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T E S I S 
Estudio de la interacción entre el supresor de 
tumores LKB1 y la proteína cinasa C en líneas 
celulares de colon. 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE : 
BIÓLOGO 
P R E S E N T A : 
ERIC FLORES HERNÁNDEZ 
DRA. MARTHA ROBLES FLORES 
2008 
Neevia docConverter 5.1
 
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1. Datos del alumno 
Apellido paterno: 
Apellido materno: 
Nombre: 
Teléfono: 
Universidad: 
Facultad o Escuela: 
Carrera: 
No. de cuenta: 
1. Datos del alumno 
Flores 
Hernández 
Eric 
044 55 33 10 18 93 
Universidad Nacional Autónoma de 
México 
Facultad de Ciencias 
Biología 
09710960-2 
 
2. Datos del tutor 
Grado: 
 Nombre: 
 Apellido paterno: 
 Apellido materno: 
 
2. Datos del tutor 
Dra. 
Martha 
Robles 
Flores 
3. Datos del sinodal 1 
Grado: 
Nombre: 
Apellido paterno: 
Apellido materno: 
 
3. Datos del sinodal 1 
Dra. 
Marina 
Macías 
Silva 
4. Datos del sinodal 2 
Grado: 
Nombre: 
Apellido paterno: 
Apellido materno: 
4. Datos del sinodal 2 
Dra. 
Claudia 
González 
Espinosa 
5. Datos del sinodal 3 
Grado: 
Nombre: 
Apellido paterno: 
Apellido materno: 
 
5. Datos del sinodal 3 
Dra. 
María Cristina 
Castañeda 
Patlán 
6. Datos del sinodal 4 
Grado: 
Nombre: 
Apellido paterno: 
Apellido materno: 
 
6. Datos del sinodal 4 
M. en C. 
Héctor 
González 
Aguilar 
7. Datos del trabajo escrito 
Título: 
 
 
 
Número de páginas: 
Año: 
 
 
7. Datos del trabajo escrito 
Estudio de la interacción entre el 
supresor de tumores LKB1 y la 
proteína cinasa C en líneas celulares 
de colon. 
47 
2008 
 
 
 
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A Nelita, cuyo coraje y disciplina siempre me han alentado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Agradezco a la Dra. Martha Robles Flores, por el apoyo, la paciencia infinita y la confianza que 
me otorgó para la realización de este trabajo. 
 
Agradezco a la Dra. Marina Macías Silva, a la Dra. Claudia González Espinosa, a la Dra. María 
Cristina Castañeda Patlán y al M. en C. Héctor González Aguilar por el apoyo en la revisión de 
este trabajo. 
 
Agradezco a mis padres Abel y Juanita por el amor y el sustento que siempre me han brindado. 
 
Agradezco a mis tíos Bertha, Amado y María Luisa por la gran generosidad que siempre han 
tenido hacia mí. 
 
Agradezco a Alma Graciela porque su cariño nunca ha faltado en los momentos más difíciles. 
 
Agradezco a Erick, a Tatiana y a Jonathan por ser mis amigos. 
 
Este proyecto fue apoyado por CONACyT y por PAPIIT. 
 
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ÍNDICE 
 
Lista de abreviaturas ………………………………………………………………………..1 
Resumen ………………………………………………………………………………….......3 
 
1. Introducción .............................................................................................................4 
 
1.1 Cáncer ….......................................................................................................5 
-Cáncer colo-rectal ....................................................................................7 
1.2 Epitelio intestinal ..........................................................................................8 
1.3 La ruta de señalzación canónica Wnt .......................................................10 
1.4 Proteína Cinasa C ......................................................................................13 
-Estructura ..............................................................................................14 
-Alteraciones en el patrón de expresión ..................................................17 
1.3 Cinasa de serina treonina LKB ................................................................18 
 -Función y localización..............................................................................10 
 -Vías de señalización.................................................................................20 
-Polaridad ................................................................................................. 20 
- Síndrome PJ ..........................................................................................21 
1.4 LKB1, Wnt y PKC ....................................................................................23 
 
 
2. Hipótesis .................................................................................................................24 
 
3. Objetivos .................................................................................................................24 
 
4. Materiales y métodos 
4.1 Líneas celulares ....................................…...................................................25 
 4.2 Cultivo celular .............................................................................................26 
 4.3 Obtención de extractos celulares .............................................................26 
 4.4 Cuantificación de proteínas ......................................................................26 
 4.5 Electroforesis e Inmunoblot .....................................................................26 
 4.6 Inmunoprecipitación ..................................................................................27 
 Inmunofluorescencia y DAPI seguida de microscopía confocal .......….......28 
 
5. Resultados 
 - La secuencia de Lkb1 posee sitios consenso de fosforilación para PKC .........29 
 - Expresión de LKB1 en las líneas celulares normales 112-CON e IEC-18 .......30 
 -Expresión de LKB1 en las líneas celulares de cáncer de colon HT-29 y RKO ..31 
 - Interacción entre LKB1 e isoformas de PKC en líneas celulares de colon........32 
 -LKB1 y PKC βI co-localizan en IEC-18.............................................................34 
 -LKB1 y PKCβI co-localizan en RKO..................................................................36 
6. Discusión .................................................................................................................39 
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7. Conclusiones ...........................................................................................................40 
8. Bibliografía .............................................................................................................42 
 
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 1 
Lista de abreviaturas y nombres 
 
PKC: Protein kinase C; proteína cinasa C. 
LKB1: nombre del gen causante del síndrome de Peutz-Jeghers. 
DNA: Deoxiribonucleic acid; ácido desoxirribonucleico. 
LOH: Loss of heterozygosity; pérdida de heterocigocidad. 
ISSSTE: Instituto de seguridad y servicios sociales de los trabajadores del estado. 
Wnt: ruta de señalización “Wnt” o ligando “Wnt” 
APC: Adenomatous polyposis coli; proteína de poliposis adenomatosa de colon. 
CKIα: Casein kinase Iα; caseína cinasa Iα. 
GSK-3β: Glycogen sintase kinase 3β; cinasa de la glucógeno sintetasa isoforma 3β 
LRP: LDL Receptor related protein; proteína relacionada al receptor de LDL. 
LEF: Lymphoid enhancer factor; factor potenciador linfoide. 
Dvl: dishevelled 
TCF: T-Cell factor; factor de células T. 
c-Myc: factor de transcripción similar al oncogene de la mielocitomatosis viral 
PCP: Planar celular polarity; polaridadplanar celular. 
JNK: Jun N-terminal kinase; cinasa del extremo amino de Jun. 
PLC: Phospholipase C; fosfolipasa C. 
IP3: Inositol 1,4,5-trisphosphate; 1,4,5-trisfosfato de inositol. 
CamKII: Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II; cinasa dependiente de calcio-
calmodulina II. 
PS: Phosphatidylserine; fosfatidilserina. 
DAG: Diacylglycerol; diacilglicerol. 
cPKC: Classical PKC; PKC clásica. 
nPKC: Novel PKC; PKC nueva. 
aPKC: Atypical PKC; PKC atípica. 
PKD: Protein kinase D; proteína cinasa D. 
PIP2: Phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate; fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato. 
PIP3: Phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate; fosfatidilinositol 3,4,5-trisfosfato. 
TPA: 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetate; 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato 
PMA: Phorbol 12-myristate 13-acetate; forbol-12-miristato-13-acetato. 
ATP: Adenosine triphosphate; trifosfato de adenosina. 
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 2 
CG-NAP: Centrosome and golgi-localized PNK-associated protein; proteína asociada a PNK 
localizada en el aparato de Golgi y centrosoma. 
RACKs: Receptor for activated C kinase; receptor para cinasa C activada. 
STICKs: Substrates that interact with C kinase; sustratos que interaccionan con PKC 
TGFβ: Transforming growth factor β; factor de crecimiento transformante β. 
STK11: Serine-threonine kinase 11; cinasa de serina-treonina 11 
STRAD: Ste20 related adaptor; adaptador relacionado a Ste20. 
MO25: Mouse protein 25; proteína de ratón 25. 
Par: Partitioning defective protein, proteína de repartición defectuosa. 
GCK: Germinal center kinase; Cinasa del centro germinal. 
LIP1: LKB1 interacting protein; proteína que interacciona con LKB1 
Hsp90: Heat shock protein 90; proteína de choque térmico 90. 
Cdc37: Cell division cycle-related protein kinase 37; cinasa relacionada con el ciclo de división 
celular 37. 
AMP: Adenosine monophosphate; monofosfato de adenosina. 
AMPK: AMP-activated protein kinase; cinasa dependiente de AMP. 
ACC: Acetyl-Coenzime A carboxylase; carboxilasa de la acetil-Coenzima A. 
RING: E3 Ubiquitin-protein ligase RNF5; ligasa proteína-ubiquitina E3 RNF5. 
PDZ: acrónimo que combina las primeras letras de tres proteínas — post synaptic density protein 
(PSD95), Drosophila disc large tumor suppressor (DlgA), y zonula occludens-1 protein (zo-1) — en 
las cuales se descubrió que comparten este dominio. Los dominios PDZ ayudan a anclar las 
proteínas transmembranales al citoesqueleto y a mantener unidos los complejos de señalización. 
PJS: Peutz-Jeghers sindrome; síndrome de Peutz-Jeghers. 
XEEK: Xenopus egg and embryo Kinase; cinasa del huevo y del embrión de Xenopus. 
ATCC: American type culture collection 
DMEM: Dulbeco’s modified Eagle’s medium; medio de Eagle modificado por Dubelco 
EDTA: ethylene diamine tetraacetic acid; ácido etilendiaminotetraacético. 
EGTA: ethylene glycol tetraacetic acid; ácido etilenglicoltetraacético 
PMSF: phenylmethylsulfonyl fluoride; fluoruro de fenil-metil-sulfonilo 
SDS: Sodium dodecil sulfate; dodecilsulfato de sodio 
PAGE: Polyacrylamide gel electrophoresis; electroforesis en gel de poliacrilamida 
PBS: Phosphate buffered saline ; amortiguador salino de fosfato 
FITC: Fluorescein isothiocyanate; isotiocianato de fluoresceína. 
DAPI: 4’,6-diamino-2-phenylindole; 4’,6-diamino-2-fenilindol. 
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 3 
cDNA: Complementary DNA; ADN codificante. 
kDa: kilodalton. 
 
 
RESUMEN 
 
La proteína cinasa C (PKC) es un elemento amplificador clave en las rutas de transducción de 
señales hormonales que controlan un amplio rango de respuestas biológicas tales como expresión 
génica, proliferación y diferenciación celular. Desde su descubrimiento ha generado gran interés 
en el estudio del cáncer, debido a que es el blanco de moléculas promotoras de tumores, está 
implicada en la activación de oncogenes, en el control de la proliferación celular y en la apoptosis, 
y por tanto, es una enzima clave en el proceso de la carcinogénesis. Los tumores de tipo colo-
rectal se encuentran entre las formas de cáncer más frecuentes en el ser humano. Debido a que el 
epitelio intestinal está en continua renovación, es susceptible a experimentar un descontrol de la 
proliferación celular que lo puede llevar a la transformación maligna. Se ha demostrado que para 
el mantenimiento adecuado de la homeostasis de este epitelio intervienen varias vías de 
señalización, de las cuales, la ruta Wnt está alterada en más del 90% de los casos de carcinoma y 
adenocarcinoma de colon. Existen numerosos trabajos que han demostrado la participación de 
PKC en el proceso de carcinogénesis del colon y, de manera interesante, se ha involucrado a PKC 
en la regulación de la llamada vía no canónica de la ruta de señalización Wnt, aunque su 
participación precisa aún se desconoce. 
Por otro lado, la proteína supresora de tumores LKB1 es una cinasa de residuos de serina y 
treonina que se encuentra mutada y con baja actividad en el síndrome Peutz-Jeghers, el cual se 
asocia a cáncer intestinal. Actualmente se sabe que LKB1 participa en la regulación del 
metabolismo energético, en el mantenimiento de la polaridad celular y en el desarrollo 
embrionario, sin embargo su participación en el cáncer colo-rectal aún no ha sido completamente 
estudiada. 
En este trabajo, utilizando líneas celulares de colon humano y de intestino de rata en cultivo, 
encontramos que existe un aumento en la expresión de LKB1 en células malignas con respecto a 
su expresión en las células normales. También demostramos por primera vez, mediante 
experimentos de co-inmunoprecipitación, inmunofluorescencia y microscopía confocal, que el 
supresor tumoral LKB1 y las isoformas de proteína cinasa C α, βI y δ interaccionan 
específicamente tanto en las células normales de intestino como en las cancerosas. 
 
 
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 4 
INTRODUCCIÓN 
 
 
Los seres vivos tanto unicelulares como pluricelulares tienen mecanismos de comunicación que 
les permiten reaccionar a cambios en el ambiente; ya sea externo, en el caso de los organismos 
unicelulares, o, como en el caso de las células de un organismo pluricelular, reaccionar a las 
señales del medio interno, generando una respuesta. Esta habilidad de las células de recibir y 
actuar en respuesta a señales emitidas más allá de la membrana plasmática es fundamental para 
la vida. Las células bacterianas perciben señales por medio de receptores de membrana que 
monitorean el medio circundante, y esto les permite responder a estímulos tales como pH, fuerza 
osmótica, disponibilidad de nutrientes, oxígeno, depredadores, competidores, etc. En organismos 
más complejos, los distintos tipos celulares intercambian una amplia variedad de información de 
su entorno y de las actividades metabólicas interdependientes que se llevan a cabo en diferentes 
tejidos. En todos estos casos las señales son detectadas por receptores específicos y se 
transducen en respuestas celulares apropiadas. 
 
A pesar del inmenso número de señales biológicas, así como igual cantidad de respuestas, los 
organismos usan sólo unos pocos mecanismos evolutivamente conservados para detectar señales 
extracelulares y transducirlas en cambios intracelulares (1). La transmisión de una señal involucra 
la interacción de un ligando extracelular con una proteína receptora en la célula. La unión del 
ligando cambia la conformación del receptor, de una forma inactiva a una activa, provocando que 
la señal sea transmitida al interior celular. El proceso es llamado transducción de señales debido a 
que un tipo de señal ha sido transformado a otro a través de la proteína receptora. La transducción 
provee una amplificación de la señal original. 
 
Estos mecanismos de comunicación a veces sufren alteraciones debido a múltiples factores. Las 
alteraciones tanto genéticas como epigenéticas ocasionan fallas permanentes en la actividad 
celular, dando como resultado estados patológicos comoproliferación excesiva de las células, lo 
que en muchos casos resulta en la transformación maligna de las mismas. Debido a que diversos 
estudios han demostrado una red de intercomunicación entre los sistemas de señalización y que 
una vía puede interaccionar con otra, en el presente trabajo se estudiaron dos proteínas de las 
que hay datos que indican que podrían interaccionar y participar en la progresión de la 
carcinogénesis colo-rectal: LKB1 y PKC. 
 
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 5 
 
Cáncer 
 
En 2005, de 58 millones de defunciones registradas en todo el mundo, 7.6 millones se debieron al 
cáncer. Más del 70% de todas las muertes por cáncer se producen en los países de ingresos 
bajos y medios, donde los recursos disponibles para la prevención, el diagnóstico y el tratamiento 
de la enfermedad son limitados o inexistentes. Se prevé un aumento de las muertes por cáncer, 
hasta de aproximadamente 9 millones en 2015, y 11,4 millones en 2030 (2). 
 
Existe un equilibrio particular en cada órgano en lo concerniente a la proliferación y la muerte 
celular. A este estado fisiológico se le denomina cinética celular normal y se regula en cada tejido 
según su función. La ruptura de este equilibrio a favor de la acumulación de células somáticas, ya 
sea por mecanismos genéticos o epigenéticos llevan a la aparición de fenotipos alterados que son 
sujetos a selección; ésta es la esencia del origen de las neoplasias. Carcinogénesis es el proceso 
durante el cual las mutaciones sucesivas convierten una célula normal en un conjunto de células 
neoplásicas y su progenie sobrepasa los controles normales de proliferación y territorio (3). En la 
visión de la carcinogénesis como un proceso multifactorial, cada paso mutacional conduce a la 
expansión clonal de células que llevan una nueva mutación; de este modo, la probabilidad de que 
mutaciones múltiples ocurran en una misma célula se incrementa. Sin esta expansión clonal de 
células mutantes, las probabilidades de acumulación de varios eventos poco frecuentes en la 
misma célula serían muy bajas (4). 
 
El ritmo normal de mutaciones y sus mecanismos de reparación, así como las vías hacia la 
apoptosis, se ven afectados en el cáncer, ya que de forma habitual las células son capaces de 
reparar la gran mayoría de sus mutaciones (5). Las neoplasias se inician por mutaciones o 
expresiones anormales en genes que cumplen las funciones de proliferación celular, apoptosis, 
reparación del DNA y envejecimiento celular. Después, las divisiones celulares sucesivas de esta 
población tumoral inicial producen nuevas mutaciones que alteran otras funciones celulares y 
otorgan nuevos atributos biológicos como son la motilidad celular, la adhesividad celular, 
protección inmunológica y metástasis. Estas alteraciones varían con el tipo de tumor. Por lo 
anterior, las características del fenotipo canceroso son, por un lado, ignorar las señales 
antiproliferativas y de diferenciación para mantener la capacidad de proliferación sostenida, y por 
otro, la evasión de la apoptosis, invasión y angiogénesis (6,7). 
 
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 6 
Las células cancerosas poseen todo tipo de mutaciones incluyendo las puntuales, las deleciones o 
pérdida de un segmento grande del cromosoma, la amplificación, la translocación y las 
aneuploidías, que afectan el número de cromosomas. La exposición continua a agentes 
carcinogénicos provoca variaciones genéticas progresivas en las células susceptibles. La mayoría 
de los carcinógenos no son activos en su forma inicial, pues requieren de una transformación 
metabólica en el organismo mediada por los citocromos P450, cuya expresión varía en cada 
individuo. Algunas personas no poseen las enzimas que metabolizan los pro-carcinógenos y esto 
los protege frente a su efecto mutagénico. Esto explica, en parte, la diferente frecuencia de 
tumores en individuos con el mismo grado de exposición a agentes químicos (8) 
 
Muchas alteraciones, ya sea de tipo genético o epigenético, pueden causar la excesiva 
proliferación celular característica del cáncer. Entre las genéticas tenemos la de ganancia de 
función o adquisición de una función genética, que es un mecanismo en donde los genes que 
tienen funciones en el control normal de crecimiento celular o la diferenciación tienen una 
expresión inapropiada y debido a esto, por una variedad de mecanismos, pueden conducir a 
cáncer. Cuando un gen mutado tiene una ganancia de función que produce cáncer se denomina 
oncogen, su contraparte no mutada recibe el nombre de proto-oncogen. La pérdida de funciones 
es otro mecanismo involucrado en la carcinogénesis, en donde la pérdida de un gen supresor de 
tumores es requerida para la tumorigénesis. Las mutaciones de pérdida de función son mucho 
más comunes que las mutaciones de ganancia de función en el caso de cáncer hereditario (que se 
da por alteraciones heredadas en la secuencia de DNA de la célula progenitora) (5,6) debido a 
que la pérdida es enmascarada durante el desarrollo por el alelo normal restante. Existen dos 
clases de genes supresores de tumor; en la primera, los genes están directamente involucrados 
en el desarrollo de cáncer y su pérdida de función perjudica directamente alguna vía crucial para 
la proliferación celular. La segunda clase agrupa a los genes cuya pérdida de función acelera la 
adquisición de alteraciones en las vías cruciales para la proliferación, apoptosis o senescencia 
celular, pero su pérdida está asociada indirectamente al cáncer y su acción recae fuera de la vía 
decisiva; son genes involucrados en la reparación del DNA y la integridad del genoma (6). 
 
La pérdida de heterocigosis (LOH; loss of heterozygosity) involucra la pérdida de la función normal 
de un alelo de un gen cuando el otro alelo ya está inactivo. Existe evidencia de que el 
silenciamiento epigenético, más que la mutación es el mecanismo más común para suprimir la 
función génica. A este respecto se ha observado que los eventos de remodelación de la 
cromatina, como por ejemplo la metilación de las regiones ricas en dobletes de citosina-guanina 
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 7 
(“islas CpG”) en la región promotora de genes de las células somáticas es un mecanismo común 
de silenciamiento epigenético de uno o de los dos alelos de los genes supresores de tumores (5). 
 
Eventos exógenos en los alrededores de la célula cancerosa también pueden determinar su 
destino; tal es el caso de heridas e inflamación crónica que se asocian con cáncer. Sus efectos 
pueden estar mediados a través de proliferación incrementada, lo que se asocia con un aumento 
en la probabilidad de mutaciones, o a través de efectos parácrinos como el de las células 
inflamatorias, que incrementan la producción de metaloproteasas de matriz extracelular. Otro 
factor importante son las variaciones en los niveles de hormonas o de factores de crecimiento 
circulantes, que muestran asociaciones significativas con el riesgo de cáncer (5). 
 
Aunque el concepto de “célula troncal cancerosa” se propuso por primera vez hace más de 100 
años, en los últimos tiempos, los avances en el conocimiento de la biología de células troncales y 
la acumulación de gran cantidad de evidencias experimentales han llevado a un nuevo paradigma 
de oncogénesis. Estudios recientes han permitido elucidar la presencia de células troncales 
cancerosas que tienen la habilidad exclusiva de regenerar tumores. Estas células troncales de 
cáncer comparten muchas características de las células troncales normales, incluyendo la 
capacidad de auto-renovación y de originar células que se diferencien a células especializadas (9). 
Presumiblemente, todos los cánceres surgen de células troncales alteradas que conservan estas 
dos capacidades. Las células troncales de cáncer se han identificado recientemente en una gran 
cantidad de tumores humanos. A principios del 2007 dos grupos de investigación reportaron por 
primera vez la identificaciónde las células iniciadoras de cáncer de colon (10,11). Ambos grupos 
demostraron que el cáncer colorrectal es creado y propagado por un pequeño número de células 
no diferenciadas tumorigénicas que expresan el marcador CD133. Este antígeno es una 
glucoproteína de 120 kDa de 5 dominios transmembranales, de función y ligando desconocidos, 
que se expresa tanto en células troncales normales (células troncales hematopoyéticas, neurales, 
endoteliales y epiteliales embrionarias) como en células cancerosas de retinoblastoma, 
teratocarcinomas, leucemias y en tumores cerebrales, de hígado y de colon. 
 
Cáncer colo-rectal (CRC). 
 
El cáncer es, sin duda, una de las enfermedades que ha irrumpido con mayor ímpetu en el 
panorama epidemiológico desde finales del siglo XX, convirtiéndose en un problema de salud 
pública a nivel mundial no sólo por sus graves manifestaciones clínicas y su alta letalidad, sino 
también por la gran variedad de factores de riesgo con los que se asocia. 
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 8 
 
En México se ha visto un aumento continuo de las enfermedades crónico-degenerativas, hasta 
constituirse en las principales causas de muerte y de enfermedad, entrando el cáncer en este 
género. Entre 1922 y 2006 la proporción de muertes por cáncer en México pasó de 0.6 a 12.9% de 
las defunciones totales ocurridas por todas las causas y en toda la población. El grupo más 
afectado corresponde al de las mujeres de entre 30 y 64 con un porcentaje de muertes por 
tumores malignos del 25.2% en 2008 (12). 
 
El cáncer ocupó en el 2006 el segundo lugar como causa de muerte en el país en la población de 
30 a 64 años de edad (16.1% contra 16.9% de la diabetes mellitus) y desde 1980, en que el 
registro de información permitió diferenciar la localización de la neoplasia, han sido las principales 
causantes de las defunciones: 1ª) tráquea, bronquios y pulmón, 2ª) gastrointestinal (aumentando 
de forma alarmante el número de casos de cáncer de colon en los últimos años) y 3ª) cérvico 
uterino. En el año 2006 el cáncer provocó 64,000 defunciones anuales, 52 y 48% para mujeres y 
hombres respectivamente (12). A nivel internacional el cáncer de colon se ubica entre los cinco 
cánceres más comunes, junto con el de pulmón, estómago, cérvico uterino y mama (6,12). 
 
Médicos investigadores del ISSSTE y del Instituto Nacional de Salud Pública han realizado un 
estudio, que revela que el cáncer de colon afecta en igual proporción a hombres y mujeres, con un 
promedio de edad de los afectados de 63 años. En mayores de 45 años la incidencia ha 
aumentado 100% (13). Por estas razones, es importante continuar con el estudio de esta 
enfermedad, aportando datos que ayuden a esclarecer sus causas y establecer terapias efectivas. 
 
El epitelio intestinal. 
 
El intestino forma parte del aparato digestivo, el cual absorbe y después suministra al organismo 
un aporte continuo de agua, electrolitos y nutrientes. Las funciones del intestino comprenden el 
tránsito de los alimentos a lo largo de todo el tubo digestivo; la secreción de los jugos digestivos y 
la digestión de los alimentos; la absorción de los productos digeridos, el agua y los distintos 
electrolitos. Estas funciones, así como la circulación de la sangre a través de los órganos 
gastrointestinales para transportar las sustancias absorbidas son controladas, en parte por los 
sistemas nervioso y hormonal (14). 
 
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 9 
El epitelio intestinal se caracteriza por su alta tasa de autorrenovación, lo que lo hace muy 
susceptible a la transformación maligna y además presenta los paradigmas de la biología de las 
células troncales, establecida para otros tejidos con gran capacidad de autorrenovación (15). 
Debido a que la homeostasis del epitelio intestinal se fundamenta en el balance preciso entre 
proliferación celular, diferenciación y apoptosis, representa un atractivo modelo experimental para 
el estudio integrado de la homeostasis de estos procesos celulares. 
Este epitelio, como la epidermis de la piel, constituye una barrera entre el cuerpo y el exterior. A 
nivel microestructural, mientras la epidermis está constituida de múltiples capas celulares, el 
epitelio intestinal consiste de una sola capa de frágiles células epiteliales. Estas células absorben 
el líquido y electrolitos de la mezcla resultante de productos biológicos aprovechados mientras 
mantienen el quimo indigerible y la microflora asociada dentro del lumen (15). 
 
La capa epitelial posee una topología única; está formada por una estructura bidimensional 
plegada en valles (criptas) y crestas (vellosidades). En la base de las criptas proliferativas residen 
las células troncales, las cuales por división asimétrica dan origen a células hijas, una de las 
cuales permanece como troncal y la otra, progenitora, que después de experimentar dos o tres 
ciclos de división, su progenie va migrando hacia arriba para diferenciarse al alcanzar las crestas 
en células absortivas (enterocitos) o en células secretoras de hormonas o de mucus. En estas 
crestas, finalmente, degeneran las células a través de apoptosis y son desprendidas al lumen del 
intestino para su expulsión (Fig. 1) (15). 
 
Dos linajes principales de células diferenciadas se observan dentro del epitelio intestinal: el linaje 
absortivo o enterocitos y el linaje secretor. Éste último comprende a las células caliciformes, al 
linaje enteroendócrino, y en el intestino delgado también a las células Paneth. Los enterocitos son 
las células más abundantes en el intestino, secretan hidrolasas y absorben nutrientes. Las células 
caliciformes secretan mucosas protectoras e incrementan en número del duodeno al colon. Las 
células del linaje enteroendócrino secretan hormonas (serotonina, sustancia P, o secretina) y las 
células Paneth, que sólo se encuentran en el intestino delgado, secretan agentes antimicrobianos 
como criptidinas, defensinas y lisozima para controlar el contenido microbiano en el intestino 
delgado (Fig. 1) (15,16). 
 
 
 
 
 
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Figura. 1. Anatomía del intestino. A) El epitelio del intestino delgado está formado por criptas y vellosidades. 
B) En el colon no hay células de Paneth, ni crestas prominentes, la superficie es lisa, con criptas mucho más 
profundas que en el intestino delgado. Se aprecian las células troncales en la base de cripta, mientras que las células 
proliferativas ocupan dos tercios de la cripta y las células diferenciadas ocupan el resto de la cripta y la superficie 
plana del epitelio. Modificado de (15 y 16). 
 
 
La ruta de señalización canónica Wnt 
 
En cuanto a las moléculas que regulan la homeostasis del epitelio intestinal, la evidencia 
experimental in vivo ha demostrado que la ruta de señalización “Wingless” o “Wnt”, juega un 
papel esencial en la homeostasis de tejidos de autorenovación, como el epitelio intestinal. Su 
relevancia en la biología del colon se estableció hace más de una década, cuando se encontró 
que el gen que codifica para la proteína supresora tumoral Adenomatous Polyposis Coli (APC), 
está mutada en un número abrumador de casos de carcinoma de colon hereditarios o esporádicos 
Estudios moleculares han demostrado la existencia de mutaciones que promueven la activación 
vía Wnt en aproximadamente el 90% de los casos (17). 
 
El elemento distintivo de la vía canónica Wnt es la regulación de los niveles de β-catenina 
citoplásmicos (Fig. 2, panel A). La β-catenina es una proteína multifuncional que combina las 
características de una proteína estructural de las uniones adherentes con aquellas de un factor de 
transcripción. En ausencia de ligando Wnt (familia de glucoproteínas palmitoiladas), la proteína β-
catenina es fosforilada por la cinasa de serina/treonina caseína cinasa Iα (CKIα) lo que a su vez 
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permite la fosforilación por parte de la cinasa de la glucógeno sintetasa3β (GSK-3β). La 
interacción entre estas cinasas y la β-catenina es facilitada por las moléculas de andamiaje Axina 
y APC, que en conjunto forman el complejo de degradación de la β-catenina; Así, la β-catenina 
fosforilada es reconocida por el sistema ubiquitina-proteosoma y subsecuentemente degradada. 
En ausencia del ligando Wnt, este complejo de degradación es muy activo y mantiene a β-
catenina citoplásmica en un nivel bajo. Cuando los ligandos Wnt se unen a su complejo de 
receptores, formado por el receptor de siete dominios membranales de la familia frizzled y el co-
receptor LRP/Arrow, inhiben la actividad de la GSK-3β a través de la fosfoproteína Dishevelled 
(Dvl), lo cual resulta en la estabilización y acumulación de β-catenina en el citoplasma. La 
acumulación citoplásmica de la β-catenina es un factor clave para su posterior translocación al 
núcleo, donde interacciona con los miembros de la familia de factores de transcripción LEF/TCF, 
funcionando como activador transcripcional en genes relacionados a la proliferación celular como 
C-myc y ciclina D1 (18,19). 
 
 
Figura 2. Vía de señalización Wnt. A) En la ruta canónica, la actividad depende de la acumulación de β-catenina en el 
citoplasma y su migración al núcleo. B) La vía Wnt no canónica es independiente de β-catenina Modificada de (21). 
 
 
Se han descrito tres mecanismos por los cuales se da la acumulación nuclear de β-catenina en 
células cancerosas: 1) inactivación del gen supresor APC; 2) mutaciones supresoras de la axina; y 
3) mutaciones en el extremo amino terminal de la β-catenina. Aproximadamente en el 85% de los 
casos de cáncer de colon se ha demostrado pérdida de función de la proteína APC; este evento 
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lleva a la acumulación de β-catenina en el núcleo, lo cual desencadena una respuesta 
transcripcional de genes involucrados en la proliferación (17,20). 
 
La vía de señalización mediada por Wnt-β-catenina descrita hasta aquí, se denomina canónica 
para diferenciarla de, al menos, tres vías distintas de señalización mediadas por ligandos Wnt, 
pero independientes de la acción de la β-catenina. Hace aproximadamente 15 años fue descrita la 
activación de los receptores Frizzled principalmente por los ligandos Wnt4, Wnt5a y Wnt11, sin 
actividad transcripcional aparente de β-catenina (21). Mediante estudios realizados en Drosophila, 
se describió la vía de polaridad planar celular (PCP), la cual promueve la activación de la proteína 
cinasa JNK (jun-N-terminal) (22). Por otra parte, se observó que algunos receptores Frizzled, al 
igual que otros receptores de siete dominios transmembranales, actuaban a través de proteínas G, 
activando a la fosfolipasa C (PLC) y la fosfodiesterasa. Este hallazgo sugirió que debía producirse 
un aumento de Ca2+ intracelular debido a la formación del mensajero IP3. Esta hipótesis fue 
corroborada al demostrarse que la inyección de Wnt5a, en embriones de pez cebra, aumentó 
transitoriamente la concentración de Ca2+ intracelular. El aumento de Ca2+ lleva a la modulación 
de proteínas tales como la proteína cinasa dependiente de calcio-calmodulina II (CamKII) y la 
PKC; además, el diacilglicerol producido también por la activación de PLC, activa a la PKC (Fig. 
2). En concordancia con esto, se ha demostrado que la expresión ectópica de Wnt5a resulta en la 
translocación de PKC a la membrana plasmática y aumenta su actividad de cinasa in vitro (21-24). 
 
Se ha observado la importancia de la vía de señalización no canónica, principalmente en la 
modulación de los movimientos celulares durante la embriogénesis (24); sin embargo, se conoce 
poco acerca de los posibles eventos de señalización independientes de β-catenina en el 
mantenimiento de tejidos adultos de autorenovación, como es el caso del mantenimiento de 
células troncales y su posible convergencia con otras vías intracelulares de señalización, 
incluyendo la vía Wnt canónica. De este modo, el grado de entrecruzamiento de la ruta de 
señalización Wnt con otras vías de señalización celular, apenas empieza a considerarse y es, sin 
duda, una importante área de investigación dado el potencial de la ruta Wnt de interaccionar con la 
actividad de otros oncogenes y la pérdida de supresores tumorales. 
Debido a la reconocida participación de PKC y Wnt en eventos de carcinogénesis, es importante el 
estudio de esta cinasa en un sistema biológico como el colon y el cáncer colo-rectal. 
 
 
 
 
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La proteína cinasa C (PKC) 
 
La PKC forma parte de una familia de cinasas de serina/treonina que juegan un papel clave en los 
procesos de transducción de señales que controlan importantes procesos biológicos tales como 
desensibilización de receptores, procesos metabólicos, neurotransmisión, regulación de la 
transcripción, mediación de la respuesta inmune, memoria, diferenciación celular y tumorigénesis. 
Desde su descubrimiento en 1977 por Yasutomi Nishizuka, la función de PKC ha sido el foco de 
atención de investigadores interesados en estudiar las vías de transducción de señales en el 
cáncer. 
 
Estudios de clonación molecular, así como análisis bioquímicos, han revelado que la PKC es una 
familia de 12 isoformas de cinasas de serina/treonina con estrecha homología estructural en 
mamíferos y con enzimas homólogas en levaduras, nemátodos y en la mosca de la fruta. Estas 
isoformas poseen diferencias en su localización, propiedades cinéticas, especificidad de sustrato y 
pueden subdividirse en tres grupos: las clásicas o convencionales (cPKC: α, βI, βII, y γ) activadas 
por calcio, fosfolípidos (como la fosfatidilserina o PS), y diacilglicerol (DAG); las nuevas (nPKC: δ, 
ε, η y θ ) activadas por DAG y fosfolípidos, aunque independientes de calcio; las atípicas (aPKC: ζ 
y ι, de la cual su homólogo en ratón se ha llamado PKCλ) que no responden ni a calcio ni a DAG, 
y además PKCµ o PKD, que tiene múltiples características que la hacen una pariente diferente de 
las isoformas de PKC (25). Cada miembro de la familia de PKC posee diferente modo de 
activación, pero todos tienen en común el requerir de fosfatidilserina (26-28). 
 
Los activadores endógenos de la PKC generalmente son de naturaleza lipídica. El más 
importante, para las PKC convencionales y nuevas, es el 1,2-diacilglicerol (DAG), producto de la 
degradación del fosfatidil inositol 4,5-bisfosfato (PIP2). Otros son el ácido lisofosfatídico, la 
lisofosfatidilcolina, algunos ácidos grasos cis-insaturados como el araquidónico y el oleico, los 
cuales activan a la PKC en presencia de DAG. Se ha considerado a otros lípidos como la 
ceramida y al fosfatidil inositol 3,4,5-trisfosfato (PIP3) como activadores específicos de las PKC 
atípicas no dependientes de DAG (26). 
 
Los ésteres de forbol son los compuestos exógenos más comunes para activar a la PKC de modo 
farmacológico. De este grupo de diterpenos, el más utilizado es el TPA o llamado también PMA 
(forbol miristato-acetato), el cual se aisló del árbol Croton tiglium. El TPA, cuya actividad es tres 
órdenes de magnitud más potente que el DAG, se intercala rápidamente en la membrana y activa 
a la PKC al unírsele directamente. Un activador con una potencia igual o mayor al del TPA es la 
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briostatina, sustancia derivada de briozoarios marinos. Un rasgo especial de la briostatina, bajo 
ciertas condiciones, es su capacidad de antagonizar algunos efectos biológicos del TPA. Otros 
compuestos exógenos análogos son resiniferotoxina, mezereína, timeleatoxina, ingenol y las 
DAG-lactonas. Todos ellos activan a la PKC mimetizando bioquímicamente al DAG. 
 
Estructura de la PKC 
 
Cada isoforma de PKC es el producto de un gen separado, con excepción de PKCβI y βII, que son 
variantes del mismo gen por procesamiento alternativo. Cada isoforma de PKC consiste de una 
sola cadena polipeptídica con dos dominios bien definidos: el dominio regulador en elextremo 
amino y el dominio catalítico en el extremo carboxilo (Fig. 3). La región reguladora posee los 
motivos involucrados en la unión de los cofactores fosfolipídicos y el Ca2+ y participa en las 
interacciones proteína–proteína que regulan la actividad y localización de PKC. La región C-
terminal es el dominio de cinasa e incluye motivos involucrados en la unión a ATP y unión de 
sustrato. Los dominios reguladores y catalíticos están conectados por una región “bisagra” que es 
altamente sensible a rompimiento proteolítico por proteasas celulares (25). 
 
Las PKC poseen regiones que están altamente conservadas entre las diferentes isoformas 
(regiones C1 a C4) y regiones variables (V1 a V5) que no están conservadas en todas las 
isoformas (Fig. 3). La región C1 está presente en todas las isoformas de PKC y contiene un 
dominio de autoinhibición o pseudosustrato, que se une al sitio de unión del sustrato en el dominio 
catalítico y mantiene la enzima en un estado inactivo en ausencia de cofactores y activadores. La 
secuencia de aminoácidos del pseudosustrato se asemeja al motivo de fosforilación en los 
sustratos de PKC, pero posee un aminoácido no fosforilable (como alanina) en vez de serina o 
treonina (29). 
 
Una característica distintiva de la región C1 es la presencia de dominios ricos en cisteína, que 
participan en la unión del segundo mensajero DAG y los ésteres de forbol en las PKCs clásicas y 
nuevas (30,31). Mientras las PKCs clásicas y nuevas tienen dos copias de estos motivos en 
tandem, sólo una copia se halla en las PKCs atípicas. Las PKCs clásicas poseen una región C2 
involucrada en la unión de Ca2+ inmediata al extremo carboxilo a los dominios ricos en cisteína. Un 
dominio tipo C2 está presente cerca del extremo amino en las PKCs nuevas, aunque este dominio 
es incapaz de unir a Ca2+ (32). 
 
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Los dominios ricos en cisteína de la región C1 unen con gran afinidad DAG y ésteres de forbol en 
presencia de fosfatidilserina como cofactor, uniéndose los primeros en el mismo sitio, y teniendo 
un alto grado de conservación en los sitios de unión entre las diferentes isoformas (33). Cada uno 
de estos dominios ricos en cisteína requieren de un mínimo de 43 aminoácidos en el dominio para 
la unión de los ésteres de forbol, y poseen un motivo HX12CX2CX13/14CX2CX4HX2CX7C, donde 
H es histidina, C es cisteína, y X es otro aminoácido. Cada dominio une fuertemente a dos átomos 
de Zn2+, resultando en una estequiometría de 4 Zn2+ por molécula de cPKC o nPKC (25). 
 
Cada dominio rico en cisteína de PKC tiene una conformación de estructura globular, y los ésteres 
de forbol se unen a un surco formado por dos láminas β. El ligando no induce cambios 
significativos en la conformación del dominio rico en cisteína, pero cubre un sitio hidrofóbico al 
principio de la estructura formando una región hidrofóbica contigua que promueve la inserción del 
dominio en la bicapa lipídica de las membranas (34). 
 
El dominio C2 en las cPKCs se encuentra inmediatamente después del extremo carboxilo del 
dominio rico en cisteína y es un sitio de unión a Ca2+. A pesar de la variación en las secuencias 
primarias, análisis estructurales revelan que se pliega en una estructura que consiste de dos 
láminas β antiparalelas conectadas por asas con el sitio de unión a Ca2+ localizado en una de las 
orillas del dominio, y tiene cinco residuos de Asp conservados involucrados en la coordinación de 
dos iones de Ca2+. El dominio C2 actúa como un módulo de membrana, donde los iones de Ca2+ y 
los residuos básicos contribuyen a la unión electrostática de la membrana. En las nPKC los 
residuos de Asp que se requieren para la unión de Ca2+ no están presentes, y es por eso que no 
cumple con esta función (32). 
 
El dominio catalítico de las isoformas de PKC incluye los dominios C3 y C4; el C3 posee el sitio de 
unión para ATP, el donador de fosfatos para la actividad de fosfotransferasa; el C4 posee el sitio 
de unión para los sustratos. Cuando la PKC se mantiene en un estado inactivo, el pseudosustrato 
ocupa el sitio C4, bloqueando la unión de los sustratos (25). 
 
Se sabe que las funciones intrínsecas de las isoenzimas de PKC son reguladas por tres 
mecanismos: 1) fosforilación, que prepara a la enzima para su actividad catalítica, 2) unión a 
cofactores, los cuales activan alostéricamente a la enzima, y 3) la interacción con proteínas de 
anclaje que colocan a las isoenzimas cerca de sus reguladores y sustratos. 
 
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Figura 3. Estructura esquemática de las isoformas de proteína cinasa C. A) Todas tienen un dominio de cinasa (en 
color cian) y una extensión C-terminal que contiene dos sitios conservados de fosforilación: un sitio de 
autofosforilación y un motivo hidrofóbico. En las PKC atípicas un residuo de glutamato (E) ocupa la posición del 
fosfoaceptor, Todas las isoformas tienen una secuencia de pseudosustrato (en verde) que es el extremo amino del 
dominio C1 (en naranja). El dominio C1, constituido por dos repeticiones en tandem, está presente en las PKC nuevas 
y convencionales y funciona como sensor de diacilglicerol. Las PKC atípicas tienen un dominio C1 apócrifo que no 
responde a los ésteres de forbol ni al DAG. Las PKC convencionales tienen un dominio C2 (amarillo) que funciona 
como módulo de unión a fosfolípidos regulado por Ca2+, y en las nuevas PKC no se une ni a fosfolípidos de 
membrana ni a Ca2+. B) Representación tridimensional de algunos de los dominios descritos en A. Modificado de (28). 
 
 
La función de PKC depende de una correcta distribución celular. Su localización es llevada a 
cabo por proteínas de unión que funcionan como proteínas de anclaje o de andamiaje, como se 
mencionó anteriormente. Estas proteínas posicionan a PKC cerca de sus sustratos, de sus 
reguladores o en compartimentos intracelulares específicos, tales como la membrana plasmática, 
aparato de Golgi, mitocondria, núcleo, y citoesqueleto. Existen diferentes proteínas de anclaje 
para PKC, algunas de estas proteínas regulan a varias isoformas de PKC, mientras que otras 
regulan la distribución de isoformas específicas. También hay proteínas de unión para formas no 
fosforiladas de PKC, para formas fosforiladas pero inactivas y para formas fosforiladas y activas 
de PKC. Por ejemplo la proteína de anclaje CG-NAP localiza a PKCε recién sintetizada al aparato 
de Golgi (35). Miembros de la familia de proteínas de andamiaje conocidas como RACKs por sus 
siglas en inglés (Receptor for Activated C Kinase) posicionan a PKC fosforilada y activa en sitios 
celulares específicos. Otras proteínas conocidas como STICKs (Substrates That Interact with C 
kinase) unen a PKC fosforilada pero inactiva, y después liberan a PKC una vez fosforilada (36). 
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El descubrimiento de que las isoenzimas de PKC son selectivamente activadas por ésteres de 
forbol, promotores de tumores, de una forma similar al activador endógeno DAG, dio la primera 
relación entre las rutas de señalización mediadas por PKC y los procesos de carcinogénesis (37). 
 
Alteraciones en el patrón de expresión de las isoformas de PKC asociadas a la 
carcinogénesis de colon. 
 
La expresión, activación y función de PKC han sido estudiadas extensivamente en el epitelio 
intestinal. En el epitelio de colon normal, los niveles de expresión de las isoformas α y δ se 
encuentran elevadas en el tercio superior de la cripta y disminuyendo gradualmente su expresión 
hacia la base de la cripta en la que se presenta una proliferación normal en el epitelio (38,39). Se 
piensa que PKC puede funcionar como regulador de eventos post-mitóticos, por ejemplo, en la 
diferenciación e inhibición del crecimiento durante la autorrenovación del epitelio intestinal, un 
concepto apoyado por el hecho de que PKC media un programa coordinado de salida del ciclo 
celular en células intestinales (40-43). Varios estudioshan demostrado que PKCα participa en la 
inhibición de la progresión del ciclo celular en la transición G1/S en células epiteliales intestinales 
por medio de la activación del inhibidor de cinasas dependientes de ciclinas p21 y p27, y de 
inhibir el inicio de la traducción de la ciclina D1 (40,41,43). También se ha demostrado que al 
aumentar la expresión de PKCδ en células CaCo-2 (línea celular tumoral de colon), se limita el 
crecimiento celular al retardar la transición a la fase G1, se aumenta la diferenciación celular y 
se acelera la apoptosis, mediante la regulación negativa de la ciclina D1 y la ciclina E y de la 
inducción de los niveles de expresión del inhibidor de cinasas dependientes de ciclinas p21 
(38,44). Estos resultados sugieren que las vías de señalización dependientes de PKC pueden 
controlar el crecimiento celular y provocar diferenciación celular en este epitelio. A este respecto, 
se ha observado una marcada disminución de los niveles de expresión de PKC α, δ, ε, ζ y η 
(38,39) en adenomas de colon humano, y que la actividad total de PKC disminuye comparada 
con el epitelio de colon normal (45). Sin embargo, aunque los niveles de la mayoría de las 
isoformas de PKC disminuyen, otras como PKCβII, incrementan su expresión en diversos 
modelos de cáncer de colon (46). Interesantemente, existen datos que sugieren la participación 
de esta isoforma en la ruta de señalización Wnt, ya que se ha reportado que la sobreexpresión de 
PKCβII promueve el cáncer de colon a través de la supresión de la señalización del TGFβ y de la 
activación de la vía de señalización APC/β-catenina, pero se desconoce el mecanismo por el cual 
ocurre esto (47). Además, se ha observado que después de la exposición de células de cáncer 
colo-rectal a ácidos biliares, PKCβII fosforila e inactiva a GSK-3β (48). Asimismo, el producto del 
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gen wnt5a parece estar sobre-expresado por la activación de PKC y disminuido por su inhibición, 
lo cual apoya la hipótesis de una posible convergencia de la señalización por Wnt y PKC durante 
el desarrollo de procesos cancerosos (49-51) 
 
Aunque la evidencia experimental muestra que el proceso de carcinogénesis intestinal está 
asociado con alteraciones en la actividad y expresión de las isoformas de PKC, la contribución de 
estos cambios a la progresión del tumor en este tejido continúa aún sin definirse (38). Estos datos 
sugieren que la regulación negativa de PKCα y PKCδ y la sobre expresión de PKCβII, pueden 
provocar un crecimiento anormal en las células epiteliales de colon. Esto resultaría en una 
hiperproliferación que haría a estas células más susceptibles a mutágenos y de esta manera 
contribuir al proceso de carcinogénesis. 
 
Cinasa de serina-treonina LKB1 
 
LKB1 (STK11) es una cinasa de residuos de serina-treonina ubicua que participa en la 
proliferación celular, el metabolismo energético, la polaridad celular y el desarrollo embrionario. Se 
le ha identificado como supresor de tumores. 
 
El gen Lkb1 comprende 23 kb y está compuesto por 10 exones, 9 de los cuales son codificantes. 
El gen es transcrito en la dirección telómero-centrómero. La proteína LKB1 humana es una cinasa 
de residuos de serina-treonina que comprende 433 residuos de aminoácidos (la LKB1 de ratón 
436), y su dominio catalítico (a.a. 44-309) es poco parecido al de otras proteínas cinasas, 
explicando el por qué se encuentra localizado en el centro del “kinoma” humano (52). Hay 
solamente una isoforma del gen LKB1 en el genoma humano. Las regiones N-terminal y C-
terminal no catalíticas de LKB1 no están relacionadas con ninguna otra proteína y no poseen 
dominios funcionales identificados. La región C-terminal posee actividad reguladora de la función 
de LKB1 (53). Lkb1 se expresa a varios niveles en todos los tejidos fetales y adultos examinados 
(54,55) lo que la coloca como una proteína fundamental para la homeostasis del organismo. 
 
La actividad de LKB1 se regula por modificaciones post-traduccionales que incluyen fosforilación 
por otras cinasas, auto-fosforilación y farnesilación (Fig. 4), así como por cambios en la 
localización celular mediadas por su interacción con la pseudocinasa STRADα (56,57). 
 
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Figura 4. Sitios de modificación post-traduccional de la proteína LKB1 de ratón. Los sitios de autofosforilación se 
muestran en rojo y los sitios fosforilados por otras cinasas en negro. El sitio de farnesilación Cys433 se muestra en 
verde. Se indican los agonistas y las proteínas cinasas que fosforilan cada sitio. Los dominios regulatorios se 
muestran en blanco y el dominio de cinasa en azul. (DRN: dominio amino regulador; DRC: dominio carboxilo 
regulador) Modificado de (56) 
 
 
El gen LKB1 ha sido conservado durante la evolución y es esencial para la viabilidad. Se han 
identificado ortólogos en ratón (58), Xenopus leavis (XEEK1) (58), Caenorhabditis elegans (Par-4) 
(60), Drosophila melanogaster (61) y levadura (62). 
 
Función y localización de LKB1 
 
La evidencia actual indica que LKB1 está localizada principalmente en el citoplasma, aunque se 
encuentra en pequeñas cantidades en el núcleo (56,57,63-66). Se sabe que LKB1 se encuentra 
en la célula formando un complejo heterotrimérico con las proteínas STRAD (Ste20 related 
adaptor) y MO25 (Mouse protein 25). STRAD es una seudocinasa de 48 kDa de la familia de las 
CGK (cinasas del centro germinal) que se une a LKB1 y la retiene en el citoplasma, posiblemente 
al impedir que se una a las importinas que la translocan al núcleo (57). La unión de STRAD a 
LKB1 también aumenta su actividad catalítica (67). La interacción de LKB1 con STRAD provoca 
que la proteína de andamiaje MO25 pueda unirse al complejo y estabilizarlo (63,67). Además, se 
ha descubierto que la unión de LKB1 a la proteína LIP1 induce la localización citoplasmática de 
LKB1 (68) aunque no se ha reportado que esta interacción tenga efectos en la actividad de LKB1. 
 
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Además de su interacción con STRAD y MO25, una fracción significativa de la LKB1 se encuentra 
formando otro complejo con Hsp90 y Cdc37. Este complejo estabiliza y previene la degradación 
de LKB1 vía proteosoma (69). Es posible que este complejo participe también en la formación del 
complejo de activación y retención citoplasmática de LKB1:STRAD:MO25 (63). 
 
Vías de señalización en las que participa LKB1 y las enfermedades asociadas 
 
La interacción de LKB1 con la seudocinasa STRAD y con la proteína de andamiaje MO25 es 
esencial para la actividad biológica de LKB1 (63,67). El complejo trimérico se establece en el 
citoplasma (63), donde se cree que LKB1 ejerce sus funciones celulares conocidas, incluyendo la 
función de inhibición de la proliferación celular (70). El primer sustrato fisiológico identificado de 
LKB1 fue la cinasa dependiente de AMP (AMPK) (71-73), no obstante, el número de sustratos 
fisiológicos se elevó hasta 14 cinasas de residuos de serina/treonina cuyos dominios catalíticos 
están cercanamente relacionados (74,75). Análisis filogenéticos colocan a esas cinasas en un 
grupo conocido como la subfamilia de cinasas relacionadas a AMPK (74,75). LKB1 fosforila la 
treonina del asa T en los dominios catalíticos de las enzimas sustrato, las cuales requieren de esta 
fosforilación para tener una actividad completa. LKB1 no activa a todas las cinasas de la 
subfamilia AMPK, la especificidad se debe a una preferencia por leucina en una posición -2 (72). 
 
Durante la activación de AMPK el AMP se une a su subunidad reguladora causando un cambio 
conformacional, lo que permite a LKB1 fosforilar la subunidad catalítica α de la AMPK en el 
residuo Thr172. AMPK fosforila y desactiva a varias enzimas metabólicas como ACC (acetil-CoA 
carboxilasa) y glucógeno sintetasa (76). El resultado de esas fosforilaciones inhibitorias es una 
caída en la síntesis de glucógeno y lípidos juntocon la activación de la oxidación de ácidos grasos 
y glucólisis. Además, AMPK ejerce efectos de mayor duración al modular la transcripción (77,78) y 
la traducción (79) para inhibir el crecimiento celular y la proliferación (76). 
 
LKB1 y la polaridad celular 
 
La relación entre LKB1 y la polaridad celular se empezó a conocer mediante estudios realizados 
en mutantes de C. elegans con establecimiento anormal de asimetrías durante los primeros ciclos 
celulares de la embriogénesis (80). Uno de los genes defectuosos resultó ser par-4, el ortólogo de 
Lkb1. Los otros genes identificados codificaban la cinasa de Ser/Thr Par-1, la proteína de dominio 
de dedo RING Par-2, las dos proteínas de dominio PDZ Par-3 y Par-6, y la Par-5 (la proteína 14-3-
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3). Se ha sugerido que Par-4/LKB1 funciona como un regulador río arriba en esta vía de 
polarización (81). Todos los genes par, excepto par-2, tienen homólogos en Drosophila 
melanogaster y vertebrados, donde regulan la polarización de células epiteliales y neuronales a 
través de una red compleja de interacciones PAR (82,83). 
 
Estudios en Drosophila demostraron que LKB1 y par-1 también funcionan en una vía de 
señalización relacionada al establecimiento del eje antero-posterior (61). Sin embargo, no están 
claros los roles relativos de las cinasas LKB1 y PAR-1 en este organismo. 
 
En mamíferos, la co-expresión de LKB1 y STRAD en células de cáncer epitelial condujo a la 
dramática remodelación del citoesqueleto de actina y a un transporte endosómico dirigido 
semejante a la polarización (84). Además, la microinyección de astrocitos de rata con fragmentos 
de LKB1 produce defectos en la orientación del centro de reorganización de los microtúbulos (53). 
Esos descubrimientos sugieren que LKB1 regula la polaridad en células de mamífero. Se ha 
sugerido que la pérdida de regulación de la polaridad de células epiteliales es un mecanismo que 
contribuye a la formación de tumores en individuos con síndrome de Peutz-Jeghers (PJS) donde 
el gen de LKB1 se encuentra mutado (61,84) 
 
Síndrome de Peutz-Jeghers y cáncer asociado 
 
El síndrome de Peutz-Jeghers (PJS, por sus siglas en inglés) es una enfermedad heredada de 
forma autosómica dominante. Los pacientes con PJS desarrollan pólipos hamartomatosos1 
benignos, especialmente en el tracto gastrointestinal (Fig 5), así como también una marcada 
pigmentación cutánea de las membranas mucosas. La característica más importante del PJS es el 
incremento en el riesgo de desarrollar tumores malignos en múltiples tejidos (85-87). Se ha 
estimado que el 93% de los pacientes con PJS desarrollan tumores malignos a la edad de 43 años 
(88). Las estimaciones de la frecuencia de incidencia del PJS varían ampliamente desde 1 en 10 
000 hasta 1 en 120 000 nacimientos vivos (56,85). Aunque la mayoría de los pacientes tiene 
antecedentes familiares de PJS, del 10% al 20% de los casos son resultado de mutaciones 
espontáneas del gen Lkb1 en la línea germinal (89). 
 
1 Histológicamente se trata de componentes normales de la mucosa distribuidos de manera anormal. Por tanto no es neoplásico y, 
al menos teóricamente, carece de potencial canceroso. Yogeshwar Dayal, Ronal DeLellis. El tubo digestivo. En: Patología 
estructural y funcional. Robbins. Ed Interamericana, McGraw-Hill 4ª ed. 1990 : 873-958. 
 
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Los pacientes con PJS desarrollan principalmente cáncer gastrointestinal (91-92). Sin embargo, 
también se ha observado incremento en el riesgo de padecer otros tipos de cáncer tales como 
pancreático, de seno y ovárico. La diversidad entre los espectros de cáncer reportados refleja la 
participación de factores ambientales o modificadores genéticos en la carcinogénesis. Además, no 
se observan correlaciones genotipo-fenotipo claras (91-92). Sin embargo, la pérdida de 
heterocigocidad favorece la progresión hacia un fenotipo maligno 
 
 
 
Figura 5. Poliposis gastrointestinal en PJS y en ratón. Se observan pólipos (punta de flecha) en el estómago glandular 
tanto de ratones (A) como de pacientes con PJS (B). Los ratones, generalmente presentan pólipos más grandes en el 
píloro (flecha negra). Los pólipos de ratones en el intestino delgado (C, flecha roja) raramente alcanzan el tamaño de 
los del estómago, mientras que en los pacientes con PJS frecuentemente causan graves obstrucciones (D, flecha 
roja). La histología de los pólipos de ratón (E) y humano (F) es indistinguible, mostrando ambos ramificación de un 
núcleo de músculo liso (flecha negra) junto con tejido epitelial y estromal bien diferenciados. La figura esquemática a 
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la izquierda muestra la localización de los pólipos indicados en los páneles A-D con sus correspondientes símbolos. 
Modificado de (90) 
 
 
LKB1, ruta Wnt y PKC 
 
Como se mencionó anteriormente, las proteínas PKC y LKB1 participan activamente en el proceso 
de tumorigénesis en el intestino, sin embargo, la interacción entre ellas se ha estudiado poco. 
Varias evidencias experimentales indican que la interacción de PKC con LKB1 tiene relevancia 
fisiológica. Se ha reportado que PKCζ fosforila a LKB1 en Ser428 y la transloca del núcleo al 
citoplasma (57), lo que podría favorecer su activación. ...De este modo se ha sugerido que PKCζ 
participa río arriba en la vía LKB1-AMPK (93). También se ha propuesto que PKCζ media la 
inhibición de Akt dependiente de LKB1 en respuesta a ONOO-, lo que conduce a apoptosis (66). 
Interesantemete, se demostró que la proteína homóloga de LKB1 en Xenopus, XEEK, forma un 
complejo con PKCζ y la cinasa GSK3-β. Esta interacción regula la fosforilación de GSK3-β y la 
actividad de la ruta Wnt in vivo (94). Por otro lado, en un ensayo de expresión genética realñizado 
por microarreglos, se encontró que LKB1 regula la transcripción de varios genes involucrados en 
vía de señalización Wnt, así como la fosforilación y degradación de β-catenina (95). El PMA, un 
activador de varias isoformas de PKC, activa LKB1 de una forma que no es completamente 
reversible por la supresión de PKCζ (96), lo que sugiere que probablemente otras isoformas de 
PKC estan involucradas en la fosforilación y activación de LKB1. 
Por lo anterior, es posible suponer que existe una relación directa entre LKB1, PKC y que esta 
interacción está relacionada con la ruta de señalización Wnt, la cual es importante para la 
fisiología normal y la patología del colon. 
 
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HIPOTESIS 
 
Esperamos encontrar que algunas isoformas de PKC interaccionen específicamente con el 
supresor tumoral LKB1 de manera diferencial entre el estado normal y canceroso del colon. 
 
 
OBJETIVO GENERAL 
 
Investigar si algunas isoformas de proteína cinasa C interaccionan con la proteína cinasa LKB1 en 
líneas celulares de colon normal y canceroso. 
 
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MATERIALES Y MÉTODOS 
 
Líneas celulares utilizadas 
La tabla siguiente resume las principales características de las células utilizadas. 
 
Tabla 1. Líneas utilizadas y sus características. Información tomada del American Type Culture Collection (ATCC) (96) 
112CoN Organismo: Homo sapiens (humano) 
Morfología: fibroblasto 
Órgano: colon 
Enfermedad: ninguna 
Características del organismo: 22 semanas de gestación; femenino 
Característica de crecimiento: adherente 
 
IEC-18 Organismo: Rattus norvegicus (rata) 
Morfología: epitelial 
Órgano: íleon 
Enfermedad: ninguna 
Características de crecimiento: adherente 
Presentan inhibición por contacto, no crecen en agar blando y no son tumorigénicas en ratones 
desnudos 
 
RKO Organismo: Homo sapiens (humano) 
Morfología: epitelial 
Órgano: colon 
Enfermedad: carcinoma 
Característica de crecimiento: adherente 
RKO es una línea de carcinoma de colon pobremente diferenciada, desarrollada por Michael Brattain. 
Las células RKO expresan la proteínap53 tipo silvestre, pero no cuentan con el receptor humano 
tiroideo nuclear endógeno (h-TRbeta1). 
Tumorigenicidad: Sí, en ratones desnudos y en agar blando 
 
HT-29 Organismo: Homo sapiens (humano) 
Morfología: epitelial 
Órgano: colon 
Enfermedad: adenocarcinoma colo-rectal 
Características del organismo: 44 años; femenino; caucásico. 
Característica de crecimiento: adherente 
Productos celulares: antígeno carcinoembriónico (CEA); factor de crecimiento transformante beta 
(TGEFβ); mucina. 
Fecha de aislamiento: la línea celular fue aislada de un tumor primario en 1964 por J. Fogh, usando el 
método de cultivo por explante. 
Susceptibilidad a virus: a virus de inmunodeficiencia humana (VIH, LAV) 
Las células HT-29 son negativas para CD4; positivas para la expresión de los oncogenes of c-myc, K-
ras, H-ras, N-ras, Myb, sis y fos. La proteina p53 está sobreexpresada y tiene una mutación de G -> A 
en el codón 273 del gen, lo que resulta en una sustitución de Arg -> His. 
Tumorigenicidad: Sí, en ratones desnudos; forma adenocarcinomas bien diferenciados, consistentes 
con tumores primarios colónicos (grado 1) 
 
 
 
 
 
 
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Cultivo celular 
 
En cajas de petri se cultivaron células humanas fetales normales de colon (112CoN), y células 
cancerosas de colon humano (RKO y HT-29), adquiridas de American Type Culture Collection 
(ATCC) (Tabla 3). 
 
Las células RKO y 112CoN se cultivaron en Dulbeco’s Modified Eagle’s medium (DMEM) 
suplementado con 10% de suero fetal bovino, antibióticos (penicilina, estreptomicina) y L-
glutamina 2 mM. Las células HT-29 se mantuvieron en medio McCoy 5a con 10% de suero fetal 
bovino, antibióticos 1% y glutamina 1%. Todas las células se mantuvieron a una temperatura de 
37°, en una atmósfera de 95% aire y 5% CO2. 
 
Obtención de extractos celulares totales 
 
Para ensayos de western blot de PKC o de LKB1, las células de interés se procesaron con buffer 
de lisis (Tris 20 mM, EDTA 2 mM, EGTA 10 mM pH 7.5, Tritón X-100 0.5%, inhibidor de tripsina 
0.1 mg/mL, Leupeptina 10 µg/ml, PMSF 1 mM). Los lisados se clarificaron por centrifugación a 
13000 x g durante 10 minutos a 4°C. Se extrajo el sobrenadante (parte soluble) y el precipitado 
(parte insoluble) se desechó. Del extracto se obtuvo una alícuota (30µl) para la determinación de 
proteína y el resto se diluyó con buffer de muestra Laemmli 2X y se guardó a 4°C. 
 
Cuantificación de proteína 
 
De los extractos totales a analizar se extrajeron alícuotas para la determinación de proteína total. 
La cuantificación se realizó mediante el método de Bradford con reactivo comercial adquirido de 
Bio-Rad. Las preparaciones se analizaron mediante espectrofotometría a una densidad óptica de 
595nm. 
 
Electroforesis y Western blot 
 
Cantidades equivalentes de proteína (75 µg) de los extractos obtenidos se separaron por 
electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) al 10%. Las proteínas se 
transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se bloquearon toda la noche a 4°C o 1 hora a 
temperatura ambiente, con agitación suave, en una solución de leche libre de grasa (BioRad) al 
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5% en amortiguador salino con tris (TBS; Tris 20mM, NaCl 500 mM, pH 7.5). Las membranas se 
lavaron con TTBS (TBS + Tween al 0.2%) dos veces por 5 min. Después se incubaron con el 
correspondiente anticuerpo primario a 4°C toda la noche. Los anticuerpos se diluyeron en TTBS 
para su uso de la siguiente menera: policlonal anti LKB1, 1:50,000; policlonal anti PKCβI, δ y ζ, 
1:5,000; y monoclonal anti PKCα, 1:1,000. Todos fueron obtenidos de Santa Cruz Biotechnology. 
Se lavaron 3 veces y se incubaron por una hora a temperatura ambiente con el segundo 
anticuerpo (PIERCE, Goat anti-rabbit) a una concentración 1: 5000, (ZYMED, HRP-rabbit anti-goat 
1:50,000) y (PIERCE, Goat anti-mouse 1:1000). Después de lavarse e incubarse con la solución 
para quimioluminiscencia (Pierce Supersignal), las bandas se detectaron por exposición de las 
membranas con placas de autorradiografía. Como control de carga se detectó la expresión de 
actina en las mismas membranas, para lo cual las membranas se sometieron a un proceso de 
“borrado” de los anticuerpos incubando con solución de borrado (2-mercaptoetanol 0.7%, SDS 2% 
y Tris 0.1M) a 50°C durante media hora), después de lo cual se bloquearon con una solución de 
leche (BioRad) al 5% en TBS, y posteriormente se incubaron con el anticuerpo de ratón 
monoclonal anti-actina, revelándose también por quimioluminiscencia. 
 
La intensidad de las señales se analizó por densitometría mediante el programa Quantity one (Bio-
Rad). Los datos de por lo menos tres experimentos independientes se compararon, tomando 
como dato base la densidad de la banda en las células normales (en las cuales la normalización 
se tomó como 1) 
 
Inmunoprecipitación 
 
Las células con un 90% de confluencia se lavaron dos veces con amortiguador salino de fosfatos 
(PBS) frío. Se agregó a la monocapa buffer de lisis (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 
Tritón X-100 0.5%, Na4P2O7 10mM, NaF 11mM, Na3VO4, 1mM, PMSF 1mM, Leupeptina 1mM, 
inhibidor de tripsina 0.1mg/ml). Para evitar inmunoprecipitación inespecífica, las muestras se 
incubaron con 10 µl de proteína A-sefarosa y 10 µl de suero pre-inmune durante una hora a 4° C. 
La muestra se precipitó con el anticuerpo indicado durante toda la noche a 4°C. Al día siguiente, 
al inmunoprecipitado obtenido se le añadió 25 µl de proteína A-sefarosa y se incubó por dos horas 
más. Las muestras se lavaron dos veces con buffer de lavado A para inmunoprecipitación (Tris 50 
mM, NaCl 600mM, Tritón X-100 1%, igepal 0.5%, Na4P2O7 10mM, NaF 11mM, Na3VO4, 1mM, 
PMSF 1mM, Leupeptina 1mM, inhibidor de tripsina 0.1mg/ml pH 7.5) y una vez con búfer de 
lavado B para inmunoprecipitación (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, Tritón X-100 1%, igepal 0.5%, 
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Na4P2O7 10mM, NaF 11mM, Na3VO4, 1mM, PMSF 1mM, Leupeptina 1mM, inhibidor de tripsina 
0.1mg/ml pH 7.5). Finalmente, se centrifugaron las muestras, se desechó el sobrenadante y al 
resto se le agregó 50µl de Laemmli 2X. Posteriormente se siguió el protocolo de Western blot y se 
reveló con el anticuerpo adecuado. 
 
Ensayos de inmunofluorescencia y DAPI seguida de microscopía confocal 
 
Las células se crecieron en cubreobjetos previamente tratados con Histogrip (Zymed), a un 90% 
de confluencia. Luego de tres lavados con PBS se fijaron con metanol absoluto durante 10 
minutos a -20°C. Las células se volvieron a lavar tres veces con PBS y se procedió a su 
permeabilización con Tritón X-100, 0.4% en PBS por 10 min a temperatura ambiente; se hicieron 
otros tres lavados de la misma forma. El bloqueo de las células se hizo con BSA libre de IgG al 
0.5% en PBS por 30 min a 4°C. Posteriormente la monocapa de células se incubó con el 
anticuerpo primario toda la noche a 4°C. Las muestras se lavaron 3 veces en PBS y se incubaron 
con una dilución 1:100 de anticuerpos secundarios acoplados a FITC anti-conejo (Jackson) 
durante 1 hora a 4°C en oscuridad y las muestras control (sin anticuerpo primario) también se 
incubaron con estos anticuerpos. Las células se lavaron tres veces con PBS y una vez al final con 
H2O desionizada antes de montarse en portaobjetos con Anti fade (Bio Rad). En el caso de las 
muestras que se procesaron con DAPI se realizó una dilución 1:1000, se dejó incubar por 15 min a 
temperatura ambiente y posteriormente se le agregó el Vectashield (Vector Labs) para ser 
montadas. Se examinó la fluorescencia de las células por microscopía confocal. 
 
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RESULTADOS 
 
La secuencia de Lkb1 posee sitios consenso de fosforilación para PKC 
LKB1 es una cinasa de residuos de serina-treonina cuya función es regulada por fosforilación. 
Dado que se ha demostrado que la isoiforma ζ de PKC fosforila y regula la actividad de LKB1 en el 
metabolismoenergético de las células endoteliales; y que tanto LKB1 como varias isoformas de 
PKC están involucradas en la progresión tumoral, nosotros pensamos que LKB1 podría ser blanco 
de regulación por fosforilación por alguna otra isoforma de PKC en el proceso de carcinogénesis 
de colon. Con el fin de buscar sitios posibles de fosforilación en LKB1, se hizo un análisis de la 
secuencia de cDNA del gen Lkb1 (en minúsculas por referirse al gen) con el programa NetPhos 
1.0 Server y con el NetPhos 2.0 Server. Estos programas predicen sitios de fosforilación en 
residuos de serina, treonina y tirosina en proteínas eucariontes usando conjuntos de redes 
neurales. Las predicciones para cada sitio son indicadas por un valor (score) que va de 0 a 1; 
mientras más alto sea el score de una predicción, mayor será la posibilidad de que el residuo sea 
fosforilado. Los resultados muestran que la secuencia de Lkb1 posee varios sitios que 
comúnmente son reconocidos y fosforilados por la proteína cinasa C. El NetPhos 1.0 Server, la 
versión más antigua del programa, predijo 10 sitios como blanco de fosforilación por PKC (Tabla 
2). Entre estos sitios predichos por el programa se encuentra la serina 428 (el residuo que se ha 
demostrado que es fosforilado por la PKC ζ) con un score de apenas 0.63. Por otro lado, con el 
programa NetPhos 2.0 Server se identificaron 5 posibles sitios de fosforilación para PKC en la 
secuencia de LKB1 (Tabla 3), de los cuales sobresalta la fosforilación de la serina 428 que ya ha 
sido demostrada ser fosforilada por PKC en células endoteliales. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Tabla 2. Sitios predichos por el programa NetPhos 1.0 
como sitios fosforilados por PKC y su score. Se resalta 
en negritas la serina que se ha demostrado ser 
fosforilada por PKC 
Sitio Score 
T-189 0.73 
T-230 0.70 
T-244 0.59 
S-271 0.69 
S-299 0.65 
S-307 0.77 
S-401 0.56 
T-402 0.78 
S-419 0.56 
S-422 0.87 
S-428 0.63 
 
Tabla 3. Secuencias identificadas con NetPhos 2.0 
como posibles sustratos de PKC y su posibilidad de 
ser fosforilados. El sitio reportado como fosforilado por 
PKC se resalta en rojo. Se resalta en negritas la serina 
que se ha demostrado ser fosforilada por PKC 
 
Posición Secuencia Score 
209 AADDTCRTS 0.716 
299 AKRFSIRQI 0.995 
307 IRQHSWFRK 0.990 
328 PSPDTKDRW 0.795 
401 AAQLSTKSR 0.808 
404 LSTKSRAEG 0.965 
422 CSASSKIRR 0.790 
428 IRRLSACKQ 0.995 
 
 
 
Expresión de LKB1 en las líneas celulares normales (no cancerosas) 112-CON e IEC-18 
 
Si bien PKC es capaz de fosforilar a la proteína LKB1, entonces es posible que interactúen 
físicamente. Por tanto, decidimos examinar la posible interacción entre PKC y LKB1. El primer 
paso que dimos fue elegir como modelo una línea celular control que presentara las proteínas de 
interés, que fuera representativa de la fisiología del colon y que fuera de fácil manipulación. En el 
laboratorio disponemos de líneas celulares no cancerosas: 112-CON (fibroblastos de colon 
humano) e IEC-18 (epitelio de íleon de rata). Ya se sabía que para trabajar con PKC se podía 
elegir entre cualquiera de estas dos líneas normales. Para saber si LKB1 se expresaba en las 
células 112-CoN o IEC-18 se hicieron experimentos de Western blot. En la figura 8 se observa que 
LKB1 se expresa en las dos líneas celulares con un nivel de expresión similar. Entonces, 
decidimos escoger a la línea celular IEC-18 como modelo no canceroso para este estudio porque 
además de expresar LKB1 en la misma forma que las células humanas, crecen rápidamente como 
epitelio (donde se origina el proceso del cáncer), mientras que las 112 crecen lentamente y con 
morfología de fibroblastos. 
 
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Figura 8. Expresión del supresor tumoral LKB1 en dos líneas de colon normal (no malignas). Se observan las bandas 
correspondientes a la proteína de 50 kDa LKB1. Se utilizó actina como control de carga. 
 
 
Expresión de LKB1 en las líneas celulares de cáncer de colon HT-29 y RKO 
 
Posteriormente analizamos la expresión de la cinasa LKB1 en líneas celulares derivadas de 
cáncer de colon. Puesto que LKB1 es una enzima que funciona como supresor tumoral, nosotros 
pensamos que era muy probable que su expresión disminuyera al pasar la célula del estado 
normal al estado canceroso. Con el fin de saber si la expresión de LKB1 en células malignas de 
colon era diferente a la expresión de LKB1 en células normales de intestino, se hicieron ensayos 
de Western blot. En la figura 9 se observa un aumento significativo en el nivel de expresión del 
supresor tumoral LKB1 en las líneas celulares malignas de colon (RKO y HT-29) respecto a la 
línea no cancerosa (IEC-18). Asimismo, se observa diferencia entre la movilidad relativa de la 
banda correspondiente a LKB1 de célula no maligna y la correspondiente a LKB1 de células 
malignas lo que sugiere que la proteína LKB1 puede estar modificada en las células cancerosas. 
 
 
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Figura 9: Expresión de la proteína LKB1 en líneas celulares de colon. (A) Western blot que muestra las bandas 
correspondientes a 50 kDa (LKB1) y las correspondientes a la proteína β-actina como control de carga. (B) 
Densitometría a partir de tres experimentos independientes. Se muestra la expresión relativa a la de las células 
normales ± S.E.M. 
 
 
Interacción entre LKB1 e isoformas de PKC en líneas celulares de colon 
 
Varios reportes indican que LKB1 co-precipita con la proteína cinasa C ζ (56,65,92,94) en células 
... lo que representa..., por lo que quisimos saber si la isoforma atípica ζ de PKC co-precipitaba 
con LKB1 en células IEC-18 (no malignas), y HT-29 o RKO (cancerosas). Como se observa en la 
figura 10, PKC ζ se encontró en el inmunoprecipitado de LKB1 tanto en el colon normal como en el 
canceroso. Efectivamente, LKB1 y PKC co-precipitan en las tres líneas celulares analizadas. 
Además, se confirmó que los niveles celulares de PKC ζ aumentan en células HT-29 y RKO con 
respecto a las células IEC (Cita bernardo), lo que sugiere que... (obsérvese el carril 
correspondiente al extracto celular (+) en la figura 10). 
 
 
Figura 10. Co-precipitación de PKCζ con LKB1. Se muestra el western realizado a partir de los inmunoprecipitados de 
LKB (IP:LKB1) o de los extractos celulares totales (Extracto celular) como control. La flechita a la derecha del panel 
señala la banda correspondiente a PKCζ. 
 
 
Previamente, nuestro grupo de trabajo descubrió que existen diferencias en la expresión de varias 
de las isoformas de PKC al compararse el estado normal contra el estado canceroso. De las 
isoformas de PKC estudiadas, se descubrió que la α, la βI y la δ disminuyen su expresión al pasar 
la célula del estado normal al canceroso (cita). De manera interesante, existen varios reportes que 
sugieren que estas isoformas funcionan como supresoras de tumor en el epitelio intestinal, lo que 
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significa que su inactividad puede ser importante para la transformación maligna (cita). Estos 
datos se muestran en la figura 11. En este trabajo confirmamos que... (describir los resutados) 
 
 
Figura 11. Western Blot SDS-PAGE. Expresión de las isoformas α, βI y δ de PKC en la línea celular normal IEC-18 y 
las líneas cancerígenas HT-29 y RKO. Se observa disminución en la cantidad total de cada isoforma de PKC 
analizada en el estado canceroso respecto al estado no canceroso. (A) Se observa diferencia en la cantidad de PKC 
alfa entre las líneas cancerosas. (B) La isoforma PKC beta1 de las células normales migra más lentamente que la de 
las cancerosas. (C) La isoforma delta sólo presenta diferencias de expresión entre el estado normal y el canceroso, 
sin cambios en la movilidad en SDS-PAGE ni en la expresión entre líneas cancerosas. 
 
 
Puesto que nuestros resultados anteriores apoyaban la idea de que LKB1 interaccionaba con PKC 
en células de colon, examinamos la posibilidad de