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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE 
MÉXICO 
 
 
FACULTAD DE QUÍMICA 
 
 
 
 
ESTUDIO COMPARATIVO DE DOS MÉTODOS 
ANALÍTICOS PARA CUANTIFICAR VITAMINA C TOTAL 
EN ALGUNAS VARIEDADES DE 
CHILE (Capsicum annuum) 
 
 
 
T E S I S 
 
 
 
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE: 
 
QUÍMICA EN ALIMENTOS 
 
P R E S E N T A: 
 
ALEJANDRA IBETH GARCÍA VÉLEZ. 
 
 
 
 
MÉXICO, D.F. 2007. 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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Jurado Asignado: 
 
 
 
Presidente. 
 
Ángela Sotelo López. 
 
Vocal. 
 
Marco Antonio León Felix. 
 
Secretario. 
 
Lucia Cornejo Barrera. 
 
1er sup. 
 
Luis Orlando Abrajan Villaseñor. 
 
2do sup. 
 
Rosa Maria Argote Espinosa 
 
 
 
 
 
Sitio donde se desarrollo el tema: 
 
 
Laboratorio 111, Conjunto E, Depto. de Farmacia, Facultad de Química, Cd. Universitaria, 
CP. 04510 
 
 
 
 
 
 Asesor: Supervisor técnico: 
 
 
M. en C. Ángela Sotelo López. Q. A. Argelia Sánchez Chinchillas 
 
 
 
 
Sustentante: 
 
 
 
Alejandra Ibeth García Vélez. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Este trabajo se lo dedico a mi Mamá y a mi Papá 
por amarme, apoyarme y confiar 
incondicionalmente en mi. 
Y a mi hermana por saber amarme y comprenderme 
mejor que nadie. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Agradecimientos. 
 
 
A la Universidad nacional Autónoma de México, por haberme otorgado el enorme beneficio 
de la Educación. ¡GRACIAS! 
 
A la Facultad de Química y a todos mis profesores por su dedicación, su tiempo y por haber 
compartido conmigo su gran caudal de conocimientos y experiencias. ¡GRACIAS! 
 
A la Mtra. Ángela Sotelo López por su gran ejemplo de amor, tenacidad y compromiso con la 
ciencia, la investigación y la educación. ¡GRACIAS! 
 
Al proyecto PAPIME PE205005, mi agradecimiento por su apoyo para la realización del 
presente trabajo. 
 
A los miembros de mi Jurado por compartirme su tiempo, sus conocimientos y su orientación. 
¡GRACIAS! 
 
A Argelia Sánchez Chinchillas por ser mi guía y apoyo incondicional en la realización de este 
proyecto. ¡GRACIAS! 
 
A mis Maestras: Rosita, Lety e Ili; a mis amigas las Mostras, y a mis compañeras y 
compañeros del Lab 111. GRACIAS, por todos los buenos momentos compartidos, por su 
apoyo, amistad y confianza. 
 
A la Sra. Vicky por todo su cariño y todas las tensiones que tuvo conmigo. ¡GRACIAS! 
 
A todos mis compañeros y compañeras de la carrera por haber formado parte de mi vida y 
brindarme su amistad. ¡GRACIAS! 
 
Finalmente a DIOS y a la VIDA. ¡GRACIAS! 
 
 
ÍNDICE. 
INDICE TEMÁTICO. 
 
RESUMEN 
 
OBJETIVOS GENERALES Y PARTICULARES 
 
ANTECEDENTES 
1. El chile (Capsicum sp) 
Historia del chile en México. 
Características Generales 
Situación nacional 
2. Vitamina C 
Propiedades Físicas y Químicas del Ácido Ascórbico 
Función. 
Deficiencia. 
Fuentes alimentarias. 
Recomendaciones. 
Aplicaciones 
Ácido dehidroascórbico (DHA) 
Análisis de Vitamina C. 
3. Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución 
Definición de Cromatografía Liquida de Alta Resolución 
Instrumental en HPLC 
Fase Móvil. 
Bombas. 
Inyector. 
Columna/ Fase Estacionaria. 
Detector. 
Inyector/ Registrador. 
Parámetros relevantes en HPLC 
Tiempo y Volumen de Retención 
Ancho de pico. 
Platos teóricos. 
Altura equivalente a un plato teórico. 
Factor de Capacidad. 
Selectividad. 
Resolución. 
 4. Validación de Métodos Analíticos 
Definición. 
Linealidad. 
Precisión. 
Sensibilidad 
Especificidad. 
 
DIAGRAMA GENERAL DE INVESTIGACIÓN. 
 
METODOLOGÍA 
Información de la Muestra 
Acondicionamiento. 
Determinación de Humedad Analítica. 
Proceso de extracción del Ácido Ascórbico y Dehidroascórbico. 
Determinación de Ácido Ascórbico por Titulación (AOAC) 
Determinaciones por HPLC de Fase Normal. 
Determinación de Ácido Ascórbico. 
Determinación de Ácido Ascórbico Total. 
Determinación de Ácido Dehidroascórbico. 
Barrido para determinar la longitud de onda de máxima absorción. 
Determinación de la concentración óptima de reductor a usar. 
Verificación de la Linealidad del sistema. 
Prueba de Precisión. 
Prueba de Sensibilidad. 
Prueba de Selectividad. 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
Determinación de Parámetros de Validación y Condiciones Óptimas de Trabajo. 
Análisis de Muestras. 
 
CONCLUSIONES 
 
BIBLIOGRAFÍA 
 
ANEXOS 
 
 
 
 
 
Lista de Palabras Clave. 
Ácido Ascórbico, Ácido Dehidroascórbico, HPLC, Vitamina C, Chiles, Capsicum annuum. 
 
 
 
 
 
RESUMEN. 
 
La vitamina C es uno de los antioxidantes predominantes encontrados en la dieta 
humana, una gran parte de la investigación se ha enfocado en los antioxidantes de los 
alimentos por su función anti-degenerativa y acción preventiva contra el cáncer; de ahí 
radica la importancia de su cuantificación. El ácido ascórbico es la principal forma activa 
de la vitamina C, aunque el ácido dehidroascórbico también exhibe actividad biológica y 
para evitar que se subestime el contenido de vitamina C de los alimentos es importante 
medir el ácido ascórbico y dehidroascórbico. La importancia de este estudio reside 
entonces en realiza la comparación entre dos métodos de cuantificación del ácido 
ascórbico: La técnica de cromatografía (HPLC) y el método oficial del AOAC (titulación 
volumétrica) para de esta manera encontrar el mejor método analítico de cuantificación 
de ácido ascórbico en uno de los alimentos más consumidos por la población: el chile 
(Capsicum sp). Se trabajaron ocho distintas variedades de chile: Poblano, Chilaca, 
Habanero, Pimiento Morrón, Güero, de Árbol, Piquín y Serrano; los dos últimos en dos 
diferentes etapas de maduración, con el fin de evaluar el efecto de la maduración en el 
contenido de vitamina C. Los resultados obtenidos muestran que no existe una 
diferencia significativa entre los métodos propuestos. Además se encontró que existe 
una relación inversa entre la pungencia y el contenido de vitamina C y que el estado de 
madurez influye directamente sobre el contenido del ácido ascórbico presentándose un 
mayor contenido de éste en el estado verde (inmaduro), sin embargo el estado de 
madurez no afecta de manera significativa el contenido de ácido dehidroascórbico. 
 
OBJETIVOS GENERALES. 
 
 Realizar un estudio comparativo entre el método oficial (AOAC 1990) y el método 
cromatográfico propuesto para medir la vitamina C, en ocho variedades de chile: 
Serrano, Piquín, Poblano, Chilaca, Pimiento Morrón, Habanero, Güero y de 
Árbol. 
 Comprobar la eficiencia de un método cromatográfico para cuantificar ácido 
ascórbico y ácido dehidroascórbico (vitamina C total) en algunas variedades de 
chile, previa reducción del ácido dehidroascórbico con ditiotreitol. 
 
 
OBJETIVOS PARTICULARES. 
 
 Establecer las condiciones óptimas para la extracción del ácido ascórbico y 
dehidroascórbico de las muestras de chile. 
 Identificar y cuantificar el ácido ascórbico y dehidroascórbico empleando una 
técnica de HPLC de fase normal. 
 Establecer si hay diferencias significativas en la cuantificación de la vitamina C 
entre el método oficial y el método cromatográfico propuesto. 
 Monitorear elácido ascórbico y ácido dehidroascórbico en dos de las variedades 
de chile estudiadas; en dos fases de maduración (verde y maduro) 
 Verificar la técnica cromatográfica propuesta mediante la evaluación de algunos 
parámetros de validación. 
ANTECEDENTES. 
1. EL CHILE (Capsicum sp). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Diversas variedades de chile (Capsicum sp) 
 
 1.1 Historia del chile en México. 
El chile junto con la calabaza, el maíz y el fríjol fue la base de la alimentación de las culturas 
de Mesoamérica y actualmente es un ingrediente casi obligado en la comida mexicana no 
solo por el sabor que imparte sino también por su picor. 
 
La historia del uso prehispánico del chile ha quedado registrada en algunos textos según se 
aprecia en el Códice Mendocino. También entre los tributos fijados por el tlatoani de México, 
los tributarios, entregaban cargas de chiles en cestos, tenates, etc; que eran depositadas en 
las bodegas imperiales; e incluso en las épocas de sequía el chile seco seguía figurando en 
la dieta. (Laborde y Pozo, 1984). 
1.2 Características Generales. 
Todos los chiles son del género Capsicum de la familia de las Solanáceas. Los estudios 
taxonómicos coinciden en que son 5 las especies cultivadas: Capsicum baccatum, C. 
chinense, C. pubescens, C. frutescens y C. annuum, de las cuales la última es la más 
importante. 
 
 La pungencia del chile se debe a la capsaicina, que se encuentra mayoritariamente en la 
placenta del fruto. La capsaicina esta controlada por un gen dominante, los chiles que 
carecen de éste son dulces como el pimiento morrón. Desde el siglo XVI, se clasificó en 6 
categorías al chile según su pungencia: en picantes, muy picantes, muy muy picantes, 
brillantemente picantes y picantísimos. Existe un sistema de medición del picor de los chiles 
propuesta por Wilbur Scoville (1912), cuyo objetivo era determinar la máxima dilución del 
extracto de chile en la que aún fuera detectable el picor (Unidades Scoville, Ver Tabla 1). Hoy 
en día se emplean la cromatografía de líquidos de alta resolución para medir el contenido de 
capsaicina en los chiles; este método es mucho más preciso debido a que mide los niveles 
de capsaicina en ppm que pueden posteriormente ser convertidas en unidades Scoville. 
 
Existen varios factores que determinan lo picante de un chile; por lo general los chiles más 
pequeños son más picantes que los de fruto grande. Factores como el clima, el agua, y 
minerales de la tierra donde se cultiva desempeñan un papel importante; una planta que 
sufrió sequía o altas temperaturas resulta más picante que otra cultivada bajo condiciones 
más controladas o simplemente encontrarse en la parte inferior de la planta ocasiona que 
madure primero y sea más picante que los de arriba. (Folleto técnico INAI, SARH, 1981, 
Dirección General de Política Agrícola, 1994). 
Tabla 1. Tipo y características de las variedades de chile empleadas en el estudio. 
 
Nombre 
Común 
Especie Variedad Características 
Unidades 
Scoville 
Chilaca 
Capsicum 
annuum 
lougum 
Sendt 
Largo 12-18cm, Ancho 2-4cm, 
Color verde oscuro con 
tonalidades rojas. 
1000-2500 
Poblano C. annuum 
grossum 
Sendt 
Largo 8-14cm, Ancho 4-8cm, 
Color verde oscuro. 
1000-2000 
Pimiento 
Morrón 
C. annuum -------- 
Largo de 4-10cm, Ancho 6-12cm, 
Color amarillo, naranja, verde y 
rojo 
0-100 
Güero C. annuum 
lougum 
Sendt 
Largo de 8-12cm, Ancho 2-4cm, 
Color verde claro con tonalidades 
amarillas 
2500-5000 
Serrano C. annuum 
acuminaturn 
Figerh 
Largo de 4-6cm, Diámetro 1-2cm, 
Color verde intenso. 
5000-15000 
Árbol C. annuum 
conoides 
Miller 
Largo 3-5cm, Ancho 1cm, Color 
verde intenso. 
15000-30000 
Piquín C. frutescens baccatum 
Largo 6-90mm, Color verde que 
para a rojo cuando madura. 
15000-50000 
Habanero C. chinense ------- 
Lardo 2-6cm, Ancho 2-4cm, Color 
verde, naranja, amarillo y rojo. 
100000 –
350000 
Folleto técnico INIA, SARH 1981 
1.3 Situación nacional. 
México destaca a nivel mundial por tener la mayor variedad genética de Capsicum annuum 
que ha dado origen a gran número de variedades o tipos de chiles. Sin embargo, 
curiosamente no es el productor más importante como se observa en la tabla 2. 
 
Tabla 2. Producción mundial de Chile (Capsicum sp). 
País Área (Ha) 
Rendimiento 
(Ton/Ha) 
Producción 
(Ton) 
China 621,800 20.45 12,531,000 
México 140,693 13.17 1,853,610 
Turquía 88,000 19.83 1,745,000 
Estados Unidos 34,400 28.42 977,760 
España 22,500 42.36 953,200 
Indonesia 173,817 5.01 871,080 
Otros 624,681 ____ 6,083,848 
Total 1,696,891 14.74 25,015,498 
 Documento Conaproch 2006 
En algunos estados del país se destinan superficies al cultivo del chile para deshidratarlo, 
principalmente, y en otros se destina para producto fresco y encurtido. 
 
En el 2001 se registró un consumo de chile per cápita de 8.7 kilogramos. Esto representó un 
incremento del 17.6% de 1980 a la fecha. 
 
C. annuum agrupa la mayor diversidad de chiles ya sean cultivados o silvestres. El cultivo se 
adapta a los diversos climas y tipos de suelo del país en altitudes que van desde el nivel del 
mar hasta 2500m, por lo que en el país existen más de 40 variedades de chile. 
 
La superficie de siembra nacional fluctúa entre las 150 mil hectáreas, de las cuales más del 
90% cuenta con sistema de riego. Regularmente el rendimiento bajo sistema de riego es por 
lo menos del doble del rendimiento obtenido en condiciones de secano. 
 
El 80% de la producción nacional se consume internamente, del volumen exportado el 85% 
es a Estados Unidos y el resto a Canadá. (Documento de Conaproch, 2006) 
 
La producción del país se puede agrupar en tres grandes áreas geográficas de acuerdo a las 
condiciones climáticas y tecnológicas que presentan: 
 
• Región norte y noroeste. Tienen buenos rendimientos y productividad en base a la 
adopción de buena tecnología, tienen condiciones ambientales más o menos 
estables y adecuados canales de comercialización. En esta región sobresalen los 
estados de Chihuahua, Sinaloa, Sonora, Nayarit, Durango, Baja California, Baja 
California Sur y el sur de Tamaulipas quienes producen chiles jalapeños, bell, 
serrano, cayenne, anaheim, güeros y anchos. Esta región esta especializada en la 
producción de chiles frescos para el consumo directo o la industria procesadora. 
 
• Región centro o bajío. Comprenden zonas tradicionales de producción de chiles para 
deshidratar (anchos, mulatos, pasilla, puya y guajillo). Por lo general tienen 
tecnología de producción y los métodos de secano tradicionales, lo que ocasiona que 
tengan bajos rendimientos y productos de mala calidad. Los estados comprendidos 
en esta región son: Aguascalientes, Guanajuato, Puebla, San Luis Potosí, Zacatecas 
y Querétaro. 
 
• Región sur y sureste. Se siembra principalmente de secado y humedad residual, lo 
que origina altos riesgos e inestabilidad de la producción. Incluye regiones de 
Veracruz, Oaxaca, Campeche y Quintana Roo donde los rendimientos son bajos y no 
compiten en mercados exigentes de productos de calidad. (Documento de 
Conaproch, 2006) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2. VITAMINA C. 
 
2.1 Propiedades Físicas y químicas del Ácido Ascórbico (AA). 
El ácido ascórbico dentro de la clasificación de las vitaminas, pertenece a las vitaminas 
hidrosolubles. Tiene la estructura de una lactona, su característica ácida deriva del carácter 
enólico de los grupos hidroxilos en la posición C2 y C3, siendo el OH de C3 el más ácido y 
presenta valores de pKa2 = 4.17 y pKa1 = 11.57. (Ver Figura 2) 
 
El máximo de absorción en el ultravioleta, del ácido ascórbico, varia con la concentración, el 
disolvente y el pH, presenta longitud de onda (λ) de absorción máxima entre 245-260nm en 
medio ácidoy de 265nm en medio neutro. 
 
Se presenta en forma de cristales monoclínicos, de punto de fusión 190-192°C, estable al 
aire cuando está seco; en preparaciones acuosas, se oxida al ser expuesto al aire y a la luz. 
Se le considera como una sustancia antioxidante y tiene una función importante en la 
absorción y reducción del hierro, presenta una densidad de 1.65 y una rotación especifica de 
20.5°. (Assard et. al, 2004, Davies et. al, 1991) 
 
 
Figura 2. L- Ácido Ascórbico. 
2.2 Función. 
El ácido ascórbico es una vitamina indispensable para el hombre y un antioxidante celular 
que desempeña un papel importante en el mantenimiento de la salud y específicamente en 
el tratamiento de diversas enfermedades. 
 
El ácido ascórbico es uno de los reductores más potentes que existe en forma natural en los 
tejidos vivos. Es indudable que la función bioquímica que desempeña el ácido ascórbico se 
relaciona con su carácter de buen agente reductor. 
 
La mayoría de los animales sintetizan al ácido ascórbico a partir de la glucosa, en el hígado; 
el hombre carece de la enzima L-gluconolactonoxidasa, la cual está relacionada con la 
síntesis de este ácido, razón por la cual se tiene que ingerir en la dieta. 
 
La función exacta del ácido ascórbico en el organismo, es desconocida, se sabe que a nivel 
celular interviene en la síntesis del colágeno, de las hormonas esteroides, de la serotonina, 
de la melanina y de los polisacáridos. A nivel orgánico tiene diversos modos de acción: 
absorción del hierro, reducciones y oxidaciones celulares, mantiene el transporte de 
electrones a nivel mitocondrial, mantiene bajo nivel redox para la vitamina E y enzimas con 
radicales azufrados, actividad detoxicante a través del sistema peroxidasa y estimula la 
fagocitosis. (Assard et. al, 2004, Illera et. al, 2000) 
 
El ácido ascórbico también es importante en la hidroxilación de la dopamina y en la 
hidroxilación, durante la síntesis de esteroides. Participa como reductor en el metabolismo de 
la tirosina, se le relaciona con la síntesis de purinas y para la formación de DNA. 
Este ácido también es necesario para la incorporación del hierro en la ferritina y colabora en 
la formación de cartílago, capilares, huesos y dientes. 
 
Además el ácido ascórbico se requiere para el metabolismo de la tiroxina y la biosíntesis del 
ácido fólico y folínico, es necesario para la producción normal de fibrillas del tejido conectivo 
y es esencial en diversos sistemas enzimáticos de oxidación. (Assard et. al, 2004, Mc Dowell, 
2000) 
 
 
 
2.3 Deficiencia. 
 
En estudios relacionados a los síntomas presentes cuando hay una deficiencia de vitamina 
C se ha demostrado que ésta es esencial para procesos metabólicos, crecimiento normal, 
especialmente de huesos y dientes y al parecer, es un factor antiestrés e influye en glándulas 
suprarrenales y tiene acción antiinfecciosa. 
 
Las enfermedades que se acompañan, de bajas concentraciones de vitamina C : incluyen el 
hipertiroidismo, neoplasia y úlceras pépticas. Es sabido que la deficiencia de vitamina C 
produce escorbuto (lesiones patológicas en huesos y vasos sanguíneos). También puede 
producir trastornos físicos, los cuales son fáciles de advertir por síntomas no específicos 
como: laxitud, irritabilidad, perdida de peso y dolores musculares y articulares en piernas y 
muslos. Se producen hemorragias en piel, muslos y encías, con edemas progresivos, las 
hemorragias en los tejidos, pueden producir hematosis, mucosas sangrantes, perdida de 
sangre por los aparatos gastrointestinales y hemorragias cerebrales. 
La carencia del ácido ascórbico deteriora la formación de la colágena, comprometiendo la 
integridad estructural del tejido conectivo. 
 
El ácido ascórbico se absorbe casi en su totalidad en el tracto intestinal, después de haber 
sido absorbido se le encuentra en la sangre, en mayor proporción en suero que en glóbulos 
rojos; también se encuentra distribuido en todos los tejidos del organismo. Las mayores 
concentraciones de ácido ascórbico se encuentran en tejido glandular y las menores en tejido 
adiposo. 
 
El contenido de ácido ascórbico en la sangre, refleja el estado general de impregnación del 
organismo sano. Todo individuo con un nivel de ácido ascórbico en sangre en un rango de 
1.5-2.0mg/100mL está saturado de vitamina C; si va de 0.5-1.0mg/100mL está en estado 
normal-bajo y concentraciones menores a 0.5mg/100mL se asocia al escorbuto clínico. 
 
El ácido ascórbico está parcialmente distribuido en el organismo y es excretado por el riñón 
cuando el nivel sanguíneo es superior al umbral de 1.4mg/100mL. (Assard et. al, 2004, Mc 
Dowell, 2000) 
 
 
 
 
 
2.4 Fuentes alimentarias. 
 
El ácido ascórbico se encuentra ampliamente distribuido en frutas y verduras como: plantas 
verdes, tomates, guayabas, perejil, pimiento verde, frutas cítricas; en alimentos de origen 
animal se encuentra en cantidades menores. Ver Tabla 3. 
 
Tabla 3. Alimentos Ricos en Ácido Ascórbico (Vitamina C) 
 
Alimento 
Porción 
Comestible 
Cantidad (mg/100g de 
muestra húmeda) 
Guayaba 89 273 
Chile Rojo 100 225 
Grosella Negra 100 200 
Perejil 100 190 
Pimiento 81 131 
Chile verde 100 120 
Brócoli 61 110 
Kiwi 86 94 
Berro 67 87 
Papaya 72 82 
Litchi 62 71.5 
Naranja Valencia 75 80.6 
Toronja (Pomelo) 72 39.7 
Mataix. Fuente “Instituto de Nutrición y Tecnología de Alimentos, Universidad de Granada 2003”
2.5 Recomendaciones. 
 
Las necesidades diarias de la vitaminas en el hombre varían dependiendo de la edad, sexo y 
algunas características especiales; en general las recomendaciones dietéticas diarias de 
vitamina C en forma de ácido ascórbico son los presentados en la tabla 4. 
 
Tabla 4. Ingesta diaria recomendada de vitamina C. 
Grupo RDA (mg/día) 
Lactantes (de 0 a 6 meses) 30mg 
Lactantes (de 6 meses a un año) 35mg 
Niños (de 1 a 3 años) 40mg 
Niños (de 4 a 10 años) 45mg 
Jóvenes (de 11 a 14 años) 50mg 
Adultos 60mg 
Mujeres embarazadas 70mg 
Mujeres en lactancia (primeros 6 meses) 95mg 
Mujeres en lactancia (segundos 6 meses) 90mg 
Chávez y Ledesma. Fuente “Instituto Nacional de Nutrición 1997”
 
2.6 Aplicaciones. 
 
El ácido ascórbico se produce industrialmente por síntesis usando como materia prima el 
sorbitol que es una hexosa presente en diversas frutas el cual se obtiene por hidrogenación 
de la glucosa. 
Las propiedades químicas del ácido ascórbico permiten una variedad importante de 
aplicaciones industriales. Cerca de un tercio de la producción es usado para preparaciones 
vitamínicas en la industria farmacéutica; el resto es parcialmente aplicado como aditivo en los 
alimentos para mejorar la calidad y estabilidad de los productos alimenticios. 
 
El ácido ascórbico en la industria alimentaria tiene diversas aplicaciones entra las que 
destacan: 
-Inhibición de la formación de nitrosaminas en productos carnícos, estabilización del color de 
la carne y fijación del color de las carnes curadas. 
-Protección enzimática de frutas y vegetales procesados. 
-Fortificación nutricional de alimentos y bebidas. 
-Mejoramiento de la calidad de los sabores. 
-Antioxidante para evitar la descomposición de aceites, vinos, cervezas, leche y productos 
lácteos. 
-Incremento de la calidad en vinos y cervezas. (Mc Dowell, 2000) 
 
 
2.7 Ácido dehidroascórbico. (DHA) 
 
El ácido dehidroascórbico al igual que el ácido ascórbico es una forma biológicamente activa 
de la vitamina C. El ácido dehidroascórbico es producto de oxidación del ácido ascórbico, es 
un 2,3-diacetal, él cual existe predominantemente en forma de biciclo hidratado. La oxidación 
del ácido ascórbico se favorece por la presencia de oxígeno y algunos iones metálicos 
pesados como Cu2+, Ag+ y Fe3+ y por pH alcalino. 
El ácido dehidroascórbico puede reducirse nuevamente ante varios agentes reductores,por 
ejemplo el glutatión o el ácido sulfhídrico, de esta manera las dos formas del ácido ascórbico, 
constituyen un sistema reversible de óxido-reducción; sin embargo el ácido dehidroascórbico 
se oxida de manera irreversible hasta ácido dicetogulónico, ver figura 3. 
 
 
Figura 3. Reacción de oxidación del ácido ascórbico 
 
En solución acuosa el ácido dehidroascórbico es relativamente hidrofóbico y menos ionizable 
que el ácido ascórbico y por lo tanto penetra mucho mejor la membrana celular. (Davies et. 
al, 1991, Leenheer et. al, 1992) 
 
2.8 Métodos analíticos para cuantificación de Vitamina C. 
Existen diversos métodos analíticos para llevar a cabo estudios de detección y cuantificación 
del ácido ascórbico y sus varías formas, en diversos productos alimenticios y no alimenticios, 
materiales biológicos, productos farmacéuticos o simplemente para observar su 
comportamiento dentro y fuera del organismo. Sin embargo, el análisis de la vitamina C 
presenta muchas dificultades y aun hoy en día no existe el método de análisis que esté libre 
de interferencias. 
 
El principal problema al que se enfrentan los diversos procedimientos es determinar al L-
ácido ascórbico y sus varios productos de oxidación, de manera simultánea y con un mínimo 
de preparación de muestras e interferencias. Para analizar al ácido ascórbico existen 
diferentes métodos como los son: 
 
 Métodos Químicos. 
Los métodos de titulación o colorimetría toman ventaja de las propiedades redox del ácido 
ascórbico. Usualmente se emplean agentes oxidantes para llevar al ácido ascórbico a ácido 
dehidroascórbico, una técnica introducida desde 1927 usa al 2,6 Diclorofenol-indofenol, el 
cual presenta una coloración azul a pH neutro y rosa en solución ácida; esta técnica es 
sencilla de emplear, pero presenta interferencias cuando el ácido ascórbico no es el único 
componente redox en la solución, por ejemplo si hay presencia de taninos, iones metálicos o 
azucares reductores. 
 
Muchas otras técnicas se han desarrollado usando diversos agentes titulantes como lo son el 
hierro (III), yodo, Azul de metileno, Peroxido de Vanadio-Ácido Sulfúrico y otros. A pesar de 
que son métodos sencillos de realizar presentan muchos problemas de interferencias 
causadas por la matriz biológica en la que se trabaje. 
 
 Análisis espectrofotométrico. 
En solución acuosa el ácido ascórbico tiene una fuerte absorción a 265nm, lo cual debería 
ser suficiente para el análisis espectrofotométrico directo, sin embargo la vitamina C se 
encuentra muy frecuentemente en soluciones que contienen sustancias que presentan 
absorbancias muy cercanas a esta región en UV. Aún cuando la posición de la banda de 
absorción varía en función del disolvente usado (en alcohol el máximo se localiza en 245nm), 
la matriz biológica en la que se trabaje es la gran limitante del uso de la espectrofotometría 
directa. 
 
 Métodos electroquímicos. 
Estos métodos ofrecen una gran eficacia y precisión así como una gran sensibilidad de 
operación. Un ejemplo es en las tabletas de vitamina C que contiene hierro(II), el cual ha 
sido analizado usando voltarimetria de pulso diferencial con un electrodo de carbono. Sin 
embargo, el desarrollo de este tipo de métodos se ha visto opacado por el uso de la 
cromatografía. 
 
 Métodos Cromatográficos. 
Estas técnicas presentan la mejor esperanza de vencer el problema de las interferencias por 
otras sustancias presentes en las matrices biológicas ya que permiten la determinación 
directa de pequeñas cantidades de ácido ascórbico de manera inequívoca, no así de todos 
los productos de su oxidación simultáneamente. La única forma satisfactoria de lograr este 
grado de especificidad es separando los analitos presentes. 
 
La Cromatografía Gas-Líquido (GLC) permite determinar indirectamente al ácido ascórbico 
previa conversión de éste a su éter volátil (trimetil-silil). La GCL aún cuando arroja resultados 
reproducibles y precisos no es muy comúnmente usada debido a que consume mucho 
tiempo durante su desarrollo. 
 
El HPLC ha sido el método más utilizado para la determinación y cuantificación de sustancias 
químicas. (Leenheer et. al, 1992). 
 
En el caso de la vitamina C han tenido que surgir diversas técnicas para cubrir la gran 
variedad de matrices y las peculiaridades de cada una de ellas, además de permitir 
determinar pequeñas cantidades y todas las formas y productos de oxidación de la vitamina 
C. Algunos ejemplos son: 
 
 En cromatografía de fase normal se usan columnas NH2 o Carbohidrato para 
cuantificar ácido ascórbico, ácido isoascórbico y ácido dehidroascórbico 
simultáneamente, en matrices vegetales. (Wimalasari y Willis, 1983). 
 
 En cromatografía de fase reversa se han usado columnas de ODS, C18y C8 para a 
cuantificación directa del ácido ascórbico y la cuantificación indirecta del ácido 
dehidroascórbico y ácido isoascórbico, en matrices vegetales. (Níspero-Carriedo et. al, 
1992, Zapata y Dufour, 1992). 
 
 Utilizando columnas de intercambio-iónico se ha determinado el ácido ascórbico y 
ácido dehidroascórbico en muestras de sangre y tejido animal. (Davies et. al, 1991). 
 
 Utilizando diversas columnas y métodos de extracción como: Kall y Andersen 1999 y 
como Marshall et. al, 1999, quienes usan un sistema de derivatización post-columna. 
 
 
3. CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN. 
 
3.1 Definición de Cromatografía líquida de alta resolución. 
 
La cromatografía se puede definir simplemente como un método físico-químico de 
separación basada en la distribución de los componentes de una mezcla (analito) entre dos 
fases inmiscibles, una fija o estacionaria que se encuentra dentro de una columna y una fase 
móvil que es la que recorre toda la longitud de la columna. 
 
En cromatografía líquida, tanto la fase móvil como el analito se encuentran en estado líquido; 
estos fluyen a través de la columna que contiene en su interior la fase fija o estacionaria, en 
la cual los componentes de la mezcla interactúan con la misma y posteriormente son 
retenidos selectivamente por la columna. 
 
La separación diferencial es resultado del equilibrio de distribución de los componentes de 
una mezcla entre la fase móvil y estacionaria. Dichos componentes se separan en la 
columna y al salir de ésta son conducidos por la fase móvil hasta un detector en el orden en 
el que emergieron, registrándose los tiempos de retención característicos de cada compuesto 
así como sus respectivas concentraciones en cromatogramas, los cuales son representados 
por picos idealmente gaussianos o simétricos en un tiempo de retención específico. 
 
Dependiendo del tipo de fase fija y del tipo de fenómeno físico que provoca la separación, la 
cromatografía líquida de alta resolución se puede dividir en varias clases. 
 
• Cromatografía de líquidos de fase normal. La retención depende de las interacciones 
entre la parte polar de la fase estacionaría y el soluto. Para que la reacción ocurra, el 
material de empaque debe ser más polar que la fase móvil con respecto a la muestra. 
Por ejemplo la fase estacionaria es generalmente sílica y las fases móviles típicas son 
hexano, cloruro de metileno, tetrahidrofurano, acetonitrilo, metanol y mezclas de estos 
disolventes con buffers. 
 
 Cromatografía de fase reversa. El empaque es no polar y el disolvente es polar con 
respecto a la muestra. Las fases estacionarias típicas son cadenas hidrocarbonadas 
(C8, C18) y las fases móviles están constituidas de mezclas de disolventes orgánicos 
y agua, tales como metanol-agua, acetonitrilo-agua, etc. (Quatrrocchi et. al, 1992 y 
Krstulovic,1982) 
 
 
3.2 Instrumental en HPLC. 
Un equipo de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) puede representarse por la 
figura 4. 
 
3.2.1 Fase móvil. 
La fase móvil es la fase que recorre toda la longitud de la columna disolviendo el analitopara 
que pueda pasar por la fase fija o estacionaria. Debe ser un disolvente o una mezcla de 
solventes con un alto grado de pureza, desionizado y filtrado previamente para evitar que 
partículas e impurezas tapen y contaminen la columna o puedan dañar las bombas. 
 
La preparación de la fase móvil garantiza la reproducibilidad en los resultados y tiempos de 
retención. La diferencia en la preparación de una mezcla (pH u otros) produce modificaciones 
en la selectividad del sistema, reproducibilidad de los tiempos de retención y respuesta del 
analito en el detector. 
 
3.2.2 Bomba. 
Es el sistema que permite impulsar la fase móvil a través de la columna o fase estacionaria. 
Las bombas que se emplean en esta tipo de aparatos pueden realizar dos tipos de elución: 
isocrática en el cual el volumen de la fase móvil se mantiene constante, y en gradiente que 
proporciona diferentes cantidades o volúmenes de disolvente. Estas bombas utilizan 
presiones máximas de 6000psi. 
 
Las bombas deben ser aptas para proporcionar el flujo adecuado al método (velocidad de 
flujo de 0.1 a 10mL/min) y entregar con exactitud el flujo establecido (volumen entregado por 
unidad de tiempo) y mantener en un mínimo grado la inestabilidad de la línea base por 
diferencias en la entrega de solvente o sincronía de los pistones. 
 
3.2.3 Inyector. 
Los inyectores son válvulas que orientan la muestra hacia la columna, pueden ser de tres 
tipos: 
 
Inyector de loop fijo. En el cual el volumen del flujo de la muestra se programa de forma 
constante (comúnmente 20µL) el cual puede ser llenado total o parcialmente. En el primer 
caso, se requiere de al menos 3 veces el volumen nominal de loop, lo que permite obtener 
una precisión de hasta 0.05%. Si se llena parcialmente, la precisión de la inyección esta 
influenciada por la precisión de la jeringa con la que se introduce la muestra. 
 
Inyector con loop variable. El cual puede inyectar diferentes cantidades de muestra. 
 
Inyector automatizado. En el que la muestra se coloca dentro de un vial y el aparato toma 
automáticamente lo que se requiere. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cromatograma 
 
 
 Figura 4. Esquema general de un equipo de HPLC 
 
Fase 
móvil. 
Sistema 
de 
bombeo 
Inyector 
o 
Automuestreador 
Columna. 
Detector. Desechos 
Registrador 
 
3.2.4 Columna / Fase estacionaria. 
Es la parte más importante del sistema, la columna es la fase fija o estacionaria donde se va 
a llevar a cabo la separación de los analitos y donde se realiza la interacción soluto-
disolvente. 
Las columnas son tubos largos de acero inoxidable, que tienen un tamaño variable que va de 
2 a 30cm con un diámetro de 2 a 9mm y tienen en su interior generalmente sílica. 
La cromatografía de fase normal basa su función en las interacciones que se forman entre 
los grupos libres de la sílice y las moléculas, siendo necesario un disolvente no polar para 
eluirlas. La cromatografía de fase reversa emplea una columna no polar para interactuar con 
los analitos, siendo empleada una fase móvil polar para eluirles. 
Algunas de las principales diferencias entre la cromatografía de líquidos de fase normal y 
fase reversa se muestra en la Tabla 5. 
 
Tabla 5. Diferencias entre fase normal y fase reversa. 
Parámetro. Fase Normal. Fase Reversa. 
Polaridad de la columna. Alta a Media Baja a Media. 
Polaridad del solvente. Baja a Media. Media a Alta. 
Orden de elución. De Menor a mayor Polaridad. De Mayor a Menor Polaridad.
Efecto del incremento en la 
polaridad del solvente. 
Reducción de tr Aumento de tr
 
La principal desventaja de los soportes de sílice está en su susceptibilidad al pH; por debajo 
de 2 se hidrolizan los grupos funcionales enlazados, en tanto que valores superiores a 8 
provocan que la sílice se disuelva, perdiéndose la integridad de la columna. 
 
El tipo de sílice del soporte, el diámetro de las partículas que forman el soporte, el tamaño de 
los poros en las partículas, la concentración del grupo funcional ligado a la sílice y la cantidad 
de grupos funcionales en la sílice sin enlazar, son los factores que se deben tener en cuenta 
para alcanzar reproducibilidad entre los análisis realizados entre distintos laboratorios o 
distintos operadores. (Skoog, 1994). 
3.2.5 Detector. 
Los tipos de detectores más empleados en HPLC son: 
• De Fluorescencia. 
• Espectrofotométricos (Ultravioleta, Visible e Infrarrojo). 
• De Índice de Refracción (Detector Universal). 
• Electroquímicos. 
 
Los sistemas de detección deben contar con: amplio intervalo de respuesta lineal, evitar el 
ensanchamiento de bandas extracolumna, generar una respuesta para todos los solutos, ser 
altamente sensibles, evitar que la señal sea modificada por cambios de temperatura, poseer 
una alta relación señal/ruido, evitar la degradación de la muestra y responder con alta 
velocidad a los cambios instantáneos. 
 
El tipo UV-Visible es el detector más utilizado en HPLC debido a que la mayoría de los 
compuestos tienen cuando menos una absorbancia en las regiones del UV ó visible. Se 
fundamenta en la ley de Lamber y Beer, la cual relaciona la absorbancia del soluto con su 
concentración mediante la siguiente fórmula: 
A = absorbancia. 
 
A = ξbc donde: 
ξ = absortividad molar. 
c = concentración 
b = trayectoria recorrida. 
 
3.2.6 Integrador / Registrador. 
Es la parte del equipo que permite interpretar la señal mostrando no solo el cromatograma 
obtenido, sino los tiempos de retención, las áreas y los porcentajes de los componentes 
contenidos en el analito. Idealmente, se trata de picos gaussianos y cada pico corresponde a 
un componente de la muestra original. El tiempo de retención se mide desde el momento de 
la inyección de la muestra hasta que aparece el pico máximo en el cromatograma. 
 
El integrador calcula además el área correspondiente a cada pico, la cual es proporcional a la 
cantidad de sustancia. Dado que los detectores de HPLC son no-destructivos, ya es posible 
recuperar los productos que salen de él. De esta manera, dependiendo del tamaño del loop 
de inyección, de la columna y del tipo de bombas es posible realizar separaciones analíticas 
obteniendo cromatogramas. (Quatrrocchi et. al, 1992 y Skoog, 1994). 
 
3.3 PARÁMETROS RELEVANTES EN HPLC. 
En el campo de la química, el término parámetro se emplea para referirse a una cantidad que 
toma diferentes valores y caracteriza un proceso. Los parámetros cromatográficos permiten 
tabular y comunicar los datos con mayor facilidad. Los parámetros comúnmente usados en 
HPLC (Ver Figura 5) son: 
 
Figura 5. Esquema de parámetros relevantes en un cromatograma de HPLC. 
3.3.1 Tiempo y Volumen de retención. 
El tiempo o volumen de retención permite identificar a un componente dado, pues son 
característicos bajo condiciones de trabajo constantes. 
El grado de retención de un compuesto particular en una mezcla es expresado, 
generalmente, en términos de tiempo (tr) o un volumen de retención (Vr). 
 
El tiempo muerto (t0) es el volumen mínimo de fase móvil que transporta a un analito dado y 
corresponde al volumen que ocupa la fase móvil en los resquicios de las partículas de la fase 
estacionaria en la columna. 
 
El tiempo de retención corregido (tr’) es el tiempo que dura la interacción con la fase 
estacionaria, se calcula restando el tiempo muerto del tiempo de retención. El volumen de 
retención corregido (Vr’) es el volumen de la fase móvil necesario para lograr eluir un 
compuesto retenido en la columna. Se obtiene restando el volumen muerto del volumen de 
retención. 
 
3.3.2 Ancho de pico. 
El ancho del pico a la base (Wb), es la porción de la línea base intersectada por las tangentes 
al pico. El ancho del pico a la mitad de la altura (W1/2) es una medida más reproducible y 
adecuada para evaluar la eficiencia del sistema pues permite describir picos cuya líneabase 
no está claramente definida o no semejen una curva gaussiana. Un sistema eficiente produce 
picos delgados. 
 
 
3.3.3 Platos teóricos. 
El número de platos teóricos (N) representa el poder de separación de una columna, una 
columna eficiente tiene un número elevado de platos teóricos, pues cada plato teórico 
representa un equilibrio teórico de distribución del soluto entre las fases. El valor de N es una 
medida de la eficiencia. 
 
3.3.4 Altura equivalente de un plato teórico. 
La altura equivalente de un plato teórico (H) es el segmento de una columna a la que 
corresponde un plato teórico. Es la medida inversa de la eficiencia; entre menor sea la altura 
equivalente de un plato teórico, el sistema es más eficiente, ya que, teóricamente, el sistema 
requiere de menor cantidad de fase estacionaria para obtener un equilibrio de separación, 
dando la posibilidad de que a lo largo de la columna ocurran muchos equilibrios más. 
 
3.3.5 Factor de capacidad. 
El factor de capacidad (K’) se define como la razón de la cantidad de soluto en la fase móvil 
al equilibrio. es igual a la relación del tiempo que el soluto permanece en la fase estacionaria 
respecto al tiempo que permanece en la fase móvil. 
 
3.3.6 Selectividad. 
La selectividad (α) mide las diferencias relativas entre la interacción de dos solutos con la 
fase estacionaria. Un valor mayor de α significa una columna más selectiva e implica una 
mejor separación entre solutos. 
 
 
3.3.7 Resolución. 
La resolución (Rs) es la medida cuantitativa del grado de separación entre dos solutos. Es 
una expresión que relaciona el ancho dos picos eluidos, con la distancia entre sus máximos. 
A mayor valor de resolución, mayor grado de separación entre picos. La resolución es 
función de la selectividad (α), eficiencia (N) y retención (K’) de un sistema. La resolución se 
ve afectada por: eficiencia de la columna, tamaño de partícula, velocidad de flujo, presión en 
la columna, longitud de la columna, interacción soluto-disolvente y solvente-solvente. A 
medida que aumenta la resolución, el contenido relativo de impurezas disminuye. (Rubinson 
y Rubinson, 2000 y Krstulovic, 1982) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4. VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS. 
 
4.1 Definición. 
Un método analítico se defina como la secuencia de actividades que se deben cumplir para 
llevar acabo el análisis de un componente especifico (analito) en una muestra. La validación 
es proporcionar la información necesaria para comprobar que un método cumple con el 
objetivo para el que fue diseñado, es decir, es la evidencia documentada, de los estudios de 
laboratorio, de que un método satisface con seguridad los requisitos para su aplicación 
analítica, permitiendo la obtención de resultados confiables y cercanos al valor real. 
La evidencia documentada de la validez de un método se expresa por medio de la 
evaluación de distintos parámetros: linealidad, exactitud, precisión, repetibilidad, 
reproducibilidad, límites de detección y cuantificación, especificidad, tolerancia, robustez y 
estabilidad, en función de la característica del análisis. Cada parámetro debe cumplir con 
ciertos criterios de aceptación para considerar que la metodología es válida. 
Los métodos que aparecen en la literatura oficial reconocida (Farmacopea de los Estados 
Unidos Mexicanos, métodos oficiales de análisis de la AOAC, etc) se consideran válidos y 
solo deben cumplirse una etapa de adecuación, verificando que los resultados obtenidos 
cumplan con los criterios de aceptación. 
 
4.2 Linealidad. 
La linealidad es la proporcionalidad que existe entre la concentración de un analito y la 
respuesta (directa u obtenida por medio de transformaciones matemáticas definidas) que 
genera. Se utiliza el modelo de la ecuación de la línea recta (Y = mx + b) para la evaluación. 
También se evalúa el intervalo dentro del cual se cumple dicha proporcionalidad. 
La linealidad del sistema es la proporcionalidad del análisis de estándares de referencia en el 
sistema de cuantificación. Permite obtener curvas de calibración que relacionan la respuesta 
que genera el analito (Y) en una metodología dada, con la concentración de soluciones 
estándar del analito (X). La curva de calibración se prepara con al menos 5 niveles de 
concentración del estándar, cada nivel, al menos por triplicado. 
 
La ecuación que describe la tendencia se obtiene por el método de cuadrados mínimos, 
donde se obtienen coeficientes de determinación (r2), pendiente (m) y ordenada al origen (b), 
además se estima el intervalo de confianza de la pendiente. El coeficiente de determinación 
debe ser mayor a 0.98 para considerar adecuado el modelo lineal; el intervalo de confianza 
de la pendiente no debe incluir el cero, pues esto implicaría que no existe proporcionalidad 
alguna entre la respuesta y la concentración. También se recomienda encontrar el intervalo 
de confianza para la ordenada al origen, si éste incluye el cero, se considera que es 
adecuado analizar muestras comparando su respuesta contra la respuesta por un estándar 
en un solo nivel de concentración, es decir, sin necesidad de una curva de calibración para 
cada análisis. 
 
La linealidad del método es el comportamiento entre la concentración del compuesto de 
interés, en la muestra, y la respuesta obtenida, descrito mediante la ecuación de la línea 
recta. En este punto se debe abarcar la metodología involucrada en la preparación de la 
muestra (extracción, purificación, formación de derivados, etc.) permite asegurar que los 
resultados que se obtengan serán directamente proporcionales a la concentración del analito 
en la muestra, dentro de un intervalo dinámico de trabajo y después de haber preparado la 
muestra de modo conveniente para su análisis. Se utilizan al menos tres niveles de 
concentración. (Alcántara et. al, 2002 y García et. al, 2002). 
 
4.3 Precisión. 
Es el grado de concordancia entre ensayos individuales cuando el método se aplica 
repetidamente a múltiples alícuotas de una muestra o referencia homogéneos. 
Se expresa matemáticamente como la derivación estándar relativa (RSD) o coeficiente de 
variación (%C.V): desviación estándar muestra / media aritmética *100. 
Este punto incluye la precisión del método y del sistema. 
 
La evaluación de precisión permite encontrar el error en el análisis debido únicamente al 
equipo. Se examina seis veces una sola muestra, empleando las mismas condiciones en el 
análisis. La precisión del sistema se determina a partir del análisis de una solución a un solo 
nivel de concentración, por sextuplicado. 
 
La precisión del método (o precisión intermedia) se obtiene del análisis por triplicado de una 
muestra homogénea o sustancia de referencia en dos días diferentes y por dos analistas 
diferentes. 
 
4.4 Sensibilidad. 
Cuanto mayor es la sensibilidad de un método, será más probable medir cambios pequeños 
en la respuesta del sistema de detección, que es la mínima cantidad de analito que se puede 
detectar pero no necesariamente cuantificar, y el límite de cuantificación que es la mínima 
concentración del analito que se puede determinar con exactitud y precisión razonables. 
Tanto el límite de detección, como el de cuantificación, pueden ser estimados a partir de la 
relación señal / ruido o de los parámetros de la curva de calibración. 
 
4.5 Especificidad / Selectividad. 
La especificidad es la capacidad de un método analítico para obtener respuesta debida 
únicamente al analito de interés y no a otros componentes de la muestra, es decir, evaluar 
inequívocamente al analito en presencia de compuestos endógenos. La selectividad es la 
posibilidad del método de separar el analito de otros productos. La prueba más simple para 
la evaluación de especificidad es el análisis de un blanco de la matriz biológica. La 
evaluación de la selectividad, en los métodos cromatográficos, requieredel análisis de 
pureza de cada uno de los picos para asegurar que el método es capaz de separar un analito 
de otros productos. (Alcántara et. al, 2002 y García et. al, 2002). 
 
 
 
 
 
 
 
METODOLOGÍA 
 
 
Diagrama General de Investigación 
 
 
Congelación a 
–52°C 
Extracción de Ácido 
ascórbico y 
dehidroascórbico con 
Ácido m-fosfórico 3%. 
(Wimalasari y Willis 1983)
Determinación por 
HPLC fase normal del 
Ácido ascórbico y 
Ácido ascórbico Total.
Reacción del Ácido 
dehidroascórbico con 
D-L Ditiotreitol (DTT) 
2% por 30min. 
(Lykkesfeldt et. al 1995)
Determinación de 
humedad analítica 
(AOAC 1990) 
Muestras de Chile 
en estado fresco.
Determinación de 
Ácido ascórbico por 
titulación con 2,6 
Diclorofenol-indofenol 
(AOAC 1990)
 
 
 
 
 
Determinación de 
condiciones óptimas 
de trabajo y 
parámetros de 
validación.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Análisis de Resultados. 
Análisis Estadísticos 
(ANOVA y Prueba múltiple 
de Duncan).
 
 
 
 
Conclusiones 
 
 
 
1. Información de la muestra. 
Las ocho variedades de chile (Capsicum sp.) con las que se trabajó fueron Chilaca, Poblano, 
Pimiento Morrón, Güero, Serrano, de Árbol, Piquín y Habanero, sus características generales 
se muestran en la tabla 2; de ellas el chile Serrano y Piquín se obtuvieron en dos diferentes 
estados de maduración para determinar el efecto del estado de madurez en el contenido de 
la vitamina C. 
 
Todas las muestras excepto el chile Piquín se obtuvieron en la “Central de Abastos” del D. F., 
en estado fresco y se verificó que tuvieran características homogéneas en cuanto a color y 
tamaño, además de que no presentaran rasgos de daño causado por manipulaciones 
(practicas de cultivo y traslado) previas a la adquisición. Las muestras se obtuvieron siempre 
en los mismos locales comerciales para disminuir la variación causada por la procedencia de 
las muestras. Las muestras de Piquín se obtuvieron directamente de la mata en un jardín de 
Cuernavaca, Morelos y se diferenciaron los dos estados de madurez estudiados tomando en 
cuenta el color (rojo-estado maduro, verde-estado inmaduro), las muestras se recolectaron y 
trasladaron tratando de no causarles daño. En las muestras de chile Serrano se hizo la 
diferenciación en cuanto al estado de madurez basada en el tamaño de las muestras y en la 
intensidad del color verde que presentaba 
 
2. Acondicionamiento. 
En cuanto las muestras llegaron se hizo una segunda valoración de las mismas a fin de 
utilizar solo aquellos especimenes que tuvieran características óptimas (es decir un aspecto 
agradable y saludable). Las muestras se colocaron en recipientes de plástico adecuados al 
tamaño de las muestras y se mantuvieron en un Utra-congelador (Revco) a –50 °C. 
3. Determinación de humedad analítica (AOAC 1975 No. 934.01) 
• Materiales. 
Estufa de Secado (Blue M) 
Estufa de vacío (Lab-Line Duo Vac Over Mod.3620) 
Balanza Analítica (Sartorius analytic). 
Desecador de vidrio. 
 
• Procedimiento. 
 
Las charolas se pusieron a secar en la estufa de secado hasta que alcanzaron un peso 
constante, el cual fue registrado. Posteriormente se pesan de 2-3gramos de muestras a las 
cuales previamente se les retiró el pedúnculo. Con el fin de eliminar el exceso de humedad 
antes de introducir las muestras a la estufa de vacío se dejan por espacio de 30-40min en 
una estufa de secado a una temperatura promedio de 120°C. 
 
Posteriormente las muestras se ponen a secar por 24-48 horas en la estufa de vacío con 
una presión no menor a 15mm de Hg y una temperatura de 60-65°C. 
 
Se realizan pesadas periódicas de las charolas durante el tiempo que permanecen en la 
estufa de vacío, retirándolas de la estufa y dejándolas enfriar en un desecador por 20min; 
este proceso se repite hasta que el peso fue constante en milésimas de gramo. 
 
• Cálculos. 
 
Contenido de humedad = Peso muestra húmeda – Peso muestra seca.
Contenido de humedad % de humedad = Peso de muestra húmeda *100 
 
4. Proceso de extracción del Ácido Ascórbico y Ácido Dehidroascórbico. 
 
• Materiales y Reactivos. 
Balanza analítica (Sartorius analytic) 
Matraz aforado de 100 y 25mL con tapón. 
Mortero con pistilo. 
Matraz Kitasato de 25mL con equipo para filtrado a vacío. 
Ácido m-fosfórico (Merck). 
 
• Preparación de soluciones. 
La solución de Ácido m-fosfórico al 3%, se prepara pesando exactamente 3g del ácido y 
llevándolo con agua desionizada a un volumen de 100mL en un matraz aforado. 
 
• Procedimiento. 
De la muestra se pesan de 3-5g incluidas piel y semillas, y se colocan en un mortero junto 
con 5mL de la solución de ácido m-fosfórico, se mezcla hasta obtener una pasta homogénea 
del chile, la cual se traslada íntegramente a un matraz aforado de 25mL y se lleva a aforo 
con el ácido m-fosfórico, se agita de forma manual por 1min. 
 
Todo el extracto se filtra con vacío a través de papel filtro (Whatman no. 2) y se enjuaga con 
5mL del ácido m-fosfórico. A partir de este extracto se hacen las mediciones de ácido 
ascórbico por los dos métodos analíticos y la reducción para la determinación de ascórbico 
total. 
 
5. Determinación de ácido ascórbico por titulación con 2,6 diclorofenol-indofenol. 
(AOAC 1990. No 967.21) 
 
Esta técnica está basada en las propiedades reductoras de la vitamina C, la cual al entrar en 
contacto con el cromóforo 2,6 diclorofenol-indofenol lo reduce provocando un cambio de 
coloración que va del azul al rosa. Por este método solamente se mide el ácido ascórbico 
pero no el dehidroascórbico que también tiene acción de vitamina C. 
 
• Materiales y Reactivos. 
Balanza analítica (Sartorius analytic). 
Bureta graduada de 25mL. 
4 Matraces Erlenmeyer 125mL. 
Matraz aforado de 50 y 200mL con tapón. 
Micropipeta y puntas de 200-1000µL (Micro Genes) 
Estándar de Ácido Ascórbico (Sigma Ultra 99.0%, A-5960) 
2,6 Diclorofenol-indofenol (Sigma D-1878) 
Bicarbonato de Sodio (Mallinckodt 3476) 
Ácido m-fosfórico (Merck). 
 
• Preparación de soluciones. 
Ácido m-fosfórico al 3%, se prepara pesando exactamente 3g del ácido y llevándolo con 
agua desionizada a un volumen de 100mL en un matraz aforado. 
 
Estándar de ácido ascórbico (1mg/mL) se prepara pesando correctamente 50mg de ácido 
ascórbico de referencia y se llevan a un volumen final de 50mL con ácido m-fosfórico 3%. 
 
2,6 Diclorofenol-indofenol (0.25mg/mL) se prepara disolviendo 50mg de sal de sodio de 2,6 
diclorofenol-indofenol en 50mL de agua a la cual se le adicionan 42mg de NaHCO3, se agita 
vigorosamente y cuando se disuelve el color se lleva a un volumen final de 200mL con agua 
en un matraz aforado. 
 
• Procedimiento. 
Para obtener un valor de referencia del volumen gastado de solución de 2,6 diclorofenol-
indofenol por 1mg de ácido ascórbico se transfiere por triplicado 1mL de la solución estándar 
de ácido ascórbico a matraces Erlenmeyer de 125mL que contienen 9mL de m-fosfórico al 
3%. En una bureta de 25mL se coloca la solución de 2,6 diclorofenol-indofenol y se titula la 
solución hasta que se tenga un color rosa que se mantiene por más de 5 segundos. 
 
Además se realiza un blanco, para esto en un matraz Erlenmeyer se colocan 10mL de ácido 
m-fosfórico al 3% y se titula de la misma manera. 
 
En el caso de las muestras, del extracto preparado se toman 3 alícuotas de 1mL, se colocan 
en matraces Erlenmeyer de 125mL y se añaden 9mL de ácido m-fosfórico; se titulan con la 
solución de 2,6 Diclorofenol-indofenol hasta el que el vire del color perdure por más de 5 
segundos. 
 
 
• Cálculos. 
mL gastados x muestra * 1mg ascórbico X = mL gastados x estándar
 
Donde: X = Contenido de Ácido Ascórbico (mg) 
 
X * Va * 100 Ácido ascórbico (mg/100g) = Peso de muestra (g) 
 
Donde: Va = Volumen del aforo del extracto (mL) 
 
 
6. Determinaciones por HPLC de fase normal. 
 
Con el fin de conocer el contenido de ácido ascórbico y dehidroascórbicoy conocer que tan 
significativa es la cantidad de este último, la cual no es evidenciada por la determinación 
hecha con el método de titulación. 
 
• Materiales y Reactivos. 
Sistema HPLC (Agilent Technology mod. 1100) con detector de arreglo de diodos. 
Columna cromatográfica (Atlantis HILIC Sílica 3*50mm, 3µm, Waters) 
Potenciómetro (Corning mod. 430) 
Viales de 1.5mL con tapa de rosca. (Agilent Technology) 
Micropipeta y puntas con capacidad de 50-200 y 200-1000µL (Micro Genes) 
Sistema de filtración al vacío y filtros de tamaño de poro 0.22µm (tipo GV) y 0.44µm (tipo HA) 
(Millipore). 
Filtro Miller de nylon 0.22µm de poro y 13mm de diámetro. (Millipore) 
Matraces aforados con tapón de 500, 100, 25 y 1mL. 
Jeringa de 10mL. 
Acetonitrilo (grado HPLC) (J.T. Baker) 
Acetato de amonio (J.T Baker) 
Ácido Fosfórico (J.T. Baker) 
Ácido m-fosfórico (Merck) 
D-L Ditiotreitol (Sigma D-0632) 
Tris (hidroximetil) amino-metano (Sigma Aldrich 252859) 
Ácido Sulfúrico (J.T. Baker) 
Ácido Clorhídrico (J.T. Baker) 
Estándar de ácido ascórbico (Sigma Ultra 99%, A-5960) 
Estándar de ácido dehidroascórbico (Sigma 80% D-8132) 
 
 
• Condiciones de trabajo. 
Fase móvil (80:20) Acetonitrilo: Buffer de Acetato de Amonio (10mM) pH 4.4 
Flujo de 0.1mL/min. 
Volumen de inyección 0.5µL. 
Tiempo de corrida 20min. 
Longitud de onda de detección 260nm. 
Máximo del pico de ácido ascórbico 4.4 + 0.2 min. 
Máximo del pico de D-L Ditiotreitol 3.6 + 0.2 min. 
 
• Preparación de soluciones. 
El acetonitrilo (grado HPLC), antes de ser usado se filtra a través de una membrana de poro 
de 0.22µm. 
 
El buffer de acetato de amonio (10mM), se prepara pesando de manera exacta 0.3859g de 
la sal de acetato de amonio y se disuelve llevando a un volumen de 500mL en un matraz 
aforado con agua desionizada (previamente filtrada a través de una membrana de poro de 
0.45µm), el buffer se ajusta con H3PO4 (conc) hasta pH = 4.4; después de ajustar el pH se 
afora a un volumen de 500mL y se vuelve a filtrar con una membrana de poro 0.45µm. 
 
Ácido m-fosfórico al 3%, se prepara pesando exactamente 3g del ácido y llevándolo con 
agua desionizada a un volumen de 100mL en un matraz aforado. 
 
Buffer Trizma [tris (hidroximetil) amino-metano] (0.125M) se prepara pesando 0.3786g y se 
llevan a 20mL con agua, se ajusta con HCl (conc) hasta pH final de 9.0 y se lleva a un 
volumen final de 25mL en un matraz aforado. 
 
Buffer de Trizma [tris (hidroximetil) amino-metano] (0.5M) se prepara pesando 1.5142g y se 
llevan a 20mL con agua, se ajusta con HCl (conc) hasta pH final de 9.0 y se lleva a un 
volumen final de 25mL en un matraz aforado. 
 
D-L-Ditiotreitol (DTT) al 2%, se prepara pesando 0.02g de D-L Ditiotreitol y se lleva a un 
volumen final de 1mL con el buffer Trizma 0.5M, en un matraz aforado. 
D-L Ditiotreitol (DTT) al 8%, se prepara pesando 0.4g de D-L-Ditiotreitol y se lleva a un 
volumen final de 5mL con el buffer Trizma 0.5M en un matraz aforado. 
 
Ácido sulfúrico (0.5M) se prepara tomando 13.1mL de ácido concentrado en un matraz 
aforado de 50mL y se lleva a un volumen final de 50mL con agua para llegar a una 
concentración de 5M. De esta solución se toman 10mL y se llevan a 100mL con agua en un 
matraz aforado de 100mL para tener finalmente la solución de H2SO4 0.5M. 
 
Estándar de ácido ascórbico (100µg/mL) se prepara pesando correctamente 50mg de ácido 
ascórbico de referencia y se lleva en un matraz aforado a un volumen final de 50mL con 
ácido m-fosfórico 3%; de este volumen se toman 2mL y se llevan en un matraz aforado a un 
volumen final de 10mL usando ácido m-fosfórico 3%. El estándar debe prepararse 
diariamente debido a que sen solución a temperatura ambiente solo es estable por 3 horas. 
 
Estándar de ácido dehidroascórbico (Expresado en µg/mL de ácido ascórbico la 
concentración de esta solución es de 100µg/mL), se prepara pesando correctamente 0.0171g 
de ácido dehidroascórbico de referencia y se llevan en un matraz aforado a un volumen final 
de 5mL con ácido m-fosfórico 3%. 
 
 
 
 
 
 
6.1 Determinación de Ácido Ascórbico. 
 
La metodología empleada nos permite determinar el ácido ascórbico de manera simple ya 
que en el método propuesto se observan los picos con una definición muy precisa. 
• Procedimiento. 
Del extracto obtenido previamente se toman 2.5mL, los cuales se pasan por un acrodisco de 
nylon de 0.22µm, descartándose las primeras tres gotas, se colectan los dos últimos mililitros 
en un vial. De este volumen se toma una alícuota de 200µL y se añaden 200µL del buffer 
Trizma 0.125M. 
 
Se inyecta en el equipo de HPLC bajo las condiciones previamente establecidas y se 
observa el cromatograma para que de acuerdo al valor de la respuesta (Área en Unidades de 
Absorbancia) esté dentro del intervalo establecido en la curva patrón (10-100µg/mL). Si la 
respuesta no está dentro del intervalo previamente establecido, se hace una dilución del 
extracto dependiendo de la cantidad de ácido ascórbico presente en la muestra, esta dilución 
se realiza como se ve en la tabla 6. 
 
Tabla 6. Diluciones de los extractos de chile. 
Volumen de extracto
(µL) 
Volumen Final con 
Ácido m-fosfórico 
(mL) 
Conc. final 
750 1 3 : 1 
500 1 1 : 1 
250 1 1 : 3 
 
Si la respuesta está dentro del intervalo entonces se inyecta la muestra por triplicado. 
• Cálculos. 
• Concentración de ácido ascórbico en µg/mL (Se usa el valor de la regresión 
lineal de la curva patrón del estándar de ácido ascórbico). 
 
y = b + mx -------- X = (y – b) / m 
Donde: X = concentración de ácido ascórbico en µg/mL. 
 
 Concentración de ácido ascórbico en mg/100g de muestra. 
 
 X * 2 * Ve 100 Ácido ascórbico 
(mg/100g) 
=
1000 * Peso Muestra(g) * D2
 
 
Donde: X = Concentración de ácido ascórbico en µg/mL. 
 2 = Dilución del extracto con Buffer Trizma 0.125M. 
 Ve = Volumen total del extracto (mL) 
1000 = Factor para transformar µg en mg. 
 D2 = Dilución para ajustar lectura dentro de la curva patrón (Tabla 6). 
 
 
6.2 Determinación de Ácido Ascórbico Total. 
 
Se determina el Ácido Ascórbico Total, el cual incluye el ácido ascórbico presente 
originalmente en la muestra y el ácido dehidroascórbico transformado en ácido ascórbico. 
 
• Procedimiento. 
Se toman 200µL del extracto ya diluido como se muestra en la tabla 6 y se le añaden 100µL 
de la solución reductora de DTT 2%, se deja en reposo por media hora (30min) a fin de que 
todo el ácido dehidroascórbico se reduzca a ácido ascórbico, transcurrido este tiempo se 
añaden 100µL del H2SO4 0.5M para equilibrar el pH y se inyecta la muestra por triplicado. 
 
• Cálculos. 
• Concentración de ácido ascórbico total en µg/mL (Se usa el valor de la 
regresión lineal de la curva patrón del estándar de ácido ascórbico.) 
 
y = b + mx -------- x = (y – b) / m 
Donde x = concentración de ácido ascórbico en µg/mL. 
 
 Concentración de ácido ascórbico en mg/100g de muestra. 
 
 X * 2 * Ve 100 Ácido ascórbico 
(mg/100g) 
=
1000 * Peso Muestra(g) * D2
 
 
Donde: X = Concentración de ácido ascórbico en µg/mL. 
 2 = Dilución del extracto con DTT y con H2SO4 0.5M. 
 Ve = Volumen total del extracto (mL) 
1000 = Factor para transformar µg en mg. 
 D2 = Dilución para ajustar lectura dentro de la curva patrón (Tabla 6). 
 
6.3 Determinación de Ácido Dehidroascórbico. 
 
Se realiza de manera indirecta, previa transformación a ácido ascórbico y se obtiene por 
diferencia del ácido ascórbico total. 
 
• Cálculos. 
• Concentración de ácido dehidroascórbico en mg/100g. 
 
Ácido Ascórbico total – Ácido Ascórbico = Ácido Dehidroascórbico (mg/100g) 
 
Este cálculo deja al ácido dehidroascórbico en forma de ácido ascórbico para transformarlo 
solo se requiere usar los valores de los pesos moleculares de ambos compuestos. 
 
Ácidoascórbico = 176.1g/mol. 
Ácido dehidroascórbico = 174.1g/mol. 
 
mg de ácido dehidroascórbico = mg ácido ascórbico * (174.1/176.1) 
 
 
6.4 Barrido para determinación de longitud de onda de máxima absorción. 
• Procedimiento. 
Se inyecta el estándar (el cual se prepara tomando una alícuota de 200µL en un vial y se 
añaden 200µL del Trizma de 0.125M) para ver el comportamiento de la respuesta, a cinco 
longitudes de onda de manera simultánea. 
Como se sabe que el máximo de absorción del ácido ascórbico está entre 240-260nm se fija 
en el equipo la lectura a 240, 245, 250, 252 y 260nm, se analiza la respuesta y se obtiene la 
longitud de onda de máximo rendimiento. (Wimalasari y Willis 1983, Níspero-Carriedo 1992) 
 
Posteriormente se realiza la misma determinación con una muestra en la cual se añade el 
reductor para descartar posibles interferencias o empalmado de picos. 
 
 
 6.5 Curva para determinar la concentración óptima del reductor a usar. 
 
En la literatura existen varios reportes en los cuales se menciona una gran variedad de 
concentraciones de DTT que pueden emplearse y desde 0.15 hasta 4%, dependiendo de la 
matriz biológica de estudio, motivo por el cual se realizo una curva para determinar la 
concentración óptima del reductor a usar. (Lykkesfeldt et. al, 1995 y Hernández et. al, 
2006) 
 
• Procedimiento. 
Se pone la solución estándar de ácido dehidroascórbico en presencia del reductor DTT a las 
diferentes concentraciones preparadas (Ver Tabla 7) para hacer una curva de respuesta y 
así determinar la concentración óptima a usar del reductor. 
Se ponen en un vial 200µL del estándar, se añaden 100µL del DTT y se deja reposar por 
media hora, transcurrido este tiempo se añaden 100µL de H2SO4 (0.5M) y observando el 
cromatograma se ve la concentración del estándar en forma de ácido ascórbico, ver tabla 9. 
 
Tabla 7. Diluciones empleadas para determinar la concentración óptima de DTT a usar. 
 
Solución de la 
que se parte 
Conc DTT(%) 
Volumen de 
DTT % (mL) 
Volumen final 
(mL) 
Concentración de 
solución preparada. 
 DTT(%) 
2 2.5 5 1 
4 2.5 5 2 
8 2.5 5 4 
8 1.5 2 6 
 
 
Tabla 8. Concentraciones finales en la curva de DTT. 
 
Concentración de la 
solución de DTT %
Conc Final de 
DHA (µg/mL) 
Conc Final de 
DTT % 
8 50 2.0 
6 50 1.5 
4 50 1.0 
2 50 0.5 
1 50 0.25 
 
 
 
 
 6.6 Verificación de la linealidad del sistema. 
 
La linealidad del sistema es la proporcionalidad del análisis de estándares de referencia en el 
sistema de cuantificación. Permite obtener curvas de calibración que relacionan la respuesta 
que genera el analito (Y) en una metodología dada, con la concentración de soluciones 
estándar del analito (X). La curva de calibración se prepara con al menos 5 niveles de 
concentración del estándar, cada nivel, al menos por triplicado. 
 
• Procedimiento. 
De la solución estándar de ácido ascórbico cuya concentración es de 1mg/mL se hacen 
diluciones con ácido m-fosfórico 3% a un volumen final de 10mL (Ver Tabla 9), para tener 
todas las concentraciones que se manejan en la curva patrón; estas muestras se preparan 
en concentraciones mayores puesto que en la solución que se inyecta se hace una dilución 
extra. 
Una vez preparadas las concentraciones de los estándares se toma un volumen de 200µL 
en un víal y se le añaden 200µL del Trizma de concentración 0.125M; este paso representa 
una dilución (1:1) que hace que las concentraciones finales de los estándares sean las 
mencionadas en la tabla. 
 
Se procede a hacer la inyección de cada concentración por sextuplicado y se determina el 
Promedio, Desviación estándar y el Coeficiente de Variación. 
 
 
 
Tabla 9. Diluciones para la curva patrón de ácido ascórbico. 
 
Volumen del estándar 
(mL) 
Concentración 
preparada (µg/mL) 
Concentración final 
(µg/mL) 
2.0 200 100 
1.6 160 80 
1.4 140 70 
1.2 120 60 
1.0 100 50 
0.8 80 40 
0.6 60 30 
0.2 20 10 
 
 
6.7 Prueba de Precisión. 
 
La evaluación de adecuabilidad permite encontrar el error en el análisis debido únicamente al 
equipo. Se examina seis veces una sola muestra, empleando las mismas condiciones en el 
análisis. La precisión del sistema se determina a partir del análisis de una solución a un solo 
nivel de concentración, por sextuplicado. 
 
Se emplean los datos obtenidos de 3 de las concentraciones de la curva patrón para verificar 
la linealidad del sistema a un solo nivel de concentración, se determina el Promedio, 
Desviación estándar y Coeficiente de variación. 
 6.8 Prueba de Sensibilidad. 
Cuando mayor es la sensibilidad de un método, será más probable medir cambios pequeños 
en la respuesta del sistema de detección, que es la mínima cantidad de analito que se puede 
detectar pero no necesariamente cuantificar, y el límite de cuantificación que es la mínima 
concentración del analito que se puede determinar con exactitud y precisión razonables. 
 
Se realiza preparando concentraciones (mediante una serie de diluciones) menores al último 
nivel de concentración de la curva patrón, se procede a realizar la inyección y registro de 
señal, por lo que esta determinación se hace mediante ensayo y error hasta que la respuesta 
arrojada por los cromatogramas nos permite definir los parámetros de limite de detección y 
límite de cuantificación, se determina el Promedio, Desviación estándar y Coeficiente de 
variación. 
 
6.9 Prueba de Selectividad. 
La especificidad es la capacidad de un método analítico para obtener respuesta debida 
únicamente al analito de interés y no a otros componentes de la muestra. 
 
Se inyecta un blanco de las soluciones y se observa el cromatograma para verificar que la 
respuesta esta dada solo por el ácido ascórbico. 
 
 
 
 
 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 
 
1. Determinación de Parámetros de Validación y condiciones óptimas de trabajo. 
 
1.1 Verificación de la linealidad del sistema. 
En la tabla 10 se muestran los resultados obtenidos durante la elaboración de la curva de 
calibración del tipo: respuesta = f (concentración), (Ver Grafica 1). Como el coeficiente de 
determinación (r2) es mayor de 0.98 y los valores de Coeficiente de variación reportados para 
los sextuplicados en dos días diferentes son menores al 5% cumple la prueba de linealidad 
del sistema. El análisis cromatográfico del estándar de ácido ascórbico (Ver figura 6) 
presenta un pico bien definido. 
 
Tabla10. Linealidad del sistema. Respuesta (relación de áreas) en función de concentración. 
Estándar de Ácido 
Ascórbico (µg/mL) 
Respuesta %C.V. 
10 121.70 ± 5.02 4.12 
30 403.84 ± 9.54 2.36 
40 589.46 ± 16.18 2.74 
50 718.48 ± 20.67 2.88 
60 926.47 ± 17.77 1.92 
70 1028.07 ± 24.47 2.38 
80 1258.00 ± 40.61 3.23 
100 1609.37 ± 49.85 3.10 
 
 
 
Figura 6. Cromatograma de la separación de una solución estándar de ácido ascórbico 
(100µg/mL). 
 
El pico que se observa a un tiempo de 4.482min es el correspondiente al ácido ascórbico; las 
proporciones son de 200µL de la solución estándar de ácido ascórbico (200µg/mL) en ácido 
m-fosfórico 3%, adicionada con 200µL de buffer Tris (hidroximetil) amino-metano (0.125M). 
Los picos que se observan a tiempo 3.523 y 3.902min corresponden al blanco. 
Columna Atlantis HILIC Sílica 3*50mm, 3µm. Detector de UV, longitud de onda 260nm. 
Volumen de inyección 0.5µL, tiempo de corrida 20min, fase móvil (80:20) Acetonitrilo: Buffer 
de Acetato de Amonio (10mM) pH 4.4, flujo de 0.1mL/min. 
Máximo del pico de ácido ascórbico 4.4 + 0.2 min. 
 
Grafica 1. 
Curva Patrón Ácido Ascórbico
y = 16.09x - 47.157
R2 = 0.9954
-100
100
300
500
700
900
1100
1300
1500
1700
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
µg/mL
A
re
a
 
 
 
1.2 Pruebas de Precisión. 
 
En la tabla 11 se encuentran los resultados obtenidos después de inyectar seis veces una 
solución estándar de ácido ascórbico a tres diferentes nivelesde concentración, en dos 
diferentes días. Los resultados son los obtenidos en la realización de la curva patrón. 
Se obtuvieron coeficientes de variación bajos, cumpliendo con el criterio de aceptación ya 
que los valores de C.V. son menores al 3%. 
 
 
 
Tabla11. Precisión del sistema. Reacción en el estándar de ácido ascórbico en dos días. 
 Estándar de Ácido 
Ascórbico(µg/mL) 
Respuesta % C.V 
10 117.47 ±1.99 1.69 
50 718.62 ± 10.64 1.48 Día 1 
100 1650.07 ± 26.13 1.58 
10 125.97 ± 2.90 2.30 
50 718.34 ± 16.63 2.78 Día 2 
100 1568.65 ± 28.38 1.81 
 
 
1.3 Prueba de sensibilidad. 
A partir de la curva de calibración se determinaron los límites de cuantificación (mínimo 
cuantificable con certeza) y de detección (mínima concentración detectable pero no 
cuantificable). Los valores obtenidos en dos días diferentes para determinar el límite 
cuantificación son los observados en la tabla 12. 
 
Tabla 12. Determinación del límite de cuantificación en dos días. 
Estándar de Ác. Ascórbico 
5 (µg/mL) 
Respuesta % C.V. 
Día 1 64.143 ±0.599 0.934 
Día 2 60.567±0.212 0.349 
 
El límite de detección se calibró en 2µg/mL. 
1.4 Determinación de la concentración óptima de DTT a usar. 
 
Tabla 13. Respuesta dada por Ditiotreitol. 
Concentración de 
Ditiotreitol (%) 
Respuesta % C.V. 
1 658.48 ± 34.08 5.17 
2 771.38 ± 56.87 7.37 
4 796.9 ± 63.21 7.93 
6 762.4 ± 121.0 14.69 
8 803.68 ± 61.88 7.69 
 
 
Grafica 2. 
Curva de reducción de DHA con diferentes concentraciones de 
DTT
0
200
400
600
800
1000
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Conc de DTT en %
A
re
a
 
 
Al realizar al análisis estadístico de la t-student se observa que entre los resultados obtenidos 
de la concentración de 2 y 8% no hay diferencias significativas. Por otro lado entre los datos 
de 1 y 8% si la hay. Esto nos permite fijar el valor de 2% como la concentración del reductor 
óptima para trabajar, tal como encontró Hernández et. al. (2006) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2. Análisis de Muestras. 
Tabla 14. Comparación entre muestras y métodos para la cuantificación de ácido ascórbico y 
ácido dehidroascórbico en ocho variedades de chile y en dos estados de maduración. 
Muestras 
Titulación 
AOAC(1990) 
Ácido Ascórbico
HPLC 
Ácido 
Ascórbico 
HPLC 
Ácido 
Dehidroascórbico 
 
HPLC (Total) 
AA + DHA 
Serrano Maduro 
62.84 ± 6.15 
(9.78) 
60.2 ± 7.52 
(12.5) 
5.46 65.64 ± 8.70 
(13.25) 
Serrano Verde 
96.95 ± 10.16 
(10.48) 
96.27 ± 9.97 
(10.35) 
5.54 101.87 ± 9.88 
(9.7) 
Piquín Maduro 
93.11 ± 6.32 
(6.78) 
92.33 ± 5.62 
(6.08) 
8.72 100.4 ± 6.91 
(6.88) 
Piquín Verde 
134.73 ± 18.46 
(13.70) 
148.80 ± 10.97 
(7.37) 
7.98 157.62 ± 11.43 
(7.25) 
Árbol 
103.57 ± 15.82 
(15.27) 
105.29 ± 16.59 
(15.75) 
7.05 112.41 ± 15.48 
(13.77) 
Habanero 
106.83 ± 8.89 
(8.32) 
109.65 ± 9.43 
(8.60) 
3.33 113.38 ± 9.93 
(8.76) 
Güero 
130.62 ± 4.53 
(3.47) 
136.16 ± 6.88 
(5.06) 
5.58 141.79 ± 6.78 
(4.78) 
Pimiento morrón 
151.15 ± 7.34 
(4.86) 
149.61 ± 9.05 
(6.05) 
7.45 157.14 ± 9.27 
(5.9) 
Poblano 
190.08 ± 20.73 
(10.9) 
186.37 ± 23.91 
(12.82) 
6.62 193.06 ± 24.44 
(12.66) 
Chilaca 
316.18 ± 28.1 
(8.88) 
332.53 ± 28.87 
(8.68) 
11.43 344.08 ± 27.71 
(8.05) 
 
Resultados obtenidos de seis determinaciones para cada muestra y reportados en base 
húmeda (mg/100g), incluyen desviación estándar y coeficiente de variación. El ácido 
dehidroascórbico se obtuvo por la diferencia del ácido ascórbico total menos el ácido 
ascórbico originalmente presente en la muestra. 
Los cromatogramas representativos se pueden ver en las figuras 7 y 8. 
 
 
 
Figura 7. Cromatograma de la separación de una muestra de Chile Poblano. 
 
El pico que se observa a un tiempo de 4.522min es el correspondiente al ácido ascórbico; las 
proporciones son de 200µL del extracto de chile en ácido m-fosfórico 3%, adicionada con 
200µL de buffer Tris (hidroximetil) amino-metano (0.125M). El pico que se observa a tiempo 
3.964min corresponden al blanco. 
 
Columna Atlantis HILIC Sílica 3*50mm, 3µm. Detector de UV, longitud de onda 260nm. 
Volumen de inyección 0.5µL, tiempo de corrida 20min, fase móvil (80:20) Acetonitrilo: Buffer 
de Acetato de Amonio (10mM) pH 4.4, flujo de 0.1mL/min. 
Máximo del pico de ácido ascórbico 4.4 + 0.2 min. 
 
 
 
 
 
Figura 8. Cromatograma de la separación de una muestra de Chile Poblano (Reducida). 
 
 
El pico que se observa a un tiempo de 4.393min es el correspondiente al ácido ascórbico; las 
proporciones son de 200µL del extracto de chile en ácido m-fosfórico 3%, adicionada con 
100µL del reductor (Ditiotreitol 2% preparado en buffer Tris [hidroximetil] amino-metano 0.5M) 
y 100µL de H2SO4 (0.5M). 
 
El pico que se observa a tiempo 3.511min corresponde al reductor. 
 
 
2.1 Análisis del contenido de Ácido Ascórbico en ocho variedades de chile. 
 
En la tabla 14 se muestra el contenido de Vitamina C expresado en concentración de Ácido 
Ascórbico en las diferentes variedades de chile presenta un amplio rango que va desde un 
máximo de 332.5mg/100g de muestra correspondientes al chile Chilaca hasta un mínimo de 
60.2g/100g del chile Serrano Maduro, estos resultados están expresados en base húmeda 
(Bh), que es como originalmente se analizaron las muestras, y como la mayoría de los 
autores reportan el contenido de vitamina C. 
 
La cuantificación del Ácido Ascórbico en frutas por cromatografía de líquidos se ha realizado 
anteriormente Howard et al. (2000) usando el método descrito por Wimalasari y Wills (1983) 
obtienen valores de 114-135mg/100g para el chile Pimiento y de 115-122mg /100g para el 
chile Habanero. Lee et. al, (1995) usando el mismo método reporta valores de 
121.8mg/100g, 168.4mg/100g, 63.9mg/100g para el chile de Árbol, Poblano y Serrano 
respectivamente, estos valores concuerdan con los obtenidos. 
 
Es importante hacer notar que aun la muestra con el menor contenido de ácido ascórbico de 
las analizadas presenta un aporte suficiente por 100g de muestra para cubrir los 
requerimientos diarios de un adulto en condiciones estándar; ya que el valor de RDA 
reportado para adultos es de 60mg (Instituto Nacional de Nutrición 2001), lo que por 
supuesto implica que el resto de las especies analizadas rebasan este requerimiento y en el 
caso particular del chile Poblano (188mg/100g) y Chilaca(324mg) el aporte es del 300 y 
500% respectivamente. 
 
2.2 Comparación de Métodos HPLC vs Titulación. 
 
Al hacer la comparación de la concentración de Ácido Ascórbico obtenidas por ambos 
métodos (Titulación y Cromatografía) se observa que estadísticamente no existen diferencias 
para ninguna de las variedades de chile; y no se observa una tendencia en cuanto a cual 
metodología aporta un mayor rendimiento. 
 
Aun cuando se esperaba que el contenido de ácido ascórbico obtenido al hacer el análisis 
por titulación fuera mayor debido a las interferencias que se pudieran presentar por la 
influencia de otros agentes reductores presentes en los extractos de chile, esto no sucedió. 
En el caso de las muestras de chile Serrano(verde y maduro), Piquín(maduro), Pimiento y 
Poblano los valores obtenidos por titulación son mayores que los obtenidos por 
cromatografía; mientras que para las muestras de chile de Árbol, Habanero, Güero, Piquín 
(verde) y Chilaca los valores obtenidos por cromatografía son mayores a los obtenidos por 
titulación. Este comportamiento aun cuando no pudo ser explicado fue encontrado por 
Hernández et al. (2006) quienes comparan el método oficial contra un método cromatográfico 
propuesto por ellos, en un análisis de Vitamina C en frutas tropicales. 
 
Al hacer el análisis estadístico (Análisis de Varianza y prueba múltiple de Duncan, ver Anexo 
3.1) y comparar los resultados arrojados para todas las variedades de chiles cuantificadas 
por ambos métodos se observa que entre la mayoría de las