Estudo da mutação múltipla dos RNAs reguladores em Azotobacter vinelandii

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BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE PUEBLA 
INSTITUTO DE CIENCIAS 
CENTRO DE INVESTIGACIONES EN CIENCIAS MICROBIOLÓGICAS 
POSGRADO EN MICROBIOLOGÍA 
“Estudio del efecto de la mutación múltiple de 
los RNAs reguladores del sistema Rsm en la 
producción de alginato y PHB en Azotobacter 
vinelandii” 
 
TESIS 
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE: 
 
MAESTRA EN CIENCIAS (MICROBIOLOGÍA) 
CON OPCIÓN EN: BIOQUÍMICA Y GENÉTICA MICROBIANA 
 
PRESENTA: 
Biol. Araceli Rosales Cruz 
 
ASESOR DE TESIS: 
D. C. Miguel Castañeda Lucio 
PUEBLA, PUE. Enero, 2018 
Resumen 
El sistema de dos componentes GacS/A, ha sido estudiado ampliamente por ser un 
regulador maestro involucrado en la expresión de diversos metabolitos secundarios 
en numerosas bacterias Gram negativas de la subdivisión gamma. Este sistema está 
presente en la familia Pseudomonadaseae, a la cual pertenece Azotobacter 
vinelandii. El interés de estudio en esta bacteria se ha enfocado en su capacidad 
para producir polímeros de interés industrial como lo son el alginato y el poli-β-
hidroxibutirato (PHB). El sistema GacS/A regula la producción de estos polímeros. Al 
mutar alguno de los genes que codifican a las proteínas que componen este 
sistema, se abate la producción de ambos polímeros. Esta regulación no se 
establece de manera directa, sino a través de un sistema intermediario llamado 
Rsm. El sistema Rsm está constituido por la proteína RsmA que funge como represor 
traduccional de los transcritos de genes que codifican para enzimas clave en la 
síntesis de ambos polímeros. Además de la proteína RsmA el sistema Rsm posee dos 
o más pequeños RNAs reguladores (sRNAs). El sistema Rsm de A. vinelandii cuenta 
con el mayor número de sRNAs, nueve en total (ocho de la subfamilia RsmZ y uno 
de la subfamilia RsmY). Para realizar mutantes múltiples en estos genes, se tiene 
la dificultad de solo contar en A. vinelandii con cuatro marcadores de resistencia 
útiles. Por lo anterior, en este trabajo se adaptó e implementó una herramienta 
reportada originalmente en Burkholderia pseudomallei, con la cual se pueden 
realizar mutantes múltiples sin necesidad de mantener los marcadores de 
resistencia. El sistema Flp-FRT permite llevar a cabo mutaciones por remoción en las 
cuales se hace dispensable el marcador de selección una vez que lleva a cabo su 
función. Se logró demostrar la efectividad de la herramienta al obtener mutantes 
dobles en genes representativos de los rsm-sRNAs. Lo anterior nos permitió conocer 
un poco más del papel que realizan estos reguladores dentro de la compleja 
cascada de señalización GacS/A-Rsm en A. vinelandii. 
 
Contenido 
Resumen ................................................................................................................................ 2 
Introducción ......................................................................................................................... 7 
Los sistemas de dos componentes ................................................................................ 7 
El sistema GacS/A ............................................................................................................ 8 
El sistema Rsm.................................................................................................................... 9 
El género Azotobacter .................................................................................................. 11 
Azotobacter vinelandii .................................................................................................. 12 
Alginato ........................................................................................................................... 13 
Poli β hidroxibutirato(PHB) ............................................................................................. 14 
Regulación de la producción de alginato y PHB en A. vinelandii por el sistema 
Gac/Rsm .......................................................................................................................... 15 
Antecedentes ..................................................................................................................... 19 
Justificación ........................................................................................................................ 22 
Hipótesis ............................................................................................................................... 22 
Objetivos.............................................................................................................................. 22 
Material biológico .............................................................................................................. 23 
Resultados y discusión ....................................................................................................... 28 
Construcción de los plásmidos pUCΔrsmZ1::GmFRT y pUCΔrsmZ1::TcFRT ............ 30 
Construcción de los plásmidos pUCΔrsmZ2::GmFRT y pUCΔrsmZ2::TcFRT ............ 31 
Construcción de los plásmidos pGEMΔrsmZ3::GmFRT y pGEMΔrsmY::GmFRT ..... 33 
Construcción de los plásmidos pGEMΔrsmZ4::GmFRT y pGEMΔrsmZ6::GmFRT ... 34 
Construcción del plásmido pUCΔrsmZ5::GmFRT ....................................................... 35 
Construcción del plásmido pGEMΔrsmZ7::GmFRT .................................................... 36 
Obtención de la mutante de EΔrsmZ1 ....................................................................... 37 
Escisión del casete por efecto de la recombinasa FLP ............................................ 38 
Obtención de la mutante de EΔrsmZ2 ....................................................................... 43 
Obtención de la mutante de EΔrsmY ......................................................................... 44 
Obtención de la mutante de EΔrsmZ6 ....................................................................... 45 
Obtención de la mutante doble EΔrsmZ2ΔrsmZ1 ..................................................... 46 
Obtención de la mutante doble EΔrsmZ2ΔrsmY ....................................................... 47 
Obtención de la mutante doble EΔrsmZ1ΔrsmZ7::GmFRT ....................................... 48 
Producción de alginato en las mutantes EΔrsmZ2, EΔrsmY, EΔrsmZ2ΔrsmZ1, 
EΔrsmZ2ΔrsmY yEΔrsmZ1ΔrsmZ7. .................................................................................. 49 
Producción de PHB en las cepas mutantes dobles, EΔrsmZ2ΔrsmZ1, 
EΔrsmZ2ΔrsmY y EΔrsmZ1ΔzrmZ7. ................................................................................. 51 
Conclusiones ....................................................................................................................... 53 
Perspectivas ........................................................................................................................ 53 
Anexos ................................................................................................................................. 54 
Antibióticos ...................................................................................................................... 55 
Condiciones de cultivo ................................................................................................. 55 
Técnicas ........................................................................................................................... 55 
Extracción plasmídica por lisis alcalina ................................................................... 55 
Extracción plasmídica por perclorato ..................................................................... 56 
Extracción plasmídica Maxi Prep ............................................................................. 56 
Extracción de fragmento de ADN a partir de gel de agarosa ........................... 56 
Precipitación de DNA por glucógeno..................................................................... 57 
Reacciónde ligación ................................................................................................ 57 
Preparación de células electro-competentes de E. coli DH5α ........................... 57 
Preparación de células quimio-competentes de E. coli DH5α ........................... 58 
Técnica de transformación por electroporación .................................................. 58 
Técnica de transformación con células quimiocompetentes ............................ 58 
Preparación de células competentes de A. vinelandii ........................................ 58 
Transformación en células de A. vinelandii ............................................................ 59 
Extracción de DNA genómico .................................................................................. 59 
Cuantificación de alginato por el método del Carbazol .................................... 59 
Bibliografía .......................................................................................................................... 61 
 
 
Figura 1. Esquema general del mecanismo funcional de los sistemas de dos 
componentes (SDC) ............................................................................................................ 8 
Figura 2. Mecanismo de acción del sistema GacS/A .................................................... 9 
Figura 3. Interacción de CsrA con la estructura de tallo de los RNAs ....................... 10 
Figura 4. Conformación que adquiere RsmZ, para proteger los sitios que reconoce 
la RNAsa E que induce su degradación ........................................................................ 11 
Figura 5. Micrografía donde se muestra la diferencia de tamaño entre una célula 
de A. vinelandii (A) con la de E. coli (B). ........................................................................ 12 
Figura 6. Micrografía electrónica del quiste de A. vinelandii ...................................... 13 
Figura 7. Estructura química del alginato ....................................................................... 14 
Figura 8. Micrografía electrónica de células de A. vinelandii que contienen 
gránulos de PHB ................................................................................................................. 15 
Figura 9. Metabolismo de la producción de alginato y PHB en A. vinelandii .......... 16 
Figura 10. Estructuras secundarias de los sRNAs del sistema Rsm de A. vinelandii . 17 
Figura 11. Expresión de los sRNAs de la familia Rsm en medio BS líquido a 30 °C en 
agitación 200rpm. .............................................................................................................. 20 
Figura 12. Producción de alginato en las mutantes de los sRNAs de la familia Rsm.
 .............................................................................................................................................. 20 
Figura 13. Mapa de vector pFZE1, que contiene casete de resistencia a zeocina 
(ble) flanqueado por las secuencias FRT, ...................................................................... 28 
Figura 14. Corrimiento electroforético de fragmentos de ADN usados para 
construir los plásmidos pFZEGm. ...................................................................................... 29 
Figura 15. Verificación de las construcciones pFZEGm y pFZETc por digestión con 
las enzimas SalI y BamHI .................................................................................................... 30 
Figura 16. Construcción del pUCΔrsmZ1::GmFRT. ......................................................... 30 
Figura 17. Construcción de pUCΔrsmZ1::TcFRT. ............................................................. 31 
Figura 18. Construcción de pUCΔrsmZ2::GmFRT. .......................................................... 32 
Figura 19. Construcción de pUCΔrsmZ2::TcFRT. ............................................................. 32 
Figura 20. Generación de los plásmidos pGEMΔrsmZ3::Gm y pGEMΔrsmY::Gm. .... 33 
Figura 21. Generación de los plasmidos pGEMΔrsmZ4::Gm y pGEMΔrsmZ6::Gm. .. 34 
Figura 22. Generación el plásmido pUCΔrsmZ5::Gm. .................................................. 36 
Figura 23. Construcción del plásmido pGEMΔrsmZ7::GmFRT ...................................... 37 
Figura 24. A) Diagrama del análisis de comprobación por PCR de las mutantes 
rsmZ1. B) Análisis por PCR para verificar la mutación del gen rsmZ1. ........................ 38 
Figura 25. Mapa del vector pFLPe4. ................................................................................ 39 
Figura 26. Análisis por PCR para la verificación de la presencia del plásmido 
pFLPe4 en las mutantes rsmZ1 de A. vinelandii. ............................................................ 40 
Figura 27. Ensayo de contra-selección para obtener las mutantes de rsmZ1 sin el 
casete de resistencia. ....................................................................................................... 40 
Figura 28. Anailisis por PCR que demuestra la pérdida del casete GmFRT en la 
mutante rsmZ1 .................................................................................................................... 41 
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file:///C:/Users/Usuario/Dropbox/Azotobacter/Tesis%20revisada%20enero.docx%23_Toc503430544
file:///C:/Users/Usuario/Dropbox/Azotobacter/Tesis%20revisada%20enero.docx%23_Toc503430545
file:///C:/Users/Usuario/Dropbox/Azotobacter/Tesis%20revisada%20enero.docx%23_Toc503430545
file:///C:/Users/Usuario/Dropbox/Azotobacter/Tesis%20revisada%20enero.docx%23_Toc503430559
file:///C:/Users/Usuario/Dropbox/Azotobacter/Tesis%20revisada%20enero.docx%23_Toc503430559
Figura 29. Mapa del locus rsmZ1 silvestre, del locus con la mutación por inserción 
del casete, y del locus donde se removió el casete.................................................... 41 
Figura 30. Análisis por PCR que comprueba la pérdida del plásmido pFLPe4 en las 
mutantes rsmZ1 ................................................................................................................... 42 
Figura 31. Obtención de la mutante rsmZ2. ................................................................... 43 
Figura 32. Obtención de la mutante en rsmY. ............................................................... 44 
Figura 33. Obtención de la mutante en rsmZ6. ............................................................. 45 
Figura 34. Obtención de la mutante doble EΔrsmZ2ΔrsmZ1::GmFRT. ........................ 46 
Figura 35. Obtención de la mutante doble EΔrsmZ2ΔrsmY::GmFRT. ......................... 47 
Figura 36. Obtención de la mutante doble EΔrsmZ2ΔrsmZ7::GmFRT. ........................ 48 
Figura 37. Efecto de compensación de la expresión de rsmZ1 en mutantes rsmY y 
de la expresión de rsmY en una mutante rsmZ1. .......................................................... 50 
Figura 38. Cuantificación de alginato en mutantes de los sRNAs de la familia Rsm
 .............................................................................................................................................. 51 
Figura 39. Cuantificación de PHB en mutantes de los sRNAs de la familia Rsm ....... 52 
ICUAP - MICROBIOLOGÍA Enero 2018 
 
 7 
Introducción 
Los sistemas de dos componentes 
Los microorganismos tienen la capacidad de responder a cambios en su ambiente 
para poder adaptarse y sobrevivir, logrando así, perpetuar la especie. Existen 
numerosos sistemas de señalización con los que cuentan los microorganismos para 
generar una respuesta específica a los diversos estímulos a los que se enfrentan. 
Unos de estos sistemas es el denominado “sistema de dos componentes” (SDC) 
presente en organismos de los reinos Procariota como Eucariota. La forma en que 
actúan se da por circuitos moleculares que detectan y amplifican señales 
específicas, permitiendo la generaciónde respuestas particulares (Barba-Ostria, 
2014). 
El proceso de señalización se establece mediante la fosforilación sucesiva de 
proteínas, una proteína que detecta la señal y una efectora que responde a la 
señal. La primera se fosforila en un residuo conservado de histidina y la segunda en 
un residuo de aspartato. La primera proteína es una cinasa histidínica (HK) que 
cuenta con un dominio de entrada que reconoce las señales presentes el medio 
ambiente en búsqueda de señales. En cuanto la señal es detectada, la cinasa, que 
funciona como dímero, se fosforila mediante una fosforilzación cruzada. Para 
realizar la fosforilación, las HK poseen un dominio catalítico y uno de unión al ATP 
(CA) donde se encuentra la histidina conservada, vecino a este dominio se 
encuentra un dominio DHp el cual promueve la dimerización (Capra & Laub, 2012) 
(Figura1). 
El grupo fosfato es transmitido al segundo componente del sistema que es 
conocido como regulador de respuesta (RR). Éste posee un dominio receptor del 
fosfato (REC) en su extremo N-terminal, donde está presente el residuo conservado 
de aspartato. En su extremo C-terminal el RR posee un dominio efector o de salida 
que es activado por la fosforilación de la proteína en el dominio REC. En la mayoría 
de los RR el dominio efector puede interactuar directamente con el ADN actuando 
como regulador transcripcional. La fosforilación del RR provoca un cambio 
conformacional que le permite dirigirse a sus genes blanco ya sea para reprimir o 
activar su expresión (Barba-Ostria, 2014). 
 
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 8 
 
Figura 1. Esquema general del mecanismo funcional de los sistemas de dos componentes (SDC) 
(modificado de Capra & Laub, 2012). 
En muchos casos, las HK realizan dos funciones, de manera que cuando no reciben 
señal para autofosforilarse actúan como fosfatasas con sus RR, por lo tanto, la 
relación de cinasa/fosfatasa está relacionada con la modulación de la respuesta 
de salida. En algunos casos las señales de entrada pueden promover el estado de 
fosfatasa en lugar de estimular la autofosforilación (Capra & Laub, 2012). 
El sistema GacS/A 
Un sistema de dos componentes presente en diversas bacterias Gram-negativas es 
el sistema Gac S/A, conocido también como BarA/UvrY en E. coli, VarS/VarA en 
Vibrio cholerae, BarA/SirA en Salmonella y LetS/LetA en Legionella (Brencic et al., 
2009). En E. coli este SDC está relacionado con la regulación de metabolismo 
primario de carbono, en tanto en Vibrio, Salmonella y Legionella controla la 
producción de factores de virulencia (Vakulskas et al. 2014). En Psedomonadaceas 
los sistemas GacS/A ortólogos controlan de manera genérica metabolitos 
secundarios (Lapouge et al, 2008). 
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 9 
El primer componente del sistema GacS es una cinasa híbrida o multidominios las 
que además del dominio CA (también llamado H1), poseen dos dominios extras de 
fosforilación: un dominio receptor REC (también llamado D1) y un dominio llamado 
Hpt o H2. En estas cinasas la transferencia del fosfato se da secuencialmente del 
dominio CA (H1) al REC (D1) y de este al Hpt (H2), el cual transfiere el fosfato al 
dominio REC del RR GacA (Figura 2). 
 
Figura 2. Mecanismo de acción del sistema GacS/A (Heeb & Haas, 2001). 
El sistema Rsm 
De manera general los genes cuya expresión está regulada por el sistema GacS/A 
son controlados por un sistema intermediario llamado Rsm. En el sistema Rsm 
participan dos o más RNAs reguladores pequeños (sRNAs), de entre los 100 y 500 
nucleótidos (Duss et al., 2014). Los sRNAs de la familia Rsm juegan papeles como 
regulador positivo contrarrestando la actividad represora del segundo 
componente del sistema la proteína RsmA (represor del metabolismo secundario, 
por sus siglas en inglés)(Romeo, 1998). Los ortólogos RsmA, llamados CsrA en 
enterobacterias, son proteínas pequeñas de 7 kDa (Heeb et al., 2006). Las proteínas 
RsmA/CsrA se unen a RNAs mensajeros blanco, bloqueando su unión al ribosoma y 
promoviendo su degradación. En presencia de los sRNAs de la familia Rsm la 
proteína RsmA es inactivada al ser secuestrada por los sRNAs (Vakulskas et al., 2016). 
Los sRNAs interactúan con RsmA (CsrA) gracias a su estructura secundaria en forma 
de tallos y asas bastante estables (Figura 3). La interacción con la proteína RsmA la 
realizan motivos GGA, los cuales se encuentran en las asas de las estructuras 
secundarias de tallo y asa (Dubey et al., 2005). 
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 10 
 
Figura 3. Interacción de CsrA con la estructura de tallo de los RNAs (Mercante et al., 2009). 
La interacción que llega a realizar esta proteína con los sRNAs es muy específica y 
ordenada que puede ser entendida como una estructura de protección, ya que 
los sRNAs llegan a formar una estructura muy estable de forma de “esponja” que 
los protege de la degradación a causa de la RNAsa E a la vez que secuestra a 
RsmA (Duss et al., 2014)(Figura 4). La interacción de los sRNAs con RsmA se 
establece por medio de sus motivos GGA caracterizados en esta familia de 
reguladores, los cuales son similares a los sitios que reconoce RsmA (Lapouge, et al., 
2008). En la estructuración de la esponja se propone que también interactúan los 
sRNAs de las diferentes familias Rsm, de tal manera que algunas moléculas podrían 
favorecer la interacción con RmA, mientras que otras posiblemente la 
desfavorezcan. Al co-existir dos o más subtipos de sRNAs de la familia se podrían 
generar esponjas distintas con características diferenciales. También se especula 
que la estequiometria entre los componentes de la esponja podría tener injerencia 
en la funcionalidad de ésta. 
La proteína RsmA de Y. enterocolitica 8081 se ha podido cristalizar y con ello se ha 
establecido que se trata de un monómero compuesto por cinco hojas β y un α- 
hélice que funcionalmente actúa como dímero. 
Comparando las secuencias proteicas de los homólogos de RsmA en 
Pseudomonas spp. se encontró una identidad de entre 75 y 85%, algo similar ocurre 
con la proteína CsrA de E. coli (Heeb et al., 2006). 
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En E. coli, CsrA regula la utilización de fuentes de carbono, síntesis de glucógeno, 
formación de biopelícula y movilidad, mientras que en Erwinia carotovora, el 
homólogo CsrA/RsmA controla la expresión de enzimas extracelulares y el sistema 
de secreción del tipo III relacionado con la interacción de este patógeno con la 
planta (Romeo et al., 2013). En el caso de P. fluorescens que cuenta con dos 
proteínas homologas (RsmA y RsmE), éstas se encargan de regular negativamente 
la síntesis de metabolitos secundarios extracelulares antifúngicos (Kay et al., 2005). 
En E. coli, los niveles de CsrA aumentan a medida que las células experimentan la 
transición de la fase exponencial a fase estacionaria (Vakulskas et al., 2016). Este 
sistema también se ha reportado en Azotobacter encontrando que participa 
regulando la producción de los polímeros PHB y alginato (Hernandez-Eligio et al., 
2012). 
 
Figura 4. Conformación que adquiere RsmZ, para proteger los sitios que reconoce la RNAsa E que 
induce su degradación (Duss et al., 2014) 
El género Azotobacter 
El género de Azotobacter pertenece al grupo de las bacterias Gram-negativas, es 
una gama-proteobacteria ubicada en la familia Pseudomonadaceae. Esta 
bacteria es grande mostrando formas de cocos o bacilos. El tamaño de las células 
puede ser de 2 nm o más de diámetro y 4 nm de longitud, es decir puede llegar a 
ser 5 veces mayor que E. coli (Figura 5). Presenta movilidad gracias a sus flagelos 
perítricos. Fija nitrógeno en condiciones aerobias, con un tipo de metabolismo 
estricto usando oxígeno como aceptor final de electrones, aunque también puede 
crecer en bajas tensiones de oxígeno. Puede ajustar sus tasas de consumo de 
oxígeno manteniendo los niveles bajos en el citoplasmaayudando a la protección 
de sus nitrogenasas para llevar a cabo la fijación del nitrógeno (Segura et al., 2014). 
Otra característica de este género es la capacidad de diferenciarse morfológica y 
fisiológicamente durante la fase estacionaria o bajo condiciones ambientales 
adversas formando quistes resistentes a la desecación. Cada uno de éstos quistes 
proviene de una célula vegetativa. Una vez que entran al proceso de 
diferenciación, las células vegetativas llevan a cabo una última división celular y 
pierden el flagelo, de 24 a 36 horas después entran en una etapa de 
compactación, comenzando a redondearse hasta una forma casi esférica (Figura 
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 12 
6), la forma diferenciada le proporciona la ventaja de sobrevivir hasta por 10 años, 
aunque existen reportes que puede resistir hasta 24 años en suelos secos (Segura et 
al., 2014). 
Tres de los componentes más interesantes de los quistes por su abundancia y 
funciones estructurales son el polisacárido alginato, el poliéster PHB y los lípidos 
fenólicos alquilresorcinoles (ARs) y alquilpironas (APs)(Romero et al., 2016). 
 
 
Figura 5. Micrografía donde se muestra la diferencia de tamaño entre una célula de A. vinelandii (A) 
con la de E. coli (B). 
 
Azotobacter vinelandii 
Entre las especies del genero más estudiadas se encuentra A. vinelandii, por su 
crecimiento aerobio obligado y sus altos niveles de expresión de sus nitrogenasas 
(Dos Santos, 2011). Una propiedad interesante de A. vinelandii es la capacidad que 
tiene de producir dos polímeros que han impactado a nivel industrial, los cuales son 
el alginato y el PHB. Se ha reportado que ambos polímeros están involucrados en 
el proceso de enquistamiento; el alginato es un componente de la capsula del 
quiste y la acumulación de PHB se correlaciona con la frecuencia de formación de 
éste (Castañeda et al., 2000). 
A. vinelandii es una bacteria poliploide, es decir posee varias copias de su 
cromosoma, se ha reportado que pueden tener hasta 80 copias(Nagpal et al., 
1989). Con la secuenciación de la cepa DJ, se encontró que contiene un 
cromosoma simple de 5 365 318 bp con un contenido de GC de 65.7% y que 
codifica para aproximadamente 5051 proteínas (Segura et al., 2014). 
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Figura 6. Micrografía electrónica del quiste de A. vinelandii 
Alginato 
El alginato es un copolímero lineal compuesto de β-d- ácido mannuronico (M) y su 
C-5 epímero el α-L- ácido gulurónico (G) unidos por enlaces β1-4. La distribución y 
contenido de los monómeros puede ser muy variada y va desde cadenas con 
secuencia alternas MGMGMG ó bloques MMMGGGMMM (Figura 7), en las que el 
número de monómeros en los bloques es también muy variable. Esto llega a 
suceder por la variación del medio en el que se crecen, así como la presencia de 
iones como el calcio; cuando es agregado al medio en bajas cantidades, el 
alginato producido contiene sólo una pequeña proporción de ácido 
gulurónico(Larsen & Haug, 1971). 
La producción de alginato en A. vinelandii se inicia con el sustrato fructosa 6-fosfato 
la cual es convertida en ácido GDP manurónico después de cuatro reacciones 
enzimáticos y es polimerizado a nivel de la membrana interna. Por último, una 
acetilasa modifica el ácido polimanurónico y éste es secretado. Ya en el exterior 
celular, los residuos de manuronato no acetilados son epimerizados convirtiéndolos 
en guluronato, dando término así a la síntesis del polímero (Figura 9). Es importante 
aclarar que la síntesis de alginato no solamente se da en la fase latente; en la fase 
vegetativa la síntesis también es importante ya que el polímero forma parte 
importante en la formación de biopelículas además de formar una barrera física 
que protege a la bacteria de la difusión de metales pesados y oxígeno. En el quiste, 
el alginato forma parte estructural de las cubiertas protectoras de la célula, 
llamadas exina e intina (Segura et al., 2003). La exina es rica en secuencias de GG, 
Proporcionando una estructura más rígida en la unión a iones de calcio. En el caso 
de la intina, la predominancia es en la presencia de MG o MM (Clementi, 1997). 
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El alginato en la actualidad tiene muchas aplicaciones industriales, tales como 
agente estabilizador, espesante y gelificante. Inicialmente, fue descubierto en el 
patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa y en A. vinelandii. Posteriormente, 
se investigó la producción de alginatos en Azotobacter chroococcum Psedomonas 
fluorescens, Psedomonas putida y Psedomonas syringae (Clementi, 1997). 
A. vinelandii mantiene un cluster de genes biosínteticos similar al presente en P. 
aeruginosa, pero organizada en cuatro (hasta ahora descritos) unidades 
transcripcionales regidas por diferentes promotores (Mejıa-Ruiz et al., 1997). 
 
Figura 7. Estructura química del alginato 
 
Poli β hidroxibutirato(PHB) 
El PHB es un polímero considerado amigable al ambiente por ser biodegradable 
puesto que no es producido a partir de productos petroquímicos, siendo 
esencialmente las bacterias quienes llevan a cabo su síntesis. Su producción a nivel 
industrial inició en los años 90, pero su comercialización no ha llegado a ser exitosa 
debido a la imposibilidad de disminuir costos de producción. Sin embargo sus 
propiedades fisicoquímicas compiten con las del polietileno y polipropileno, 
agregando la ventaja de poderse degradar en tiempos más cortos a diferencia de 
éstos, que son derivados del petróleo (Akiyama et al., 2003). 
Este polímero pertenece al grupo de los PHAs (poli-hidroxialcanoatos) que son 
termoplásticos de ácidos alcaniocos sintetizados y almacenados como reserva de 
carbono y energía en diversas bacterias bajo una condición limitante de 
crecimiento y un exceso de fuente de carbono. La forma de almacenamiento se 
da en gránulos citoplasmasmáticos con un diámetro de 0.2 a 0.5 µm. Estos gránulos 
pueden verse por microscopía de contraste de fases usando los colorantes 
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liposolubles negro Sudan o rojo de Nilo (Figura 8), siendo el PHB el más estudiado de 
este grupo de polímeros (Urtuvia et al., 2014). 
 
 
Figura 8. Micrografía electrónica de células de A. vinelandii que contienen gránulos de PHB (Peña, et 
al., 2014). 
La vía de biosíntesis de (3BH), inicia con la condensación de dos moléculas de 
acetil-CoA para formar acetoacetyl-CoA. La enzima que cataliza esta reacción es 
la 3-cetotiolasa, codificada por el gen phbA. Una acetoacetil-CoA reductasa, 
codificada por el gen phbB, convierte el acetoacetyl-CoA en 3-hidroxibutiril-CoA 
usando como cofactor el NADPH. Finalmente la enzima codificada por el gen 
phbC, una PHA sintasa, es la que polimeriza los monómeros de 3-hidroxibutiril-CoA 
a P(3HB) liberando CoA (Figura 9) (Peña et al., 2014). 
Estos genes están agrupados en el cluster phbBAC, vecino a este se encuentra el 
gen phbR, cuyo producto actúa como activador de este operón (Peralta-Gil et al., 
2002). Se ha reportado que la acumulación de PHB en Azotobacter se produce 
principalmente en condiciones de limitación de oxígeno, debido al aumento de las 
proporciones de NADPH+ / NADP y acetil-CoA / CoA, que promueven la biosíntesis 
de PHB (García et al., 2014). 
Regulación de la producción de alginato y PHB en A. vinelandii por el 
sistema Gac/Rsm 
En A. vinelandii los genes esenciales en las rutas de biosíntesis tanto del alginato 
como del PHB están relacionados con el metabolismo central por los intermediarios 
que ingresan a ambas vías (figura 9). Inicialmente la regulación reportada para 
ambos polímeros que se conoció fue transcripcional, siendo uno de los reguladores 
principales el gen codificado por algU (σE). Este factor sigma regula la transcripción 
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 16 
de uno de los promotores del gen algD que codifica para la enzima GDP-manosadeshidrogenasa, la enzima para la síntesis del alginato 
 
Figura 9. Metabolismo de la producción de alginato y PHB en A. vinelandii (Galindo et al., 2007). 
(Mejıa-Ruiz et al., 1997). En el caso del gen algD, además del promotor descrito, se 
sabe que están presentes otras dos secuencias promotoras, de una de ellas aún no 
se conoce que factor sigma lo reconoce, y la segunda es reconocida por un factor 
σS. Para el caso de PHB, el operón biosintético phbBAC es transcrito a partir de dos 
promotores: uno de ellos σE dependiente y otro de naturaleza desconocida. Para 
establecer una transcripción eficiente del operón, se requiere del activador 
transcripcional PhbR, el cual al mismo tiempo está regulado por el factor σS (Peralta-
Gil et al., 2002). Además de estos reguladores transcripcionales, existe una cascada 
de regulación de carácter post-transcripcional donde participan los sistemas 
Gac/Rsm. Para el caso del alginato, originalmente se reportó la participación del 
sistema GacS/A en el control de la transcripción del gen algD (Castañeda, et al., 
2001). En el caso del PHB de manera similar se reportó que GacS/A estaba 
involucrado en la regulación de la transcripción de los genes phbR y phbB, 
(Hernandez-Eligio et al., 2011; Hernandez-Eligio et al., 2012). 
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 17 
 
La manera en que el sistema GacS/A regula la transcripción de los genes algD, 
phbR y phbB es similar a como actúa en otras gamma-proteobacterias. Como se 
mencionó, en general, los homólogos GacS/A controlan indirectamente a sus 
blancos regulando al sistema de control post-transcripcional Rsm. Lo anterior se hizo 
 
 
 
Figura 10. Estructuras secundarias de los sRNAs del sistema Rsm de A. vinelandii (Castañeda et al., 
2016) 
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 18 
 
evidente al identificar y probar la funcionalidad de secuencias de unión de RsmA 
en los mRNAs de los genes algD(Manzo et al., 2011), phbBAC y phbR (Hernandez-
Eligio et al., 2012). De esta forma, en A. vinelandii, RmsA impide que los mensajeros 
de algD, phbBAC y phbR sean traducidos inhibiendo así la producción de los 
polímeros. Cuando la síntesis de ambos polímeros es requerida se expresan los 
sRNAs de la familia Rsm que constituyen los segundos componentes del sistema. En 
A vinelandii se ha reportado la presencia de nueve genes que codifican para estos 
sRNAs (Figura 10) (Castañeda et al., 2016; Manzo et al., 2011). 
La transcripción de los sRNAs-rsm está controlada por GacA, lo que inicialmente se 
evidenció al encontrar secuencias altamente conservadas de la caja GacA 
(TGTAAGN6 CTTACA) en las regiones reguladoras de los genes sRNAs-rsm, de 
acuerdo a lo anterior, en ausencia de GacA su transcripción disminuye (Hernandez-
Eligio et al., 2012). Los datos anteriores indican una cascada de la regulación donde 
GacS/A regulan al sistema Rsm y este a su vez, regula a nivel post-trasncripcional la 
expresión de los genes algD, phbR y phbB. 
 
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 19 
Antecedentes 
Originalmente se reportó en A. vinelandii que el sistema Rsm estaba constituido por 
dos RNAs reguladores, llamados RsmZ1 RsmZ2 y un regulador homólogo a RsmA, 
donde GacA controlaba directamente la expresión de los sRNA. Mutantes sencillas 
y dobles en los genes rsmZ1 y rsmZ2 presentan una disminución significativa en la 
síntesis de alginatos (Manzo et al., 2011). La mutante doble rsmZ1rsmZ2 de la cepa 
mucoide E está afectada en la producción de alginatos (tiene una disminución de 
cerca del 70%) como se observó en las mutantes sencillas rsmZ1 y rsmZ2 pero no 
como la mutante gacA que prácticamente no produce polímero, lo cual sugirió la 
existencia de alelos adicionales de los sRNA´s que podrían estar supliendo la 
función de los dos ausentes. Ante esta presunción se realizaron nuevas búsquedas 
exhaustivas en las regiones intergénicas del genoma de A. vinelandii 
encontrándose siete alelos adicionales a los que se les llamó RsmZ3, RsmZ4, RsmZ5, 
RsmZ6, RsmZ7, RsmZ8 y RsmY, que en conjunto con RsmZ1 y RsmZ2, convirtieron a A. 
vinelandii en la bacteria con más sRNA´s (nueve en total) de la familia Rsm 
reportados (Figura 10) (Romero et al., 2016). 
El estudio de cada uno de los sRNAs se inició con la finalidad de comprender qué 
papel juegan en la cascada de regulación. En primera instancia, se generaron 
mutantes en cada uno de los sRNAs (rsmZ3, rsmZ4, rsmZ5, rsmZ6, rsmZ7, rsmZ8 y rsmY) 
en las que al medir la producción de alginatos ninguna de ellas mostró una 
afectación semejante a la de la mutante gacA (Figura 12). Las mutaciones en 
rsmZ3, rsmZ4 y rsmY, disminuyeron la producción de alginato. En contraste, las 
mutaciones en rsmZ5, rsmZ6 y rsmZ7, aumentaron la producción de alginato 
(Figura 12) (López–Pliego 2014, datos no publicados). Una de las posibles 
explicaciones a este hecho podría ser que estos sRNAs no se expresaran en las 
condiciones estudiadas. Para probar lo anterior se construyeron fusiones 
transcripcionales gusA en cada uno de los genes que codifican para los sRNAs. Las 
fusiones rsm-gusA generadas, fueron útiles para establecer que todos sRNAs de la 
familia Rsm se expresan en las condiciones que favorecen la producción de 
alginatos, lo cual rechazaba la hipótesis planteada (Figura 11). Otra explicación 
podría ser que los sRNAs RsmZ3, RsmZ4, RsmZ5, RsmZ6, RsmZ7, RsmZ8 y RsmY tuvieran 
un efecto regulador aditivo que en conjunto con RsmZ1 RsmZ2 contrarrestarían la 
función de RsmA. Si lo anterior fuera correcto, entonces una mutante múltiple que 
no expresara ningún sRNA Rsm tendría un fenotipo similar a la mutante gacA. 
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 20 
 
Figura 11. Expresión de los sRNAs de la familia Rsm en medio BS líquido a 30 °C en agitación 200rpm 
(López–Pliego 2014, datos no publicados). 
 
Figura 12. Producción de alginato en las mutantes de los sRNAs de la familia Rsm. (López–Pliego 
2014, datos no publicados). 
Otra estrategia seguida en el estudio de los sRNAs fue estudiar la sobre-expresión 
de cada uno de los sRNAs en una mutante gacA, donde no se expresa ninguno de 
ellos. En el primer intento por llevar a cabo esta estrategia, los genes estructurales 
se colocaron bajo el promotor tac. Sin embargo, no fue posible tener resultados 
claros al respecto, ya que la expresión de los genes fue muy baja (Isidro – Coxca, 
2015). Lo anterior influyó en buscar el uso de un promotor más fuerte con una 
expresión constitutiva para lograr una producción mayor de los RNAs que 
condujera a la restauración de los fenotipos afectados en una mutante gacA. El 
promotor elegido fue el promotor del gen gyrA, nativo de A. vinelandii, con el que 
finalmente se pudo estudiar el efecto de los genes rsmZ1, rsmZ2, rsmZ6 y rsmY. Como 
se esperaba, la sobre-expresión restauró la producción de alginato en una mutante 
gacA, confirmando la participación de dichos genes como blanco final de la 
cascada de señalización Gac/Rsm involucrada en la síntesis de alginato, aunque 
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 21 
no explica de manera clara como sucede finamente el mecanismo de regulación, 
ya que el sistema se sobresatura y no se conoce realmente cuantas copias de 
cada uno de los sRNAs estudiados está interactuando con RsmA (May-Compañ, 
2016). Para profundizar en estos aspectos sería necesario generar una herramienta 
molecular que permitiera realizar una expresión controlada de los distintos sRNAs, 
de tal manera que se pudiera determinar con fines de comparación los niveles de 
inductor de expresión necesarios para detectar un efecto en la regulación. Lo 
anterior se podría realizar mediante el uso de un promotor manipulable en su 
inducción. 
Una estrategia para estudiar los sRNAs en conjunto, se reportó en P. fluorescens 
CHA0 donde también el sistema GacS/A controla la producción de antibióticos y 
compuestos para el control biológico de hongos patógenos de plantas.GacS/A 
igualmente, tiene como sistema intermediario a Rsm, donde RsmA junto con su 
homólogo RsmE reprimen la traducción de genes de biocontrol en dicha cascada. 
En este microrganismo los sRNAs del sistema Rsm son RsmY, RsmZ y RsmX. La 
mutación simultanea de los tres genes resulta en una baja expresión de los genes 
blanco, similar a lo que sucede en las mutantes gacA o gacS (Kay et al., 2005). 
Como ya fue mencionado, una alternativa interesante de estudio sería realizar la 
mutación de cada uno de los genes de los sRNAs en una sola célula. Para alcanzar 
lo descrito sería necesaria una herramienta que permitiera llevar a cabo 
mutaciones por remoción del gen sin la necesidad de mantener el marcador de 
resistencia, ya que por su multi-resistencia únicamente se pueden utilizar cuatro 
marcadores en la bacteria, así que manteniendo el marcador de resistencia no se 
pueden generar más allá de mutantes cuádruples. 
Una herramienta útil para generar mutaciones por remoción en las que se evita el 
uso de genes de resistencia es la herramienta Flp-FRT que se ha reportado en 
Burkholderia pseudomallei, la cual de manera similar a A. vinelandii es una bacteria 
multi-resistente a diversos antibioticos. Parte de esta herramienta es un plásmido 
que contiene un marcador de resistencia útil en esta bacteria (Zeocina) 
flanqueado por secuencias FRT, estas secuencias son sitios de recombinación 
reconocidas por la recombinasa Flp, una vez reconocida la secuencia FRT por Flp 
en casete de resistencia es escindido dejando libre de éste el fragmento de DNA 
que presentaba la inserción del marcador de resistencia. Otra parte del sistema es 
un plásmido que porta el gen que codifica la recombinasa Flp bajo el control del 
promotor PBAD regulado por ramnosa. Además este plásmido tiene un origen de 
replicación sensible a temperatura, es conjugativo y de amplio rango de 
hospedero (Choi et al., 2008). El promotor Prha requiere de dos reguladores, 
codificados por los genes rhaR y rhaS los cuales también están presentes en el 
vector. 
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 22 
Justificación 
El estudio de la cascada de regulación GacS/A-Rsm forma parte de una vía de 
transducción de señales y control genético en bacterias Gram negativas de la 
subdivisión γ que en los años recientes ha cobrado gran relevancia. Los estudios 
realizados hasta el momento han podido caracterizar las diversas subfamilias de los 
sRNAs del sistema Rsm; esto se ha llevado poco a poco generando mutantes de 
cada uno de estos genes. Sin embargo, A. vinelandii presenta el mayor número de 
isoformas de estos reguladores, nueve en total, dificultando su estudio por los 
métodos tradicionales de mutación, donde se deba mantener un marcador de 
selección. Por tal motivo, surge la necesidad de generar una herramienta donde 
nos permita realizar mutantes de más de un regulador sin necesidad de estar 
presente algún marcador de selección, como lo es la herramienta Flp-FRT 
reportada en Burkholderia pseudomallei. De esta forma poder estudiar el efecto en 
conjunto de los sRNAs del sistema Rsm dentro de dicha regulación, teniendo un 
impacto directo en el entendimiento del papel de la cascada en la regulación del 
metabolismo secundario de A. vinelandii.Hipótesis 
Es posible la generación de mutantes sencillas dobles o hasta múltiples de los genes 
sRNAs-rsm en A. vinelandii mediante el uso de un sistema de escisión de marcadores 
Flp-FRT. 
Objetivos 
General 
o Estudiar los sRNAs de la familia Rsm de A. vinelandii 
 
Particulares 
o Generar un sistema de mutagénesis Flp-FRT útil en A. vinelandii 
o Establecer un protocolo para generar mutantes múltiples en los genes que 
codifican para sRNAs de la familia Rsm de A. vinelandii. 
o Caracterizar las mutantes generadas en relación a la producción de 
alginatos y PHB 
 
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 23 
Material biológico 
Tabla 1. Cepas usadas en este trabajo 
CEPA CARACTERÍSTICAS REFERENCIA 
E. coli DH5α SupE44, lacU169, hsdR17, 
resA1, endA1, gyrA96, thi-1, 
rel1. 
Biomedal S.L. 
E. coli DH5a (pRK2013) supE44, lacU169 
(N80lacZ)M15), recA1, endA1, 
hsdR17, thi-1, gyrA96, relA1, 
pRK2013 (KmR oriColE1 RK2-
Mob+ RK2-Tra+) 
Biomedal S.L. 
E. coli S 17.1 TpR SmR recA, thi, pro, hsdR-
M+RP4: 2-Tc:Mu: Km Tn7, fago 
lisógeno λpir 
Biomedal S.L. 
A. vinelandii cepa E Cepa silvestre resistente a 
ácido nalidíxico 
(Larsen & Haug, 1971) 
EΔrsmZ1::GmFRT Derivada de la cepa E, que 
tiene una mutación por 
remoción/inserción del gen 
rsmZ1. 
Este trabajo 
EΔrsmZ1::TcFRT Derivada de la cepa E, que 
tiene una mutación por 
remoción/inserción del gen 
rsmZ1. 
Este trabajo 
EΔrsmZ2::GmFRT Derivada de la cepa E, que 
tiene una mutación por 
remoción/inserción del gen 
rsmZ2. 
Este trabajo 
EΔrsmY::GmFRT Derivada de la cepa E, que 
tiene una mutación por 
remoción/inserción del gen 
rsmY. 
Este trabajo 
EΔrsmZ6::GmFRT Derivada de la cepa E, que 
tiene una mutación por 
remoción/inserción del gen 
rsmZ6. 
Este trabajo 
EΔrsmZ7::GmFRT Derivada de la cepa E, que 
tiene una mutación por 
remoción/inserción del gen 
rsmZ7. 
Este trabajo 
EΔrsmZ1::GmFRT/pFLPe4 Transconjugante de la 
mutante rsmZ1::GmFRT que 
porta el plásmido pFLPe4 
Este trabajo 
EΔrsmZ1::TcFRT/pFLPe4 Transconjugante de la 
mutante rsmZ1::TcFRT que 
porta el plásmido pFLPe4 
Este trabajo 
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 24 
EΔrsmZ2::GmFRT/pFLPe4 Transconjugante de la 
mutante rsmZ2::GmFRT que 
porta el plásmido pFLPe4 
Este trabajo 
EΔrsmZ6::GmFRT/pFLPe4 Transconjugante de la 
mutante rsmZ6:: GmFRT que 
porta el plásmido pFLPe4 
Este trabajo 
EΔrsmZ7::GmFRT/pFLPe4 Transconjugante de la 
mutante rsmZ7:: GmFRT que 
porta el plásmido pFLPe4 
Este trabajo 
EΔrsmZ1 Mutante de la cepa E, en la 
que se removió el gen rsmZ1 
Este trabajo 
EΔrsmZ2 Mutante de la cepa E, en la 
que se removió el gen rsmZ2 
Este trabajo 
EΔrsmZ6 Mutante de la cepa E, en la 
que se removió el gen rsmZ6 
Este trabajo 
EΔrsmZ7 Mutante de la cepa E, en la 
que se removió el gen rsmZ7 
Este trabajo 
EΔrsmZ1ΔrsmZ7::GmFRT Derivada de la mutante 
EΔrsmZ1, con una segunda 
mutación en el gen rsmZ7 
Este trabajo 
EΔrsmZ2ΔrsmZ1::GmFRT Derivada de la mutante 
EΔrsmZ2, con una segunda 
mutación en el gen rsmZ1 
Este trabajo 
EΔrsmZ2ΔrsmY::GmFRT Derivada de la mutante 
EΔrsmZ2, con una segunda 
mutación en el gen rsmY 
Este trabajo 
EΔrsmZ1ΔrsmZ7::GmFRT/ 
pFLPe4 
Transconjugante de la 
mutante 
EΔrsmZ1ΔrsmZ7::GmFRT que 
posee el plásmido pFLPe4 
Este trabajo 
EΔrsmZ2ΔrsmZ1::GmFRT/ 
pFLPe4 
Transconjugante de la 
mutante 
EΔrsmZ2ΔrsmZ1::GmFRT que 
posee el plásmido pFLPe4 
Este trabajo 
EΔrsmZ2ΔrsmY::GmFRT/ 
pFLPe4 
Transconjugante de la 
mutante 
EΔrsmZ2ΔrsmY::GmFRT que 
posee el plásmido pFLPe4 
Este trabajo 
EΔrsmZ1ΔrsmZ7 Derivada de la mutante 
EΔrsmZ1 en la que se removió 
el gen rsmZ7 
Este trabajo 
EΔrsmZ2ΔrsmZ1 Derivada de la mutante 
EΔrsmZ2 en la que se removió 
el gen rsmZ1 
Este trabajo 
EΔrsmZ2ΔrsmY 
 
 
Derivada de la mutante 
EΔrsmZ2 en la que se removió 
el gen rsmY 
Este trabajo 
 
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 25 
 
 
Tabla 2. Plásmidos usados en este trabajo 
PLÁSMIDO CARACTERÍSTICAS REFERENCIA 
pFZE1 Plásmido con el casete de 
resistencia a Zeocina 
flanqueado por secuencias FRT 
flanqueadas por un polilinker 
 (Choi et al., 2008) 
pFZEGm Plásmido con el casete de 
resistencia a Gentamicina 
flanqueado por secuencias 
FRT flanqueadas por un 
polilinker 
Este trabajo 
pFZETc Plásmido con el casete de 
resistencia a Tetraciclina 
flanqueado por secuencias FRT 
flanqueadas por un polilinker 
Este trabajo 
pKM2 Plásmido derivado del pUC18 
que porta una mutación por 
remoción/inserción del gen 
rsmZ1 
(Velázquez Sánchez, 2008) 
pUC25CLB::Gm Plásmido derivado del pUC18 
que porta una mutación por 
remoción/inserción del gen 
rsmZ2 
(Tzontecomani Pérez, 
2010) 
p5_2097rsmD::Gm Plásmido derivado del pGEM T 
easy que porta una mutación 
por remoción/inserción del gen 
rsmZ3 
(Domínguez Ojeda, 2011) 
pGEMrsmXY::Gm Plásmido derivado del pGEM T 
easy que porta una mutación 
por remoción/inserción del gen 
rsmY 
(Terán Melo, 2011) 
pGEMΔrsmZ4::Km Plásmido derivado del pGEM T 
easy que porta una mutación 
por remoción/inserción del gen 
rsmZ4 
(Cruz Gómez, 2013) 
pGEMΔrsmG::Gm Plásmido derivado del pGEM T 
easy que porta una mutación 
por remoción/inserción del gen 
rsmZ6 
(García Ramírez, 2011) 
pUC19rsmF-Sm Plásmido derivado del pUC19 
que porta una mutación por 
remoción/inserción del gen 
rsmZ5 
(López Pastrana, 2012) 
pGEMΔrsmH::Gm Plásmido derivado del pGEM T 
easy que porta una mutación 
(García Ramírez, 2011) 
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 26 
PLÁSMIDO CARACTERÍSTICAS REFERENCIA 
por remoción/inserción del gen 
rsmZ7 
pUCΔrsmZ1::GmFRT Plásmido derivado del pKM2 
que contiene la 
remoción/inserción del gen 
rsmZ1con casete GmFRT 
Este trabajo 
pUCΔrsmZ1::TcFRT Plásmido derivado del pKM2 
que contiene la 
remoción/inserción del gen 
rsmZ1 con casete TcFRT 
Este trabajo 
pUCΔrsmZ2::GmFRT Plásmido derivado del 
pUC25CLB::Gm que contiene 
la remoción/inserción del gen 
rsmZ2 con casete GmFRT 
Este trabajo 
pUCΔrsmZ2::TcFRT Plásmido derivado del 
pUC25CLB::Gm que contiene 
la remoción/inserción del gen 
rsmZ2 con casete TcFRT 
Este trabajo 
pGEMΔrsmZ3::GmFRT Plásmido derivado del 
p5_2097rsmD::Gm que 
contiene la remoción/inserción 
del gen rsmZ3 con casete 
GmFRT 
Este trabajo 
pGEMΔrsmY::GmFRT Plásmido derivado del 
pGEMrsmXY::Gm que contiene 
la remoción/inserción del gen 
rsmY con casete GmFRT 
Este trabajo 
pGEMΔrsmZ4::GmFRT Plásmido derivado del 
pGEMΔrsmZ4::Km que 
contiene la remoción/inserción 
del gen rsmZ4 con casete 
GmFRT 
Este trabajo 
pGEMΔrsm6::GmFRT Plásmido derivado del 
pGEMΔrsmG::Gm que 
contiene la remoción/inserción 
del gen rsmZ6 con casete 
GmFRT 
Este trabajo 
pUCΔrsmZ5::GmFRT Plásmido derivado del 
pUC19rsmF-Sm que contiene la 
remoción/inserción del gen 
rsmZ5 con casete GmFRT 
Este trabajo 
pGEMΔrsm7::GmFRT Plásmido derivado del 
pGEMΔrsmH::Gm que contiene 
la remoción/inserción del gen 
rsmZ7 con casete GmFRT 
Este trabajo 
 
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 27 
Tabla 3. Oligonucleótidos usados en este trabajo 
Nombre Secuencia 5´- 3´ Descripción 
Z1 fw GCC CGC CCA GCA GAT Tm= 68°C. Amplifica 
700 pb del gen rsmZ1 Z1rv GCA GGG CCG GCG ATG AAG AAA 
RsmB5´ GTC GTA GGA ACG ACG TCG GCT GAC Tm= 64°C. Amplifica 
160 pb del gen rsmZ1 RsmB3´ TCG GGC GTC GGG GAG GAT TTT TC 
RsmC3 GCG CGG CGT TGC TCG TCG TT Tm=62°C. Amplifica 
578 pb del gen rsmZ2 RsmC4 CGC CGC TCG CCG TTC TCC 
Z3fw CGA TAA GCT GCC GCC CTG TTT CAA Tm=62°C. Amplifica 
871 pb del gen rsmZ3 Z3rv TCG CAT AAG GGG GAG GCA CTG TCT 
2kbEd GCG GCG GCG GCG GAA ATG CTA Tm=67°C. Amplifica 
1700pb delgen rsmZ4 2kbEr CGT CTT CAG TGC GGC TCG GGT TCC 
Z5fw GCG CCG CCT GCC CCT GCT GAT Tm=68.5°C. Amplifica 
600 pb del gen rsmZ5 Z5rv GCT CGC GCC CTG TGC TGG ATG G 
Z6fw GGC CCG TAC CTT GAT GCG ATG TTG Tm=60.5°C. Amplifica 
692 pb del gen rsmZ6 Z6rv GCC GGCCAG TTG CAC GAC ATT CCT 
Z7fw AAA AAG GCC GCG CAG TAT GAC AGG Tm=62.5°C. Amplifica 
612 pb del gen rsmZ7 Z7rv GAG GGG GAG ATG CGT GGG GAT TTT 
XYfw GGC GGC ATT CTA TCC TGT C Tm=60.5°C. Amplifica 
746 pb del gen rsmY XYrv CGA ACC GCG CAT CCC CCT GAA 
prhaFw GGA TCC TGT ATA TCT CCT TGC TGA A Tm= 56°C. Amplifica 
2068 pb del plásmido 
pFLPe4 
prhaRv AAC TCG AGC TCG ATC ATA TGC ATT 
 
 
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 28 
Resultados y discusión 
En el laboratorio Genética Molecular Microbiana se cuenta con plásmidos que 
presentan mutaciones realizadas por remoción-inserción en cada uno de los genes 
que codifican a los sRNAs de la familia Rsm. En estos plásmidos se removieron los 
genes rsm-sRNA y se puso en su lugar un casete de resistencia útil en A. vinelandii. 
Como en A. vinelandii solo son útiles cuatro marcadores de resistencia algunos 
marcadores se repetían. De ese modo es imposible realizar más de cuatro 
mutaciones a la vez en la bacteria, por tal motivo se buscó una estrategia para 
poder generar mutaciones reciclando el marcador en cada una de éstas. 
Partiendo de la herramienta Flp-FRT, reportada anteriormente en B. pseudomallei, 
generamos nuevos plásmidos que permitieran adaptar el sistema a nuestro 
microorganismo de estudio. El plásmido pFZE1 original del sistema Flp-FRT cuenta 
con un marcador que confiere resistencia a zeocina, un buen marcador para 
usarse en investigación, ya que muy pocos organismos tienen resistencia a este 
glicopéptido, pero éste presenta la desventaja de ser muy tóxico, se ha 
demostrado que células de mamíferos son sensibles a este compuesto. Por lo 
anterior se decidió adicionar un marcador de los que se usan de forma rutinaria en 
A. vinelandii, como los casetes de resistencia a gentamicina (Gm), tetraciclina (Tc), 
kanamicina (Km) o estreptomicina (Sm). 
Los marcadores elegidos fueron Gm y Tc, cuyos casetes tienen tamaños de 800 y 
1400 pb respectivamente. El primero tiene un tamaño más manejable para labores 
de manipulación genética, pero tiene la desventaja de que A. vinelandii presenta 
una concentración mínima inhibitoria muy baja para este antibiótico. En el caso 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A B 
C 
Figura 13. Mapa de vector pFZE1, que contiene casete de resistencia a zeocina (ble) flanqueado 
por las secuencias FRT,(Choi et al., 2008). B) Inserción de los casetes Gm y Tc al vector pFZE1 en 
sitio único MluI. C) Mapa los casetes GmFRT y TcFRT 
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del casete de resistencia a Tc no cuenta con ese inconveniente, pero el tamaño 
de la construcción generada sería mayor, lo que podría dificultar el proceso de 
doble recombinación homóloga. Por lo anterior, se decidió generar dos 
interposones (FRT-Gm y FRT-Tc) cuya eficiencia se probaría posteriormente. 
Las modificaciones se iniciaron con el vector pFZE1 (Choi et al., 2008), al cual se le 
ligó uno de los casetes de los marcadores de resistencia elegidos. La ligación se 
realizó en un único sitio MluI dentro de la secuencia flanqueada por las secuencias 
FRT sin eliminar el gen de zeocina. El corte con MluI permite linearizar el vector y no 
interfiere en los pasos posteriores a la construcción (Figura 13). 
El plásmido pFZE1 fue digerido con la enzima MluI el cual generó un fragmento de 
3500pb. El casete de resistencia a Gm se obtuvo de la digestión del vector 
pBSL141con la enzima MluI. El casete de Gm obtenido tiene un tamaño de 800 pb 
(Figura 14 inciso A). Para la construcción de pFZETc de igual manera se utilizó la 
enzima MluI para linearizar el vector pFZE1, en tanto el casete de resistencia a Tc se 
obtuvo del plásmido pBSL190 digerido con la misma enzima obteniendo un 
fragmento de1400pb (Figura 14 inciso B). 
 
 
Para verificar la construcción exitosa de los plásmidos pFZTc y pFZGm, se realizaron 
digestiones usando los sitios de corte múltiple presentes en el vector pFZE1 que se 
usó de base (Figura 13 inciso C). Las enzimas utilizadas para este fin fueron BamHI y 
SalI. Para el caso de la construcción del casete Gm se deberían liberar dos bandas, 
una de 2680 y otra de 1619 pb. Para la construcción pFZTc los tamaños de corte 
con las mismas enzimas serían de 2680 y 2216 pb (Figura 15). 
A B 
Figura 14. Corrimiento electroforético de fragmentos de ADN usados para construir los plásmidos 
pFZEGm, inciso A; pFZETc, inciso B. 
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 30 
 
Figura 15. Verificación de las construcciones pFZEGm y pFZETc por digestión con las enzimas SalI y 
BamHI 
En el siguiente paso del trabajo se usarían los casetes construidos para intercambiar 
los marcadores convencionales que se encuentran en los plásmidos mutagénicos 
originales que se usaron para generar las mutantes en los rsm-sRNAs. 
 
Construcción de los plásmidos pUCΔrsmZ1::GmFRT y 
pUCΔrsmZ1::TcFRT 
 
Figura 16. Construcción del pUCΔrsmZ1::GmFRT. 
 
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 31 
El plásmido pKM2 se usó como base para generar los plásmidos mutagénicos del 
gen rsmZ1. El plásmido pKM2 porta un locus de 2kb donde se removió al gen rsmZ1 
y en su lugar se insertó un casete de resistencia a Km. El casete Km se ligó en un sitio 
SalI generado artificialmente por PCR inverso (Velázquez Sánchez, 2008), es 
importante señalar que el sitio de la inserción está flanqueado río arriba y río abajo 
1000 pb aproximadamente. 
 
Figura 17. Construcción de pUCΔrsmZ1::TcFRT. 
El nuevo plásmido mutagénico se construyó digiriendo los plásmidos pKM2, pFZEGm 
y pFZETc con la enzima SalI. El plásmido pKM2 liberó fragmentos de 4622pb y 1200pb 
que corresponden a la estructura base y al casete de Km (Figura 16). La restricción 
del plásmido pFZEGm generó un fragmento de 2680 pb de la estructura base y otro 
de 1619pb del casete GmFRT (Figura 16). Para el pFZETc, la restricción liberó la 
estructura base (2680 pb) y 2226pb del casete TcFRT (Figura 17). Posteriormente, se 
llevaron a cabo las ligaciones de plásmido derivado del pKM2 ya sin el casete de 
Km y del casete GmFRT obteniendo el plásmido pUCΔrsmZ1::GmFRT. Del mismo 
modo se llevó a cabo la construcción del plásmido pUCΔrsmZ1::TcFRT solo que 
ahora usando el casete TcFRT. Ambas construcciones se verificaron por patrón de 
restricción con la enzima SalI donde tendrían que aparecer los fragmentos 
correspondientes al vector base y al casete insertado 4622pb /1619 pb para el 
pUCΔrsmZ1::GmFRT y de 4622pb / 2226 pb para el vector pUCΔrsmZ1::TcFRT . 
 
 
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Construcción de los plásmidos pUCΔrsmZ2::GmFRT y 
pUCΔrsmZ2::TcFRT 
 
Figura 18. Construcción de pUCΔrsmZ2::GmFRT. 
 
El plásmido pUC25CLB::Gm se utilizó como base para generar el plásmido 
mutagénico del gen rsmZ2. Este plásmido cuenta con un locus de 1500 pb 
aproximadamente, donde se mantienen secuencias río arriba y río abajo del gen 
rsmZ2 de 550 y 766 pb respectivamente. En este fragmento se retiró la secuencia 
estructural del sRNA y en su lugar se insertó un casete de resistencia a Gm. El 
casete se ligó a un sitio BamHI generado artificialmente por PCR inverso 
(Tzontecomani Pérez, 2010). 
 
Figura 19. Construcción de pUCΔrsmZ2::TcFRT. 
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 33 
Para las construcciones de los plásmidos mutagénicos con los casetes FRT, se 
realizaron digestiones con la enzima BamHI de los plásmidos pUC25CLB::Gm, 
pFZEGm y pFZETc. Para el caso del plásmido pUC25CLB::Gm se generó un 
fragmento de 4200 pb y otro de 800 pb del casete removido (Figura 18). Las 
restricciones de los plásmidos pFZEGm y pFZETc, generaron fragmentos de 
2680/1619 pb y 2674/2226 pb, respectivamente (Figuras 18 y 19). Posteriormente se 
llevó a cabo la ligación del plásmido base (derivado del pUC25CLB::Gm) con el 
casete de GmFTR para generar el plásmido pUCΔrsmZ2::GmFRT y el plásmido base 
más el casete TcFRT para obtener el plásmido pUCΔrsmZ2::TcFRT, los cuales se 
verificaronrealizando una digestión a cada uno de ellos con la enzima BamHI 
donde tendrían que liberarse los fragmentos correspondientes al vector base y al 
casete insertado, 4200/1619 pb para el pUCΔrsmZ2::GmFRT y 4200/2226 pb para el 
pUCΔrsmZ2::TcFRT (Figuras 18 y 19). 
Construcción de los plásmidos pGEMΔrsmZ3::GmFRT y 
pGEMΔrsmY::GmFRT 
 
Figura 20. Generación de los plásmidos pGEMΔrsmZ3::Gm y pGEMΔrsmY::Gm. 
Para la construcción de los siguientes plásmidos mutagénicos solo se usó el casete 
GmFRT. 
El plásmido p5_2097rsmD::Gm se usó como base para generar el plásmido 
pGEMΔrsmZ3::GmFRT El plásmido p5_2097rsmD::Gm tiene como base el vector 
pGEM T Easy y porta un fragmento de 710 pb río arriba del inicio del gen rsmZ3 y 
1403 pb río abajo del gen. El gen rsmZ3 se escindió del locus ligando en su lugar un 
casete de resistencia a Gm, la inserción se realizó en un sitio XhoI generado 
artificialmente por PCR inverso (Domínguez Ojeda, 2011). El nuevo plásmido 
mutagénico se construyó digiriendo al plásmido base p5_2097rsmD::Gm con la 
enzima XhoI y el pFZEGm con la enzima SalI que genera extremos compatibles con 
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XhoI. La ligación se llevó a cabo con el plásmido derivado del p5_2097rsmD::Gm sin 
el casete de Gm con el casete de GmFRT, obteniendo el plásmido 
pGEMΔrsmZ3::GmFRT el cual se corroboró con una digestión BamHI, aprovechando 
que el casete mantiene los sitios BamHI en los extremos y que la compatibilidad de 
los sitios que se usó para ligar, eliminaba sitios de reconocimiento específico para 
alguna de las enzimas. El patrón de digestión tendría que mostrar los fragmentos 
4924 pb del vector base y 1619 pb del casete GmFRT (Figura 20). 
Para el caso de la construcción de pGEMΔrsmY::GmFRT, se partió del plásmido 
pGEMrsmXY::Gm, el cual presenta una secuencia de 1415 río arriba y 790 pb río 
abajo del gen rsmY, este vector cuenta con un gen de resistencia a Gm que 
sustituye a la región estructural del rsmY, el casete originalmente se ligó en un sitio 
XhoI generado de manera artificial por PCR inverso (Terán Melo, 2011). 
Para generar el nuevo plásmido mutagénico el plásmido pGEMrsmXY::Gm se digirió 
con la enzima XhoI, y el plásmido pFZEGm con la enzima SalI. Al ligar ambos 
fragmentos se generó el plásmido pGEMΔrsmY::GmFRT el cual se verificó mediante 
una digestión con la enzima BamHI que generó los fragmentos de 4635 pb del 
vector y 1619 pb del casete GmFRT (Figura 20). 
Construcción de los plásmidos pGEMΔrsmZ4::GmFRT y 
pGEMΔrsmZ6::GmFRT 
 
Figura 21. Generación de los plasmidos pGEMΔrsmZ4::Gm y pGEMΔrsmZ6::Gm. 
 
Los siguientes plásmidos mutagénicos que se construyeron fueron los de los genes 
rsmZ4 y rsmZ6 ya que los plásmidos originales cuentan con la inserción del marcador 
en un sitio KpnI, aprovechando la secuencia en común para realizar el intercambio 
de casetes. 
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 35 
Para rsmZ4 se partió del plásmido pGEMΔrsmZ4::Km (Cruz Gómez, 2013), este 
plásmido mantiene un locus del gen rsmZ4 con una región río arriba de 1200 pb 
aproximadamente y 500 pb de la región río abajo de dicho gen. El gen estructural 
se retiró y en su lugar se insertó un casete de resistencia a Km ligado en un sitio KpnI 
generado por medio de PCR inverso. El plásmido pGEMΔrsmZ4::GmFRT se construyó 
digiriendo los plásmidos pGEMΔrsmZ4::Km y pFZEGm con la enzima KpnI. El plásmido 
base liberó fragmentos de 4700 pb y 1200 pb que corresponden a la estructura 
base del plásmido y al casete de Km respectivamente (Figura 21). El plásmido 
pFZEGm digerido con KpnI libera fragmentos de 2680 (vector) y 1619 (casete). 
Posteriormente se llevó a cabo la ligación del plásmido base pGEMΔrsmZ4 y el 
casete GmFRT para obtener el plásmido pGEM ΔrsmZ4::GmFRT. para verificar la 
construcción de este nuevo plásmido se realizó una digestión con la enzima KpnI 
obteniéndose fragmentos de 4700 y 1619 pb que corresponden al vector y al 
casete respectivamente (Figura 21). 
Para construir el plásmido pGEMΔrsmZ6::GmFRT se tomó como base el 
pGEMΔrsmG::Gm, el cual cuenta con un locus de 1600 pb aproximadamente, de 
donde se removió el gen rsmZ6, mantiéndose 663 pb río arriba de dicho gen y 993 
pb río abajo, en lugar del gen estructural se encuentra un casete de Gm ligado en 
un sitio KpnI (García Ramírez, 2011). El cambio de casete, se realizó digiriendo con 
la enzima KpnI tanto el plásmido pGEMΔrsmG::Gm como del plásmido pFZEGm. La 
digestión del plásmido pGEMΔrsmG::Gm libera los fragmentos 4671 de la estructura 
base y 800 pb del casete, el plásmido pFZEGm, 2680 más 1619 pb (Figura 21). 
Posteriormente se realizó la ligación del vector base como del nuevo casete 
GmFRT. El plásmido generado se comprobó por digestión con la enzima KpnI la cual 
muestra fragmentos 4671y 1619 pb (Figura 21) que indican la construcción correcta. 
Construcción del plásmido pUCΔrsmZ5::GmFRT 
Para la construcción del plásmido pUCΔrsmZ5::GmFRT se partió del plásmido 
pUC19rsmF-Sm, el cual cuenta con un locus de 2000 pb donde se removió gen 
estructural de rsmZ5 y en su lugar fue ingresado un casete de estreptomicina, 
manteniendo una secuencia río arriba del gen de 1073 pb y una secuencia río 
abajo de 808 pb. El casete fue ligado en un sitio KpnI generado de forma artificial 
(López Pastrana, 2012). Para generar la nueva construcción con el casete GmFRT 
se realizó una digestión con la enzima KpnI tanto del vector pUCΔrsmZ5::GmFRT 
como del pFZEGm. Los fragmentos que se liberan, para el caso del 
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 36 
 
Figura 22. Generación el plásmido pUCΔrsmZ5::Gm. 
pUCΔrsmZ5::GmFRT son de 4530pb (del plásmido base) y 2000 pb (del casete de 
Sm), para el caso del pFZEGm, son de 2680 pb del vector y de 1619 pb del casete 
GmFRT. Una vez que se tenían ambos fragmentos se realizó la ligación para obtener 
el plásmido pUCΔrsmZ5::GmFRT. Para realizar la verificación del nuevo plásmido se 
llevó a cabo una reacción de restricción con la misma enzima donde tendrían que 
estar presentes fragmentos 4530 pb del plásmido base y 1619 pb del casete GmFRT 
(Figura 22). 
Construcción del plásmido pGEMΔrsmZ7::GmFRT 
La construcción del vector pGEMΔrsmZ7::GmFRT se realizó a partir del vector 
pGEMΔrsmH::Gm (García Ramírez, 2011), este plásmido mantiene 720 pb de la 
secuencia río arriba del gen estructural y 460 pb río abajo del gen rsmZ7. Cuenta 
con la remoción de la secuencia del gen estructural y en su lugar se le insertó un 
casete de resistencia a Gm. 
El plásmido mutagénico se construyó digiriendo el plásmido pFZEGm con la enzima 
SalI que liberó fragmentos de 2680 pb del vector y 1619 pb del casete GmFRT. Para 
el caso del plásmido pGEMΔrsmH::Gm se realizó la digestión con la enzima XhoI 
liberando fragmentos 4180 de la estructura base y 800 pb del casete de Gm (Figura 
23). Una vez que se realizaron ambas digestiones se llevó a cabo la ligación del 
plásmido base con el casete GmFRT. Para comprobar la construcción se realizó una 
digestión con la enzima BamHI que se encuentra dentro de la construcción del 
casete, justo en los sitios de multiclonación. El patrón esperado se puede ver en la 
figura 23, un fragmento de 41800pb del vector y otro de 1619 pb del casete GmFRT. 
 
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 37 
 
 
Figura 23. Construcción del plásmido pGEMΔrsmZ7::GmFRT 
 
Obtención de la mutante de EΔrsmZ1 
Una vez obtenidas las construcciones de los plásmidos mutagénicos de los sRNAs 
se transformaron en células competentes de A. vinelandii. Para comprobar la 
funcionalidad de la herramienta, se eligió iniciar con la generación de la mutante 
rsmZ1, ya que este sRNA es el más estudiado de la familia Rsm. Para probar ambos 
casetes se realizaron experimentos paralelos con los vectores pUCΔrsmZ1::GmFRT y 
con pUCΔrsmZ1::TcFRT. Las transformantes se seleccionaron en medio mínimo 
adicionado con Gm o Tc según fuera el caso. Paraprobar la presencia de la 
mutación, se extrajo ADN genómico de cada una de las candidatas y fue usado 
como molde para realizar una PCR usando los oligonucleótidos Z1fw y Z1rv, que 
amplifican el locus donde se encuentra la mutación del gen en cuestión (Figura 
24). La mutante que presenta el casete de GmFRT debería amplificar un fragmento 
de 2141 pb, para el caso de la mutante tetraciclina resistente, el tamaño del 
amplificado debería ser de 2841 pb. En la cepa silvestre E usada como control se 
amplificaría el locus silvestre de 700 pb (Figura 24 inciso B). 
 
 
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 38 
 
 
Figura 24. A) Diagrama del análisis de comprobación por PCR de las mutantes rsmZ1. B) Análisis por 
PCR para verificar la mutación del gen rsmZ1. 
En análisis de PCR con el que se probó el genotipo de las mutantes también 
permitió determinar que las mutaciones están completamente segregadas, un 
hecho importante a considerar por la poliploidia presente en A. vinelandii. 
Escisión del casete por efecto de la recombinasa FLP 
Para iniciar el proceso de escisión de los casetes GmFRT y TcFRT del genoma de las 
mutantes EΔrsmZ1::GmFRT y EΔrsmZ1::TcFRT se les conjugó de forma triparental el 
plásmido pFLPe4. El plásmido pFLPe4 contiene el gen que codifica para la 
recombinasa FLP bajo un promotor PrhaBAD, también posee los genes que codifican 
para los activadores RhaS y RhaR que son necesarios para expresar al gen FLP. En 
presencia de L-ramnosa RhaR se une a RhaS y el complejo RhaR/ RhaS se une al 
promotor PrhaBAD activando así la transcripción del gen flp. Primeramente, se 
comprobó que el plásmido pudiera replicarse en A. vinelandii, lo cual era probable 
ya que su origen de replicación proviene del plásmido pRO1600 de P. aeruginosa, 
una bacteria filogenéticamente cercana a A. vinelandii. Para probar que el 
plásmido pFLPe4 estuviera presente en la mutante, se realizó una PCR con 
B 
A 
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 39 
oligonucleótidos capaces de reconocer y amplificar los genes rhaS y rhaR, es 
preciso aclarar que los oligonucleótidos no se alinean en ninguna secuencia del 
genoma de A. vinelandii. Los oligonucleótidos fueron: pRhaFw y pRhaRv, con ellos 
se amplificó una región de 2068 pb que incluye la secuencia del promotor rha y las 
secuencias que codifican para dos activadores, RhaS y RhaR (Choi et al., 2008; 
Wegerer et al., 2008)(Figura 25). 
 
 
Figura 25. Mapa del vector pFLPe4. Se marca con naranja la secuencia amplificada con los 
oligonucleótidos pRhaRw y pRhaRv 
Se probaron cuatro transconjugantes candidatas observándose que todas 
contaban con el plásmido lo cual se evidenció al amplificar el fragmento de 2068 
pb (Figura 26). Como control positivo se amplificó el fragmento usando como 
molde DNA plasmídico del pFLPe4. 
Una vez que fue conjugado el plásmido pFLPe4 a las mutantes se llevó a cabo la 
inducción de la expresión de la flipasa por acción de la ramnosa. Una vez 
expresada la flipasa reconocería los sitios FRT presentes en el gen mutado y así se 
llevaría a cabo la escisión del casete. Se eligió a una transconjugante y se sembró 
en medio BS con ramnosa al 0.2%, de acuerdo a lo reportado, el promotor PrhaBAD 
responde a bajas concentraciones de ramnosa (Choi et al., 2008); se incubó por 
48 horas a 30° C y posteriormente se realizaron diluciones seriadas del cultivo (1x10-
3, 1x10-4 , 1x10-5 y 1x10-6), siendo la dilución 1x10-5 de donde se obtuvieron 100 
candidatas en promedio, permitiendo una selección precisa. 
 
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Figura 26. Análisis por PCR para la verificación de la presencia del plásmido pFLPe4 en las mutantes 
rsmZ1 de A. vinelandii. 
Estas candidatas tenían que ser sometidas a un experimento de contra-selección 
sembrándolas tanto en una placa de medio mínimo con el antibiótico de selección 
y otra sin antibiótico. Si es que se realizó la escisión del casete de resistencia al 
antibiótico en cuestión, las candidatas solo podrían crecer en medio que no 
contuviera el antibiótico. En el ensayo de contra-selección, se observó una eficacia 
de 99% en la escisión del casete de resistencia (Figura 27). 
 
 
Figura 27. Ensayo de contra-selección para obtener las mutantes de rsmZ1 sin el casete de 
resistencia. 
Aunque el fenotipo de resistencia de las transconjugantes nos sugería que sí se 
había efectuado la eliminación del casete de resistencia, esto se comprobó por 
PCR con los oligonucleótidos Z1fw y Z1rv, que se utilizaron anteriormente para 
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amplificar las regiones río arriba y río abajo del gen rsmZ1. Para el caso de la 
amplificación del locus rsmZ1 en la cepa silvestre E se repite el patrón de 
amplificación: un fragmento de 700 pb pb (carril 1 figura 28), en el caso de la 
mutante la amplificación muestra una banda de 2141 pb (carril 2 figura 28). En las 
mutantes en las que se indujo la flipasa (carriles 3 a 8) se observa la pérdida del 
casete, el amplificado muestra un tamaño de 627 pb (carriles 3-8 figura 28) ya que 
la liberación del casete genera una “cicatriz” de las FRT de 86 pb (Figura 29). 
 
Figura 29. Mapa del locus rsmZ1 silvestre, del locus con la mutación por inserción del casete, y del 
locus donde se removió el casete. 
 
Una vez que se probó que la eliminación del casete se realizó con éxito, se prosiguió 
a eliminar el plásmido pFLPe4 para evitar que la flipasa se siguiera expresando. Para 
lograr lo anterior se aprovechó el hecho de que el plásmido pFLPe4 solo puede 
replicarse a la temperatura permisiva de 30 °C. Por consiguiente, las mutantes se 
resembraron en placas de BS sin antibiótico, pero ahora se incubaron a la 
Figura 28. Anailisis por PCR que demuestra la pérdida del casete GmFRT en la mutante rsmZ1 
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temperatura no permisiva de 37° C. Para verificar la pérdida del plásmido se realizó 
nuevamente la PCR con los oligonucleótidos que amplifican el locus rhaSR del 
plásmido comprobando que las candidatas ya no presentaban el plásmido pFLPe4 
(Figura 30). 
 
Figura 30. Análisis por PCR que comprueba la pérdida del plásmido pFLPe4 en las mutantes rsmZ1 
El resultado anterior nos dio la certeza de que la herramienta funcionaba en A. 
vinelandi. Al igual que en lo reportado para Burkholderia. La posibilidad de reciclar 
el marcador usado para seleccionar las mutantes permitiría generar mutantes 
múltiples sin depender del número de los marcadores de resistencia útiles en la 
bacteria (Choi et al., 2008). Aunado a lo anterior, es importante resaltar que esta 
herramienta también puede ser usada para generar mutaciones sin efecto de 
polaridad. Para aprovechar la estrategia generada se decidió que el siguiente 
paso fuera realizar mutantes dobles de los sRNAs de la familia Rsm guiándose con 
los resultados generados en nuestro grupo de trabajo, al respecto sabemos que las 
mutaciones en algunos de estos genes de los disminuyen la producción de alginato 
(rsmZ1, rsmZ2, rsmZ4 y rsmY), y otros casos la aumentan (rsmZ5, rsmZ6 y rsmZ7) (Figura 
12). 
Se realizaron las siguientes mutantes sencillas como a continuación se describe. 
 
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Obtención de la mutante de EΔrsmZ2 
Para generar la mutante en rsmZ2 se eligió el plásmido pUCΔrsmZ2::GmFRT para 
transformarlo en células competentes de A. vinelandii. El éxito de la doble 
recombinación en las mutantes candidatas se comprobó por PCR con los 
oligonucleótidos RsmC3y RsmC4 (Figura 31 inciso A), observando que todas 
presentaban la mutación generada por la inserción del casete. También se 
corroboró la segregación total de la mutación en los cromosomas de A. vinelandii. 
Después de lo anterior, se seleccionó una mutante para llevar a cabo el proceso 
de escisión de casete y comprobar por PCR la remoción de éste (Figura 31 inciso 
B). El fenotipo que se observa