye el desarrollo tanto del 
ergastoplasma como del aparato de Golgi, 
acumulan glicógeno y lípidos en su citoplasma y se les llama condrocitos. (Fig. 3) 
La zona que rodea las lagunas se llama matriz territorial (cápsulas cartilaginosas), 
y la matriz entre las lagunas se conoce como matriz interterritorial.2-4 
2.2 FORMACIÓN DEL CARTILAGO 
Una vez que las células mesenquimatosas se condensan y dan lugar a los centros 
de condrificación, se van diferenciando y secretan una matriz extracelular que las 
va rodeando. Al mismo tiempo, las fibras primitivas de colágena se van 
segregando, y van quedando embebidas en el interior de la matriz extracelular. 
Finalmente, las células adquieren sus características histológicas de condrocito y, 
quedan aisladas unas de otras en cavidades o lagunas, al aumentar el material 
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 5 
intersticial entre ellas. Una vez que ha aparecido el cartílago, éste sufre un doble 
proceso de crecimiento, el crecimiento intersticial y el aposicional. 
En el crecimiento intersticial, las células se dividen por mitosis y entre dos células 
hijas se forman tabiques intersticiales que separan a las dos células. Estas células 
formarán la nueva matriz y las nuevas fibras de colágena. 
Por otro lado, en el crecimiento aposicional, el mesénquima que va rodeando al 
contorno cartilaginoso inicial se condensa formando el pericondrio. 
Posteriormente, las células de la capa interna del pericondrio, se van 
transformando en condrocitos que secretarán la matriz y la colágena que formará 
el nuevo tejido cartilaginoso. 
Sin embargo, se ha demostrado que los condrocitos que descienden de una 
misma célula por el proceso de mitosis del crecimiento intersticial, mantienen un 
vínculo directo entre ellos al agruparse formando los denominados grupos 
isogénicos. 
2.3 COMPONENTES DE LA MATRIZ EXTRACELULAR (MEC) 
Los condrocitos son los encargados de sintetizar y secretar los componentes 
orgánicos de la matriz extracelular que son básicamente:3-6 
 Colágeno 
 Proteoglicanos 
 Glicoproteínas. 
2.3.1 COLÁGENO 
Es una proteína extracelular compuesta por tres cadenas polipeptídicas (cadenas 
α); las cuales se enroscan entre sí formando una estructura en soga, y se 
estabiliza mediante puentes de hidrógeno en la glicina y uniones covalentes 
determinadas por la hidroxilisina.7 El colágeno puede formar homotrímeros (las 
tres cadenas α son iguales entre sí), como en los tipos II y X, y heterotrímeros (las 
tres cadenas α son diferentes), enlos tipos VI, IX y X. 
El colágeno que mayoritariamente se encuentra en el cartílago es de tipo II, lo cual 
le confiere al cartílago una gran resistencia a la tensión y ayuda a inmovilizar a los 
proteoglicanos en la MEC.7 
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 6 
Las fibras de colágeno adoptan un patrón morfológico en forma de malla o red 
concéntrica que rodean a los grupos isogénicos. Las fibras que rodean a los 
grupos isogénicos y las células que los forman constituyen la denominada 
condrona. 
2.3.2 PROTEOGLICANOS (PGs) 
Los PGs son macromoléculas complejas formadas por un núcleo proteico con 
varios dominios globulares al que se unen largas cadenas de polisacáridos 
denominados glicosaminoglicanos (GAG). Estos están formados por una cadena 
larga, no ramificada, de unidades repetidas de polisacáridos. 
La distinción entre los glicosaminoglicanos o glucosaminoglicanos son los restos 
de azucares como lo podemos ver en la siguiente tabla.3 
Tipo de GAG Disacárido Distribución 
Ac. Hialurónico Ac. glucurónico + N-acetilglucosamina • tejido conectivo 
• piel 
• cartílago 
• líquido sinovial 
Condroitín Sulfato Ac. glucurónico + N-acetilgalactosamina • cartílago 
• hueso 
• piel 
• pared de arterias 
• córnea 
Dermatán 
Sulfato 
Ac. glucurónico (ác. idurónico) 
+ 
N-acetilgalactosamina 
• piel 
• vasos sanguíneos 
• corazón 
Heparán 
Sulfato 
Ac. glucurónico (ác. idurónico) 
+ 
N-acetilglucosamina 
• membranas básales 
• pulmón 
• vasos sanguíneos 
• corazón 
• sangre 
Queratán 
Sulfato 
Galactosa 
+ 
N-acetilglucosamina 
• cartílago 
• córnea 
• discos vertebrales 
 Tabla 1. Principales glucosaminoglicanos (GAG) 
 
El 80-90% de los PGs son grandes y se denominan agrecanos debido a sus 
propiedades de agregación, su localización es en el cartílago y su principal función 
es el soporte mecánico.8 
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 7 
Fig. 4 Estructura de los Proteoglicanos 
Están formados por un centro proteico 
(2,25 kDa) que presenta tres dominios 
globulares (G1, G2, G3) al que se adhieren 
cadenas de condroitín sulfato y queratán 
sulfato. En el extremo N-terminal de la 
proteína central, uno de los dominios 
globulares (G1) tiene la función específica 
de unión al hialuronato a través de la 
llamada proteína de unión, formando un 
complejo agrecano-hialuronato (Fig 4). Los 
principales agrecanos son el condroitín 
sulfato en sus distintas isoformas (condroitín-6-sulfato principalmente), el queratán 
sulfato y el dermatán sulfato. El condroitín sulfato es el más abundante y cada 
cadena está formada por 25-30 unidades de disacáridos, con un peso promedio 
de 15-20 kDa. Las cadenas de queratán sulfato son más cortas y su peso 
molecular medio oscila entre 5-10 kDa.9 
El hialuronato es también un glicosaminoglicano que se diferencia de los 
agrecanos por no estar sulfatado, no poseer proteína central y no formar PGs. Al 
no estar ramificado se unen a él múltiples moléculas de agrecano y se forman 
grandes macromoléculas que permanecen inmovilizadas dentro de la red de 
colágeno. 
La mayor concentración de condroitín sulfato esta alrededor de los grupos 
isogénicos, lo cual permite visualizar una matriz territorial, y una menor 
concentración esta, entre los diferentes grupos isogénicos, la cual es la matriz 
interterritorial. 
Los PGs son altamente hidrofilicos debido a que los grupos sulfato y carboxilo de 
los GAGs retienen iones positivos (sodio) junto con agua y esto hace que: a) el 
tejido mantenga su turgencia y no se deforme por fuerzas compresivas, y b) pueda 
difundir con facilidad los nutrientes hasta las células 
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 8 
2.3.3 GLICOPROTEÍNAS. 
En el cartílago se encuentran diferentes tipos de glicoproteínas. Algunas son de 
transmembrana y actúan como receptores para moléculas de adhesión, factores 
de crecimiento o interleucinas. Otras glicoproteínas son extracelulares con 
funciones de unión y ensamblaje entre los componentes de la MEC y los 
condrocitos. En general, están constituidas por una base proteica a la que se unen 
algunos mono y oligosacáridos. 
Las principales glicoproteínas estructurales son la ancorina CII, fibronectina, 
laminina y, sobre todo, las integrinas. La ancorina CII es un miembro de la familia 
de calpactinas situada en la superficie del condrocito que liga al colágeno y ancla 
los condrocitos a las fibras colágenas de la MEC. La fibronectina se presenta en 
forma de agregados en la MEC y en la superficie de los condrocitos; y está tiene 
afinidad para unirse a fibrina, colágeno tipo II, heparina, hialuronato, etc. 
La interacción de todas estas glicoproteínas con los condrocitos se realiza por 
medio de otras glicoproteínas, denominadas moléculas de adhesión y estas son 
las integinas, cadherinas y selectinas como E-selectina, P-selectina y L-selectina. 
Dentro de estas, las más importantes son las integrinas, las cuales regulan los 
procesos de adhesión, migración, proliferación y diferenciación celulares.9 
Las interacciones entre las glicoproteínas con otros componentes de la MEC, 
especialmente las macromoléculas, y la superficie de los condrocitos proporcionan 
estabilidad a todo el cartílago. 
Como podemos ver muchas de estas glicoproteínas sirven de receptores para los 
factores de crecimiento los cuales parecen actuar directamente sobre los 
condroblastos y condrocitos mediante receptores de superficie denominados 
integrinas e indirectamente mediante modificaciones de la matriz extracelular que 
modula las señales transmitidas a las células desde la matriz extracelular. 
2.4 FACTORES DE CRECIMIENTO (FCs) 
Los FCs, incluyendo las citoquinas, representan un número muy grande de 
polipéptidos, glucoproteínas y otras moléculas relacionadas, producidos en 
cantidades limitadas. 
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 9 
Todos ellos estimulan o inhiben la proliferación, la diferenciación y las funciones 
especializadas de casi cualquier tipo de célula.10 
2.4.1 DEFINICIÓN 
Se denomina FCs al mensajero químico que actúa sobre: 1) la misma célula que 
lo produce, por vía autocrina o intracrina; 2) en células vecinas, por vía paracrina 
y/o 3) en un grupo celular distante, por vía endocrina.11 
Los FCs transmiten la señal a las células sensibles a ellos uniéndose a un 
receptor específico, y esta unión da lugar a un sistema transductor de señales 
constituido por proteínas citoplasmáticas que, en último término, determinan la 
activación o inhibición de genes intranucleares. 
Con respecto a los efectos que producen, los FCs se pueden clasificar en: 
1. Reguladores positivos que estimulan la proliferación, o la diferenciación 
celular o ambas. 
2. Reguladores negativos que inhiben la proliferación, la diferenciación o 
ambas. 
Los FCs también ejercen efectos metabólicos en la célula diferenciada; esto es, 
promueven su funcionamiento como célula especializada. Por otro lado, algunos 
tipos celulares responden de manera diferente al mismo factor de crecimiento 
dependiendo de su estado de diferenciación. 
Los FCs. se sintetizan en el retículo endoplásmico en forma de grandes moléculas 
precursoras: pre-pro-factores o pro-factores; luego se almacenan, en forma de 
gránulos, en el aparato de Golgi; allí se realiza el procesamiento de los pre-pro-
factores y de los pro-factores en factores. Finalmente, los gránulos son vertidos al 
líquido extracelular mediante exocitosis.5 
Al ingresar al líquido extracelular ya sea intersticial o plasmático los FCs se fijan, 
rápidamente, a proteínas que impiden su degradación y que se denominan: 
Proteínas Transportadoras o de Unión (Binding Proteins o BP). Al igual que las 
hormonas, los FCs sólo ejercen efectos fisiológicos cuando no están unidos a las 
BP y, en consecuencia, pueden unirse fácilmente a los receptores de las células 
blanco.5 
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 10 
2.4.2 MECANISMO DE ACCIÓN 
Al igual que otros mensajeros químicos los FCs ejercensus efectos, inicialmente, 
mediante la unión a receptores específicos ubicados en la membrana celular. 
Por lo general, estos receptores son enzimas que catalizan la fosforilación de las 
proteínas en tirosina, por lo que se las denomina tirosina-quinasas (TK); o hay 
otros tipos de receptores que también son quinasas pero en serina y treonina. Las 
TK inician reacciones en cascada, que además son ramificadas. Por lo general, la 
unión entre receptor y ligando lleva a la autofosforilación y activación de la enzima 
receptora. El receptor activado se une a proteínas citoplasmáticas que inician una 
cascada, que culmina con la fosforilación de proteínas, que a su vez fosforilan 
factores de transcripción cuya activación determina que se modifique la expresión 
de ciertos genes, y produzcan una respuesta celular trófica (proliferación y 
diferenciación celular) o metabólica (función celular especializada), última etapa de 
la serie de reacciones.5,12 
2.4.3 FUNCIONES DE LOS FACTORES DE CRECIMIENTO EN LOS 
CONDROCITOS. 
Tales efectos en los condrocitos, varían tanto in vivo como in vitro, en función de la 
especie animal, la edad de los sujetos, etc. En general, estimulan la síntesis de los 
componentes de la MEC del cartílago, inhiben las proteasas y activan los sistemas 
de inhibición de éstas. Sin embargo, en condiciones basales la mayoría de los FCs 
no tienen ningún efecto sobre la síntesis de PGs o la inhiben.5 Pero no todos los 
fenotipos celulares tienen los mismos receptores, debido a estos fenómenos el 
efecto de los FCs no será el mismo en todos los tejidos ni en todas las situaciones. 
A continuación se describen las principales familias de factores de crecimiento que 
intervienen en la biología del cartílago. 
2.4.4 FAMILIA DEL FACTOR DE CRECIMIENTO TIPO INSULINA (IGF) 
El sistema del IGF comprende los factores de crecimiento IGF-I, IGF-II y la propia 
insulina, sus receptores y una serie de proteínas denominadas IGFBPs, que 
regulan la disponibilidad de los mismos. 
La mayoría de los FCs son sintetizados por el megacariocito, pero el IGF-I y la 
proteína que modula su actividad biológica, IGFBP-3 (insulin growth factor binding 
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 11 
protein -3) se sintetizan en el hígado y se liberan al torrente circulatorio donde son 
las plaquetas las encargadas de captar el factor por endocitosis y almacenarlo en 
los gránulos alfa. 
El IGF es el factor de crecimiento del que mejor se conoce su actividad sobre la 
proliferación y desarrollo de los condrocitos del cartílago y de su crecimiento. 
Ejerce procesos anabólicos tanto en fases del desarrollo como en etapas adultas, 
favoreciendo la síntesis de proteoglicanos y colágeno II. 
Por otro lado el IGF-I estimula la síntesis de integrinas alfa 3 y 5 en la superficie de 
los condrocitos y favorece la adhesión de éstos a la fibronectina y al colágeno 
II.5,13,14 
Los condrocitos del cartílago articular expresan receptores para el IGF-I y las 
acciones de los IGFs sobre ellos dependen de los niveles del factor y de su 
receptor, de la afinidad y disponibilidad del propio receptor y de IGFBP. 
Los factores de crecimiento tipo insulina, son factores endocrinos circulantes en el 
torrente sanguíneo que se unen a receptores específicos para IGF1R (tirosin-
cinasa) e IGF2R (manosa 6- fosfato). 
2.4.5 FACTOR INHIBIDOR DE LA LEUCEMIA (LIF) 
Se trata de un factor de crecimiento con actividad pleiotrófica que estimula la 
liberación de PG e inhibe su síntesis en cultivo. Pero existe una forma soluble de 
su receptor, denominada proteína ligante del factor inhibidor de la leucemia —
LIFBP— que inhibe de manera dosis-dependiente la liberación de PG producida 
por el LIF y revierte la supresión de su síntesis.5,15 
2.4.6 FACTOR DE CRECIMIENTO DERIVADO DEL ENDOTELIO 
VASCULAR (VEGF) 
El VEGF (también conocido como factor de permeabilidad vascular VPF, y 
vasculotropina VAS) es una glucoproteína dimérica con cuatro isoformas que son 
altamente específicas para los receptores VEGF-1,-2,-3. Su peso molecular es de 
46 KD. Los receptores de VEGF pertenecen a la familia de los receptores tirosin-
cinasa, que inician la cascada al dimerizarse.14,16 La activación de los receptores 
de VEGF (VEGFR) también resulta en señalización indirecta para el inicio de la 
adhesión y la agregación de las integrinas a las proteínas de la matriz extracelular. 
Neevia docConverter 5.1
 12 
El cartílago normal carece de vasos y ello es debido, al menos en parte, a que los 
condrocitos producen factores inhibidores de la proliferación de células 
endoteliales y la angiogénesis de acuerdo con su estado de diferenciación y de la 
presencia de MEC. Sus receptores se expresan en las placas de crecimiento de 
las vértebras y en las costillas.5,17 
2.4.7 INTERLEUCINAS (IL) 
Representan el otro gran sistema implicado en la regulación del metabolismo del 
cartílago, y que en líneas generales desempeñan acciones opuestas a los factores 
de crecimiento. Las más importantes en la biología del cartílago articular son las 
IL-1 e IL-6 y el TNFα. Sus mecanismos de acción son muy variados y 
posiblemente incluyen la inducción de apoptosis en los condrocitos.5 
2.4.8 FACTOR DE NECROSIS TUMORAL ALFA (TNF- α) 
Es una proteína secretada por los monocitos y macrófagos activados de PM 
17.000 daltons que está codificada por un gen situado en el cromosoma 6 
humano. 
Se han encontrado receptores para el TNF en fibroblastos, células endoteliales, 
adipocitos y miocitos. El número de receptores celulares no es indicativo del grado 
de respuesta celular a la acción de éste. 
Sus acciones son variadas, dependiendo del tipo celular en el que se sitúa. En las 
células normales ejerce un papel estimulador. Estimula el crecimiento de los 
fibroblastos, los induce, junto a las células endoteliales a producir GM-CSF, y 
aumenta la expresión de antígenos de clase 1. Induce además la liberación de IL-
1 por las células endoteliales y estimula los fibroblastos. 
Por otra parte el TNFα estimula la producción de enzimas proteolíticos, 
principalmente metaloproteasas, e inhibe la síntesis de componentes de la MEC, 
permitiendo la degradación del cartílago. Recientemente se ha visto que la 
colagenasa-3 se expresa en los condrocitos durante el desarrollo y en 
determinadas patologías, y que su ARNm es inducido por el TNFα.5 
Neevia docConverter 5.1
 13 
2.4.9 FAMILIA DEL FACTOR DE CRECIMIENTO FIBROBLÁSTICO (FGF) 
Son una familia de polipéptidos, de los cuales los mejor caracterizados son el 
FGF-1 o FGFa (ácido) y el FGF-2 o FGFb (básico).14,16,18 El FGF es un polipéptido 
mitógeno aislado de cerebro y pituitaria, el cual ha sido demostrado que es 
mitógeno para células derivadas de la mesoderma en cultivo de tejidos; también 
ha sido detectado en el cartílago articular y es un potente mitógeno y factor de 
diferenciación para los condrocitos, tanto in vitro como in vivo.19 
Sus efectos biológicos se regulan mediante los receptores de la superficie con alta 
afinidad. Desarrollan su actividad a partir de la tirosina-quinasa. Por otro lado, El 
FGFb regula la producción y degradación de los componentes de la MEC 
estimulando la síntesis de PG a la vez que suprime la síntesis de condroitín-6-
sulfato. Además, potencia la acción de la IL-1, induce la expresión de su receptor y 
favorece la de colagenasa-3 en unas líneas celulares de condrosarcoma.5,10,12,20-22 
2.4.10 FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDÉRMICO (EGF) 
El EGF (factor de crecimiento epidérmico) es una pequeña proteína (53 residuos 
de aminoácido con un peso molecular de 6.045 KDa) que estimula la proliferación 
de las células epidérmicas y de una gran variedad de otros tipos celulares, tanto 
epiteliales como no epiteliales. Esta presente en las glándulas submaxilares del 
ratón y similar a la estructura urogastrica humana, el cual ha sido señalado que es 
mitógeno para células epidermales, como también para fibroblastos y fibrasmusculares lisas y aumenta la síntesis de ADN en los condrocitos, dependiendo 
de la edad.5,14,20-23 
Es mitógeno para los condrocitos articulares y sobre los constituyentes de la MEC 
puede favorecer o inhibir la síntesis de PG. Además, los inhibidores de la síntesis 
de PG (ácido retinoico e IL-1β) aumentan la densidad de receptores para el EGF, 
mientras que los tratamientos con potenciadores de la síntesis (hormona 
paratiroidea y el dibutiril-cAMP) la reducen. 
Se conoce que el EGF se encuentra en el plasma y puede representar uno de los 
factores involucrados en la proliferación de condrocitos in vivo. 
Neevia docConverter 5.1
 14 
Fig. 5 Cartílago Hialino 
2.5 TIPOS DE CARTILAGO 
Según las características y componentes de la matriz, el cartílago se clasifica en 
tres grandes grupos:3,4,24 
a) Hialino: incluye el cartílago articular, nasoseptal, costal, traqueal y 
laringeal. 
b) Elástico: incluye el cartílago auricular (de la oreja) y de la epiglotis. 
c) Fibroso o Fibrocartílago: se encuentra en el disco intervertebral de la 
espina, en el tendón y la intersección del ligamento del hueso. 
Y cada uno de estos, es distinto en su estructura y naturaleza bioquímica. 
2.5.1 CARTÍLAGO HIALINO 
Es el tipo de cartílago más abundante del cuerpo. En 
estado fresco, el cartílago hialino aparece como una 
masa translucida color blanco azuloso. Con 
excepción de los cartílagos articulares, este tejido 
siempre esta cubierto por el pericondrio. Su grosor 
varía según la función y el área de cada articulación e 
incluso en las distintas áreas de una misma 
articulación (Fig. 5). 
Las células cartilaginosas o condrocitos se 
encuentran en las lagunas de la matriz; las células 
jóvenes son aplanadas o elípticas, con su eje mayor 
paralelo a la superficie. Hacia el interior se hacen ovales o hipertroficas y se hallan 
en los nidos celulares o grupos isogénicos. Las células cartilaginosas maduras se 
encuentran en general hacia el centro de la masa cartilaginosa. 
2.5.2 CARTÍLAGO ELÁSTICO 
Este es semejante al cartílago hialino, excepto que tiene abundantes fibras 
elásticas en su matriz, además de muchas fibras colágenas delgadas y elastina. 
La matriz es amarillenta en estado fresco, por la presencia de fibras elásticas y es 
mas opaca que el cartílago hialino, del cual es una modificación. Las células del 
cartílago elástico son similares al cartílago hialino, y están alojadas en lagunas 
Neevia docConverter 5.1
 15 
Fig. 6 Cartílago Elástico 
Fig. 7 Cartílago Fibroso 
aisladamente o en grupos isogénicos de 2 a 4; 
presentan menor acumulación de grasa y 
glucógeno que las del cartílago hialino. También 
esta rodeado por el pericondrio (Fig. 6). 
Las fibras elásticas forman una red más o menos 
densa en las porciones mas profundas de la 
matriz y son menos abundantes en la periferia del 
cartílago, a partir de la cual se les puede seguir 
hasta el pericondrio circundante. Este tipo de 
cartílago se encuentra en los lugares en que se 
necesita sostén con flexibilidad, como el conducto 
auditivo externo, pabellón auricular, trompa de eustaquio, epiglotis y algunos 
cartílagos de la laringe. 
2.5.3 FIBROCARTÍLAGO 
Este tipo de cartílago contiene pocas células, su matriz tiene abundante colágeno 
tipo I y II, la cual esta agrupada en haces, también 
su matriz es rica en condroitín sulfato y dermatan 
sulfato; presenta una gran resistencia a las 
tracciones y compresiones, por lo que, se 
presenta donde se necesita apoyo firme. Nunca 
se presenta solo, sino que se fusiona 
gradualmente con el cartílago hialino vecino o con 
el tejido fibroso denso (Fig. 7). El fibrocartílago es 
un tipo transicional entre el cartílago hialino y el 
tejido conectivo fibroso denso de tendones y 
ligamentos, sus células tienden a agruparse en 
cápsulas separadas unas de otras por gruesos haces de fibras colágenas. Las 
células están encerradas en cápsulas de matriz cartilaginosa hialina. No hay un 
verdadero pericondrio. Muestra una cantidad escasa de matriz y tiene haces de 
colágena tipo I, que se tiñen en forma ácidofila. Los condrocitos están alineados 
Neevia docConverter 5.1
 16 
muchas veces en hileras paralelas alternadas con haces gruesos y burdos de 
colágena, y son las responsables de la fuerzas de tensión que soporta este tejido. 
2.6 FISIOPATOLOGIA DEL CARTILAGO Y TERAPIA CELULAR 
Actualmente existe una alta incidencia de patologías causadas por la progresiva 
destrucción del cartílago hialino y elástico, ya que el cartílago tiene una capacidad 
de reparación limitada y las lesiones a este nivel generan un tejido del tipo 
fibrocartilaginoso que no reproduce las características fisiológicas, morfológicas y 
mecánicas necesarias para mantener una viabilidad celular, generando un daño 
progresivo1. Al parecer estos cambios están relacionados con la edad, ya que hay 
una disminución del número de condrocitos por mm3, y por lo tanto una 
disminución de la actividad de síntesis de las macromoléculas de la matriz 
extracelular. 
Además de estos problemas existen las patologías por traumas adquiridos o por 
defectos congénitos en los diferentes cartílagos, como en el auricular, nasoseptal, 
articular, traqueal, etc.7,22,25-27 Por lo que, numerosas técnicas han sido utilizadas 
con el objetivo de restituir o regenerar el tejido dañado.1,28 Estas técnicas o 
terapias celulares incluyen: 
a) Transplante autólogo o autoinjerto: Consiste en sustituir una parte de la 
articulación afectada por otra que tenga la misma función; esta proviene 
del mismo individuo y es uno de los mejores métodos quirúrgicos; pero a 
pesar de que el tejido es repuesto, el problema de la deficiencia de su 
función no se ha resuelto, y nada mas se puede extraer una pequeña 
porción y el sitio donde se extrajo el implante, se deja dañado. 
b) Transplante alogénico o aloinjerto: Aunque con el desarrollo de agentes 
supresores del sistema inmune, se ha prolongado la era del aloinjerto 
(proveniente de un individuo genéticamente diferente), el número de 
donadores con el mismo tipo de HLA (por sus siglas en inglés Human 
Leukocyte Antigen) es muy limitado, y además se corre el riesgo de una 
posible transmisión de algún virus como el HIV o hepatitis al receptor o en 
dado caso, el rechazo del órgano transplantado.29 
Neevia docConverter 5.1
 17 
c) Dispositivos mecánicos: Son otro método para la sustitución del tejido, 
los cuales no pueden realizar todas las funciones de un órgano, y por lo 
tanto, proveen sólo un beneficio temporal; además tienen un tiempo de 
vida media limitada, insuficiencia para unirse al hueso, y puede causar 
reacciones alérgicas por la abrasión del material. 
 
Sin embargo, la eficacia a largo plazo de estas técnicas es incierta hasta el 
momento. 
Por otra parte, la población que requiere recibir el trasplante de un órgano o tejido 
ha aumentado vertiginosamente en nuestro país; la lista de espera conformada 
por los datos de los pacientes procedentes de las instituciones públicas y privadas 
muestra que la demanda rebasa por mucho el número de órganos de los que se 
dispone.30 El desfase entre el número de donaciones y la demanda de trasplantes 
reproduce la situación que en otros países ya se presenta de una forma más 
aguda, y México no es la excepción. 
Ejemplos como este existen muchos, y ante la necesidad de nuevas terapias para 
las aplicaciones médicas surge una nueva área denominada Ingeniería de Tejidos 
o lo que se le llama hoy Medicina Regenerativa,26,31 con la cual se pretende 
restaurar los tejidos dañados, como es en el caso del cartílago, formando un 
injerto de condrocitos autólogos. 
2.7 INGENIERÍA DE TEJIDOS O MEDICINA REGENERATIVA. 
La ingeniería de tejidos se define según la Nacional Science Foundation Workshop 
(NSFW) como un campo interdisciplinario de investigación con aplicaciones 
clínicas para restaurar, reemplazar o regenerar tejidos y/o órganos; y asítratar 
alguna función dañada, ya sea, por un defecto congénito, alguna enfermedad y/o 
trauma, y esta se utiliza en combinación de varios avances tecnológicos que van 
más allá de un transplante tradicional y/o terapia.32 
Además esta área, aplica los principios y métodos de la ingeniería (materiales, 
química de superficie, química física, matemáticas e ingeniería computacional) a 
los principios de las ciencias de la vida (como son biología molecular, biología 
celular, medicina de transplantes, genética y cirugía), para el entendimiento de la 
Neevia docConverter 5.1
 18 
relación función-estructura de los tejidos normales y patológicos y al desarrollo de 
nuevos tejidos o “constructos” para aumentar, restaurar o mantener los sistemas 
biológicos existentes.31,32 
Este es un nuevo campo que busca usar la combinación de células, biomateriales 
y factores de crecimiento para lograr la rápida regeneración o reparación de 
tejidos con propiedades mecánicas y bioquímicas similares a las del tejido original. 
2.7.1 PRINCIPIOS BÁSICOS EN LA INGENIERÍA DE TEJIDOS. 
Mediante la ingeniería de tejidos se han fabricado diferentes tejidos, utilizando 
células madre y células somáticas; sin embargo, la mayoría de estos tejidos se 
realizan a nivel experimental en animales31 (ver tabla 2). 
Ingeniería de tejidos 
basada en células madre 
Ingeniería de tejidos 
basada en células somáticas 
Vasos sanguíneos Vejiga 
Hueso Cartílago (oreja, nariz) 
Cartílago Valvas de corazón 
Cornea Intestino 
Esmalte de los dientes Riñón 
Músculo de corazón Uretra 
Hígado Traquea 
Páncreas Meniscos 
Tejido nervioso Mucosa oral 
Músculo esquelético Uréter 
Piel 
 Tabla 2. Tejidos formados mediante Ingeniería de tejidos. 
 
Independientemente del tipo de tejido, algunos de los “ingredientes básicos” para 
crecer nuevos tejidos in vivo son: células, matriz extracelular, vasos sanguíneos, 
comunicación intercelular e interacciones célula-matriz extracelular. Dichos 
componentes están bien combinados, en un espacio bien coordinado y en una 
fase tiempo-dependiente. Además de los ingredientes antes mencionados, otro de 
los prerrequisitos para la aplicación exitosa de la ingeniería de tejidos in vivo, es 
tener los conceptos quirúrgicos bien elaborados. A medida que se incrementa la 
complejidad de los componentes utilizados en la ingeniería de tejidos hay que 
Neevia docConverter 5.1
 19 
tomar las debidas precauciones para evitar un daño de las células que pueden 
susceptibles o de los templetes bioactivos durantes su implantación. Dependiendo 
de los conceptos específicos, un periodo previo in vitro puede variar de 1 día hasta 
varios meses. Este periodo comúnmente es usado para la expansión celular o la 
inducción de la diferenciación celular tejido-especifico.33 
En general, en la ingeniería de tejidos se utilizan biomateriales modificados que en 
conjunto con los componentes celulares mimetizan a un tejido natural, como 
resultado se forma un material biológico funcional para la restauración física y/o el 
remplazamiento de los defectos tisulares; superando a los autoinjertos o 
aloinjertos.34 
Por lo que, mediante la ingeniería de tejidos se podría formar un “neo-cartílago” , 
el cual tendría muchas aplicaciones en el Laboratorio de Ingeniería de Tejidos de 
este hospital; pero, primero se debe de estandarizar un método de cultivo y 
seleccionar un biomaterial que nos sirva de sostén para sembrar los condrocitos, y 
estos puedan proliferar y formar un tejido, además de que les permita sintetizar 
proteínas como son: proteoglicanos y colágena tipo II, los cuales son marcadores 
de la estabilidad fenotípica de estas células. 
2.7.2 BIOMATERIALES. 
El termino biomaterial comprende un amplio rango de substancias de origen 
natural y sintéticas, las cuales se utilizan en amplio espectro para aplicaciones 
medicas.32 Así, los biomateriales se pueden definir como substancias contenidas 
en drogas o alimentos utilizados para uso terapéutico o de diagnóstico o bien en 
algunos casos se definen como materiales compuestos de derivados biológicos o 
sintéticos para aplicaciones clínicas.35 
El desarrollo de nuevos biomateriales requiere de los conocimientos conjuntos de 
ingenieros, biólogos y físicos. En años recientes, se ha incrementado el desarrollo 
de nuevos biomateriales, no artificiales (obtenidos de animales o humanos) y 
artificiales de los cuales deben ser totalmente biocompatibles, reabsorbibles y no 
reabsorbibles y de tal manera que la implantación de nuevos biomateriales en la 
clínica se esta expandiendo enormemente (Tabla 3). 
 
Neevia docConverter 5.1
 20 
Matrices artificiales 
absorbibles 
Matrices artificiales 
no absorbibles 
Matrices no artificiales 
Poligalactina Polivinil alcohol Esponjas de colágeno de tipo I 
Ácido poliláctico Nylon Menisco 
Ácido poliglicólico Poliester Tejidos embrionarios 
Poliuretano Politetrafluoroetileno Hueso descalcificado 
 Fibras de carbono Fibrina polimérica 
 Polietileno Ácido hialurónico 
 Tabla 3. Los materiales utilizados en la Ingeniería de Tejidos. 
 
Todos los biomateriales utilizados en la ingeniería de tejidos deben cumplir con 
ciertos prerrequisitos, tales como no ser tóxicos o carcinogénicos, que sean 
biocompatibles, esterilizables y con flexibilidad quirúrgica, además de tener ciertas 
propiedades mecánicas como ser permeables, estables, elásticos, y reabsorbibles 
a medida que se reemplaza el tejido. Los biomateriales permiten la adherencia 
celular y poseen el potencial de transportar agentes biomoduladores como los 
factores de crecimiento y material genético.36 
 
Mediante técnicas de hibridación se ha logrado integrar la matriz extracelular a los 
polímeros, por lo que se le denomina “scaffold” o templete. Una de las principales 
proteínas utilizada para combinarse con los polímeros es la colágena, la cual tiene 
propiedades adhesivas para las células, sin embargo, otros componentes de la 
matriz extracelular pueden recubrir la superficie de los polímeros e incrementar las 
uniones celulares más específicas entre polímero-célula, como las glicoproteínas 
que semejan a la fibronectina, vitronectina y laminina, la secuencia péptido 
semejante a arginina-glicina-ácido aspártico (RGD).34,37 
Hoy en día, siguen diseñándose y sintetizándose muchos biomateriales para ser 
utilizados en el área medica en un futuro, así por ejemplo algunos biomateriales 
están diseñados para cambiar de una forma temporal a una permanente por un 
cambio de temperatura.38 
Neevia docConverter 5.1
 21 
Fig. 8 Estructura del PGA 
Uno de los biomateriales que se esta 
utilizando en este laboratorio y que se podría 
utilizar como soporte para los condrocitos, es 
el ácido poliglicólico (PGA); el cual es un 
polímero sintético, cuyo peso molecular es 
de 69 kDa; esta formado por fibras 
organizadas en forma de red, con un 
diámetro de 13-μm, y tiene un 97% de 
porosidad. (Fig 8) El PGA pierde su 
integridad mecánica en alrededor de dos 
semanas y disminuye su masa a un 50%, en 4 semanas de cultivo tanto in vitro 
como in vivo.39,40 Su fabricación es por vaciado en molde, y es diseñado como una 
red multifilamentaria orientada como una tela de trama, para formar una malla no 
ondulada de fibras interconectadas y prensada entre placas calientes para mejorar 
su estabilidad mecánica. La malla es prensada en discos de 5-10mm de diámetro, 
1, 2, o 5 mm de espesor. Finalmente es esterilizada con óxido de etileno por 12 
horas y secada por al menos 24hs. 
Otro biomaterial es el ácido poli-láctico-co-glicólico (PLGA), el cual es un polímero 
ampliamente utilizado como dispositivos terapéuticos por su biodegradabilidad y 
biocompatibilidad.39,40 Se prepara en diferentes proporciones de ácido láctico y 
ácido glicólico, las cuales van desde una dilución 50:50 hasta un 75:25 
respectivamente; se degrada por hidrólisisen sus uniones éster en presencia de 
agua y la relación que se utiliza mas frecuentemente es 50:50; y se ha 
comprobado que se degrada alrededor de 2 meses.40 
Con la unión del PGA y PLGA se puede formar un co-polímero el cual permite que 
el PGA aumente su adhesión celular. 
2.7.3 CULTIVO DE CONDROCITOS 
Al igual que ocurre con otros tipos celulares, cuando los condrocitos se aíslan y se 
cultivan en monocapa pueden aumentar de forma notable, su capacidad de 
síntesis, por lo que pueden tener ciertas aplicaciones clínicas especialmente en 
ingeniería de tejidos y en la terapia génica.26,41 Sin embargo, el cultivo de 
PGA 
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 22 
condrocitos in vitro no esta exento de dificultades, en particular, es su tendencia a 
desdiferenciarse en cultivos en monocapa, por lo que con el paso del tiempo su 
fenotipo cambia progresivamente a una morfología de fibroblastos al realizar 
diferentes resiembras o subcultivos.27,42-46 
Las causas de la desdiferenciación de los condrocitos son: su trasplante de un 
medio condrotrópico en el que están sometidos a una serie de factores de 
crecimiento y la carencia in vitro de la matriz tridimensional que ellos mismo 
secretan; por lo que, la ausencia de estos elementos conduce a una adaptación al 
nuevo medio y se produce esta transformación.27,44,45 
La desdiferenciación es evitable por varios métodos diferentes o con la 
combinación de varios de éstos, tal es el caso de: 
1) Cultivo a alta densidad (2 × 105 células por cm2), es el más empleado y vendría 
a resolver parte del problema, dado que son capaces de mantener el fenotipo 
condrocitario hasta que son subcultivados. Aun así, y a pesar de sus ventajas, los 
condrocitos presentan en ellos una expresión de colágeno tipo II más lábil que la 
de agrecano. 
2) Inclusión de los condrocitos en matrices tridimensionales que simulen, de 
alguna forma, el ambiente primordial del que han sido extraídos, y se han utilizado 
como matrices a geles de colágeno, agarosa, alginato, esponjas de colágeno y 
polímeros sintéticos o biomateriales;47 estos son capaces de mantener su fenotipo, 
pero la desventaja es su crecimiento celular lento. 
3) Un método paliativo es el tratamiento de las células con factores de crecimiento 
que retrasan el proceso de desdiferenciación.12,20,41,43 
Aunado a esto, las muestras de cartílago presentan una enorme variabilidad en 
sus respuestas, por lo que el uso de biorreactores es importante para 
mantenimiento del cartílago y para valorar los diferentes procedimientos al que es 
sometido este tejido.31,51 
2.7.4 BIORREACTORES. 
Los biorreactores tienen una función importante en la ingeniería de tejidos, ya que 
gracias a estos sistemas es posible la reproducibilidad y se pueden controlar los 
factores ambientales específicos.49 Mediante estos sistemas se realizan estudios 
Neevia docConverter 5.1
 23 
Fig. 9 Cultivos en el biorreactor. 
controlados con el objetivo de entender los efectos 
físicos, químicos y biológicos. Los birreactores se 
han empleado para el cultivo de bacterias o células 
de mamíferos en un ambiente monitoreado, 
controlado y bajo ciertas condiciones operacionales 
como son: pH, temperatura, oxígeno y suministro 
de nutrientes a niveles industriales o gran escala 
(Fig 9). Por lo tanto, los conocimientos obtenidos de 
los cultivos celulares en monocapa no aplican para el cultivo de tejidos en tercera 
dimensión y por lo tanto, cada tipo de neotejido creado in vitro (piel. hueso, 
cartílago) requiere de un diseño especial.31 
2.8 ANTECEDENTES 
La formación de cartílago mediante ingeniería de tejidos utilizando condrocitos 
articulares depende de las condiciones y la duración de los cultivos utilizados in 
vitro, para así lograr una mejor calidad del neotejido (por ejemplo: mejor 
composición bioquímica e histomorfologica) y de función (mecánica y porcentaje 
de biosíntesis).49 Estudios realizados por el grupo del Dr. Atala, demostraron que 
es posible formar cartílago articular tanto in vivo como in vitro utilizando 
condrocitos de cartílago hialino bovino como fuente celular y una matriz a base de 
un polímero de ácido poliglicólico (PGA).48 Después de seis semanas de cultivo, 
se formó un tejido completamente cartilaginoso, estando en completo equilibrio la 
cantidad de glicosaminoglicanos y colágeno.48,49 Aunque algunos investigadores 
consideran que el factor más importante para la formación del cartílago por 
ingeniería de tejidos es la presencia de células biosintéticas activas, capaces de 
proliferar y rellenar los espacios existentes en el polímero y formar cartílago 
progresivamente.50 
Estudios realizados recientemente demostraron que existen dos parámetros muy 
importantes para la generación de cartílago: la selección de un tipo celular 
apropiado y la concentración celular. Así como también que, existe una correlación 
entre el número celular inicial, el grosor y peso del cartílago neo-formado.51 Un 
periodo apropiado de crecimiento se correlaciona con un incremento de la 
Neevia docConverter 5.1
 24 
proliferación de matriz cartilaginosa y un incremento en las distancias 
intercelulares. El balance entre estos dos parámetros es vital para tener éxito en la 
formación de cartílago por ingeniería de tejidos.52 
La devolución o remisión de los condrocitos a un ambiente condrotrópico 
(fundamentalmente su situación en matrices tridimensionales) puede conducir a la 
rediferenciación de estas células, con la recuperación de la expresión génica 
característica de ellas y la vuelta a un fenotipo típicamente condral.22,41,43,48 
La estimulación de los condrocitos en cultivo in vitro con factores de crecimiento 
aumentan su proliferación como por ejemplo: en presencia de IGF-I producen una 
mayor síntesis de los proteoglicanos, que coincide con un aumento en la 
expresión de su receptor; el FGFb o FGF-2 y EGF aumenta la proliferación de 
condrocitos de oreja de conejo o articulares, expuestos a medio suplementado con 
suero;53 además que el EGF se encuentra en el plasma y puede representar uno 
de los factores involucrados en la proliferación de condrocitos in vivo.20 En estos 
artículos varían en las concentraciones de los recombinantes, ya que estimulan a 
los condrocitos con concentraciones que van desde 5ng/mL, 10ng/mL hasta 100 
ng/mL. e inclusive en concentraciones de µg. 13,19-21,43 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Neevia docConverter 5.1
 25 
3.- PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. 
Al no encontrar un tejido que pueda remplazar al cartílago, tanto en su 
estructura, como en su flexibilidad, todas las investigaciones se han enfocado 
en el intento de encontrar una manera de poder “fabricar” neo cartílago in vitro, 
con la finalidad de sustituir los defectos causados en este, y así conseguir una 
integridad anatomo-funcional completa tanto en lesiones de la laringe, traquea, 
pabellón auricular y oído medio con el cartílago elástico, al igual que 
articulaciones, nariz y formación de hueso con el cartílago hialino. 
Sin embargo, el uso de los condrocitos no se limita a la formación de tejidos ya 
que, como se ha visto los condrocitos tienen una facilidad de crecimiento, 
cultivo, y expansión celular in vitro; además de que es un tejido idóneo para 
transplantarse, ya que es aneural, relativamente avascular, e 
inmunoprivilegiado, nutriéndose fundamentalmente del líquido sinovial, y se ven 
protegidos del sistema inmune por la matriz circundante lo que les permite 
sobrevivir durante años, sin necesidad de inmunosupresión.48 
Por todo esto, su utilidad es muy viable en el campo de la urología, ya que, en 
recientes estudios se ha demostrado que pueden ser usado para formar el 
tracto genitourinario para el tratamiento del reflujo vesicouretral y la 
incontinencia urinaria en modelos animales y en humanos48,50; además de que 
puede ser utilizado en prótesis testiculares en pacientes con ausencia testicular 
unilateral o bilateralcausada por problemas congénitos (criptorquidia, 
hipogonadismo, hermafroditismo) ó adquiridos (traumas, cáncer testicular), los 
cuales son problemas que se presentan en urología pediátrica de este hospital. 
El principal inconveniente del cultivo de condrocitos, es el de realizar varias 
resiembras, para obtener una cantidad apropiada para sembrar sobre el 
templete o matriz tridimensional, esto conlleva a enfrentarnos a un problema 
común en este linaje celular que es la desdiferenciación hacia un linaje 
fibroblástico, lo cual cambia la síntesis de colágeno tipo I en lugar de la síntesis 
de colágeno tipo II. Por lo que sea visto, la necesidad de utilizar factores de 
crecimiento para que sea más rápida su expansión en menos pasajes y así 
evitar su desdiferenciación. 
Los FCs en general, ejercen un efecto anabólico y catabólico sobre los 
condrocitos y puede potenciarse entre ellos54, por lo que se han relacionado 
Neevia docConverter 5.1
 26 
con la producción de matriz extracelular (MEC), la cual sufre un proceso 
permanente de renovación que determina el grado de actividad condrocitaria. 
En cultivos in vitro, se ha observado que la adición de factores de crecimiento 
exógenos como el IGF-1, el EGF y el FGF básico (FGF-2) inducen la 
proliferación y la síntesis de ciertas proteínas de matriz extracelular de 
condrocitos,59-62 ya que tienen un efecto anabólico a comparación del TNF-α y 
LIF que tienen un efecto catabólico sobre los componentes de la matriz. 
Debido a esto, se propuso establecer un método de cultivo, con un adecuado 
equilibrio entre la rápida proliferación de los condrocitos y evitando su 
desdiferenciación mediante la presencia de FCs. 
Por lo tanto, los condrocitos estimulados con IGF-I, EGF y FGFb, tendrían 
como ventajas: 
 Estimular la proliferación celular, lo cual evitaría su desdiferenciación a 
fibroblastos, además evitaría la síntesis de colágena tipo I. 
 Obtener un neocartílago con mejores características morfológicas en un 
tiempo de cultivo más corto, en comparación con el cultivado en condiciones 
normales de cultivo (medio DMEM-F12 con 10% SFB). 
Por lo que, se han planteado las siguientes preguntas de investigación: 
¿Incrementaran la proliferación los factores que tienen un efecto anabólico que 
los que tienen un efecto catabólico? 
¿La estimulación de los condrocitos con factores de crecimiento incrementa o 
disminuye la síntesis de proteínas en membrana o matriz extracelular? 
¿Que cartílago es mejor el hialino o el elástico para su uso en el laboratorio de 
ingeniería de tejidos? 
¿Qué diferencias existen en la utilización de uno y otro? 
¿Cual de los factores de crecimiento utilizados será el más conveniente para su 
uso en laboratorio de ingeniería de tejidos? 
¿Qué concentración de los factores de crecimiento será la mas apropiada para 
utilizar? 
 
Neevia docConverter 5.1
 27 
4.- OBJETIVOS. 
 
1) Obtener biopsias y disgregar las células de tejido auricular y costal de 
conejo. 
2) Cultivar los condrocitos a diferentes concentraciones de factores de 
crecimiento. 
3) Realizar una cinética de proliferación de los condrocitos en presencia y 
ausencia de los factores de crecimiento IGF-I, EGF, y FGFb. 
4) Caracterizar las células condrocíticas mediante inmunohistoquimica y 
citometría de flujo. 
5) Determinar el efecto del IGF, EGF y FGFb en la expresión y síntesis de 
proteínas de condrocitos hialinos y condrocitos elásticos in vitro. 
6) Analizar la expresión de proteínas de superficie y membrana en los 
condrocitos estimulados con los factores de crecimiento. 
 
 
 
 
Neevia docConverter 5.1
 28 
5.- HIPÓTESIS. 
 
Se ha descrito que los condrocitos cultivados in vitro, responden al efecto de 
factores de crecimiento, como el EGF, FGFb, IGF-1; entonces, si los cultivos de 
condrocitos se estimulan con estos factores de crecimiento se incrementara la 
proliferación, la síntesis y/o expresión de las proteínas de matriz extracelular, y 
por lo tanto, mejoraran las características morfológicas del cartílago. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Neevia docConverter 5.1
 29 
6.- MATERIALES Y MÉTODOS. 
1) Obtención del tejido auricular y costal de conejo. 
Se utilizaron conejos machos New Zeland, púberes de aproximadamente 7 
semanas de vida extrauterina y un peso aproximado 1.7 kg. Fueron 
anestesiados por vía muscular y arterial con Ketamina y pentobarbital a una 
dosis de 20 mg/kg y 40 mg/kg respectivamente. Se utilizó el antibiótico 
Gentamicina pre y post-operatorio a una dosis de 13 mg/kg y 5 mg/kg 
respectivamente. 
Los conejos fueron cuidados por el personal capacitado del Bioterio del 
Hospital Infantil Federico Gómez, que incluye alimento, agua y limpieza diaria a 
libre consumo. 
2) Disgregación de tejido cartilaginoso mediante tripsina-EDTA 
y colagenasa tipo II. 
Las biopsias de cartílago hialino y/ó elástico fueron transportadas en PBS 1X 
frío con antibiótico-antimicótico (GIBCO) frío por separado al laboratorio en 
tubos cónicos Falcon de 50mL. En condiciones de esterilidad, fueron lavadas 
exhaustivamente en tres ocasiones con PBS 1X estéril, se les retiró la capa 
que recubre el cartílago (pericondrio), se cortaron en pequeñas porciones de 
aproximadamente 1 mm3 y fueron disgregados por separado en presencia de 5 
mL de tripsina-EDTA (GIBCO) por 30 minutos a 37ºC (para eliminar los 
fibroblastos), transcurrido el tiempo, se desechó el sobrenadante, se lavaron 
tres veces con PBS 1X, se les adicionó 5 mL de colagenasa tipo II (1 mg/mL) 
(ICN Biomedicals Inc) en DMEM-F12 (GIBCO) y se mantuvieron en agitación 
constante por 3 horas a 37ºC y 5% de CO2. 
El disgregado celular se centrifugó por 10 min. a 2000 r.p.m (SORVALL), el 
botón celular se resuspendió en medio DMEM-F12 fresco y las células 
condrocíticas fueron sembradas a una concentración celular de 2 x 105 
células/cm2 en cajas de petri de 100 mm x 20 mm (CORNING) con 10 mL de 
DMEM-F12 (GIBCO) al 10% de suero fetal de bovino (SFB) (GIBCO). 
3) Cultivo y crecimiento de las células condrocíticas. 
Las células fueron cultivadas en medio de cultivo DMEM-F12 suplementado 
con Suero Fetal de Bovino al 10%, antibiótico-antimicótico 1% (GIBCO), en una 
Neevia docConverter 5.1
 30 
incubadora (REVCO) a 37ºC, humedad saturada y 5% de CO2. Una vez que los 
condrocitos alcanzaron una confluencia celular del 80%, se procedió a 
resembrarlos o sembrarlos en presencia de los diferentes los FCs. 
4) Cultivo de condrocitos a diferentes concentraciones de 
factores de crecimiento. 
Para observar el día máximo de proliferación y encontrar la concentración 
adecuada de cada uno de los FCs se hizo la siguiente prueba. En una placa de 
96 pozos fondo plano (COSTAR) se sembraron 50 x 105/mL condrocitos en 
presencia-ausencia de cada uno de los siguientes FCs: EGF (SIGMA), FGFb 
(SIGMA), VEGF (SIGMA), TNF-α (BIODESIGN), LIF (SIGMA) e IGF-1 
(BIOSOURCE). Las concentraciones utilizadas fueron de 5, 10 y 20 ng/mL y se 
evaluó la viabilidad por la prueba del MTT (SIGMA) al día 7. El MTT es un 
colorante amarillo soluble en agua, el cual es reducido por las células vivas a 
formazan un colorante púrpura e insoluble en agua. 
La evaluación se hizó de la siguiente manera: a tres pozos con condrocitos en 
presencia-ausencia del recombinante correspondiente a cada concentración, 
se les adicionó 40 μL de la solución de MTT-PBS (5mg/mL) y fueron incubadas 
3-4 horas a 37ºC; trascurrido el tiempo, se retiró el medio-solución de MTT-
PBS, entonces los pozos se lavaron con PBS 1X y se les agregó 200μL de 
alcohol isoamílico-HCl (0.04%) (SIGMA), se resuspendió bien el precipitado 
azul hasta que se disolvió y se tomó una alícuota de 30 µL para ser leídos en 
un lector de placas para ELISA (Tecan GENios) a 595 nm. 
5) Cinética de proliferación de los condrocitos en presencia de 
los factores de crecimiento mediante el método de MTT. 
En una placa de 96 pozosfondo plano (COSTAR) se sembraron 50 x 105 
condrocitos/mL en presencia-ausencia de cada uno de los siguientes FCs: 
EGF, FGFb, VEGF, TNF α, LIF e IGF-I. Tres pozos correspondientes de 
recombinante fueron evaluados a los días 1, 3, 5, 7, 9, 11 y 13. Brevemente, se 
adicionaron 40 μL de la solución de MTT-PBS (5mg/mL) y se incubaron 3-4 
horas a 37ºC.; trascurrido el tiempo se retiró la solución de MTT-PBS, se lavó 
con PBS 1X y posteriormente se agregaron 200μL de alcohol isoamilico-HCl 
(0.04%), se resuspendió bien el precipitado azul hasta que se disolvió y 
Neevia docConverter 5.1
 31 
finalmente se tomó una alícuota de cada condición, las cuales fueron leídas a 
595 nm en un lector de placas para ELISA (Tecan GENios). 
6) Caracterización de los condrocitos mediante 
inmunohistoquìmica (colágena II, ρ-selectina, S-100, CD-14, y 
agrecanos). 
Para la caracterización de los condrocitos por inmunohistoquímica (IHQ) se 
utilizó el kit En vision+® System-HRP (DAB) (DakoCytomation). Brevemente, 
se sembraron 1 x 105 cél./pozo en medio DMEM/F12 en presencia de SFB 10% 
en una cámara Lab-Teck de 8 pozos (Nalge Nunc Int.), una vez que las células 
formaron una monocapa, fueron fijadas con acetona fría por 1 min. 
Posteriormente, fueron incubadas con el bloqueador de peroxidasa endógena 5 
min., se lavaron dos veces con agua destilada y se volvieron a incubar otros 5 
min. ahora con el bloqueador universal 1X (Biogener 10X), se incubaron por 45 
min con el siguiente panel de anticuerpos monoclonales/policlonales primarios: 
anti-S100 (SIGMA), anti-ρ-Selectina (DakoCytomation), anti-colágena II 
(CHEMICON), anti-agrecanos* (SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC.). Para 
lo cual, se utilizaron diluciones de 1:100, transcurrido el tiempo, se lavaron con 
PBS-Tween20 (0.01%) en tres ocasiones, se incubaron por 30 min. con el 
polímero de Dako (el cual, tiene adsorbido un anticuerpo secundario y la HRP) 
y se lavaron nuevamente en 3 ocasiones con PBS-Tween20 (0.01%), 
finalmente, se agregó el revelador DAB por 1 min., se lavaron en 4 ocasiones 
con PBS-Tween20 (0.01%) para eliminar el exceso del cromógeno; y se 
realizo una contratinción con Hematoxilina de Harris y se observaron en el 
microscopio de luz visible. 
*Para los pozos donde correspondían al anticuerpo antiagrecanos: no se utilizó 
el Kit de DAKO, por lo que las células condrociticas después de incubarse con 
el anticuerpo primario anti-agrecano fueron incubadas con un anticuerpo 
secundario Multi Link (DakoCytomation) a una dilución 1:100 por 30 min., 
trascurrido el tiempo se lavaron nuevamente en 3 ocasiones con PBS-Tween20 
(0.01%) y se incubaron con Streptavidina-Biotina (DakoCytomation) a una 
dilución 1:300 por 30 min., trascurrido el tiempo se lavaron nuevamente en 3 
ocasiones con PBS-Tween20 (0.01%) y finalmente se agregó el sustrato DAB 
por 1 min. se lavaron en 4 ocasiones con PBS-Tween20 (0.01%) para eliminar 
el exceso de el cromógeno, después se realizó una contratinción con 
Neevia docConverter 5.1
 32 
Hematoxilina y fueron observadas en el microscopio de luz visible (Zeiss, 
Olympus B071). 
7) Caracterización de los condrocitos tratados con el EGF, IGF-
I, y FGFb, mediante inmunohistoquímica (colágena II, ρ-
selectina, S-100, CD-14, y agrecanos). 
Una vez sembradas las células a una concentración de 1 x 105 cél./pozo con 
medio DMEM/F12 en presencia de SFB al 10% en una cámara Lab-Teck de 8 
pozos, fueron estimuladas con FGFb (5ng/mL), EGF (5 ng/mL) e IGF-I (10 
ng/mL) y se fijaron al cuarto día, fueron caracterizaron con los anticuerpos 
antes mencionados, usando el mismo procedimiento. 
8) Caracterización de los condrocitos mediante citometria de 
flujo (FACS). (colágena II, ρ-selectina, S-100, CD-14, y 
agrecanos). 
Para la caracterización por FACS, las células fueron despegadas del sustrato 
utilizando tripsina-EDTA (0.025%) y fueron lavadas dos ocasiones con PBS 
estéril y frío. Posteriormente, se colocaron 2 x 106 células en 7 viales y fueron 
incubadas en 100μL de PBS-albúmina sérica bovina al 0.01% por 10 min.; 
transcurrido este tiempo se lavaron 2 veces con PBS frió, se incubaron con 
100μL del bloqueador universal 1X por 5 min, después se incubaron por 45 
min. a 4ºC con un panel de anticuerpos: anti-S100, anti-Colágena II, anti-ρ-
Selectina, y anti-Agrecanos*. Las células fueron lavadas con PBS frío dos 
veces e incubadas con un anticuerpo secundario anti-mouse-FITC (SIGMA), el 
cual reconoce específicamente la porción Fc del anticuerpo primario (dilución 
1:100 por 30 min.). Transcurrido el tiempo, las células se lavaron en dos 
ocasiones y se centrifugaran, el botón celular se resuspendió en 1 mL y se 
procedió a leerlos en un FACS-Scalibur (Becton Dickinson) en el canal 2, a una 
longitud de onda de 520 nm. 
*El anti-Agrecanos, se incubó con un anticuerpo secundario anti-goat marcado 
con FITC (SIGMA) dilución 1:100 por 30 min. 
Neevia docConverter 5.1
 33 
9) Caracterización de los condrocitos tratados con el EGF, IGF-
I, y FGFb mediante citometría de flujo. (colágena II, ρ-selectina, 
S100, CD14, Y agrecanos). 
Es el mismo procedimiento que el anterior nada mas que ahora tratados por 
separado con los factores antes mencionados y caracterizados con los 
anticuerpos correspondientes. 
10) Formación de los polímeros PGA-PLGA 
El ácido poliglicólico (PGA) (ALBANY INTERNATIONAL RESEARCH) fue 
cortado en 24 trozos pequeños de 1cm2 y cubiertos (rociados) de ácido 
poliláctico-coglicólico (PLGA) (50:50) (SIGMA), una vez cubierto toda la 
superficie de ambos lados y las orillas del PGA, se procedió a secar por 24 
horas los polímeros PGA-PLGA para eliminar el cloroformo en el cual es 
disuelto el PLGA. 
Después se procedió a esterilizar los polímeros. 
11) Siembra en polímeros de ácido poliglicolico (PGA)-ácido 
polilactico-coglicolico (PLGA) 
Una vez que alcanzaron una confluencia del 80% los condrocitos de los 
primeros pasajes (del P2-P4) estimulados con los factores de crecimiento (IGF-
I, EGF, FGFb) y no estimulados (medio DMEM-F12 con SFB al 10%), fueron 
despegados del sustrato utilizando tripsina-EDTA (0.025%) por 10-12 min. Se 
colocaron en tubos Falcon de 50 mL por separado y fueron centrifugados por 
10 min. a 2000 r.p.m., el botón celular se resuspendió en PBS 1X y fueron 
lavadas una vez mas con PBS 1X frío. Finalmente, el botón celular se 
resuspendió en 500 μL de medio DMEM-F12 sin suero y se procedió a contar 
el numero de células con azul tripano (SIGMA). 
Previamente los polímeros PGA-PLGA fueron hidratados en condiciones de 
esterilidad con el medio DMEM-F12 sin suero en un recirculador (Glas-Col) por 
10-15 min., se retiró el medio y se eliminó lo mas que se pudo de la membrana 
succionando con una pipeta pasteur, los polímeros se colocaron en placas de 
petri (todo esto en condiciones de suma esterilidad) y se procedió a la siembra 
de los condrocitos. 
Se tomó del resuspendido celular los μL necesarios para sembrar 8.5 x 106 de 
cada uno de los tipo de condrocitos (elásticos y costales), tratados o no 
Neevia docConverter 5.1
 34 
tratados con los factores de crecimiento (IGF, EGF, FGF), se sembraron en 
cada polímero y se incubaron por 3 horas bajo condiciones estériles de 37ºC, 
humedad saturada, 5% de CO2. 
Posteriormente se adicionaron 10 mL de DMEM-F12 al 10% de SFB a cada 
una de las membranas por 24 horas. Al día siguiente se retiró el medio y se 
procedió a contar las células que no se adhirieron al polímero, y se colocaron 
las membranas en birreactores por separado, con una agitación muy suave y 
se cambio el medio cada tercer día, adicionándole en cada recambio la 
concentración adecuada de cada recombinante. 
Cada uno de los polímeros se dejó por 15 días en cultivo, posteriormente se 
sacaron del birreactor y se fijaron en formol para hacer cortes histológicos 
12) Cortes histológicos y citoquímica. 
Ya fijados las muestras en formol, se incluyeron en parafina,se realizaron 
cortes histológicos de 4 micras y el tejido se montó en portaobjetos y se 
procedió a teñirlos con Hematoxilina-eosina para observar su morfología y 
estructura, con Azul Alciano-Pas para detectar los mucopolisacaridos ácidos 
(totales), y la tricrómica de Mallory para observar la colágena (ver anexo). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Neevia docConverter 5.1
 35 
CARTILAGO HIALINO A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FACTORES DE CRECIMIENTO
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
P
B
S
M
E
D
IO
V
E
G
F 
5
V
E
G
F 
10
V
E
G
F 
20
IG
F
 5
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 1
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 2
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 5
E
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F
 1
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E
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 2
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T
N
F
 5
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 1
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T
N
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 2
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F
 5
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F
 1
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 2
0
F
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 5
F
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 1
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F
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 2
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Nanogramos / mL
P
R
O
L
IF
E
R
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C
IÓ
N
 (
D
.O
. 
5
9
5
 
n
m
)
 ٭ ٭ ٭
 ٭ ٭ ٭
7.- RESULTADOS 
CARTILAGO HIALINO Y ELASTICO CON DIFERENTES 
CONCENTRACIONES DE FCs. 
Para evaluar la capacidad de los FCs de estimular la proliferación de los 
condrocitos de cartílago hialino y elástico; en una primera parte fueron estimulados 
exógenamente con 10, 30 y 50ng/mL, observándose un efecto proliferativo con 
concentraciones de alrededor de 10 ng/mL (datos no mostrados), por lo que se 
decidió manejar concentraciones de entre 5, 10 y 20 ng/mL en los siguientes 
cultivos en monocapa, para conocer la concentración mas adecuada para su 
aplicación (ver Grafica 1 y 2). 
Los condrocitos fueron estimulados con VEGF, IGF-I, EGF, TNF-α, LIF y FGFb 
con diferentes concentraciones (ver materiales y métodos). Sólo el EGF y el FGFb 
estimularon la proliferación de los condrocitos, con 5, 10 y 20 ng/ml con una 
diferencia significativa proporcionada con la prueba de t-student con α = 5% y un 
95% de confianza, comparado con respecto al medio sin FCs (control) a los 7 días 
de cultivo in vitro (ver gráfica 1 y anexo). Además se determinaron las 
concentraciones óptimas para cada uno de los recombinantes, VEGF (5ng/ml), 
IGF-I (10 ng/ml), EGF (5 ng/ml), TNF-α (5 ng/ml), LIF (10 ng/ml) y FGFb (5ng/ml). 
Grafica 1. Efecto en la proliferación de los condrocitos del cartílago hialino con los factores 
de crecimiento. El símbolo * indica una diferencia significativa determinada por t-student 
con α=5%. 
Neevia docConverter 5.1
 36 
CARTILAGO ELASTICO A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FACTORES DE CRECIMIENTO.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
P
B
S
M
E
D
IO
V
E
G
F
 5
V
E
G
F
 1
0
V
E
G
F
 2
0
IG
F 
5
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F 
10
IG
F 
20
E
G
F
 5
E
G
F
 1
0
E
G
F
 2
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TN
F 
5
TN
F 
10
TN
F 
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LI
F 
5
LI
F 
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LI
F 
20
FG
F 
5
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F 
10
FG
F 
20
Nanogramos/mL
P
R
O
L
IF
E
R
A
C
IÓ
N
 (
D
.O
. 
5
9
5
 
n
m
)
 ٭ ٭ ٭
 ٭ ٭ ٭
 
También se puede apreciar en esta misma grafica que el FCs que ejerce un 
estimulo o un efecto mayor en la proliferación es el EGF, inclusive tiene un efecto 
de casi el doble que el ejercido por el FGFb. 
En el cartílago elástico (grafica 2), los FCs. que tuvieron un efecto en la 
proliferación con respecto al medio DMEM-F12 con SFB al 10% fueron el EGF y 
FGFb a 5, 10 y 20 ng/mL, lo cual fue muy semejante al cartílago hialino; además 
de estos FCs. los que ejercieron un estimulo, fueron el IGF-I a 20 ng/mL y el LIF a 
5 ng/mL; pero con la prueba de t-student no fueron significativos, nada mas el 
EGF y FGFb. También se observo que el FGF-2 a 5 y 20 ng/mL fue superior al 
FGF-2 a 10 ng/mL, pero la diferencia entre el de 5 y 20 ng/mL fue mínima por lo 
que se prefirió utilizar el de 5 ng/mL para la estimulación por ser menor 
concentración, y se establecieron las concentraciones óptimas para cada uno de 
los recombinantes, VEGF (20 ng/ml), IGF-I (20 ng/ml), EGF (5 ng/ml), TNF-α (10 
ng/ml), LIF (5 ng/ml) y FGFb (5ng/ml) (ver gráfica 3). 
 
Grafica 2. Efecto en la proliferación de los condrocitos del cartílago elástico con los 
factores de crecimiento. El símbolo * indica una diferencia significativa determinada por t-
student con α=5%. 
 
 
 
Neevia docConverter 5.1
 37 
ANDEVA PARA EL EFECTO DE LOS FCs A DIFERENTES 
CONCENTRACIONES SOBRE EL CARTILAGO HIALINO Y 
ELASTICO. 
Para esta evaluación, se plantearon dos hipótesis: 
 la hipótesis nula (H0) los dos cartílagos presentan el mismo efecto en la 
proliferación. H0 = μH = μE 
 la hipótesis alterna (Ha) los dos cartílagos no presentan el mismo efecto en 
la proliferación. Ha = μH ≠ μE 
 
[ ] 
FCs 
F. CALCULADA 
TNF FGFb EGF IGF-I LIF VEGF Medio 
sin FCs 
5 2.675 0.470 4.936* 0.008 0.109 3.598 1.573 
10 0.003 0.808 4.986* 6.044* 0.641 6.529* 
20 0.179 2.964 2.429 1.815 0.032 3.140 
F teórica (0.95,1,14) = 4.60 
 Tabla 4. El efecto de los FCs en la proliferación de condrocitos obtenidos del cartílago 
hialino y elástico. * Diferencia Significativa entre los 2 tipos de cartílago. 
 
En esta tabla se muestran las diferencias en cuanto a su proliferación entre los 
dos tipos de condrocitos (estimulados y no estimulados), y comparamos los 
valores de F calculada con respecto a la F teórica obtenida de la tabla A-7 de 
percentiles de la distribución F (F0.95). Puesto que Fcalc. > Fteor., se rechaza H0 y se 
acepta Ha, por lo que si hay diferencias significativas (al 5%), entre el cartílago 
hialino y el elástico cuando son estimuladas con el EGF a 5 y 10 ng/mL, IGF a 
10ng/mL y con el VEGF a 10 ng/mL; el EGF actúa o estimula mas la proliferación 
de los condrocitos del cartílago elástico, en comparación con los del cartílago 
hialino, aunado a que proliferan mas rápido los condrocitos de cartílago hialino que 
los condrocitos de cartílago elástico con medio sin FC. Así como también, el IGF-1 
y VEGF a 10 ng/mL estimulan más la proliferación de los condrocitos de cartílago 
hialino que los condrocitos de cartílago elástico. 
 
 
Neevia docConverter 5.1
 38 
CINETICA DE PROLIFERACION DEL CARTILAGO HIALINO Y 
ELASTICO. 
 
Ya determinada la concentración optima de cada FCs, se realizó una cinética de 
proliferación a 13 días (Graficas 3-6), además se comparo al EGF, IGF-I y FGFb 
con los que tienen un efecto catabólico en la MEC (LIF y TNFα). 
En la grafica 3 referente a los condrocitos del cartílago hialino, se corroboró que 
los mejores dos FCs, son el EGF y el FGF. El efecto proliferativo de estos dos, se 
comienza a observar desde el día 5 de cultivo, si comparamos con el resto de los 
FCs o el control (medio); además se observa que los condrocitos del cartílago 
costal (hialino) responden muy semejante ante el estimulo de los factores de 
crecimiento y este efecto también se observo en el cartílago elástico (grafica 5). 
Grafica 3. Evaluación de la cinética de proliferación del cartílago hialino por el MTT hasta 
el día 13. 
 
En la grafica 4 se observa que del día 1 al 5, el FC que aumenta mas la 
proliferación es el FGFb, y a partir del día 7 hasta el final el que ejerce un mayor 
estimulo es el EGF, aunque el que le sigue es el FGFb; también se puede 
observar que el FGFb, EGF, TNF-α y IGF tienen diferencias significativas en 
varios días con respecto al medio (barras con rayas en negro), determinada por t-
student con α=5% (ver anexo). 
 
CINÉTICA CARTILAGO HIALINO POR MTT
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
DIA 1 DIA 3 DIA 5 DIA 7 DIA 9 DIA 11 DIA 13
P
R
O
L
IF
E
R
A
C
IÓ
N
 (
D
.O
. 
5
9
5
 n
m
)
PBS
M EDIO
VEGF
IGF
FGF
LIF
TNF
EGF
Neevia docConverter 5.1
 39 
Grafica 4. Evaluación de la cinética de proliferación de condrocitos costales (cartílago 
hialino) por el MTT. 
 
En la grafica 5 se observa nuevamente que el EGF y FGFb ejercen un estimulo 
mayor en la proliferación que el control (medio) y otros FCs, aunque al día 11 el 
LIF y TNF-α también ejercen un efecto proliferativo un tanto menor al EGF y FGFb 
pero mayor al control. 
Grafica 5. Evaluación de la cinética de proliferación del cartílago elástico por el MTT hasta 
el día 13. 
 
CINÉTICA CARTILAGO ELÁSTICO POR MTT
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
DIA 1 DIA 3 DIA 5 DIA 7 DIA 9 DIA 11 DIA 13
P
R
O
L
IF