Estudio-de-los-mecanismos-de-la-resistencia-innata-inducidos-por-virus-de-mosaico-de-la-papaya-PapMV

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UNIVERSIDAD NACIO]\;AL
DE MEXICO
FACULTAD DE QUIMICA
AUTONOl\IA
ESTUDIO DE LOS MECANISMOS DE LA RESISTENCIA
INNATA INDUCIDOS POR EL VIRUS DE MOSAICO DE LA
PAPAYA (PapMVl.
T E s I s
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:
QUrMICA FARMACEUTICA BIOLOGA
P R E S E N T A
REBECA
MEXICO, D. f.
PEREZ FLORES
ro.MENES PROFESIONALES
FACULTAD DE OUIMICA
2005
 
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JURADO ASIGNADO:
Presidente:
Vocal:
Secretario:
1er Suplente :
2° Suplente:
Dr. Jorge Fernando Paniagua Salís
Dr. Constantino 111 R. López Macias
Dr. Enrique Ortega Soto
M. en C. Mónica Berenice Heras Chavarría
M. en C. Ferjanith Márquez Lora
El presente trabajo fue desarrollado en la Unidad de Investigación Médica en
Inmunoquímica del Hospital de Especialidades del Centro Médico Nacional Siglo
XXI del Instituto Mexicano del Seguro Social.
f\\
López Macias M. en C. odolfo Pastel in Palacios
SUPERVISOR TÉCN ICO
~u10riz0 a la Difg~lñl1 G~!1tté1i de, ~¡, lW~NTANTE
UNA" adifundir fln forrnat.n sleclrornco e IfI\preso t1
COJ'tenldo de mi trab:.:to r,eepclonal.
NOMBRE: }, e o. P e r- 'Z.
- r: s;
2
DEDICATORIAS
A mis papás por su cariño y apoyo que me han brindado siempre, estoy
muy orgullosa de ustedes y siempre los llevo en mi corazón. Papá,
gracias por tus enseñanzas , Mamá gracias por tu amor, los quiero mucho.
A mis abuelitos y a mi tía Eisa por estar siempre conmigo, por su cariño y
apoyo. Abuelita, gracias por ser un ejemplo de perseverancia y fuerza de
voluntad, tus acciones han dejado huella en mi vida.
A Christian por aparecer en mi vida y darme una razón para seguir
adelante con mis sueños, eres un ejemplo para mi. Gracias por tus
enseñanzas, por tu paciencia , por tu amor y por enseñarme a confiar en
que las cosas pueden ser maravillosas. Te amo. A la Sra. Yuri, Alan y
Emmanuel por abrirme las puertas de su casa y dejarme entrar a su
familia.
A Luzcla por su apoyo incondicional, por sus consejos, por su paciencia,
por todos esos momentos maravillosos y sobre todo, por ser la peor mejor
amiga que existe en el mundo. Te quiero mucho.
A Dith, Armando y Efra por estar siempre conmigo, por sus consejos, por
soportarme y enseñarme a ser alguien mejor. Los quiero mucho.
A Carlitas, Betty, Poncho, Letty, Mariana y Aldo por hacer de los últimos
semestres en la Facultad momentos inolvidables que marcaron mi vida,
los quiero mucho y los recuerdo siempre.
A Cris, Morax, Eli, Luisa, Aarón y el Maestro Pastelín por hacer del
laboratorio mi casa.
3
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Armando Isibasi por darme la oportunidad de participar en este
trabajo en la Unidad de Investigación Médica en Inmunoquímica.
Al Dr. Constantino López por su confianza, apoyo e instrucción en mi
formación como investigadora.
Al Dr. Rodolfo Pastelin por su apoyo en el análisis y critica profunda del
presente trabajo y a mis compañeros de la Unidad de Investigación
Médica en Inmunoquímica por su apoyo en la realización y discusión de
este trabajo.
Al Dr. Denis Leclerc por su apoyo y colaboración en este proyecto.
A la Dra. Laura Bonifaz y a la Biol. Juliana Idoyaga de la Unidad Médica
en Investigación en Enfermedades Autoinmunes del Hospital de
Especialidades del Centro Médico Nacional Siglo XXI por su apoyo en la
realización de los experimentos y en la discusión de los mismos.
Al Dr. Leopoldo Flores del Laboratorio de Inmunología Celular del
CINVESTAV por permitirme el uso de sus instalaciones para la realización
de los experimentos y por su apoyo y discusión de los mismos.
A la Dra. Ingebor Becker del laboratorio del Departamento de Medicina
Experimental de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional
Autónoma de México.
Al Sr. Ricardo Vargas Orozco y el MVZ. Daniel Sánchez Almaraz del
Bioterio del Departamento de Medicina Experimental de la Facultad de
4
Al Sr. Ricardo Vargas Orozco y el MVZ. Daniel Sánchez Almaraz de:
8ioterio del Departamento de Medicina Experimental de la Facultad de
Medicina de la Universidad Nacional Autónoma de México, por permitirme
utilizar las instalaciones del bioterio y por su colaboración sin la cual este
trabajo no hubiera sido posible.
El presente trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología (CONACYT). Proyecto No. 45261- M y por el Fondo para el
Fomento a la Investigación Médica (FOFOI) en los proyectos FP 2003-
020 y FP 2004-052
5
íNDICE
ABREVIATURAS
RESUMEN
1. INTRODUCCIÓN
11. ANTECEDENTES
1. Inmunidad innata vs. Resistencia innata
2. Componentes celulares de la resistencia innata
3. Moléculas asociados a microorganismos (MAMs):
estructuras importantes enel reconocimiento de
antígenos por la resistencia innata.
a. Receptores de reconocimiento
molecular (MRRs) intracelulares
b. Receptores de reconocimiento
c. molecular (MRRs) solubles
d. Receptores.de reconocimiento
molecular (MRRs) anclados a la membrana
.• Receptores fagocíticos
• Receptores tipo Toll (TLRs)
4. Microdominios lipídicos
5. Mecanismos de activación de la resistencia innata
9
12
14
19
22
26
27
27
28
29
31
6
a. Señalización intracelular a través del
reconocimiento por TLRs 33
b. Producción de citocinas. 34
c. Expresión de moléculas coestimuladoras 36
6. Mecanismos de activación de la inmunidad adaptativa 38
7. Contribución de los mecanismos de la resistencia
innata en la generación de la inmunidad adaptativa 41
a. Adyuvantes. 42
b. Virus vegetales: una alternativa para el 44
desarrollo de vacunas.
8. Modelo experimental: virus de mosaico de la papaya
(PapMV)
111. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
IV. HIPÓTESIS
V. OBJETIVOS
VI. MATERIALES Y MÉTODOS
1. Obtención de monocitos de médula ósea
de ratón y su diferenciación a macrófagos.
2. Evaluación de la agregación de microdominios
Iipídicos por el PapMV.
3. Obtención de monocitos de sangre humana
periférica y su diferenciación a macrófagos.
4. Estimulación de los macrófagos de humano y
45
47
47
48
49
51
52
7
de ratón con el PapMV. 54
5. Cuantificación de citocinas pro-inflamatorias
de humano y de ratón por el método de ELlSA. 54
6. Estudio de la maduración de células dendríticas
y la activación de macrófagos de ratón BALB/c in vivo
inducida por el PapMV. 58
7. Contribución de los macrófagos en la generación de
la respuesta inmune humoral contra el PapMV. 60
8. Determinación del título de anticuerpos anti-PapMV. 61
VII. RESULTADOS 63
VIII. DISCUSiÓN 77
IX. CONCLUSIONES 83
X. PERSPECTIVAS DEL TRABAJO 84
XI. ANEXOS 85
XII. BIBLIOGRAFíA 87
8
ABREVIATURAS
Ab
AIMV
APC
SCR
CMV
CP
CTB
CVP
OC
DO
ELlSA
FITC
GM -CSF
GMl
HRP
IFN -y
19
IKB
Anticuerpo
Virus de mosaico de la alfalfa
Células presentadoras de antígeno
Receptor del linfocito S
Virus de mosaico del ejote
Proteínas de la cápside
Subunidad B de la toxina del cólera
Partículas virales quiméricas
Células dendríticas
Dominio de muerte
Ensayo inmunoenzimático en fase sólida
Isotiocianato de fluoresceína
Factor estimulador de colonias de
granulocitos/monocitos
Gangliosido Gal(B1 - 3)GaINAc(B- 4)[NeuAc(a2 - 3)]
Peroxidasa de rábano
Interferón gamma
Inmunoglobulinas
Fracción inhibidora del factor nuclear KB
9
IKK
IL-
ip
IRAK
iv
JNK
LPS
LRRs
MAM
MAPK
MHCI
MHC 11
MRR
MyD8B
NF-kB
NK
NOD
OPD
OVA
PapMV
PBS
PE
SFB
Cinasa de IKB
Interleucina -Intraperitoneal
Cinasa asociada al receptor de IL - 1
Intravenoso
Cinasa N- Terminal de JUN
Lipopolisacárido
Repeticiones ricas en leucina
Moléculas asociadas a microorganismos
Cinasa activada por mitógeno
Complejo principal de histocompatibilidad clase I
Complejo principal de histocompatibilidad clase !I
Receptores de reconocim iento de microorganismos
Proteína de diferenciación mieloide BB
Factor nuclear kappa B
Células asesinas naturales
Dominios de unión a oligonucleót idos
o - fenilendiamina
Ovoalbúmina
Virus de mosaico de la papaya
Solución amortiguadora de fosfatos
Ficoeritrina
Suero fetal bovino
la
SSI Solución salina isotónica
ssRNA RNA de cadena sencilla
TAB Proteína de unión a TAK-1
TAK Cinasa activada por TGF - r.,
TBSV Virus del arbusto de tomate
TIR Dominio TolIlIL -1 R
TLR Receptor tipo TolI
TMB Tetrametilbencidina
TMV Virus de mosaico del tabaco
TNF - o Factor de necrosis tumoral alfa
TRAF Factor asociado al receptor de TNF
11
RESUMEN
Este trabajo tuvo como finalidad estudiar los mecanismos de la
resistencia innata inducidos por el PapMV, un virus vegetal cuya cápside
esta compuesta por 1200 copias de una única proteína en una forma
organizada y altamente repetitiva formando un arreglo paracristalino.
En el laboratorio hemos observado que la administración en
ratones de una sola dosis de este virus en ausencia de adyuvantes, es
capaz de inducir una respuesta inmune humoral que se mantiene por lo
menos durante un año posterior a la inmunización, caracterizada por altos
títulos de anticuerpos de todas las subclases de IgG, haciendo de este
virus un excelente inmunógeno1. Además, al administrarlo junto con otros
antígenos como OVA y porinas de Salmonella enterica serovar Typhi se
obtienen títulos de anticuerpos más altos que los producidos por los
antígenos solos demostrando que el PapMV es un adyuvante",
Al realizar este estudio encontramos que el PapMV es reconocido
por macrófagos derivados de monocitos de médula ósea de ratones
BALB/c, ya que al estimularlos con 1J.1g/mL de proteína del virus se induce
la agregación de microdominios lipídicos in vitro, además, el PapMV
también es capaz de activar a estas células ya que la estimulación con la
misma dosis genera la producción de citocinas proinflamatorias: TNF - a ,
12
IL - 6 e IL - 12p70. La activación in vitro también se comprobó en
macrófagos humanos derivados de monocitos de sangre periférica, en
donde la estimulación con la misma dosis que en ratón indujo la
producción de TNF - a aunque no la de IL - 6 e IL -12p70.
Observamos también, que el PapMV es capaz de activar a células
dendríticas de ratones BALB/c in vivo, ya que al administrar 30119 de
proteína del virus vía ip se observó un incremento en la expresión de
moléculas coestimuladoras en células dendríticas con fenotipo
CD11c+CD11 b como CD40 y moléculas de clase 11 en células presentes
en el ganglio y CDBO en el bazo.
Además, se comprobó que los macrófagos derivados de monocitos
de médula ósea de ratones BALB/c contribuyen a la generación de la
respuesta inmune humoral contra el virus, ya que al estimularlos con
1 Ilg/mL de PapMV durante 3h y transferir por vía intravenosa 106 células
estimuladas a ratones de la misma cepa, observamos títulos de
anticuerpos IgG anti - PapMV.
En conjunto estos resultados demuestran que el PapMV induce los
mecanismos de la resistencia innata contribuyendo a la generación de
altos títulos de anticuerpos anti - PapMV y confiriéndole sus propiedades
de adyuvante al aumentar el título de anticuerpos contra los antígenos
anteriormente mencionados.
13
1. INTRODUCCiÓN
La necesidad de desarrollar vacunas seguras, efectivas, que
puedan administrarse en cualquier etapa de la vida y que confieran
protección de larga duración contra un número importante de
enfermedades infecciosas para las cuales no existen vacunas en la
actualidad y para aquellas que ya existen pero que no cumplen con las
características anteriormente mencionadas, ha llevado a los
investigadores al estudio cada vez más profundo de los mecanismos de la
respuesta inmune que son necesarios para conferir protección contra
estas enfermedades . La inducción de inmunidad (protección) depende
de la acción conjunta de los mecanismos innatos de defensa y de la
respuesta inmune adaptativa; aunque la mayor parte de la protección es
generada por los mecanismos innatos de defensa', el estudio de la
inmunidad se ha concentrado principalmente en la respuesta inmune
adaptativa.
Desde el descubrimiento de los Receptores tipo TolI (TLRs)4 el
estudio de la respuesta inmune innata se ha incrementado y cada vez se
obtienen más datos que respaldan el hecho de que es muy importante ya
que, además de ser la primera línea de defensa del organismo, los
mecanismos que se activan ante la presencia de algún estímulo inician,
amplifican y dirigen el tipo de respuesta inmune adaptativa que se genera
contra el rnisrno''.
14
amplifican y dirigen el tipo de respuesta inmune adaptativa que se genera
contra el mismos.
Es por ello que ha habido un aumento en los estudios que tienen
como línea de investigación manipular la respuesta inmune innata con el
fin de mejorar la efectividad de las vacunas, entender los mecanismos de
generación de inmunidad 6 .
Existen sustancias capaces de favorecer un aumento en el título de
anticuerpos contra un antígeno a las cuales se les dio el nombre de
adyuvantes" . Ahora se sabe que el mecanismo mediante el cual estas
sustancias ejercen dicho efecto es mediante el reconocimiento y
activación de la respuesta inmune innata", por lo que la definición actual
de un adyuvante se refiere a sustancias capaces de potenciar la
respuesta inmune. Sin embargo, a pesar de que se ha observado que
muchos compuestos o mezclas pueden ser utilizados como adyuvantes
para vacunas, solo dos están permitidos para el uso en humanos (alúmina
y la microemulsión MF59)9.10 ya que se ha observado que algunos de los
componentes de estas sustancias pueden causar efectos tóxicos,
secundarios e incluso inducción de autoinmunidad al administrarlos en
modelos animales .
Los virus vegetales han sido considerados recientemente como
sistemas atractivos para la expresión y presentación de proteínas que
pueden ser util izados para el desarrollo de nuevas estrategias de
vacunación y como adyuvantes en la respuesta mrnune!' .
15
Se ha demostrado que los virus vegetales pueden ser efectivas
herramientas para la producción y presentación de antígenos, ya que el
estudio cada vez más profundo de la biología molecular de estos virus ha
dado la pauta para utilizarlos como sistemas de expresión de antígenos ,
lo cual ofrecería grandes ventajas ya que, en general, los virus vegetales
no son patógenos en humanos y otros animales. Las proteínas de la
cápside (CP) de los virus vegetales son particularmente buenas
acarreadoras para presentar péptidos al sistema inmune. Cuando la
secuencia de la proteína de interés es fusionada adecuadamente, las
secuencias exógenas son expresadas en plantas originando CP virales
recombinantes (CVP) capaces de autoensamblarse y generar partículas
virales quiméricas expresando en su superficie la secuencia exógena.
Otra de las propiedades de estas CVP es que las proteínas
exógenas son expresadas en un arreglo organizado y repetitivo. Se ha
observado que este tipo de arreglo de los antígenos favorece la activación
de los linfocitos B independientemente de la cooperación de T, mediante
el reconocimiento a través de BCRs y el entrecruzamiento de los mismos,
lo cual proporciona un estímulo lo suficientemente fuerte para activar al
linfocito B para la posterior producción de anticuerpos12.13. Muchos de los
agentes infecciosos incluyendo virus, bacterias y parásitos expresan en su
superficie antígenos dispuestos en un arreglo altamente organizado y
repetitivo y se ha visto que pueden activar a los linfocitos B por este
mecanismo.
16
El virus de mosaico deltabaco (TMV)14, el virus de mosaico de la
alfalfa (AIMV)15, el virus de mosaico del ejote (CMV)16,17 y el virus del
arbusto de tomate (TBSV)18, han sido utilizados para expresar
determinantes antigénicos de diferentes patógenos tanto de humanos
como de animales, incluso se ha demostrado que al inmunizar ratones
con algunos de estos CVP, se puede conferir protección contra los
patógenos cuyos determinantes antigénicos fueron expresados en los
virus vegetales 19.
En el laboratorio contamos con un modelo experimental que
consiste en un virus vegetal, el virus de mosaico de la papaya (PapMV),
con el cual hemos observado que la administración en ratones de una
sola dosis de este virus en ausencia de adyuvantes, es capaz de inducir
una respuesta inmune humoral que se mantiene a lo largo de por lo
menos un año posterior a la inmunización, caracterizada por altos títulos
de anticuerpos de todas las subclases de IgG, haciendo de este virus un
excelente inmunógeno.
Además, al administrarlo junto con otros antígenos como OVA y
porinas Salmonefla enterica serovar Typhi, se obtienen títulos de
anticuerpos más altos que los producidos por los antígenos solos
demostrando que el PapMV es un adyuvante.
Sin embargo , no se conocen los mecanismos de la resistencia
innata que son activados y que le permiten a este virus ser tan buen
inmunógeno y adyuvante ,
17
Si se hicieran CVP utilizando al PapMV se obtendrían muchas
ventajas en comparación con otros virus vegetales como el TMV, ya que
el PapMV puede obtenerse en mucho mayores cantidades puesto que en
una hectárea de papayas infectadas se puede extraer 1 kg de virus, con
lo cual, si se administraran 100 ~g de virus recombinante, una hectárea
sería suficiente para vacunar a 10 millones de personas o animales.
De acuerdo a lo anterior, este trabajo tiene como finalidad el
estudio de los mecanismos de la resistencia innata que nos ayuden a
entender la inmunogenicidad y la capacidad adjuvante del PapMV y que
en un futuro cercano nos permita crear una nueva plataforma para el
desarrollo de vacunas seguras, efectivas , que puedan administrarse en
cualquier etapa de la vida y que confieran protección de larga duración.
18
11. ANTECEDENTES
1. Inmunidad innata vs. Resistencia innata
Durante mucho tiempo el estudio de la inmunidad innata fue
relegado por el estudio de la inmunidad humoral debido a las
aplicaciones que pudieron darle de manera inmediata a los
antícuerpos'".
Sin embargo, estudios recientes sobre la defensa del organismo
contra patógenos, han demostrado que el tipo, la cantidad y los
mecanismos efectores de la inmunidad adaptativa, dependen del tipo
de mecanismos de la respuesta inmune innata activados por el
reconocimiento de los patógenos" . Además, existen otras razones
que han hecho que el estudio de la inmunidad innata tome
importancia: se ha visto que en todos los organismos multicelulares
existen mecanismos de inmunidad innata, mientras que la respuesta
inmune adaptativa solo se encuentra en los vertebrados'F; los
receptores de reconocimiento de la inmunidad innata son altamente
conservados y específicos pero esta especificidad no es de tipo clonal
y se encuentran codificados en la línea germinal por lo que el número
de receptores es pequeño mientras que los de la inmunidad adaptativa
si tienen especificidad clonal , se generan mediante rearreglos de
genes y por lo tanto, su número es casi ilimitados.
19
A pesar de lo anterior, la inmunidad innata presenta una
desventaja frente a la inmunidad adaptativa: no se ha demostrado que
tenga memoria. Es por ello que el Dr. Rolf Zinkernagel ha propuesto
cambiar el término de inmunidad innata por el de resistencia innata ya
que la palabra inmunidad23 , la cual originalmente se definió como
protección contra la enfermedad ya sufrida, esta sumamente ligada
con el termino memoria inmunológica . La memoria inmunológica
puede definirse como la habilidad del sistema inmune para responder
más rápida y eficientemente a patógenos con los que ya había tenido
contacto previamente y refleja la preexistencia de poblaciones
clonalrnente expandidas de linfocitos antígeno - especlñcos".
Sin embargo , estudios recientes han demostrado que en los
invertebrados, los cuales carecen de inmunidad adaptativa, existen
ciertos indicios de rnemoría"; se ha observado una mayor y más rápida
respuesta contra un patógeno en la descendencia de los crustáceos
Daphnia magna que tuvieron un contacto previo con ese patógeno.
Más aún, se probaron dos diferentes cepas del mismo patógeno y la
descendencia que fue retada con la misma cepa con la cua l
inmunizaron a la madre respond ieron de la manera anteriormente
mencionada, mientras que las que fueron retadas con la otra cepa no
mostraron dicha respuesta, lo cual nos indica cierto grado de
especificidacr".
20
Aunque se tienen estos antecedentes hasta el momento no se
ha demostrado memoria inmunológica debida a la respuesta innata de
los vertebrados, por lo cual utilizaremos en este trabajo el término de
resistencia innata como sinónimo de inmunidad innata.
El estudio la resistencia innata se ha dividido en dos tópicos,
debido a que las herramientas empleadas para su estudio son muy
diferentes, en mecanismos celulares y humorales, los cuales a su vez
se han dividido en sensores y efectores25.
RESISTENCIA
INNATA
HUMORAL
CELULAR
AFERENTE
(SENSORA)
EFERENTE
(EFECTORA)
AFERENTE
(SENSORA)
EFERENTE
(EFECTORA)
LBP, C014, colectinas
properdina, C3b,
pentraxinas.
Citocinas, defensinas,
BPI, complemento,
lactoferrina, reactantes de
fase aguda.
TLR's, Dectin-1,
MR, OEC20S,
PKR, NOO 1y 2.
Péptidos antimicrobianos,
proteasas, Iipasas,
glicosidasas, moléculas de
adhesión, Hz02, radical
hidroxilo, Ión superóxido, NO,
peroxinitrito.
Fig 1. Componentes de la resistencia innata. (modificada de Beutler, B.,
Molecular Immunology (40) 2004, pago847)
21
2. Componentes celulares de la resistencia innata
La resistencia innata utiliza diferentes tipos de células para
responder ante el ataque de microorganismos. Estas células
despliegan una serie de actividades efectoras con el fin de controlar la
infección, atraer al sitio a más células de la resistencia innata y activar
a la respuesta inmune adaptativaf', Algunas de estas actividades
consisten en la fagocitosis del antígeno, la liberación de mediadores
inflamatorios y factores quimiotácticos, la presentación de antígeno a
los linfocitos T, entre otras25. Muchas de estas actividades pueden ser
desempeñadas por la misma célula, aunque hay células que
preferentemente solo realizan algunas de ellas, por ejemplo, los
neutrófilos, monocitos, macrófagos y células dendrít icas son células
fagocíticas, siendo ésta la especialidad del neutrófilo ; los macrófagos y
células dendrít icas son presentadoras de antígeno aunque se
reconoce a las últimas como las especialistas; la mayoría de ellas son
capaces de liberar mediadores inflamatorios. A continuación se
presenta una breve explicación de las células de la resistencia innata
que son relevantes en esta investigación:
Macrófagos.- Se encuentran presentes en todos los tejidos del
organismo , a los cuales proveen de una vigilancia constante". Derivan
de precursores mieloides en la médula ósea, el bazo y el hígado fetal
hacia una forma de macrófagos inmaduros denominados monocitos. Al
22
dejar el ambiente de la médula ósea migran hacia los diferentes tejidos
probablemente dirigidos por qutrníocínas". Al entrar al parénquima del
tejido, el ambiente circundante influye significativamente en la función
del macrófago, ya que los macrófagos residentes de diferentes tejidos
despliegan una serie de funciones diferentes. Después de alguna
agresión hacia el tejido, los macrófagos residentes pueden contribuir a
la resistencia innata mediante el despliegue de una serie de
actividades inflamatorias y efectoras'",
Los macrófagos son capaces de detectar la presencia de
microorganismos mediante el reconocimientode moléculas asociadas
a microorganismos (MAMs) a través de receptores de reconocimiento
de microorganismos (MRRs)29 presentes en la superficie de la célula .
Posterior al reconocimiento el macrófago se activa y despliega sus
funciones efectoras, dentro de las cuales se encuentra la fagocitosis y
destrucción del patógeno, la producción de una serie de citocinas'" y
quimiocinas que ayudarán a la comunicación entre las células tanto de
la resistencia innata como de la inmunidad adaptativa y finalmente la
presentación de antígeno a los linfocitos T CD4+ con lo cual se inic ia
la respuesta inmune adaptativa".
Una vez que se ha activado la respuesta inmune adaptativa los
linfocitos CD4+ y CD8+ pueden incrementar las funciones de los
macrófagos mediante la liberación de citocinas que, al unirse a su
receptor presente en los macrófagos, activan una serie de genes que
23
hacen al macrófago más eficiente en sus funciones. Los macrófagos
también tienen en su superficie receptores para anticuerpos · y
complemento los cuales contribuyen a la destrucción del antígeno.
Células dendríticas (DC).- Son componentes cruciales del sistema
inmune teniendo un papel esencial en la inducción y control de la
activación de los linfocitos T así como la modulación de la respuesta
de los linfocitos 8 y células NK32. La potencia de las células
dendríticas en inducir la activación de los linfocitos T depende de su
capacidad de capturar, intemalizar y procesar antígenos llevando a la
presentación de péptidos asociados a las moléculas de MHC a
linfocitos T antígeno específicos , además, una vez que reconocen al
antígeno a través de MRRs pueden ocurrir varios eventos como
fagocitarlo y posteriormente presentarlo ylo inducir su maduración, la
cual consiste en un aumento en la expresión de moléculas
coestimuladoras como CD80, CD86, CD40 necesarias para una
efectiva activación de linfocitos T narve: y moléculas de MHC para la
presentación de antígeno y una disminución en su capacidad
fagocítica. El proceso de maduración de las células dendríticas incluye
un cambio en la expresión de receptores para qulrntocinasf y
moléculas de adhesión" el cual le permite viajar del sitio de infección
al órgano linfoide secundario más cercano, lugar en el que se lleva a
cabo la presentación de antígeno y en donde la DC es capaz de
24
producir una serie de citocinas cruciales para las funciones efectoras
de los linfocitos T3S.
Las DCs se encuentran en la periferia del organismo, lo que le
permite detectar rápidamente la presencia de antígenos.
Se ha visto que existen diferentes subpoblaciones de DCs.
Estudios anteriores apoyaban la idea de que estas subpoblaciones se
generaban debido a que las células dendríticas podían generarse a
partir de precursores mieloides y precursores Iinfoides. Sin embargo,
investigaciones recientes han demostrado que OC con el mismo
fenot ipo pueden generarse tanto de precursores mieloides como
linfoides. Otros estudios han mostrado evidencia de que verdaderas
subpoblaciones de OC pueden originarse paralelamente de estos
precursores. Por esta razón es que el enfoque del tema se ha centrado
en las diferencias entre las poblaciones conocidas de OC, ahora
llamadas colectivamente células dendríticas convencionales (CDC) y
las nuevas integrantes y poco conocidas del grupo, las células
dendríticas plasmacitoides (PDC)26, las cuales han sido identif icadas
por su capacidad de producir grandes cantidades de IFN tipo I como
respuesta a las infecciones virales y se ha visto que tienen una
fisiología compleja y diferente de las CDCs puesto que difieren de
éstas en el control génico de la expresión de moléculas de MHC así
como en la rápida producción de IFN tipo I después del reconocimiento
del antígeno a través de TLRs36.
25
3. Patrones moleculares asociados a microorganismos (MAMs):
estructuras importantes en el reconocimiento de antigenos por la
resistencia innata.
La estrategia de reconocimiento de la resistencia innata se
basa en la detección de estructuras moleculares conservadas ,
presentes en los microorganismos pero no en el organismo hospedero
las cuales se conocen como moléculas asociadas a microorganismos
(MAMs)37 y representan los blancos de reconocimiento por parte de la
resistencia innata, a través de receptores llamados receptores de
reconocim iento de microorganismos (MRRs).
Dentro de los MAMs se encuentran los ácidos nucleicos como
el RNA de doble cadena el cual es generado por virus de RNA que se
encuentran replicándose, N-formil metionil péptidos que son típicos en
las proteínas bacterianas, Iípidos complejos y carbohidratos que son
sintetizados exclusivamente por los microorganismos, como el
lipopolisacárido en las bacterias Gram negativas, los ácidos teicoicos
en las bacterias Gram positivas y los oligosacáridos ricos en manosa
que se encuentran en las glicoproteínas bacterianas'',
La resistencia innata utiliza una variedad de MRRs los cuales
pueden encontrarse expresados en la superficie de la célula, en
compartimentos intracelulares o secretados en el torrente sanguíneo o
26
fluidos tisulares. Las principales funciones de los MRR's incluyen la
opsonización, activación del complemento y cascadas de coagulación,
fagocitosis, apoptosis y cascadas de señalización que llevan a una
respuesta proinflamatoria . De acuerdo a lo anterior los MRRs se
puede dividir en tres clases':
a) Receptores de reconocimiento molecular (MRRs) intracelulares:
Están involucrados en el reconocimiento de patógenos intracelulares,
en particular virus, con el fin de activar mecanismos que bloqueen su
replicación. Los dos sistemas mejor caracterizados son el de la
proteína cinasa R (PKR) Y la oligoadenilato sintasa (OAS), los cuales
juegan un papel muy importante en la protección antiviral del
hospedero. Las proteínas de la familia de Dominio de unión a
oligonucleótidos NOO (NOD1 y N002) también pertenecen a este tipo
de MRRs y recientemente se ha demostrado que participa como un
sensor general de bacterias intracelulares Gram positivas y Gram
negativas5,38,39.
b) Receptores de reconocimiento molecular (MRRs) solubles: Esta
clase de MRRs dan lugar a tres tipos de funciones: activan al
complemento , opsonizan células para facilitar su fagocitosis y, algunas
de ellas , funcionan como proteínas accesorias para el reconocimiento
de MAMs por receptores transmembranales . Son producidos
principalmente por el hígado y en menor grado por células como
fagocitos. Estos MRRs son conocidos como proteínas de fase aguda.
27
Dentro de este grupo se encuentran: colectinas (como la lectina de
unión a manosa (MBL)40, la cuál es el único miembro de este grupo
que es capaz de activar al complemento, proteínas surfactantes A y D
(SP - A Y SP - D), pentraxinas (como la proteína C reactiva (PCR) y
el proteína amiloide sérica (SAP», transferasas de Iípidos (como la
proteína de unión a LPS (LBP), la proteína de incremento de la
permeabilidad (BPI), etc.) y las proteínas de reconocimiento de
peptidoglicano (PGRp·s)5.
c) Receptores de reconocimiento molecular (MRRs) anclados a la
membrana: Estos receptores se pueden encontrar tanto en la
membrana celular como en la membrana de endosomas.
• Receptores fagocíticos : Se expresan en la superficie de
macrófagos, neutrófilos y DCs y como su nombre lo indica ,
reconocen MAMs en la superficie de los mícroorqanismos" y
median la fagocitosis de los mismos, los cuales posteriormente,
son transportados a compart imentos lisosomales en donde
existen una gran cantidad de mecanismos disponibles para su
destruccíón'". En el caso de las DCs y los macrófagos, la
fagocitosis es seguida por el procesamiento de antígenos y su
presentación a linfocitos T en el contexto de moléculas del
MHC. Algunos integrantes de este grupo son: receptores
scavenger (SR's) como SR - A Y MARCO, miembros de la
familia de las lectinas tipo C42•43 , como el receptor de manosa
28
(MR) presente en los macrófagos y DEC20Sexpresado en OC,
y receptores de 13 - glucanos, como Dectin - 1.
• Receptores tipo Toll (TLRs): El término Tal! (Estupendo en
alemán) originalmente se refería a un receptor presente en la
superficie de la célula que dirigía la orientación dorso/ventral en
las larvas de Drosophila44 . Al final del siglo XX, el receptor Tal!
mostró ser esencial en la defensa de Drosophila contra la
infección por hongos y otros mlcroorqanlsrnos'". Al secuenc iar
el genoma de este insecto se encontraron nueve proteínas
pertenecientes a la familia Toll . En los 90s del siglo XX un
homólogo al receptor Tal! fue encontrado en mamíferos (TLR4)
y se observó que inducía la expresión de genes involucrados en
la respuesta inflamatoria. Debido a su similitud con los
receptores Tal! de Drosophila, se les dio el nombre de TLR
(siglas en inglés de Tal! - like receptorsj". Los TLRs de los
mamíferos comprenden una familia que consiste en al menos
11 miembros en humano y 13 en ratón". Los primeros 9 se
conservan entre el humano y el ratón, ya que se ha visto que el
TLR10, el cual presumiblemente es funcional en humano,
presenta una mutación en ratón que ocasiona que la secuencia
sea no productiva indicando que el TLR10 en ratón no es
funcional , por otra parte, el TLR11 de ratón es funcional
mientras que en humano la secuencia presenta un codón de
29
terminación que resulta en una carencia en la producción de
este TLR en humanos48,49.
Se ha observado la presencia de estos receptores en la
mayoría de las células del sistema inmune, tales como
macrófagos, células dendríticas, linfocitos T y linfocitos B.
La porción citoplasmática de los TLR muestra una gran
similitud al receptor de la familia de la IL - 1, por lo que se le
denomina dominio TIR (ToIIIIL - 1 receptor). A pesar de estas
similitudes la región extracelular es diferente : mientras que el
receptor para IL -1 contiene dominios parecidos a
inmunoglobulinas, los TLR presentan regiones ricas en leucinas
(LRRs)50. Funcionalmente, se ha demostrado una importante
participación de estos receptores en el reconocimiento de
componentes microbianos específicos derivados de patógenos
incluyendo hongos, parásitos, virus, bacterias y plantas.
30
dbcyl
lipopeptides
trlacyl
llpopoptides lIa ellln LPS
MD-2
TlR4
Fig. 2 Principales ligandos de los TLRs. (Imagen tomada de Takeda H.
and Akira S., Intemacionallmmunology 2005)
4. Microdominios lipídicos
La teoría del mosaico fluido de Singer - Nicholson acerca de la
organización de la membrana celular propone que su organización
consiste en una bicapa lipídica que funciona como un solvente neutral
de dos dimensiones la cual tiene poca influencia sobre la función de
las proteínas mernbranales'". Sin embargo, estudios más recientes
han demostrado que los Iípidos en la membrana celular se encuentran
en más de un estado: la líquida ordenada (Lo) y la líquida
31
desordenada (Ld). En el estado Ld toda la bicapa lipídica es fluida,
como en el modelo propuesto por Singer - Nicholson, mientras que en
la fase Lo, los fosfolípidos con cadenas de hidrocarbonos saturadas se
encuentran empacadas fuertemente por el colesterol. A estas regiones
se les conoce como microdominios lipldicos'".
Los microdominios lipídicos son regiones de la membrana
celular ricos en esfingolípidos, colesterol y glicolípidos, como el
glicoesfingolípido GMl 53,54, en las cuales se encuentran proteínas de
forma const itutiva como las proteínas ancladas a
glicosilfosfatidilinositol (GPI), cinasas de la familia Src, entre otras, yen
las que se asocian un gran número de receptores incluyendo TLRs y
MRRs fagocíticos, entre otras proteínas, después del reconocimiento
específico de un ligando por su receptors·56 . Además, después de
esta interacción ocurre la agregación de varios de estos microdominios
Iipídicos permitiendo la oligomerización de algunos receptores y la
interacción de diferentes proteínas con la finalidad de amplificar la
señal inicial induciendo la activación de la célula y de sus funciones
efectoras, y finalmente formando una plataforma en donde se
concentran todos los componentes necesarios para la presentación de
antígenos en el contexto de las moléculas del MHC a los linfocitos
5. Mecanismos de activación de la resistencia innata
a. Señalización intracelular a través del reconocimiento por
TLRs
Una vez que los MRRs han reconocido a sus ligandos se
desencadenan una serie de eventos hacia el interior de la célula
que culmina con la transcripción de ciertos genes como respuesta
hacia determinado estímulo.
En el caso de los TLRs, una vez reconocido su ligando, la
molécula adaptadora proteína de diferenciación mieloide (My088)
es reclutada hacia el dominio TIR donde facilita la asociación de
IRAK4 con el complejo anteriormente formado, a través de una
interacción homofílica entre dominios de muerte (DO). La unión de
My088 con IRAK4 facilita la fosforilación mediada por IRAK4 de
una serie de residuos cruciales en el asa de activación de la cinasa
IRAK1, lo cual activa a esta enzima. Una vez que se ha activado se
autofosforila en los residuos N - terminales y esta hiperfosforilación
permite la unión de TRAF6 a este complejo. Posteriormente el
complejo IRAK1 - TRAF6 se desacopla del resto e interactúa en la
membrana plasmática con un complejo preformado por las
proteínas TAK1, TAB1 Y TAB2 o TAB3. Esta interacción induce la
fosforilación de TAB2fTAB3 y TAK1, que posteriormente se
33
transloca hacia el citoplasma junto con TRAF6 y TAB1. TAK1 es
subsecuentemente activada en el citoplasma, promoviendo la
activación de (KKs59 que fosforilan las (KBs. Esta fosfori lación lleva
a la degradación de (KB ya la consecuente liberación de NF - KB.
La activación de TAK1 también resulta en la activación de las MAP
cinasas (MAPKs) incluyendo la cinasa N - Terminal de JUN
(JNK)4.4.50•60 .
La familia del factor de transcripción NF - KB induce la
expresión de muchos genes que desempeñan un papel crítico tanto
en la regulación de la respuesta inmune inflamatoria como en la
protección de las células de la apoptos is. Estos factores pueden
ser inducidos por una gran variedad de estímulos tales como:
proteínas proinflamatorias, LPS, RNA de cadena doble y sencilla ,
secuencias de DNA inmunoestimuladoras y toxinas, los cuales
están mediados por el reconocimiento a través de receptor y varios
factores de estrés como la radiación UV y el estrés oxidativo'", por
lo que el factor NF - KB inicia respuestas rápidas y coordinadas en
múltiples tipos celulares62.63.
b. Producción de citocinas
Las citocinas desempeñan un papel muy importante en la
comunicación intercelular de los organismos. Actúan en
34
concentraciones que van desde nanomolar a picomolar y dentro
sus funciones se encuentran regular la supervivencia celular , ·el
crecimiento, diferenciación y funciones efectoras de las células.
Son fundamentales en la regulación de la respuesta inmune y a
diferencia de las hormonas, las citocinas no son almacenadas en
glándulas como moléculas preformadas, pero son rápidamente
sintetizadas y secretadas por diferentes células después de una
estimulación64•65. Las citocinas actúan sobre diferentes células
blanco por lo cual se dice que su función es pleiotrópica , además
de que diferentes citocinas pueden causar el mismo efecto sobre
una célula blanco a lo que se le denomina redundancia.
Las citocinas son polipéptidos de bajo peso molecular las cuales
han sido clasificadas de acuerdo a tres criterios: 1) en base a su
actividad biológica en pro - y anti - inflamatorias, 2) de acuerdo al
tipo de receptor al que se unen y 3) de acuerdo a su estructura
trídímenslonal'".
Algunas de las citocinas pro - inflamatorias son la IL - 1B, IL-
607 , IL - 12p7068 Y TNF - alfa. Estas citocinas son producidas por
las células de la resistencia innata y pueden tener como blanco
tanto células de la resistencia innata como de la inmunidad
adaptañva'". Dentro de las funciones que desempeñanse
encuentran: la inducción de otras citocinas y quimiocinas, la
inducción de proteínas de fase aguda, la polarización de las células
35
T CD4+, la producción de anticuerpos, la proliferación celular, entre
otras7(}"72.
c. Expresión de moléculas coestimuladoras
La activación de los linfocitos T depende del reconocimiento
específico de péptidos antigénicos unidos a las moléculas del
MHC, presentes en la superficie de las células presentadoras de
antígeno, por parte del TCR. Sin embargo, esta unión es
insuficiente para activar al linfocito T y en cambio puede producir la
apoptosis de la célula o un estado de anergia.
La adecuada activación y proliferación de los linfocitos T
requiere, además de la interacción entre el TCR y el complejo de
las moléculas de MCH - péptido, de señales de coestimulación
proporcionadas por moléculas presentes en la superficie de las
células presentadoras de antígeno.
Actualmente se conocen un gran número de moléculas
coestimuladoras para los linfocitos T cuyas funciones pueden ser
distintas o sobrelaparse/". La señal de coestimulación es
proporcionada principalmente por las integrantes de tres familias: la
superfamilia de las moléculas CD80 y CD86 y el receptor CD28
(B7:CD28), la familia del factor de necrosis tumoral:receptor del
36
factor de necrosis tumoral (TNF:TNFR), la cual carece de dominios
de muerte, y la supertamilia CD2.
Familia B7:CD2874. - Son cruciales para la activación de los
linfocitos T, para la prevención de la tolerancia y para un adecuado
desarrollo de la inmunidad mediada por los linfocitos T. Estas
moléculas no solo proveen de señales positivas que estimulan el
crecimiento de los linfocitos T, también aumentan la producción de
citocinas y promueven la diferenciación de estas células. Sin
embargo, también envían señales negativas que limitan, terminan o
atenúan la respuesta de T. Son dos las moléculas pertenecientes a
esta familia CD80 y CD86 y sus receptores, presentes en los
linfocitos T, CD28 y CTLA- 4.
TNF:TNFR75•76._ La principal molécula coestimuladora
perteneciente a esta familia es CD40. Es expresada en una gran
variedad de células como linfocitos B, macrófagos, células
dendríticas, células epiteliales, fibroblastos. El ligando de CD40
(CD154) es expresada principalmente en linfocitos T CD4+
activados. Después de la unión de CD40 un gran número de vías
de señalización son activadas llevando a cambios en la expresión y
función de los genes. Éstos incluyen NF - KB, MAP cinasas,
proteínas TRAF, P13K Y la vía de señalización JAKlSTAT, las
cuales aumentan la expresión de otras moléculas coestimuladoras,
la producción de múltiples citocinas y quimiocinas y recientemente
37
se ha demostrado que la interacción de CD4ü con su receptor
promueve la producción de factores angiogénicos.
6. Mecanismos de activación de la inmunidad adaptativa
Una vez que los mecanismos de la resistencia innata se han
activado contribuyen a la generación de la respuesta inmune
adaptativa mediante la liberación de citocinas, la expresión de
moléculas coestimuladoras y la presentación de antígenos en el
contexto de las moléculas del MHC.
Los receptores de la inmunidad adaptativa reconocen
antígenos, los cuales se definieron como aquellas moléculas que
pueden ser reconocidas específicamente por anticuerpos". Cuando
estos antígenos cumplen con ciertas características como: alto peso
molecular, filogenéticamente distantes, cierta naturaleza química y
complejidad, entonces se dice que son inmunógenos los cuales se
definieron como aquellos antígenos que son capaces de despertar
una respuesta inmune en contra de los mismos. Existe otro tipo de
antígenos que no cumplen con las características anteriormente
mencionadas: los haptenos, los cuales tiene bajo peso molecular y
por ello no pueden despertar a la respuesta inmune, sin embargo, si
se conjugan estas moléculas a otras de mayor tamaño, adquieren
todas propiedades necesarias para ser inrnunóqenos'".
38
La inmunidad adaptativa puede dividirse en respuesta celular y
respuesta humoral. La respuesta inmune celular comprende a los
linfocitos T (LT) CD8+ y CD4+, los cuales son activados cuando los
las APCs (DCs, Linfocitos B(LB) y macrófagos) les presentan péptidos
en el contexto de las moléculas del complejo principal de
histocompatibilidad de clase I y de clase 11 (MHCI y MHCII)
respectivamente, las cuales son reconocidas a través del receptor del
linfocito T (TCR)79.80.
Los LT CD4+ reconocen a los antígenos exógenos que son
presentados en moléculas del MHC de clase 11, cuando esto ocurre,
los LT CD4+ se diferencian a subclases funcionales llamadas LT
cooperadores 1 (Th1) o LT cooperadores 2 (Th2)81.82. La diferencia
entre estas dos subclases radica en el perfi l de citocinas que
secretaran, siendo el interterón gamma (IFN-y) la citocina
característica para los Th1 mientras que la Interleucina 4 (IL-4) la
característica para los Th2.
Los LT CD8+ reconocen antígenos endógenos asociados a las
moléculas del MHC de clase 1. Están encargadas de destruir a las
células infectadas por parásitos intracelulares, función que realizan
por medio de la liberación de IFN-y y del factor de necrosis tumoral
alfa (TNF-a) o bien por un proceso citolítico directo. El IFN-y juega un
papel importante en el mecanismo de adyuvanticidad ya que
39
incrementa la capacidad fagocítica de las DCs y macrófagos así como
el aumento en la expresión de moléculas coestimuladoras.
La inmunidad humoral está mediada por los linfocitos S, los cuales
se activan mediante el reconocim iento del antígeno en su forma nativa
a través del receptor del linfocito S (SCR), acción que induce su
proliferación y diferenciación hacia célula plasmática la cuál esta
encargada de la producción de anticuerpos cuya especificidad es
idéntica a la del SCR. La primera inmunoglobulina que secretan es
IgM pero posteriormente las citocionas generadas por los LT
cooperadores83,84 promueven el cambio de isotipo con lo cual los
linfocitos S pueden producir diferente clases de anticuerpos los cuales
tienen diferentes funciones en la respuesta inmune, por ejemplo: los
anticuerpos IgG1 tienen la función de opsonizar y neutralizar, IgG2a e
IgG2b opsonizan y activan complemento e IgG3 concentra al
antígeno85,86.
40
Humano Ratón
Interleucina Subclase Interleucina Subclase
IL-1ü IgG1 IL-4 IgG1
. ? IgG2 IFN-y IgG2a(. .
IL-1ü IgG3 TGF-~ IgG2b
IL-4 + IL-13 IgG4 INF-y IgG3
IL-4 + IL-13 IgE IL-4 IgE
IL-1ü + TGF-~ IgA1 e IgA2 TGF-~, IL-4, IL-6 IgA
Tabla 1. Efecto de las citocinas sobre el cambio de isotipo en linfocitos B.
7. Contribución de los mecanismos de la resistencia innata en la
generación de la inmunidad adaptativa.
Como se ha mencionado anteriormente los mecanismos de la
resistencia innata, al ser activados mediante el reconocimiento de
MAMs por los MRRs, contribuyen a la generación de la respuesta
inmune adaptat iva cuyos receptores reconocen antígenos. Este
reciente conocimiento ha promovido el estudio de estos mecanismos
para que su entendimiento nos permita manipularlos y obtener como
resultado una respuesta inmune eficiente, protectora y de larga
duración, contra antígenos poco inmunogénicos.
41
a. Adyuvantes.
En 1916, Le Moigne y Pinol7 reportaron que las emulsiones
de aceites podían incrementar la respuesta inmune en contra de un
antígeno, y entre 1924 y 1926, Ramon88 descubrió que la
inflamación local causada por bacterias correlacionaba con el
incremento en el título de anticuerpos y acuñó el término adyuvante
para describir a toda aquella sustancia capaz de incrementar la
respuesta de anticuerpos en contra de un antíqeno",
Para que una sustancia pueda ser empleada como
adyuvante en humanos debe cumplir con requerimientos muy
estrictos, los cuales muy pocas veces pueden ser cumplidos,
limitando así la disponibil idad de adyuvantes adecuados. Entre los
requisitos que un adyuvante tiene que cumplir para ser de uso
humano se encuentran los siquientes"No debe ser tóxico o tener efectos secundarios en el rango
de dosis en el que se presenta el efecto adyuvante.
Debe estimular una fuerte respuesta humoral ylo celular.
Proveer de una buena memoria inmunológica o provocar
inmunidad de larga duración.
No debe inducir autoinmunidad.
No debe ser mutagénico, carcinogénico, teratogénico o
pirogénico.
42
Debe ser estable en rangos amplios de tiempo de
almacenamiento, temperatura, y pH.
Actualmente sólo existen dos adyuvantes que pueden ser
utilizados en humanos: las sales de alumino y magnesio y la
microemulsión MF59, que exitosamente se introdujo en el mercado
europeo en 1997 para ser coadministrada con una vacuna contra la
Influenza9,B9-91.
En la actualidad un adyuvante puede ser definido como los
diversos componentes que mezclados y coadministrados con las
determinantes antigénicas, ayuden a potenciar la respuesta inmune
específica del antígeno in viv06,92,93 .
Normalmente se espera que un adyuvante promueva la
generación de una respuesta inmune aumentada y de larga
duración, sin embargo, en la actualidad un buen adyuvante no
debe cumplir solamente con la parte cuantitativa sino que también
se exige que induzca la mejor respuesta biológica posible'".
Se ha visto que los adyuvantes actúan a nivel de la
resistencia innata ya que inducen un incremento en la activación de
sus componentes celulares al ser reconocidos por los MRRs
presentes tanto en su superficie como en el interior de la célula".
Sin embargo, el efecto adyuvante ejercido por la alúmina no se
debe a su reconocimiento por MRRs si no por su capacidad de
43
formar depósitos en el sitio de la administración en donde se
concentra al antígeno y permite que su liberación sea lenta95.
Estos mecanismos originan una mejor respuesta por parte
de la respuesta inmune adaptativa, ya que como se ha mencionado
anteriormente, ésta es modulada por la resistencia innata.
b. Virus vegetales: una alternativa para el desarrollo de
vacunas
Los virus vegetales han sido considerados recientemente
como sistemas atractivos para la expresión y presentación de
proteínas que pueden ser utilizados para el desarrollo de nuevas
estrategias de vacunación, al igual que su uso como
adyuvantes11,96.
Se ha demostrado que los virus vegetales pueden ser
efectivas herramientas para la producción y presentación de
antígenos ya que el estudio cada vez más profundo de la biología
molecular de estos virus ha dado la pauta para utilizarlos como
sistemas de expresión de antígenos, lo cual ofrecería grandes
ventajas ya que, en general, los virus de plantas no son patógenos
para humanos y otros animales. Las proteínas de la cápside (CP)
de los virus de plantas son particularmente buenas acarreadoras
para presentar péptidos al sistema inmune. Cuando las secuencias
44
de la proteína de interés son fusionadas adecuadamente, las
secuencias exógenas son expresadas en plantas originando CP
virales recombinantes (CVP) capaces de autoensamblarse y
generar partículas virales quiméricas expresando en su superficie
la secuencia exógena.
El virus de mosaico del tabaco (TMV)14, el virus de mosaico
de la alfalfa (AIMV)15, el virus de mosaico del ejote (CMV)97,98 y el
virus del arbusto de tomate (CPMV)99, han sido utilizados para
expresar determinantes antigénicos de diferentes patógenos tanto
de humanos como de animales, incluso se ha demostrado que al
inmunizar ratones con algunos de estos CVP, se puede conferir
protección contra los patógenos cuyos determinantes antigénicos
fueron expresados en los virus de plantas19.
8. Modelo experimental: virus de mosaico de la papaya (PapMV).
El virus de mosaico de la papaya (PapMV) es un virus vegetal
filamentoso no envuelto, que pertenece a la familia de los Potexvirus,
cuyas dimensiones son aproximadamente de 5000 Á de largo y 140 Á
de diámetro1OO. La cápside de las partículas vira les está compuesta por
1200 copias de una única proteína dispuesta de manera organizada y
altamente repetitiva formando un arreglo paracristalino, ya que
mediante microscopía electrónica se ha observado que la partícula
45
A
intacta es helicoidal, en donde cada 4 vueltas (a una distancia de 133
Á)101 se encuentran aproximadamente 35 copias de la proteína de la
cápside. Las partículas virales contienen una sola cadena de RNA de
polaridad positiva102,103.
El PapMV se propaga en la planta Cariea papaya y se obtiene,
después de un proceso de purificación muy sencillo, en mucho
mayores cantidades en comparación con otros virus como el TMV, ya
que en una hectárea de papayas infectadas se puede extraer 1kg de
PapMV104-106 .
8
Fig. 3 En el panel A se muestran las lesiones causadas a las hojas de Cariea
papaya por el PapMV. El panel B es una micrografía del PapMV.
46
111. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En el laboratorio hemos observado que el PapMV es un excelente
inmunógeno y adjuvante ya que la administración en ratones de una sola
dosis de este virus en ausencia de adyuvantes, es capaz de inducir una
respuesta inmune humoral que se mantiene a lo largo de por lo menos un
año posterior a la inmunización, caracterizada por altos títulos de
anticuerpos de todos las subclases de IgG, y al administrarlo junto con
otros antígenos como OVA y porinas de Salmonella enterica serovar
Typhi, se obtienen títulos de anticuerpos más altos que los producidos por
los antígenos solos.
Sin embargo, no se conocen los mecanismos de la resistencia
innata activados por este virus y su contr ibución en la inmunogenicidad
del virus , por lo que este trabajo tiene como finalidad el estudio de los
mecanismos de la resistencia innata que nos ayuden a entender la
inmunogenicidad y capacidad adyuvante del PapMV
IV. HIPÓTESIS
El PapMV activará a las células de la respuesta inmune innata
como macrófagos y células dendríticas induciendo la producción de
citocinas proinflamatorias y la expresión de moléculas coestimuladoras.
47
V. OBJETIVOS
Objetivo general
Estudiar los mecanismos de la resistencia innata inducidos por el
PapMV.
Objetivos particulares
a) Determinar si el PapMV es reconocido por macrófagos derivados de
monocitos de médula ósea de ratones BALB/c.
b) Evaluar si el PapMV es capaz de activar a macrófagos derivados de
monocitos de médula ósea de ratones BALB/c y a macrófagos
derivados de monocitos de sangre periférica humana.
e) Observar el efecto del PapMV sobre la maduración de células
dendríticas y activación de macrófagos de ratones BALB/c in vivo.
d) Determinar si los macrófagos derivados de monocitos de médula ósea
de ratones BALB/c contribuyen a la generación de la respuesta
inmune humoral contra el PapMV.
48
VI. MATERIALES Y MÉTODOS
1. Obtención de monocitos de médula ósea de ratón y su
diferenciación a macrófagos.
Los ratones de la cepa BALB/c entre seis y ocho semanas de edad
proporcionados por el bioterio de la Unidad de Medicina Experimental de la
Facultad de Medicina de la UNAM localizado dentro de las instalaciones del
Hospital General de México, se sacrificaron mediante dislocación cervical y
se fijaron a una plantilla para ratón. Se extrajeron ambos fémur y se
colocaron en un tubo con PBS. En la campana de seguridad biológica se
lavaron los fémur con alcohol al 70% durante 10 segundos y posteriormente
3 veces con PBS. Se cortaron los extremos del fémur dejando un canal
para eluír la médula ósea empleando 5 mL de medía DMEM (ver Anexo)
suplementado. El eluido se colectó en tubos cónicos estériles de 15 mL y
se centrifugó a 1100rpm/1min.l4°C. El sobrenadante de cada tubo se
transfirió a otro tubo cónico estéril y se centrifugaron a 1100rpm/1O
min.l4°C. Se desechó el sobrenadante, se colectaron los botones de los
tubos en uno solo y se resuspendió en un volumen final de 6mL con medio
de Médula ósea (ver Anexo). Se colocó 1 mL de la suspensión celular en
cajas para cultivo celular de baja adherencia y se completó a un volumen
final de 20mL con medio de médula ósea. Las cajas se incubaron a 3rC
con5% de COz durante 6 días.
49
Al tercer día se agregó a cada caja 5 mL de medio de médula ósea.
Al sexto día se desechó el medio de las cajas y se lavaron 2 veces con 10
mL de PBS frío y se dejaron en hielo con 10 mL de PBS. Se despegaron
las células y las suspensiones se colocaron en tubos cónicos estér iles de
15 mL los cuales se centrifugaron a 1100rpm/10 min.l4°C. Se desechó el
sobrenadante, se colectaron todos los botones en un solo tubo y se
resuspendió en DMEM suplementado a un volumen conocido. Se obtuvo
el número de células en el hematocitómetro asegurándose que más del
80% del cultivo se encontrara viable. Para obtener el número de células
por mL se empleó la siguiente fórmula:
No. de células X Dilución X 104 =No. de células / mL
Se colocó en una placa de 6 pozos la cantidad necesaria de
suspensión de células para que en cada uno de ellos hubieran 1 x106
células y se completó el volumen en cada pozo a 2mL con DMEM
suplementado. Se incubó toda la noche antes del experimento a 370 C en
atmósfera de 5% de C02.
50
2. Evaluación de la agregación de microdominios lipídicos por el
PapMV.
Se obtuvieron macrófagos derivados de monocitos de médula ósea
de ratón. Posteriormente se colocaron 1x105 células en portaobjetos
circulares estériles, incubándolas toda la noche a 37° C en atmósfera de
5% de COz.
Las células fueron estimuladas 30 minutos con 11lg/mL de PapMV
obtenido y purificado en el Centro de Investigación en Infectología de la
Universidad l.aval. Québec, Canadá.
Posteriormente se fijaron con paraformaldeh ido 1% Y después de
lavadas, se agregó CTB-FITC (1:500) y se incubó 2 horas a temperatura
ambiente y en la oscuridad. Antes de agregar el anticuerpo anti-PapMV se
bloquearon los sitios de unión inespecífica con suero de chivo (1:100)
incubando 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar se adicionó
el anticuerpo anti-PapMV rata (1:100) y se incubó toda la noche a 4°C.
Como anticuerpo secundario de empleó anti-lgG ·de rata marcado con
ficoeritrina (1:500) y se incubó una hora a temperatura ambiente. Se
realizó la observación al microscopio de fluorescencia.
51
3. Obtención de monocitos de sangre periférica humana y su
diferenciación a macrófagos.
En la campana de seguridad biológica , a partir de una bolsa de
concentrado leucocitario proporcionada por el Banco de Sangre del
Centro Médico Nacional Siglo XXI, se tomaron 50 mL y se diluyeron 1:4
en PBS estéril a temperatura ambiente. En tubos cónicos de 50 mL se
colocaron 15 mL de Lymphoprep. se estratificaron 30 mL de la sangre
diluida y se centrifugaron a 2000 rpm/30 min.ltemperatura ambiente.
Posteriormente se retiró la capa superior (suero) y se recolectó la
monocapa de células mononucleares la cual se transfirió a tubos cónicos
de 15 mL que se centrifugaron a 1000 rpm/10 min.l4° C. Las células se
lavaron con PBS hasta obtener un sobrenadante translucido . Durante el
último lavado se centrífugo a 700 rpm.
Después de decantar el sobrenadante se resuspendió el botón en
RPMI suplementado + 2% de suero autólogo + 0.16 !!UmL de GM-CSF y
se agregó 1 mL de la suspensión en cajas de cultivo celular de baja
adherencia completando el volumen a 25 mL con RPMI suplementado (ver
Anexo). Se incubó a 37° C en atmósfera de 5% de C02 por 6 días y al
tercer día se lavaron las células con 2 veces con PBS frío y finalmente se
agregaron 25 mL RPMI suplementado + 2% de suero autólogo + 0.16
!!UmL de GM-CSF.
52
Para despegar las células diferenciadas se lavó suavemente con
PBS a temperatura ambiente y se adicionó a cada caja 10 mL de PBS +
EDTA 0.5 mM y se incubó a 37° C en atmósfera de 5% de C02 por 20 mino
Se colectaron las suspensiones en tubos cónicos de 15 mL y se
centrifugaron a 1000 rpm/10 min.l4°C. Se lavaron las células tres veces con
PBS frío y se centrifugaron a 1000 rpm/10 min.l4° C.
Se resuspendieron las células en RPMI suplementado a un
volumen conocido y se obtuvo el número de células en el
hematocitómetro asegurándose que más del 80% del cultivo se
encontrara viable. Para obtener el número de células por mL se empleó la
siguiente fórmula:
No. de células X Dilución X 104 =No. de células / mL
Se colocó en una placa de 6 pozos la cantidad necesaria de
suspensión de macrófagos para que en cada uno de ellos hubieran 1 x106
células y se completó el volumen en cada pozo a 300¡.tL con RPMI
suplementado. Se incubó toda la noche antes del experimento a 37° C en
atmósfera de 5% de C02.
53
4. Estimulación de los macrófagos de humano y de ratón con el
PapMV.
Una vez obtenidos los macrófagos de humano y de ratón y fueron
colocados en placas de 6 pozos, se agregaron los siguientes estímulos:
1Jlg/mL, 0.1Jlg/mL y 0.01Jlg/mL de PapMV, 100 ng/mL LPS E co/i como
control positivo y medio de cultivo RPMI suplementado como control
negativo. Se incubaron las células a 37°C y 5% CO2. Se recolectaron los
sobrenadantes a las 3, 6, 12 Y 24 horas y se centrifugaron a
2000rpm/5min.l4°C . Se hicieron alícuotas de los sobrenadantes que se
almacenaron en tubos eppendorff a -70°C hasta su análisis.
5. Cuantificación de citocinas pro-inflamatorias de humano y de ratón
por el método de ELl5A.
Las condiciones específicas señaladas por el proveedor para la
determinación de cada una de las citocinas se muestran en la tabla 2.
Los kits utilizados fueron los siguientes:
o MS TNF mono/mono OptEIA Set 20TST No. cat. 555268
o HU TNF OptEIA Set 20TST No. cat. 555212
o MS IL - 6 OptEIA Set 20TST No. cat. 555240
o HU IL - 6 OptEIA Set 20TST No. cat. 555220
o MS IL - 12 P70 OptElA Set 20TST No. cat. 555256
54
o HU IL - 12 P70 OptElA Set 20TST No. cal. 555183
Las placas para ELlSA de 96 pozos se fijaron adicionando 1OO~L
por pozo del Ab de captura diluido en solución de cubrimiento y se
incubaron toda la noche a 4°C. Después se lavaron 3 veces con 300~L de
solución de lavado. Posteriormente se bloquearon las placas adicionando
a cada pozo 200~L de solución de ensayo y se incubaron durante 1 hora
a temperatura ambiente.
Se lavaron las placas 3 veces con 300~L de solución de lavado y
luego se adicionaron 1OO~L tanto de la curva estándar como de las
muestras en su pozo correspondiente y se incubaron durante 2 horas a
temperatura ambiente.
Para preparar la curva estándar se agregó la cantidad necesaria de
citocina recombinante para obtener la concentración más alta indicada por
el proveedor a 1mL de solución de ensayo. A partir de esta solución se
hicieron diluciones seriadas 1:2 hasta completar el rango de valores de
concentración establecido.
Después de la incubación las placas se lavaron 5 veces con 300~L
de solución de lavado y posteriormente se agregaron a cada pozo 1OO~L
de solución de detección (Ab de detección biotinilado + reactivo Avidina-
HRP) y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente.
Al finalizar el tiempo de incubación las placas se lavaron 7 veces
con 300~L de solución de lavado, se adicionaron 1OO~L de solución de
TMB (Sigma No. cal. T - 8665) Y se incubó durante 30 mino en oscuridad.
55
Para detener la reacción se agregó a cada pozo 50¡.tL de H2S0 4 2 N Y
posteriormente se determinó la densidad óptica en el lector de ELlSA
(Lector para placas de ELlSA Dynex Technologies Modelo MRXII) a una
longitud de onda de 450nm.
56
Solución de Dilución Ab Límites de la Dilución Ab Dilución de la
cubrimiento de captura curva estándar de detección enzima (HRP)
Carbonato
TNF-a. de sodio pH 1:250 500 - 7.8 1:250 1:250
=9.5 pg/mL
Carbonato
o
c::
IL-6 de sodio pH 1:250 300 -4.7 1:250 1:250ro
E
::J
J: =9.5 pg/mL
Carbonato
IL-12 de sodio pH 1:250 500-7.8 1:250 1:250
p70 =9.5 pgmL
Fosfato de
TNF-a. sodio pH = 1:25 1000 -15.6 1:500 1:250
6.5 pg/mL
Carbonato
c::
IL-6 de sodio pH 1:250 1000-15.6 1:500 1:250-o-roc::: =9.5 pg/mL
Fosfato de
IL-12 sodio pH = 1:125 4000-62.5 1:250 1:125
p70 6.5 pg/mL
Tabla 2. Especificaciones del proveedor para la cuantificación de citocinas de
humano y de ratón.
57
6. Estudio de la maduración de célulasdendriticas y la activación de
macrófagos de ratón BALBJc in vivo inducida por el PapMV.
Ratón Antígeno Cantidad Tiempo
1 PapMV 30119 72
2 PapMV 30119 48
3 PapMV 30119 24
4 PapMV 30119 12
5 Poly I:C 50119 48
6 Poly I:C 50119 24
7 Poly I:C 50119 12
8 SSI - -
Tabla 3. Antígenos y tiempos para la inmunización de ratones hembras
BALBJcde 7 semanas de edad.
Cumplido el tiempo correspondiente, se sacrificaron a los ratones
BALBJc libres de patógenos específicos (SPF) entre seis y ocho semanas
de edad adquiridos en Harlan México por dislocación cervical. Se extrajeron
los ganglios popitleos, inguinales, braquiales y axilares en ese orden y
posteriormente el bazo. Los órganos se colocaron en 4.5 mL de solución
balanceada de Hanks y se adicionó 0.5 mL de colagenasa D (0.5 UJmL).
Con la ayuda de una aguja (25Gx16mm) se perfundió el bazo con la
solución balanceada de Hanks y los ganglios se disgregaron con la ayuda
58
de una aguja del mismo calibre . Se incubaron a 3rC/5% C02/20minutos.
Se adicionaron 100J.1L de EDTA 0.5M.
Con la ayuda de una pipeta Pasteur se terminó de disgregar el
tejido y se filtró la suspensión celular con la ayuda de tela de organza,
colocando las células en tubos cónicos de 15 mL. Se completó el volumen
a 13 mL con PBS-SFB 2%. Se centrífugo a 1500 rpm/10minutos/4°C. Las
células de ganglio se resuspendieron en 500¡.tL de PBS-SFB 2%
De la suspensión de células de bazo se lisaron los eritrocitos (3 mL
de buffer de lisis, 3 minutos a 3rC, y se centrifugó 1500rpml5min/4°C).
Se lavaron 2 veces con PBS-SFB 2% y resuspendieron en 1 mL de PBS-
SFB 2%. Se plaquearon las células de bazo (100J.1L por pozo) y las de
ganglio (100J.1L por pozo). Se centrifugaron a 2000rpm/3minutos/4°C. Se
decantó el sobrenadante, y se resuspendieron las células . Se bloqueó con
FCS 2% en PBS-SFB 2%, adicionando 100J.1L por pozo. Se incubó por 15
minutos a 4°C. Posteriormente se centrifugó a 2000rpm/3minutos/4°C. Se
decantó el sobrenadante y se resuspendieron las células . Se agregaron
los anticuerpos:
A todos los pozos se les agregó anti-CD11c PE (1:100) yanti-
CD11b APC (1:200). Excepto a un pozo de los controles al cual no se le
agregará ningún anticuerpo. Anti-CD80, anti-CD86, anti-CD69(1 :100) y
anti-MHCII FITC (1:10 000). La dilución de los anticuerpos se hizo en
PBS-SFB 2%-azida de sodio 0.01%. Se incubó 30 minutos a 4°C. Se
realizaron 2 lavados con solución PBS-SFB 2%-azida de sodio 0.01% Y
59
un lavado con PBS. Se resuspendieron las células en paraformaldehído
4% en PBS-SFB 2%. Se Incubó 20 minutos a temperatura ambiente y
posteriormente se centrífugo a 2000rpm/3min/4°C. Se lavó 2 veces con
solución PBS-SFB 2%-azida de sodio 0.01% Y se resuspendió en 150J.1L
en solución PBS-SFB 2%-azida de sodio 0.01%. Se conservaron a 4°C
hasta su análisis por citometría de flujo.
7. Contribución de los macrófagos en la generación de la respuesta
inmune humoral contra al PapMV.
Se obtuvieron macrófagos derivadas de monocitos de médula ósea
de ratones BALB/c entre seis y ocho semanas de edad proporcionados
por el bioterio de la Unidad de Medicina Experimental de la Facultad de
Medicina, de la UNAM localizado dentro de las instalaciones del Hospital
General de México, los cuales fueron estimulados con PapMV (30J.1g)
durante 3 horas. Las células estimuladas se lavaron cuatro veces con
PBS + 2% SFB. Posteriormente fueron administradas en diferente
cantidad (104, 105, 106 células por ratón) por vía intravenosa a ratones de
la misma cepa. Como controles se administraron PapMV (30J.1g) solo, el
primer sobrenadante , el sobrenadante del último lavado y células sin
estimular. En los días señalados en la figura 5 se tomaron muestras
sanguíneas con el fin de evaluar la participación de las células de la
resistencia innata en la generación de anticuerpos anti-PapMV.
60
8. Determinación del título de anticuerpos anti - PapMV.
Las placas para ELlSA de 96 pozos se fijaron adicionando 100¡.JL
de solución reguladora de carbonatos más el antígeno por pozo (0.1 Ilg
PapMV/pozo) . Las placas fueron incubadas 1 hora a 37°C y durante toda
la noche a 4°C. Después se lavaron cuatro veces con solución de lavado.
Posteriormente se bloquearon las placas adicionando a cada pozo
100¡.JL de solución de bloqueo. Se incubaron una hora a 37°C y se lavaron
cuatro veces con solución de lavado.
Los sueros a analizar se diluyeron 1:40 en factor de 2 con solución
de bloqueo. Los sueros se transfirieron cuantitativamente y en el orden
correspondiente a la placa de ELlSA previamente sensibilizada. Se
incubaron 1 hora a 37°C y al término de ese tiempo se lavaron cuatro
veces con solución de lavado.
Se agregaron 100¡.JL del anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón
correspondiente marcado con peroxidasa de rábano (HRP) diluido 1:1000
en solución de bloqueo. La incubación de las placas se realizó a 37°C
durante 1 hora, posteriormente se lavaron cuatro veces con solución de
lavado .
El revelado de las placas se realizó adicionando 100¡.JL de solución
de revelado (0.5mg/ml de o-fenilendiamina en CBS y H202) a cada pozo.
Se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente 15 minutos y la
reacción se detuvo con 10¡.JL de H2S042.5N por pozo.
61
La densidad óptica fue determinada a una longitud de onda de
490nm en un lector de ELl8A (Lector para placas de ELl8A Dynex
Technolog ies Modelo MRXII). Los resultados se graficaron como título de
anticuerpos (-1092 x 40) vs tiempo . La preparación de las soluciones
empleadas se detalla en los anexos.
62
VII. RESULTADOS
• El PapMV induce la agregación de microdominios Iipidicos en
macrófagos derivados de monocitos de médula ósea de ratones
BALB/c:
Con el fin de determinar si el PapMV es reconocido por
macrófagos se decidió estudiar la agregación de microdominios
lipídicos, ya que esta ocurre cuando se lleva a cabo el reconocimiento
de un ligando por su receptor, permitiendo y amplificando la
señalización intracelular, provocando múltiples efectos en la célula
blanco .
Los macrófagos derivados de monocitos de médula ósea de
ratones BALB/c se estimularon durante 30 mino con 1 Ilg/mL de
PapMV y posteriormente se tiñeron con la subunidad B de la toxina del
cólera (CTB) conjugada con FITC, la cual se une específicamente al
glicolípido GMl constitutivo de los microdominios lipídicos, y con un
anticuerpo de rata anti - PapMV conjugado con PE.
Como se muestra en la Fig. 4, los macrófagos tienen un nivel
basal de agregación de microdominios lipídicos ya que en las células
sin estimular se observan regiones con fluorescencia verde
correspondiente a FITC (panel B - 11) Yse demuestra que no hay unión
inespecífica del anticuerpo anti - rata ya que no se observa
63
fluorescencia de la PE (panel B - 111). Sin embargo en presencia del
estímulo (PapMV) se observa un incremento en la agregación de
microdominios lipídicos y se comprueba la presencia del virus ya que
se observa fluorescencia de la PE (panel A - 11 YA - 111).
Estos resultados muestran que el PapMV induce la agregación
de microdominios lipídicos en macrófagos derivados de monocitos de
médula ósea de ratones BALB/c, lo que indica que es reconocido por
las mismas.
11 111
A
B
Ag. 4 El PapMV induce la agregación de microdominios lipídicos. En el panel A
se muestran macrófagos derivados de monocitos de médula 6sea de ratones
BALBlc que fueron estimulados con PapMV a una concentración final de 1~glmL
durante 30 minutos. En el panel B se muestran macr6fagos sin estimulo. El panel I
muestran macr6fagos sin teñir. En el panel 11 se observan los microdominios
Iipidicos teñidos con CTB - FITC. En el panel 111 se observa el PapMV marcado con
PE. Las células se fijaron con parafonnaldehido 1% durante 20 minutos a 4°C.
64
• El PapMV es capaz de activar a macrófagos derivados de
monocitos de médula ósea de ratones BALB/c y a macrófagos
derivados de monocitos de sangre periférica humana:
Existen muchas maneras de saber si una célula se activa en
presencia deun estímulo, una de ellas es la detección de citocinas
producidas por la célula blanco. Las citocinas son una de las primeras
respuestas a un antígeno y son uno de los componentes encargados
de la comunicación intercelular que permiten la activación del sistema
inmune.
Los macrófagos derivados de monocitos de médula ósea de
ratones BALB/c se estimularon con diferentes dos is de PapMV y se
recolectaron los sobrenadantes de cultivo a los diferentes tiempos
indicados en la Fig. 5. Posteriormente se realizó la determinación de la
concentración de diferentes citocinas mediante una ELlSA de captura.
Como control positivo del experimento se utilizó LPS de E. coli
(100ng/mL) el cual se sabe que es reconocido por TLR4, lo que induce
la producción de diferentes citocinas.
Como se muestra en la Fig. 5 el PapMV activó a los macrófagos
derivados de monocitos de médula ósea de ratones BALB/c con la
concentración más alta utilizada del virus (1¡.tg/mL) , ya que se observa
la producción de citocinas pro - inflamatorias tales como TNF - a, IL-
12 p70 e IL - 6., siendo ésta última la que se detectó en mayor
65
cantidad al igual que con el LPS de E. coli, sin embargo se observa
que con este último estímulo la producción de IL - 6 llega a su
concentración más alta a las 24h y se mantiene hasta las 72h,
mientras que con PapMV el pico de concentración se alcanza a las
48h y posteriormente cae.
En cuanto a la IL - 12 p70, ambos estímulos muestran la misma
cinética de producción alcanzando la concentración más alta a las 12h
y cayendo a la misma concentración a las 24h, sin embargo, se
observa que el PapMV produce aproximadamente la mitad de IL - 12
p70 que el LPS de E. coli.
Por último, en cuanto a la producción de TNF - a se observa
que las cinéticas son diferentes ya que mientras que con el LPS de E.
coli se alcanza la concentración más alta a las 6h y posteriormente
cae, con el PapMV se observa que la concentración aumenta hasta las
24h.
Estos resultados indican que el PapMV es capaz de activar a
macrófagos derivados de monocitos de médula ósea de ratones
BALB/c.
66
100 400
80 :::¡ 300:::r E
E -Cñ 60 el
..!: .e: 200
~ 40
N....u.. I
Z ...J 1001-
20
O
4 8 12 16 20 24 28 O 4 8 12 16 20 24 28
800
:r 600
E
i3l
a.
~400
<D
:::!
200
8 16 24 32 40 48 56 64 72
Tiempo (h)
___ PapMV (1.0 Il9!mL)
--.- PapMV (0.1Il9!mL)
...- PapMV (0.01 l!9/mL)
--+- LPS E. coli (100nglmL)
--'-Medio
Fig. 5 El PapMV activa a macrófagos de ratón. En la figura se muestra la
producción de citocinas proinflamatorias por macrófagos de ratón derivados de
monocitos obtenidos de médula ósea estimulados con diferentes concentraciones
de PapMV. A los tiempos indicados se tomaron los sobrenadantes de las células
estimuladas y la determinación de las citocinas se realizó por el método ELtSA de
acuerdo a las indicaciones del proveedor.
67
Después que observamos que el PapMV activa a macrófagos
derivados de monocitos de médula ósea de ratones BALB/c,
decidimos averiguar si este efecto se repetía en otro sistema: en
macrófagos derivados de monocitos de sangre periférica humana, lo
cual nos indicaría que nuestros resultados son consistentes ya que se
repiten en diferentes especies.
La estrategia experimental fue la misma solo que las células se
obtuvieron de acuerdo al protocolo del punto 3 de materiales y
métodos, las dosis de PapMV probadas, la determinación de la
concentración de las citocinas y el control positivo utilizado fueron los
mismos.
Los resultados obtenidos se muestran en la Fig. 6 en donde se
observa que los macrófagos si se activan al ser estimulados con la
concentración más alta de PapMV (1~g/mL) al igual que en ratón, sin
embargo solo se detectó la producción de TNF - a. en concentraciones
mucho mayores a las alcanzadas en ratón, con una cinética de
producción similar a la observada con el LPS de E. coli pero en
concentraciones menores.
Estos resultados indican que el PapMV es capaz de activar a
células de la resistencia innata de diferentes especies, sin embargo el
tipo de citocinas producidas es diferente entre ellas lo que indicaría
que el reconocimiento y los mecanismos de señalización inducidos por
el virus del es diferente entre estas especies.
68
2000 1.00
::J
::J' 1600 E 0.75-E C)
~ 1200
Q.
O 0.50
e .....
800 Q.
u.. N
Z ..- 0.25
1- 400
..J
0.00
4 8 12 16 20 24 28 O 4 8 12 16 20 24 28
1250
___ PapMV (1.0 ¡¡g/mL)
1000 .....- PapMV (0.1¡¡g/mL)
:::i -+ PapMV (0.01 ¡¡g/ni.)Ea 750 --+- LPS E. colí (100 ng/mL)
Q.
-.-Medio
CD 500
::!
250
O
O 4 8 12 16 20 24 28
Tiempo (h)
Fig. 6 El PapMV activa a macrófagos de humano. En la figura se muestra la
producción de citocinas proinflamatorias por macrófagos de humano derivados de
sangre periférica estimulados con diferentes concentraciones de PapMV. A los
tiempos indicados se tomaron los sobrenadantes de las células estimuladas y la
determinación de las citocinas se realizó por el método ELl8A de acuerdo a las
indicaciones del proveedor.
69
• El PapMV promueve la maduración de células dendríticas de
ratones BALBte in vivo.
Una vez comprobado que el PapMV activa a macrófagos
derivados de monocitos de médula ósea de ratones BALBtc in vitro se
decidió investigar si este fenómeno se observaba in vivo,
En esta ocasión utilizamos como indicadores de activación al
aumento en la expresión de moléculas coestimuladoras y moléculas
del complejo principal de histocompatibilidad clase 11 (MHC - 11), la cual
ocurre en presencia de algún estímulo. Estas moléculas permiten una
activación adecuada de los linfocitos T CD4+, siendo un vínculo entre
la resistencia innata y la inmunidad adaptativa
El experimento consistió en inmunizar vía ip ratones hembra
BALBtc (SPF) adquiridos en Harlan México, con 30119 de PapMV.
Posteriormente se sacrificaron en los tiempos señalados en el punto
número 6 de materiales y métodos, se obtuvieron las células de los
ganglios y el bazo y se realizaron diferentes tinciones para detectar a
las moléculas coestimuladoras y del MHC - 11 Y para los marcadores
del tipo celular. Como control positivo se utilizaron 50119 de Poly I:C,
un ligando de TLR3107 que se sabe que induce la maduración de
células dendríticas, es decir, provoca un aumento en la expresión de
moléculas coestimuladoras y del MHC - 11.
70
En la Fig. 7 se muestran los resultados positivos que obtuvimos
en el experimento, los cuales corresponden a un tipo de células
dendríticas con el fenotipo CD11c+CD11b-. Se observa que el
incremento de moléculas de MHC - 11 solo ocurre en el ganglio a
tiempos tardíos (72h) mientras que la expresión de CD40, que también
ocurre en el ganglio, se observa a las 24h de la inmunización . En el
bazo solo se observó el incremento de CDaO a las 24h. El incremento
de CD40 en ganglio y de CDaO en el bazo provocados por el PapMV
son muy similares a los inducidos por la Poly I:C, desafortunadamente
no se puede comprobar si existe similitud en la expresión de moléculas
de MHC - 11 debido a que al tiempo al que se observó el incremento
inducido por el PapMV no se consideró al control positivo por falta de
reactivo.
No se observó ningún cambio en la expresión de las moléculas
estudiadas en macrófagos o en células dendríticas de diferente
fenotipo.
Estos resultados indican que el PapMV es capaz de inducir la
maduración de células dendríticas in vivo.
71
Bazo
SSI
• PapMV
Polyl:C
Inmunización via ip con SSI,
PapMV o Poly I:C
Sacrificio a las 12, 24, 48 Y 72h
Ganglios
CD11c+ CD11c+ CD11c+
CD11b+
CD11c+
CD11b-
CD11c-
CD11b+
CD80
MHcn
CD40
CD86
CD69
Fig. 8 Protocolo para la detenninación de la maduración de células
dendriticas y activación de macrófagos. Los resultados obtenidos corresponden
a las 24h. CD11c+: células dendñticas totales, CD11c+CD11b+: células dendñticas
dobles positivas , CD11c+CD11b-: todas las células dendñticas excepto las dobles
positivas, CD11c-CD11b+: macrófagos.
72
A C040Ganglio 24h
C011c+C011b-
B HC-UGanglio 72h
C011c+C011b-
e