Estudio-molecular-en-el-exon-28-del-gen-VWF-en-pacientes-mexicanos-con-enfermedad-de-von-Willebrand

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE 
MÉXICO 
 
 
 
 FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES 
CUAUTITLÁN 
 
 
 
 
 
 “Estudio molecular en el exón 28 del gen VWF 
en pacientes mexicanos 
 con enfermedad de von Willebrand” 
 
 
 
T E S I S 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: 
 
 
QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA 
 
 
P R E S E N T A : 
 
 
 
BEATRIZ MENA MONTES 
 
 
 
 
 ASESORAS: DRA. ROSENDA ISABEL PEÑALOZA ESPINOSA 
 M. en C. BRENDA MIREYA MELO NAVA 
 
 
 
 
 
 CUAUTITLÁN IZCALLI, EDO. DE MÉX. 2007 
 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUT!TLAN 
UNIDAD DE LA ADMINISTRACION ESCOLAR 
DEPARTAMENTO DE EXAMENES PROFESIONALES 
V~IVER'iDAD };tAc,lOJtAl. 
AV~MADE 
MEX I<:,O 
DRA. 3UEMI RODRIGUEZ ROMO 
DIRECTOR DE LA FES CUJ!.WTITLAN 
PRESENTE 
~O! 
etwI!1m~'iG~AI V 
ATN: L. A. ARACEU HERRERA HERNANDEZ 
Jefe del Departamento de Exámenes 
Profesionales de la FES Cuautitlán 
Con base en el art. 28 del Reglamento General de Exámenes, nG3 pennitimos 
comunicar a usted qlJe revisamos la Tesis: 
"Es tudio ¡r¡~le cular ~n el ex6p 2A del p'en v,rp en 
r¡acicn te s mexic ~1no:'i con E'nferrned8d r'le van ,'lilleor8nd " 
que presc:lb ~pasante: 3p. e t ri.z. ""ro "P Itcn:ct!"o'"'s'"-...,-,,,,--.,--. .,-__ _ 
con número de cuenb: 4');:>J 3 ~.d 3é para obtener el titulo de : 
~í~ic~ F?rmacéu ti ca Bi610ga 
Con$iderando que dicho trabajo reúne los requisitos necesarios para ser discutido en 
el EXAMEN PROFESIONAL correspondiente, otc,rgamos nuestro VOTO APROBATORIO. 
ATENTAMENTE 
"POR MI RAZA HABLARA EL ESPIRITU" 
Cuautitlán Izcalll , Méx. a ~ de Noviembre 
PRESIDENTE Dra . Gilda Flores Rosal es 
VOCAL ~~Lu,~~~:Q~~~'::! Dra . Roseada r~abe) Peñfl] oZ8 _Espi n 
SECRETARIO QBP . Antonio S8nchez Ortea~ 
PRIMER SUPLENTE Dr a . Sandra lJínz BarriPR Ar.ce". L-2:::~~~~~. 
SEGUNDO SUPLENTE jFB . Rosalb a Bonil l~. 3ánche7. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
“ESTUDIO MOLECULAR EN EL EXÓN 
28 DEL GEN VWF EN PACIENTES 
MEXICANOS CON ENFERMEDAD DE 
VON WILLEBRAND.” 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dedicada a mi familia 
 
 
 
 Mis padres 
 
Beatriz Montes Cárdenas 
 
Simón Mena Ferrer 
 
 
 
y mis hermanos 
 
 
María Angelina Mena Montes 
 
Marcelo Mena Montes 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DEDICATORIAS 
 
 
 
A mis padres 
 
Beatriz Montes Cárdenas 
Simón Mena Ferrer 
 
 
 Por su apoyo incondicional y por sus consejos que día a día llevo conmigo, por la 
paciencia con la que me han sabido dirigir todos estos años, gracias por estar conmigo 
siempre. Gracias por darme todo el amor del mundo, todo lo que ahora soy y he 
logrado se los debo a ustedes y siempre estaré agradecida porque nunca alcanzare a 
pagarles tanto. 
 
 
A mis hermanitos 
 
 Angelina y Marcelo quienes con su alegría han llenado de luz mi vida desde su 
existencia y a quienes quiero, admiró y respeto mucho, gracias por su apoyo y 
compartir conmigo su vida. 
 
 
A mi tutora 
 
Dra. Gilda Flores Rosales por compartir conmigo un poco de su experiencia, por 
guiarme durante está carrera y hacerme entender el papel tan importante de la 
ciencia. 
 
 
A Dios 
 
A aquel que día a día esta conmigo y guía cada uno de mis pasos, gracias señor por 
brindarme amor, tranquilidad y ofrecerme cada día para vivirlo y disfrutarlo al 
máximo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
HUELLAS 
 
 
“Una noche soñé que caminaba con Jesús sobre la arena de la playa 
Y a través del firmamento se dibujaban escenas de mi vida. 
 
 
En cada escena veía dos pares de pisadas en la arena, unas eran mías, las 
otras de Jesús. Cuando la última escena de mi vida relució ante mis ojos, 
miré hacia atrás, para ver las pisadas en la arena, y note que sólo había un 
juego de pisadas, realmente me molesté y 
 
 
Pregunté a Jesús: 
 
‐ Señor tu me dijiste que una vez  
que hubiera yo decidido seguirte, caminarías 
a mi lado todo el camino. 
 
Pero he notado que en esta época, 
la más difícil de mi vida, hay solamente 
un juego de pisadas. 
 
No comprendo por que precisamente 
cuando más te necesito, me has abandonado. 
 
Jesús me contestó: 
 
‐Yo te quiero mucho y nunca, 
te abandonaría. 
 
En este tiempo de dolor, 
cuando tu ves únicamente un par de pisadas, 
es porque ………………….. YO TE LLEVO EN MIS BRAZOS”. 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
 
A la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán, por ser una segunda casa y 
brindarme todas aquellas instalaciones necesarias para mi formación. 
 
 
A la Dra. Rosenda Isabel Peñaloza Espinosa por haberme dado la oportunidad de 
participar en su proyecto y ofrecerme confianza durante la tutoría de la presente tesis. 
 
Al Dr Fabio Salamanca Gómez, jefe de la Unidad de Investigación Médica en Genética 
Humana. 
 
 A la M en C Brenda Melo Nava por su tiempo dedicado a enseñarme y dirigirme en 
la realización de este proyecto y por la amistad que en ella encontré. 
 
 
A aquellas personas que me apoyaron, con la disposición para otorgarme información 
requerida en este trabajo: 
 
A la Dra. Herminia Benítez, de la Unidad del Servicio de Hematología del CMN 
SXXI del IMSS. 
 
 A la Dra. Laura Espinosa, Jefa de la Unidad del Servicio de Hematología del CMN 
“La Raza” del IMSS. 
 
Al Dr. Manuel López, Jefe de la Unidad del Servicio de Hematología del Hospital 20 
de Noviembre del ISSSTE. 
 
 
 
A los profesores que integran el jurado: Dra. Gilda Flores Rosales, Dra. Rosenda Isabel 
Peñaloza Espinosa, QBP. Antonio Sánchez Ortega, Dra. Sandra Díaz Barriga Arceo, 
QFB. Rosalba Bonilla Sánchez, a los cuales agradezco su paciencia, su disposición y su 
tiempo invertido en la revisión de está tesis. 
 
 
 
A mis amigos (as) y compañeros (as) quienes compartieron conmigo su tiempo, 
conocimiento y su amistad durante esté sendero de la vida ¡Gracias por todo! 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTO 
 
 A la 
 
UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
y a la 
 
Fundación Alfredo Harp Helú 
 
 
por el apoyo que recibí de ambas, gracias a ello concluí con éxito mis estudios 
 
por medio del Programa Nacional de Becas 
 
(PRONABES). 
ÍNDICE GENERAL 
 
Páginas 
Abreviaturas………………………………………..….…………………...................II 
 
Resumen……………………………………………………………………..…….….III 
 
Glosario…………………….……………………………………...............................V 
 
 I.-Generalidades………………….……….………………………..…………...........1 
 1.1.-Antecedentes……………………...........................................................1 
 1.2.-Enfermedad de von Willebrand (EVW)……………………...….………..2 
 1.2.1.-Clasificación.…………...…………………………………………...2 
 1.2.2.-Epidemiología………………………………………………..……..5 
 1.2.3.-Penetrancia variable………………………………………..……...7 
 1.2.4.-Diagnóstico……………………………………………………..…..8 
 1.3.-Gen del factor von Willebrand (VWF)…………………………………….8 
 1.4.-Proteína del factor von Willebrand (FVW)……………………………….9 
 1.5.- Pruebas clínicas del laboratorio...………………………………………15 
 
II.-Objetivos………………………………………………………….........................18 
 
III.-Diagrama de trabajo………………………………......……………………...….19 
 
IV.-Materiales……………………………………………………………………..….20V.-Metodología…..……..………………………………….....................................22 
 
VI.-Resultados………………………..……………………….…….………………..27 
 
VII.-Discusión de resultados………….……….…………………...…………..…...33 
 
VIII.-Conclusiones……….………………………………………...….....................35 
 
IX.-Bibliografía...…….…………………………………………..............................36 
ABREVIATURAS 
 
 DNA Ácido Desoxirribonucleico 
 
 RNA Ácido Ribonucleico 
 
 FVW: RCo Actividad del cofactor de ristocetina 
 
 RIPA Aglutinación de plaquetas inducida por ristocetina 
 
 FVW: Ag Antígeno del Factor de von Willebrand 
 
 dNTPs Desoxinucleótidos trifosfados 
 
 cDNA DNA complementario 
 
 Taq DNA Polimerasa Thermus aquaticus 
 
 EVW Enfermedad de von Willebrand 
 
 FVIII Factor VIII de coagulación 
 
 FVW Factor de von Willebrand 
 
 VWF Gen del factor de von Willebrand 
 
 GP Glicoproteína 
 
 BLAST Herramienta de búsqueda de alineamiento local 
Básica 
 
 kb Kilo bases 
 
 nt Nucleótido 
 
 pb Pares de bases 
 
 RFLP Polimorfismos de longitud de los fragmentos de 
 restricción 
 
 SNP Polimorfismos de nucleótido sencillo 
 
 PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa 
 
 RNAm RNA mensajero 
 
 ISTH SSC Subcomité Científico de la Sociedad Internacional en 
Trombosis y Hemostasia 
 
 TP Tiempo de protrombina 
 
 TTPa Tiempo de tromboplastina parcial activad 
RESUMEN 
 
 
 La enfermedad de von Willebrand (EVW) es causada por defectos cualitativos 
(estructuras anormales) o cuantitativos (cantidades reducidas) del factor de von 
Willebrand (FVW) en torrente sanguíneo, por lo que se ve inhibida la adhesión 
plaquetaria y se manifiesta por sangrados mucocutáneos y hemorragias recurrentes. 
 
 El FVW es una glicoproteína multimérica compleja que se sintetiza en 
megacariocitos y en células endoteliales (Ruggeri, 1997) y se encuentra en plasma. 
El gen VWF codifica para esta proteína y se localiza en el brazo corto del 
cromosoma 12 (12p13.3) y presenta 52 exones. El exón 28 es el más grande, 
comprende 1400 pb y codifica para los dominios A1 y A2 que se unen a la 
glicoproteína 1b (GPIb), y para el dominio A3 que es el sitio de unión a colágena. 
 
 La clasificación actual consiste en 6 tipos distintos. Los tipos 1 y 3 son por defecto 
en la cantidad del FVW y el tipo 2 tiene 4 variantes debidas a alteraciones 
cualitativas (2A, 2B, 2M, 2N) del FVW (Sadler, 1994). La estimación exacta de una 
prevalencia es complicada por la penetrancia incompleta en el fenotipo de la 
enfermedad, sin embargo la mayoría de los autores cita hasta un 1.3% en la 
población mundial (Keenny, 2001). 
 
 La variación es debida a que los casos leves pueden pasar desapercibidos. Las 
pruebas de laboratorio son esenciales para establecer el diagnóstico, sin embargo 
ninguna proporciona por sí sola un valor predictivo exacto y las pruebas a nivel 
molecular han podido inferir una relación genotipo-fenotipo importante, explicando 
algunas características de esta patología. 
 
 El objetivo del presente trabajo fue determinar variantes moleculares en el exón 28 
del gen VWF ya que es el más frecuentemente alterado (ISTH SSC VWF Base de 
datos de la Universidad de Sheffield http://www.vwf.group.shef.ac.uk/), en pacientes 
mexicanos con EVW. 
 
 Los estudios moleculares del exón 28 del gen VWF en pacientes mexicanos, son 
importantes para ayudar a comprender el origen de la enfermedad y contribuir así 
con el diagnóstico de la enfermedad, su tratamiento y el asesoramiento genético 
adecuado. También nos permite corroborar que nuestra población es una mezcla de 
genes indígenas, caucásicos y africanos. 
 
 Se obtuvo DNA a partir de linfocitos de sangre periférica de 10 pacientes con 
enfermedad de von Willebrand del Hospital de Pediatría de Centro Medico Nacional 
Siglo XXI, previo consentimiento informado. Se amplificó el exón 28 en dos 
segmentos, se purificaron los productos de reacción y a continuación se 
secuenciaron directamente, previamente marcados con Big Dye de acuerdo a las 
especificaciones de la casa comercial Applied Biosystem, (USA). La secuencia 
resultante se comparó por medio del programa BLAST con la informada en la red, y 
se prosiguió a la búsqueda de variantes moleculares. 
 
 Se identificaron 2 nuevos polimorfismos G5023T y C3867A del cDNA lo que no 
cambia el amino ácido: 1675L/L y 1288S/S, respectivamente. Además se 
encontraron los polimorfismos H1472D y V1565L, previamente descritos (Sadler, 
1993; Ginsburg, 1993). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
GLOSARIO 
 
 
Alelo: Forma alternativa de un gen situado en un locus particular. 
 
Antígeno: Cualquier sustancia que induce la producción de un anticuerpo, al que se 
une en forma específica. Molécula, generalmente una proteína de superficie celular, 
que puede inducir la formación de anticuerpos. 
 
Codominancia: Situación en la que los efectos fenotípicos de los alelos de un gen 
se expresan total y simultáneamente en el heterocigoto. 
 
Codón: Triplete de bases del mRNA que especifica un aminoácido o una señal de 
detención de la traducción. 
 
Cromosoma: Unidad estructural del material genético que consiste en una única 
molécula de DNA líneal de hebra doble y las proteínas asociadas. 
 
Dominio: Región alojada en el interior de una proteína que se pliega y funciona de 
una manera semiindependiente. Región de una proteína con estructura terciaria con 
distintiva actividad característica. 
 
Electroforesis: Técnica que mide la tasa de migración de moléculas con carga 
eléctrica en un medio, al aplicar un campo eléctrico. Es utilizada para separar una 
mezcla de moléculas por su migración diferencial en una fase estacionaria. 
 
Expresividad: Grado en el que se manifiesta un fenotipo para un carácter dado. 
 
Exón: Segmento de DNA de un gen que se transcribe y se traduce a proteína. 
 
Fenotipo: Características físicas, bioquímicas o clínicas de una persona que se 
expresan del genotipo. 
 
Gen: Unidad física fundamental de la herencia cuya existencia se puede confirmar 
por variantes alélicas y que ocupa un locus cromosómico concreto. Secuencia de 
DNA que codifica para un polipéptido o una molécula de RNA. 
 
Genética: Rama de la biología que trata de la herencia de caracteres y de la 
expresión de los mismos. 
 
Genotipo: Constitución génica de un individuo. 
 
Haplotipo: Grupo de alelos de loci íntimamente ligados que se encuentran en un 
individuo y suele segregar como unidad. 
 
Herencia: Transmisión de caracteres de una generación a la siguiente. 
 
Heterocigoto: Individuo con alelos distintos en uno o más loci. Tales individuos 
darán lugar a gametos diferentes. 
 
Homocigoto: Individuo que tiene un par de alelos iguales para un locus dado. 
 
Intrón: Porción de DNA situadas entre regiones codificantes de un gen que se 
transcribe pero que no aparece en el mRNA maduro. 
 
Mutación: Proceso que da lugar a la alteración del DNA. 
 
Mutación puntual: Mutación que se puede cartografiar en un solo locus. En el 
ámbito molecular,cambio que resulta de la alteración de un nucleótido por otro. 
 
Nucleótido: Nucleósido unido covalentemente a un grupo fosfato. Los nucleótidos 
son las piezas de construcción básicas de los ácidos nucleicos. 
 
Oligonucleótido (Primer): Secuencia lineal de nucleótidos (hasta 20) conectados 
por enlaces fosfodiéster 5’-3’. Está secuencia tiene pares de bases específicamente 
para una secuencia blanco a fin de permitir que una polimerasa inicie la síntesis de 
un filamento complementario. 
 
Penetrancia: Frecuencia expresada en porcentaje en la que individuos de un 
genotipo dado manifiestan al menos en algún grado un fenotipo mutante concreto 
asociado con un carácter. 
 
Polimerasa: Enzima que cataliza la formación de DNA y de RNA a partir de 
desoxirribonucleótidos y de ribonucleótidos, respectivamente. 
 
Polimorfismo: Existencia de dos o más variantes (alelos, fenotipos, variantes de 
secuencia, variante de estructura cromosómica) que se segregan en una población 
con una frecuencia importante. Los usos más laxos entre genetistas moleculares 
incluyen: 
1.- Cualquier variante de secuencia que se encuentra a una frecuencia >1% en una 
población. 
2.- Cualquier variante de secuencia no patogénica, prescindiendo de la frecuencia. 
 
Polimorfismo equilibrado: Polimorfismo genético que se mantiene en una 
población por selección natural. 
 
Polimorfismo genético: Coexistencia estable de dos o más genotipos discontinuos 
en una población. Presencia de dos o más alelos de cualquier sistema en una 
población en la que la frecuencia del más raro de ellos no puede explicarse por 
mutación recurrente. 
 
Polimorfismo de la longitud de fragmentos de restricción (RFLP): Variación en 
la longitud de fragmentos de DNA generados por endonucleasas de restricción. 
Estas variaciones están causadas por mutaciones que crean o suprimen sitios de 
corte de enzimas de restricción. Los RFLP se heredan de manera codominante y 
pueden utilizarse como marcadores genéticos. 
 
Polipéptido: Molécula formada por aminoácidos unidos mediante enlaces 
peptídicos. Este término se utiliza para denominar la cadena aminoacídica antes de 
que asuma su configuración tridimensional funcional. 
 
Pseudogén: Gen no funcional con homología de secuencia a un gen estructural 
conocido presente en cualquier sitio del genoma. Se diferencian de sus parientes 
funcionales por inserciones, deleciones, por la presencia de secuencias 
flanqueantes repetidas directas de 10 a 20 nucleótidos o por contener un número de 
codones de paro. 
 
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): Método para amplificar segmentos 
de DNA que utiliza ciclos de desnaturalización térmica, de emparejamiento a 
cebadores y de síntesis de DNA dirigida por la DNA polimerasa. 
 
Sustitución de base: Cambio de una base en una molécula de DNA que produce 
una mutación o un polimorfismo. Hay dos tipos de sustituciones: las transiciones, en 
la que una purina substituye a una purina o una pirimidina substituye a una 
pirimidina y las transversiones, en las que una pirimidina substituye a una purina o 
viceversa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
I GENERALIDADES 
 
1.1 Antecedentes 
 
 Erick von Willebrand, médico finlandés, describió en 1926 un trastorno 
hemorrágico hereditario con características diferentes a la hemofilia y lo denominó 
“pseudohemofilia” porque no era una herencia ligada al X, y sí una transmisión 
autosómico dominante. Este trastorno se conoce ahora con el nombre de su 
descubridor. Su evaluación comenzó con una familia que vivía en Föglö, una isla en 
el archipiélago Ǻland de Finlandia (Zhang, 1993). El propusitus de esta familia fue 
una mujer quien sangró hasta la muerte después de su periodo menstrual, otros 
cuatro miembros de la familia murieron como resultado de hemorragias no 
controladas. El Dr von Willebrand atribuyó el desorden a un defecto en las plaquetas 
o en la pared vascular después de notar en estos pacientes un tiempo de sangría 
prolongado y un conteo plaquetario normal (Lillicrap, 2004). 
 
 Durante los años 50 y principios de los 60 el trastorno se relacionó con un nivel 
reducido en la actividad del factor VIII procoagulante compensando la deficiencia 
mediante infusión de plasma. Para 1971 por primera vez se demostró mediante 
pruebas inmunológicas que el factor VIII (FVIII) y el factor von Willebrand (FVW) 
eran proteínas distintas. 
 
 En 1985 cuatro grupos independientes de investigadores caracterizaron al gen 
VWF (Ginsburg, 1985; Lynch, 1985; Sadler, 1985 y Verweij, 1985), y la secuencia 
peptídica del factor de von Willebrand fue determinada en 1986 (Titati, 1986). Todo 
esto, permitió la localización de los sitios funcionales del gen VWF y se definió el 
papel de la proteína FVW en la hemostasia primaria. 
 
 La EVW es el desorden hemorrágico hereditario más común en los seres humanos 
causada por defectos cualitativos (estructuras anormales) o cuantitativos (cantidades 
reducidas o ausente) del FVW en torrente sanguíneo que inhiben la adhesión 
plaquetaria (Casaña, 20001; Keeney, 2001; Lillicrap, 2004; Mckenzie, 2000; 
Tierney, 2003 y Gibbins, 2004). 
 
 
1.2 Enfermedad de von Willebrand (EVW) 
 
 1.2.1 Clasificación de la EVW 
 
 Se han descrito más de 20 subtipos, aunque la clasificación actual consiste en 6 
tipos distintos. Los tipos 1 y 3 son defectos cuantitativos donde el FVW tiene poca o 
nula presencia, el tipo 2 tiene 4 variantes cualitativas (2A, 2B, 2M, 2N) con distintos 
defectos de unión a ligandos (Clasificación de acuerdo a su ultima publicación de la 
Sociedad Internacional sobre Trombosis y Hemostasia, Sadler, 1994). 
 
1.2.1.1 Enfermedad de von Willebrand tipo 1 
 
 Es un trastorno de deficiencia cuantitativa parcial, la forma de herencia es 
autosómico dominante, y es conocida como el tipo clásico. Su diagnóstico es 
complicado debido a su penetrancia reducida o incompleta y a su expresividad 
variable. Se caracteriza por una reducción paralela que va de leve a moderada en 
los niveles plasmáticos de FVW:Ag y Factor VIII; tiene una distribución de 
multímeros normal y es la forma más común de la enfermedad observada en cerca 
del 80% de los casos clínicos. 
 
 Los síntomas más comunes son las hemorragias excesivas de las superficies de 
las mucosas. En mujeres se puede evidenciar por una menstruación excesiva, o 
después de cortaduras, cirugía o traumatismos (Lillicrap, 2004; Casaña, 2001; 
Eikenboom, 2006; Goodeve, 2006; Kunicki, 2004; Montgomery, 2006; Rodeghiero, 
2005; y Sadler, 2004 y 2005). 
 
 1.2.1.2 Enfermedad de von Willebrand tipo 2A 
 
 Es un defecto cualitativo del FVW asociado con la ausencia de los multímeros 
grandes. Aproximadamente se presenta en 10-15% de los casos clínicos. Hay 
niveles bajos en la actividad del cofactor de ristocetina FVW: RCo a la par del 
FVW:Ag. 
 
 Es un desorden autosómico dominante, causado por mutaciones bien definidas en 
los dominios D2, A1 y A2 del gen VWF (Allen, 2000; Patrushev, 2001; Hilbert, 2004; 
Hommais, 2006; Kunicki, 2006 y O’Brien, 2006). Pueden distinguirse dos grupos: 
 El grupo 1 se debe a un defecto en el trasporte intracelular y el grupo 2 está 
asociado a un incremento en la proteólisis del FVW en plasma (Keeney, 2001). 
 
1.2.1.3 Enfermedad de von Willebrand tipo 2B 
 
 Es una variante cualitativa, con aumento de la afinidad por el receptor GPIb /IX de 
las plaquetas. Variante no común, se presenta en <5% de los casos clínicos. Este 
tipo se asocia con una reducción en los multímeros de alto peso molecular debido a 
que los multímeros grandes del FVW se unen de manera espontánea a las 
plaquetas y no están disponibles para la adhesión plaquetaria normal. Este tipo es el 
resultado de cambios en la región del dominio A1 (Casaña, 1998; Patruchev, 2001; 
Matsubara, 2003; Ulrichts, 2004 y Baronciani, 2005). 
 
 La prueba de RIPA (aglutinación de plaquetas inducida por ristocetina) es útil para 
diagnosticareste subtipo teniendo un incremento al utilizar plasma rico en plaquetas 
del paciente y concentraciones de ristocetina de <0.6 mg/mL. Se presenta con un 
modo de herencia autosómico dominante. 
 
 Una mutación plaquetaria que aumenta la afinidad de la GPIb/IX para los 
multímeros del factor de von Willebrand normales, crea un trastorno similar desde 
el punto de vista clínico, denominado tipo plaquetario o pseudoenfermedad de von 
Willebrand. En este caso los multímeros grandes también desaparecen del plasma 
y se activan las plaquetas. Aquí el defecto está en las plaquetas manifestándose 
anormalmente en la agregación con ristocetina (Rodack, 2005). 
 
 Para diferenciar el tipo 2B de la EVW del tipo plaquetario se necesita, la prueba de 
aglutinación inducida por ristocetina de las plaquetas lavadas del paciente y 
mezcladas con plasma normal presentando una manifestación mayor en el caso de 
EVW tipo plaquetario, pero no en el tipo 2B; o un análisis en los genes del FVW y la 
GPIbα (Lillicrap, 2004). 
 
1.2.1.4 Enfermedad de von Willebrand tipo 2M 
 
 Variante cualitativa asociada con un defecto específico en la interacción 
plaqueta/FVW, con disminución de la unión del FVW con las plaquetas, los 
multímeros de alto peso molecular tienen un rango normal. La relación entre 
FVW:Ag y FVW: RCo es <0.6. La mayoría de las mutaciones sustitutivas que causan 
el tipo 2M han sido localizadas en el dominio A1 codificado en parte del exón 28 
(Casaña, 1998; Patruchev, 2001; Hilbert, 2002 y ISTH SSC VWF Base de datos de 
la Universidad de Sheffield. http://www.vwf.group.shef.ac.uk/). 
 
1.2.1.5 Enfermedad de von Willebrand tipo 2N 
 
 Es un defecto cualitativo del FVW, que resulta en una disminución de su afinidad 
por el factor VIII y por consecuencia en circulación hay niveles bajos del FVIII. El tipo 
de herencia es autosómica recesiva. 
 
 Frecuentemente la única anormalidad que se detecta en el laboratorio, es un nivel 
bajo en plasma de FVIII, confundiéndose ocasionalmente con hemofilia A. Las 
mutaciones responsables de este fenotipo se agrupan en la región del gen VWF que 
codifica al dominio D’ que comprende los exones 18-25 (Jorieux, 2000 y Hilbert, 
2003 y 2004). 
 
 
 
 
1.2.1.6 Enfermedad de von Willebrand tipo 3 
 
 Este trastorno cuantitativo clínicamente grave, es raro. El factor de von Willebrand 
no está presente o está casi ausente, resulta en una marcada reducción o ausencia 
de plaquetas, del FVW en plasma y la actividad del factor VIII está reducida. 
Usualmente la herencia es autosómica recesiva con una frecuencia aproximada de 
1-5:106 de los casos (Castaman, 2006 y Kenny, 2001). 
 
 Por lo general no hay multímeros plasmáticos. Estos pacientes manifiestan graves 
hemorragias mucocútaneas recurrentes, así como frecuentes hemorragias músculo-
esqueléticas y en tejidos blandos. 
 
 El tipo 3 de la EVW se produce por pérdidas grandes en el DNA o por mutaciones 
que dan lugar a la ausencia total de mRNA del factor de von Willebrand funcional, 
produciendo hemorragia sistémica y anatómica grave en el sujeto heterocigoto, o en 
caso de los homocigotos por consanguinidad los síntomas se asemejan a los de la 
hemofilia A (Mckenzie, 2000; Rodack, 2005 y Mongomery, 2006). 
 
 1.2.1.7 Enfermedad de von Willebrand adquirida 
 
 La deficiencia adquirida muestra manifestaciones similares a las de la enfermedad 
de von Willebrand, se ha descrito asociada con trastornos autoinmunes, 
linfoproliferativos y mieloproliferativos, gammapatías monoclonales benignas, tumor 
de Wilms, angiodisplasia intestinal, enfermedad cardiaca congénita , exposición a 
plaguicidas y síndrome urémico hemolítico (Bloom, 1991; Rodack, 2005 y Federici, 
2006). 
 
 
 1.2.2 Epidemiología de la EVW 
 
 La EVW es el desorden hereditario más común de la coagulación en los seres 
humanos. Su prevalencia en la población varía dependiendo del enfoque 
diagnóstico. Sin embargo por lo menos en dos estudios epidemiológicos 
prospectivos, se ha encontrado que hasta 1% de una población predominantemente 
pediátrica manifiesta síntomas y signos de laboratorio de la EVW (Rodeghiero, 1987 
y Werner, 1993). 
 
 La estimación exacta de una prevalencia es complicada por la penetrancia variable 
en el fenotipo de la enfermedad se presenta con una prevalencia de 1.3% en la 
población mundial (Keenny, 2001) pero puede ser mayor ya que casos leves pueden 
pasar desapercibidos. 
 
 En México no hay datos exactos sobre prevalencia, los pocos datos obtenidos son 
los siguientes: La federación de hemofilia de la República Mexicana informa en su 
página web, que 78% de sus pacientes registrados presenta hemofilia A y el 2% de 
la EVW, esto es 60 pacientes con EVW de 3,387 pacientes con otras alteraciones de 
la coagulación (Figura 1). 
 
 El jefe del servicio de hematología del hospital 20 de Noviembre del ISSSTE tiene 
en su registro desde 1986 hasta noviembre del 2006, 4 casos de EVW, sin embargo, 
en el laboratorio de diagnóstico de este hospital se tiene el registro de 2 pacientes 
con EVW en el 2005 y 8 en el 2006. 
 
 La jefa del servicio de hematología del hospital de Centro Médico “La Raza”, tiene 
sólo registrados de varios años atras 4 pacientes con EVW de 164 pacientes con 
alteraciones de la coagulación. 
 
 Y en el hospital de Pediatría de CMN SXXI del IMSS se tienen más datos sobre 
esta enfermedad, la tasa de prevalencia anual de pacientes con diagnóstico de EVW 
(por cada 1000 pacientes atendidos en citas de primera vez) fue de: 2.5 en 1995 y 
1996, 1.0 en 1997, 1.2 en 1998, 0.5 en 1999 y 1.0 en 2000, y de enero a noviembre 
del 2006 se tienen 13 pacientes con diagnóstico de EVW. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1: Registro nacional de pacientes con diferentes alteraciones de la coagulación, el porcentaje 
esta expresado al número de pacientes registrados en la federación de hemofilia de República 
Mexicana. 
 
 
 1.2.3 Penetrancia variable 
 
 Además de las mutaciones genéticas, la EVW presenta una penetrancia variable. 
El sistema de grupos sanguíneos ABO, las hormonas, el ejercicio y el estrés 
también influyen en la producción del FVW. Las personas con un grupo sanguíneo O 
tienen niveles de 20 a 25% menores del factor de von Willebrand que los 
observados por los otros grupos sanguíneos A, B y AB (Bauduer, 2004; Bowen, 
2002 y Miller, 2003). 
 
 Las elevaciones de estrógenos durante el embarazo normalizan la concentración 
plasmática del FVW incluso en la deficiencia moderada, sin embargo los niveles 
maternos disminuyen con rapidez después del parto lo que conduce a la hemorragia 
aguda. El FVW es un reactante de fase aguda, debido a ello los niveles aumentan 
en la inflamación, el ejercicio y el estrés (Bloom, 1991 y Rodack, 2005). 
 
 
 
 
 1.2.4 Diagnóstico 
 
 Para un diagnóstico de la EVW se tiene que tomar en cuenta: 
 
1.2.4.1 Un historial personal y familiar de hemorragias mucocutáneas 
1.2.4.2 Una evaluación de laboratorio que sea consistente con un defecto 
cuantitativo y/o cualitativo del FVW. 
 
 La evolución clínica de la EVW se basa principalmente en la acumulación de un 
historial personal objetivo de hemorragias mucocutáneas excesivas, epistaxis 
recurrentes, hemorragias gingivales, hemorragias prolongadas debidas a 
laceraciones y propensión a hematomas, así como menorragias en mujeres. 
 
 Un historial familiar de hemorragias excesivas en donde la mayoría de los tipos 
son heredados como rasgo autosómico dominante puede ser evidente, sin embargo, 
se puede complicar ya que la enfermedad presenta formas de penetrancia y 
expresividad variables en el fenotipo, manifestándose en diversos síntomas dentro 
de la familia (Lillicrap, 2004; Federici, 2006 y Budde , 2002). 
 
 
1.3 Gen del factor von Willebrand (VWF) 
 
 El gen VWF esta localizado en el brazo corto del cromosoma12 (12p13.3), con 
una longitud de 178 kb y comprende 52 exones, donde el más grande es el exon 28 
que tiene 1.4 kb. (McClatchey, 2002; Collins, 1987 y Mancuso, 1989). 
 
 Codifica para un RNAm de ~9 kb, la transcripción está regulada por una 
combinación de factores ubicuos y específicos al tipo de célula, incluyendo las 
proteínas GATA y ETS (Lillicrap, 2004). 
 
 El exón más grande del gen VWF es el exón 28 que comprende 1380 pb que 
codifican para 460 aminoácidos, implicando los dominios A1 y A2 los cuales son 
para la unión a GPIb (Huizing, 2002) y para el dominio A3 que es el sitio de unión a 
colágena. 
 
 Por el gran tamaño y complejidad del gen, el análisis es complicado debido a la 
existencia adicional de un pseudogén en el cromosoma 22 (22q11-13) (Patracchini, 
1989) que con los exones 23 al 34 presenta una alta homología (97%) de la 
secuencia del cromosoma 12 (Mancuso, 1991); este pseudogén presenta múltiples 
codones de paro y pudo haberse generado en la época en la que los primates se 
diferenciaron (Lillicrap, 2004). 
 
 Las conversiones genicas entre el gen VWF y el pseudogén son eventos raros y 
están restringidos a regiones límites que codifican para los dominios D3 y A1. Estas 
conversiones genicas son facilitadas por la alta homología entre el gen y el 
pseudogén y probablemente por la presencia de las secuencias llamadas “chi” que 
promueven la recombinación no homologa entre genes, incluso entre cromosomas 
diferentes, hay dos secuencias chi (CCTGGTGG y GCTGGTGG) en el gen VWF, 
una es localizada en la región 3’ del intrón 27 y otra en la región 5’ del exón 28, 
estando estas región sujeta a conversiones genicas, explicando de esta manera la 
variabilidad genética en la región 3’ del intrón 27 y la región 5’ del exón 28. 
(Eikenboom, 1994; Gupta, 2005). 
 
 
1.4 Proteína del factor von Willebrand 
 
 El FVW es una glicoproteína compleja que se encuentra en plasma, en los 
gránulos alfa de las plaquetas y en tejido conectivo subendotelial (Ruggeri, 1997; 
Dacie, 2002 y Ruiz, 2003). Se sintetiza en megacariocitos y en células endoteliales 
donde se almacena en los llamados cuerpos Weilbel-Palade (Gibbins, 2004). Los 
pesos moleculares de la proteína varían de 0.5 a más de 20 millones de daltones, 
tiene una vida media en circulación in vitro de 24 horas y su concentración media 
plasmática es de 1 mg/dL. La biosíntesis del FVW es compleja y requiere de varias 
modificaciones post-traduccionales incluyendo un proceso proteolítico, glicosilación y 
sulfatación (Mancuso, 1989). 
 
 El procesamiento se inicia en el retículo endoplásmico rugoso, donde el péptido 
señal se elimina y se agregan carbohidratos. A continuación se forman dímeros por 
enlaces disulfuro ubicados en los extremos carboxilo terminales. Los dímeros se 
desplazan a la región del aparato de Golgi donde el propéptido es eliminado, y aquí 
los carbohidratos se transforman a complejos y se agregan grupos sulfato (Figura 2). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Resumen de los eventos post-traducionales que tienen lugar durante la biosíntesis del FVW 
y su ubicación al interior de la célula endotelial o megacariocito. (RER= Retículo endoplásmico 
rugoso). Figura tomada de Lillicrap, 2004. 
 
 
 Ya en las etapas finales, los dímeros comienzan a vincularse por los extremos 
amino terminales mediante enlaces de disulfuro para formar multímeros continuando 
este proceso en el citoplasma (Mckenzie, 2000). 
 
 Se sintetiza como una proteína de 2813 aminoácidos denominada factor prepro-
von Willebrand o pro-von Willebrand, este monómero consiste de 22 aminoácidos 
del péptido señal, 741 aminoácidos del propéptido y 2050 aminoácidos de la 
subunidad madura con un peso molecular de 260, 000 daltones (Figura 3). 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Estructura polipéptido primaria del FVW que contiene una secuencia de 22 aminoácidos 
correspondientes al péptido señal, 741 aminoácidos del propéptido. La subunidad madura ya 
secretada tiene 2050 aminoácidos y diferentes dominios que unen a receptores plaquetarios, 
colágena y factor VIII. Figura tomada de Lillicrap, 2004. 
 
 
 
 La estructura primaria de la proteína FVW está formada por varios dominios 
repetidos designados desde la A hasta la D (Figura 4). Los dominios D1, D2, D’ y D3 
participan en la regulación del proceso de formación de multímeros, y las regiones D’ 
y D3 también median la unión con el factor VIII. Tanto el dominio A1 como el A3 
poseen propiedades de unión a colágena. 
 
 Los sitios donde el FVW se une a las plaquetas son: en el dominio A1 al receptor 
plaquetarario de glicoproteína Ib/IX y en el dominio C2 al receptor de glicoproteína 
IIb/IIIa. Así cada monómero permite a la proteína unirse a los ligandos GPIb/IX y 
GPIIb/IIIa de las plaquetas, en el subendotelio a la colágena y al factor VIII de 
coagulación en torrente sanguíneo (Ruggeri, 1997 y Keeney, 2001). 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Estructura de la proteína FVW que contiene una secuencia de 22 aminoácidos 
correspondientes al péptido señal, 741 aminoácidos del propéptido y 2050 aminoácidos que dan una 
subunidad madura señalando en cada dominio los sitios de unión a receptores plaquetarios, colágena 
y factor VIII. (Figura tomada de la ISTH SSC VWF Base de datos de la Universidad de Sheffield. 
http://www.vwf.group.shef.ac.uk/ y Keeney, 2001). 
 
 
 
 Los multímeros del factor de von Willebrand, están constituídos por una gama 
amplia de tamaños. Los multímeros más pequeños son secretados 
espontáneamente por las células endoteliales tanto al plasma como al subendotelio. 
Los secretados al plasma se combinan con el factor VIII al circular prolongado su 
vida media plasmática de unos minutos a 12 horas, este complejo es denominando 
VIII/FVW (Rodak, 2005). 
 
 Los multímeros más grandes se almacenan en los cuerpos de Weibel-Palade de 
las células endoteliales, secretados después de una lesión y son estimulados por 
trombina, fibrina o histamina. El factor de von Willebrand sintetizado en los 
megacariocitos se almacena en los gránulos alfa de las plaquetas, estos contienen 
multímeros más grandes que los que están en plasma (Mckenzie, 2000 y Gibbins, 
2004 ). 
 
 Aquellos multímeros extremadamente grandes de FVW se unen a la superficie de 
la célula endotelial, mediante unan interacción con la proteína P-selectina de 
membrana Weibel-Palade. En este sitio, los multímeros del FVW se ven sometidos a 
“corte por estres” del flujo sanguíneo y el tamaño de los multímeros tiene una 
reducción fisiológica por el evento de fragmentación proteolítica controlado 
(Bernardo, 2005). El sitio de fragmentación del FVW está en el dominio A2, entre los 
aminoácidos 1505 y 1506, la fragmentación es mediada por la metaloproteinasa 
ADAMTS13 (Bowen, 2004 y Sadler, 2005). 
 
 La proteína FVW presenta sitios de unión a ligandos plaquetarios (GP1b, 
GPIIa/IIIb), a FVIII en el torrente sanguíneo y de colágena en la pared del vaso, y 
desempeña 3 funciones fisiológicas: 
 
 Media la adhesión de las plaquetas a los sitios de lesión vascular por medio 
de su unión al receptor plaquetario glicoproteína Ib/IX y a colágena en el 
subendotelio vascular (Resendiz, 2004). 
 
 Facilita la agregación plaquetaria por medio de su unión al receptor IIb/IIIa. 
 
 Se une por medio de un enlace de tipo no covalente al factor VIII (Figura 5) 
para estabilizarlo y protegerlo de la degradación proteolítica mientras es 
transportado en circulación general (Keeney, 2001). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5.Complejo factor von Willebrand-factor VIII. El FVW muestra sus diferentes sitios de unión a 
membrana plaquetaria, colágena y factor VIII (Tomado de Rodack, 2005). 
 
 
 El mecanismo de acción del FVW consiste en que se une a la colágena fibrilar 
expuesta durante la descamación de las células endoteliales, luego las plaquetasse 
unen a través de sus sitios de la GP Ib/IX a la “capa” de moléculas FVW (Figura 6). 
Cuando el FVW se une a la GP Ib/IX por la integrina de superficie plaquetaria (Karp, 
1999) se activan las plaquetas y expresan el segundo sitio de unión al FVW, la GP 
IIb/IIa, en este sitio se une al FVW y al fibrinógeno mediando la agregación 
plaquetaria (Rodack, 2005). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Interacción de las plaquetas que se enlazan al factor von Willebrand creando un puente 
entre la colágena del subendotelio después de una lesión. (Tomado de Mckenzie, 2000). 
 
 
1.5 Pruebas clínicas de laboratorio 
 
 El perfil de pruebas de la enfermedad de von Willebrand debe realizarce por lo 
general dos o tres veces en un período de semanas o meses. 
 
 El perfil normal implica el tiempo de sangría, que es la prueba de rutina para el 
factor de von Willebrand y mide la función de las plaquetas cuando el resultado de la 
prueba es anormal, no significa que las plaquetas sean las anormales, sino que, en 
ausencia del factor de von Willebrand, las plaquetas no pueden adherirse a la 
colágena e iniciar la serie de reacciones que conducen a la formación del tapón 
hemostático primario. La prueba de FVW:RCo, que es similar a la agregometría 
plaquetaria, proporciona un resultado cuantitativo de la actividad de FVW. 
 
 El FVW:Ag aporta un resultado cuantitativo para el FVW total, funcional y no 
funcional. El recuento de plaquetas, es necesario para descartar la trombocitopenia 
como una causa alternativa del sangrado sistémico. El tiempo de tromboplastina 
parcial activada (TTPa) se prolonga cuando el nivel del factor VIII disminuye 
(Lillicrap, 2004; Tierney, 2003; Rubio, 2004 y Baynes, 2006). 
 
 Los exámenes adicionales, agregados al perfil para indicar el diagnóstico en los 
casos más difíciles son: la prueba de agregometría plaquetaria inducida por dosis 
bajas de ristocetina (LD-RIPA), es útil para el diagnóstico del subtipo 2B, la prueba 
de actividad del factor VIII, la prueba de unión a colágena, y la electroforesis en gel 
de agarosa o poliacrilamida que permite la visualización cualitativa de la distribución 
multimérica del FVW. 
 
 Sí el paciente tiene un historial de pérdida de sangre, esta puede deberse a una 
deficiencia de hierro o anemia, el tipo 2B del EVW generalmente tiene una leve 
trombocitopenia crónica por lo que, el tiempo de sangría no se debe usar como 
prueba de detección habitual para la EVW y se puede utilizar el analizador PFA100® 
aún que su papel exacto no se ha resuelto (Rodack, 2005 y Moore, 2001). 
 
 Las pruebas más útiles para el diagnóstico son: la prueba inmunológica para el 
antígeno del FVW (FVW:Ag); una prueba funcional para el FVW, la prueba del 
cofactor de ristocetina (FVW: RCo) y la prueba de función del procoagulante del 
FVIII (FVIII:C). Deben establecerse los rangos normales locales para estas pruebas 
y debido a la variabilidad de los valores, habrán de repetirse, por lo menos dos 
veces las pruebas antes de confirmar el diagnóstico de la enfermedad (Castaman, 
2003).Cuando se realizan estas pruebas los laboratorios deben comunicar las 
variaciones biológicas, las variables preanalíticas, así como los fármacos que 
afectan estos resultados, la repetición de estas pruebas brinda una predicción más 
definitiva. 
 
 Las técnicas de biología molecular más utilizadas son: La Reacción en Cadena de 
la Polimerasa (PCR), la secuenciación automática y los RFLP (Polimorfismos de 
longitud de los fragmentos de restricción). Los análisis con RFLP son muy comunes, 
y representan la variación de origen natural ocasionada por cambios en un solo par 
de nucleótidos (Perera, 2003; Theophilus, 2002). 
 
 Las técnicas de diagnóstico molecular revolucionan el enfoque del laboratorio para 
la detección de la EVW. En la actualidad las pruebas a nivel molecular han podido 
inferir en el diagnóstico de la EVW ya que se han identificados gran cantidad de 
mutaciones responsables de los diferentes tipos de la EVW (Tabla 1). 
 
 Estudios de funcionalidad (Hilbert, 2002 y 2003) han mostrado que la EVW puede 
ser el resultado de una serie de defectos del gen VWF que causan manifestaciones 
clínicas distintas de la enfermedad. 
 
Un análisis en población mexicana de los exones con mayor frecuencia de mutación 
del gen VWF en pacientes con EVW (Melo, 2006) se informó que con 27 pacientes 
se identificarón en el exón 28, 2 mutaciones nuevas y 8 polimorfismos nuevos no 
antes reportados. 
 
 Los pacientes en quienes se sospecha de EVW por la clínica y las pruebas de 
coagulación, es necesario corroborar el dato de alteración molecular en el gen VWF 
donde el exon 28 es el más frecuentemente alterado. 
 
 
 
 
 
 
TABLA 1.- RESUMEN DEL TIPO DE EVW, FRECUENCIA, HERENCIA Y BASES MOLECULARES. 
 
 
Tipo de 
EVW 
Frecuencia Tipo de 
herencia 
Bases moleculares. 
Tipo 1 1-3: 1000 AD 
 
Penetrancia 
incompleta. 
Reporte de varias 
mutaciones. 
Las bases moleculares no 
son conocidas en la 
mayoría de los casos. 
Tipo 2A 10-15% de los 
casos clínicos de la 
EVW. 
AD Mutaciones dentro del 
dominio A2. 
Mutaciones en el grupo 1: 
Defecto en el transporte 
intracelular. 
Mutaciones en el grupo2: 
Incremento en la 
proteolísis del FVW en el 
plasma después de la 
secreción. 
 
Tipo 2B No común < 5% de 
los casos clínicos 
de la EVW. 
AD Mutaciones dentro del 
dominio A1. Resulta un 
incremento o una unión 
espontánea a GPIb de la 
plaqueta. 
Tipo 2M Incidencia poco 
estimada. 
AD Mutaciones y pequeñas 
deleciones en el dominio 
A1. 
Tipo 2N No común, 
heterocigotos 
pueden ser 
prevalentes en 
algunas 
poblaciones. 
AR 
(Homocigotos o 
algunos 
heterocigotos 
pueden parecer 
Hemofilia A 
autosómica.) 
Mutaciones dentro del 
extremo N-terminal del 
FVW maduro interfiere con 
la unión al FVIII. 
Tipo 3 1-5: 106 AR Deleciones en el gen VWF, 
mutaciones con sentido, 
sin sentido y con 
corrimiento en el marco de 
lectura a lo largo del gen 
VWF. Defecto cis en la 
expresión del mRNA. 
 
 AD: Autosómica dominante. AR: Autosómica recesiva (Tomada de Kenny, 2001). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
II OBJETIVOS 
 
 General 
 
 Determinar variantes moleculares en el exón 28 del gen VWF mediante 
técnicas de biología molecular en 10 pacientes mexicanos con enfermedad 
de von Willebrand del hospital de Pediatría de CMN Siglo XXI del IMSS. 
 
 Particulares 
 
 Amplificar el exón 28 con el método de reacción en cadena de la polimerasa 
(PCR). 
 
 Marcar las muestras con Big Dye para detectar alteraciones en los 
nucleótidos por medio de la secuenciación. 
 
 
 Comparar los resultados de la secuenciación mediante el programa BLAST y 
la base de datos (ISTH SSC VWF Base de datos de la Universidad de 
Sheffield. http://www.vwf.group.shef.ac.uk/) para identificar alguna variante 
molecular. 
 
III DIAGRAMA DE TRABAJO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Purificación y 
cuantificación del DNA 
Amplificación del exón 28 
del gen VWF mediante 
PCR
Extracción de DNA a partir 
de leucocitos de sangre 
periférica, previamente 
tomada con EDTA 
PACIENTE CON 
ENFERMEDAD DE VON 
WILLEBRAND 
 
Secuenciación 
Interpretación y discusión 
de resultados 
Reacción de 
secuenciación marcando 
con Big Dye 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
IV MATERIAL 
 
 4.1 Biológico 
 
 Muestra de 3-4 ml de sangre periférica con EDTA de 10 pacientes con diagnóstico 
establecido de enfermedad de von Willebrand, previo consentimiento informado y la 
aprobación del proyecto por el comité de ética del Hospital de Pediatría CMN SXXI, 
IMSS, de acuerdo a los siguientes criterios: 
 
4.1.1 Criterios de inclusión 
 
 Pacientes que tengan un diagnóstico clínico establecido de enfermedad de 
von Willebrand. 
 Que acepten voluntariamenteel estudio al firmar una carta de 
consentimiento. 
 
4.1.2 Criterios de exclusión 
 
 Pacientes que estén bajo tratamiento medico con anticoagulantes o con 
algún medicamento como la aspirina que interfieran con la coagulación al 
momento de la toma de muestra (De Gaetano, 2003). 
 
 
 4.2 Químico 
 
 Solución de lisis (tris 10 Mm, NaCl 10 mM, MgCl2 5mM) 
 NaCl 5mM 
 SDS Dodecilbenceno sulfato de sodio al 10% 
 Etanol al 100% y 70% 
 Agua destilada o desionizada 
 Colorante Azul de bromofenol 
 Bromuro de etidio (0.5 µg/mL) 
 Buffer para PCR Tris-HCl/ NaCl de Invitrogen 
 MgCl2 50mM de Invitrogen 
 dNTPs (2mM) solución de dTTP, dATP, dCTP, dGTP de Invitrogen 
 primers de Invitrogen 
 Platinum ® Taq DNA Polimerasa de Invitrogen 
 Acetato de amonio 10 M 
 Big Dye TM Terminators de Amplied Biosystem que contiene: 
 A- Terminador con dicloro [R6G] 
 C- Terminador con dicloro [ROX] 
 G- Terminador con dicloro [R110] 
 T- Terminador con dicloro [TAMRA] 
 Deoxinucleótidos trifosfatados (dATP, dCTP, dITP, dUTP) 
 DNA polimerasa AmpliTaq 
 FS con pirofosfatasa estable Terminal, MgCl2
 Buffer para marcaje NaCl, Tris- HCl pH 9.0 
 Enzima de restricción Bsl1 (10 000U/ml) de New England Bio Labs: 
 NEBuffer10X: NaCl (100 mM), Tris-HCl (50mM), MgCl2, DTT (1mM) pH 7.9 
 
 
4.3 Equipos 
 
 Espectrofotómetro Biophotometer 6131 Eppendorf de UV 
 Termociclador GeneAmp 9700, Applied Biosystem, USA 
 Microcentrífuga Eppendorf 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
V METODOLOGÍA 
 
 
5.1 Extracción de DNA 
 
 Se centrifuga la sangre total previamente recolectada con EDTA a 2500rpm por 30 
min, transcurrido este tiempo se separan los leucocitos con pipeta pasteur 
recolectándolos en un tubo de microcentrífuga, se agrega a los leucocitos solución 
de lisis, se centrifuga a 6,000 rpm por 10 min, desechando el sobrenadante, se 
repite esto por 3 veces. 
 
 Se agregan 180µL de NaCl a 5 mM se agita en vortex y se deja reposar por 10 
min, transcurrido este tiempo, se agregan 90 µL de SDS 10% y se agita por 10 min, 
después se agregan 690 µL de solución saturada de NaCl, se agita 10 min y se 
centrifuga 10 min a 13,000rpm, transcurrido este tiempo se reparte el sobrenadante 
en dos tubos de microcentrífuga añadiendo a cada tubo 800 µL de etanol al 100%, 
posteriormente se centrifuga a 10,000rpm por 5 min, al finalizar este tiempo se 
desecha el sobrenadante y se agrega etanol al 70%, se centrifuga por 5 min a 
10,000 rpm repitiendo este paso 3 veces, terminando esto, se desecha el último 
sobrenadante y se evaporar el etanol a 50 ºC, la pastilla seca se resuspender con 
agua destilada o desionizada aproximadamente 200 µL y se conservan los tubos a 
4ºC. 
 
5.2 Cuantificación de DNA 
 
 Se programa el espectrofotómetro conforme a la dilución deseada en este caso 2 
de DNA más 98 de agua, para obtener un factor 1:50. Se calibrar con el blanco, y se 
colocan 2 µL de muestra con 98 µL de agua destilada a la celda previamente limpia 
y seca. El espectrofotómetro da la concentración real. 
 
 Se corre una electroforesis en gel de agarosa al 1.5% donde se colocan 2µL de la 
muestra con 3µL de colorante en uno de posos, conjuntamente se coloca en otro 
poso 2µL de marcador de peso la cámara de electroforesis se conecta al fuente de 
poder donde se va a correr a 100 volts por aproximadamente 25 min, el gel se revela 
con bromuro de etidio, observando en el transiluminador bandas grandes. 
 
 
5.3 Amplificación de ambos segmentos del exón 28 por el método de PCR 
 
Se prepara la siguiente mezcla en la campana previamente esterilizada con UV 
 
 Buffer 2.5 µL 
 MgCl2 0.75 µL 
 dNTPs 2 µL 
 Primer F 1 µL 
 Primer R 1 µL 
 H 2O 15.5 µL 
 Taq 0.25 µL 
 DNA 100 ng 
 Dando un volumen final de 25 µL. 
 
 La mezcla es para una reacción y dependiendo del fragmento se usan 
oligonucleótidos específicos (Tabla 2) además se debe calcular para un número de 
reacciones dado. 
 
 Se programa el termociclador para que se lleve a cabo la PCR que requiere las 
siguientes condiciones, variando la Tm de cada par de oligos que se utilicen (ver 
tabla 3): 
 94 ºC 5 min 
 94 ºC 30 seg 
 Tm dependiendo cada par de oligos 
 72 ºC 30-50 seg 
 72 ºC 7 min 
 4ºC ∞ 
 
TABLA 2: SECUENCIA DE OLIGONUCLEÓTIDOS EMPLEADOS 
 
Oligonucleótido Secuencia (5’→3’) Tamaño 
del 
fragmento 
Localización* 
V28AF AGAAGTGTCCACAGGTTCTTC 150-170 
V28AR AGATTTGGAACAGTGTGTATTT 487pb 615-636 
V28B.F CTCAAGCAGATCCGCCTCATC 794-815 
V28R CATACCAGGTGCAGGGGAGAG 
789pb 
1569-1589 
vwkp28.F CCTGAAGCCCCTCCTCCTACT 915-935 
vwkp28R AGGATTAGAACCCGAGTCG 
376pb 
1666-1684 
 
F, oligonucleótido sentido; R oligonucleótido antisentido 
* Numeración acorde con Mancuso et al. 1989. 
 
 
 
 
TABLA 3: CONDICIONES PARA UNA PCR DE ACUERDO A CADA PAR DE OLIGONUCLEÓTIDOS 
EMPLEADOS. TEMPERATURA Y TIEMPO DE CADA ETAPA, CONCENTRACIÓN DE MAGNESIO 
REQUERIDA Y EL TAMAÑO DE CADA FRAGMENTO. 
 
Oligonucleótid
o 
Temperatura y 
tiempo de 
desnaturalizació
n 
Temperatur
a y tiempo 
de 
alineación 
(Tm) 
Temperatur
a y tiempo 
de 
extensión 
Concentració
n de 
Magnesio 
Tamaño 
del 
fragment
o 
V28AF 
V28AR 
94ºC/ 30 seg 55ºC/30seg. 72ºC/45 seg 1,5-2,5 mM 487pb 
V28B.F 
V28R 
94ºC/ 30 seg 62ºC/30seg. 72ºC/ 50 
seg 
1,5mM 789pb 
Kpn28F 
Kpn28R 
94ºC/ 30 seg 59ºC/30seg. 72ºC/ 40 
seg 
1,5mM 
 376pb 
 
5.4 Purificación de los productos obtenidos por PCR 
 
 Se prepara un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 2% donde se coloca en 
un poso marcador de peso molecular, y en otro poso se adicionan los 25 µL de la 
PCR previamente mezclados con 25 µL de colorante, se llenan los otros posos de 
acuerdo al número de muestras que se tengan, se conecta la cámara de 
electroforesis a la fuente de poder y se corre a 100 volts por 20 minutos. 
 
 Se cortar la banda en el trans-iluminador de UV, y se guarda en un tubo para 
microcentrifuga a -72ºC después de 2 hrs, la banda se centrifuga a 10,000 rpm por 
5 min, ésta se pasa a la columna rellena de fibra de vidrio, la columna se coloca 
encima de del tubo anterior y se centrifugan a 10,000 rpm por 15 min, trascurrido 
este tiempo se mide el volumen obtenido en el tubo inferior, se agregan medio 
volumen de acetato de amonio 10 M más el doble del volumen de Etanol al 100%, 
posteriormente se centrifuga a 14,000 rpm por 20 min, se retira el sobrenadante con 
sumo cuidado y se agregan 150 µL de etanol al 70% y se centrifuga nuevamente a 
14,000 rpm por 10 min esto se realiza otras 3 veces y al final se deseca a 55ºC, la 
pastilla seca se resuspende agregando 10-15 µL de agua destilada. 
 
 Se prepara un gel de agarosa al 2% y se corren 2 µL de la muestra recuperada, 
conjuntamente se corre marcador de peso y marcador de masa en la electroforesis a 
100 volts por 15 min, se cuantifica comparando la intensidad de la banda con el 
marcador de masa. 
 
 
5.5 Reacción de secuenciación realizando un marcaje con Big Dye 
 
Preparar una mezcla en campana estéril de 
 
 Big Dye 1 µL 
 Buffer de Big Dye 3 µL 
 Primer 0.3 µL 
 H 2O 14 µL 
 DNA2 µL 
 Dando un volumen final de 20 µL 
 
 Se programa el termociclador con las siguientes condiciones 
 
 94 ºC 5 min 
 94 ºC 10 seg 
 50 ºC 5 seg 
 60 ºC 4 min 
 4 ºC ∞ 
 
 Terminado este tiempo de reacción se purifica la mezcla de reacción de secuencia 
por medio de columnas de sephadex y enviar a secuenciar en el Instituto de Biología 
de la UNAM. 
 
 
5.6 Comparación de los datos obtenidos 
 
 Los resultados obtenidos se abren en la computadora mediante el programa 
CHROMAS y a su vez, por medio del programa BLAST se alinea la secuencia de 
nuestras muestras con la secuencia del exón 28 que esta en red, de esta forma se 
detectan alguna alteración en nuestra secuencia y se buscan en la Base de datos 
de la Universidad de Sheffield ISTH SSC VWF http://www.vwf.group.shef.ac.uk. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
VI RESULTADOS 
 
6.1 Pacientes 
 
 De los 10 pacientes diagnosticados no relacionados, se analizaron 4 pacientes 
femeninos y 6 masculinos, 9 de ellos tuvieron grupo sanguíneo O, Rh (+) y 1A, Rh 
(+); con un rango de edad de los 3-38 años, cuyo promedio fue de 19.8 años. El 
tiempo de sangrado y el TP está normal en el 100% de los pacientes, el TTP está 
prolongado en 50% de los pacientes, un 30% de los pacientes presenta leve 
trombocitopenia. 
 
 El FVW está disminuido en 40% de pacientes y el FVIII está disminuido en 10% de 
los pacientes y sólo el 10% presenta alteración en ristocetina. 
 
 Se tienen 7 pacientes tipo 1, uno tipo 2A, uno tipo 2B y uno tipo 2M de la EVW 
(Tabla 4). Clasificados así debido a que todos presentan síntomas de sangrados 
mucocutáneos excesivos y hemorragias de leves a moderadas con antecedentes 
tanto personales como familiares de estos síntomas, por los valores obtenidos del 
laboratorio y la correspondientes valoración del médico Hematólogo y el médico 
Genétista. 
 
 
 
 
TABLA 4: RESULTADOS OBTENIDOS EN LAS PRUEBAS REALIZADAS EN EL LABORATORIO 
CLÍNICO DE LOS 10 PACIENTES ESTUDIADOS CON DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDAD DE VON 
WILLEBRAND. 
 
 
Paciente Edad Ivy Plaquetas Rh TP TTPa FVIII:C 
% de 
agregación 
con 
Ristocetina VWF:Ag Diagnóstico 
Valor de 
Referencia 
Sin 
rango 2-6 min 
150-450 
x103 11-14.5 seg 23-32 seg 60-140% 60-150% 61-158% Tipo 
1 27 2’59’’ 223 A+ 11.8/12.8 31.9/29.4 126 65 90 1 
2 17 3’ 295 O+ 12/12.8 38.7/29.5 100 91.2 53.4 1 
3 3 3’30´´ 120 O+ 13.5/12.6 42.7/29.5 78 71 15.2 2A 
4 8 2´45´´ 301 O+ 11.7/12.1 49.7/29.2 17 71.25 86.8 2N 
64 12 4´25´´ 474 O+ 13/12.4 32.2/29.8 88 106 81.8 1 
65 38 1’55’’ 354 O+ 12.3/12.4 31.4/29.8 101 123 71.8 1 
66 35 3’50’’ 203 O- 12.4/12.4 28.9/29.8 89 98 55.9 1 
76 13 2´05´´ 131 O+ 13/12.6 34.4/29.8 130 93 66 1 
78 35 5’2’’ 112 O+ 13/12.6 24.7/29.8 186 58 98.7 2B 
79 10 4’ 235 O+ 12.4/12.6 37.2/29.9 112 102 35.2 1 
Promedio 19.8 2´76´´ 244.8 12.51 35.18 102.7 87.8 65.48 
 
 
Paciente: Se asignó una numeración dada. Ivy: Prueba del tiempo de sangrado expresada en minutos (min), TP: 
Tiempo de Protrombina en segundos (seg), TTPa: Tiempo de Tromboplastina Pacial activada en segundos, 
FVIII:C: Concentración del factor VIII, % de agregación con el antibiótico ristocetina, VWF:Ag: Antigeno de FVW. 
Diagnóstico: Tipo de EVW. 
 
 
 
 
6.2 Amplificación de ambos segmentos del exón 28 mediante PCR 
 
 
 
 Después de la extracción del DNA a partir de leucocitos de sangre periférica 
tomada de cada uno de los pacientes, se procedió a amplificar el exón 28 en 2 
segmentos, uno cercano al extremo 5’ y otro cercano al extremo 3’, esto debido a 
que al intentar amplificar todo el exón 28 completo la banda de PCR se hacia 
inespecífica y al purificar la banda, la cantidad recuperada era poca y no suficiente 
para secuenciar (Figura 6), además en 2 segmentos se evita amplificar parte de la 
secuencia del pseudogén. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6: Amplificación de los segmentos de 789pb y 487pb del exón 28 del gen VWF para los 
pacientes 1 y 2, amplificación del exón 28 completo dando un producto de 1440pb para los pacientes 
1 y 2. 
 
 
 La PCR de ambos segmentos del exón 28 se visualizó en un corrimiento 
electroforético en gel de agarosa de bajo punto de fusión al 2 % debido a como se 
observa en la figura 7, ambas reacciones presentan impurezas, la banda fue cortada 
y congelada para proceder a purificarla. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
487pb 
 
 
 
 
789pb 
 
 
 
PM: Marcador de peso de 100 pb. 
464: Fragmento de 487 pb del paciente 64. 
465: Fragmento de 487 pb del paciente 65. 
466: Fragmento de 487 pb del paciente 66. 
478: Fragmento de 487 pb del paciente 78. 
445: Fragmento de 487 pb del paciente 45. 
71: Fragmento de 789 pb del paciente 71. 
764: Fragmento de 789 pb del paciente 64. 
765: Fragmento de 789 pb del paciente 65. 
766: Fragmento de 789 pb del paciente 66. 
778: Fragmento de 789 pb del paciente 78. 
745: Fragmento de 789 pb del paciente 45. 
 
 
 
Figura 7: Corrimiento electroforético en gel de agarosa al 2% de una PCR para ambos segmentos 
(789pb y 487 pb) del exón 28 del gen VWF de diferentas pacientes. 
 
 
 Después de congelar la banda del producto de PCR, ésta es purificada por medio 
de fibra de vidrio, al final del procedimiento se realizó un corrimiento electroforético 
para verificar la cantidad recuperada al compararse con el marcador de masa como 
se ve en la figura 8. 
 
 
 
 
487pb 
 
 
 
 
789pb 
 
 
 
 
 
 
Figura 8: Corrimiento en gel de agarosa al 2% de los productos purificados de ambos segmentos del 
exón 28. 
 
 
 Además, también se amplificaron ambos segmentos del exón 28 en 50 
individuos sanos con valores de Ivy, TTPa, FVW:Ag, FVIII:C normales, en la figura 9 
se observan bandas de 487 pb de 25 de estos individuos normales. 
 
 
 
 
 
487pb 
 
 
 
 
 
 
 
 
487pb 
Masa: Marcador de masa (2μL) 
64: Fragmento de 487 pb del paciente 64. 
65: Fragmento de 487 pb del paciente 65. 
66: Fragmento de 487 pb del paciente 66. 
78: Fragmento de 487 pb del paciente 78. 
45: Fragmento de 487 pb del paciente 45. 
64: Fragmento de 789 pb del paciente 64. 
65: Fragmento de 789 pb del paciente 65. 
66: Fragmento de 789 pb del paciente 66. 
78: Fragmento de 789 pb del paciente 78. 
45: Fragmento de 789 pb del paciente 45. 
3: Fragmento de 789 pb del paciente 3. 
 
 
 
 
 
Figura 9: Corrimiento en gel de agarosa al 2% para el segmento que da un producto de 487pb de 
algunos individuos sanos, donde pm es marcador de peso de 100 pb. 
 
6.3 Secuencias 
 
 Después de purificar los productos de la reacción de PCR, estos fueron marcados 
por medio de una reacción con Big Dye, purificados y posteriormente se enviaron a 
secuenciar, después por medio de los programas CHROMAS y BLAST se obtienen 
los siguientes resultados, donde en la figura 10B la flecha indica el nucleótido A 
(Adenina) que al compararse con la secuencia normal 10A, hay un cambio del 
nucleótido A por una C, y al compararse con la literatura se tiene el polimorfismo 
V1565L y así mismo la secuencias de la figura 11, en la 11D se tienen dos picos 
indicando la presencia de otro nucleótido (Heterocigoto) en este caso están 
presentes tanto A como C, al compararse con el normal 11C, se tiene el 
polimorfismo S1288. 
 
 A) B) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 10: A) Secuencia normal en la posición 1224 del exón 28 del gen VWF. B) Secuencia alterada 
en la posición 1224 del exón 28 del gen VWF (Polimorfismo V1565L). 
 
 
 C) D) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 11: C) Secuencia normal en la posición 398 del exón 28 del gen VWF. D) Secuencia alterada 
en la posición 398 del exón 28 del gen VWF (Polimorfismo S1288).Al analizar las secuencias de ambos segmentos del exón 28 de los 10 pacientes, 
se obtuvieron 4 polimorfismos que se resumen en la tabla 5, donde la frecuencia fue 
determinada analizando las secuencias de los 50 individuos normales que 
conjuntamente se trabajaron. 
 
 
TABLA 5: RESULTADOS OBTENIDOS EN EL EXÓN 28 DEL GEN VWF; 4 POLIMORFISMOS 
INDICANDO SU POSICIÓN EN EL cDNA, EN EL MENSAJERO Y EN LA PROTEÍNA. 
 
 
 
No nt 
cDNA No nt Alelos No aa 
Enzima de 
Restricción
Población y 
Frecuencia Referencia 
Frecuencia 
en México 
3867 398 C/A S1288 -- -- -- 0.97/0.03 
4414 945 G/C 
H/D 
1472 Rle AI 
Norte 
América 
0.89/0.11 Sadler, 1993 0.78/0.22 
4693 1224 G/T 
V/L 
1565 Bsl I NI Sadler, 1993 
 
0.60/0.40 
 
5023 1554 C/T L1675 -- -- -- 0.97/0.03 
 
 
 No nt cDNA: Número de nucleótido en el cDNA; 
 No nt: Número de nucleótido acorde con Mancuso, 1989. 
 No aa: Número de amino ácido, NI: No informado. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
VII DISCUSIÓN DE RESULTADOS OBTENIDOS 
 
 
 El DNA es la base de la información en el proceso de la herencia, esté material 
genético presenta varias características: replicación, almacenaje y expresión de la 
información, y variación por mutación. Si ocurre una mutación, un cambio en la 
composición química del DNA, la alteración se reflejará en la transcripción y en la 
traducción, afectando a una proteína específica, estos cambios pueden causar 
diversas enfermedades en esté caso la enfermedad de von Willebrand en México. 
 
 La EVW es la alteración de la coagulación hereditaria más frecuente, se presenta 
a nivel mundial con el 1%, está incidencia es muy baja, y en México que no se tienen 
datos sobre prevalencia encontrar un caso de EVW es raro, por está razón en el 
presente trabajo se tuvieron únicamente 10 pacientes con EVW que fueron 
diagnosticados en un hospital de concentración donde acuden pacientes de toda la 
república. Además el diagnóstico de está enfermedad es muy complicado por la 
penetrancia que presenta, y porque se requieren diversas pruebas de laboratorio 
para su confirmación. 
 
 La extracción de DNA por el método de precipitación de sales es sencilla, rápida y 
fácil de realizar, obteniéndose cantidades de DNA adecuadas para trabajar. 
Posterior a la extracción se amplificó el exón 28 del gen VWF, la amplificación del 
exón completo resulta complicada por su tamaño, y al intentar la amplificación del 
exón completo, se tienen diferentes bandas dando una reacción muy inespecífica, y 
debido a que con el método de purificación empleado, se recupera muy poca 
cantidad del producto y no era lo suficiente para secuenciar (Figura 6), se amplificó 
en 2 segmentos, uno cercano al extremo 5’ de un producto de 487pb, y otro 
segmento cercano al extremo 3’ de 789 pb, con esté procedimiento se evita además 
amplificar parte de la secuencia del pseudogén. La amplificación del exón en 2 
segmentos nos da los productos de reacción más pequeños, así aunque con la 
purificación se tenga un rendimiento bajo, la cantidad requerida para secuencia es 
suficiente. La interpretación de las secuencias se realizó por medio del programa 
CHROMAS y de la herramienta BLAST, los cuales son fáciles de utilizar y se 
encuentran disponibles en red, las secuencias se alinearon para la búsqueda de 
variantes moleculares, como se tiene en las figuras 10 y 11. 
 
 Al final del análisis se encontraron 4 polimorfismos, de los cuales 2 son sin cambio 
de aminoácido L1675 y S1288; 2 con cambio de aminoácido, el polimorfismo donde 
hay cambio de valina por leucina V1565L ambos aminoácidos neutros no polares y 
el polimorfismo donde hay cambio de histidina por ácido aspártico H1472D un 
aminoácido con carácter básico por uno ácido, los dos últimos han sido descritos en 
población mexicana y en Norteamérica. La frecuencia de los 4 polimorfismos fue 
determinada por secuenciación en 100 alelos normales de 50 individuos sanos con 
valores de Ivy, TTPa, FVW:Ag, FVIII:C normales. 
 
 Es importante aclarar que en la presente tesis, sólo se estudiaron dos segmentos 
del exón 28 y con esto no se descarta la presencia de una mutación específica en 
otra región del gen; debido a que el gen VWF es muy grande y una mutación puede 
caer en cualquier sitio, ya sea en el promotor, en el gen regulador, en alguno de los 
otros 51 exones o en los intrones (Keightley, 1999; Harvey, 2000). Además, no sólo 
las variantes moleculares influyen en la producción del FVW, también el sistema 
sanguíneo ABO, las hormonas, la inflamación, el ejercicio y el estrés porque la EVW 
es multifactorial (Bloom, 1991; Rodack, 2005). 
 
 El IMSS a pesar de ser una institución pública ha introducido mediante la 
investigación, un diagnóstico molecular de la EVW en México ya que principalmente 
el tipo 2 N de la EVW es confundido con hemofilia A. El diagnóstico molecular 
complementa al diagnóstico clínico y de laboratorio ya que es diferencial y 
confirmatorio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
VIII CONCLUSIONES 
 
 
 
 Se determinaron 4 variantes moleculares en el exón 28 del gen VWF. 
 
 
 
 Se identificaron 4 polimorfismos, 2 sin cambio de aminoácido L1675 y S1288; 
2 con cambio de aminoácido en la secuencia V1565L y H1472D este último 
previamente descritos en Norteamérica. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
IX BIBLIOGRAFÍA 
 
Allen, S., Abuzenadah, A.M., Hinks, J., Blagg, J.L., Ingerslev, J., Goodeve, A.C., 
Peake, I.R. y Daly, M.E. (2000). A novel von Willebrand disease causing mutation 
(Arg273Trp) in the von Willebrand factor propeptide that results in defective 
multimerization and secretion. Blood 96:560-568. 
 
Bauduer, F. y Ducout, L. (2004). Is the assessment of von Willebrand disease 
prevalence an achievable challenge? The example of the French Basque Country 
where blood group O and factor XI deficiency are highly prevalent. J Thromb 
Haemost. 2:1724-1726. 
 
Baronciani, L., Federici A.B., Beretta, M., Cozzi, G., Canciani, M.T. y Mannucci, P.M. 
(2005). Expression studies on a novel type 2B variant of the von Willebrand factor 
gene (R1308L) characterized by defective collagen binding. J Thromb Haemost. 
3:2689-2694. 
 
Baynes, John. (2006). “Bioquímica Médica. Fundamentos y aplicaciones clínicas”. 
Segunda edición. Editorial Elsevier Mosby. Madrid España. pp. 683. 
 
Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Choi, H., Moake, J.L. y Dong, J.F. (2005). 
Platelets adhered to endothelial cell-bound ultra-large Von Willebrand factor strings 
support leukocyte tethering and rolling under high shear stress. J Thromb Haemost. 
3: 562–70. 
 
Berntorp, E. y Önundarson, P.T. (2005). Prevalence of von Willebrand disease in the 
Nordic Region. Haematologica reports 1:4-6. 
 
Bloom, A.L. (1991). von Willebrand factor: Clinical features of inherited and acquired 
disorders. Clinic Proceed. 66:743-751. 
 
Bowen, D.J. y Collins, P.W. (2004). An amino acid polymorphism in von Willebrand 
factor correlates with increased susceptibility to proteolysis by ADAMTS13. Blood 
103:941-947. 
 
Bowen, D.J. (2003). An influence of ABO blood group on the rate of proteolysis of 
von Willebrand factor by ADAMTS13. J Thromb Haemost.1:33-40. 
 
Budde, U., Drewke, E., Mainusch, K. y Scheneppenheim, M.D. (2002). Laboratory 
Diagnosis of Congenital von Willebrand disease. Sem Thromb Haemost. 28:173-190. 
 
Casaña, P., Martínez, F., Haya, S., Tavares, A. y Aznar, J.A. (2001). New mutations 
in exon 28 of the von Willebrans’s disease. Haematologica 86: 414-419. 
 
Casaña, P., Martínez, F., Haya, S., Tavares, A. y Aznar, J.A. (1998). Search for 
mutation in a segment f the exon 28 the human von Willebrand factor gene: new 
mutations, R1315C and R1341W, associated with type 2M and 2B variants. Am J 
Hematol. 59:57-63. 
 
Casaña, P., Martínez, F., Haya, S., Tavares, A. y Aznar, J.A. (2001) .Significat 
linkage and non-linkage oftype 1 von Willebrand disease to the von Willebrand factor 
gene. Br J Haematol. 115:692-700. 
 
Castaman, G., Federici, A.B., Rodeghiero, F. y Manaucci, P.M. (2003). von 
Willebrand’s disease in the year 2003: towarda the complete identification of gene 
defects for correct diagnosis and treatment. J Haematol. 88: 94-108. 
 
Castaman, G., Rodeghiero, F., Tosetto, A., Cappelletti, A., Baudo, F., Eikenboom, 
J.C., Federici, A.B., Lethagen, S., Linari, S., Lusher, J., Nishino, M., Petrini, P., 
Srivastava, A. y Ungerstedt, J.S. (2006). Hemorrhagic symptoms and bleeding risk 
in obligatory carriers of type 3 von Willebrand disease an international, multicenter 
study. J Thromb Haemost. 4: 2164-2169. 
 
Collins, C.J., Underdahl, J.P., Levene, R.B., Ravera, C.P., Morin, M.J., Dombalagian, 
M.J., Ricca, G., Livingston, D.M. y Lynch, D.C. (1987). Molecular cloning of the 
human gene for von Willebrand factor and identification of the transcription initiation 
site. Biochemistry 84:4393-4397. 
 
Dacie, Lewis. (2002). “Practical Haematology”. Novena edición. Ed. Churchill. China 
pp.634. 
 
De Gaetano, G. y Cerletti, C. (2003). Aspirin resistance: a revival of platelet 
aggregation tests? J Thromb Haemost. 1:1710-1713. 
 
 Eikenboom, J., Van Marion, V., Putter, H., Goodeve, A., Rodeghiero, F., Castaman, 
G., Federici, A.B., Batlle, J., Meyer, D., Mazurier, C., Goudemand, J., 
Schneppenheim, R., Budde, U., Ingerslev, J., Vorlova, Z., Habart, D., Holmberg, L., 
Lethagen, S., Pasi, J., Hill, F. y Peake, I. (2006). Linkage analysis in families 
diagnosed with type 1 von Willebrand disease in the European study, molecular and 
clinical markers for the diagnosis and management of type 1 VWD. J Thromb 
Haemost. 4:774-782. 
 
Eikenboom, J., Vink, T., Brient, E., Sixma, J.J. y Reitsma, P.H. (1994). Multiple 
substitutions in the von Wllebrand factor that mimic the pseudogene sequence. 
PNAS. 91:2221-2224. 
 
Federici, A.B. (2006). Acquired von Willebrand syndrome: an underdiagnosed and 
misdiagnosed bleeding complication in patients with lymphoproliferative and 
myeloproliferative disorders. Semin Hematol. 43: 548-558. 
 
Federici, A.B.,MD. (2006). Management of inherited von Willebrand disease in 2006. 
Sem Thromb Haemost. 32:616-620. 
 
Federici, A.B., Mazurier, C., Bemtorp, E., Lee, A.C., Scharrer, I., Goudemand, J., 
Lethagen, S., Nitu, I., Ludwig, G., Hilbert, L. y Mannucci, P.M. (2004). Biologic 
response to desmopressin in patients with severe type 1 and type 2 von Willebrand 
diseases: results of a multicenter European study. Blood 103:2032-2038. 
 
Gibbins, J.M., Mahaut-Smith M.P. (2004). “Platelets and Megakaryocytes”. 
Perspectives and Techniques. Vol.2. Humana Press. New Jersey,USA. 
 
Ginsburg, D., Handin, R.I., Bonthron, D.T., Donlon, T.A., Bruns, G.A.P., Latt, S.A. y 
Orkin, S.H. (1985). Human von Willebrand factor (vWF): Isolation of complementary 
DNA (cDNA) clones and chromosomal localization. Science 228: 1401-1406. 
 
 Ginsburg, D. y Sadler, J.E. (1993). von Willebrand disease: a database of point 
mutations, insertions, and deletions: for the Consortium on von Willebrand Factor 
Mutations and Polymorphisms, and the Subcommittee on von Willebrand Factor of 
the Scientific and Standardization Committee of the International Society on 
Thrombosis and Haemostasis. Thromb Haemost. 69:177-184. 
 
Goodeve, A.C., Eikenboom, J.C.J., Ginsburg, D., Hilbert, L., Mazurier, C., Peake, 
I.R., Sadler, J.E. y Rodeghiero, F. (2000). A standard nomenclature for von 
Willebrand factor gene mutations and polymorphisms. On behalf of von Willebrand 
Factor Subcommittee of the Scientific and Standardization Committee of the 
International Society on Thrombosis and Haemostasis. Maastricht. 
 
Goodeve, A., Eikenboom, J., Castaman, G., Rodeghiero, F., Federici, A.B., Batlle, J., 
Meyer, D., Mazurier, C., Goudemand, J., Schneppenheim, R., Budde, U., Ingerslev, 
J., Habart, D., Vorlova, Z., Holmberg, L., Lethagen, S., Pasi, J., Hill, F., Soteh, M.H., 
Baronciani, L., Hallden, C., Guilliatt, A., Lester, W. y Peake, I. (2006). Phenotype and 
Genotype of a Cohort of Families Historically Diagnosed with Type 1 von Willebrand 
Disease in the European Study, Molecular and Clinical Markers for the Diagnosis and 
Management of Type 1 von Willebrand Disease (MCMDM-1VWD). Blood First 
Edition Paper, DOI 10.1182/blood-2006-05-020784. 
 
Gupta, P.K., Adamtziki, E., Budde, U., Jaiprakash, M., Kumar, H., Harbeck-Seu, A., 
Kannan, M., Oyen, F., Obsert, T., Wedekind, I., Saxena, R. y Schneppenheim, R. 
(2005). Gene conversions are a conmon cause of von Willebrand diases. Br J 
Haematol. 130:752-758. 
 
Harvey, P.J., Keightley, A.M., Lam, Y.M., Miu, Y., Cameron, C. y Lillicrap, D. (2000). 
A single nucleotide polymorphism at nucleotide -1793 in the von Willebrand factor 
(VWF) regulatory region is associated with plasma VWF Ag. Levels. Br J Haematol. 
109:349-353. 
 
Hilbert, L., Federici, A.B., Baronciani, L., Dallagiovanna, S. y Mazurier, C. (2004). A 
new candidate mutation G1629R, in a patient with type 2A von Willebrand disease: 
basic mechanisms and clinical implications. Haematologica 89:1128-1133. 
 
Hilbert, L., D’Oiron, R., Fressinaud, E., Meyer, D., Mazurier, C. the INSERM network 
on molecular abnormalities in von Willebrand disease. (2004). First identification and 
expression of a type 2N von Willebrand disease mutation (E1078K) located in exón 
25 of von Willebrand factor gene. J Thromb Haemost. 2:2271-2273. 
 
Hilbert, L., Fressinaud, E., Ribba, A.S., Meyer, D., Mazurier, C. the INSERM network 
on molecular abnormalities in von Willebrand disease. (2002). Identification of a new 
type 2M von Willebrand disease mutation also at position 1324 of von Willebrand 
factor. Thromb Haemost. 87:635-640. 
 
Hilbert, L., Jorieuxs, S., Proulle, V., Favier, R., Goudemand, J., Parquet, A., Meyer, 
D., Fressinaud, E., Mazurier, C. the INSERM Network on molecular abnormalities in 
von Willebrand disease. (2003). Two novel mutations, Q1053H and C1060R, located 
in the D3 domain of VWF, are responsible of decreasing FVIII-binding capacity. Br J 
Haematol. 120:627-632. 
 
Hommais, A., Stepaniani, A., Fressinaud, E., Mazurier, C., Meyer, D., Girma, J.P. y 
Ribba, S. (2006). Mutations C1157F and C1234W of von Willebrand factor cause 
intracellular retention with defective multimerization and secretion. J Thromb 
Haemost. 4:148. 
 
Huizing, E.G., Tsuji, S., Romijn, R.A.P., Schiphorst, M.E., Groot, P.G., Sixma, J.J. y 
Gros, P. (2002). Structures of Glycoprotein Ibα and its complex with von Willebrand 
factor A1 Domain. Science 297:1176-1179. 
 
Jorieux, S., Fressinaud, E., Goudemand, J., Gaucher, C., Meyer, D., Mazurier, C. 
the INSERM Network on molecular abnormalities in von Willebrand disease. (2000). 
Conformational changes in the D’ domain of vonWillebrand factor induced by CYS 25 
and CYS 95 mutations lead to factor VIII binding defect and multimeric impairment. 
Blood 95:3139-3145. 
 
Karp, Gerarld. (1999). “Biología Celular y Molecular”. Conceptos y experimentos. 
Editorial Mc GrawHill-Interamericana. México D.F. 
 
Keightley, A.M., Lam, Y.M., Brady, J.N., Cameron, C.L. y Lillicrap, D. (1999). 
Variation at the von Willebrand Factor (VWF) gene locus is associated with plasma 
VWF: Ag levels: Identification of three novel single nucleotide polymorphisms in the 
VWF gene promoter. Blood 93:4377-4283. 
 
Keeney, S. y Cumming, A.M. (2001). Review. The molecular biology of von 
Willebrand disease. Clin Lab Haem. 23:209-230. 
 
Kunicki, T.J., Baronciani, L., Canciani, M.T., Gianniello, F., Head, S.R., Mondala, 
T.S., Salomon, D.R. y Federici, A.B. (2006). An association of candidate gene 
haplotypes and bleeding severity I von Willebrand disease type 2A, 2B and 2M 
pedigrees. J Thromb Haemost. 4:137. 
 
Kunicki, T.J., Federici, A.B., Salomon, D.R., Koziol, J.A., Head, S.R., Mondalatony, 
S., Chrismar, J.D., Baronciani, L., Canciani, M.T. y Peake, I.R. (2004). An association 
of candidate gene haplotypes and bleeding severity