Estudio-sobre-la-capacidad-de-la-planta-acuatica-Lemna-gibba-para-la-detoxificacion-del-4nitrofenol-en-condiciones-de-laboratorio

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA 
DE MEXICO 
PROGRAMA DE MAESTRIA y DOCTORADO 
EN CIENCIAS BIOaUIMICAS 
ESTUDIO SOBRE LA CAPACIDAD DE LA PLANTA 
ACUATICA LEMNA GIBBA PARA LA DETOXIFICACION 
DEL 4-NITROFENOL EN CONDICIONES DE 
LABORATORIO 
T E S I S 
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE 
MAESTRA EN CIENCIAS 
(BIOQUIMICAS) 
PRESENTA 
Q.F.B. AlOA SOTO HERNANDEZ 
TUTOR, DR. MANUEL JIMENEZ ESTRADA 
MEXICO, D. F. MAYO 2007 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
RECONOCIMIENTOS 
Esta tesis se realizó bajo la dirección del Dr. Manuel Jiménez Estrada en el laboratorio 2-10 del 
Instituto de Química de la UNAM. 
Se reconoce la asesoría de: 
• La Ingeniera Agrónoma Ma. Teresa de Jesús Olivera Flores del laboratorio de Cultivo de 
Tejidos Vegetales (Conjunto E, Facultad de Quimica, UNAM) en el cultivo de Lemna gibba. 
• El Dr. Rafael Vázquez Duhalt, y sus Técnicos Rosa Román Miranda y Raunel Tinoco del 
Instituto de Biotecnología en la utilización del cromatógrafo de líquidos. 
• El Dr. Javier Espinosa Aguirre y la M. en C. Sandra Giovanna Salamanca Pinzón del 
Instituto de Investigaciones Biomédicas en el ensayo de actividad nitrorreductasa. 
 
El Comité Tutoral que revisó el desarrollo de la tesis, estuvo conformado por: 
Dr. Manuel Jiménez Estrada Instituto de Química, UNAM 
Dra. Estela Sánchez Quintanar Facultad de Química, UNAM 
Dr. Rafael Vázquez Duhalt Instituto de Biotecnología, UNAM 
 
El Jurado de Examen de Maestría estuvo constituido por: 
PRESIDENTE Dra. Estela Sánchez Quintanar Facultad de Química, UNAM 
VOCAL Dr. Rafael Vázquez Duhalt Instituto de Biotecnología, UNAM 
SECRETARIIO Dra. Martha Patricia Coello Coutiño Facultad de Química, UNAM 
SUPLENTE Dr. Arturo Navarro Ocaña Facultad de Química, UNAM 
SUPLENTE Dr. Guillermo Aguilar Osorio Facultad de Química, UNAM 
 
Durante los estudios de maestría, recibí apoyo económico del CONACYT (número de registro 
183486) y de la DGEP- UNAM. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A mis padres: 
 J. Carmen Soto Carrillo y Clemencia Hernández Olguín por su ejemplo de 
dedicación y generosidad incondicional 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 A mis padres por impulsarme a seguir luchando. 
 A mis hermanos Patricia, Citlali, Gabriel y Alejandra por expresar el “gen de la 
locura”. 
 .A mi pequeño sobrino José Manuel por mantener viva la ilusión de viajar por el 
mundo. 
 Al Dr. Manuel Jiménez Estrada por su confianza, sus enseñanzas y por 
arriesgarse a desarrollar este proyecto. 
 A la IA. María Teresa de Jesús Olivera Flores y a los integrantes del laboratorio 
de Cultivo de Tejidos Vegetales del Conjunto E (Innan, Mary, Cris, Rose, Tecui, 
Ara, Mauricio, Lore, Erick…) por los gratos momentos en el concurrido 
laboratorio 116. 
 A mis compañeros del laboratorio 2-10 del Instituto de Química (Juan Antonio, 
Simón, Brenda, Julio, Norma, Paola y Felipe) por las celebraciones acompañadas 
de pizza. 
 Al Dr. Jesús Espinosa Aguirre, al Dr. Rafael Camacho, a la M. en C. Giovanna 
Salamanca y a los chicos de su laboratorio, por su ayuda y amistad desde el primer 
momento. 
 A la M. en C. Donají Velasco Arias por ser una excelente amiga. 
 
~ , 
~ , 
INDICE 
 
 Página 
Lista de figuras ......... ………………………………………………………….. I 
Lista de tablas …….......………………………………………………………... III 
1. ANTECEDENTES ...................................................................................... 1 
1.1 Usos, fuentes, propiedades fisicoquímicas y toxicológicas del 
4-nitrofenol ………………………………………………….................. 
1 
1.2 Estrategias para el tratamiento de la contaminación por 4-nitrofenol …. 4 
1.2.1 Tratamientos químicos .................................................................. 4 
1.2.2 Biorremediación por microorganismos ......................................... 5 
1.2.2.1 Estudios realizados con bacterias ......................................... 5 
1.2.2.2 Estudios realizados con hongos ........................................... 6 
1.2.3 Fitorremediación ........................................................................... 12 
1.2.3.1 Estudios de transformación de nitroaromáticos en plantas … 14 
1.2.3.2 Absorción y transporte de xenobióticos en plantas ............. 19 
1.2.3.3 Metabolismo de xenobióticos en plantas ............................ 20 
 
 
 
 
 
INDICE (continuación) 
 Página 
1.2.3.3.1 Reacciones de fase I .................................................... 21 
1.2.3.3.2 Reacciones de fase II (Formación de conjugados) ...... 22 
1.2.3.3.2.1 Conjugación con glucosa .................................. 22 
1.2.3.3.2.2 Conjugación con glutatión ……………............... 23 
1.2.3.3.2.3 Conjugación con ácido malónico ………………. 24 
1.2.3.3.2.4 Conjugación con péptidos ……………………. 25 
1.2.3.3.3 Reacciones de fase III (compartimentalización) …...... 25 
1.2.3.3.3.1 Compartimentalización en la vacuola ……….. 25 
1.2.3.3.3.2 Residuos unidos …..…………………………… 26 
1.2.3.4 Enzimas aisladas de plantas para la transformación de 
nitroaromáticos……………………………………………… 
26 
1.3 Generalidades sobre Lemna gibba .......................................................... 29 
2. HIPÓTESIS ................................................................................................ 32 
OBJETIVO GENERAL .............................................................................. 32 
OBJETIVOS PARTICULARES ................................................................. 32 
3. OBJETIVOS ................................................................................................. 32 
 
 
INDICE (continuación) 
 
 Página 
4. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................... 33 
4.1 Sustancias ............................................................................................... 33 
4.2 Preparación de medios de cultivo ……………………………………… 33 
4.3 Condiciones de incubación …………………………………………….. 34 
4.4 Colecta y mantenimiento del material vegetal ....................................... 34 
4.5 Obtención y mantenimiento de plantas axénicas ................................... 34 
4.6 Experimento de biotransformación ....................................................... 35 
4.6.1 Determinación de la concentración de 4-nitrofenol en el medio 
de cultivo .................................................................................... 
36 
4.6.2 Análisis del material vegetal ...................................................... 36 
4.6.2.1 Determinación del peso fresco ......................................... 37 
4.6.2.2 Búsqueda de 4-nitrofenol y/o metabolitos en el material 
vegetal ............................................................................... 
37 
4.6.2.3 Determinación de clorofilas a y b ..................................... 37 
4.6.2.4 Obtención del extracto crudo de Lemna gibba ................. 38 
4.6.2.5 Cuantificación de proteínas .............................................. 38 
4.6.2.6 Ensayo de actividad nitrorreductasa ................................. 39 
 
INDICE (continuación) 
 
 Página 
5 RESULTADOS..............................................................................................41 
5.1 Colecta y crecimiento de Lemna gibba ................................................. 41 
5.2 Experimento preliminar de biotransformación ....................................... 42 
5.3 Evaluación de los procedimientos de limpieza de Lemna 
gibba........................................................................................................ 
44 
5.4 Experimento estandarizado de biotransformación ................................... 46 
5.5 Actividad nitrorreductasa ....................................................................... 50 
6 DISCUSIÓN ……………………………………………………………….. 54 
7 CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS....................................................... 58 
8 REFERENCIAS ........................................................................................... 60 
9 ANEXOS ..................................................................................................... 64 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Lista de figuras 
Figura Contenido Página
1 Estructuras de algunos nitrofenoles considerados como contaminantes 
prioritarios …………………………………………………………………. 1 
2 Nitrofenoles aislados de partículas de escape de motores a diesel…………. 2 
3 Pesticidas que son fuente de 4-nitrofenol ………………………………….. 3 
4 Degradación del TNT por P. chrysosporium ………………………………. 8 
5 Metabolitos generados durante la degradación de 2,4-dinitrotolueno por P. 
chrysosporium……………………………………………………………… 9 
6 Vías metabólicas propuestas para la degradación del 4-nitrofenol por P. 
chrysosporium ……………………………………………………………… 10 
7 Estrategias de fitorremediación…………………………............................... 13 
8 Metabolitos de oxidación del TNT obtenidos por transformación con 
Myriophyllum aquaticum ………………………………………………….. 16 
9 Metabolitos del glicerol trinitrato en plantas de tabaco modificados con el 
gen de la enzima pentaeritritol tetranitrato (PETN) reductasa aislada de 
Enterobacter cloacae. …………………………………………………….... 
17 
10 Sección transversal esquemática de una hoja, indicando el arreglo de varios 
tipos de células……………………………………………………………… 20 
11 Representación esquemática de la detoxificación de xenobióticos en una 
célula de una planta…………………………………………………………. 21 
12 Conjugación enzimática del fluorodifen con glutatión en chícharo ……...... 24 
13 Mecanismos para la reducción de grupos nitro en compuestos 
nitroaromáticos …………………………………………………………….. 27 
14 Esquema propuesto para la eliminación de nitrito a partir del tetryl por la 
ferredoxina NADP oxidorreductasa de hojas de espinaca ………………… 28 
 
- I - 
 
 
 
Lista de figuras (continuación) 
 
Figura Contenido Página
15 Planta de Lemna gibba vista desde la superficie adaxial, lateral y 
abaxial……………………………………………………………………. 29 
16 Plantas de Lemna gibba en fase de reproducción asexual o vegetativa y 
sexual ……………………………………………………………………. 30 
17 Comparación del aspecto de Lemna gibba recién colectada y después de 
5 meses de cultivo en el laboratorio……………………………………… 41 
18 CCF fase normal del medio de cultivo a los 12 días de incubación .......... 43 
19 Etapas de recuperación de Lemna gibba para obtención de plantas 
axénicas después de 1 día , 3 días, 8 días y 19 días de incubación en 
medio MS sólido ……………………………………………………….. 
45 
20 Diagrama de flujo para el tratamiento de las muestras en el ensayo de 
biotransformación. ………………………………………………………. 46 
21 Concentración del 4-nitrofenol en el medio de cultivo en ausencia y 
presencia de Lemna gibba. ………………………………………………. 47 
22 Cantidad de clorofila a y clorofila b en las plantas que crecieron sin 4-
nitrofenol y en presencia de 4-nitrofenol ……………………………….. 48 
23 Aspecto de las plantas en el experimento de biotransformación a los 6 
días de incubación en ausencia y presencia de 4-nitrofenol. 49 
24 Variación del peso fresco de las plantas en ausencia y presencia de 
4-nitrofenol………………………………………….................................. 49 
25 CCF fase normal de los extractos de plantas del sistema C....................... 50 
26 Espectros de absorción de la mezcla de reacción al tiempo cero y a los 4 
min ………………………………………………………………………. 51 
27 Actividad nitrorreductasa de los extractos de la planta Lemna gibba que 
creció durante 6 días en medio de cultivo y en solución de 4-nitrofenol 
50 μM ……………………………………………………………………. 
53 
28 Conjugados del 4-nitrofenol encontrados en diversos cultivos en 
suspensión ……………………………………………………………….. 57 
- II - 
Lista de tablas 
 
 
Tabla Contenido Página 
1 Concentraciones inhibitorias medias (CI50) en Lemna gibba frente a 
diferentes compuestos ………………………………………………………. 31 
2 Gradiente de elusión para separar y cuantificar el 4-nitrofenol en el medio 
de cultivo y el material vegetal …………………………………………....... 36 
3 Contenido de las mezclas de reacción en el ensayo de actividad 
nitrorreductasa………………………………………………………………. 39 
4 Concentración de 4-nitrofenol en el medio de cultivo en el experimento de 
biotransformación…………………………………………………………… 43 
5 Algunos nitrocompuestos evaluados como sustratos para los componentes 
A y B de la nitrorreductasa de E. coli ……………………………………. 56 
6 Valores de las pendientes (ΔA/seg) para las mezclas de reacción en el 
ensayo de actividad nitrorreductasa ……………………………………….. 67 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
- III - 
 
RESUMEN 
El 4-nitrofenol es un producto de degradación de algunos pesticidas como el 
paratión; también puede formarse por reacción fotoquímica de hidrocarburos 
aromáticos y óxidos de nitrógeno en fase de vapor (Karim y Gupta, 2003). 
 La fitorremediación es una técnica innovadora, basada en la capacidad de 
las plantas para acumular o transformar contaminantes (Salt et al, 1998). Estudios 
realizados en plantas terrestres y acuáticas han demostrado que algunas especies 
tienen la capacidad de metabolizar compuestos nitroaromáticos. (Schnoor et 
al,1995). La planta acuática Lemna gibba se encuentra ampliamente distribuida en 
México. Esta planta se reproduce principalmente de manera vegetativa, 
acumulando gran cantidad de biomasa en tiempos cortos (Lot et al, 1999), lo que 
la hace un organismo adecuado para estudios de fitorremediación. 
En el presente trabajo se describen las condiciones experimentales para la 
obtención y el mantenimiento de cultivos axénicos de Lemna gibba, con los que 
se realizaron experimentos sobre la biotransformación del 4-nitrofenol. 
Se encontró que la cantidad de 4-nitrofenol disminuyó en el medio de cultivo 
en presencia del material vegetal. No se encontraron metabolitos provenientes del 
4-nitrofenol en el medio de cultivo ni en el material vegetal. Sin embargo, en un 
intento por explicar la disminución de la concentración del 4-nitrofenol en 
presencia de Lemna gibba, se determinó la actividad de nitrorreductasa en el 
extracto crudo de las plantas y se encontró una actividad del orden de 5 
nmol/min⋅mg proteína. Esta actividad es semejante a la obtenida del extracto de la 
planta que creció en ausencia de 4-nitrofenol. 
 
 1
1. ANTECEDENTES 
1.1 Usos, fuentes, propiedades fisicoquímicas y toxicológicas 
del 4-nitrofenol 
Los nitrofenoles son compuestos empleados como intermediarios en la producción 
de explosivos, fármacos, pesticidas, pigmentos y conservadores de madera. 
Debido al uso indiscriminado de estos compuestos, se encuentran como 
contaminantes de agua y suelo. 
El 4-nitrofenol (1), el 2-nitrofenol (2) y el 2,4-dinitrofenol (3) (Fig. 1) se 
encuentran en la Lista de Contaminantes Prioritarios de la Agencia de Protección 
Ambiental de los Estados Unidos, la cual recomienda restringir la concentración de 
estos compuestos a 10 ng/L (Karim y Gupta, 2003). 
 
NO2
OH OH
NO2
NO2
OH
NO2
1 2 3 
Fig. 1. Estructuras de algunos nitrofenoles considerados como contaminantes 
prioritarios: 4-nitrofenol (1), 2-nitrofenol (2) y 2,4-dinitrofenol (3). 
 
El 4-nitrofenol puede ser producido en la atmósfera mediante la foto-oxidación 
de hidrocarburos aromáticos tales como el benceno, tolueno,fenantreno y 
nitrobenceno (Gangolli, 1999; Karim y Gupta, 2003). 
 2
Patnaik y Khoury (2004) reportaron la formación del 4- y el 2-nitrofenol a 
partir de la reacción del ión nitrito y del fenol en soluciones acuosas a temperatura 
ambiente en presencia y ausencia de luz; obteniéndose un rendimiento 
ligeramente mayor en presencia de luz y soluciones ácidas. El 2-nitrofenol se 
formó con mayor rapidez y con mayores rendimientos que el 4-nitrofenol en todas 
las condiciones de reacción. 
 
El 4-nitrofenol (1), el 2-metil-4-nitrofenol (4), el 3-metil-4-nitrofenol (5) y el 4-
nitro-3-fenilfenol (6) (Fig. 2) fueron aislados a partir de partículas del escape de 
motores a diesel y presentaron actividad vasodilatadora. Debido a que los 
alquilfenoles se han asociado con actividad estrogénica, dichos compuestos 
fueron evaluados como agentes estrogénicos y anti-androgénicos en un modelo 
de Saccharomyces cerevisiae que expresa receptores de estrógeno y andrógeno 
humanos. Todos los nitrofenoles mostraron actividad anti-androgénica y 
únicamente 4 no mostró actividad estrogénica (Taneda et al., 2004) 
 
NO2
OH
CH3
4
NO2
OH
CH3
5
NO2
OH
Ph
6 
Fig. 2. Nitrofenoles aislados de partículas de escape de motores a diesel 
 
El 4-nitrofenol también puede generarse mediante la hidrólisis microbiana o la 
fotodegradación de varios pesticidas tales como el metilparatión (7), etilparatión 
(8) y fluorodifen (9) (Fig. 3). 
 3
NO2
O
P
RO
RO
S
NO2
OF3C NO2
7 R= CH3 
8 R= CH2CH3
9
 
Fig. 3. Pesticidas que son fuente de 4-nitrofenol: metilparatión (7), 
etilparatión (8) y fluorodifen (9). 
En estado sólido, el 4-nitrofenol se presenta como cristales entre incoloros y 
amarillo pálido de olor característico. En forma de polvo, es posible que explote si 
se encuentra mezclado con el aire o hidróxido de potasio. Es un oxidante fuerte y 
reacciona violentamente con materiales combustibles y reductores. Posee un valor 
de constante de partición octanol/agua log Kow entre 1.87 y 2.04. Su solubilidad en 
agua es de 16 g l-1 a 25 ºC. En solución acuosa, el 4-nitrofenol es un compuesto 
altamente colorido y su presencia a concentraciones > 1mg/L produce un color 
amarillo brillante; esto proporciona un indicador visual de la presencia de 4-
nitrofenol, aunque la producción de ácido puede causar la desaparición del color 
amarillo. También es soluble en acetona, cloroformo, éter dietílico, etanol, tolueno 
y piridina. (INSHT, ICSC 066; Laha y Petrova, 1998; Gangolli, 1999). 
Los nitrofenoles han sido ampliamente utilizados como compuestos modelo 
en los estudios de biodegradación de contaminantes orgánicos (Laha y Petrova, 
1998). Estos son altamente tóxicos para el humano y los mamíferos, siendo 
fácilmente reducidos a los derivados nitroso e hidroxilamina. Estos derivados 
pueden conducir a la formación de metahemoglobina, la cual es incapaz de unir 
oxígeno, o de nitrosaminas, las cuales son carcinogénicas. Algunos 
nitroaromáticos, tales como el nitropireno, son mutagénicos y varios nitrofenoles 
tienen un efecto desacoplante en la fosforilación oxidativa. La mayoría de los 
nitroaromáticos son altamente tóxicos también para las bacterias y por tanto 
pueden inhibir el crecimiento microbiano (Andreoni et al., 1995). 
 4
1.2 Estrategias para el tratamiento de la contaminación por 
4-nitrofenol 
Las estrategias de remediación deben ser consideradas en base al sitio 
contaminado y a la concentración del contaminante. Por ejemplo, la toxicidad de 
los nitroaromáticos limita la aplicabilidad de la biorremediación cuando las 
concentraciones son altas, o el tratamiento produzca subproductos recalcitrantes. 
Por el contrario, los tratamientos químicos que consumen energía, tales como la 
incineración, pueden ser demasiado caros a bajas concentraciones, o pueden 
causar otros problemas ambientales tales como emisiones de óxidos de nitrógeno 
(Rodgers y Bunce, 2001). 
Se encuentra reportado que las aminas aromáticas son 500 veces menos 
tóxicas que los correspondientes nitroaromáticos (Karim y Gupta, 2001). 
 
1.2.1 Tratamientos químicos 
Los compuestos nitroaromáticos son resistentes a la oxidación química o biológica 
y a la hidrólisis debido al efecto de atracción de electrones por parte de los grupos 
nitro. Debido a esto, son ambientalmente persistentes y la remediación de 
corrientes de agua y aguas subterráneas contaminadas es difícil (Rodgers y 
Bunce, 2001). 
La reducción del 4-nitrofenol ha sido estudiada en presencia de 
nanopartículas de oro, empleando un exceso de borohidruro. Esumi et al. (2002) 
sintetizaron nanocompuestos de oro los cuales fueron unidos a dendrímeros de 
poli(amidoamina) y poli(propileneimina). Los autores encontraron que el 4-
nitrofenol fue convertido al 4-aminofenol en presencia de ambos dendrímeros. Por 
su parte, Praharaj et al. (2004) obtuvieron nanopartículas de oro adheridas a una 
resina de intercambio aniónico y también encontraron la formación de 4-
aminofenol cuando fueron evaluadas para la degradación del 4-nitrofenol. 
 5
Li et al. (2005) llevaron a cabo la degradación del 4-nitrofenol con TiO2 (10-30 
nm) en el cual se había adsorbido previamente el ácido 5-sulfosalicílico. La 
eficiencia de adsorción del 4-nitrofenol aumentó de 42 a 84%. En condiciones de 
fotodegradación óptima (pH inicial de 4.0, 4-nitrofenol 5 mg/L, 100 mg de 
catalizador, tiempo de irradiación de 120 min con lámpara de mercurio de alta 
potencia de 160 W), la eficiencia de degradación del 4-nitrofenol por el TiO2, 
incrementó de 40 a 88% después de la modificación en la superficie del TiO2. 
1.2.2 Biorremediación por microorganismos 
Los nitrofenoles en aguas y suelos superficiales son degradados por oxidación 
fotoquímica. Sin embargo, en suelos más profundos y aguas subterráneas, la 
degradación de nitrofenoles depende principalmente de la biodegradación y ésta 
puede ser iniciada por mecanismos de oxidación o reducción (Laha y Petrova, 
1998) 
1.2.2.1 Estudios realizados con bacterias 
Blasco y Castillo (1992) describieron la degradación del 4-nitrofenol y 2,4-
dinitrofenol por la bacteria fototrófica asimiladora de nitrato y nitrito Rhodobacter 
capsulatus E1F1. La degradación se llevó a cabo en condiciones microaerobias y 
fue dependiente de la luz. R. capsulatus utilizó el 2,4-dinitrofenol como aceptor de 
electrones. En un estudio posterior, Blasco y Castillo (1993), purificaron y 
caracterizaron la enzima responsable de la foto-reducción del 2,4-dinitrofenol a 2-
amino-4-nitrofenol en Rhodobacter capsulatus E1F1. La nitrofenol reductasa 
purificada es un dímero, con masa molecular de 52 kDa, temperatura óptima de 
30°C, pH óptimo de 6; Km aparente para el 2,4-dinitrofenol de 70 μM. La 
nitrofenol reductasa de Rhodobacter capsulatus E1F1 contiene FMN y 
probablemente hierro no hemo como grupos prostéticos. 
Laha y Petrova (1998) realizaron estudios in vitro para evaluar la habilidad de 
poblaciones microbianas nativas de los Everglades (sur de Florida, EU) para 
 6
degradar xenobióticos, para lo cual emplearon como compuesto modelo el 4-
nitrofenol. Los resultados mostraron que a concentraciones de 10 y 100 μg/g de 
suelo hubo un grado de mineralización del 18% en una semana. Sin embargo, a 
una concentración de 10 mg/g de suelo, no hubo mineralización del 4-nitrofenol en 
un periodo de 4 meses; tal concentración aparentemente produjo un efecto 
inhibitorio. La velocidad y grado de mineralización del 4-nitrofenol aumentó hasta 
el 30% por la inoculación con microorganismos (previamente aislados en otros 
sitios) que degradan el 4-nitrofenol. 
Takeo et al. (2003) aislaron una bacteria que degrada el 4-nitrofenol a partir 
de lodos activados. La bacteria, identificada como Rhodococcus sp. y designada 
como PN1, utilizó el 4-nitrofenol como única fuente de carbono, nitrógeno y 
energía. Las pruebas de degradación del4-nitrofenol mostraron que ésta fue 
inducida por el 4-nitrofenol y que el 4-nitrocatecol fue uno de los metabolitos. 
Además, los autores de este trabajo describen la clonación (en Escherichia coli) 
de un cluster del gen de la 4-nitrofenol hidroxilasa, la enzima responsable del 
catabolismo del 4-nitrofenol. 
 
1.2.2.2 Estudios realizados con hongos 
El basidiomiceto de la pudrición blanca de la madera Phanerochaete 
chrysosporium degrada diferentes contaminantes entre los que se encuentran el 
2,4-dinitrotolueno (Valli et al., 1992), el TNT (Michels et al., 1994; Rieble et al., 
1994) y el 4-nitrofenol (Teramoto et al., 2004). En condiciones limitantes de 
carbono, nitrógeno o azufre, P. chrysosporium lleva a cabo la mineralización de los 
compuestos aromáticos y los azoxitetranitrotoluenos con ayuda de enzimas del 
sistema que degrada la lignina (un polímero aromático natural abundante). Dicho 
sistema contiene lignino peroxidasa (LiP), manganeso peroxidasa (MnP), 
oxidasas, reductasas, peróxido de hidrógeno, alcohol veratrílico, oxalato y quinol 
oxidasas. (Rieble et al., 1994; Esteve-Nuñez et al., 2001). 
 7
Como en otros organismos, los pasos iniciales en la degradación fúngica del 
TNT (10) involucran la reducción de grupos nitro (Fig. 4). El TNT fue reducido a 
una mezcla de 4-hidroxilamino-2,6-dinitrotolueno (11) 4-aminodinitrotolueno (12), 
2,4-diaminonitrotolueno (13), y azoxitetranitrotoluenos (14). 
 
Stahl y Aust (1993) proporcionaron evidencia de que el TNT es reducido por 
un sistema redox de la membrana plasmática en P. chrysosporium que requiere el 
micelio vivo e intacto. Los autores sugirieron que la reducción está acoplada al 
sistema de salida de protones usado por el hongo para mantener el pH fisiológico 
extracelular a aproximadamente 4.5. En contraste, Rieble et al. (1994) reportaron 
una actividad reductasa del TNT asociada a la membrana que requirió NADPH 
como cosustrato y la ausencia de oxígeno molecular. Debido a que la actividad fue 
detectada en la forma soluble en detergente, donde un potencial de membrana no 
podía ser mantenido, se asumió que no era necesario un potencial de membrana 
para esta reacción. Por otro lado, también se ha descrito la actividad reductasa 
intracelular del TNT dependiente de NAD(P)H. 
 
Cuando cultivos ligninolíticos de P. chrysosporium fueron incubados con 4-
aminodinitrotolueno (12), se detectó un compuesto identificado como 4-formamida-
2,6-DNT (15). Este intermediario fue transformado a 2-amino-4-formamida-6-
nitrotolueno (16), un compuesto que desapareció rápidamente bajo condiciones 
ligninolíticas. En ambientes no ligninolíticos los metabolitos aminodinitrotolueno 
fueron reducidos lentamente a diaminonitrotoluenos y la concentración de 
azoxitetranitrotoluenos incrementó. 
 
 8
NO2
CH3
NO2O2N
NO
CH3
NO2O2N
NHOH
CH3
NO2O2N
N
CH3
NO2O2N
O
N
CH3
O2N NO2
O2
NH2
CH3
NO2O2N
NH2
CH3
NH2O2N
Lignina y Manganeso 
peroxidasas
Oxidación y mineralización
Ar-N=N-Ar
Ar-NH-NH-Ar
NHCOCH3
CH3
NH2O2N
NH2
CH3
NH2O2N
NHCHO
CH3
NO2O2N
NHCHO
CH3
NH2O2N
HO
10
111213
14
1516
 
Fig. 4. Degradación del TNT por P. chrysosporium (Esteve-Nuñez et al., 2001). 
 
En referencia al metabolismo del 2,4-dinitrotolueno (17, Fig. 5), Valli et al. 
(1992) demostraron que el primer paso en la degradación de este compuesto es 
su reducción intracelular a 2-amino-4-nitrotolueno (18) o 4-amino-2-nitrotolueno 
(19). Posteriormente tiene lugar la reducción de los aminonitrotoluenos para 
formar el 2,4-diaminonitrotolueno (20). La 4-nitro-1,2-benzoquinona (21) se genera 
por la oxidación extracelular de la amina por la manganeso peroxidasa (MnP); este 
 9
intermediario sufre un ciclo de reducción y metilación generando 4-nitro-1,2-
hidroquinona (22), 1,2-dimetoxi-4-nitrobenceno (23), iones nitrito y metanol. 
Transcurridos 24 días de la incubación, P. chrysosporium mineraliza el 34% de 
2,4-dinitrotolueno únicamente bajo condiciones ligninolíticas. 
 
 
CH3
NO2
NO2
OCH3
OCH3
NO2
O
O
NO2
OH
OH
NO2
CH3
NH2
NO2
CH3
NO2
NH2
CH3
NH2
NH2
OH
OH
OH
OH
OCH3
OH
MnP LiP
OH
OH
HO
O
O
OH
OH
O
OH
O
CH3OH
+ +
MnP
+
O
OH
O
+ NO2
-
MnP
O
O
NO2
+ CH3OH
17
18
19
20
21
21
22
23
OH
O
O
+
OCH3
21 + NO2- CH3OH+
LiP
 
Fig. 5. Metabolitos generados durante la degradación de 2,4-dinitrotolueno por P. 
chrysosporium (Valli et al., 1992). 
 10
Teramoto et al. (2004) examinaron la habilidad de P. chrysosporium para 
degradar el 4-nitrofenol y la compararon con la degradación del 2,4-dinitrotolueno. 
Como lo demostraron Valli et al. (1992), en el metabolismo del 2,4-dinitrotolueno 
por P. chrysosporium se detectaron metabolitos amino, lo cual indica la 
participación de nitrorreductasas. Para determinar la existencia de dicha actividad 
en el metabolismo del 4-nitrofenol, este se adicionó junto con el 2,4-dinitrotolueno 
al medio de cultivo. Los resultados confirmaron que el 2,4-dinitrotolueno fue 
reducido al 2-amino-4-nitrotolueno (18); sin embargo, como se muestra en la figura 
6, el 4-nitrofenol (1) no fue convertido al 4-aminofenol, sino al 1,2-dimetoxi-4-
nitrobenceno (23) mediante la formación del intermediario 4-nitroanisol (24); 
ambos productos fueron detectados en el medio de cultivo cuando el hongo creció 
bajo condiciones ligninolíticas. Cuando el 4-nitroanisol fue adicionado como 
sustrato, fue convertido a 1,2-dimetoxi-4-nitrobenceno con formación de 
cantidades traza de 4-nitrofenol. . 
 
OH
NO2
OCH3
NO2
OCH3
NO2
OH
Vía 1
Vía 2
OH
NO2
OH
OCH3
NO2
OCH3
LiP
O
O
OCH3
1 24
23
CO2
25
26 
Fig. 6. Vías metabólicas propuestas para la degradación del 4-nitrofenol por P. 
chrysosporium (Teramoto et al., 2004). 
 11
A pesar de que el 1-hidroxi-2-metoxi-5-nitrobenceno (25) no fue observado 
durante el metabolismo del 4-nitroanisol, los autores proponen la vía metabólica 1 
para la obtención de dimetoxinitrobenceno a partir de 4-nitrofenol. La vía 2 se 
propuso debido a que cuando el 4-nitrocatecol fue adicionado al medio de cultivo, 
también se obtuvo el dimetoxinitrobenceno. La adición de piperonil butóxido, un 
inhibidor del citocromo P-450, inhibió la formación de dimetoxibenceno pero no 
afectó el metabolismo del 2,4-dinitrotolueno. Los autores también encontraron 
que, a pesar de su naturaleza fenólica, el 4-nitrofenol y el 4-nitroanisol no fueron 
oxidados por las peroxidasas ligninolíticas extracelulares. 
La oxidación del dimetoxinitrobenceno por la LiP libera el grupo nitro para 
formar la 2-metoxi-1,4-benzoquinona (26), la cual se propone que es mineralizada 
a CO2. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 12
1.2.3 Fitorremediación 
Recientemente se ha centrado la atención en la fitorremediación -el uso de 
plantas para remover contaminantes del ambiente o volverlos menos peligrosos 
(Salt et al., 1998). La fitorremediación puede ser aplicada a contaminantes 
orgánicos e inorgánicos (presentes en suelo, agua y aire) por medio de diferentes 
estrategias (Fig. 7). 
La fitorremediación de metales y otros compuestos inorgánicos puede llevarse 
a cabo de varias formas: fitoextracción, la absorción y concentración de metales 
del suelo en las raíces y brotes de la planta; rizofiltración, el uso de las raíces de 
las plantas para remover los metales de efluentes; fitoestabilización, el uso de 
plantas para reducir la dispersión de los metales en el ambiente; o la 
fitovolatilización, la captación y liberación de materiales volátiles tales como los 
compuestos que contienen mercurio o arsénico. 
La fitorremediación de compuestos orgánicos puede ocurrir por medio de 
fitoestabilización; fitoestimulación, la estimulación de biodegradación microbiana 
en la rizósfera; o por fitotransformación, la absorción y degradación de 
contaminantes orgánicos por la planta (Glick, 2003). 
Las diferentes estrategiasde fitorremediación no son mutuamente excluyentes; 
por ejemplo, en un humedal construído, la acumulación, estabilización y la 
volatilización pueden ocurrir de manera simultánea (Pilon-Smits, 2005) 
 
 
 
 
 
 13
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Entre las ventajas que presenta la fitorremediación se encuentran las 
siguientes (Macek et al., 2000; Pilon-Smits, 2005): 
• La fitorremediación puede ser usada para sustratos sólidos, líquidos y 
gaseosos. 
• Debido a que este proceso es finalmente mediado por el sol, la 
fitorremediación es en promedio 10 veces más barata que los métodos de 
remediación basados en la ingeniería tales como excavación del suelo, lavado 
o quemado del suelo o sistemas bombeados y tratados. 
• Las plantas son una fuente renovable y barata. 
• Las raíces de las plantas promueven el incremento en el número de 
microorganismos y la actividad en la rizósfera. 
• El hecho de que la fitorremediación usualmente se realice in situ, contribuye 
a su costo-efectividad y puede reducir la exposición de los humanos, la vida 
silvestre y el ambiente al sustrato contaminado. 
Fig. 7. Estrategias de 
fitorremediación (modificada 
de Pilon-Smts, 2005) 
 14
La fitorremediación también posee algunas limitaciones, como son: 
• Las plantas que median la limpieza tienen que estar dónde se encuentre el 
contaminante y tienen que ser capaces de actuar sobre éste. Por tanto, las 
propiedades del suelo, el nivel de toxicidad y el clima deberán permitir el 
crecimiento de la planta. 
• La fitorremediación también puede estar limitada por la profundidad de la raíz 
debido a que las plantas tienen que ser capaces de alcanzar el contaminante. 
La profundidad de la raíz es típicamente de 50 cm para especies herbáceas o 
3 m para árboles, aunque se han reportados freatofitas que alcanzan 
profundidades de 15 m o más, especialmente en climas áridos. 
• Dependiendo del proceso biológico involucrado, la fitorremediación también 
puede ser más lenta que la mayoría de los métodos de remediación 
establecidos como la excavación, incineración, bombeo y tratamiento. 
• La fitorremediación también puede estar limitada por la biodisponibilidad de 
los contaminantes. No obstante, la biodispobibilidad puede aumentarse al 
adicionar sustancias al suelo. 
 
 
1.2.3.1 Estudios de transformación de nitroaromáticos en 
plantas 
La mayoría de los estudios relacionados con el metabolismo de compuestos 
nitroaromáticos están enfocados a la transformación de explosivos tales como el 
TNT. En éstos emplean plantas terrestres y acuáticas de tipo silvestre o 
modificadas (por introducción de genes bacterianos), así como cultivos en 
suspensión. Los estudios que involucran plantas completas no transformadas 
pueden contener o no su microflora asociada. 
 
 15
Schnoor et al. (1995) reportan la actividad nitrorreductasa en la planta 
acuática Lemna minor. En dicho estudio se indica que las enzimas nitrorreductasa 
y lacassa son secretadas al medio. Los autores proponen que dichas enzimas 
degradan el 2,4,6-trinitrotolueno e incorporan los metabolitos (obtenidos por 
ruptura del anillo) en nuevo material vegetal o detritus orgánico. 
Con el fin de profundizar más sobre este tema, se hizo una revisión sobre el 
uso de las plantas para detoxificar los contaminantes nitroaromáticos y los 
mecanismos que emplean para llevar a cabo las biotransformaciones. 
Scheidemann et al. (1998) realizaron estudios de biotransformación del TNT 
en once plantas terrestres. Las plantas fueron cultivadas durante ocho semanas 
en suelo contaminado con 10, 100 o 500 mg TNT/Kg de suelo. Los principales 
metabolitos del TNT encontrados en las raíces fueron el 2-aminodinitrotolueno y 4-
aminodinitrotolueno. A la concentración de 10 mg TNT/Kg, la alfalfa (Medicago 
sativa) incorporó la mayor cantidad de nitroaromáticos; sin embargo no creció a 
una concentración de 100 mg TNT/Kg suelo. Por el contrario, Triticum aestivum y 
Phaseolus vulgaris pudieron desarrollarse a 100 mg TNT/Kg y sus raíces 
presentaron altos niveles de metabolitos de TNT. Sólo Phaseolus vulgaris fue 
capaz de crecer en presencia de 500 mg TNT/Kg de suelo con muy altos niveles 
de nitroaromáticos en las raíces. Para los suelos contaminados a 10 mg/Kg, más 
del 95% del nitro aromático original estuvo presente como metabolitos amino, pero 
no se conoce si esta transformación ocurrió antes o después de la captación por 
las plantas. 
En referencia al metabolismo del TNT en plantas acuáticas, Hughes et al. 
(1997) realizaron estudios sobre el destino del [14C] TNT en tres sistemas: 
Myriophyllum spicatum nativa con su microflora asociada, Myriophyllum aquaticum 
axénica y cultivos de tejidos de raíz de Catharanthus roseus. Los productos de 
reducción 4-amino-2,6-dinitrotolueno y 2-amino-4,6-dinitrotolueno fueron 
observados fuera de las plantas; sin embargo, los autores no tienen evidencia 
suficiente para concluir si la transformación ocurrió en la superficie de la planta, o 
 16
si los productos de transformación pudieron ser intercambiados entre los 
compartimentos extracelulares e intracelulares. Únicamente en el caso de 
Myriophyllum nativa el TNT fue detectado a niveles bajos en los extractos de 
plantas. 
En otro estudio, Bhadra et al. (1999) se enfocaron al aislamiento y la 
caracterización de los productos del metabolismo oxidativo del TNT en 
Myriophyllum aquaticum. Los metabolitos encontrados en el medio de cultivo 
fueron (Fig. 8): ácido 2-amino-4,6-dinitrobenzoico (27), alcohol 2,4-dinitro-6-
hidroxibencílico (28), 2-N-acetoxiamino-4,6-dinitrobenzaldehído (29) y el 2,4-
dinitro-6-hidroxitolueno (30). También se observaron los metabolitos azoxi-
tetranitrotolueno. La presencia de los metabolitos en el medio de cultivo no 
excluye que los metabolitos se encuentren dentro de la planta. Se piensa que las 
enzimas involucradas en el proceso de oxidación son oxigenasas de función 
mixta. 
 
COOH
NH2
NO2
O2N
27 
CH2OH
NO2
NO2
HO
28 
H
N
O
CHO
NO2
O2N
29 
CH3
NO2
NO2
HO
30 
Fig. 8. Metabolitos de oxidación del TNT obtenidos por transformación con 
Myriophyllum aquaticum. 
 
French et al. (1999) transformaron plantas de tabaco, por medio de 
Agrobacterium tumefasciens, para que expresara la enzima pentaeritritol 
tetranitrato (PETN) reductasa (Fig. 9). Dicha enzima, la cual es dependiente de 
NADPH, fue aislada de Enterobacter cloacae PB2, una cepa que es capaz de 
utilizar el PETN y el glicerol trinitrato (31) como única fuente de nitrógeno. Las 
 17
semillas de las plantas transgénicas fueron capaces de germinar y crecer en 
presencia de glicerol trinitrato a una concentración 1 mM ó TNT 0.05 M, tales 
concentraciones inhibieron la germinación y el crecimiento de las semillas tipo 
silvestre. Las plántulas transgénicas crecieron en medio líquido con 1 mM de 
glicerol trinitrato y mostraron una eliminación más rápida y completa del grupo 
nitro que las plántulas no transformadas. 
 
O
O
O
NO2NO2
NO2
O
O
NO2NO2
OH
O
OH
NO2
OH
31 
Fig. 9. Metabolitos del glicerol trinitrato (31) en plantas de tabaco modificados con 
el gen de la enzima pentaeritritol tetranitrato (PETN) reductasa aislada de 
Enterobacter cloacae PB2. 
 
Hannink et al. (2001) demostraron que las plantas de tabaco (Nicotiana 
tabacum cv. Xanthi) transformadas con Agrobacterium, las cuales expresan la 
nitrorreductasa de Enterobacter cloacae, son capaces de tolerar y detoxificar el 
TNT a niveles que son comúnmente encontrados en los sitios contaminados. Los 
estudios se llevaron a cabo en plantas T2. Las semillas fueron germinadas en 
placas que contenían 0.25 mM de TNT. La línea transgénica más tolerante al TNT 
(designada NR 3-2) presentó signos moderados de fitotoxicidad. No se observó 
una disminución considerable en la germinación de semillas transgénicas 
comparadas con las semillas tipo silvestre y ambas líneas deplantas desarrollaron 
raíces similares en longitud y forma. En un ensayo con plántulas crecidas en 
medio líquido que contenía TNT, Los resultados mostraron que las plantas tipo 
silvestre ganaron 48% en peso fresco y removieron 78% del TNT a 0.1 mM al final 
del estudio (168 h), por su parte, la línea NR 3-2 ganó 52% y removió 71% del 
 18
TNT en las primeras 6 horas. Todo el TNT fue removido por las plantas NR 3-2 en 
20 horas. A la concentración de 0.25 mM, las plantas tipo silvestre removieron 
cantidades insignificantes de TNT y las plantas transgénicas removieron 50% del 
TNT en las primeras 6 horas y todo el TNT en 72 horas. Se produjeron cantidades 
insignificantes de metabolitos aminodinitrotolueno en el medio de cultivo por 
ambas líneas de plantas a ambas concentraciones de TNT. 
 
Nepovím et al. (2004) evaluaron la transformación del TNT en cultivos en 
suspensión de Rheum palmatum y Solanum aviculare. La concentración inicial de 
TNT disminuyó hasta 50 % en el transcurso de 1 hora en presencia de R. 
palmatum y el 100% después de 6 horas En presencia de S. aviculare, la mayor 
parte de TNT fue captada en 10 horas. La concentración de TNT que inhibió el 
50% del crecimiento de los cultivos celulares fue del orden de 38 mg/L (0.167 
mM). 
 
En el estudio realizado por Adamia et al. (2006) se evaluó la capacidad de 
plántulas de soya (Glycine max), cebada (Hordeum sativum), alfalfa (Medicago 
sativum), garbanzo (Cicer arietinum), chícharo (Pisum sativum), zacate italiano 
(Lolium multiflorum), girasol (Helianthus annuus) y maíz (Zea mays) para absorber 
y detoxificar el TNT. De estas plantas, la soya fue el mejor candidato, por lo cual 
se evaluó la actividad nitrorreductasa en homogenados de raíz de soya. 
La actividad nitrorreductasa aumentó de manera significativa en todos los 
organelos (principalmente en los microsomas) durante el cultivo de las plantas de 
soya en un medio que contenía TNT; sin embargo, aun después de la inducción, la 
actividad de la nitrorreductasa microsomal permanece más baja que la de otras 
fracciones y la más alta se encuentra en el citosol. También se encontró que a 
mayor actividad nitrorreductasa, la asimilación del TNT por la planta era más 
rápida. 
 19
Por otra parte, las enzimas fenoloxidasa y peroxidasa oxidaron el [C3H3]TNT. 
Después de comparar los resultados de la oxidación enzimática con los de la 
inducción de la nitrorreductasa, la cual se activa más significativamente bajo la 
acción del TNT, los autores postulan que la vía principal de la transformación del 
TNT en células de plantas involucra la reducción de los grupos nitro. 
 
1.2.3.2 Absorción y transporte de xenobióticos en plantas 
Aunque las plantas pueden tomar las sustancias a partir de las fases de vapor, 
líquido y sólido, el movimiento de los compuestos dentro de la planta usualmente 
ocurre en solución. Los compuestos que tienen mayor probabilidad de ser 
absorbidos son aquellos con coeficientes de partición octanol/agua (log Kow) entre 
0.5 y 3.0. La eficiencia de entrada de las sustancias orgánicas también depende 
de su pKa, su masa molecular, su concentración, la temperatura y el pH del 
medio, el contenido de agua y material orgánico en el suelo y la fisiología de la 
planta. (Alkorta y Garbisu, 2001). 
De acuerdo a Korte et al. (2000) existen dos vías de entrada de los 
xenobióticos a las plantas: las raíces y las hojas. Para entrar a través de las 
raíces las sustancias deben penetrar únicamente a través de paredes celulares no 
subesterificadas libres de cutícula. 
Por otra parte, las sustancias entran a las hojas a través de los estomas si 
son moléculas gaseosas, o a través de la cutícula de la epidermis si son 
sustancias orgánicas lipofílicas (Fig. 10). Debido a esto, las hojas poseen mayor 
selectividad que las raíces para absorber las sustancias. 
 20
 
Fig. 10. Sección transversal esquemática de una hoja, indicando el arreglo de varios 
tipos de células (tomado de Nobel, 1999). 
 
 
1.2.3.3 Metabolismo de xenobióticos en plantas 
Existen tres fases del metabolismo de xenobióticos en plantas (Fig. 11). La 
mayoría de los xenobióticos sufre una reacción metabólica de fase I, la cual es 
oxidativa, reductiva o hidrolítica; en esta fase se forman grupos amino, hidroxilo o 
ácido carboxílico libres. En el metabolismo de fase II, ocurre una adición 
enzimática de una molécula de azúcar, aminoácido o glutatión a un grupo 
funcional recién formado durante la fase I. Finalmente, el metabolismo de fase III 
convierte los conjugados de fase II en residuos insolubles o los conjuga con una 
molécula adicional y los metabolitos son compartimentalizados en la vacuola. 
Cloroplastos 
T 
lOO/1m 
1 
Poro del estoma Célula guarda 
Cutícula 
Epidermis 
superior 
Células del 
mes6filo 
empalizada 
Células 
esponjosas 
de mes6filo 
Ep idermis 
inferior 
 21
 
Fig. 11. Representación esquemática de la detoxificación de xenobióticos en una 
célula de una planta. P450 = Cyt P450 mono oxigenasa; GT = glucosiltransferasa. X y X-
Z son los xenobióticos, y Z es la parte nucleofílica desplazada en la reacción catalizada 
por glutatión transferasa (GST). (Adaptado de Kreuz et al., 1996) 
 
1.2.3.3.1 Reacciones de fase I 
Estas reacciones generalmente se llevan a cabo mediante enzimas tipo 
citocromo P450 (Cyt P450). La reacción general es: 
XH + O2 + NADPH → XOH + H2O + NADP+ 
 
donde XH es el sustrato y XOH es el producto oxidado. Las reacciones más 
comunes mediadas por Cyt P450 con xenobióticos son hidroxilaciones de anillos 
aromáticos o grupos alquilo y liberación de heteroátomos (O- y N- desalquilación). 
La introducción de un grupo hidroxilo en una molécula de xenobiótico incrementa 
su polaridad e hidrofilicidad. 
Las monooxigenasas Cyt P450 encontradas en plantas son proteínas 
microsomales (masa molecular ≈ 55 kD) que requieren O2, NADPH, y NADPH-
Cyt P450 reductasa para su actividad catalítica. Las enzimas Cyt P450s están 
involucradas en la biosíntesis de metabolitos tales como fenilpropanoides, 
terpenos, ácidos grasos, glucósidos cianogénicos, etc. (Kreuz et al., 1996; Korte et 
al., 2000; Werck-Reichhart et al., 2000) 
RE """'" 
. -
 22
1.2.3.3.2 Reacciones de fase II (Formación de conjugados) 
La formación de conjugados es un proceso metabólico en donde las sustancias 
endógenas o exógenas son convertidas a componentes polares para facilitar su 
remoción de el (los) sitio(s) de procesos metabólicos continuos (Dorough, 1976, 
citado por Hall et al., 2001). 
Las reacciones de conjugación se llevan a cabo mediante la adición de 
sustancias que están presentes dentro de las células de las plantas a los grupos 
-OH, -NH2 y -SH de los xenobióticos. La adición de un azúcar, un aminoácido o 
glutatión al xenobiótico produce un conjugado con un peso molecular más alto, 
que es más soluble en agua, menos móvil y usualmente más susceptible a un 
proceso posterior en la planta; todo lo cual los vuelve no disponibles para el 
metabolismo primario y por tanto que alcancen su sitio blanco (Hall et al., 2001). 
 
1.2.3.3.2.1 Conjugación con glucosa 
 
En plantas, la glucosa es adicionada a los xenobióticos para formar diferentes 
tipos de conjugados mediante la acción de enzimas conocidas como 
glucosiltransferasas. La reacción general de formación de conjugados con glucosa 
se muestra a continuación: 
UDP-Glc + HO-X (H2N-X, HOOC-X) → Glc-O-X (Glc-NH-X, Glc-O-CO-X) + UDP 
Los xenobióticos con anillos aromáticos hidroxilados pueden ser conjugados 
con azúcares para formar los O-glucósidos. Los N-glucósidos se forman por la 
adición de azúcares en grupos amino del anillo aromático de los xenobióticos. Las 
reacciones de conjugación que ocurren en los grupos sulfhidrilo producen S-
glucósidos, los cuales son menos comunes. 
 23
Algunos ésteres de glucosa pueden sufrir una segunda conjugación con otro 
monosacáridopara producir un gentiobiosido; en donde, el segundo azúcar que es 
transferido al conjugado no tiene que ser glucosa (Hall et al., 2001). 
Las glucosiltransferasas, han sido descritas como enzimas solubles o unidas 
a membrana con masas moleculares nativas de 40 a 62 kD y compuestas de uno 
o dos polipéptidos (Kreuz et al., 1996). Estas enzimas, las cuales son codificadas 
por grandes familias multigénicas, están involucradas en la biosíntesis de una 
variedad de productos secundarios de plantas tales como flavonoides, glucósidos 
cianogénicos, glucosinolatos, glicoalcaloides, glucósidos de ácido salicílico y 
glucósidos de ácido indolacético (Gachon et al., 2005). 
 
1.2.3.3.2.2 Conjugación con glutatión 
El glutatión (GSH) es un tripéptido (γ-glutamilcisteinil-β-glicina) encontrado en 
organismos aerobios, y que está involucrado en la conjugación de xenobióticos y 
en la detoxificación de radicales libres (Coleman et al., 1997; Hall et al, 2001). Esta 
reacción ocurre por el ataque del anión GSH tiolato a un sustrato electrofílico (X-Z) 
con el desplazamiento simultáneo de un nucleófilo (Z) para formar moléculas 
menos tóxicas y más polares (Kreuz et al., 1996): 
 
X-Z + GSH → X-SG + HZ 
 
La conjugación de los xenobióticos con glutatión puede ocurrir 
enzimáticamente por la acción de glutatión-S-transferasas (GSTs), o no 
enzimáticamente (aunque en el último caso la reacción es más lenta). 
En plantas, las GSTs están localizadas en el citosol, son enzimas homo- o 
heterodiméricas (masa molecular en el rango de 23-30 kD) y existen como 
múltiples isoenzimas con actividades especie-específicas para un amplio espectro 
de compuestos electrofílicos. Las plantas con altas concentraciones de GSTs son 
 24
más tolerantes a ciertos herbicidas que las plantas con cantidades más bajas 
(Coleman et al., 1997; Hatzios, 2001). 
En la figura 12, se muestra la obtención del 4-nitrofenol como producto de la 
adición del glutatión al fluoridifen mediante la acción de una glutatión transferasa. 
 
NO2
OF3C NO2
+ Glutatión (GSH)
Glutatión-S-transferasa
NO2
GSHF3C
Conjugado GSH
+ HO NO2
9
1 
Fig. 12. Conjugación enzimática del fluorodifen (9) con glutatión en chícharo (citado 
en Hall et al., 2001) 
 
1.2.3.3.2.3 Conjugación con ácido malónico 
En esta reacción, los conjugados con glucosa de los xenobióticos se unen a hemi-
ésteres de ácido malónico en presencia de malonil-CoA. 
En algunos casos, los xenobióticos son conjugados con glutatión, el cual es 
degradado a cisteína antes de su conjugación con malonato. Por ejemplo, el 
fluorodifen-GSH es metabolizado a un conjugado de cisteína y posteriormente es 
N-acilado con ácido malónico (Kreuz et al., 1996; Coleman et al., 1997). 
 25
1.2.3.3.2.4 Conjugación con péptidos 
En la revisión de Korte et al. (2000) se indica que el fenol no es glicosilado en 
plantas intactas. Un estudio sobre el metabolismo del [1,6-14C]fenol en plántulas 
estériles de maíz, chícharo y calabaza demostró que los fenoles forman 
conjugados con péptidos de bajo peso molecular. Otros fenoles también forman 
conjugados con péptidos en plantas: el α-naftol en plántulas de maíz, chícharo y 
calabaza; el o-nitrofenol en plántulas de chícharo; el 2,4-dinitrofenol en plántulas 
de maíz, calabaza y chícharo. Los fenoles se unen covalentemente a péptidos por 
medio de grupos hidroxilo. La composición de aminoácidos de los péptidos que 
participan en la conjugación con fenoles varía. 
 
1.2.3.3.3 Reacciones de fase III (compartimentalización) 
Las plantas no tienen un sistema excretor, de manera que sus productos tóxicos 
usualmente son compartimentalizados en vacuolas o embebidos en polímeros 
estructurales para prevenir la toxicidad del xenobiótico. Sin embargo, en algunos 
casos, pueden ser exudadas pequeñas cantidades de xenobióticos de las raíces 
(Coleman et al.,1997; Hall et al., 2001). 
 
1.2.3.3.3.1 Compartimentalización en la vacuola 
La vacuola es el organelo involucrado en el almacenamiento de los compuestos y 
la osmorregulación; está rodeada por la membrana del tonoplasto producida por el 
Golgi. 
Respecto a la vía de entrada de conjugados a la vacuola, se han reportado 
transportadores que reconocen los conjugados de glutatión; dichos 
transportadores son dependientes de ATP y están localizados en el tonoplasto 
(Coleman et al., 1997). Aun no se han caracterizado transportadores de glucosa o 
 26
aminoácidos aunque se ha establecido la hipótesis de que existen debido a que el 
transporte requiere magnesio y es inhibida por vanadato (Kreuz et al., 1996). 
 
1.2.3.3.3.2 Residuos unidos 
Los metabolitos de xenobióticos, derivados de conjugación con glucosa y GSH 
pueden ser depositados como “residuos unidos” en la matriz extracelular (Kreuz 
et al., 1996, Coleman et al, 1997). 
 
 
 
1.2.3.4 Enzimas aisladas de plantas para la transformación de 
nitroaromáticos 
La nitrorreducción es un paso inicial en el metabolismo de una variedad de 
compuestos estructuralmente diversos, incluyendo los nitrofuranos, nitropirenos y 
nitrobencenos. Las enzimas que catalizan este proceso son llamadas 
nitrorreductasas. 
 
Las enzimas nitrorreductasas son ubicuas y pueden ser obtenidas de plantas, 
microorganismos y animales. Estas enzimas, a diferencia de las nitrato/nitrito 
reductasas, no reducen el nitrato o el nitrito, no son parte de ninguna cadena 
respiratoria y no proveen una fuente de nitrógeno reducido para el crecimiento 
celular. Se piensa que las nitrorreductasas se expresan constitutivamente, y sus 
funciones fisiológicas no son claras (Kitts et al., 2000). Estas enzimas se clasifican 
en dos grupos: sensibles al oxígeno e insensibles al oxígeno (Fig. 13). 
 
 27
Las nitrorreductasas insensibles al oxígeno o Tipo I, usan un mecanismo 
de reducción de dos electrones y son capaces de reducir los grupos nitro bajo 
condiciones aerobias (Kitts et al., 2000; Esteve-Nuñez et al., 2001). Ejemplos de 
estas enzimas, son la NAD(P)H- quinona oxidorreductasa (anteriormente llamada 
DT-diaforasa, EC 1.6.99.2) y las nitrorreductasas de las bacterias entéricas 
(Watanabe et al., 1998). 
Por otra parte, las nitrorreductasas sensibles al oxígeno, o Tipo II, reducen 
los grupos nitro en un proceso de un solo electrón, formando un anión radical nitro. 
En presencia de O2, el anión radical nitro puede ser oxidado nuevamente a un 
grupo nitro, y se produce el anión radical superóxido. Mientras el oxígeno esté 
presente, opera un ciclo que consume equivalentes reductores sin la reducción 
neta del grupo nitro. De esta manera, las nitrorreductasas tipo II sólo son capaces 
de la reducción neta del grupo nitro en ambientes anaerobios (Kitts et al., 2000; 
Esteve-Nuñez et al., 2001). Ejemplos de nitrorreductasas tipo II son la NADPH-
citocromo P-450 oxidorreductasa (EC. 1.6.2.4) y la NADPH-b5 oxidorreductasa 
(EC 1.6.2.2), (Watanabe et al., 1998). 
 
 
Fig. 13. Mecanismos para la reducción de grupos nitro en compuestos nitroaromáticos. El primer paso en la 
reducción del grupo nitro puede ser lograda a través de la transferencia de un electrón (línea sólida) o la 
transferencia de dos electrones (línea discontinua). El primer mecanismo produce un radical nitroanión que podría 
reaccionar con el oxígeno para formar radical superóxido y el compuesto nitroaromático original a través de un 
ciclo (línea punteada). Si el mecanismo ocurre mediante la transferencia de dos electrones, el derivado nitroso 
formado es el primer intermediario; siguiendo dos transferencias de electrones consecutivas, se producen la 
hidroxilamina y la amina aromática. (Esquema adaptado por Esteve-Nuñez et al., 2001 a partir de Spain, 1995). 
 
, • ro, 
o· , 
u.. p' 
~r ~, .. ~ . 
¿A. o 
•• H OH H H 1I >0 1;' " / Ji'"' ,,/ ~ ---- .... ~ -:OH-'- N --" ' ----- - ------~'------. 
OH' Ar Ar Ar 
 28
Las nitrorreductasas son flavoproteínas solubles que usan NADH o NADPH 
como donadoresde electrones. 
Hasta la fecha, no se ha identificado la (s) enzima (s) que lleva a cabo la 
transformación de compuestos nitroaromáticos en plantas. Existen sólo dos 
estudios que emplean enzimas purificadas de plantas. 
Shah y Spain (1996) encontraron que la ferredoxina NADP oxidorreductasa 
(una enzima sensible al oxígeno) de hoja de espinaca, transformó el explosivo 
2,4,6-trinitrofenilmetilnitramina (tetryl, 32) por liberación de nitrito, para formar el 
metabolito N-metil-2,4,6-trinitrobencenamina (33), como se esquematiza en la 
figura 14. 
e
H e
NO2
O2O2
N
NO2
NO2
O2N
H3C NO2
N
NO2
NO2
O2N
H3C NO2
N
NO2
NO2
O2N
H3C H
32 33
 
Fig. 14. Esquema propuesto para la eliminación de nitrito a partir del tetryl por la 
ferredoxina NADP oxidorreductasa de hojas de espinaca (Shah y Spain, 1996). 
 
En otro estudio, Shah y Campbell (1997) reportaron la reducción del 
nitrobenceno a fenilhidroxilamina por la ferredoxina NADP oxidorreductasa. Los 
autores encontraron que se forma aproximadamente un mol de fenilhidroxilamina 
por cada mol de nitrobenceno. El metabolito no fue observado bajo condiciones 
aerobias. 
 29
1.3 Generalidades sobre Lemna gibba 
Lemna gibba es una planta monocotiledónea perteneciente a la familia 
Lemnaceae. Las lemnáceas son las plantas más pequeñas con flores. 
 Las hojas de las lemnáceas comúnmente son llamadas frondas (Fig. 15A). A 
diferencia de las hojas de la mayoría de las plantas, la fronda de Lemna es una 
estructura propagativa (www.mobot.org/jwcross/duckweed/).Las frondas hijas se originan 
del tejido meristemático en el interior de dos sacos laterales de la fronda madre y 
pueden permanecer unidas a ella hasta que maduran; cada fronda hija que 
emerge de una bolsa ya contiene dos o más generaciones de frondas hijas (Li et 
al., 2004). 
 
 
Fig. 15. Planta de Lemna gibba vista desde la superficie adaxial (A), lateral (B) 
y abaxial (C), en la cual se observan las frondas (f), la raíz (r) y las bolsas de 
aerénquima (a). Las fotos B y C fueron obtenidas de 
http://de.wikipedia.org/wiki/Bucklinge_Wasserlinse 
El tejido debajo de la epidermis consiste de un parénquima fotosintetizador, 
parcialmente interrumpido por grandes espacios de aire intercelulares 
(aerénquima), mientras que la raíz está localizada en la cara abaxial (Fig. 15 B y 
C). Lemna minor y Lemna gibba presentan una sola raíz, mientras que otros 
géneros dentro de la misma familia no presentan raíz (Wolfia y Wolfiella) o 
presentan más de una raíz (Spirodella). 
Aunque las lemnáceas pueden presentar flores y frutos (Fig. 16 B y C, 
respectivamente), su forma de multiplicación es predominantemente vegetativa 
(Fig. 16A). 
A 
B C
f 
a r 
r r 
a 
 30
 
Fig. 16. Plantas de Lemna gibba en fase de reproducción asexual o 
vegetativa (A) y sexual (B y C). La figura B muestra plantas con flores y la figura 
C muestra el fruto. La foto B se obtuvo en http://botit.botany.wisc.edu/.../Lemnaceae/Lemna y la 
foto C en www.mobot.org/jwcross/duckweed/ . 
 
Las propiedades de las plantas que son favorables para la fitorremediación 
son: crecimiento rápido, alta biomasa, competitiva, robusta y tolerante a la 
contaminación (Pilon-Smits, 2005). En condiciones naturales, el crecimiento más 
intenso de Lemna gibba se presenta desde Junio hasta Agosto. Las plantas 
duplican su biomasa en 1-6 días, y la duplicación del número de frondas ocurre en 
2-3 días (Wang, 1990). Las lemnáceas cultivadas en el laboratorio pueden crecer 
indefinidamente si se proveen los nutrientes, la luz y el agua. Slovin y Cohen 
(1988) reportan que la cepa G-3 de Lemna gibba cultivada en medio E, crece a 
velocidad logarítmica durante 45 días, sin fase lag aparente. Cada fronda produce 
aproximadamente 15 frondas hijas y después la fronda madre senesce. En estos 
cultivos, las primeras frondas senescentes (amarillas) aparecen después de 20 
días de crecimiento y representan una pequeña fracción respecto a la población 
total. De acuerdo a Li et al (2004), estas plantas poseen un alto contenido de 
proteína (45 % del peso seco). 
Las lemnáceas están adaptadas a una amplia variedad de zonas climáticas y 
geográficas, con excepción de los desiertos y las regiones polares. En México, se 
encuentra en los estados de Aguascalientes, Baja California, Chihuahua, 
Coahuila, Distrito Federal, Durango, Guanajuato, Hidalgo, Jalisco, Michoacán, 
Oaxaca, Puebla, Querétaro, Sonora, Tamaulipas, Tlaxcala, Veracruz y Zacatecas 
(Lot et al., 1999). 
A B C
 31
Estas plantas se encuentran flotando libremente en estanques eutroficados 
formando una capa; su tamaño (aproximadamente 1 cm de diámetro) permite 
tener una cantidad abundante de biomasa en espacios reducidos. 
Lemna gibba se encontró creciendo de manera natural en humedales de sitios 
dedicados previamente a la minería de uranio en el estado de Sajonia, Alemania; 
en donde se observó que la planta es capaz de acumular relativamente grandes 
cantidades de este elemento. Debido a que durante la extracción de uranio 
también hubo exposición hacia otros elementos como el arsénico, Mkandawire y 
Dudel (2005) evaluaron la capacidad de Lemna gibba para acumular arsénico (en 
forma de arsenato) y encontraron que su acumulación incrementó con la 
concentración de arsénico en el medio pero disminuyó con la concentración de 
fosfato. 
Las especies Lemna gibba y Lemna minor han sido consideradas como 
especies de prueba estándar para la evaluación de toxicidad de agroquímicos. En 
la tabla 1, se muestran valores de concentración inhibitoria media (CI50) en Lemna 
gibba frente a algunos compuestos orgánicos y un compuesto inorgánico. De 
acuerdo a los autores, las lemnáceas se pueden adaptar y/o desarrollar 
resistencia rápidamente debido a su rápida tasa de crecimiento. 
Tabla 1. Concentraciones inhibitorias medias (CI50) en Lemna gibba frente 
a diferentes compuestos (adaptada de Wang, 1990) 
Sustancia CI5o (mg/L) 
CuSO4 2.21 
o-cresol 246 
di(2-etilhexil)ftalato 2,060 
Etilenglicol 17,159 
2,4,6-triclorofenol 0.13 
Los experimentos tuvieron una duración de 7 días y se evaluó la velocidad de 
crecimiento. 
 
 32
 
 
 
2. HIPÓTESIS 
En base a que se ha encontrado que la planta acuática Lemna minor presenta 
actividad nitrorreductasa y al hecho de que las plantas presentan la capacidad de 
detoxificar compuestos xenobióticos, se espera que la planta acuática Lemna 
gibba lleve a cabo la biodegradación del contaminante 4-nitrofenol. 
 
 
3. OBJETIVOS 
 
OBJETIVO GENERAL 
Evaluar la transformación del 4-nitrofenol en plantas axénicas de Lemna gibba 
(silvestre) en condiciones de laboratorio. 
 
OBJETIVOS PARTICULARES 
• Obtener plantas axénicas de Lemna gibba y mantenerlas en condiciones de 
laboratorio. 
• Determinar la cinética de degradación del 4-nitrofenol. 
• Determinar la existencia de actividad nitrorreductasa en el extracto crudo de 
la planta. 
 
 33
4. MATERIALES Y MÉTODOS 
4.1 Sustancias 
El 4-nitrofenol (98% de pureza), el NADPH (N6505), la nitrofurantoína y el DMSO 
se obtuvieron de Sigma. En el proceso de desinfección de las plantas se empleó 
hipoclorito de sodio (Cloralex, 6% de cloro activo), peróxido de hidrógeno al 30 % 
(Hycel de México), Promyl (Benomyl al 50%), Agri-mycin 500 (Pfizer, ANEXO 1), 
Cefotaxima (Kendrick). Los disolventes tetrahidrofurano (THF), acetonitrilo (ACN), 
acetato de etilo (AcOEt) y hexano fueron grado HPLC y se obtuvieron de Baker. El 
agua desionizada empleada para la fase móvil en el HPLC fue obtenida por un 
sistema MilliQ. La nitrorreductasa B de Salmonella fue proporcionada por el Dr. 
Jesús Espinosa Aguirre (Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM). 
 
4.2 Preparación de medios de cultivo 
Los medios de cultivo se prepararon a partir de soluciones stock 100 veces 
concentradas (100x). El agua utilizada para su preparación fue agua desionizada 
(Aqua Tec). Losreactivos fueron Grado Analítico o Grado Cultivo de Tejidos 
Vegetales. 
Medio Hoagland. El medio Hoagland líquido diluido 2.5 veces se preparó a partir 
de las soluciones stock indicadas en el ANEXO 2 (cuatro mililitros de cada 
solución 100 veces concentrada por litro de medio), se adicionó agua (c.b.p 1L) y 
la solución se ajustó a pH 7.0 (Sánchez-Villavicencio, 2003) con hidróxido de 
potasio empleando un pH metro Hanna pH209. El medio empleado en el cultivo de 
Lemna gibba axénica y los experimentos de biotransformación, se esterilizó por 
filtración con ayuda de filtros Millipore 0.45 μm. 
Medio MS. En la preparación de un litro de medio MS sólido se emplearon 10 mL 
de cada una de las soluciones stock (ANEXO 3), se adicionó sacarosa a una 
concentración final de 1% (p/v) y agua desionizada estéril (c.b.p. 1L). Después de 
 34
homogeneizar la solución, se ajustó el pH a 5.8 (Li et al. 2004) con hidróxido de 
potasio 1 N y 0.1 N y finalmente se adicionó Gelrite (Sigma) al 0.26% (p/v). El 
medio se calentó a ebullición (1 min/100 mL de medio) hasta la incorporación del 
agente gelificante y se colocó en frascos de vidrio con tapa. El medio de cultivo se 
esterilizó en autoclave durante 18 minutos a 120 ºC y a 1.2 kg/cm2. 
 
4.3 Condiciones de incubación 
Las plantas fueron mantenidas en incubación a una temperatura de 25 ± 2 °C, 
intensidad luminosa de 50 μmol/m2s (proporcionada por lámparas de luz blanca 
fluorescente), con un fotoperiodo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad. 
 
4.4 Colecta y mantenimiento del material vegetal 
La colecta se realizó en un estanque ubicado en las afueras de la ciudad de 
Amealco, Querétaro. El pH del agua de colecta fue de 7 (papel pH- Fix 0-14, 
CRISA). 
Con el fin de eliminar el material que acompaña a Lemna gibba, las plantas de 
interés se enjuagaron con agua corriente y después se colocaron en medio 
Hoagland líquido (ANEXO 2) diluido 2.5 veces y ajustado a pH 7.0. Las plantas 
se incubaron en las condiciones descritas en recipientes abiertos. 
 
4.5 Obtención y mantenimiento de plantas axénicas. 
Las plantas obtenidas a partir del cultivo en el laboratorio, fueron sometidas a una 
serie de soluciones de agentes antimicrobianos durante un determinado tiempo y 
en agitación magnética (con excepción del tratamiento con cefotaxima). Antes de 
colocar las plantas en una nueva solución, éstas fueron enjuagadas con agua 
desionizada estéril. En primer lugar se pusieron en contacto por 60 minutos con 
 35
H2O2 al 3%; posteriormente se transfirieron a una solución de Promyl (1 g/L) y 
permanecieron en esta solución por 10 minutos, seguido del tratamiento con Agri-
mycin 500 (1 g/L) durante 10 minutos. Finalmente se colocaron en una solución 
de Cefotaxima (0.5 g/L) durante 30 minutos sin agitación. 
Las plantas tratadas (a las cuales se les cortó la raíz para facilitar la 
manipulación) se colocaron en medio MS sólido (ANEXO 3) pH 5.8 con la 
superficie adaxial en contacto con el medio (Li et al., 2004) y se mantuvieron en 
incubación en las condiciones descritas (sección 4.3). Después de transcurridas 
48 horas de incubación, se buscó la presencia de hongos, bacterias y algas. Las 
plantas que no presentaban organismos asociados, se mantuvieron en incubación 
durante aproximadamente 20 días y posteriormente se transfirieron a medio 
Hoagland líquido diluido 2.5 veces. La transferencia de las plantas axénicas a 
medio de cultivo nuevo, se realizó cada 7 días. 
 
4.6 Experimento de biotransformación 
En el experimento de biotransformación se emplearon tres sistemas: (A) 4- 
nitrofenol disuelto en medio de cultivo, (B) Lemna gibba axénica en medio de 
cultivo. (C) 4-nitrofenol y Lemna gibba en medio de cultivo. 
Los experimentos se llevaron a cabo en matraces Erlenmeyer de 125 mL los 
cuales contenían 50 mL de medio Hoagland diluido 2.5 veces. A los sistemas A y 
C, les fue adicionado el 4-nitrofenol (solución acuosa [1mg/mL]) de manera que se 
obtuviera una concentración final de 2.5 mg/L (19.92 μM). A los matraces de los 
sistemas B y C se les agregaron aproximadamente 0.4 g de plantas axénicas. 
Durante el experimento se monitoreó el medio de cultivo (concentración de 4-
nitrofenol) y el material vegetal (aspecto, peso fresco, cantidad de proteína, 
presencia de 4-nitrofenol y/o metabolitos de éste y la actividad nitrorreductasa). 
Tal monitoreo se llevó a cabo al inicio del experimento y posteriormente a las 48, 
96 y 144 horas de incubación. 
 36
4.6.1 Determinación de la concentración de 4-nitrofenol en el 
medio de cultivo 
En cada día de muestreo, se filtró el contenido de los matraces a través de papel 
Whatman No. 2, se registró el volumen de medio y le fueron agregados 25 mL de 
THF; de esta solución se tomó una alícuota y se guardó en refrigeración hasta su 
análisis. El análisis por HPLC se llevó a cabo en un cromatógrafo de líquidos 
Perkin-Elmer con detector de arreglo de diodos, a 320 nm, equipado con una 
columna de fase reversa C18 EC 250/4 NUCLEOSIL 120-5 (Macherey-Nagel). La 
elusión se realizó con un gradiente de agua-acetonitrilo (ACN) como se muestra 
en la tabla 2, con una velocidad de flujo de 0.5 mL/min. Cincuenta microlitros del 
medio de cultivo adicionado con THF, fueron inyectados a los 5.5 min del inicio de 
la corrida (paso cero). 
La concentración del 4-nitrofenol se calculó mediante interpolación con una 
curva patrón de 4-nitrofenol disuelto en medio Hoagland y THF (1:1, v/v) y se 
corrigió respecto al volumen de medio de cultivo obtenido en cada día de 
muestreo. 
Tabla 2. Gradiente de elusión para separar y cuantificar el 4-nitrofenol en el 
medio de cultivo y el material vegetal. 
Paso Tiempo 
(min) 
Flujo 
(mL/min)
% ACN % H2O 
0 0.0 0.5 0 100 
1 2.0 0.5 0 100 
2 10.0 0.5 100 0 
3 2.0 0.5 100 0 
 
4.6.2 Análisis del material vegetal 
El material vegetal obtenido después de filtrar el contenido de cada uno de los 
matraces, fue utilizado para realizar las siguientes determinaciones: peso fresco, 
presencia de 4-nitrofenol y/o sus metabolitos, cuantificación de clorofilas a y b. 
 37
La cantidad de proteínas y la actividad nitrorreductasa se realizaron con 
muestras de planta que permanecieron en incubación durante 144 horas. 
 
4.6.2.1 Determinación del peso fresco 
Las plantas recién filtradas obtenidas en cada día de muestreo, se enjuagaron 
con agua desionizada estéril, se transfirieron a papel absorbente estéril para 
eliminar el agua superficial y se registró el peso de las plantas. 
 
4.6.2.2 Búsqueda de 4-nitrofenol y/o metabolitos en el material 
vegetal 
El material vegetal, previamente pesado, se colocó en un mortero frío y se molió 
con ayuda de hielo seco. El sólido obtenido se extrajo con una mezcla de MeOH: 
CH2Cl2 (2:1, v/v). Veinte microlitros de extracto se aplicaron a una placa de silica 
gel (Alugram Sil G/UV254, Macherey Nagel) la cual fue eluída con una mezcla de 
Hex-AcOEt (1:1, v/v); al evaporarse el eluyente la cromatoplaca se visualizó en 
una cámara de luz ultravioleta de onda corta (254 nm). La mezcla de disolventes 
del extracto se evaporó a sequedad y el sólido se resuspendió en 1 mL de ACN, 
esta solución se centrífugo a 3500 x g durante 5 minutos y 50 μL del sobrenadante 
se inyectaron en el HPLC. Las condiciones de elusión son las mismas que se 
utilizaron para el análisis del medio de cultivo (sección 4.6.1). 
 
4.6.2.3 Determinación de clorofilas a y b 
Al finalizar el periodo de incubación correspondiente, se sacaron las plantas del 
medio de cultivo, se eliminó el agua superficial y se colocaron en 25 mL de una 
mezcla MeOH:CH2Cl2 (2:1, v/v). Las plantas permanecieron en contacto con el 
disolvente durante 12 h, después de lo cual se filtró la solución y se registró la 
 38
absorbancia de la solución a 647 nm y 664 nm (espectrofotómetro UV-Vis 
Shimadzu U160). La cantidad de clorofilas a y b se determinómediante las 
siguientes ecuaciones: 
Clorofila a = 11.93 A664nm – 1.93 A647nm 
Clorofila b = 20.36 A647nm – 5.50 A664nm 
 
4.6.2.4 Obtención del extracto crudo de Lemna gibba 
Las plantas previamente pesadas (las cuales fueron independientes de las 
extraídas con solventes orgánicos), se trituraron en un mortero con ayuda de hielo 
seco. Las plantas molidas se transfirieron a tubos eppendorf y se les adicionaron 
1.5 mL de buffer de fosfatos 50 mM pH 7.0. La suspensión se agitó en vortex y 
posteriormente se centrifugó a 100,000 g durante 60 minutos (ultracentrífuga 
Beckman L8-55) y se recuperó el sobrenadante, al cual se le determinó la 
cantidad de proteínas y la actividad nitrorreductasa. 
 
4.6.2.5 Cuantificación de proteínas 
La cuantificación de proteínas se llevó a cabo por el método de Bio-Rad (basado 
en el método de Bradford, 1976). 
El reactivo se preparó diluyendo 1 parte del colorante concentrado por 4 
partes de agua destilada y desionizada. Esta solución se filtró a través de papel 
filtro Whatman No. 1 para eliminar las partículas. 
Las muestras se prepararon con 20 μL de extracto crudo y 980 μL de reactivo, 
posteriormente se registró la absorbancia a 595 nm. La concentración de proteína 
en las muestras, se calculó por interpolación de la absorbancia en una curva 
patrón de albúmina sérica bovina. 
 
 
 39
4.6.2.6 Ensayo de actividad nitrorreductasa 
La evaluación de la actividad nitrorreductasa de los extractos crudos obtenidos de 
las plantas de los sistemas B y C se realizó de acuerdo al protocolo establecido 
por el grupo de trabajo del Dr. Jesús Espinosa Aguirre (modificado de Liochev et 
al., 1999). 
La determinación se basa en la oxidación del NADPH por un sustrato 
nitroaromático en presencia de una enzima con actividad nitrorreductasa para 
formar el compuesto aminoaromático y NADP+. A diferencia de su forma oxidada 
(NADP+), el NADPH absorbe a 340 nm. Se espera que al transcurrir la reacción, 
se consuma el NADPH y por tanto disminuya la absorbancia a dicha longitud de 
onda. 
Para descartar los factores que provoquen la disminución del NADPH 
(consumo por el extracto o por interacción con el nitroaromático sin el extracto), se 
emplearon varios controles, los cuales se muestran en la tabla 3 (mezclas de 
reacción 2 a 4). 
 
Tabla 3. Contenido de las mezclas de reacción en el ensayo de actividad 
nitrorreductasa. 
 
 
a Equivalente a 50 μg de proteína. 
b 4-nitrofenol o nitrofurantoína 
c Se adicionó justo antes de iniciar la reacción 
 
Mezcla de 
reacción 
Extracto 
crudoa 
Nitroaromáticob NADPHc 
1 + + + 
2 + - + 
3 - + + 
4 - - + 
5 + + - 
6 + - - 
7 - + - 
 40
Como se muestra en la tabla 2, los controles de reacción consistieron de 
buffer de fosfatos 50 mM (pH 7.0), al cual se adicionó extracto crudo (equivalente 
a 50 μg de proteína), compuesto nitroaromático (4-nitrofenol o nitrofurantoína) y/o 
NADPH. 
El procedimiento que se describe a continuación, se refiere a la mezcla de 
reacción 1 pero se aplica, con las modificaciones necesarias, a todas las mezclas 
de reacción. 
En un volumen final de reacción (1.0 mL), se mezcló buffer de fosfatos 50 mM 
(pH 7.0), extracto crudo equivalente a 50 µg de proteína y 10 μL de solución stock 
2.5 mM de nitroaromático (nitrofenol o nitrofurantoìna) disuelto en DMSO. La 
mezcla se incubó 10 minutos a 25 °C evitando el contacto con la luz. Para 
comenzar la reacción, luego de la incubación se adicionaron 10μL de solución 
stock 10 mM de NADPH y se leyó inmediatamente a 340 nm durante 4 minutos 
en un espectrofotómetro Camspec M350 Double Beam. 
La velocidad de consumo del NADPH en presencia de extracto crudo y 
nitroaromático se determinó en base a los resultados de absorbancia de la mezcla 
1 menos las mezclas que contienen NADPH (mezclas 2, 3 y 4). Para calcular la 
concentración de NADPH se consideró un coeficiente extinción molar de 6.22 
mM1cm-1 a 340 nm, como se muestra en el ANEXO 4. 
En el caso del control positivo se empleó 1 µL de nitrorreductasa B de 
Salmonella sp (actividad específica de 195 nmol/min mg proteína) en lugar del 
extracto crudo. 
 
 
 
 
 
 41
5. RESULTADOS 
5.1 Colecta y crecimiento de Lemna gibba 
El material vegetal fue colectado en estanques ubicados en las afueras de la 
ciudad de Amealco, Qro. Estas plantas fueron identificadas como Lemna gibba por 
el Dr. Antonio Lot Helgueras. Debido a que la planta de interés cohabita con otros 
organismos, fue necesario eliminarlos. 
Las plantas adultas de Lemna gibba presentaron cuatro o más frondas, las 
cuales forman un diámetro de aproximadamente 1 cm (figura 17). Las frondas 
poseen bolsas de aire (aerénquima) que son características de esta especie. 
También se presenta un tallo-raíz que varía de tamaño (se observaron raíces de 
hasta 5 cm de longitud). Como se observa en la figura 17, las plantas que 
permanecieron en cultivo en el laboratorio durante 5 meses, perdieron las zonas 
de aerénquima. 
 
 
Fig. 17. Comparación del aspecto de Lemna gibba recién colectada 
(izquierda) y después de 5 meses de cultivo en el laboratorio (derecha). 
A=Vista frontal, B=Vista lateral. 
 
 
 
A 
B 
 42
5.2 Experimento preliminar de biotransformación 
Con el fin de estandarizar las condiciones de experimentación para evaluar la 
interacción de Lemna gibba y el 4-nitrofenol en condiciones de laboratorio, se 
realizaron una serie de experimentos. Para tal efecto se establecieron tres 
sistemas: el sistema A contenía 2.5 mg/L (19.92 μM) de 4-nitrofenol en medio de 
cultivo Hoagland diluido 2.5 veces (pH 7.0); el sistema B se empleó como control 
de crecimiento de Lemna gibba en medio de cultivo y en el sistema C, Lemna 
gibba se encontraba creciendo en solución de 4-nitrofenol a la misma 
concentración que el sistema A. Los experimentos se llevaron a cabo en matraces 
Erlenmeyer de 125 mL con tapón de gasa y algodón. Cada sistema se evaluó por 
triplicado. 
En los primeros experimentos, las plantas de los sistemas B y C habían sido 
tratadas con una solución de hipoclorito de sodio comercial al 1% (v/v) durante 2 
minutos. 
Al transcurrir cuatro, ocho y doce días de incubación, se determinó la 
absorbancia del medio de cultivo a 400 nm, tomando 3 réplicas de cada sistema 
para cada día de muestreo y posteriormente se correlacionó con la concentración 
de 4-nitrofenol. 
Los resultados (tabla 4) mostraron que la concentración de 4-nitrofenol en el 
medio de cultivo en ausencia de planta (sistema A), se mantuvo constante durante 
el periodo de incubación. En el caso del sistema C, la concentración disminuyó en 
un 83% a los 4 días de incubación; sin embargo, la absorbancia aumenta a los 8 y 
12 días de incubación. Es importante mencionar que a partir del día 7, se 
comenzaron a observar algas en el medio de cultivo, por lo que la absorbancia 
registrada, no se pudo correlacionar con la concentración de 4-nitrofenol. 
La extracción con acetato de etilo del medio de cultivo de los tres sistemas a 
los 12 días de incubación y su análisis por cromatografía en capa fina de fase 
normal (Fig. 18), reveló que la cantidad de 4-nitrofenol en el medio de cultivo que 
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había estado en contacto con Lemna gibba (sistema C), era menor en relación al 
sistema que no contiene la planta (sistema A), confirmando la participación de 
Lemna gibba en la disminución de la cantidad de 4-nitrofenol en el medio de 
cultivo. La cromatografía no mostró la presencia del metabolito 4-aminofenol en 
los extractos del medio de cultivo. En el medio extraído a partir del sistema B no 
se observó ningún metabolito proveniente del material vegetal. 
Tabla 4. Concentración de 4-nitrofenol en el medio de cultivo en el 
experimento de biotransformación 
 
 
* Los datos de absorbancia correspondientes a los 8 y 12 días de incubación en presencia de Lemna gibba 
son 0.060 ± 0.002 y 0.204 ± 0.020;