Estudio-de-la-oligomerizacion-de-la-toxina-Cry1Ab-de-Bacillus-thuringiensis-y-su-insercion-en-membrana-mediante-espectroscopia-de-fluorescencia-del-triptofano

Vista previa del material en texto

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA 
 
 
 
“Estudio de la oligomerización de la toxina Cry1Ab de 
Bacillus thuringiensis y su inserción en membrana mediante 
espectroscopia de fluorescencia del triptofano” 
 
 
 
T E S I S 
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE 
MAESTRO EN CIENCIAS BIOQUIMICAS 
P R E S E N T A: 
Carlos Cristopher Padilla Delgado 
 
 
 
 
 
Directora de Tesis: 
 Dra. Liliana Pardo López 
 
 
 
JUNIO 2007 
 
 
 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
Restricciones de uso 
 
DERECHOS RESERVADOS © 
PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL 
 
Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal 
del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). 
El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea 
objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para 
fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo 
mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Estudio de la oligomerización de la toxina Cry1Ab 
de Bacillus thuringiensis y su inserción en membrana 
mediante espectroscopia de fluorescencia del triptofano” 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El presente trabajo se realizó en el Instituto de Biotecnología de la Universidad 
Nacional Autónoma de México, Departamento de Microbiología Molecular en el 
laboratorio de la Dra. Alejandra Bravo de la Parra. Durante la realización de este 
proyecto se contó con apoyo económico por parte del Consejo Nacional de Ciencia y 
Tecnología (CONACyT) con numero de registro 195569 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Esto va dedicado para el ser mas maravilloso que me ha tocado conocer, que día con día 
me enseña que hay que disfrutar la vida al máximo, dándome mucho amor y alegría. 
Alancito, algún día leerás esto y espero sigas siendo una gran persona. 
 
 
 
 
“We barely remember who or what came before this precious moment, 
We are choosing to be here right now. Hold on, stay inside 
This holy reality, this holy experience. 
Choosing to be here in 
This body. This body holding me. Be my reminder here that I am not alone in 
This body, this body holding me, feeling eternal 
All this pain is an illusion. 
Alive, I 
In this holy reality, in this holy experience. Choosing to be here in 
This body. This body holding me. Be my reminder here that I am not alone in 
This body, this body holding me, feeling eternal 
All this pain is an illusion. 
Twirling round with this familiar parable. 
Spinning, weaving round each new experience. 
Recognize this as a holy gift and celebrate this chance to be alive and breathing. 
This body holding me reminds me of my own mortality. 
Embrace this moment. Remember. We are eternal. 
All this pain is an illusion”. 
(Tool, Parabola) 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
A la Dra. Alejandra Bravo por permitirme continuar laborando en su grupo de 
trabajo, siendo un gran ejemplo a seguir, gracias Ale. 
 
A mi tutora, Dra. Liliana Pardo por todo lo bueno y no tan bueno (sobretodo sus 
“neuras”) que tuvimos en nuestra convivencia, ambos aprendimos mucho formando 
un buen equipo, 
 
A los miembros del jurado en la revisión de esta tesis: Dr. Segovia, Dra. Garza, Dr. 
Takuya, Dr. Corzo, y a la Dra. Bravo, gracias por sus aportaciones. 
 
A los miembros de mi comité tutoral a lo largo de la maestría, Dra Gloria Saab y Dr. 
Enrique Rudiño, por guiarme adecuadamente y que aportaron valiosas sugerencias 
que hicieron de este un buen trabajo. 
 
En a mi familia, Diana por aguantar este tiempo y a mi pequeñín, Alancito, por 
darme gran felicidad día con día. 
 
A mi papá, mi mamá y mi hermano por darme su apoyo en todo momento, 
ayudándome más de la cuenta, sin su apoyo difícilmente estaría en este nivel. Gracias 
 
A mis compañeros de laboratorio, Ángeles, Claudita, Leivi, Nuria, Luisa, Teresita, 
Erandi, Teresota, Idalia, Nancy, Roberto, Ramiro, Oswaldo, Sabino, Carlos, Juan y 
al Dr. Mario Soberón, por momentos muy divertidos que ayudan a mantener un 
ambiente más que agradable para laborar, al menos para mi, ja. 
 
A Iván y Jorge por innumerables momentos mas que divertidos, y no solo 
borracheras sino sobretodo buen humor, eso es la neta del planeta. 
 
A Isa por ayudarme en todo momento, estar ahí casi siempre, porque luego te ibas 
temprano. Gracias, eres más que un ejemplo a seguir. Aunque no tan gurú como 
Juan M. 
 
Al Cheko y Alex, por su gran amistad, Chela y Liz por tocho morocho. 
 
A mis compañeros de generación con los que compartí momentos muy agradables, 
Alberto, Lili, Luary, Karla Garcia, Karla Mtz, Arlette, Ana, Erikita, nos vemos 
pronto chikos, y como dijo el tío Gamboin …“No me fallen…sobrinos”. 
 
 
 
 
ÍNDICE DE CONTENIDO 
 
LISTA DE ABREVIACIONES…...…......…...………………………...……...………. 1 
 
INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………….. 2 
Características generales. Bacillus thuringiensis …………………………………. 3 
 
Clasificación de las δ-endotoxinas de Bacillus thuringiensis……………………. 5 
 
Estructura de las toxinas Cry ………………………………………………………… 6 
 
Mecanismo de acción de las proteínas Cry ………………………………………… 7 
-Solubilización y procesamiento de las protoxinas Cry ……………………………. 9 
-Unión al receptor y oligomerización…………………………………………………. 10 
 -Inserción en la membrana y formación de poro …………………………………… 12 
 
Espectroscopia De Fluorescencia……………………………………………………… 15 
- Absorción de la luz…………………………………………………………………….. 15 
- Fluorescencia…………….……………………………………………………………… 19 
- Relajació vibracional…………………………………………………………………… 20 
- Conversión interna…………………………………………………………………….. 21 
- Efectos del solvente…………………………………………………………………..... 22 
- Apagamiento colisional (quenching)………………………………………………….. 25 
- Fluoróforos……….…………………………………………………………………….. 26 
- Fluorescencia de proteínas…………………..………………………………………… 29 
- El triptofano y su función en las proteínas…………………………………………... 31 
 
ANTECEDENTES PARTICULARES…………………………………………………. 33 
 
HIPÓTESIS………………………………………………………………………………. 42 
 
OBJETIVOS …………………………………………………………………………….. 42 
 
MATERIALES Y METODOS …………………………………………………………. 43 
 
Purificación de cristales de las toxinas mutantes. ………………………………… 43 
 
Determinación de concentración de proteína ……………………………………….. 44 
 
Bioensayos de toxicidad……………………………………………………………….. 45 
 
Electroforesis de proteínas……………………………………………………………. 45 
 
 
Producción de la toxina………………………………………………………………… 46 
 
Formación del Oligómero ……………………………………………………..……… 46 
 
Purificación del monómero y oligómero…………………………………………… 47 
 
Detección por Western blot …………………………………………………………… 47 
 
Espectros de emisión…………………………………………………………………… 48 
 
Apagamiento de la fluorescencia …………………………………………………….. 48 
 
Preparación de liposomas …………………………………………………………….. 49 
 
Inserción en membrana………………………………………………………………… 50 
 
 
RESULTADOS…………………………………………………………………………. 51 
 
Producción de los cristales de la toxina Cry1Ab silvestre y de las mutantes 
múltiples de Triptofano.……………………………………………………………….. 51 
 
Purificación de las toxinas …………………………………………………………….. 51 
 
Análisis de toxicidad de las mutantes……………………………………………….. 52 
 
Activación de la protoxina mediante el uso de tripsina……………………………. 53 
 
Purificación del monómero por FPLC…………………………………………………54 
 
Oligomerización de las toxinas ……………………………………........................... 55 
 
Purificación del oligómero por FPLC ………………………………………………… 58 
 
Apagamiento de la fluorescencia …………………………………………………….. 61 
 
Apagamiento de la fluorescencia con Inserción en la membrana…………….….. 65 
 
DISCUSIÓN …………………………………………………………………………….66 
 
PERSPECTIVAS………………………………………………………………………… 76 
 
REFERENCIAS ………………………………………………………………………….. 78 
 1 
ABREVIACIONES 
AC Adenilato ciclasa 
Anti-CMyc Anticuerpo monoclonal anti-ratón 
APL Alcalino fosfatasa 
APN Aminopeptidasa N 
Bt Bacillus thuringiensis 
cAMP Adenosil monofosfato cíclico 
DT Toxina de la difteria 
E Energía 
Eel Energía electrónica 
EqtII Equinotoxina II 
Erot Energía rotacional 
Evib Energía vibracional 
F Fluorescencia 
ƒa Fracción accesible al apagador 
FPLC Cromatografía líquida de proteínas 
GalNac N-acetilgalactosamina 
GPI Glicosil-fosfatidil-inositol 
HCT Medio de cultivo (Hidrolizado de casein-triptona) 
kDa Kilo Daltones 
KI Ioduro de potasio 
Ksv Constante de Stern Volmer 
LC50 Dosis letal media 
MM Mutante múltiple 
NBD Fluoróforo 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol 
PA Antígeno protector 
PFO Perfingolisina 
Phe Fenilalanina 
PKA Proteína cinasa A 
PMSF fluoruro de fenilmetil sulfonilo 
Q Apagador de fluorescencia 
S0,1,2 Estados electrónicos 
SP Medio de Esporulación 
SUV Vesículas unilamelares pequeñas 
TFPs Toxinas formadoras de poro 
Trp Triptofano 
Tyr Tirosina 
UV Ultravioleta 
VIP Proteínas insecticidas vegetativas 
VMMA Vesículas de membrana de microvellosidad apical 
W Triptofano 
Wt Cepa silvestre 
λ Longitud de onda 
 2 
“Estudio de la oligomerización de la toxina Cry1Ab de Bacillus thuringiensis y 
su inserción en membrana mediante espectroscopia de fluorescencia del 
triptofano” 
 
INTRODUCCIÓN 
Uno de los principales intereses a nivel mundial en la producción de alimentos y 
en la salud humana, es el control de plagas por insectos que afectan la agricultura y de 
vectores de enfermedades de importancia en la salud pública (Bravo et al., 2005). Se 
estima que anualmente un 28% de la producción de alimentos en el mundo es afectada 
por insectos plagas ya sea en el campo o durante su almacenamiento. Hasta los últimos 
años el control de estas plagas se ha basado principalmente en el uso de insecticidas 
químicos; lo que ha provocado una serie de efectos no deseados en el medio ambiente 
como son: la acumulación de químicos carcinogénicos en los ecosistemas, la 
contaminación del agua, el desarrollo de resistencia por parte de los insectos y sobre 
todo la destrucción indiscriminada de otras especies benéficas que afectan el entorno 
natural. En conjunto, todos estos factores han originado la búsqueda de alternativas que 
no dañen al medio ambiente (Rajamohan et al., 1998). 
Una alternativa con menor impacto nocivo a los ecosistemas para el control de 
plagas de diversos cultivos, es el uso de bioinsecticidas. Este tipo de control biológico, 
hace uso de un organismo silvestre o modificado genéticamente o bien alguno sus 
productos para reducir los efectos de insectos plaga en su conjunto (Karamanlidou et al., 
l991 y Badii et al., l996). Ignoffo en 1979 reportó la existencia de más de 1500 especies de 
microorganismos entomopatógenos con potencial para el control de insectos, contando 
entre ellos a: hongos, virus, protozoarios y bacterias, en donde éstas últimas son las de 
mayor importancia. Sin embargo, su uso a nivel mundial abarca apenas unos pocos 
millones de hectáreas de cultivos y bosques cada año. Los insecticidas químicos han 
dominado el mercado de control de plagas desde 1960 ya que presentan un gran número 
de ventajas entre las que se incluyen: su bajo costo de producción, un amplio espectro de 
especies blanco y su fácil aplicación (Bishop, 1994). Los bioinsecticidas tienen desventaja 
 3 
en este punto ya que solo cuentan con un pequeño segmento dentro del mercado (≈ 5%), 
a pesar de que ofrecen una alternativa ambientalmente segura y de bajo costo con 
respecto a los químicos. Sin embargo, los bioinsecticidas tienen altos costos comerciales, 
tienen baja eficacia en comparación con los insecticidas químicos, los productos tienen 
limitada persistencia y su espectro de insectos blanco es reducido (Bravo et al., 2005). 
Por medio de la ingeniería genética se están investigando varios de estos 
problemas con el objetivo de resolverlos sin perder las características benéficas de estos 
insecticidas biológicos (Bishop, 1994). Aunado a esto, la generación de plantas 
transgénicas resistentes al ataque de insectos está ganando mucho terreno, siendo una 
de las metas principales la substitución de insecticidas químicos pero asegurando que el 
uso de esta tecnología no sea dañina al ambiente, evitando en lo posible alterar la 
diversidad genética de las especies silvestres (Bravo et al., 2005). 
 Entre los diferentes agentes de control biológico, las bacterias patógenas de 
insectos han sido de las alternativas más estudiadas. Aún cuando diversas bacterias 
infectan y matan insectos, Bacillus thuringiensis es el agente de control biológico 
comercialmente más probado y utilizado sobre algunas plagas de insectos. Por ejemplo, 
en Estados Unidos y Canadá del 80-100% del control de plagas usando bioinsecticidas 
en los bosques recae en el uso de B. thuringiensis, aunque el éxito de la aplicación 
depende del tiempo apropiado, condiciones ambientales y altas dosis de las aplicaciones 
del rociado (Bravo et al., 2005). 
 
Bacillus thuringiensis. Características generales 
Bacillus thuringiensis (Bt) es una bacteria Gram-positiva, aerobia estricta. Durante 
su ciclo de vida presenta dos fases principales, la fase de crecimiento vegetativo en 
donde las bacterias se duplican por bipartición y la fase de esporulación, la cual es un 
programa de diferenciación de bacteria a espora. El programa de diferenciación consta 
de siete estadíos, se dispara cuando la bacteria se encuentra en limitación de nutrientes, 
como fuentes de carbono, nitrógeno y fósforo, lo que da como resultado la formación de 
una célula quiescente altamente resistente a la desecación, la falta de nutrientes y 
 4 
exposición a la luz ultravioleta. Este programa de diferenciación involucra la regulación 
de muchos genes en el tiempo y en el espacio a través de la utilización de múltiples 
factores que se expresan a diferentes tiempos (Soberón y Bravo, 2001). 
Durante la fase de esporulación Bt produce inclusiones cristalinas de naturaleza 
proteica con propiedades insecticidas (figura 1). Por su acumulación en forma de 
cristales, estas proteínas son designadas como proteínas Cry o bien δ-endotoxinas 
(dentro de las cuales también se encuentran las proteínas Cyt) (Yamamoto y Dean, 2000). 
Se han reportado δ-endotoxinas activas contra insectos lepidópteros (mariposas), 
coleópteros (escarabajos), dípteros (mosquitos), himenópteros (hormigas), artrópodos 
(ácaros) y también contra otros invertebrados como nemátodos, y protozoarios, por lo 
que se han utilizado como bioinsecticidas comerciales contra larvas de insectos plaga 
que afectan la agricultura y áreas forestales, así como para el control de insectos vectores 
de patógenos del ser humano. Su éxito de utilización radica en su alta especificidad 
hacia el insecto blanco y su inocuidad para mamíferos, otros vertebrados, plantas e 
inclusive otros insectos (Schnepf et al., 1998). 
 
Figura 1. Micrografía de Bacillus thuringiensis, donde se muestra la endoespora (E) y el 
cristal (C) que contiene las proteínas insecticidas. 
 
Además de las δ-endotoxinas, B. thuringiensis ha desarrollado una serie de 
factores de virulencia que le permiten infectar a sus blancos con mayor eficiencia, entre 
los que se encuentran: fosfolipasas, proteasas, quitinasas, α-exotoxinas o exotoxinas 
termolábiles. Las β-exotoxinas, las cuales son toxinas que funcionan como análogos de 
ATP y las proteínas “VIP” (proteínas insecticidas vegetativas), que son proteínas de 
aproximadamente 80 kDa, producidas en la fase vegetativa del crecimiento, son 
E 
 C 
 5 
secretadas al medio extracelular y son activas contra una gran variedad de lepidópteros 
(de Maagd et al., 2003). 
 
Clasificaciónde las δ-endotoxinas de Bacillus thuringiensis 
Las δ-endotoxinas se dividen en 2 superfamilias: las proteínas Cry y las 
proteínas Cyt. A la fecha las proteínas Cry están agrupadas en 51 subgrupos con más de 
200 miembros y las proteínas Cyt en dos grandes grupos y varios subgrupos. La 
definición de proteínas Cry es un poco amplia: cualquier proteína paraesporal de Bt que 
muestre un efecto tóxico hacia algún organismo blanco, verificable por medio de 
bioensayos o cualquier proteína que tenga similitud en la secuencia con las proteínas 
Cry (Bravo et al., 2005). Las toxinas Cry son una familia de proteínas de 70 y hasta 140 
kDa, forman cristales y son tóxicas contra una amplia variedad de insectos. La familia de 
las toxinas Cyt incluye proteínas de 25 a 30 kDa, también forman cuerpos paraesporales 
y son activas contra dípteros (Li et et al., 2001). 
Originalmente la clasificación de las toxinas Cry se basó en la identidad de 
secuencia y en el orden de insecto contra el que son específicos. Al ir creciendo el 
número de secuencias reportadas se decidió que la nueva nomenclatura de las δ-
endotoxinas se basara exclusivamente en la similitud de la secuencia primaria. En esta 
nueva nomenclatura se incluye el nombre Cry más un nombre compuesto por cuatro 
categorías. Dentro de estas categorías, el número arábigo se designa con la primera fila 
que corresponde hasta 45% de identidad (Ej. Cry1, Cry2, Cry3, etc.); la segunda hilera 
cataloga a las proteínas con una letra mayúscula y corresponde a identidades de 45 a 
78% (Ej. Cry1A, Cry1B, Cry1C, etc.); la tercera fila asigna una letra minúscula y 
corresponde a identidades de 78 a 95% (Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, etc.); la última fila 
incluye un número arábigo al final de la nomenclatura indicando más de 95% de 
identidad (Crickmore et al., 1998). 
Cada grupo muestra una especificidad muy grande hacia ciertos tipos de 
insectos. El grupo más grande de proteínas Cry lo forma la familia Cry de 3 dominios, 
que contiene 37 subgrupos de proteínas. El resto de las proteínas Cry se agrupan en 
 6 
pequeños conjuntos de 4-5 toxinas. Uno de estos grupos tiene homología con las toxinas 
binarias de Bacillus sphericus, y otro con las toxinas Mtx también de B.sphericus (de Maag 
et al., 2003). 
 
Estructura de las toxinas Cry 
Las toxinas Cry de tres dominios son proteínas globulares y muestran el mismo 
plegamiento entre ellas. La estructura tridimensional determinada por difracción de 
rayos X de la porción tóxica de las proteínas Cry3A, Cry1Aa, Cry3Bb1, Cry4Aa y Cry4B 
al igual que de la protoxina Cry2A ha revelado que estas moléculas están organizadas 
en tres dominios estructurales distinguibles entre sí, cada uno constituido por cerca de 
200 aminoácidos (figura 2), (Li et al., 1991; Grochulski et al., 1995; Morse et al., 2001). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Estructura tridimensional de la toxina Cry1Aa. Se observan los tres dominios 
estructurales. El Dominio I (en azul) . El Dominio II (en verde) y el Dominio III (en rojo y 
amarillo), tomada de De Maagd, R., Bravo, A. y Crickmore, N. (2001). 
 
El dominio I esta constituido por seis hélices α antiparalelas y anfipáticas (α1, α2, 
α3, α4, α6, α7), éstas hélices forman un ramillete que rodea a una séptima, hélice α5 la 
cual es muy hidrofóbica. A excepción de las hélices α1, α2a, α2b, las α hélices restantes 
 7 
tienen una longitud de más de 30 Å, por lo cual son de tamaño suficiente para atravesar 
la membrana. Estos datos, junto con algunos obtenidos por experimentos de 
mutagénesis y el análisis de la interacción de péptidos sintéticos con membranas 
artificiales sugieren que se trata del dominio que forma el poro iónico (Aronson y Shai, 
2001). El dominio II está formado por tres láminas plegadas β-antiparalelas que 
terminan en asas ("loops 1, 2 y 3") en el vértice de la molécula formando un prisma. Se 
ha demostrado que el dominio II juega un papel fundamental en la especificidad de la 
toxina, donde las asas varían en tamaño y constituyen regiones hipervariables entre las 
diferentes toxinas que interaccionan con el receptor localizado en las microvellosidades 
de las células epiteliales del intestino medio de los insectos. El dominio III está 
compuesto de dos láminas β-plegadas antiparalelas, arregladas en forma de 
emparedado una sobre otra, por lo que la lámina del exterior es accesible al solvente, 
mientras que la interior se encuentra de cara a los otros dominios. Se ha propuesto que 
este último dominio protege a la toxina de la acción proteolítica prematura por parte de 
las enzimas digestivas y que la interacción con los dominios I y II es importante para 
mantener la estabilidad e integridad de la protoxina. Por otro lado, también se ha 
reportado que el dominio III esta involucrado en la especificidad de la toxina (Schnepf et 
al., 1998; Van Rie, 2000). 
 
Mecanismo de acción de las proteínas Cry 
 Aún no se ha descrito completamente el mecanismo de acción de las toxinas 
Cry, pero se ha generado una cantidad importante de información al respecto en los 
últimos años. El entender el mecanismo de acción de las toxinas de Bt y el desarrollo de 
resistencia de los insectos susceptibles es fundamental para un uso racional de estas 
toxinas en el control de plagas. Es importante mencionar que la mayor parte de la 
información se ha obtenido de insectos del orden Lepidóptera por la facilidad que 
representa su tamaño para su manejo y mantenimiento en el laboratorio. 
Los síntomas que se observan a partir de que las larvas de insectos susceptibles 
ingieren los cristales y esporas de Bt son: cese de la ingesta, parálisis del intestino, 
 8 
vómito, diarrea, parálisis total y finalmente la muerte por inanición y septicemia. Los 
estudios histopatológicos han mostrado que las células columnares del intestino medio 
son las estructuras afectadas inicialmente y en particular, la microvellosidad apical, la 
cual se destruye en su totalidad (Bravo et al., 1992). En general el mecanismo de acción 
de las proteínas Cry es un proceso de varios pasos que involucran: solubilización del 
cristal, procesamiento de las protoxinas, unión al receptor, oligomerización, unión a un 
segundo receptor, inserción en la membrana, formación de poro y lisis celular (figura 3), 
(Schnepf et al., 1998; Soberón y Bravo, 2001). 
 
 
Figura 3. Modelo de Bravo del mecanismo de acción de las toxinas Cry (Bravo et al, 2004): 1) 
Solubilización; 2) Activación proteolítica; 3) Unión a caderina y corte de hélice α-1; 4) Formación 
de oligómero; 5) Unión a APN; y 6) Formación de poro en rafts o balsas lipídicas. 
 
En el 2006 se dio a conocer un mecanismo de acción alterno al de formación de 
poro, para las toxinas Cry. El modelo plasma una serie de eventos que están reducidos o 
asociados a la membrana celular y están relacionados espacial y temporalmente a 
activación de proteínas G, estimulación de una adenilato ciclasa y producción de cAMP. 
En este modelo se plantea la idea de que la toxina Cry1Ab de Bt mata a los insectos a 
través de un evento citotóxico dependiente de Mg2+, provocado por la unión de la toxina 
al receptor tipo caderina BT-R1. Esta unión provoca la muerte celular en las células del 
insecto por la activación de una vía de señalización celular que involucra la estimulación 
de una subunidad α de una proteína G (Gαs) que a su vez estimula una adenilato ciclasa 
(AC) que incrementa los niveles de adenosil monofosfato cíclico (cAMP), hasta de 10 
 9 
veces, que culmina con la activación de una proteina cinasa A (PKA) que es la llave 
principal en la vía de la muerte celular. (Zhuang et al., 2006). De acuerdo con este trabajo, 
la activación de la vía de señalización AC/PKA altera los efectores corriente abajo que 
ocasionan la destrucción de la célula debido a la desestabilización del citoesqueleto y de 
los canales iónicos en la membrana celular, dando así una seriede eventos citológicos 
que incluyen crecimiento anómalo de membrana (blebbing), aparición de fantasmas 
nucleares (nuclear ghost) e hinchamiento celular seguido de lisis. Algo muy interesante 
que realizaron en este trabajo fue la inhibición de la vía AC/PKA, con lo cual bloquearon 
los cambios fenotípicos asociados ante la exposición a la toxina Cry1Ab. No se reportó 
fragmentación de DNA ni activación de caspasas, típicas de muerte celular por 
apoptosis. Sin embargo, estos estudios fueron realizados en cultivo celular y no con 
organismos completos, lo cual es fundamental para dar mayor peso a este modelo. 
 
Solubilización y procesamiento de las toxinas Cry 
El principal blanco de las toxinas Cry es la membrana del intestino medio de los 
insectos en estado larvario. Muchas proteínas Cry son insolubles en condiciones neutras 
o ligeramente ácidas lográndose solubilizar únicamente en pH alcalino y bajo 
condiciones reductoras debido a que la mayoría de ellas contienen en la mitad del 
carboxilo terminal varios residuos de cisteína que forman puentes disulfuro, dichas 
condiciones se encuentran en el intestino de los insectos blanco (Knowles, 1994). Con el 
rompimiento de estos puentes las proteínas insecticidas producidas por Bt, son liberadas 
del cristal como "protoxinas” de 130 kDa, en particular las toxinas Cry1. Al tiempo en 
que se solubilizan las protoxinas, estas son activadas por la acción de las proteasas 
intestinales, es decir la protoxina es procesada obteniendose finalmente una proteína de 
alrededor 60 kDa. La digestión proteolítica se realiza mayoritariamente en la zona C-
terminal (500 aminoácidos en las toxinas Cry1), y en menor proporción en el N-terminal 
(aproximadamente 30 aminoácidos). Las cantidad de enzima y el tiempo al que se 
somete la toxina a la digestión proteolítica son importantes, ya que dependiendo del tipo 
de activación se pueden obtener toxinas con diferente actividad, debido a que pueden 
 10 
darse diferentes longitudes del N-terminal al procesarse de diferente manera (Miranda 
et al., 2002). 
Dado que el extremo carboxilo de la protoxina no es esencial para la toxicidad y 
como contiene varios residuos de cisteína, esta región podría estar involucrada en la 
cristalización de la protoxina y podría también estar protegiendo a la toxina de digestión 
proteolítica prematura. De esta forma, el fragmento originado de 60 kDa denominado 
toxina es resistente a proteasas, y es ahora capaz de unirse a los receptores presentes en 
la microvellosidad apical del intestino medio y así manifestar su actividad insecticida 
(Soberón y Bravo, 2001). 
 
Unión al receptor y oligomerización 
La unión de las toxinas Cry a la membrana epitelial de las células columnares del 
intestino medio se realiza a través de receptores específicos (Hofmann et al. 1988). Se 
han hecho importantes esfuerzos dirigidos a la identificación, purificación y 
caracterización de los receptores de las proteínas Cry, y han encontrado que la mayoría 
de las toxinas Cry se unen con alta afinidad a glicoproteínas entre 63 y 220 kDa 
(Soberón y Bravo, 2001). 
Las proteínas de unión reportadas para las toxinas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac y 
Cry1C son miembros de la familia de las aminopeptidasas-N (APN) que son proteínas 
de membrana con peso molecular cercano a 120 kDa. La aminopeptidasa N está anclada 
a la membrana mediante un grupo glicosil-fosfatidil-inositol (GPI), y el resto de la 
proteína correspondiente al extremo N-terminal es extracelular (Knight et al., 1995). 
Además se encuentra selectivamente incluida en microdominios de membrana 
designados como “rafts” o balsas lipídicas, cuya característica es una composición 
lipídica rica en esfingolípidos y colesterol y su distribución espacial en las membranas 
celulares en las que se ha descrito, funcionan como sitios de unión o entrada para 
diferentes toxinas bacterianas (de Maagd et al., 2003). Por ejemplo, en el caso de toxinas 
formadoras de poro, la asociación de sus receptores con microdominios de membrana es 
un paso crucial para su oligomerización e inserción en la membrana (de Maagd et al., 
 11 
2003). Recientemente se ha demostrado que la APN de Manduca sexta y Heliothis virescens 
está localizada en microdominios de membrana y que la integridad de los mismos es 
esencial para la actividad de formación de poro de las toxinas Cry1A (Zhuang et al., 
2002). Además se sabe que la APN es una proteína glicosilada y la presencia de 
carbohidratos es importante para que se de el reconocimiento del receptor con la toxina, 
al menos en el caso de la toxina Cry1Ac, ya que se demostró que la interacción con la 
APN es determinada por la unión a un carbohidrato, en particular a N-
acetilgalactosamina (GalNac), pero no así a toxinas relacionadas como Cry1Aa y Cry1Ab 
(Pardo-López et al., 2006). Además de la APN, recientemente se ha caracterizado a otra 
proteína anclada a GPI, una alcalino fosfatasa (APL) fue propuesta como receptor 
funcional de la toxina Cry1Ac en Heliotis virescens y M. sexta esta proteína también 
contiene un motivo GalNac (Jurat-Fuentes et al., 2004). 
Por otro lado, en los lepidópteros M. sexta, B. mori y H. virescens se describió que 
las toxinas Cry1A se unen a un miembro de la familia de las caderinas (caderina E de 
aprox. 210 kDa) (Vadlamudi et al., 1995). La caderina E (Bt-R1 para M. sexta) representa 
un nuevo tipo de caderina en insectos con un 20-40% de identidad con proteínas 
miembros de la superfamilia de las caderinas; se sabe que se expresa específicamente en 
el epitelio del intestino medio durante el crecimiento y desarrollo de las larvas de M. 
sexta, pero no se ha descrito su función (Candas et al., 2002). Es una proteína 
transmembranal con un dominio extracelular de 11 ó 12 módulos de secuencias 
repetidas; un dominio transmembranal y un dominio citoplasmático (Candas et al., 
2002). Esta proteína une al monómero de las toxinas Cry1A con una KD de 1 nM, similar 
a la KD de la toxina a vesículas hechas a partir de microvellosidad apical (VMMA). Por 
otro lado, la afinidad de unión de la toxina monomérica a la APN es del orden de 100 
nM, lo cual sugiere que la unión a Bt-R1 es el primer evento para la interacción de las 
toxinas Cry1A a la membrana. La interacción con Bt-R1 es necesaria para la posterior 
oligomerizacion de la toxina, ya que su unión en forma de monómero induce el corte de 
la hélice α-1, con lo cual se sugiere, conduce a un cambio conformacional de la toxina 
 12 
que expone regiones hidrofóbicas y como consecuencia, se forma una estructura preporo 
de 4 subunidades y finalmente generó un poro en la membrana (Gómez et al., 2002). 
Un modelo del mecanismo de acción (Bravo et al, 2004, figura 3) de la toxina con su 
células blanco fue sugerido por nuestro grupo de trabajo y se basa principalmente en la 
interacción secuencial de la toxina Cry con dos o más receptores: la toxina se une 
inicialmente a la caderina en su forma monomérica con una Kd de 1 nM, esta interacción 
conduce a la oligomerización de la toxina, posteriormente la forma oligomérica se une a 
la aminopeptidasa con una Kd de 0.75 nM (200 veces más afín que el monómero). Esta 
interacción induce la inserción de la toxina en balsas lipídicas (lipid rafts) provocando la 
muerte de la célula y eventualmente la del organismo. (Bravo et al., 2004; de Maagd et al., 
2003). 
 
Inserción en la membrana y formación de poro 
La fase irreversible de la unión de las proteínas Cry a la membrana se considera 
como una evidencia de que las proteínas Cry se insertan en la membrana, para luego 
causar la destrucción del tejido intestinal de las larvas de insectos susceptibles (Soberón 
y Bravo, 2001). 
Se propone que la unión de la toxina al receptor puede provocar un cambio 
conformacional que hace a la toxina competente para insertarse en la membrana. El 
siguiente paso involucra la formación del poro en la membrana (Soberónet al., 2000; 
Gómez et al., 2002). 
Con base en el conocimiento que se tiene acerca de la inserción de otras toxinas 
bacterianas formadoras de poro, se han propuesto dos modelos posibles de la inserción 
de toxinas Cry en la membrana. Un primer modelo (modelo del abrecartas), propuesto 
por Hodgman y Ellar, sugiere que las hélices hidrofóbicas α-5 y α-6 sobresalen de la 
toxina insertándose como un abrecartas en la membrana como consecuencia de un 
cambio conformacional disparado por el receptor mientras que el resto de la toxina 
permanece fuera de la membrana o unida al receptor (Hodgman y Ellar, 1990). El otro 
modelo (modelo de paraguas) plantea también que después de la unión con el receptor, 
 13 
se inserta la región α4-α5 mientras que el resto de las hélices se aplanan sobre la 
superficie de la bicapa lipídica exponiendo hacia ella su cara hidrofóbica quedando de 
esta manera la molécula en forma parecida a un paraguas. Actualmente es mayor la 
acumulación de evidencias que respaldan este último modelo. Aunque hasta la fecha no 
hay datos concluyentes de que es lo que pasa con los otros 2 dominios. 
 Las proteínas Cry forman poros con un diámetro interior de 6 a 10 Å. El tamaño 
de estos poros y la aparición frecuente de múltiples estados de conductancia en los 
estudios de la actividad de las proteínas Cry en bicapas lipídicas planas, se han 
considerado como evidencias de la formación de diversos estados de agregación de las 
δ-endotoxinas. Se propone que se requieren cuatro unidades de la toxina Cry para 
formar un poro. Al ser poco selectivos, los poros permiten el paso de diferentes solutos 
de alto peso molecular, ocasionando un desbalance osmótico (Soberón y Bravo, 2001). 
Nuestros datos demuestran que el oligómero se inserta eficientemente a 
vesículas sintéticas de membrana contrario a lo que sucede con el monómero, esto 
sugiere que el oligómero es un intermediario durante la inserción de la toxina a las 
membranas (Rausell et al., 2004). Por lo tanto, se propone que una vez que se forma el 
oligómero, éste es acarreado por la APN hacia los microdominios de membrana, se 
inserta en la membrana de las células epiteliales del intestino y forma poros (Bravo et al., 
2004). De esta manera las proteínas Cry causan la muerte de las células epiteliales al 
inactivar el sistema que mantiene el gradiente de pH y por lisis osmótica. Las toxinas 
Cry aumentan la permeabilidad de la microvellosidad apical a cationes, aniones, agua y 
moléculas de mayor tamaño. Esto causa a su vez que se colapse la diferencia de 
potencial y por tanto se pierda la fuerza motriz que dirige la entrada de aminoácidos al 
interior celular, así como la redistribución de los cationes entre el lumen y el citoplasma. 
Se considera que el efecto más devastador de este proceso es la alcalinización del 
citoplasma, ya que esto interfiere con el metabolismo celular normal, que tiene como 
consecuencia final la destrucción del epitelio intestinal. Una vez que las células 
columnares y caliciformes se destruyen, las esporas de Bt tienen acceso a la hemolinfa, 
medio en el que proliferan. La consecuencia final de la destrucción del intestino medio y 
 14 
la proliferación de bacterias en la hemolinfa es la muerte de las larvas por inanición y 
septicemia (Soberón y Bravo, 2001). 
 
De todos estos pasos la formación del oligómero y la inserción de éste en la 
membrana son los menos estudiados, de ahí nuestro interés en dilucidar como es que la 
estructura monomérica de la toxina cambia su naturaleza hidrofílica hasta llegar a una 
estructura oligomérica que es capaz de insertarse en la membrana y formar un poro. 
Para estudiar este proceso utilizaremos la espectroscopia de fluorescencia utilizando 
como fluoróforos los triptofanos intrínsecos de la toxina Cry1Ab. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 15 
ESPECTROSCOPIA DE FLUORESCENCIA 
La espectroscopia de fluorescencia es el método espectroscópico óptico más 
extensivamente usado en mediciones analíticas y en investigación científica. El gran 
número de aplicaciones en ciencias biológicas va desde la determinación analítica de 
trazas de metales en el ambiente a mediciones de pH en células completas bajo 
condiciones fisiológicas. La espectroscopia de fluorescencia se está aplicando para 
estudiar procesos físicos fundamentales de moléculas; relaciones estructura-función e 
interacciones de biomoléculas como proteínas y ácidos nucleicos; secuenciación de DNA 
y caracterización genómica. 
Hay dos razones principales para el uso extensivo de esta técnica. La primera, es el alto 
nivel de sensibilidad y el amplio rango dinámico de ensayos que pueden realizarse. En 
segundo lugar, la instrumentación requerida es conveniente y para la mayoría de los 
propósitos el equipo puede adquirirse por un costo no muy elevado. 
 
Absorción de la luz 
La luz es una forma de radiación electromagnética, una mezcla de ondas con diferentes 
longitudes de ondas. La longitud de onda (λ) es definida como la distancia entre dos 
crestas de una onda. Las unidades empleadas son nanómetros. Dependiendo de la 
longitud de onda, nuestros ojos perciben un color diferente, si es que ésta se encuentra 
en el rango visible, o no lo perciben si pertenece a un espectro diferente, como la luz 
ultravioleta o el infrarrojo (figura 4). 
 
 16 
 
Figura 4. Representación del espectro de luz a diferentes longitudes de onda. El ultravioleta (UV) 
abarca aproximadamente de los 200 a 400 nm, el visible de 400 a 760 nm y el infrarrojo a partir de 
760 nm. 
 
La luz de ciertas longitudes de onda puede ser absorbida selectivamente por una 
sustancia de acuerdo a su estructura molecular. La absorción de la energía de la luz 
ocurre cuando un fotón incidente promueve la transición de un electrón de un estado de 
menor a mayor energía. Las moléculas con electrones en compuestos aromáticos 
usualmente absorben luz cerca del UV (150–400 nm) o en la zona del visible (400–750 
nm). Los electrones excitados eventualmente pierden esta energía ganada y por un 
proceso de radiación regresan a su estado inicial. La radiación emitida por una molécula, 
o un átomo, después de que ha absorbido energía para colocarse en un estado excitado, 
es definida como luminiscencia. Ésta se divide formalmente en dos categorías, 
fluorescencia y fosforescencia, dependiendo de la naturaleza del estado excitado. Existe 
sólo un estado basal para una molécula dada. Sin embargo, hay diversos estados 
excitados posibles aún para moléculas muy simples, y la naturaleza exacta depende de 
los tipos de orbitales involucrados. Los estados electrónicos de las moléculas electrónicas 
se pueden agrupar en dos grandes categorías: estados singulete y triplete. 
 
 17 
En los estados excitados singulete, un electrón en un orbital excitado está apareado (spin 
opuesto) a un segundo electrón en un orbital en el estado basal, dicho de otra forma, 
todos los electrones en la molécula tienen sus spins apareados. En consecuencia, el 
regreso al estado basal es “permitido” por el spin y ocurre rápidamente por emisión de 
un fotón. Este es el caso de la fluorescencia, y las velocidades de emisión de ésta son 
típicamente de 108 s-1, por lo que la vida media de la fluorescencia es cercana a 10 ns. 
La fosforescencia es la emisión de luz de estados excitados triplete. Los estados excitados 
triplete son aquellos en los cuales un par de electrones tienen sus spins desapareados, 
esto es, el electrón en el orbital excitado tiene la misma orientación que un electrón en el 
estado basal. La transición al estado basal es impedido y las velocidades de emisión son 
lentas (103 – 100 s-1), tal que la vida media de la fosforescencia es típicamente de 
milisegundos a segundos. 
Los procesos que ocurren entre la absorción y emisión de luz se describen por los 
diagramas de Jablonski (Figura 5). Estos diagramas existen enuna variedad de formas 
para ilustrar varios de los procesos moleculares que pueden ocurrir en los estados 
excitados. 
 
Figura 5. Diagrama de Jablonski. Ilustra el proceso involucrado en la creación de un estado 
excitado singulete por absorción óptica y subsiguiente emisión de fluorescencia. Los estados 
basales, primer excitado singulete y segundo excitado singulete se representan con So, S1 y S2, 
respectivamente. Las transiciones entre los estados se dibujan como líneas verticales para ilustrar 
la naturaleza instantánea de la absorción de la luz. (a) Las líneas horizontales numeradas denotan 
los niveles vibracionales. (b). 1: Excitación; 2: Conversión interna (ver más adelante); 3: Emisión 
por fluorescencia. 
 
 18 
En un diagrama de Jablonski típico, los estados electrónicos se denotan como S0, estado 
basal singulete, S1 y S2 primer y segundo estado electrónico respectivamente. En cada uno 
de estos niveles electrónicos de energía, los fluoróforos pueden estar en un número de 
niveles vibracionales de energía, representados como 0, 1, 2, etc. En este diagrama se han 
excluido diversas interacciones que se pueden dar, tal como apagamiento de 
fluorescencia, transferencia de energía e interacciones con el solvente. La transición 
entre estados se representa como líneas verticales para ilustrar la naturaleza instantánea 
de la absorción de luz. 
El espaciamiento de energía entre los diferentes niveles de energía vibracional se ilustra 
con los espectros de emisión. En un espectro de emisión de fluorescencia (figura 6) 
generalmente se presentan las intensidades de fluorescencia versus longitudes de onda 
(nm) o número de onda (cm-1). A 20º C la mayoría de las moléculas existen en el estado 
vibracional más bajo del estado basal. La energía total de una molécula, E, en un estado 
particular puede representarse como la suma de sus energías electrónicas, Eel, 
vibracional, Evib, y rotacional, Erot. El cambio general de la energía como resultado de 
la absorción de un fotón de luz es: 
 
 ΔE = ΔEel + ΔEvib + ΔErot 
 
 La absorción de un fotón por una molécula ocurre en el estado de energía vibracional 
mas baja. El proceso de absorción ocurre muy rápido (1015 s-1), tan rápido que no hay 
cambio en la coordinación nuclear de la molécula durante el proceso (Transición Frank 
Condon). Este tiempo es corto, relativo al tiempo requerido para otros procesos 
electrónicos y para el movimiento nuclear. El tiempo que ocurre en el estado excitado es 
semejante al tiempo que se necesita para que se lleven a cabo reacciones enzimáticas 
 
 19 
 
Figura 6. Espectros de absorción (A) y emisión (B) arbitrarios. 
 
La absorbancia de un soluto depende linealmente de su concentración. La longitud de 
onda y la fuerza de absorbancia de una molécula no solo dependen de su naturaleza 
química sino también del ambiente molecular de sus cromóforos. Por lo tanto, la 
espectroscopia de fluorescencia es una técnica excelente para seguir las reacciones 
enzimáticas y transiciones conformacionales en proteínas y ácidos nucleicos. El uso de 
estas mediciones yace en que no es un método destructivo y no requiere grandes 
cantidades de muestra. 
 
Fluorescencia 
Una vez que una molécula llega al nivel vibracional más bajo en el estado excitado 
singulete S1 (0) puede sufrir un proceso que es motivo de nuestro interés. Éste es, que 
regrese a uno de varios niveles de energía vibracionales/rotacionales del estado S0 por la 
emisión de un fotón de luz, que corresponde a la diferencia de energía entre el estado 
excitado S1, nivel vibracional 0, y un nivel vibracional particular de S0. En este proceso 
radiactivo llamado fluorescencia, el electrón en el orbital antienlazante hace un salto 
cuántico de regreso al orbital enlazante medio lleno, emitiendo el fotón de luz. 
El mecanismo puede definirse: 
 F* = F + hv 
Siendo F* la molécula fluorescente en estado excitado S1(0), y F su estado después de la 
emisión del fotón, hv. El tiempo de vida de un estado singulete excitado es 
 20 
aproximadamente de 10-9 a 10-7 s y por lo tanto el tiempo de caída de la fluorescencia es 
del mismo orden de magnitud. 
De acuerdo al diagrama de Jablonski la energía de emisión es típicamente menor que la 
de absorción. De aquí, que la fluorescencia ocurre a baja energía o a longitudes de onda 
mayores. Este fenómeno es conocido como el cambio o corrimiento de Stokes. La 
perdida de energía entre la excitación y la emisión es observada universalmente en 
moléculas fluorescentes en solución. Una causa común del corrimiento de Stokes es el 
rápido decaimiento al nivel vibracional mas bajo de S1. Además, los fluoróforos 
generalmente decaen a un nivel vibracional alto de S0, resultando en pérdida adicional 
de energía de excitación por formación de calor del exceso de energía vibracional. En 
adición a estos efectos, los fluoróforos pueden mostrar cambios adicionales en el 
corrimiento de Stokes, debido a efectos de relajación del solvente, formación de 
complejos, y/o transferencia de energía. 
 
Relajación vibracional 
En solución, la relajación térmica de una molécula excitada vibracionalmente es muy 
rápida a través de la transferencia del exceso de energía vibracional de la molécula 
soluto al solvente. Este proceso es tan eficiente que, no solo uno o dos cuantos de energía 
vibracional se pierden, sino todo el exceso de energía vibracional del estado excitado, en 
10-13 a 10-11 s. Esto significa que antes de que una molécula excitada en solución pueda 
emitir un fotón, sufrirá una relajación vibracional y por lo tanto la emisión del fotón 
ocurrirá siempre a partir del nivel vibracional más bajo de un estado excitado (figura 7). 
 
 21 
 
Figura 7. Relación entre los procesos del estado excitado. kPR=constante de reacción química; 
kET=constante de transferencia de energía,; kNR=constante no radiactiva (conversión interna); 
kISC=constante de cruzamiento intersistemas; kR=constante radiactiva: fluorescencia; 
kP=constante de fosforescencia. 
 
Conversión interna 
Se pueden encontrar procesos no radiactivos por los cuales las moléculas en un estado 
excitado singulete pueden regresar al estado basal sin la emisión de un fotón, 
convirtiendo toda la energía de excitación en calor. A éstos se llama conversión interna. 
De forma general, la energía de separación entre estados excitados singulete en moléculas 
aromáticas es más pequeña que la separación entre el estado S1 y el estado basal S0. Esto 
significa que el nivel vibracional 0 de S2, por ejemplo, se sobrelapará con los niveles 
vibracionales más altos de S1. Esta situación da lugar a un alto grado de acoplamiento 
entre los niveles vibracionales, de tal manera que la molécula sufre una conversión 
interna del estado S2 al nivel vibracional más bajo del estado S1. 
Otro proceso de conversión interna puede ocurrir cuando el nivel vibracional 0 de S1 se 
sobrelapa con un nivel vibracional de muy alta energía de S0. El electrón se mueve de 
regreso al orbital enlazante no lleno, y la molécula entonces se relaja vibracionalmente 
muy rápido al nivel más bajo de S0. 
 Relajación vibracional 
 
Fluorescencia 
 22 
Debido a que la vida media de la fluorescencia gira normalmente cerca de 10-8s, la 
conversión interna es generalmente completada antes de la emisión. Es por esto que la 
emisión de la fluorescencia generalmente resulta en un estado excitado térmicamente 
equilibrado, que es, el estado vibracional más bajo de S1. Una consecuencia muy 
interesante de la emisión de la alta vibración de estados basales es que el espectro de 
emisión es típicamente una imagen en el espejo del espectro de absorción en la 
transición S0 → S1. Esta similitud ocurre debido a que la excitación electrónica no altera la 
geometría nuclear como se menciono anteriormente.Como resultado, las estructuras 
vibracionales vistas en el espectro de absorción y emisión son similares. 
 
Efectos del solvente 
La polaridad del solvente y el ambiente local tienen profundos efectos en el espectro de 
emisión de los fluoróforos polares. Estos efectos son el origen del cambio de Stokes. Esto 
se debe a que un fluoróforo tiene un dipolo, el cual cambia cuando se encuentra en 
estado excitado, entonces el solvente se reacomoda de acuerdo a este cambio y esto le 
resta energía al estado excitado, lo que se refleja en una emisión a longitud de onda 
menor, lo cual es equivalente al corrimiento de Stokes. 
Los espectros de emisión son medidos fácilmente y, como resultado, hay numerosas 
publicaciones de efectos de emisión de fluorescencia en diferentes solventes, este efecto 
explicaría cambios estructurales cuando una molécula fluorescente está unida a 
proteínas, membranas o ácidos nucleicos. Un uso común de los efectos del solvente es 
determinar la polaridad de la sonda en el sitio de unión en la macromolécula, o poder 
inferir los cambios en la polaridad del sitio en particular en la macromolécula. Esto se 
realiza comparando los espectros de emisión y/o la eficiencia cuántica del fluoróforo 
cuando está unido a la macromolécula y cuando está disuelto en solventes de diferente 
polaridad. Por ejemplo, podemos encontrar que hay un corrimiento a longitudes de 
onda menores (cambio hacia el azul) cuando la polaridad del solvente va disminuyendo. 
Por el contrario, un incremento en la polaridad del solvente generalmente resulta en un 
cambio hacia el rojo (figura 8), es decir, longitudes de onda mayores, y en algunas 
 23 
ocasiones, este cambio hacia el rojo va acompañado en una reducción de la eficiencia 
cuántica del fluoróforo. 
 
 
Figura 8. Triptofanos es distintos ambientes polares. Los números indican nivel ascendente de 
polaridad, desde un ambiente completamente no polar (1), como ciclohexano, hasta un ambiente 
muy polar (4) como el agua, donde el pico de emisión se desplaza a longitudes de onda mayores. 
 
La emisión de los fluoróforos generalmente ocurre a longitudes de onda mayores que la 
absorción. Esta pérdida de energía entre la absorción y emisión de luz, se conoce como 
corrimiento de Stokes. Este corrimiento se debe a diferentes procesos dinámicos, entre 
estos procesos se incluye pérdida de energía debido a la disipación de energía 
vibracional, pero además se presenta una redistribución de electrones en las moléculas 
del solvente inducidos por la alteración del momento dipolar del fluoróforo por entrar al 
estado excitado. La reorientación de las moléculas del solvente alrededor del dipolo en 
estado excitado del fluoróforo reduce la energía del estado excitado resultando en una 
emisión de fluorescencia de menor energía que se observa como una emisión de 
longitud de onda mayor. Además en algunos casos se puede presentar interacciones 
específicas entre el fluoróforo y el solvente o solutos, lo que resulta en cambios 
específicos para cada caso. Cabe resaltar que las interacciones específicas con soluto no 
son regla para todos los fluoróforos, debido a que existe una gran diversidad de 
estructuras en estos, pero es posible dar generalidades empleando las teorías más 
 24 
sencillas para las interacciones fluoróforo-solvente y así dar interpretaciones de las 
propiedades espectrales en términos del ambiente promedio alrededor del fluoróforo. 
 
Cuando un fluoróforo es excitado, el exceso de energía vibracional es rápidamente 
cedido al solvente (figura 9). Si el fluoróforo es excitado a un estado singulete S2, 
rápidamente decae al estado S1 en 10-12 s debido a la conversión interna. Los efectos del 
solvente cambian esta emisión a niveles de energía aún más bajos debido a la 
estabilización del estado excitado por las moléculas polares del solvente. Típicamente el 
estado excitado de los compuestos aromáticos tiene un momento dipolar más grande 
(μ*) que en el estado basal (μ). Como resultado, la absorción del fotón por el fluoróforo 
resulta en la creación instantánea de un dipolo, el cual perturba el solvente alrededor del 
fluoróforo. Después de la excitación, los dipolos del solvente responden mediante una 
reorientación alrededor de μ*, lo cual baja la energía del estado excitado. Conforme la 
polaridad del solvente se incrementa, este efecto se hace mayor, resultando en la emisión 
a energías más bajas y por lo tanto cambiando la emisión a mayores longitudes de onda 
(figuras 8 y 9). 
 
 
Figura 9. Diagrama de Jablonski para fluorescencia con relajación de solvente. 
 
 25 
En general, solo los fluoróforos que son polares por sí mismos muestran una gran 
sensibilidad a la polaridad del solvente. Las moléculas no polares, como los 
hidrocarburos aromáticos no sustituidos, son mucho menos sensibles a la polaridad del 
solvente. 
Los tiempos de vida de la fluorescencia son cercanos a 10 ns (10x10-9s) son usualmente 
más largos que el tiempo requerido para la relajación del solvente. Para solventes 
líquidos a temperatura ambiente, la relajación del solvente ocurre en 10-10s. 
 
Apagamiento colisional (quenching). 
La intensidad de fluorescencia puede ser disminuida por una gran variedad de 
procesos. Tales procesos de disminución de intensidad son llamados apagamientos 
(quenching). Este apagamiento de fluorescencia puede ocurrir por diferentes 
mecanismos. El apagamiento colisional es un proceso bimolecular dependiente del 
contacto entre la molécula excitada y el apagador (quencher), ocurre cuando un 
fluoróforo en estado exitado es interrumpido ante el contacto con alguna otra molécula 
en solución, la cual es llamada apagador. Es un proceso de difusión controlada en el cual 
el fluoróforo regresa a su estado basal sin la emisión de fotón, es un proceso que 
requiere que el tiempo de vida del estado excitado sea mayor de 10-9 s. Las moléculas no 
son químicamente alteradas en el proceso. El mecanismo puede describirse como sigue: 
 
 F + hv = F* 
 F* =F + hv’ 
 F* + Q = F + Q 
 
La molécula fluorescente F absorbe un fotón para dar F*, el nivel de equilibrio del estado 
singulete excitado más bajo. F* puede emitir un fotón, hv’, y regresar al estado basal 
(fluorescencia), o puede interactuar con la molécula apagadora Q, perdiendo la energía 
de excitación y regresar a S0 sin emisión. Este mecanismo simple es descrito por la ley 
de Stern- Volmer: 
 26 
 F0/F = 1 + K [Q] = 1 + kq το [Q] 
En esta ecuación F0 es la intensidad de la fluorescencia en ausencia del apagador, F es la 
intensidad de la fluorescencia a una concentración [Q] del apagador. K es la constante de 
apagamiento de Stern-Volmer, kq es la constante de apagamiento bimolecular y το es el 
tiempo de vida del fluoróforo en estado exitado. 
Básicamente hay dos mecanismos por los cuales la pérdida colisional de la energía de 
excitación puede ocurrir: intensificación del cruzamiento intersistemas por el apagador, 
o transferencia de electrones. Una gran variedad de moléculas pueden actuar como 
apagadores colisionales, que incluyen oxígeno, halógenos, aminas y moléculas 
deficientes de electrones como arcrilamida. El mecanismo de apagamiento varía con el 
par fluoróforo-apagador. 
Además del apagamiento colisional, el apagamiento de la fluorescencia puede ocurrir 
por una variedad de procesos, los fluoróforos pueden formar complejos no fluorescentes 
con el apagador, tal es el caso del apagamiento estático y ocurre en el estado basal y no 
depende en la difusión o colisión molecular. El apagamiento también puede ocurrir por 
mecanismos no moleculares, como la atenuación de la luz incidente por el mismo 
fluoróforo u otras especies absorbentes.Fluoróforos 
Los fluoróforos son moléculas fluorescentes que tienen un espectro de absorción y 
emisión bien definidos; existe una diferencia entre los picos de absorción y emisión de 
un fluoróforo (Stokes’ shift); la intensidad de su fluorescencia emitida varía con la 
longitud de excitación, pero no varía la distribución de su espectro (figura 10), esto es 
conocido como la regla de Kasha, en la cual, ante la excitación que lleva a un nivel 
electrónico y vibracional alto, el exceso de energía es rápidamente disipada, llevando al 
fluoróforo al nivel vibracional más bajo de S1. Esta relajación ocurre en 10-12s, debido a 
esta rápida relajación, el espectro de emisión es usualmente independiente de la 
longitud de onda de excitación. Existen excepciones pero generalmente no se observan 
 27 
en moléculas biológicas. Entre los fluoróforos más utilizados se pueden encontrar 
moléculas orgánicas simples y proteínas fluorescentes. 
 
 
 
Figura 10. La excitación de un fluoróforo a tres diferentes longitudes de onda (EX 1, EX 2, EX 3) 
no cambia el perfil de emisión, pero produce variaciones en la intensidad de emisión de 
fluorescencia (EM 1, EM 2, EM 3) que corresponden a la amplitud del espectro de excitación. 
 
Los fluoróforos se pueden dividir en dos grandes clases: intrínsecos y extrínsecos. Los 
fluoróforos intrínsecos se hallan de manera natural, e incluyen los aminoácidos 
aromáticos (tirosina, fenilalanina y triptofano, Tabla 1), NADH, flavinas y derivados del 
piridoxal y clorofila. El NADH es altamente fluorescente, con un máximo de emisión y 
absorción a 340 y 460, respectivamente. El cofactor piridoxal fosfato también es 
fluorescente. Sus espectros de emisión y absorción son dependientes de su estructura 
química en la proteína. La riboflavina, FMN y FAD absorben luz en el rango visible 
(~450 nm) y emiten alrededor de 535 nm. En contraste con el NADH, las formas 
oxidadas de las flavinas son fluorescentes, y no las formas reducidas. Los ácidos 
nucleicos y nucleótidos en general no fluorescen, sin embargo existen excepciones. 
 
 
 
 
 28 
 
 
 
Por otro lado, los fluoróforos extrínsecos se agregan a la muestra para proveer 
fluorescencia cuando no existe de manera natural o para cambiar las propiedades del 
espectro de la muestra. Éstos incluyen por ejemplo, a la fluoresceína y la rodamina, entre 
otras numerosas moléculas. 
En el caso de las proteínas, es frecuente su marcaje con cromóforos que tienen 
longitudes de excitación y emisión más grandes que los aminoácidos aromáticos, se 
pueden encontrar una gran variedad de fluoróforos en catálogos de sondas moleculares. 
Están disponibles un número grande de fluoróforos para marcar covalentemente, o no, 
proteínas. Las sondas covalentes pueden tener una variedad de grupos reactivos, para 
acoplarse con aminas, sulfhidrilos, o cadenas laterales de las histidinas. 
El cloruro de Dansilo (DNS-Cl,) es usado ampliamente para marcar proteínas, 
especialmente donde se anticipan mediciones de polarización. Los grupos Dansilo se 
pueden excitar a 350 nm, donde las proteínas no absorben, sin embargo, debido a que 
absorben cerca de los 350 nm, pueden servir como aceptores de la fluorescencia de 
proteínas. El espectro de emisión del grupo dansilo es altamente sensible a la polaridad 
del solvente, y las emisiones máximas son típicamente próximas a 520 nm. 
Hay una gran diversidad de moléculas fluorescentes y numerosas interacciones y 
procesos pueden alterar las características espectrales, pueden ser diseñados para 
interactuar con iones específicos. La emisión puede ocurrir en UV o en NIR (infrarrojo 
cercano), y las sondas pueden tener tiempos de vida cortos (nanosegundos) o largos 
(microsegundos a milisegundos). 
 
Tabla 1 
 29 
La intensidad de fluorescencia de un fluoróforo dado depende de la eficiencia con la 
cual absorba y emita fotones, y de su habilidad para sufrir repetidos ciclos de excitación-
emisión. Las eficiencias de absorción y emisión son mayormente cuantificadas en 
términos del coeficiente de extinción molar para la absorción y la eficiencia cuántica para 
la fluorescencia. Ambos son constantes en condiciones ambientales específicas. El valor 
del coeficiente de extinción molar es específico a una sola longitud de onda (usualmente 
el máximo de absorción), mientras que la eficiencia cuántica es una medida de la 
emisión total de fotones en el perfil espectral fluorescente completo. La intensidad de 
fluorescencia por molécula de fluoróforo es proporcional al producto de la eficiencia 
cuántica y el coeficiente de extinción molar. 
 
Fluorescencia de proteínas 
Una de las áreas de investigación que se han visto muy beneficiadas con el uso de la 
fluorescencia es el estudio de función y estructura de proteínas. Este énfasis es el 
resultado de la presencia de fluoróforos naturales en casi todas las proteínas. Los 
aminoácidos aromáticos, la tirosina, la fenilalanina y el triptofano tienen electrones 
deslocalizados participando en los enlaces π lo que les permite absorber radiación 
electromagnética, en el rango de espectro UV a longitudes de onda específicas, 257 nm 
(Phe), 274 nm (Tyr) y 285 nm (Trp) y posteriormente emitir fluorescencia (figura 11). 
Debido a que las proteínas son generalmente excitadas a 280 nm la absorción se debe a 
los residuos Tyr y Trp, la fenilalanina no es excitada en la mayoría de los casos 
experimentales, asimismo, la eficiencia cuántica de la fenilalanina en las proteínas es 
muy pequeña, de esta forma la emisión de este residuo es raramente observada. 
 
 30 
 
Figura 11. Espectros de absorción (A) y emisión (F) de los aminoácidos aromáticos a pH7 en 
solución. 
 
A mayores longitudes de onda, como 295 nm, la absorción se debe principalmente al 
Trp, lo cual indica que la fluorescencia del Trp puede ser selectivamente excitada a los 
295 nm. 
En general, la fluorescencia de la mayoría de las proteínas es dominada por los 
residuos triptofano, el presentar un valor de ε mayor que la fenilalanina y la tirosina, le 
permite una excitación preferencial en una proteína debido a la presencia de un anillo 
indólico, un fluoróforo sensible y algo complicado. El indol del triptofano y sus 
derivados son altamente sensibles a la polaridad del solvente. Como resultado, el 
espectro de emisión de los residuos triptofano puede reflejar la polaridad del ambiente 
que los rodea. La emisión del grupo indol puede ser corrida hacia el azul si el grupo esta 
oculto dentro de una proteína nativa, y su emisión se puede desplazar hacia longitudes 
de onda mayores (cambio hacia el rojo) cuando la proteína es desnaturalizada. 
El espectro de emisión de proteínas es sensible a la unión de sustratos, reacciones de 
asociación y a la desnaturalización. 
Usualmente el número de residuos de triptofano es limitado y existen diversas proteínas 
que sólo tienen un triptofano. Debido a las propiedades electrónicas del triptofano, las 
 31 
interacciones intramoleculares selectivas pueden llevar a un aumento o apagamiento de 
la fluorescencia. Estas características proveen información sobre la estructura molecular 
alrededor del triptofano. Obviamente, si hay varios residuos de triptofano en la 
proteína, se dificulta la interpretación del comportamiento individual, debido a que el 
ambiente de cada residuo es diferente y las propiedades espectrales de cada residuo son 
generalmente distintas, por lo que al ver la emisión de todos los residuos, no podemos 
separar la contribución espectral de cada Trp en una proteína multitriptofano. 
Debido a los problemas que ocasiona el encontrar más de un triptofano, en ocasiones se 
usan análogos como 5-hidroxitriptofano y 7-azatriptofano, los cuales son substituidos en 
proteínas en lugar de los residuos de triptofano normales. Estos análogos presentan 
espectros característicos que permiten la excitación selectivay pueden dar información 
útil en detalles moleculares de interacción de complejos proteína-proteína y proteína-
ácidos nucleicos. Una aplicación práctica de los análogos de triptofano fue el incorporar 
5-hidroxitriptófano a la insulina. La molécula fue funcional, fluorescente y es útil para 
realizar estudios de interacción entre la insulina y su receptor (Laws et al., 1995) 
 
Otra característica importante es que la fluorescencia del Trp puede ser anulada por 
algunas sustancias apagadoras (quenchers), tales como yoduros, oxígeno, acrilamida, 
succinimida, entre otras. Esta sensibilidad se atribuye a la facilidad con que el anillo 
indólico dona electrones cuando se encuentra en su estado excitado. Es esta propiedad 
lo que permite determinar la exposición o accesibilidad al solvente de los residuos de 
Trp en una proteína ya sea soluble o insertada en membrana (figura 8) 
 
 
El triptofano y su función en las proteínas 
Los aminoácidos tienen diferentes papeles en la estructura y función de las 
proteínas de membrana, clasificados de acuerdo a sus propiedades y la posible función 
en las proteínas de membrana (Yeagle, 1992). El triptofano (Trp ó W, figura 12) es un 
aminoácido muy especial, ya que es el residuo con mayor área superficial, se compone 
 32 
de dos anillos biciclicos, tiene un anillo indólico en lugar de un solo anillo aromático 
encontrado en la fenilalanina, la presencia de un grupo nitrogenado hace al Trp un poco 
menos hidrofóbico que la fenilalanina (Uttamkumar et al., 2000). Finalmente el Trp está 
altamente conservado en un plano evolutivo. 
 
 
Figura 12. Estructura del Triptofano 
 
En proteínas solubles, los residuos triptofano tienden a situarse en el interior de 
la proteína. En proteínas de membrana este residuo a menudo se encuentra en la región 
límite de la bicapa y el agua, cerca de la cabeza polar del lípido. Estructuralmente el 
triptofano juega un papel fundamental en muchas proteínas y en la interacción de éstas 
con otras moléculas; además, se propone que los residuos de Trp pueden conferir 
estabilidad térmica a una proteína, así como estabilizar estructuras cuaternarias y 
ayudar en procesos de plegamiento debido a la interacción polar entre el centro del 
anillo aromático y los grupos polares. Por último, el Trp muchas veces cumple la función 
de posicionar a la proteína dentro de la membrana (Yeagle, 1992). 
 
 33 
ANTECEDENTES PARTICULARES 
Las toxinas formadoras de poro (TFPs) son proteínas citotóxicas, que tienen la habilidad 
de existir en dos estados bien diferenciados: el estado soluble y el estado asociado a 
membranas. En el estado soluble, las regiones de las TFPs que posteriormente se 
insertarán en la membrana lipídica permanecen ocultas dentro del plegamiento general 
de las toxinas. Ante la interacción con membranas, cambios de pH, asociación a 
receptores entre otras cosas, se producen cambios conformacionales que favorecen la 
inserción de dichas regiones con la membrana lipídica, de esta forma logran penetrar la 
membrana de la célula blanco. 
Dependiendo del elemento estructural que es insertado en la membrana bajo la 
formación del poro, las TFPs han sido divididas en dos grupos generales: a) aquellas 
toxinas que insertan una horquilla β (β-hairpin) formando un poro estructurado como 
barril β, como la α-toxina de Staphylococcus aureus, las citolisinas dependientes de 
colesterol de bacterias Gram-positivas o el antígeno protector de la toxina del ántrax y; 
b) aquellas toxinas que hacen uso de hélices α como elementos estructurales para 
traspasar la membrana lipídica como las colicinas y la toxina de la difteria. El último 
grupo de toxinas son las menos entendidas, en comparación con las TFPs formadoras de 
barril β (Parker y Feil, 2005). 
En el interés de encontrar el mecanismo de acción que utilizan las TFP para formar 
poros transmembranales se han empleado diversas estrategias, entre ellas los cambios 
de fluorescencia para determinar las regiones de las toxinas que están involucradas en 
atravesar la membrana. 
Una de las técnicas más empleadas consiste en introducir cisteínas a lo largo de la 
secuencia, de esta manera al introducir nuevos grupos tiol es posible marcar con un 
fluoróforo extrínseco, de esta manera evaluar su localización antes y después de su 
interacción con la membrana, además es posible emplear apagadores de fluorescencia 
incorporados a la membrana para monitorear el comportamiento de los grupos tiol al 
cambiar de ambiente polar a no polar. 
 34 
Un ejemplo de esta estrategia fue el realizado con la toxina perfingolisina O de 
Clostridium perfringens, la cual requiere de colesterol en la membrana para su actividad 
citolítica y formar un oligómero de aproximadamente 50 monómeros, que crea un hoyo 
de 150 Ǻ en la membrana. La metodología que emplearon para determinar los cambios 
estructurales que sufre la toxina durante la transición de monómero soluble al complejo 
oligomérico que se inserta en la membrana, fue construir numerosas mutantes 
reemplazando diferentes aminoácidos por cisteínas únicas. Estas mutantes fueron 
marcadas con el fluoróforo NBD, el cual es muy sensible a la polaridad del ambiente, de 
esta forma, al analizar su fluorescencia notaron que se incrementaba su intensidad y la 
vida media cuando se movía de un ambiente en solución al entorno no polar como 
resultado de su inserción a la membrana. Con este análisis pudieron tener una idea más 
detallada de la transición de monómero-oligómero y así, sugerir en el caso de la 
perfingolisina O, que la toxina se oligomeriza después de la unión a la membrana. Esto 
difiere de otros mecanismos de inserción en otras toxinas, en las cuales, el complejo de 
oligomerización se forma previo a la inserción en la membrana, como ocurre con la α-
toxina de S. aureus,la α-toxina de C. spticum, y la aerolisina de Aeromonas hydrophila 
(Shepard et al.1998). 
Otro ejemplo en el que utilizan este tipo de fluoróforos sensibles a cambiar en la 
polaridad del ambiente, con los cuales se pueden detectar algún cambio conformacional, 
es el empleado con S. aureus y la toxina formadora de poro de dos componentes, LukF y 
HS, ambos componentes son secretados en forma de monómeros solubles, los cuales 
forman poros que pueden insertarse en membranas de eritrocitos humanos y de algunos 
animales. En este trabajo se construyeron mutantes de cisteínas únicas y fueron 
marcadas con el fluoróforo Badan en el componente LukF y posteriormente 
monitorearon la unión de LukF marcada, a las membranas de eritrocitos en ausencia o 
presencia del segundo componente (HS). Esta fue la primera demostración de la entrada 
de una proteína en un ambiente hidrofóbico en la membrana celular a nivel de una sola 
molécula y provee una descripción cuantitativa de cómo las γ-hemolisinas se insertan y 
 35 
forman poros, aunque el mecanismo de inserción aún no es del todo claro (Nguyen et al., 
2006). 
Otros ejemplos utilizando la estrategia de marcar cisteínas los podemos encontrar en 
diversas toxinas como la citolisina de Vibrio cholerae (VCC) (Valeva et al., 2005), 
listeriolisina O (LLO) de Listeria monocytogenes (Schuerch, 2005), la equinotoxina II 
(EqtII), una actinoporina de Actinia equina (Malovrh et al., 2003), entre otras. 
 
Otra manera de emplear la fluorescencia es utilizar los triptofanos (W) como fluoróforos 
naturales en vez de cisteínas marcadas, debido a que en ciertas ocasiones el marcaje de 
este residuo con fluoróforos extrínsecos puede introducir perturbaciones en la estructura 
tridimensional de la toxina y/o en su interacción con la membrana (Heuck y Jonson, 
2002). Un ejemplo de esto es el realizado con la toxina EqtII, construyeron mutantes 
introduciendo un W adicional en una región no polar de la hélice α anfipática del N- 
terminal, involucradaen la inserción a la membrana. De esta manera, debido a que esta 
hélice hace contacto con las cadenas de ácidos grasos de los fosfolípidos después de su 
inserción a la membrana, se monitoreó la interacción de las regiones de la toxina con los 
lípidos de membrana y su posterior localización una vez que interaccionó con ésta, 
comparando los cambios de fluorescencia del estado silvestre con los W introducidos, 
tanto en solución como en presencia de distintos sistemas lipídicos. En este trabajo 
lograron determinar los residuos de la toxina que estaban implicados en el contacto 
inicial y superficial en la unión de la toxina con la membrana. En un trabajo previo 
determinaron que los W nativos permitían posicionar a la toxina en la interfase lípido-
agua de la bicapa lipídica y situaban a la toxina de manera paralela con la membrana. 
Con los nuevos ensayos de fluorescencia concluyeron que la hélice-α del N-terminal de 
la toxina hace un primer contacto con la membrana, posteriormente oligomeriza junto 
con otros monómeros y de esta forma adoptan una orientación perpendicular creando el 
poro (Gutiérrez-Aguirre et al., 2004). 
 
 36 
En el caso de Bacillus thuringiensis, parece que los W también tienen un papel importante 
en el mecanismo de acción de sus toxinas. Experimentos realizados en la toxina Cry1Ab 
en los que el residuo F371 localizado en el lazo 2 del dominio II se reemplazó por Cys, 
Val, Ser, Leu, Tyr y Trp mostraron que la toxicidad de Cry1Ab hacia M. sexta está 
correlacionada con el tamaño e hidrofobicidad del aminoácido de esta posición, ya que 
únicamente no se vio afectado el grado de unión irreversible hacia las VMMA y 
toxicidad cuando se cambió por Tyr y Trp, por lo tanto es esencial tener un residuo 
aromático en la posición 371 para la interacción de la toxina Cry1Ab con las proteínas 
receptoras presentes en la membrana de M. sexta (Rajamohan et al., 1996). 
Otro estudio realizado en la toxina Cyt2Aa2 de B. thuringiensis subs. 
darmstadiensis que contiene tres residuos triptofano en las posiciones 132, 154 y 157, 
demuestra que los dos primeros son residuos críticos para mantener el plegamiento y la 
función de la toxina y no pueden ser remplazados por ningún otro aminoácido, no así el 
W157, el cual puede ser sustituido pero sólo por otro aminoácido aromático. Cabe 
mencionar que los Trp 154 y 157 están conservados en todas las toxinas Cyt y que todos 
los triptofanos están localizados en la superficie de la molécula y pueden jugar un papel 
en las interacciones intermoleculares durante la formación del cristal o interactuar con la 
membrana durante la formación del poro (Promdonkoy et al., 2004). 
 
La proteína Cry1Ab posee dentro de su secuencia nueve triptofanos, siete de los 
cuales están localizados en el Dominio I, el cual se propone se inserta en la membrana, y 
dos triptofanos en el Dominio II (figura 13). Tomando ventaja de esta característica, se 
han hecho estudios estructurales midiendo la fluorescencia de los Trp de la toxina 
Cry1Ab y Cry1Ac, donde las estrategias principales que se han utilizado en estas 
proteínas consistieron en monitorear la fluorescencia con algún apagador en solución 
como yoduro o con apagadores incorporados en la membrana como grupos bromilo. 
Estos trabajos han sido realizados con proteína en forma monomérica u oligomérica en 
solución e insertadas en membranas lipídicas. Los resultados obtenidos indican que 
cuando la proteína Cry1Ab está en forma de monómero y en solución tiene el 54% de 
 37 
Trp expuestos al solvente, y en el oligómero solo el 27%, lo que sugiere que algunos Trp 
se esconden en el contacto proteína-proteína durante la oligomerización. Por el 
contrario, cuando el oligómero se inserta en la membrana, ningún Trp queda expuesto, 
localizándose preferencialmente en la interface lípido-agua, ya sea cerca de la cabeza 
polar de la fosfatidil colina o cerca de la posición del carbono 7 del ácido graso (Rausell 
et al., 2004). También se demostró que el oligómero a diferencia del monómero es capaz 
de interactuar eficientemente con membranas de fosfolípidos formando un poro estable, 
ya que más del 90% de la estructura oligomérica se insertó en la membrana, en contraste 
con la estructura monomérica donde sólo el 5% lo hizo. 
 
Figura 13. Proteína Cry1Ab donde se muestran los dominios estructurales y los 
triptofanos (en rojo). 
 
 38 
Aún no se sabe la accesibilidad de cada Trp cuando la toxina oligomeriza ni 
cuando se inserta en la membrana. Es probable que las toxinas formen un oligómero 
compuesto de cuatro subunidades, (Gómez et al, 2002) deducido por el peso molecular 
obtenido ~250kDa, equivalente a 4 subunidades de 65kDa, capaces de insertarse en la 
membrana, pero no se ha hecho un análisis exhaustivo sobre las regiones de la toxina 
que forman el canal (poro). 
En el estudio hecho utilizando el apagamiento de la fluorescencia del Trp 
empleando la toxina Cry1Ac, se pudo determinar la interacción entre la toxina y el 
azúcar N-acetilgalactosamina (GalNAc) presente en el receptor APN, se observaron 
cambios estructurales inducidos en la toxina por esta interacción (Pardo-López et al., 
2006). La toxina Cry1Ac tiene 10 residuos triptofano, uno más que Cry1Ab, y se 
encuentra localizado en el dominio III, situado muy cerca de la cavidad de unión con la 
GalNAc. El análisis de apagamiento de la fluorescencia del W indicó que en Cry1Ac 
estos residuos W tienen una exposición diferente al solvente comparado con la toxina 
Cry1Ab, a pesar de tener un W adicional. En estado monomérico Cry1Ac tiene solo un 
39% de exposición al solvente y cuando esta proteína oligomeriza se reduce la 
exposición al solvente de sus W a un 13%, lo que podría estar indicando que Cry1Ac 
despliega una estructura más compacta que Cry1Ab, sin embargo si comparamos la 
cantidad de W que fueron ocultos ante la oligomerización de estas proteínas, 
encontramos un valor de reducción similar (27%) de exposición de W, lo que sugiere un 
cambio conformacional similar para ambas toxinas. La unión de Cry1Ac a GalNAc 
mostró un efecto muy marcado en la exposición del W545 en estado oligomérico, se 
observó un corrimiento de 7 nm en la emisión máxima del oligómero después de la 
unión a GalNAc, lo que indica una alta exposición de algunos residuos W al solvente. 
Esto fue confirmado tras realizar un estudio de apagamiento de fluorescencia 
empleando KI, en el cual se observó que el 7% de los W que estaban escondidos en 
estado oligomérico fueron accesibles al apagador después del contacto con el azúcar. 
Además, se sabe que estos cambios conformacionales ocurren en la vecindad del W545 
del dominio III, debido a que al realizar estos mismos ensayos de unión a GalNAc y 
 39 
experimentos de apagamiento de la fluorescencia en la mutante W545A de Cry1Ac, no 
se observó cambio en el apagamiento de la fluorescencia de la estructura oligomérica, a 
pesar de que esta mutante si fue capaz de unirse a GalNAc. Aunque para saber si la 
unión al azúcar afecta la conformación de los dominios I y II de la toxina es necesario 
construir mutantes que solo tengan un solo residuo W (o pocos residuos) que 
mantengan su actividad, para poder realizar estos ensayos y ser mas concluyentes en el 
papel que desempeña este azúcar en el cambio estructural que pueda estar sufriendo la 
toxina Cry1Ac. 
 
Obtener una estructura tridimensional de una proteína oligomérica resulta una 
tarea difícil, que se complica aún mas si ésta se inserta en la membrana. Por lo cual, 
queremos elaborar un modelo de cómo el oligómero de la toxina Cry1Ab se inserta a la 
membrana, empleando estudios de apagamiento de la fluorescencia que representan 
una técnica fácil de utilizar y que aporta datos favorables en cuanto a posibles cambios 
conformacionales en las proteínas. 
Para esto estudiaremos el comportamiento de los triptofanos intrínsecos de la 
proteína Cry1Ab