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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA “ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE CACTÁCEAS ENDÉMICAS DEL GÉNERO Mammillaria DEL VALLE DE TEHUACÁN-CUICATLÁN, PUEBLA-OAXACA, MÉXICO” T E S I S QUE PARA OBTENER EL GRADO DE BIÓLOGO PRESENTA ARTURO IBARRA SUÁREZ DIRECTORA DE TESIS: Dra. Sofía Solórzano Lujano Laboratorio de Bioquímica Molecular, UBIPRO. Los Reyes Iztacala, Tlalnepantla, Edo. de México. 2009 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. AGRADECIMIENTOS ACADÉMICOS • Este proyecto tuvo apoyo financiero por parte del Proyecto PAPCA FESI 26 (2007), y del Proyecto Banco de Semillas Kew RBG – FESI (UNAM). • Al Macroproyecto Manejo de Ecosistemas y Desarrollo Humano (2006 – 0012 / 0063 – 3118) coordinado por la Dra. Patricia Dolores Dávila Aranda, el cual apoyó en parte al trabajo de campo. • A la Dra. Sofía Solórzano, por dirigirme en este trabajo de tesis y porque desde el inicio del proyecto confió en mí (y yo en ella). • A mis revisores, la Dra. Patricia Dolores Dávila Aranda, Dr. Héctor Octavio Godínez Alvarez, Dr. Jorge Eduardo Campos Contreras y al Dr. Angel Salvador Arias Montes, por su valioso tiempo y comentarios. • Al M. en C. Alejandro Monsalvo por su apoyo en la electroforesis de las muestras en el secuenciador automatizado de la FES Iztacala. • A la UNAM, por su grandeza y dar cabida a este tipo de proyectos, en este país tan caótico. AGRADECIMIENTOS PERSONALES • Al cactólogo Ulises Guzmán, y a mis compañeros de laboratorio Sandra Solís, Verónica García y Héctor Tapia, por su apoyo en el trabajo de campo. • A mi familia, que ha hecho posible que yo haya llegado hasta aquí. • A Fabiola, que estuvo conmigo durante esta gran aventura. Foto: Ulises Guzmán Descansando un poco en un caluroso día de trabajo en Quiotepec, Oaxaca (comenzando de izquierda a derecha, Sandra Solís, Verónica García, Héctor Tapia, Dra. Sofía Solórzano, Arturo Ibarra y Ulises Guzmán). Índice • Agradecimientos Académicos...………….……………………………..…………………………………..…i • Agradecimientos Personales…………………………………………………………………………………..ii • Índice…………………………………………………….……………………………………………..……….....iii • Resumen..……………………………………………………….………………………………………………..iv • Introducción…………………………………………………………….…………….…………………………..1 La familia Cactaceae……………………………………………………….........................................1 Genética de Poblaciones………………………………………….....................................................4 -Teoría Neutral de Evolución Molecular……………………..............................................6 Marcadores Moleculares…………………………………………...............…………………………..6 Biología de la Conservación…………………………………...….…...............................................8 Genética de la Conservación…………………………………...….…………………………………...9 • Antecedentes…………………………………………………...…….………………………………………....11 • Hipótesis y Objetivos……………………………………………………….................................................14 • Material y Métodos……………………………………………………………………………………………..15 Sitio de estudio………………………………………………...........................................................15 El sistema biológico…………………..………………………………………………………………...17 Trabajo de campo……………………..…………………………….................................................18 Trabajo de laboratorio…………………..…………………………..................................................19 -Aislamiento del DNA…………….………………….…….…………………………………..19 -Marcador Molecular Microsatélite…...………………..….................................................19 -Análisis Estadístico....……………….….….………………………………………………….21 • Resultados y Discusión………………………………………...………………...........................................23 • Conclusiones…………………………………………….………...……………….…………………………...26 • Recomendación para la Conservación de Mammillaria crucigera……………………......................27 • Anexos……………………………………………………………………………….…………………………...28 • Literatura citada………………………………………………………...………….…………………………...31 Resumen La familia Cactaceae incluye más de 2000 especies y es exclusiva de América. En esta familia, el género Mammillaria, tiene gran importancia ya que presenta más de 170 especies, de las cuales la mayoría de ellas son endémicas a México. El Valle de Tehuacán-Cuicatlán, centro de diversificación de este género, alberga especies endémicas que presentan atributos ecológico-genéticos que les confieren la cualidad de especies raras. El contar con estudios genéticos para especies vegetales raras es de gran relevancia, ya que la estructura y variabilidad genética desempeñan un papel importante en la distribución y abundancia de las especies. El presente trabajo tuvo como objetivo general analizar la variación genética de Mammillaria crucigera, especie amenazada y endémica del Valle de Tehuacán-Cuicatlán, con el propósito de contribuir a conocer su estatus genético de conservación, el cual se estimó mediante el uso de microsatélites específicos para esta especie. Se colectaron 57 muestras de tejido de individuos de tres poblaciones de M. crucigera (Tilapa 1, Tilapa 2 y Paraje Verde), de las cuales, se aisló el ADN genómico siguiendo el protocolo del DNeasy Plant Mini Kit QIAGEN®. Se usaron cuatro microsatélites para las tres poblaciones. Se realizó un análisis de AMOVA, se estimaron los índices de F (Wright), y de RST para la estructura genética con el programa Arlequin ver. 3.1; además, se elaboró un agrupamiento UPGMA usando la distancia genética de Nei (1978) con el programa TFPGA 1.3. Los resultados obtenidos mostraron que las poblaciones de M. crucigera, Tilapa 1 y Tilapa 2, presentan valores promedio de diversidad genética muy similares (HO T1 = 0.419 y HO T2 = 0.425), en contraste con los de Paraje Verde (HO PV = 0.277) que son más bajos. Además, a nivel de especie M. crucigera presenta niveles bajos de heterocigosis promedio (HO = 0.373), en comparación con P. chichipe (HO = 0.631), A. asterias (HO = 0.598) y E. grusonii (HO = 0.550). Por otra parte, se observó una diferenciación relativamente alta (RST = 0.5913), con un flujo génico muy bajo (Nm = 0.173). En relación a la distancia genética, entre las poblaciones de Tilapa 1 y Tilapa 2 fue muy baja (nodo 1 = 0.1127), en contraste con Paraje Verde que difiere altamente (nodo 2 = 1.0127), esto probablemente debido a una relación directa con la distancia geográfica, ya que se encuentran relativamente lejos. Esta variación genética muestra que es necesario implementarse una adecuada estrategia de conservación para M. crucigera, como puede ser la modificación de categoría de riesgo para esta especie en la Norma Oficial Mexicana NOM-059-ECOL-2001. Introducción La familia Cactaceae está integrada por más de 2000 especies de plantas autóctonas del continente americano, donde crecen desde Canadá hasta la Patagonia, en Argentina (Bravo-Hollis 1978). Los miembros de esta familia se distinguen por tener caracteres anatómicos y fisiológicos distintivos, tales como las aréolas y la presencia de estructuras de regeneración y crecimiento en la base de las espinas (Anderson 2001). Las cactáceas habitan un número considerable de ecosistemas, aunque son másabundantes en las zonas áridas y semiáridas (Reyes et al. 2004). Por ello, estas plantas tienen adaptaciones morfológicas, fisiológicas y reproductivas, tales como tallos suculentos y fotosintéticos, metabolismo ácido-crasuláceo y la ausencia o modificación de las hojas en espinas. Aparentemente, también están involucrados en estas adaptaciones, los procesos de hibridación y poliploidía (Zavala 1997). Las cactáceas, se concebían como un grupo taxonómico claramente definido como monofilético, tomando en cuenta solamente características morfológicas, el cual evolucionó en los últimos 60 millones de años, a partir de plantas no suculentas, con hojas bien desarrolladas y fotosíntesis de tipo C3 (Gibson y Nobel 1986, Anderson 2001). Sin embargo, con estudios recientes bajo una perspectiva filogenética realizados con un mayor número de muestras taxonómicas, o considerando fuentes de información morfológicas pero sobretodo moleculares, se ha confirmado que la evolución de la familia Cactaceae, junto con las familias Basellaceae y Didieraceae es de tipo parafilético, lo que las agrupa en el clado de la superfamilia Portulacaceae (Butterworth et al. 2002; Nyffeler 2002, Harpke y Peterson 2006). México alberga una gran diversidad de cactáceas; la cual ha sido reconocida gracias a los estudios taxonómicos y los inventarios florísticos, que presentan información sobre la distribución, ecología, morfología, aspectos etnobotánicos y clasificación de esta familia de plantas (Bravo-Hollis 1978, Bravo-Hollis y Sánchez-Mejorada 1991a, 1991b). Esta diversidad cactológica ha caracterizado el paisaje de las zonas áridas y semiáridas junto con los mezquites, magueyes y yucas (Dávila et al. 2002). Las cactáceas, son plantas conocidas en México por nombres comunes como órganos, nopales, pitayos, garambullos, biznagas, peyotes, viejitos, tetechos, abrojos, candelabros, cardenches y juncos, entre otros, de acuerdo con la arquitectura que presentan estas plantas (Bravo-Hollis y Sánchez-Mejorada 1978). La domesticación, admiración y aprecio por las cactáceas ha existido desde hace poco menos de 10,000 años en los pueblos mesoamericanos, entre los que destacaban los mexicas, nahuas, popolocas, zapotecos y mixtecos, que las han incorporado en su alimentación, medicina, utilería doméstica, religión, magia y política, entre otros usos (Zavala 1997, Casas et al. 2001). En México, uno de los géneros de cactáceas que merece mayor atención es Mammillaria, dada su gran riqueza de especies que oscila entre 170 a 306 especies (Crozier 2005, Jussieu et al. 2002, Villaseñor 2004). Esta diversidad de especies obedece a varios factores biológicos (genéticos, hibridación, sistemas de cruzamiento, entre otros) así como ambientales, más una carencia de estudios sistemáticos. Sin embargo, recientemente se han registrado 173 especies (Guzmán et al. 2003), de las cuales 113 son endémicas (DOF 2002). Además, muchas de las especies de este género, se han clasificado como raras (Hunt 1992) y algunas podrían ser consideradas extremadamente raras; ya que de acuerdo con Rabinowitz (1981), presentan los tres aspectos que determinan el tipo y grado de rareza de las especies: 1) la distribución geográfica, 2) la densidad poblacional, y 3) la especificidad por el hábitat. Por lo cual, las especies más raras se encuentran limitadas en los tres aspectos. Las especies del género Mammillaria son diploides, presentando juegos cromosómicos de 22, 24, 44 y hasta 264 cromosomas, debido principalmente a procesos de hibridación y poliploidía (Zoshchuk et al. 2003). También se ha demostrado que de acuerdo con la variación de las secuencias de ADN de cloroplasto, en estudios filogenéticos Mammillaria se recupera como polifilético con un grupo núcleo, representado por el clado Mammillaria sensu stricto (Butterworth y Wallace 2004, Crozier 2005). La distribución del género Mammillaria se presenta principalmente en el Desierto Sonorense, la Depresión del Balsas, el Istmo de Tehuantepec y en el Valle de Tehuacán- Cuicatlán (VTC). Esta última región se propone como el centro de origen y de diversificación de Mammillaria, donde las condiciones ambientales son más cálidas y las heladas escasas (Reyes et al. 2004). Sin embargo, algunas especies de mamilarias alcanzan su distribución en el suroeste de Estados Unidos, y algunas localidades de América Central y del Sur, así como algunos puntos del Caribe (Anderson 2001) (Fig. 1). El género Mammillaria está ubicado taxonómicamente dentro de la subfamilia Cactoideae y a su vez, en la tribu Cacteae (Bravo-Hollis y Sánchez-Mejorada 1991). Este género incluye los subgéneros Mammilloydia, Oehmea, Dolichothele, Cochemiea, Mamillopsis y Mammillaria; la mayoría de las especies se encuentran dentro del subgénero Mammillaria, que está dividido de acuerdo a características y distribución geográfica comunes en las secciones Hydrochylus (8 series), Subhydrochylus (3 series) y Galactochylus (3 series) (Hunt 1987, Bravo-Hollis y Sánchez-Mejorada 1991b). Fig. 1. Distribución mundial del género Mammillaria (tomado de Pilbeam 1999). El estudio de la rareza en especies vegetales ha impulsado el desarrollo de trabajos que aborda el análisis ecológico, demográfico y genético de las poblaciones. Los estudios genéticos con marcadores moleculares para especies vegetales raras son de gran relevancia; ya que se sabe que la estructura y la variabilidad genética influyen de manera importante en la distribución y la abundancia de las especies (Milligan et al. 1994). La Genética de Poblaciones estudia el comportamiento de los genes en las poblaciones a través del tiempo, el cual implica analizar los procesos ecológicos, genéticos y evolutivos que explican la composición y los cambios en las frecuencias alélicas (Cook 1979, Hedrick 2000). En este contexto, la población se considera como un grupo de individuos de la misma especie que coexisten en tiempo y espacio, y que se encuentran lo suficientemente cerca para que cualquier miembro del grupo pueda potencialmente aparearse con otro de la misma población (Hartl y Clark 1997, Hedrick 2000). El surgimiento formal de la Genética de Poblaciones se inició entre los años 1920 y 1930, con las contribuciones de los biólogos evolutivos Ronald Aylmer Fisher, John Burdon Sanderson Haldane y Sewall Wright, sentando las bases que en la actualidad siguen vigentes. El trabajo teórico de estos tres científicos fue el principal paso en el desarrollo de la síntesis moderna de la Genética Evolutiva (Hedrick 2000). Los cambios evolutivos en las poblaciones son generados principalmente por procesos de mutación, migración, endogamia, deriva génica y selección natural. De ellos depende que las frecuencias alélicas aumenten o disminuyan, lo que permite que se presente una estructura genética poblacional. Con ello, por ejemplo se puede determinar el estado genético de las poblaciones, reconstruir la historia evolutiva y hacer predicciones de extinción de las especies (Hartl y Clark 1997). Para conocer la estructura genética de las poblaciones, es necesario evaluar el flujo génico hacia el interior de cada población y entre poblaciones. Esto ha sido posible con el desarrollo de técnicas que emplean marcadores moleculares rastreables en los individuos estudiados y con programas informáticos para los análisis moleculares. Estos programas permiten hacer inferencias de los niveles o patrones de flujo génico de manera detallada y con gran resolución, basándose principalmente en la observación de la distribución espacial de los alelos en las poblaciones (Eguiarte et al. 2007). Los principales factores que afectan la estructura y diversidad genética de poblaciones de especies vegetales, son la presencia de barreras físicas para la dispersión (fragmentación del hábitat), las fluctuaciones en ladensidad poblacional, la variación en los patrones de polinización y dispersión, y los sistemas de apareamiento, entre otros (Crozier 1997; Loxterman et al. 1998). Recientemente, se ha observado que tanto las especies comunes, como las especies raras y las endémicas (distribución restringida) son genéticamente susceptibles a la fragmentación del hábitat. Los hábitats fragmentados pierden la capacidad para mantener poblaciones de plantas lo suficientemente grandes para mantener un equilibrio de mutación y deriva génica; además los fragmentos o parches del hábitat están tan aislados que el flujo génico es insuficiente para reponer los alelos perdidos (Honnay y Jacquemyn 2007). Los procesos evolutivos que mantienen la diversidad genética, actúan diferente en las poblaciones grandes y las pequeñas. En el caso de la selección natural, que es el mecanismo que ocurre cuando existe una adecuación diferencial, favoreciendo los rasgos heredables que llegan a ser más comunes en las generaciones sucesivas, ésta tiene un gran impacto en las poblaciones grandes. Sin embargo, en poblaciones pequeñas su efecto es más bajo, ya que la deriva génica tiene un efecto mayor (Frankham et al. 2002). En particular, se consideran poblaciones pequeñas aquellas que tienen menos de cien individuos por población, aunque esto puede variar dependiendo de las especies estudiadas (Barrett y Kohn 1991). En ellas se incrementan los efectos de dos procesos genéticos, la deriva génica y la endogamia. La deriva génica es el cambio aleatorio en las frecuencias alélicas que ocurre, cuando los gametos transmitidos de una generación a la siguiente traen solamente una muestra de los alelos presentes en la generación parental. Por su parte, la endogamia es el apareamiento de individuos estrechamente relacionados. En plantas, la endogamia se presenta como resultado de la autofecundación o a través de la endogamia biparental (Ellstrand y Elam 1993). Otro proceso particularmente importante es la mutación, tanto en la Evolución como en la Genética de Poblaciones, ya que es una de las fuentes de variación genética en una población. Este proceso funciona a varios niveles y puede involucrar cambios en un solo nucleótido, varios nucleótidos, parte de un gen o locus, parte de un cromosoma, todo un cromosoma, o hasta juegos de cromosomas (Hedrick 2005). Los principales tipos de mutaciones son las deletéreas, las benéficas, las neutrales, y aquellas cuyos efectos se ven favorecidos en algunos casos, pero no en otros. En particular, las mutaciones neutrales son aquellas cuyos efectos no tienen influencia sobre la adecuación de un individuo, y están determinadas por un muestreo aleatorio en poblaciones finitas, es decir, por deriva génica. La mayoría de las mutaciones neutrales son perdidas en pocas generaciones, debido a que inician con frecuencias muy bajas. Sin embargo, hay nuevas mutaciones que continúan produciéndose. De ellas, una pequeña proporción eleva su frecuencia por azar, y la otra se fija (Frankham 2002). El biólogo japonés, Motoo Kimura, fue uno de los mayores defensores de la idea de que los polimorfismos de ADN y las proteínas son predominantemente neutrales. Así, los niveles de diversidad genética para tales loci se deben a alelos neutrales bajo deriva génica, lo cual se conoce como Teoría Neutral de la Evolución Molecular (Kimura 1983). La teoría neutral predice que la tasa de sustitución de los aminoácidos en proteínas y la de nucleótidos en ADN, ocurrirá en tasas constantes para proteínas o secuencias de ADN particulares, en diferentes tamaños de población, con igual tasa de mutación neutral. Este hecho conduce a que haya una constancia por generación (Kimura 1983). Dicha teoría, frecuentemente es empleada en el campo de la Genética de Poblaciones y la Evolución. A partir de la década de los sesentas, el campo de trabajo de la Genética de Poblaciones se fusionó con la Genética Molecular, permitiendo conocer la estructura y diversidad genética de las poblaciones, a través del empleo de marcadores moleculares tales como las aloenzimas y secuencias de aminoácidos. En 1980, con datos de secuencias de ADN principalmente, se generaron un gran número de preguntas que provocaron la renovación y enriquecimiento del marco teórico de la Genética de Poblaciones (Hedrick 2000). Durante la década de los ochentas, los marcadores moleculares más utilizados fueron las aloenzimas y la técnica fue la electroforesis. Con estos marcadores y esta técnica se pudieron conocer los patrones de variabilidad genética dentro y entre las poblaciones. Posteriormente, a mediados de la década de los noventas se generalizó el uso de marcadores moleculares de ADN, como los RAPD, secuencias de ADNmt, ADNc y ADNn, ISSR, minisatélites, ITS, SNP, y microsatélites genómicos o SSR (simple sequence repeats), entre otros (Esparza-Olguín 2004). Éste último, es actualmente el marcador molecular más robusto para el análisis genético poblacional y su uso ha tenido un gran impacto (Aranguren-Méndez et al. 2005). Los microsatélites son marcadores moleculares codominantes y consisten en segmentos cortos de ADN de uno a seis pares de bases que se repiten en tándem de forma aleatoria, y están ampliamente dispersos en los genomas eucariontes (Smith y Wayne 1996). Generalmente, estos marcadores se encuentran en regiones no codificantes del genoma y están distribuidos de manera uniforme, aunque también se han observado en regiones codificantes (Li et al. 2002). Entre las ventajas que presentan los microsatélites en comparación con otros marcadores moleculares, se incluyen su elevado grado de polimorfismo debido a la variación en el número de unidades repetidas, la facilidad para medirlos y analizarlos, su precisión y confiabilidad; así como, el uso de microsatélites desarrollados para una especie particular, en varios taxa relacionados. Estos atributos permiten detectar niveles altos de variabilidad genética que las aloenzimas no pueden (Esparza-Olguín 2004). Por otra parte, en Genética de Poblaciones existen parámetros relevantes tales como el flujo génico entre poblaciones y la estructura poblacional (Smith y Wayne 1996). Para su estimación, un gran número de estudios emplean la FST de Wright (1951) y/o la RST de Slatkin (1995). Ésta última, es un FST análogo, si se asume un modelo de mutación de paso a paso, que refleja mucho mejor el patrón de mutación de los microsatélites. La tasa de mutación de un locus microsatélite es usualmente desconocida, aunque, generalmente se supone que la mayoría de los microsatélites tienen una tasa alta de mutación de aproximadamente 10-3 (Balloux y Lugon-Moulin 2002). Además, el uso de los microsatélites brinda información valiosa en el ámbito de la conservación de las especies, ya que se requiere poco material biológico, y la metodología no es invasiva. Esto es especialmente importante en las poblaciones silvestres pequeñas, en las cuales es importante conocer su diversidad genética y flujo génico (Smith y Wayne 1996). El surgimiento de la ciencia interdisciplinaria, Biología de la Conservación, se da como respuesta a la crisis ambiental severa que ha sido llamada la “sexta extinción”, la cual ha sido calificada como una “disciplina de crisis” (DeSalle y Amato 2004). Las actividades humanas, durante los dos últimos siglos han tenido un impacto directo e indirecto en los recursos naturales provocando como consecuencia, una gran pérdida de la diversidad biológica y el desequilibrio de los ecosistemas en un lapso muy corto. Este fenómeno ha provocado que converjan una amplia y diversa gama de disciplinas para la solución de dichos problemas (Fig. 2) (Soulé 1986, Frankham et. al. 2002). CIENCIAS SOCIALES Y HUMANIDADES Sociología Antropología Economía Políticas Públicas Leyes Filosofía Negocios Periodismo ArtesCreativas CIENCIAS NATURALES Biología Ecología Evolución Genética Biogeografía Geología Química Medicina Epidemiología Estadística Matemáticas Aplicadas BIOLOGÍA DE LA CONSERVACIÓN Manejo de especies amenazadas Diseño de Reservas Economía Ecológica Ecología de la Restauración Conservación de Ecosistemas Ética Ambiental Genética de la Conservación Leyes Ambientales Negocios Ambientales Periodismo de la Conservación Mercadeo de la Conservación Arte Ecológico Fig. 2. La naturaleza interdisciplinaria de la Biología de la Conservación fusiona muchos campos tradicionales de las ciencias naturales y sociales, así como de las humanidades. El propósito fundamental de la Biología de la Conservación es preservar y restaurar la diversidad biológica en todos sus niveles de organización (Soulé 1986). Por su parte, la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN) reconoce a la diversidad genética como una de las tres formas de diversidad biológica con merecida atención para su conservación, junto con las especies y la diversidad de ecosistemas. Sin embargo, es necesario considerar las implicaciones de la relación entre diversidad genética y conservación en muchos niveles: genes, individuos, poblaciones, especies y géneros, por ejemplo (Allendorf y Luikart 2007). Para mantener la diversidad biológica se han propuesto cuatro preceptos fundamentales que son: 1) el valor económico de los recursos biológicos; 2) los servicios del ecosistema; 3) la estética del paisaje; y 4) los derechos de los organismos vivos para existir. Por ello, los biólogos de la conservación necesitan entender la manera en que la diversidad genética se mantiene por los procesos naturales, con el fin de poder diseñar adecuadamente los programas de conservación que se requieren (Frankham et al. 2002). En particular, de acuerdo con el Grupo Especialista en Cactus y Suculentas de la UICN, el apoyo financiero para ejecutar acciones de conservación en cactáceas debe idealmente enfocarse en la realización de: (1) estudios taxonómicos, (2) evaluación del estado de conservación de las especies, (3) protección in situ, (4) protección ex situ, (5) desarrollo de regulaciones nacionales eficientes, (6) control del comercio nacional e internacional de especies y (7) programas educativos (Oldfield 1997). En la toma de decisiones sobre la conservación, las aportaciones hechas por la Genética de Poblaciones han ido incrementándose conforme su teoría y práctica han ido integrándose en la disciplina que ahora se conoce como Genética de la Conservación (Frankham et al. 2002). La Genética de la Conservación, es la aplicación teórica y práctica de la genética para preservar especies como entidades dinámicas capaces de evolucionar para enfrentar el cambio ambiental, minimizando el riesgo de su extinción (Allendorf y Luikart 2007). Esto abarca el manejo genético de poblaciones pequeñas, la resolución de incertidumbres taxonómicas, la definición de unidades de manejo dentro de las especies y el uso del análisis genético molecular en el campo forense (estudios de paternidad e identificación de individuos), así como el conocimiento de la historia de vida de las especies (Fig. 3) (Frankham et al. 2002). Genética de la Conservación Estructura poblacional y fragmentación Introgresión Genética evolutiva Incertidumbres taxonómicas Adaptación genética a cautiverio Endogamia Exogamia Identificación de unidades de manejo Forense Entendimiento de la biología de especies Poblaciones pequeñas Adecuación reproductiva Manejo genético Extinción Acumulación de Mutaciones Pérdida de diversidad genética CautiverioSilvestre Reintroducción Fig. 3. Estructura y contenido de la Genética de la Conservación (tomado de Frankham et al. 2002). La Genética de la Conservación se enfoca en los factores que afectan el riesgo de extinción y en los regímenes de manejo genético. Para lograr estas metas, la Genética de la Conservación plantea desarrollar investigación en las siguientes temáticas (Frankham et al. 2002): 1. Los efectos deletéreos de la endogamia en la adecuación. 2. La pérdida de diversidad genética y respuesta evolutiva al cambio ambiental. 3. La fragmentación poblacional y reducción de flujo génico. 4. La deriva génica como el principal proceso evolutivo. 5. La acumulación y pérdida de mutaciones deletéreas. 6. La adaptación al cautiverio y sus efectos adversos en la reintroducción. 7. La resolución de las incertidumbres taxonómicas. 8. La definición de unidades de manejo. 9. El análisis genético molecular en estudios de paternidad e identificación de individuos. 10. El análisis genético molecular en la evaluación del estado de conservación de especies. 11. Los efectos deletéreos en la adecuación provocados por depresión exogámica. Antecedentes La mayoría de los pocos estudios de Genética de Poblaciones realizados con cactáceas, han examinado indirectamente la variabilidad genética, usando caracteres moleculares tales como aloenzimas (Wallace 1995). Es evidente que casi todos los estudios publicados a la fecha sobre Genética de Poblaciones de cactáceas han sido realizados en especies de reproducción cruzada, y predominantemente en cactáceas columnares (Hamrick et al. 2002). Los hallazgos en estos estudios revelan que la mayoría de la diversidad genética se presenta dentro de las poblaciones, y que es más baja que los valores esperados. Por otra parte, en general este exceso de homocigocidad dentro de las poblaciones se atribuyó a un proceso de endogamia local biparental y/o a un efecto Wahlund asociado con la estructura poblacional (Terry 2005). Sin embargo, a nivel de especie, las cactáceas mostraron alta diversidad genética en comparación a otros grupos vegetales. Por ejemplo, en Pachycereus schottii, que presenta reproducción cruzada y vegetativa por clonación, la mayoría de la diversidad genética se encontró dentro de las poblaciones, y hubo baja heterocigocidad entre las poblaciones (Hamrick et al. 2002). Recientemente, los estudios a nivel molecular en Genética de Poblaciones en las cactáceas están siendo más abundantes, ya que se encuentran disponibles marcadores moleculares, tales como los microsatélites, que han sido recientemente diseñados para Polaskia chichipe (Otero-Arnaiz et al. 2004, Otero-Arnaiz et al. 2005), Astrophytum asterias (Terry et al. 2006), Opuntia echios (Helsen et al. 2007), Echinocactus grusonii (Hardesty et al. 2008), Ariocarpus bravoanus (Hughes et al. 2008), y Mammillaria crucigera (Solórzano et al. 2009). Estos marcadores, presentan un gran potencial para usarse en un amplio espectro de especies con reproducción cruzada dentro de dicha familia, y con ello están surgiendo un gran número de preguntas en varios campos de trabajo como conservación, delimitación de especies y manejo de especies domesticadas, entre otros. Para el caso de la biznaga M. crucigera, ya se tienen datos demográficos, que indican que cuando los individuos han alcanzado su tamaño reproductivo incrementan su tamaño. Además, los individuos llegan a crecer más de una categoría de tamaño en un lapso de un año (Godínez-Álvarez et al. 2003). También, se documentó que esta especie tiene una tasa de crecimiento poblacional (λ) con un valor de 0.896, que es significativamente más bajo que la unidad, lo que indica que no se encuentra en equilibrio debido a que la mortalidad excede el número de nuevos reclutamientos, y a lo largo del tiempo resultará en un rápido declinamiento poblacional (Contreras y Valverde 2002). Esta cactácea está fuertemente asociada a riscos, en suelos que alcanzan altas temperaturas, de piedra caliza, yeso y silicatos. En estos suelos, las temperaturas observadas promedio (37.7°C) fueron cercanas a las óptimas para la fijación de CO2 (23 – 30 °C). Además, M. crucigerase beneficia de la sombra de rocas nodrizas (Martorell y Patiño 2006). Se sabe que esta especie empieza a florecer a principios de invierno, y que su periodo reproductivo puede llegar hasta cinco meses. Además, produce frutos casi todo el año, con un promedio de 20 semillas por fruto (Contreras y Valverde 2002), lo cual es muy bajo, si se compara con otras cactáceas globulares que producen un promedio de 100 semillas por fruto (Godínez-Álvarez et al. 2003). Se desconoce el sistema de polinización de M. crucigera, pero se puede inferir que los polinizadores más probables, de acuerdo a la morfología de la flor, podrían ser principalmente insectos de los órdenes Hymenoptera, Diptera, y Coleoptera (Bravo-Hollis 1978). Apoyando esta idea, las abejas sociales y solitarias han sido identificadas como polinizadores primarios de algunas especies de cactáceas, especialmente los de forma de barril o de tipo globoso, tales como Echinocactus y Ferocactus. Algunas especies de abejas son consideradas polinizadores secundarios o “ladrones de néctar” de algunas cactáceas, especialmente de los taxa columnares (Valiente-Banuet et al. 1997, Dávila et al. 2002). Por otra parte, se ha observado que las lagartijas tienen actividad frugívora sobre M. crucigera (Contreras y Valverde 2002), lo cual las sugiere como posibles agentes dispersores de semillas. Otro tema relevante, es el arraigado y vigente mercado negro de plantas y semillas extraídas de poblaciones silvestres de la familia Cactaceae, y M. crucigera no ha sido la excepción. Si bien, aunque existe un comercio legal donde los principales beneficiados de esta actividad son coleccionistas aficionados y empresas extranjeras como “Mesa Garden”, “B & T World Seeds”, “Uhlig Kakteen”, y “Doug and Vivi, Rowland”, dado el origen de estas plantas se puede asumir que en un principio se extrajeron de manera ilegal. Tales empresas, por ejemplo, llegan a ofertar 20 semillas por €5.00, incluyendo en sus catálogos información como la localidad de origen. Actualmente, a pesar de que existen tratados y convenios internacionales vigentes, no se ha podido frenar esta actividad ilegal (Montaño et al. 1993). El presente trabajo se fundamenta en la Genética de la Conservación, en particular de la especie vulnerable microendémica al Valle de Tehuacán-Cuicatlán, M. crucigera, con el propósito de contribuir a conocer la estructuración genética dentro y entre poblaciones para establecer su estatus genético de conservación. Hipótesis Debido a que la especie endémica Mammillaria crucigera presenta problemas en la adecuación, baja densidad poblacional y sobreexplotación; se espera encontrar una baja diversidad genética y una alta diferenciación entre las poblaciones. Objetivo General Analizar la variabilidad genética de Mammillaria crucigera, especie amenazada y endémica del Valle de Tehuacán-Cuicatlán. Objetivos Particulares 1) Estimar la diversidad genética de Mammillaria crucigera. 2) Evaluar el flujo génico y la estructura genética de las poblaciones de Mammillaria crucigera. Material y Métodos Sitio de Estudio Este estudio fue realizado en tres localidades, dos de ellas en el municipio de San José Tilapa, Puebla y una en el municipio de San Juan Bautista Cuicatlán, Oaxaca. Se llevó a cabo un muestreo a una altura de los 900 a 960 msnm (Fig. 6). Adicionalmente, se empleó la información reportada del Valle de Tehuacán-Cuicatlán (VTC). Fig. 6. Localidades de colecta de M. crucigera del presente trabajo. El VTC ocupa un área de aproximadamente 10,000 Km2 y se localiza en los límites estatales surorientales de Puebla y nororientales de Oaxaca, entre 17°39´ y 18°52´ y entre 96°55´ y 97°44´. Además, se encuentra rodeado por las montañas de las Sierras de Juárez, de Huautla, de Zongólica y de la Mixteca e Ixcateca (Reyes et al. 2004). Esta zona semiárida presenta baja precipitación pluvial (513.2 mm.) y temperatura media anual de 25.8 °C, con suelos de tipo luvisol-vértico que se caracteriza por ser arcilloso (García- Mendoza et al. 2004). En el VTC se encuentran casi 3000 especies de plantas vasculares, de las cuales cerca de un tercio son endémicas (Téllez-Valdés y Dávila-Aranda 2003). La mayor parte de esta área está cubierta por bosque tropical seco, donde destacan especies de Bursera, Fouqueria, Cercidium, Prosopis, Acacia y Pachycereus weberii. También se presenta un matorral xerófilo donde crecen especies como Ferocactus recurvus, Agave macroacantha, Coryphanta, Cephalocereus columna-trajanii, Mammillaria y Opuntia pillosa (Valiente- Banuet et al. 2000) (Fig. 4). Fig. 4. Hábitat de la especie M. crucigera. El VTC ha sido reconocido como una provincia florística que puede considerarse también como una “isla ecológica”, dado el alto número de especies endémicas registradas en su territorio, con 365 especies de plantas vasculares (Dávila et al. 2002). Por otra parte, con base en estudios etnobotánicos y florísticos, se han identificado un total de 74 especies de cactáceas en el VTC, de las cuales 48 presentan alguna utilidad para los pueblos indígenas locales (Valiente-Banuet et al. 2000). Además, se presentan 11 tipos de vegetación dominante perteneciente a Cactaceae. Por tal motivo, la familia Cactaceae ocupa el tercer lugar en importancia por su aprovechamiento dentro del VTC (Casas et al. 2001). El Sistema Biológico En la región del VTC se encuentran nueve especies endémicas pertenecientes al género Mammillaria (Arias et al. 1997). Una de ellas, es la cactácea rara M. crucigera, microendémica a la región del VTC (Guzmán et al. 2003). Esta especie, fue clasificada por la UICN como vulnerable en 1994. Sin embargo, actualmente no aparece en ninguna categoría (IUCN 2009). Esta biznaga, se encuentra dentro del Apéndice II de la Convención sobre el Comercio Internacional de Especies de Fauna y Flora Silvestre Amenazadas (CITES 2008), y está protegida por la NOM-059-ECOL-2001 (DOF 2002), debido a su distribución limitada y su alta especificidad de hábitat (Arias et al. 2005). La especie M. crucigera Martius, es una cactácea pequeña, globular, de coloración verde-grisácea, con jugo semilechoso blanco-amarillento y con uno a varios botones cilíndricos. Cada botón exhibe tubérculos bien definidos que forman series de espirales de aréolas circulares, con espinas centrales rectas (2 a 4) y espinas cortas radiales (18 a 25) (Arias et al. 1997). Esta especie, pertenece al subgénero Mammillaria, sección Subhydrochylus, dentro de la serie Supertextae (Hunt 1987, Arias et al. 1997). Dentro de esta especie se distinguen a M. crucigera subsp. crucigera, M. c. subsp. grandinosa y M. c. subsp. tlalocii, que representan la variación fenotípica registrada en la especie (Arias et al. 1997; Anderson 2001) (Fig. 5). Además, M. crucigera tiene un juego cromosómico diploide con 22 cromosomas y su genoma tiene una longitud de 23.81 µm (Briones et al. 2004). Fig. 5. Variación fenotípica de la especie M. crucigera. Trabajo de Campo Se realizó un muestreo de tejidos del tallo de 57 individuos adultos de las tres poblaciones de M. crucigera. El número de individuos muestreados dependió de la densidad (Solórzano et al. en preparación) y distribución de ellos en cada población. Como se observa en la Tabla 1, el máximo de individuos muestreados en una población fue de 29 (Tilapa 2) y el mínimo de 8 (Paraje Verde). Colecta Localidad Individuos Muestreados Densidad 1 Tilapa 1 20 1 a 5 / m2 2 Paraje Verde 8 0.27 / m2 3 Tilapa 2 29 1 a 3 / m2 Total 57 Tabla 1. Colecta de individuos de M. crucigera por localidad. Se colectaron fragmentos de aproximadamente 2 cm2 de tejido biológico de cada individuo adulto de M. crucigera, tomando en cuenta el tamaño de cada individuo. Las muestras,se guardaron en bolsas de plástico y se etiquetaron. El transporte del material biológico se realizó utilizando un tanque de nitrógeno líquido, donde permaneció a -70°C para su posterior análisis en el laboratorio. Trabajo de Laboratorio Aislamiento de ADN Se realizó el aislamiento del ADN genómico total de las 57 muestras de individuos de M. crucigera (Fig. 7), utilizando en promedio 200 mg de tejido biológico macerado con nitrógeno líquido, siguiendo el protocolo de DNeasy Plant Mini Kit QIAGEN® (ver Anexo I). Este método, permitió obtener ADN de alta calidad con poca cantidad de tejido biológico y de forma más rápida. Fig. 7. Aislamiento de ADN genómico total en gel de agarosa al 0.8% de concentración. Marcador Molecular Microsatélite Recientemente se diseñaron ocho microsatélites específicos para la especie M. crucigera (Solórzano et al. 2009), de los cuales en este estudio se emplearon solamente cuatro, que amplifican a temperatura media (Tm) de 60 °C (Tabla 2). Todos los pares de microsatélites se ensayaron en PCR individual que contenían 0.5 ρmol de cada oligonucleótido, 100 µM de dNTPs mix, 2.0 mM de MgCl2, 10 mM de Tris-HCl pH 8.3, 75 mM de KCl, 0.5 µl de suero de albúmina bovino 100x, 2 unidades de Taq polimerasa (Invitrogen) y 10 a 20 ng de ADN genómico total, en un volumen final de 25 µl. Los ciclos de PCR fueron, desnaturalización inicial a 94 °C por 3 min, seguido por 30 ciclos a 94 °C por 10 seg de desnaturalización, alineamiento a 60 °C por 10 seg, 10 seg a 72 °C de extensión y una extensión final a 72 °C por 3 min, usando un Termociclador GeneAMP® PCR System 9700 (Applied Biosystems, USA). Tabla 2. Secuencias microsatélite empleadas en este estudio (Solórzano et al. 2009). Locus Secuencia (5´- 3´) Tm (°C) GenBank MamVTC2 F-FAM TCTCACTGCCCGTTTTCTCT R: ACGGTGATGGTGGGTGTTAT 60 EU694434 MamVTC6 F-FAM CTCCCTCCTCACCATCTTCC R: CCGAACATGACCTAGATGTGC 60 MamVTC8 F-FAM TCGATTATCTGCTGCTTCCA R: CCGAGAAAGCCCTAAAACCT 60 EU694436 MamVTC9 F-FAM TGGATACGTGGCTCTTCGAT R: CCAAATGCCAATCCTCCTAA 60 EU694437 Para confirmar que la amplificación fue exitosa, se realizó la separación de los productos de microsatélites por electroforesis, en geles de agarosa al 1.2% (Fig. 8). Los geles, se tiñeron con bromuro de etidio al 0.5 µg/ml, y se utilizó un marcador de peso molecular ABI de 100 pb, para estimar el tamaño de los fragmentos (ver Anexo II), por 30 min a 60 mAmp y 80 V. Los geles teñidos se visualizaron con luz UV, y las imágenes se almacenaron digitalmente para su posterior análisis con el programa AlphaImager2000 (Alpha Innotech Corp.). Posteriormente, se realizó la electroforesis de las regiones de microsatélites, amplificadas con oligonucleótidos F (5´ - 3´) marcados con fluorocromo FAM, en el secuenciador ABI PRISMTM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) disponible en el Laboratorio de Bioquímica Molecular, UBIPRO de la FES Iztacala UNAM. De los cuatro microsatélites empleados en este estudio, sólo dos de ellos resultaron ser polimórficos, los cuales fueron MamVTC2 y MamVTC8. Fig. 8. Productos de PCR de los loci MamVTC6 y MamVTC8 en gel de agarosa al 1.2% de concentración, con una escalera de 100pb como referencia. Análisis Estadístico Para determinar el tamaño de los alelos amplificados y la genotipificación de los individuos, se empleó el software GeneScan V y el Peak ScannerTM Version 1.0 (Applied Biosystems). Posteriormente se establecieron los alelos de acuerdo con el tamaño del fragmento en pares de bases. Con el programa Arlequin ver. 3.1 (Excoffier et al. 2007), se estimó la heterocigosis esperada (HE) y la heterocigosis observada (HO), y se realizó un análisis de AMOVA. También se llevó a cabo la evaluación del índice F (Wright 1965), con el cual se compara el grado de diferenciación entre los diferentes niveles de inclusión en los que se estructuran las poblaciones (Hartl y Clark 1997). De esta manera, se puede analizar cómo se encuentra repartida la variación genética entre los distintos niveles de subdivisión. En este sentido, los niveles en los cuales la variación genética puede ser analizada son: el total de la población (T), las subpoblaciones (S) y los individuos que conforman las subpoblaciones (I) (Hedrick 2000). Los estadísticos F evalúan la reducción proporcional de la heterocigosis de los individuos, con respecto a las subpoblaciones (FIS), de los individuos con respecto al total de la población (FIT) y de las subpoblaciones con respecto al total de la población (FST) (Nei 1987, Hartl y Clark 1997). FIS = (HS - HI) / HS FST = (HT - HS) / HT FIT = (HT - HI) / HT Donde: HT = heterocigosis de la población total HS = heterocigosis en una subpoblación con apareamiento aleatorio HI = heterocigosis de un individuo respecto al total de la población De tal manera que, la FST es en sí, una medida de la diferenciación entre las poblaciones y su valor siempre es positivo. En contraste, las FIS y FIT son medidas de desviación de las proporciones de Hardy-Weinberg en las subpoblaciones o en la población total, y pueden tomar valores positivos, en el caso de que haya una deficiencia de heterocigotos o negativos cuando hay exceso de heterocigotos (Hedrick 2000). Por otra parte, otro estadístico calculado por medio del AMOVA, fue el RST el cual es análogo a la FST de Wright, es decir, es una medida de la similitud entre las poblaciones. Este parámetro se obtiene por la suma de las diferencias cuadradas (Excoffier et al. 2007). El flujo génico se determinó con base al valor de RST, empleando la fórmula: Nm = 0.25 (RST) / RST. Además, se empleó el programa TFPGA 1.3 (Miller 1997), con el cual se elaboró un agrupamiento UPGMA, usando la distancia genética de Nei (1978). Resultados y Discusión La heterocigosis observada promedio en M. crucigera fue similar en Tilapa1 y en Tilapa2, pero difieren de Paraje Verde, lo cual se esperaba debido a que esta última población tiene muy pocos individuos y se encuentra aislada. Sin embargo, en las tres poblaciones, la heterocigosis esperada resultó ser más alta que la heterocigosis observada (Tabla 3). Localidad Tamaño muestral AO HO HE FIS Tilapa 1 20 5.25 0.419 0.45064 0.561 Tilapa 2 23 4.75 0.425* 0.58681 0.991 Paraje Verde 8 3.00 0.277* 0.43750 0.677 Tabla 3. Tamaño muestral y valores promedio de alelos observados por locus, heterocigosis observada promedio y la heterocigosis esperada promedio, así como el coeficiente FIS a nivel poblacional de M. crucigera del presente estudio. * = desviación de las proporciones de Hardy-Weinberg (P < 0.05) En M. crucigera, a nivel de especie se observó que los loci analizados en este estudio presentan una heterocigosis observada promedio muy baja, en relación a la esperada promedio. Cuando se contrastan estos valores con los observados en otras cactáceas (Tabla 4), se observa que son bastante bajos. Especie Autor Crecimiento Marcador HO HE Polaskia chichipe Otero-Arnaiz et al. 2005 columnar microsatélite 0.631 0.683 Astrophytum asterias Terry et al. 2006 globular microsatélite 0.598 0.632 Echinocactus grusonii Hardesty et al. 2008 globular microsatélite 0.550 0.508 M. crucigera presente estudio globular microsatélite 0.373 0.555 Tabla 4. Descripción comparativa de la diversidad genética promedio a nivel de especie de M. crucigera con otras cactáceas, empleando microsatélites como marcador genético para su estudio. La diferenciación genética entre las poblaciones de M. crucigera, fue relativamente alta (RST = 0.5913), lo cual nos indica que las poblaciones son muy diferentes. También se observa que tienen una clara estructura genética, pero un valor de flujo génico muy bajo (Nm = 0.173). Respecto a los estadísticos F (Wright 1965), en las poblaciones analizadasse observaron valores promedio muy altos, con FIS = 0.99820 y FIT = 0.99831, mostrando que tanto los individuos dentro de las poblaciones, como entre las poblaciones, presentan una deficiencia alta de heterócigos, lo cual provoca que no se encuentren en equilibrio de Hardy-Weinberg. Esta falta de equilibrio, se puede deber a procesos de endogamia y deriva génica, como resultado de presentar tamaño poblacional pequeño. Se realizó un agrupamiento UPGMA, que muestra la distancia genética entre los dos nodos, nodo 1 = 0.1127 y nodo 2 = 1.0127 (Fig. 9), donde el nodo 1 se encuentra conformado por Tilapa1 y por Tilapa2, y el nodo 2 solamente por Paraje Verde. Fig. 9. Dendrograma de agrupamiento UPGMA de distancia genética de Nei (1978), entre las tres poblaciones analizadas. La distancia genética de Nei (1978), entre las poblaciones de Tilapa 1 y Tilapa 2 fue muy baja, en contraste con Paraje Verde, el cual difiere altamente. La distancia genética mostrada entre ambos nodos es posible explicarla, probablemente debido a una Tilapa1 Paraje Verde Tilapa2 relación directa con la distancia geográfica, ya que se encuentran relativamente lejos (aproximadamente 20 Km.). En consecuencia, es poco probable que compartan polinizadores, debido a que polinizadores probables como Apis melifera, pueden volar dentro de un radio menor a 3 Km (Metcalf y Flint 1974). Por otra parte, recientemente se realizó un análisis de respuesta al Disturbio Antropogénico Crónico (DAC) en nueve especies amenazadas de Mammillaria del VTC. En dicho estudio se observó que las especies saxícolas, M. crucigera y M. huitzilopochtli, presentan una afectación relativamente baja por actividades humanas. Por lo cual se plantea que dichas especies no requieren protección inmediata, a diferencia del resto de las especies estudiadas (Martorell y Peters 2009). Sin embargo, en otro estudio se han examinado los efectos del cambio climático sobre los futuros patrones de distribución en 20 especies de cactáceas, y de ellas cinco fueron del género Mammillaria. En dicho estudio, se observó que M. huitzilopochtli ya se habrá extinguido bajo las condiciones proyectadas para el año 2060, con un incremento de 2 ºC y una disminución del 10% en la precipitación pluvial, (Téllez-Valdés y Dávila- Aranda 2003). Considerando que M. crucigera y M. huitzilopochtli, evolutivamente se encuentran estrechamente relacionadas y que ambas presentan una fuerte asociación a riscos para escapar de las altas temperaturas, se podría esperar un futuro similar para M. crucigera. Por último, es necesario que se realicen estudios de M. crucigera sobre su sistema de polinización y dispersión de semillas, así como de la dinámica que se lleva a cabo en los bancos de semillas en el suelo, con lo que se incrementaría el conocimiento de la biología de esta especie y se podrían implementar las bases para el diseño de estrategias de conservación. Conclusiones • En este estudio, se encontró que los microsatélites logran detectar las variaciones genéticas entre las poblaciones, así como dentro de las mismas. • Se observó que los valores de diversidad genética en Tilapa 1 y Tilapa 2 son muy similares, en contraste con los de Pareje Verde que son más bajos. • Esta especie presenta niveles bajos, tales como, heterocigosis promedio, en comparación con otras especies de cactáceas. • Existe una diferenciación genética relativamente alta, o sea, una estructura genética con una relativa deficiencia de heterócigos. • La distancia genética entre las poblaciones de Tilapa 1 y Tilapa 2 fue muy baja, en contraste con Paraje Verde, que difiere altamente. Ésto probablemente debido a una relación directa con la distancia geográfica, ya que se encuentran relativamente lejos las dos primeras respecto de la tercera. • Finalmente, la variabilidad genética observada en M. crucigera, muestra que a pesar de presentar una estructura genética es muy susceptible a los cambios ambientales y requiere una adecuada estrategia de conservación. Recomendación para la Conservación de Mammillaria crucigera. Recientemente fueron analizados los patrones de diversidad de la familia Cactaceae en una escala global, para identificar aquellos países donde las acciones de conservación deben ser presentadas. Considerando la riqueza de especies, el número de especies endémicas y el territorio nacional, se han determinado 34 países como prioritarios en la conservación de esta familia, de los cuales, México resultó ser el más importante por tener el número más alto de especies totales y de especies endémicas (Ortega-Baes y Godínez-Alvarez 2006). Por lo anterior, y con base en el conocimiento de la historia de vida de M. crucigera, es decir, los datos demográfico-ecológicos hasta ahora ya publicados (Contreras y Valverde 2002; Godínez-Álvarez et al. 2003; Martorell y Patiño 2006) y los datos genéticos obtenidos por Solórzano et al. (2009) y los del presente estudio, se recomienda la realización de un análisis de Método de Evaluación del Riesgo de Extinción (MER) que respalde la modificación de categoría de riesgo para esta especie en la Norma Oficial Mexicana NOM-059-ECOL-2001, de sujeta a protección especial a la de en peligro de extinción. Anexos Anexo I. Protocolo de aislamiento de ADN genómico total a partir de tejido de plantas usando el QIAGEN® DNeasy Plant Mini Kit (modificado). *Tejido previamente molido con nitrógeno líquido en un mortero con pistilo, y depositado en un tubo de 1.5 ml. 1. Adicionar 400 µl de Buffer AP1 y 2 µl de RNasa A a 200 mg de tejido húmedo (bien molido), y agitar vigorosamente. 2. Incubar la mezcla durante 15 min. a 65°C; durante la incubación, agitar por inversión de dos a tres veces. 3. Adicionar 130 µl de Buffer AP2 al lysate (solución con células de membrana rota), mezclar e incubar en hielo durante 10min. Centrifugar el lysate durante 5 min. a 14000 rpm. 4. Recuperar el sobrenadante, transferirlo a la QIAshredder Mini Spin Column (columna lila) colocada en un tubo de colecta de 2 ml, y centrifugar durante 2 min. a 14000 rpm. Desechar la columna lila. 5. Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1.5 ml sin tocar la pastilla. Desechar el tubo de colecta. 6. Adicionar 1.5 volúmenes de Buffer AP3/E al lysate y mezclar por pipeteo. Ejemplo: 450 µl de lysate, adicionarle 675 µl de Buffer AP3/E. 7. De la mezcla del paso 6, transferir 650 µl (sin ningún precipitado) a la DNeasy Mini Spin Column (columna blanca) colocada en un tubo de colecta de 2 ml. Centrifugar durante 1 min. a 8000 rpm, y desechar el flujo arrojado. Reusar el tubo de colecta en el paso 8. 8. Repetir el paso 7. Desechar el tubo de colecta y el flujo arrojado. 9. Colocar la DNeasy Mini Spin Column en un nuevo tubo de colecta, adicionar 500 µl de Buffer AW a la DNeasy Mini Spin Column y centrifugar durante 1 min. a 8000 rpm. Desechar el flujo arrojado, y reusar el tubo de colecta en el paso 10. 10. Adicionar 500 µl de Buffer AW a la DNeasy Mini Spin Column y centrifugar durante 2 min. a 14000 rpm. Repetir la centrifugación para que la membrana quede seca. 11. Transferir la DNeasy Mini Spin Column a un tubo de 1.5 ml, y pipetear 100 µl de Buffer AE directamente en la membrana. Incubar durante 5 min. a temperatura ambiente, y luego centrifugar durante 1 min. a 8000 rpm para eluir. 12. Repetir el paso 11. Anexo II. Buffers Buffer TBE TRIS-Base 89 mM Ácido Bórico 89 mM EDTA 2 mM Buffer de Carga para Electroforesis Glicerol 30% H2O 70% Azul de Bromofenol ~.01% Anexo III. Glosario • Alelo - es cada una de las formas alternativas que puede tener un locus o gen que se diferencian en su secuencia y que se puede manifestar en modificacionesconcretas de la función de ese gen. • Aloenzimas - formas alternativas de una proteína detectada por electroforesis que son debido a alelos alternativos en un solo locus. • Electroforesis - es una técnica para la separación de moléculas, según la movilidad de éstas en un campo eléctrico. • Heterocigoto - un individuo diploide que para un gen dado (locus), tiene en cada uno de dos cromosomas homólogos un alelo distinto. • Heterocigosis - se denomina a la condición de heterocigoto. • Homocigoto - un individuo diploide que para un gen dado (locus), tiene dos copias idénticas de ese gen para un rasgo dado en los dos cromosomas homólogos. • Locus (del latín locus, lugar; plural loci) - es una posición fija sobre un cromosoma, como la posición de un gen o un biomarcador. • Oligonucleótido - es una secuencia corta de ADN o ARN, con cincuenta o menos pares de bases nitrogenadas. • PCR - la reacción en cadena de la polimerasa, es una técnica de Biología Molecular, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN. • Saxícola – planta que crece en acantilados o riscos. • Serie (botánica) - nivel taxonómico inferior al subgénero, que agrupa acorde a características y geografía comunes. • Taq polimerasa - enzima termoestable aislada de la bacteria Thermus aquaticus, que se emplea en las reacciones de PCR, para la replicación del ADN. • Termociclador - es un aparato usado en Biología Molecular que permite realizar los ciclos de temperaturas necesarios para una reacción en cadena de la polimerasa de amplificación de ADN o para reacciones de secuenciación con el método de Sanger. 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