Estudio-citogenetico-de-liquido-amniotico-para-diagnostico-prenatal--reporte-de-312-casos-consecutivos

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FACULTAD DE CIENCIAS 
U.N.A.M, 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
DE MÉXICO 
FACULTAD DE CIENCIAS 
ESTUDIO CITOGENÉTICO DE LÍQUIDO 
AMNIÓTICO PARA DIAGNÓSTICO PRENATAL: 
REPORTE DE 312 CASOS CONSECUTIVOS 
T E s 1 s 
QUE PARA OBTENER El TíTULO DE: 
B I Ó L O G A 
P R E S 'E N T A 
Y A D IR A R O B L E S A Y A L 'A 
DIRECTORA DE TESIS: DRA. VICTORIA EDNA AIZPURU AKEL 
2005 
67 
 
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ACT. MAURICIO AGUILAR GONZÁLEZ 
Jefe de la División de Estudios Profesionales de la 
Facultad de Ciencias 
Presente 
Comunicamos a usted que hemos revisado el trabajo escrito: 
ftEstudio citogenético de liquido amniótico para diagnóstico 
pre.nat~.l: reporte de 312 casos consecutivos." 
realizado por Yadira Robles Ayala 
con nÚInerode cuenta 093 O 2 S 670 , quien cubrió los créditos de la carrera de: 
< Biología 
Dicho trabajo cuenta con nuestro voto aprobatorio. 
Director de Tesis 
Propietario 
Propietario 
Propietario 
Suplente 
Suplente 
Atentamente 
Dra. 
Dra. 
Biól. 
M. en C. Carlos Sandoval 
M.V.Z. Guillermo Islas·y 
Consejo D~partamental de Biología 
M. 
bt-J:t,4DDE ENliE~¡"¡~ 
DllIUOUJatA 
AgradeCimientos. 
A la UNAM, la facultad de Ciencias y a todos mis maestros, por 
permitirme conocer el maravilloso mundo de la Biología. 
A los miembros del jurado por el tiempo invertido en la revisión de esta 
tesis y por sus valiosas y afinadas sugerencias para enriquecerlas. 
A Clinigen por las facilidades ofrecidas para la realización de este 
trabajo. 
AlaDra. V. Edna Aízpuru Akel por darme la oportunidad de pertenecer a 
. un hermoso equipo y por el apoyo brindado. 
A la Dra. Rosa Ma. Ordóñez Razo, quien siguió de cerca el desarrollo de 
esta tesis ~y la enriqueció con sus comentarios acertados, compartió su 
conocimientoconmigo, pero sobre todo por su paciencia y profesionalismo. 
A mis compañeros de Clinigen, por hacer un buen equipo de trabajo: 
Alfredo, Paty Zamora,Paty Treja, Sergio, Angel, Bedui y fa Sra. Mary. 
1 
Dedicatorias 
A ti papi: porque un 30 de noviembre de 1995, cerraste tus ojos para 
iluminar con ellos es cielo que cubre mi vida, donde quiera que estés ¡TE AMO 
PAPÁl 
A mi mami,por todo su amor, cariño y paciencia, pero sobre todo por no 
perder la féy por enseñarme a luchar por lo que quiero. ¡TE QUIERO MUCHO 
MAMÁ! 
A mi hermano, por estar siempre a mi lado, por ser mi pilar y por traer la 
alegría ala casa, una cosita con patas que da mucha lata: Serafín. 
A Dan y Bebys, por cuidarme, compartir su vida conmigoy por no perder 
la esperanza. ¡Por fin niñas! 
A mis abuelos, por mantenernos juntos y recordarnos siempre lo 
importante que es la unión familiar. 
A mis primos: Claudia, Lluvia, Ivan, Joseph, Chotis, Negro, Pollo,Wendy, 
. Pilo y todos los demás, por los momentos de sano esparcimiento y relajación. 
A mis tíos~ por las divertidas tardes de domingo y por alguna que otra 
erífermedado golpe.adquirido durante los momentos de diversión. 
A Pecha, por su cariño '. por el tiempo compartido, los buenos momentos y 
su comprensión. 
A mis amigos: . Xóchitl, Dave, Katy, Miri, Ren, Sofy, Rodro, Carlos 
Sandoval, Jorgito Limón, Juanito, Abraham, Carlos Machuca, por su amistad, 
. por su tiempo, por las vivencias compartidas, .por la diversión y por todo lo que 
me une a ellos. 
A mi amigo Alf ,por creer en mi siempre, por enseñarme atrabajar y por 
darme unos cocos de vez en cuando para reaccionar. 
11 
A Andrés , uno de los Seres mciS maravillosos de la Tierra, gracias por 
compartir tu tiempo conmigo, por recordarme que la vida es bonita y hay que 
disfrutarla ..... ;T A M e p! 
Por último I a todos los que Se me olvidan y por las prisas o cuestión de 
espacio no he nombrado. 
iii 
ABREVIATURAS 
LA Líquido amniótico 
DCTN Defectos de cierre de tubo neural 
EMA Edad materna Avanzada 
CVS Corion villus samplig muestra de vellosidades coriales 
EG Edad gestacional 
SDG Semanas de gestación 
TMSM Triple marcador en suero materno 
DNA Siglas internacionales del ácido desoxiribonucléico 
IV 
REACTIVOS 
Amniomax Ci00 suplementado con L-glutamina y sulfato de Gentamicina 
al 1%. GIBCO. 
Colcemid. Karyomax 1 O~g/ml. GIBCO 
Fijador Carnoy. Solución demetanol (Merck) y ácido acético (JT Baker) en 
proporción de 3: 1. 
Solución hipotónica de citrato de sodio (JT Baker) 0.75 M 
Tripsina 1:250 GIBCO 
Pastillas Gurr pH 6.8 Y 7.2 para 1 litro 
Giemsa 5%Merck 
Entellan Merck 
TABLAS 
Tabla1. Características de las células de líquido amniótico observadas en 
cultivo. 
Tabla 2. Características de las laminillas en cosecha 
Tabla 3. Correlación entre la edad gestacional, aparición de colonias y 
cosecha. 
Tabla 4 .. Número de muestras por edad gestacional y detalle de cultivo 
v 
FIGURAS. 
Figura 1. Morfologías cromosómicas. 
Figura 2. Esquemas de cariotipos. 
Figura 3. Toma de líquido amniótico. 
Figura 4. Representacíónesquemática de la toma y procesamiento de 
líquido amniótico. 
Figura 5. Gráfica de número de pacientes de acuerdo a la edad 
gestacional. 
Figura 6. Gráfica de porcentajes de caríotipos femeninos y masculinos, 
normales y alterados. 
Figura 7. Gráfica de indicaciones del estudio. 
FiguraS. Gráfica de correlación entre edad gestacional y formación de 
colonias. 
Figura 9. Gráfica de correlación entre tiempo de cosecha y edad 
gestacional. 
Figura 10. Gráfica de comportamiento en cultivo y la edad gestacional. 
Figura 11. Cultivo de líquido amniótico al 2°. Día. 
Figura12. Cultivo de células epitelioides al 5° día. 
Figura 13. Colonia de células fibroblastoides al10 día. 
Figura 14. Colonia fibroblastoide al 13°. Día. 
Figura 15. Gráfica de Edad materna al momento del estudio 
VI 
íNDICE 
RESUMEN ................................................................................................. 1 
INTRODUCCiÓN 
Diagnóstico prenataL. ..... , .................................................................... .4 
Técnicas no invasivas ........ o ••••••••••••••• o ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• 5 
Técnicas invasivas ................................................................................ 7 
Liquido arrlniótico ................................................................................. 9 
Tipos celulares en liquido amniótico ................ oo .................................. 1 O 
Cultivo celular. .................................................................................... 13 
Citogenetica humana ........................................................................... 14 
Cariotipo .............................................................................................. 15 
Alteraciones numéricas y estructurales en.cromosomas humanos ..... 18 
JUSTIFiCACiÓN .................................................................................. 22 
OBJETiVOS ......................................................................................... 23 
MATERIAL Y MÉTODOS ..................................................................... 24 
RESUL TADOS ..................................................................................... 30 
DISCUSiÓN ......................................................................................... 42 
CONCLUSiONES ..............................................................: ................. 47 
BIBLIOGRAFIA .................................................................................... 48 
Vll 
RESUMEN. 
El diagnóstico prenatal supone la suma de todas aquellas acciones 
diagnósticas encaminadas a detectar alteraciones genéticas y congénitas en el 
feto. La obtención de líquido amniótico, o amniocentesis, es la técnica más 
comúnmente utilizada en diagnóstico prenatal y una de sus finalidades es la 
detección de alteraciones cromosómicas en un feto con riesgo elevado, ya sea por 
edad materna, por la presencia de alteraciones ultrasonográficas o marcadores 
bioquímicos en sangre materna. La amniocentesis, aunque es un métodoinvasivo, 
. ofrece seguridad y la posibilidad de obtener un resultado en poco tiempo y de 
buena calidad. Se realizó un estudio retrospectivo citogenético y bioquímico de 
312 casos de pacientes que asistieron a consulta genética en el Hospital Angeles 
del Pedregal. El análisis de las mismas se realizó en el Departamento de 
Citogenética de Laboratorios Clinigen S.A. de C.V. 
En los 312 casos se analizó el cariotipo, el éxito de cultivo y el tipo celular 
observado durante el mismo relacionado además con la· edad gestacionaL En 
todos los casos se registró la edad materna, la edadgestacional, motivo de 
referencia y haHazgosultrasonográficos previos a la realización del procedimiento. 
Todas las muestras de liquido amniótico fueron obtenidas por punción 
transabdominal bajo guía ultrasonográfica y con total asepsia. Las células de 
líquido amniótico. fueron cultivadas en medio de cultivo "Amniomax Medium" en 
incubadora húmeda a 37°C y una atmósfera de 5% de CO2 durante. 10 a 15 días: 
Los cromosomas se analizaron con la técnica de bandas GTG y el resultado fue 
entregado aproximadamente a los 15 días de la toma. El cariotipo fue obtenido en 
1 
el 100% de los casos y en el 5.12% se detectó alguna anomalía. La edad materna 
avanzada y trip1e marcador positivo fueron las indicaciones más frecuentes. 
2 
INTRODUCCiÓN. 
Las enfermedades humanas pueden ser localizadas en un amplio espectro 
que se extiende desde el genotipo hasta el ambiente. Por un lado tenemos las 
enfermedades genéticas, las cuales se manifiestan únicamente como 
consecuencia de la carga genética del individuo, y se dividen en monogénicas por 
ejemplo los errores congénitos del metabolismo) y cromosómicas(como la 
trisomía 21). En el extremo opuesto están las enfermedades que semanmestan 
como consecuencia de la exposición del individuo a ciertos agentesfísícos, 
químicos o biológicos; sin que exista alguna causa genética. Existen situaciones 
intermedias entre los dos polos donde se localizan [as enfermedades 
multifactoriales, las cuales se presentan como consecuencia de la interacción 
entre los genes y el medio ambiente. 
Se estima que aproximadamente 1 de cada 50 recién nacidos presenta una 
anomalía congénita mayor, que 1 de cada 100 tiene una alteración de tipo 
monogénico y aproximadamente 1 de cada 200 posee una enfermedad 
cromosómica. El 60% de los abortos espontáneos y el 7% de las enfermedades 
intrauterinas, son consecuencia de una alteración cromosÓmica. 
(www.geneslimited.com) 
Diagnóstico prenatal. 
El Diagnóstico prenatal se define como un conjunto de procedimientos que 
permiten identificar enfermedades hereditarias durante el embarazo temprano en 
humanos para su posible tratamiento y/o eliminación antes del nacimiento y 
3 
puede llevarse a cabo desde el punto de vista morfológico, bioquímico, 
cromosómico y molecular. (Schwanitz, 2000; Carrera, 1998). Actualmente, está 
indicado en: 
1) Mujeres embarazadas mayores de 35 años. Cuando aumenta la edad 
materna, la posibilidad de presentarse aneuploidía aumenta 
considerablemente. 
2) Cuando uno de los padres es portador de alguna translocación. ya que la 
segregación puede originar cariotipos desbalanceados. 
3) Cuando hay un hijo previo con alteraciones físicas y/o cromosómicas. 
4) Determinación del sexo por patología relacionada con el cromosoma X; por 
ejemplo la hemofilia. 
5) Madre portadora de Síndrome X frágil. La causa más frecuente de déficit 
mental en varones, es el síndrome de X frágil. 
6} Hijo previo con alguna metabolopatía detectable prenatalmente. 
7) Antecedente. de uno o más hijos con defectos de cierre· de tubo neural, ya . 
que de volverse a presentar alguna alteración de este tipo, puede detectarse 
prenatalmente. 
8) Cuando existe un riesgo laboral (por ejemplo los radiólogos), ya que algunas 
sustancias ó técnicas provocan daño en el DNA 
9) Cuando la pareja es consanguínea, ya que la·posibilidad de que se presenten 
alteraciones autosómicas recesivas 
10) Angustia materna 
La American Society of Human Genetics definió el asesoramiento genético 
como un proceso de comunicación relacionado con la ocurrencia. o el riesgo de 
4 
recurrencia. de un trastorno genético. Este proceso incluye ayudar a la persona o 
a la familia: 1) a comprender los hechos médicos, que abarcan el diagnóstico, 
pronóstico y tratamiento, 2) entender el papel de la genética en el trastorno y el 
riesgo de recurrencia; 3) conocer las opciones de reproducción; 4) elegir un curso 
de acción apropiado, y 5) ajustarse tan bien camo sea posible al trastorno o al 
riesgo de recurrencia. (Carrera, 1998; Schwanitz, 2000). 
Existen diferentes técnicas para realiza diagnóstico prenatal, las cuales se 
clasifican en procesos no invasivos e invasivos. 
Técnicas no invasivas. 
·las técnicas noinvasivas se indican en menores de 35 años con bajo 
riesgo para determinados cuadros genéticos. Las mismas tienen valor pronóstico y 
permiten detectar pacientes que presentan riesgo elevado para determinado 
trastorno genético. (Carrera, 1998; Thompson & Thompson. 1996) 
Ecografiafetat Se utiliza para valorar salud fetal y hace posible el 
reconocimiento de malformaciones. (Twining, 1998) 
Triple marcador en suero materno. Es una técnica bioquímica pronóstica 
que se basa. en la cuantificación de . ciertos marcadores. Previa ecografía 
transabdominal, se mide en sangre materna el nivel de marcadores bioquímicos 
específicos del segundo trimestre (estriol conjugado, a-fetoproteinay 
gonadotropina cariónica). Este estudio permite pronosticard.eterminadas, 
patologías genéticas y como defectos de cierre de tubo neural (DCTN). (Carrera, 
1998; Shwanitz, 2000 ) 
5 
- - -'" -- -. ""'" ..". - - - - _. ....._.. -- -
La sensibilidad del métodó es del 15% ton un 5% de falsos positivos. 
(Shwanitz, 2000) 
Técnicas invasivas. 
Estas técnicas tienen valor diagnóstico con una sensibilidad del 99.5% para 
detección de alteraciones cromosómicas. 
Muestreo de vellosidades conónicas. El muestreo de vellosidades 
coriónicas (CVS por .sus siglasen ingles) se ha constituido en una opción para el 
diagnóstico prenatal en el primer trimestre. El procedimiento se realiza mediante la 
guía directa de un ultrasonido por vía transcervical o transabdominal durante la 
semana 10-;1 2 de gestación y se ha disminuido signifICativamente el índice básico 
de aborto espontáneo. Se ha demostrado que los procedimientos más tempranos 
se acompañan de un índice mayor de pronósticos adversos. (Danforth, 2000; 
Camevale etat, 2003; Fitz, 1993; Carrera, 1998) 
Sangre fetal. Se realiza principalmente por dos razones: 1)por un resultado 
rápido; se dispone de los resultados citoge néticosen 48 o 72 horas comparado 
con los 10 a ·15. días requeridos para amniocitos o vellosidades que suelen incluir 
mosaicismo. Otras indicaciones para el muestreo de sangre fetal incluyen el 
diagnóstico defrastornos hematológicos en los que no se ha definido un defecto 
molécutar.(Gui;z:ar -Vazquez, 2001; Arias,1993; Carrera, 1998) 
Amniocenlesis. Steele y Breg (1969) demostraron la viabilidad de las 
células fetales para entrar en división, dado que solo las células fetales· en mitosis 
6 
presentan el material hereditarió ért forma de cromosomas permitiendola 
realización del cariotipo fetal. Desde entonces, fa amniocentesis como técnica de 
diagnóstico delcariotipo fetal se ha extendido debido a sus buenos resultados, 
senciHez y relativa seguridad. Tradicionalmente se realiza entre las semanas16 y 
18 pero la existencia de equipos ultrasonográficos más sofisticados y la mejora de 
las técnicas de cultivo citogenético, han permitido adelantar cada vez más la edad 
gestacionalen la que se realiza la toma de la muestra (amniocentesis précoz y 
ultraprecoz). (Medina-Gómez, 1984 y 1986; Hacket, 1991; Fitz-Símmons, 1993) 
En la actualidad, la amniocentesis en el segundo trimestre esta prueba 
diagnóstica prenatal invasiva que se practica más frecuentemente. El diagnóstico 
de trisomía' 21 a partir de células de líquido amniótico cultivadas obtenidas 
medianteamnioscentesis se publicó por primera vez en 1968 (Valenti,1968). 
El procedimiento se realiza con más frecuencia entre las semanas 16 y 18 
de gestación. Después de la valoración del feto por ultrasonido, incluyendo la 
localización de la placenta, se marca un sitio de inserción en el abdomen materno. 
El sitio debe elegirse para evitar tocar al feto. El ultrasonido es utilizado para 
checar la edad gestacional, la vitalidad' del feto, morfología y la existencia de un 
embarazogemelaL El ultrasonido es realizado antes y después de la punción. 
(Danfotrh, 2000, Carrera, 1998; Twining, 1993) 
Un caso especial son los embarazos gemelares que primero deben 
confirmarse, y luego, proceder a examinar a los dos fetos y a investigarla 
existencia de un tabique que separe las dos bolsas amniótkas a fin de poder llevar 
a cabo punciones separadas. La inyección de un colorante estéril diluido que 
7 
puede ser rojo fenal al 1% en Una de las dos bolsas puede completarla 
técnica. (Carrera, 1998, Fitz-Simmons, 1993, Giorlandino, 1994) 
El líquido amniótico obtenido por amniocentesis puede utilizarse para varios 
análisis. El más común es el cariotipo, que es un estudio que requiere de una a 
dos semanas para obtener el resultado: Actualmente se utiliza la técnica de 
Hibridación in situ con fluorescencia (FISH) para el análisis rápido de amniocitos 
. en interfase, en las aneuploidías más comunes. 
Liquido amniótico. 
En la actualidad el líquido amniótico (LA), es utilizado como fuente de 
información: capaz de proporcionar datos sobre la vida· intrauterina y la condición 
fetal. 
Se considera que el LA tiene un origen mixto: ovular, fetal y materno. El LA 
procede de células del amnios, que forma parte de las membranas y recubre 
también la placenta y el cordón, tanto por transporte directo como por elaboración 
de éste, mediante secreción (origen ovular). (Carrera,1998; Fitz-Sirnmons, 1993;). 
EI·fe~o contribuye gracias a su excreción urinaria y a su trasudación y eliminación 
de secreciones a través del conducto traqueobronquial. El líquido amniótico 
procede también de la trasudación de la sangre materna que circula por los vasos 
de la decidua. (Carrera, 1998; Arias, 1993). 
Con respecto al volumen del LA, se afirma que a las 10 semanas es de 30 
mi aproximadamente, y a las 20 semanas de unos 350 ml.(Lind y Carrera. 1982; 
Arias, 1993). Si se relaciona este volumen con la semana de gestación se obtiene 
8 
una parábola. Existe además una relación lineal y muy estrecha entre en volumen 
de LA y el peso del feto, 10 que indica que durante el primer trimestre, la cantidad 
del líquido depende especialmente del feto. El volumen máximo de LA se alcanza 
en la semana 35 y disminuye paulatinamente. (Carrera,1998; Arias, 1993, Fitz-
Simmons, 1993) 
El LA se renueva continua y rápidamente, esta renovación va acompañada 
de una eliminación constante, lo que constituye el recambio de LA. Durante la 
primera mitad de la gestación se elimina por las mismas vías de origen (dermis, 
amnios), durante la segunda mitad, la deglución fetal es la principal vía de 
eliminación. A medida que el embarazo avanza, la diferencia entre producción y 
eliminación ~determina la cantidad de liquido amniótico. (Arias, 1993, Carrera, 
1998; Medina-Gómez, 1986) 
Tipos celulares del LA. El LA contienen células procedentes de la 
reposición celular que ocurre tanto en el feto como en la membrana del amnios y 
del cordón umbilicaL Antes de la semana 14 se observan pocas células pero su 
número aumenta gradualmente hasta el final de la gestación. Casadey y co/s. en 
1 $65 describió los tipos celulares presentes entre las semanas 16-21 
gestacionales y trataron de determinar su sitio de origen comparándolas con 
células obtenidas ,mediante frotis celulares de diversas partes del feto, placenta, 
amnio$ y cordón umbilical. (Haswell, 1973; Medina-Gómez, 1986; Sundberg, 
1999) 
a) Células sin núcleo, poligonales y ovoides, con citoplasma translúcido. 
9 
b) Células superficiales, muy parecidas a a las anteriores pero con núcleo 
pequeño y picnótico. 
c) Células intermedias, poligonales y ovoides con núcleo grande y 
citoplasma denso. 
d) células parabasales, ovoides y cuboides, de citoplasma denso, con 
muchas vacuo las y núcleo grande. 
e) Células amnióticas, que incluyen 6 tipos morfológicos pero cuyo núcleo 
es característico. Son núcleos pequeños, ovoIdes o irregulares, con pequeños 
hundimientos en la membrana. (Medina-Gómez, 1986; Sundberg, 1999; Rebello, 
1991; Lam, yeo/s, 1998) 
Las celulas del tipo a, b y c proceden de la mucosa oral. Las células de los 
tipos a y b, que se encuentran formando láminas proceden de la piel del feto. Las 
células de los tipos d yej proceden de diferentes superficies de epitelio amniótico. 
Hoenhn, en 1967, describió que en el cultivo de LA se observa un gran 
p[eomorfismo celular. Se observan principalmente tres tipos de células: de tipo 
.epitelial, fibroblastoides yamniocitos. Los amniocitos son de origen. fetal y 
proceden principalmente de la piel. fetal y del amnios. Las célulasepitelioides 
derivan de la piel fetal, vías genitourinarias, aparato respiratorio y digestivo, 
vagina, conjuntiva y amnios. En el tercer trimestre se observan células que se 
tiñen especialmente con naranja de crecilo. Estas células están relacionadas con 
queratinización en el feto. Este proceso se inicia alrededor de la sell1ana 24. 
Algunas veces se observan en el líquido amniótico células de tipo neural, lo cual 
es indicativo de defectos de cierre de tubo neural (DCTN). 
10 
Tabla 1. Características de las células de líquido amniótico observadas en cultivo 
(tomado de Medina-Gómez, eta!. 1986) 
Ad~ones celulares 
PermOllenfes con 
Apecto de 
em rado 
~istentes. ala 
tri sinÍ%aeión 
Corta longevidad 
Amniocitos 
Itivadaspor 
otencialdecrecimiento 
Menor Q la mitad de los 
Cultivos de fibroblastos 
Diploides ·humanos 
oide 
multinl.lcleadas 
Potencial de crecimiento 
Igual al de los cultivos de . 
Fibroblastos diploides 
humanos 
El comportamiento de las células epiteliales, fibroblastoides y de los 
amniocitosen cultivo es diferente. El tipo celular que da mejores resultados par la 
obtención de Illetafases son las células fibroblastoides, seguidos de los 
aml1iocitos y, al final, las células epitelioides; además de que las células 
fibrQblastoides se pueden mantener durante largos períodos de tiempo, a 
diferencia de las células epitelioides que suelen cultivarse pobremente y no 
resisten más de tres ciclos. (Medina-Gómez, 1986) (Tabla 1) 
11 
Cultivo celular. 
El cultivo celular comenzó a utilizarse a finales del siglo antepasado con la 
. finalidad de mantener y propagar células fuera del organismo de origen, sin la 
influencia de las variaciones sistémicas que se presentan en los organismos. 
(Freshney, 1994;González-Morán, 1996;Pollard & Walker, 1997) 
El cultivo celular se podría definir como el crecimiento de células.disociadas 
del tejido original,. por migración o dispersión mecánica oenzimática" (Freshney. 
1994). 
Para un cultivo en monocapa (de tejidos· sólidos) • .las células tienenque 
pegarse al sustrato, es decir, son dependientes de anclaje, teniendo así la 
oportunidad de propagarse.· Para las células dependientes de anclaje es 
prerrequisito el contacto con el sustrato sóHdo. (Freshney, 1994; Pollard & Walker, 
1997). 
Los cultivos en suspensión se derivan de células que pueden sobrevivir y 
proliferar sin pegarse (células hematopoyéticas, líneas celulares transformadas y 
de tumores malignos, células Hela). (F reshney, 1994; Pollard & Walker, 1997). 
En general todas las células normales en cultivo tienen un potencial de 
crecimiento • diferente que está formado por una fase de inicio lag (o de 
adaptación)~la fase de gran crecimiento (exponencial o logarítmica), una 
estacionaria, y una de descenso o muerte. Estas etapas de crecimiento dan la 
posibilidad de obtener subcultivos en confluencia a corto o mediano plazo. 
(González -Morán, 1996; Freshney, 1994; PoHard & Walker, 1997) 
12 
El cariotipo fetal humano puede ser determinado en fas células cultivadas 
de líquido LA. Las amniocentesis pueden realizarse desde la semana 11, sin 
embargo, el criterio para elegir la semana en la que se realizará el proceso 
depencie del médico, ya que él es quien refiere a la paciente. El líquido amniótico 
presenta una población celular muy heterogénea: hay células que derivan del 
amnios, piel, o de los sistemas urogenital, respiratorio o digestivo.(Freshney, 1994; 
González -Morán, 1996; Pollard & Walker, 1997) 
El cultivo de células de LA se basa en la separación de células y 
sobrenadante por centrifugación y poner la suspensión usando el método de 
cubreobjetos y frascos conservando el cultivo en un sistema abierto y húmedo, 
.. conunaatmosfera de CO2 al 5% y una humedad de 95%.(Freshney,1994) 
Citogenética humana. 
Los avances logrados durante el siglo XX en las áreas de la citología, la 
genética y la bioquímica, han permitido desarrollar el área de la citogenética. Esta 
ciencia busca las bases citológicas que expliquen los eventos hereditarios. 
Podemos dividir ala citogenética en clásica y molecular. En citogenética clásica se 
realizan cariotipos con diferentes tipos de bandeo .en los cuales se analiza a cada 
uno de los cromosomas. En citogenética molecular se utiliza al DNApara la 
identificación del cambio, entre las téCnicas utilizadas en este campo se encuentra 
la hibridación in sítu con fluorescencia (FISH).(Salamanca, 1991; Rooney& 
Gzepulkowski, 1966; Sáes &Cardoso, 1978) 
Para el análisis en citogenética clásica, lo más común es la obtención de 
cariotipos y su análisis por diferentes técnicas (BandasG, C, Nor, Q ó R) . 
13 
Metacentrico 
.-23 -21 P 
~Cen 
-12 
-21.1 
-21.3 
-22.2 q 
-31 
Submeto.céntrico 
(s!)-~<P. _. :~c;a) ~ 
-12 
-21 
-23 q 
-24-2 
-~I 
-342 
Acrocéntrico 
Figura 1. Morfologías cromosómicos según localización delcentr-ómero. Si el centrómero 
estálocaUzado en la parte media. metacéntrico. Si .el centrómero está desplazado hacia 
uno de Jos brazos, se forma un brazo corto y un t:.razo largo, el cromOSOMa es 
subme.tac.éntrico. Si el centróme.ro está hacia el extremo del brazo corto, quedando este. 
último muy corto, el cromosoma se COAOCe como a.crocéntricO. 
Cariotipo. 
Uncariotipo es el análisis y ordenamiento de los cromosomas de acuerdo a su 
tamaño:, a la localización y posición del centrómero y a su patrón de bandas. La 
palabra . cariotipo, se refiere estrictamente al complementocromosómico de un 
organismo tal como aparece en una metafase. El ¡diograma corresponde a la 
ordenacióndet cariotipoen pares homólogos. Sin embargo, el uso de la palabra 
cariotipo.se ha generalizado para indicar un complemento cromosómico.ordenado 
en pares ya sea en forma fotográfica o en dibujo; mientras que elidiograma se ha 
refenctoa la representación gráfica de un cariotipo, basada en datos obtenidos de 
la medición de los cromosomas en un cierto número de rnetafases. (Salamanca. 
1991; Hooney & Czepulkowski, 1966; Sáes & Cardoso, 1978). 
La identificación . individual de los cromosomas es en muchos casos 
probl~mática;debído a la similitud morfológica entre varios pares de cromosomas. 
14 
Los patrones más utilizados son la relación de brazos, obtenida de dividir la 
longitud del brazo largo por la del brazo corto y el índice centromérico, que esta 
dado por el resultado de dividir la longitud del brazo corto entre la longitud total del 
cromosoma. 
Los pares de los cromosomas ene! cariotipo humano están numerados del 
/ 
1al 22, además del par sexual y están organizados por grupos. 
Una vez realizado el análisis microscópico de Jos cromosomas se elige una 
metafase, la cual es fotografiada. Los cromosomas son ordenados en pares 
. homólogos, formando uncariotipo. Este ordenamiento se hace de acuerdo al 
tamaño del cromosoma, la posición del centrómero y otras características tales 
como algunás constricciones secundarias, satélites, etc. (Figura 2a y 2b) 
a n I( b '; 16 "'It ',/ lt [( -. U JI 1~ 'í t! U 
iI U U U H 11 JI ii Ji ti " •• 11 ., . • tr U 
ti U ti H 11 U U it U U ea U 
ti ti •• H J. . , II ... ull 
Figura. Z. RepresenfQCiÓftesquemática decariotipo. Después de que las metafQ.Ses son analizadas, 
se procede Q .ClMnárel coriotipo, a) Representación de un cariotipo masculino y b) cariotipo 
f·emenino. 
Por otra parte, cuando se realiza un cariotipo es importante analizar la 
calidad de la laminiUaque se obtiene después de la preparación de la muestra. 
15 
Una laminilla se considera de buena calidad para el cariotipo cuando reúne 
las siguientes características: 
1.-, Debe corresponder a una categoría 2 -3 en contraste de fases. 
2.- No debe estar confluente. 
3.- Los cromosomas no deben estar cruzados o amontonados. 
4.- No debe tener citoplasma, ya que esto dificult~rá el bandeo y alterará la 
morfología de los cromosomas. 
5.- No debe estar escasa, ya que esto hace más lento el proceso de 
análisis. 
6.- Las cromatidas deben estar juntas. 
7. - Los cromosomas no deben ser cortos. 
8.- No deben tener restos de ninguna clase, plástico o pelusa, que interfiera 
en el proceso de secado y el bandeo. 
La clasificación de las laminillas en cuanto asu calidad para hacer un 
análisiscitogenético correcto (Según Donlon, 1975) se presentan en la siguiente 
tabla: 
Tabla 2. Caractertsticasde .1(1$ diferentes categorías de laminiDas 
. obtenidas después de la cosecha, según Donlon. 
Características en contraste de fases 
(poco contraste) bordes no definidos, 
Con cromatidas abi 
Contraste. 
4 CrOmosomas· con bordes ·b.en definidos y alto contraste, 
.1.0 cual les confiere un aspecto tridimensional. 
16 
Los cromosomas humanos pueden ser sometidos a técnicas de estudio 
indirectas y directas. 
Técnicas indirectas. Estas técnicas aportan datos sobre la presencia yel 
número.de cromosomas sexuales. 
Técnica directas. Sirven para proporcionar información sobre el número y 
morfología de todos los cromosomas, a través de la representación esquemática: 
el cariotipo, para lo cual es necesario el cultivo cetular. 
Cariotipo mediante técnicas de Bandeo. Con estas técnicas es posible 
efectuar una precisa clasificación de los cromosomas, los cuales pueden ser 
identificados por su perfil de bandas. (Paris Conference, 1972) 
Alteraciones numéricas y estructurales en cromosomas humanos~ 
El estudio de la variación de los cromosomas ha revelado que un cambio en 
el nÚmero de estos o en el ordenamiento de las regiones que lo conforman puede 
dar lugar a variaciones fenotípicas o a la interrupción· del desarrollo del organismo 
(Boargaonker, 1989). 
La variación en el número de cromosomas va desde la adición o pérdida de 
uno o más cromosomas a la adición de una o más dotaciones haploides de 
cromosomas. Cuando un organismo gana o pierde uno o más cromosomas pero 
no una dotación completa, se origina una aneuploidía. (Klug & Cummings, 1999; 
Mutler, 1998) 
.Aneuploidías autosómicas. Son casos en los que se ha añadido ose ha 
perdido unúnico cromosoma respecto de la dotación normal de cromosomas. A la 
17 
'- -
pérdida de un cromosoma se le denomina monosomía, a la ganancia de un 
Cromosoma se le denomina trisomía, tetrasomía, etc. 
Algunos estudios revelan que al menos entre 15 y 20 % de todos los 
embarazos, terminan en aborto espontáneo y entre el 40 y 60% de estos abortos 
presentan alguna alteración cromosómica.{Thompson & Thompson,1996; Carr, 
1.971 } 
Los ejemplos más comunes de trisomías autosómicas son trisomía 13 o 
slndrome de Patau; trisomía 18 o síndrome de Edwards y ,la trisomía 21 o 
síndrome de Down. (Goldberg & Norton,2000; Guizar-Vázq uez,200 1 ) 
Las aneuploidías de cromosomas sexuales se caracterizan por un 
desarrollo séxual anormal. En este caso podemos observar la única monosomía 
(qUe se presenta en mosaico) en humanos: 45,X o síndrome de Turner. 
(Borgaonker, 1989, Ktug & Cummings, 1998; Muller, 1998) 
Otro padecimiento común de cromosomas sexuales es el síndrome de 
Klínefelter o 47,XXY. Los cariotipos 48,XXXY, 49,XXXXY y 49,XXXVY son 
similares- fenotípicamente aunque el déficit mental aumenta de acuerdo con el 
número de cromosomas X. Otro caso es elcariotipo 47, XXY(Borgaonker, 1989, 
Klug & Cummings, 1998; Muller, 1998). 
Los cromosomas también pueden presentar variaciones estructurales que 
, eliminan, añaden o reordenan partes sustanciales de uno o más cromosomas. Los 
cambios estructurales se deben a una o más rupturas distribuidas a los largo del 
cromosoma, seguidas por la pérdida o la reordenación del material genético. 
(Guizar-Vázquez, 2001; Guizar Vázquez & Zafra; 1999; Salamanca, 1990) 
18 
Deleciones. Es la pérdida de un segmento cromosómico. Pueden ser 
terminales o intersticiales. (Boargaonker,1989; Guizar- Vazquez, 2001; Muller, 
1998; Sack, 1999). 
Duplicaciones. Es la presencia de una copia adicional de un determinado 
segmento cromosómico. (Boargaonker,1989; Salamanca, 1990, Muller, 1998; 
Sack, .1999; Valentine, 1970) 
InverSiones. Es un cambio de 1800 en la orientación de la informaoonde 
un segmento. cromosómico. Dependiendo de si contiene o no el centrómero 
podemos hablar de inversión pericéntrica o paracéntrica. (Klug & Cummingst 1999; 
Salamanca, 1990; Kaiser, 1984:Carr,1971; Boargaonker,1989) 
TransÍocaciones. Es el intercambio de material genético entre dos 
cromosomas diferentes. Se habla de translocación balanceada cuando el 
intercambio es total y no balanceada cuando se produce un defecto o exceso de 
materialcromosómico. (Rooney & Czepulkowski, 1986; Salamanca, 1990) 
/ 
Existen diferentes tipos de translocación: Recíproca (intercambio de 
regiones entre dos cromosomas no homólogos), tandem (la unión de dos 
cromosomas en las regiones teloméricas), la robertsoniana (entre dos 
cromosomasacrocéntricos). El cuarto tipo es la de brazo único en donde hay una 
ruptura a nivel centromérico de dos cromosomas no acrocéntricos. 
(Patterson,1987) 
Cromosoma en anillo. Es la ruptura de los dos telómeros y la fusión 
posterior de ambos brazos del cromosoma. 
19 
Deleciones. Es la pérdida de un segmento cromosómico. Pueden ser 
terminales o intersticiales. (Boargaonker.1989; Guizar- Vazquez, 2001; Muller, 
. 1998; Sack, 1999). 
Duplicaciones. Es la presencia de una copia adicional de un determinado 
segmento cromosómico. (Boargaonker,1989; Salamanca, 1990, Muller, 1998; 
Sack, 1999; Valentine, 1970) 
Inversiones. Es un cambio de 1800 en la orientación de la información de 
un segmento cromosómico. Dependiendo de si contiene o no el centrómero 
podemos hablar de inversión pericéntrica o paracéntrica. (Klug & Gummings,1999; 
Salamanca, 1990; Kaiser, 1984; Garr,1971; Boargaonker,1989) 
Transiocaciones. Es el intercambio de material genético entre dos 
cromosomas diferentes. Se habla de translocación balanceada cuando el 
intercambio es. total y no· balanceada cuando se produce un defecto o exceso de 
material cromosómico. (Rooney & Gzepulkowski, 1986; Salamanca, 1990) 
Existen diferentes tipos detranslocación: Recíproca (intercambio de 
regiones entre dos cromosomas no homólogos), tandem (la unión de dos 
cromosomas en las regiones teloméricas), larobertsoniana (entre dos 
cromosomas acrocéntricos). El cuarto tipo es la de brazo únicoen donde hay una 
ruptura a nivel centromérico de dos cromosomas. no acrocéntricos. 
(Patterson,1987) 
Cromosoma en anUlo. Es la ruptura de los dos telómeros y la fusión 
posterior de ambos brazos del cromosoma .. 
19 
Isocromosoma. Es un cromOsoma con ambos brazos idénticos. Es muy 
frecuente en Xq dando origen a síndrome de Turner. (Rooney & Czepulkowski, 
1966; Sáes & Cardoso,1978) 
Lugares frágiles. Son sitios cromosómicos susceptibles de sufrir rupturas 
cromosómicas cuando. se cultivaban en ausencia de ciertas sustancias químicas 
comoelácidofólico.(Dearce& Keams, 1984; Sutherland, 1984; o ostra , 1992). 
20 
JUSTIFICACiÓN 
Algunos autores sugieren que la amniocentesis puede realizarse desde la 
semana 12 (amniocentesis temprana) y obtener el resultado 3 semanas después; 
sin embargo, en estos casos se presenta un alto índice de mosaicismo. Otros 
autores reportan que las amniocentesis medias (semana 14-15)presentan buen 
crecimiento, se obtiene un reporte en dos semanas y el riesgo de observar 
mosaicos se reduce significativamente. Por lo tanto. es importante conocer en 
nuestra población cual es el tiempo idóneo para realizar la amniocentesis 
relacionándolo con el efecto de la edad gestacionat, la calidad del cultivo y el 
tiempo de crecimiento del mismo, así como la presencia de mosaicos y de . esta 
maner<;llográrla eficientización en la entrega de un resultado confiable. 
21 
OBJETIVOS 
Objetivos generales. 
a} Conocer las caracteristicasidóneas para la realización de amniocentesis considerando 
el efecto de la edad gestacional sobre el tiempo de crecimiento y calidad del cultivo. 
Objetivos .particulares: 
*Conocer la semana gestacional en la cual se obtienen cultivos para análisis 
. citogenético en tiempo óptimo. 
*Correlacionar los resultados citogenéticos con la indicación porla cual acudió la 
paciente a diagnóstico prenatal. 
*Relacionarla morfología celular con taedad gestacional. 
*Conocer la dinámica de crecimiento celular de los diferentes tipos celulares. 
22 
,. 
MATERIAL Y MÉTODOS. 
Durante el período de Octubre de 2002 a Diciembre de 2003 se analizaron 
312 muestras de liquido amniótico (LA) en el Departamento de Citogenética de 
Laboratorios Clinigen S.A. de C.v. Todas las muestras se obtuvieron por punción 
transabdominal. Las amniocentesis se realizaron en un periodo de edad 
gestacional entre la semana 13.0 y fa 32.0. 
Arnniocentesis. 
Toma de muestra. Todas las punciones se llevaron a cabo de la manera 
convencional, con un estudio ultrasonográfico previo a la punción, comprobándose 
la viabilidad fetal, la concordancia entre la edad gestacional según la fecha de 
última menstruación y por fetometría; el número de fetos, la localización 
placentaria y la cantidad de líquido amniótico presente. Bajo dirección 
ultrasonográfica directa y continua, en condiciones estériles, se procedió a la 
extracción deUquido con aguja especial para amníocentesis, extrayéndose, 
mediante aspiración 20 mi de líquido. 
Siembra. Se sembraron 6culíivos primarios y un cultivo principal en botella de25 
cm2.~ Cada muestra fue dividida en dos tubos cónicos (Falcon) de 15 mi tomando 
para uno 14.5 mi y para el otro de 5.5-6.0 m!, los cuales fueron centrifugados a 
1,500 rpm (DYNAC centrifuge, Ctay Adams) durante diez minutos. 
Una vez obtenido .el botón celular, el sobrenadante del tubo con 14.5 mi fue 
alicuotado .en dos viales de 2 mi para realizar el análisis bioquímico y de alfa feto 
proteína, el resto fue desechado dejando únicamente 1 mI. Posteriormente se 
23 
agregaron 3.5 mi de medio Amnj()max (Gibco). Las células fueron resuspendidas y 
se tomaron 0.75 mi los cuales fueron colocados sobre uncubre objetos de 
22x22mm el cual se encontraba dentro de una caja petri de 2.5 cm de diámetro 
(Falcon), haciendo un total de 6 cajas. 
Figura 3. Tomo. de liqyido amniótico. El personal utiliza ropa de 
quirófano durante la punción. . En la figura se observa el 
ultrasonido y los campos estériles que rodean la zona de punción. 
24 
Conirifugae1ón 
Pared uterina 
GllQtió'fica Cul'fiw 
",!alar 
f 
l 
t Compo:ición 
j de LÁ 
lbe'termiftacióft 
'de_xo. 
ÁntÍltsi: 
bioquiinico 
Figura 4. Representación esquemática ·de la toma de muestra y 
su procesamiento en el laboratorio. 
Al otro tubo de LA, se le retiró el sobrenadante hasta dejar 1.5 mI. Se 
agregaron 2.5 mi de medio y la mezcla se vació en una botella de cultivo de 25 . 
cm2 {F alcon} cubriendo toda la superficie. 
Las células se crecieron en una incubadora (Jouan IGO 150) con una 
. humedad del 95%, una atmósfera de 5% C02 y a una temperatura de 37°C. 
Análisis bioquímico. ,Se utilizaron 0.8 mide LA y se colocaron sobre tiras 
reactivas (Bayer Multistix 10) para conocer las concentraciones de glucosa, 
bilirrubina, cetona, gravedad específica, pH, proteínas, urobilinógeno, nitritos y 
leucoqitos. Se tomó una alícuota de 2ml de LA .para medir la concentración de a-
fetoprotéí na. 
Se elaboró una hoja de registro donde se llevó un control del monitoreo de 
'os cultivQs,en donde se anotó la fecha en que se recibió la muestra y se sembró, 
25 
la edad gestaCienal, análisis biequímtt;ó, días que tardaren en adherir las células y 
formar colonias, les días de en que se cambió el medio y el día que se cosecharon 
además características y tipos celulares ebseNades. 
Cosecha. Un parámetro importante para decidirla cosecha, fue obseNar 
en promedio cuatro a seis colonias por cultivo y aproximadamente 50 metafases. 
A cada caja se agregó 6.6x 10 -3fl9 de colcemid (Gibco)Y Bromuro de etidía 
O.01mg en .solución salina Hank's (Microlab) y se dejó incubar a 37°C durante 40 
minutos (min). Pasado este tiempo el medio se retiró y se agregaron 3 mI de 
solución hipotónica (0.75 M de citrato de sodio) previamente calentada a 37° e, 
dejando la solución durante 20 mino Después se agregó a cada cajita 2ml de. 
fijador frío, a -14°C (m~c1a metanol- ácido acético 3:1, ambes de Merck) durante 
1 minuto. Se retiró la solución de la caja y se agregaron 3 mI de fijader y se dejó 
durante 20 mino Posteriormente se retiró el fijador usado y nuevamente se 
agregaron 3 mi de fijador frío durante 15 mino Pasando este tiempo las células 
fueron "levantadas". (Salamanca, 1990; Saes &Cardese, 1978) 
. Levantamiento de .células. Una vez fijadas las células, se quitó el exceso 
de fijador, la laminilla.se sopla y se acerca al caler producide por una lámpara de 
alcohol. 
Una vez cosechados lo cultivos, se pusieron a madurar durante 24 heras en 
una estufa (Felisa 131A) a60d e para quitar el exceso de agua y posteriormente 
fueron bandeadas . 
. Bandeo cromosómico: Bandas G. Para poder analizar citogenéticamente 
las laminitas obtenidas fue necesario utilizar la técnica de bandas G, descrita 
26 
anteriormente, con algunas modificaciones. El tren de bandeo utilizado fue el 
siguiente: 
En un vaso copling se mezcló 1 mi de tripsina (Gibco 1 :250) con 50 mi de Buffer de 
Fosfatos pH 7.2 (1 pastilla Gurr más 9g de cloruro de sodio), dos copling más cada 
uno con buffer pH 7.2; un copling más con 40 mi de Giemsa (Merck) (34 mi de 
Buffer de fostatos ph 6.8 (pastillas Gurr) y 6ml de solución madre de Giemsa);.un 
copling más'con agua corriente. 
a) En la solución de tripsina se dejaron las laminiftas 1.20 minutos. 
b) Se enjuagaron en el primer buffer pH 7.2 para detener la reacción y se dejaron 
1.30 minutos en el segundo buffer pH 7.2. 
e) Las laminitas pasaron a la solución de Giemsa(Merck) y se dejaron durante 
3.15 minutos. 
d) Se dejaron secar al aire, se montaron con una resina plástica (Entellan Merck) 
y se observan al microscopio. (Salamanca, 1990) 
Subcultivos. En casos donde el material obtenido era escaso y de muy 
baja resolución, se hicieron subcultivos del cultivo principal (Botella 25 cm o cultivo 
A). Una vez que las células formaron una monocapa,las botellas eran lavadas con 
1.5 mi de solución salina de Hanks (Microlab), y posteriormente se agregaba.2 mi 
de tripsina EDTA 0.025% (1X) durante 1 ó 2 min para desprender la monocapa 
celular. Para detener la reacción se utilizaron 2 mi de medio Amniomax, lavando 
con esa mezcla la botella. Esta mezcla fue retirada y se vació en tubos cónicos de 
15 mi los cuales se centrifugaron durante 10 min a 1500 rpm. El botón celular se 
resuspendió con medio y dependiendo del tamaño del botón se vaciaba en 2 Ó 4 
cajas petrí con cubreobjetos. 
27 
En algunos casos, se procesaron muestras de linfocitos de sangre 
periférica de los padres para obtener el cariotipo, buscando en ellos algunas de las 
alteraciones encontradas en los líquidos amnióticos. 
Una vez obtenidos los cultivos, estos fueron analizados. Se revisaron en 
promedio 25 metafases por caso, incrementando el número en algunos casos en 
donde se observaron alteraciones. 
En algunos casos se utilizaron técnicas especiales como bandas C y NOR: 
Cariotipo. Una vez que se han analizado lás metafases necesarias se 
elige una para fotografiarla y armar el cariotipo. Para capturar la imagen se utilizó 
'el programa de Image Pro deMedia Cybernetics y la imagen fue procesada en un 
programa de kariotype builder de EDCl. Se entregaron reportes escritos que 
incluían una fotografía de la metafase elegida yel cariotipo armado. 
28 
RESULTADOS 
Durante el período de 15 meses ~se obtuvieron 312 muestras de líquido 
amniótico (LA) con edad gestacional entre la semana 13 y32 sin presentarse 
ninguna complicación en el feto o en la madre. El 1.8% correspondieron a la 
semana 13. El 12.4% pertenecieron a la semana 14, el 47% se encontraban entre 
la semana 15 y 16 gestacional; el 23.5% correspondieron a las semanas 17 y 18. 
El 5.3% tenian19 semanas y el resto (10.%)tenian 20 Semanas o más (Figura 5) 
NÚMERO DE CASOS POR EDAD 
GESTACIONAL 
NUMERO DE 50 
CASOS 40 
I ¡ ¡ 
13 ·14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 2627 28 2930-
EDAD GE:STJl~CI()N'IL 
Figura 5. Pacientes referidas según su edad gestacional. 
29 
· Se realizó el cultivo celular y el análisis citogenético en cada una de las 
muestras. Se obtuvo el cariotipo en el 100% de los casos, teniendo que repetir tres 
punciones, dos por falla en el cultivo y una más para confirmar un mosaico. 
Se observó que del total de los cariotipos analizados, el 5.12% tenían 
alguna alteración. Los cariotipos anormales se detectaron en el 56.25% de los 
Varones y el 42.25% correspondieron a mujeres. Las alteraciones estructurales 
fueron las anormalidades más frecuentes (75%). Sin embargo, la mayoría de estas 
alteraciones eran balanceadas,por lo cual no se presentaron alteraciones en el 
fenotipo. (Figura 6) 
RESULTADOS OBTENIDOS POR 
CARIOTIPO 11 Normal XX 
111 Normal XY 
O Alteraciones XV 
48% o Alteraciones XX 
3% 
Figura ·6. Porcentajes de' análisis citogenético·de cariotipos normales y alterados de 
acuerdo al sexo 
La indicación de referencia para la realización de la amniocentesis más 
frecuente fue por EMA (54.5%, figura 7), de los. cuales sólo el 3% presentó 
alteraciones en el cariotipo. El 20.5% de las pacientes fueron referidas por triple 
30 
marCador positivo en sangre materna. En estas se encontró un cariotipo alterado 
en el 11 % de los casos. De las pacientes referidas por antecedentes de 
cromosomopatías en la familia (4.5%), se confirmó un cariotipoalterado en 35.7% 
160. 
140. 
120. 
. 10.0. 
Número de 
casos 80 
60.. 
40. 
20. 
INDICACIONES DEL ESTUDIO 
o. -1""""---,'--
<t-"r-
Antecedentes 
00:1 . 
o-..s 
Figuro 7. Indicaciones para la realización del estudios de amniocentesÍ5. Se . observa que. 
la edad mcrterna avanzada es la indicación másfrecuentc~ seguida del triple m~ ensuero materno. 
Se realizó una correlación entre la edad gestacional. la aparición de 
colonias y la cosecha encontrándose que no hay ninguna relación entre la edad 
gestacional y el·crecimiento en cultivo (tabla 4 y figura 8 y 9).·Se aplicó una prueba 
de X2 (p>.025), y se encontró que no existe relación alguna entre las variables 
mencionadas,es decir que la edad gestacional no influye en el tiempo para 
31 
obtener el cariotipo y que los datós obtenidos Se deben totalmente al azar. Por 
otro·lado, se observaron diferencias en la población celular observada y la calidad 
de metafases obtenidas. 
Tabla 4. Correlación entre la edad gestacional, aparición de colonias y cosecha. 
Variable I Obs Promedio Desv. Est. Max 
------------~+----_:...~---------------------------~-------------------.. -
caso I 311 156.9228 90.18648 1 312 
. edad materna I 311 35.61415 5.096393 20 54 
edad gestac. I 311 16.18911 2.345763 13 32 
in(Ü.caciÓn .1 O 
formacipn coL 311 5.012862 1.228622 1 10 
------_ .. ------+--------_._----------------------------------------------
tiEllllPOcosehal 311 10.54984 2.158985 6 18 
(Ü.asentregal· 311 15.54984 2.698254 10 26 
cario tipo 1 O 
primarios! 287 5.644599 .8273074 2 6 
subcultivos '1 19 2.894737 1.286457 1 6 
-------------+----..; .. --------------------------------------------------
... metafases 293 25.4.1297. 4.610526 15 75 
. resolución." 252 403.7698 24.35778 300 600 
32 
o • 
• • • 
<P ••• 
o 
• • • • • • • • 
• • • • • • • 
• • • • • •• ••• 
• • • • • • • ••• 
• 
•• • • •• • • 
• • 
• 
15 
• 
20 25 
E Gestac. 
• 
• • 
30 35 
Fig. 8. RelGclOn entre et tiempo de formación de colonias con la edad gestacionat. 
r=-.090 
o 
N 
U') 
tU .... 
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8 
o a. 
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• • 
• 
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• • • • • • 
• • • • • 
• • • • • 
• • • 
• • • • • • 
• • • • • 
• • • • 
• • 
15 
• 
• 
• 
• • 
• • • 
• 
20 
• 
• 
• • 
• 
25 
EGestac. 
• 
• 
• 
30 
Fig. 9. Relac:ión entre el tiempo de cosecha y la edad gestacional. 
r=-.106 
35 
33 
El tiempo promedio en el que se obtuvieron colonias en todas las edades 
gestacionales fue de 5.0 días y de cosecharon a los 10.48 días. 
Al iniciarse los cultivos se observaron principalmente células de dos tipos: 
células de descamación, grandes y poligonales, las cuales no persistieron durante 
el cultivo; y células pequeñas redondas u ovaladas, refringentes, qule fueron las 
que se mantuvieron durante todo el tiempo de cultivo. Entre el 20 y 40 día se 
observaron células formadoras. de colonias. Después de la siembra, entre el 3° y 
7° día se observaron colonias de células fibroblastoides y epitelioídes. 
De forma general se observaron dos tipos celulares predominantes: células 
fibroblastoides y células epitelioides. No se observó el tipo mixto ó células de 
liquido amnlótico. En dos casos se presentaron células neuronales, las cuales 
presentaron un crecimiento muy rápido. Estos casos se refirieron por 
antecedentes ultrasonográficos de DCTN, los cuales fueron confirmados al 
interrumpir las gestaciones. 
Las colonias epitetioides que se observaron eran formadas por células 
redondas con citoplasma irregular que tienden a crecer formando "islas". 
difícilmente se desprendieron de la superficie cuando se realizó el subcultivo. 
(Figura 12) 
Las colonias fibroblastoides (figura 13 y 14) se encontraron formadas por 
células en forma de huso que emiten prolongaciones largas, se dispersaron 
adquiriendo una disposición paralela. Estas alcanzaron rápido una gran densidad, 
setripsinizaron fácilmente yse subcultivaron por varias generaciones. 
En los cultivos de menos de 15 semanas y de más de 20 semanas de 
gestación se observaron frecuentemente colonias de células epitelíoides. los 
34 
cromosomas obtenidos fueron cortos y de poco contraste en el bandeo,además 
de. presentaron mucho citoplasma. 
Las colonias de células fibroblastoides fueron abundantes y se obtuvieron 
metafases sin citoplasma con buena estructura cromosómica, lo que se reflejó en 
. el bandeo facilitando el análisis citogenético. Esto se presentó frecuentemente en 
los cultivos de semana 15 a 18. Se observó una relación entre el tipo celular 
presente en el cultivo y la calidad de las metafases obtenidas (Tabla 5). 
Cuando se analizó la relación entre la edadgestacional y la citología del 
cultivo, se observó que esta última cambia, de acuerdo a la edad gestacional y 
que además esto también afecta al bandeo ya que en edades gestacionales entre 
·'asemana 1;5 y 18 se observan colonias decélulasfibroblastoides que se bandean 
muy bien (clasificación 3 y 4). En cambio en los cultivosde semana 13 y 14 Y 
después 19 el tipo celular predominante son las célulasepitelioides. 
La tasa de fallo en el cultivo fue de 0.64%, ya que se repitieron, dos 
. punciones por fallos en el cultivo, en ambos casos la edadgestacionalfue de más 
de 20 semanas, 
35 
EDAD GEST ACIONAL y 
COMPORTAMIENTO EN CULTIVO 
Semanas de gestación . 
FtgUra 10. Gráfica que indica los días en que se observaron colonias .establecidas y los 
días de cosecha de las muestras de liquido amniótico. El promedio de días en que se 
observan· células adheridas es de 4.94 días. Elpromedic) de cosecha en días es de 
10_27 días. . 
36 
Tabla 5. Número de muestras por' eclctd gestational y detalles de los cultivos obtenidos 
por amniocentesis entre la semana 13 -34 
Edad No. Colonias Cosecha Tipo celulares observados Cosificación 
Gestacional Casos (días) (días) Según Donlon 
13 6 4.6 9.5 Pocas epitelioides y pocas 3y4 
Fibroblastos 
14 41 5A 10.8 Pocas EpiteHoides y Fibroblastos 2 
15 104 5.3 10.7 Fibroblastos obundontes. 2-3 
epitelioides 
16 66 5.1 10.9 Fibroblastos pocos epitelioides 2-3 
17 37 4.9 10.3 Fibroblastos .• pocas células 3 
epiteliales 
18 25 4.5 9.8 Fibroblastos. células epiteliales 3 
19 14 4.8 11 Fibrobiastos y célulasepiteliale.s 2 
abundantes 
20 ... 22 10 5 lOA Células epiteliales abundantes. 1-4 
pocos fibroblastos 
23-- 9 4.9 9.1 . Células. epiteliales, fibroblastos ly4 
escasos 
37 
Figura 11. Cultivo de células de líquido amniótico al 2° día después 
, De la siembra. Se observan células de tipo fibroblastoides y 
. Epitelioide.(Contraste de Fases x 4O} 
Figura 12. Cultivo de células de líquido amniótico el 5° día 
Después de .10. siembra. Se observa. una colonia de. células 
Epitelioides. (Contraste de Fases x 40) 
38 
Figura 13, Colonia de c::élulas fibroblastoides 100. día . Se observan varias 
célulqs en metafase. (células redondas y refringentes) (Contraste de Fases x 40) 
, 
Figura 14. CoJoni(1 de células fibroblastoic:fes a los 13 días de Iq siembrQ 
Se observan numerosas células en metafase (células redondas y refringentes). (Contraste 
de FQ$~s x 40) 
39 
EDAD MATERNA AL MOMENTO DEL 
ESTUDIO 
Número de 
casos 
2Q...25 26-30 
Edad materna 
Fi9~lQ Edad materl1Cl al momento de la punción, se observa que la ft'I<lyOf'ÍG de las 
pclcientes. tenían más de 35 cüíos 
40 
DISCUSiÓN. 
La amniocentesis practicada entre la semana 13 y 18 gestacional permite 
hacer. el. diagnóstico de anomalías cromosómicas y de muchas otras 
metabolopatías, además de conocer el sexo del producto en el caso de las 
enferl1ledadesligadas al cromosoma X. 
La implementación de técnicas de amniocentesis tempranas es una 
alternativa que se ofrece en loscentros de diagnóstico prenatal. 
En el presente trabajo se obtuvieron algunos hallazgos en cuanto a la 
proporción de alteraciones en el cariotipo. Estos hallazgos se refieren a que 
debido a que la indicación más frecuente para la realización del cariotipo fue la 
Edad Materna Avanzada, se esperaba que la mayor parte de las alteraciones 
fueran variaciones en el número de cromosomas (Hook, 1990; RYVEMCE,2002), 
sin embargo, se encontró que las alteraciones estructurales fueron más 
frecuentes. Es probable que la elevada presencia de alteraciones estructurales se 
deba a que las muestras estudiadasson en su mayoría pacientes que asisten 
. regularmente a consulta de asesoramiento genético y que son en su mayoría 
portadores de algún trastorno . 
. Uama la atención que aunque la mayor parte de las alteraciones 
observadas son estructurales, no se trata de variaciones desbalanceadas, por lo 
que no se. observaron· alteraciones en el fenotipo de·los portadores. 
De las muestras referidas por triple marcador se encontraron algunos casos 
como inversiones y marcadores. Sin embargo, no fueron suficientes para poder 
. decir que esta ·esla· prueba idónea para detectar alteraciones estructurales. Esta 
41 
prueba a lo largo del tiempo ha sido muy controversial, ya que depende de 
muchos factores, tales como la alimentación de la madre, el medio ambiente en el 
• que se desenvuelve, su origen étnico; además de que todos los marcadores 
bioquímicos tienen un valor pronóstico y no diagnóstico. (Carrera, 1998) 
Al hacer una correlación y aplicar una prueba de X2 entre la edad 
· gestacional, la observación de colonias y tiempo de cosecha, se observaron 
diferencias estad ísti ca rnente significativas, es decir, que no existe relación entre 
ellos. Lo cual indica que el tiempo que tardan las células en formar colonias y estar 
· listas para la qosecha, depende totalmente del azar y no del tipo celular o la edad 
gestacionaL (Nevín, et al, 1990; Rebello, et al, 1991, Sundberg, 1999) 
Nuestros resultados muestran que existe una diferencia en la población 
celular observada en los cultivos de LA a diferentes edades gestacionales, lo que 
ocasiona que existan diferencias en la calidad de las metafases obtenidas. Estas 
diferencias, pueden ser explicadas por las características propias de cada tipo 
celular y su comportamiento en cultivo. (Priest, 1977, Hecht, 1981, Medina-
· GÓmez,1985;). Las colonias formadas por células epiteloides, son muy cerradas y 
redondas. El redondeamiento de una célula está asociado con una disminución en 
la velocidad de síntesis protéica. De este modo y de acuerdo con la teoría de "la 
inhibición celular por contacto" cuando una célula entra en contacto con otras se 
· reduce la veloCidad de síntesis de proteína, incluida la proteína U, lo que provoca 
queclescienda su concentración, con 10 que la célula qúeda detenida en eLpunto 
R de Gt.(Alberts, 2003; Jiménez & Merchant, 2003) Por lo tanto, aunque las 
céllllasepitelioides se adhieren y forman Golonias más rápido que. los fibroblastos, 
! son rebasado~ por estos en crecimiento. 
42 
POr otro lado, Los cultivos de células epitelioides presentan dificultad para 
bandearse, ya que el contraste obtenido es muy bajo y tienen demasiado 
citoplasma. Se encuentran dentro de las categorías 1 y 4 de la clasificación de 
Donlon. Estas laminillas no se bandean correctamente, lo que hace que talectura 
del cariotipo sea más lenta y complicada. Estas dificultades en el bandeo se deben 
principalmente al hecho de que las células redondas, forman una especie de red 
en las colonias que establecen (tabla 2), por lo que el contacto intercelular es muy 
estrecho, y en el momento de la cosecha es difícil eliminar el citoplasma de las 
metafases. Debido a lo anterior el fijador no penetra bien en estas células y por lo 
tanto se obtíenenlaminiflas con cromosomas grises, mucho citoplasma y con 
dificultades én el bandeo. (Medina-Gómez, 1985, Rebello, 1991,Sundberg, 1999) 
En cambio, en las coloniasfibroblastoides existe espacio suficiente entre 
las células, lo que facilita la acción del fijador durante la cosecha y el bandeo es 
mejor. Parlo que la calidad del material obtenido se relaciona con la edad 
gestacional debido a la población celular que presenta. (Medina- G6mez, 1985, 
Sundberg,1999) 
Algunos autores proponen que se puede utilizar LA obtenido desde la 
semana 10 de gestación, aunque el riesgo de obtener pseudomosaicos aumenta 
considerablemente en edades tan tempranas.(Díaz-Vega, et al, 1996-Hacket, efaJ, 
.. 1991). Adicionalmente, la literatura reporta que en los casos con menOs de 15 sdg, 
donde se obtiene de 15 a20 mi de LA, se toma cerca del 15% del total del 
volumen (5% más que en los casos con más de 15 sdg), lo que ocasiona que el 
error en el diagnóstico citogenético aumente (Gray, et al, 1991, Hacket, 1991); 
además de aumentar también el riesgo de problemas musculoesqueléticos o 
43 
respiratorios en el neonato. Sundberg, 1997 y 1999, reporta que cuando la 
amniocentesis se realiza en edades muy tempranas aumenta considerablemente 
e.1 riesgo de que los neonatos presenten pie equinovaro, además de aumentar el 
porcentaje de cariotipos alterados. 
Sin embargo, nuestros hallazgos muestran que es posible obtener 
resultados sin alteraciones (pseudomosaicos) desde la semana 13 gestacional 
además,el resultado es muy parecido al obtenido en una amníocentesis de más 
de 15 semanas de gestación y no se encontraron malformaciones físicas en los 
neonatos, además de que el porcentaje de error diagnóstico cromosómico fue de 
O. Por otro lado, se haobser\lado que en las amniocentesis tempranas presentan 
una concentración de células la baja, comparados con los líquidos más tardíos. 
(Elejalde,1990, Centini, 2003,). Sin embargo, en este trabajo, los cultivos de 
menos de 15 semanas a pesar de tener una cantidad menor de. células en cultivo 
el número de colonias pronto alcanzaba a los de semanas posteriores. Todo lo 
anterior sirve de apoyo para poder recomendar la realización de la amniocentesis 
desde la semana 12 de gestación. Esto concuerda con lo reportado por Hackett et 
a1,1991, y Winsof et al. 1999, donde proponen que las amniocentesis enedad 
. temprana (12-14 sdg) son las más adecuadas, ya que se los resultados son 
confiables y además el resultado se obtiene a corto plazo (2 -3 semanas), con lo 
cual queda suficiente tiempo para poder tomar una decisión oportuna en el 
. tratamiento de cada caso. 
44 
El porcentaje de fallo en el cultivo y en el diagnóstico citogenético en este 
trabajo fue de 0.64 Y O respectivamente. Estos valores se encuentran por debajo 
del promedio, ya que los reportes existentes muestran un porcentaje de fallo en el 
cultiv() de 1.6% y un porcentaje de error en el diagnósticocitogenético de 0.3% 
(Nevin, et al, 1990, Hacket, et al, 1991, Díaz-Vega, 1996, Young Ham, 1998, 
Sundber, 1999, Phillip, 2004). Aunque Walstrom y Emery reportan que después de 
la semana 20gestacional aumenta notablemente el número de células, muchas de 
estas son células muertas, las cuales liberan sustancias tóxicas al medio, lo que 
evita que las células se adhieran y crezcan en cultivo. Sin embargo, no podemos 
asegurar que el éxito del cultivo depende de la edad gestacional, ya que, aunque 
los dos casos que no crecieron fueron de más de 20 semanas, la muestra es muy 
pequeña para poder confirmar esta hipótesis. 
El fallo en el cultivo no está asociado con alteraciones en·el cariotipo, como 
lo reportan Lenke, 1995 y Reid,1996; en los dos casos en los que el cultivo no fue 
se continuo el embarazo y se obtuvo el cariotipo en sangre periférica, sin 
presentar alteraciones cromosÓmicas. Podemos pensar que en este caso el fallo 
en el cultivo, se debió.a que la mayoría de las células que se observan en cultivos 
de más de 20 semanas son células de descamación y epitelioides por lo que la 
adhesión de las células es más complicada y el cultivo no prospera. 
45 
Conclusiones. 
• No existen diferencias en el tiempo de obtención de cultivos para 
análisis citogenético en las diferentes edades gestacionales. 
• El tipo celular observado en cultivo, se relaciona con la calidad de 
las larninitas obtenidas y el bandeo cromosómico. 
• la realización de las amniocentesís en edad temprana (12 -14 sdg) 
parece ser más adecuada, ya que se los resultados son confiables 
y se eficientiza la toma de decisiones. 
• El diagnóstico prenatal es un apoyo multidisciplinario, en donde se 
busca obtener la suficiente informaciónpara poder orientar a los 
padres y que estos tengan con todos los elementos, puedan tomar 
una decisión en el tiempo adecuado. 
46 
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