Estudio-del-efecto-de-la-casiopeina-IIIIA-sobre-el-ADN-de-celulas-de-mamiferos-tratadas-in-vitro

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES “ZARAGOZA” 
 
 
CARRERA DE BIÓLOGO 
 
 
 
“ESTUDIO DEL EFECTO DE LA CASIOPEÍNA III-ia SOBRE EL ADN 
DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS TRATADAS in vitro” 
 
 
 T E S I S 
 QUE PARA OBTENER EL TITULO DE 
 B I Ó L O G O 
 P R E S E N T A: 
 
 BEATRIZ FAJARDO MORALES 
 
 
 
 Director de tesis. 
 
 Dr. Juan José Rodríguez Mercado 
 
 
 
 
 
 México D.F., Septiembre de 2007 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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Tesis dirigida por el Dr. Juan José Rodríguez Mercado, en el laboratorio de 
Toxicología Reproductiva y Teratogénesis (L-5 PA), de la Unidad de Investigación en 
Genética y Toxicología Ambiental (UNIGEN), que se encuentra a cargo del Dr. Mario 
A. Altamirano Lozano, dentro de la Unidad Multidisciplinaria de Investigación 
Experimental, de la Facultad de Estudios Superiores Zaragoza, UNAM. 
 
Durante el desarrollo de este trabajo se contó con el apoyo PAPIIT IN236303. 
 
 
 
 
 
 
 
DEDICATORIA 
 
 
 
AL SER QUE CON SU AMOR, COMPRENSIÓN, FORTALEZA Y 
GUÍA, 
 
 
 
ME HA REGALADO LA ALEGRÍA DE LLEGAR AL FINAL DE ESTE 
CAMINO... 
 
 
 
SIN TI, ES IMPOSIBLE REALIZAR MIS SUEÑOS... 
 
 
 
INFINITAMENTE: GRACIAS. 
 
 
 
“El hombre encuentra a Dios detrás de cada puerta 
 que la ciencia logra abrir” 
Albert Einstein 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
De manera especial a los miembros del Jurado: 
 
 Dr. Benny Weiss Steider 
 
 M. en C. Rosalva Rangel Corona 
 
 Dr. Juan José Rodríguez Mercado 
 
 Dr. Mario A. Altamirano Lozano 
 
 Dra. Lucila Álvarez Barrera 
 
Gracias por su tiempo, observaciones y gentileza, ya que con ellos ayudaron a 
enriquecer este trabajo. 
DESDE EL FONDO DE MI CORAZÓN, PARA… 
 
…mis padres: Roberto y Elvira Delia; por ustedes estoy aquí, con todo lo que soy. Su 
amor, cariño, apoyo, confianza y dedicación han sido los elementos fundamentales en 
mi vida. LOS AMO. 
…mi hermano Israel, tu has sido mi mayor y mejor ejemplo de vida, tu me enseñaste 
que aún de las cenizas se puede renacer. Gracias por estar siempre a mi lado. TE 
AMO. 
…mis otras hermanas: Alina, Edith, Matty y Melina. Cada una en su momento y forma 
le han dado color a mis días. 
…Aurelio, Chio, Luis, Noemí y Tere, ustedes me enseñaron a disfrutar de los 
momentos buenos y malos en esta aventura. 
…los Serenos: Oscar, Iván, Letty, Javis, Julio, Susana, Ale, Yadira, Gil, Guadalupe… 
por compartir sus risas y lágrimas, sin esperar nada. Sin ustedes no lo hubiese 
logrado. 
…mis compañeros del laboratorio, lograron que trabajar fuera agradable y divertido. 
…Mario, sin tu ayuda, compañía, amistad y complicidad, todo sería más difícil. 
… mi familia, por los genes heredados. 
…el Dr. Juan y los Biol. Diana Florín y Raúl Cermeño, especialmente a ustedes por 
compartir conmigo su amor y conocimiento de la ciencia, por tolerarme y darme 
ánimos. 
…los que estarán siempre en mi corazón: Janet, Jesús Roberto, la beba y mi abuelo. 
 
MIL GRACIAS 
 
 
INDICE 
 
RESUMEN....................................................................................................................1 
1. MARCO TEÓRICO..................................................................................................2 
1.1. Cáncer........................................................................................................2 
1.2. Terapias......................................................................................................3 
1.3. Cobre..........................................................................................................5 
1.3.1. Importancia biológica.................................................................5 
1.3.2. Aplicaciones terapéuticas..........................................................5 
 1.3.3. Casiopeínas.................................................................................6 
1.3.4. Casiopeína III-ia.........................................................................8 
1.4. Electroforesis unicelular en gel..............................................................9 
1.4.1. Desarrollo de la electroforesis unicelular en gel.........................9 
2. JUSTIFICACIÓN...................................................................................................11 
3. HIPÓTESIS...........................................................................................................12 
4. OBJETIVOS..........................................................................................................13 
4.1. Objetivo general....................................................................................13 
4.2. Objetivos particulares............................................................................13 
5. MATERIAL Y METODOS......................................................................................14 
5.1. Obtención de la muestra.......................................................................14 
5.2. Tratamiento de leucocitos.....................................................................14 
5.3. Viabilidad de las células........................................................................14 
5.4. Electroforesis unicelular en gel (ensayo cometa)..................................15 
5.5. Reactivos...............................................................................................15 
5.6. Evaluaciones.........................................................................................16 
5.7. Análisis estadístico................................................................................16 
6. RESULTADOS.......................................................................................................18 
6.1. Estimación de la viabilidad celular.........................................................18 
6.2. Ensayo cometa......................................................................................19 
7. DISCUSIÓN..........................................................................................................33 
8. CONCLUSIONES ……………………....................................................................38 
9. PERSPECTIVAS..................................................................................................39 
10. REFERENCIAS........................................... ........................................................40 
 
 
RESUMEN 
Las principales terapias actuales contra el cáncer, se basan en la radioterapia y 
la quimioterapia. Los agentes químicos empleados en el tratamiento clínico de esta 
enfermedad, producen toxicidad elevada por lo que se han desarrollado distintos 
compuestos con centro metálico como los de cobre (CuII) nombrados Casiopeínas®, 
con el objetivo de reducir losefectos secundarios y costos. Los mecanismos por los 
cuales las Casiopeínas ejercen sus efectos aún no se completan, por eso, en el 
presente estudio se muestran datos de los efectos de diferentes concentraciones de la 
Casiopeína III-ia, sobre el ADN de leucocitos humanos. 
 Las muestras se tomaron de sangre periférica de cuatro donadores, no 
fumadores, clínicamente sanos, de 22 a 34 años de edad y se realizaron cultivos que 
fueron tratados con diferentes concentraciones de Casiopeína III-ia (1.68, 4.21, 5.61 ó 
8.42 µg/ml) durante dos o tres horas. En el segundo tiempo de tratamiento se evaluó 
la viabilidad celular, en tanto que en ambos tratamientos se determinó el daño al ADN 
con la metodología de electroforesis unicelular en gel de agarosa en condiciones 
alcalinas (EUGa). 
 Los datos muestran que este compuesto, no afecta la viabilidad de las células, 
por lo que el daño que se observa en los leucocitos es provocado por la Casiopeína III-
ia; además, el ensayo cometa muestra que la Casiopeína III-ia, incrementa el número 
de células dañadas en cada categoría de daño y la longitud de la migración del ADN. 
El comportamiento es diferente entre los cuatro donadores, por lo que el efecto de este 
compuesto se ve afectado por la variabilidad inter-individual. 
 Con los resultados obtenidos en este estudio se puede concluir que, la 
Casiopeína III-ia no modifica la viabilidad de las células, pero si es capaz de inducir 
lesiones en el ADN de leucocitos humanos tratados in vitro; la magnitud de estas 
lesiones son diferentes en cada individuo, por lo que es posible su especificidad en 
cuanto a las concentraciones que se pueden emplear en cada uno y tal vez, en cuanto 
al tipo de cáncer en el que se utilizará como terapéutico. 
 
 
 
 1
1. MARCO TEÓRICO 
1.1. CÁNCER 
 El cáncer está reconocido como un problema importante de salud pública, 
debido, a la gran incidencia de nuevos casos reportados, al impacto económico y sus 
implicaciones sociales. Por ello se le ha dado especial atención en medicina y en 
investigación básica, con el fin de tener una cultura de prevención (Rojas del Castillo, 
1992). 
El cáncer es una enfermedad producida por cambios genéticos en las células, 
por estas mutaciones, las células proliferan sin control destruyendo tejidos e incluso 
órganos normales (Ordóñez-Razo, 1991; Soto-Cruz, 1987). 
El desarrollo tumoral se describe por etapas, conocidas como: iniciación, 
promoción y progresión. La iniciación, es el evento mutagénico que da a la célula el 
potencial para crecer y proliferar sin control. Dependiendo del tipo de célula en la cual 
ocurra esto, la primera mutación puede ser expresada inmediatamente o después de 
un periodo latente de meses o años. En este último caso, la expresión de la mutación 
oncogénica puede requerir promoción, es decir, necesita recibir una señal mitogénica 
que puede darse por causas naturales, tales como la muerte de células contiguas, o 
por causas artificiales, tales como la exposición a un químico orgánico que tenga 
propiedades promotoras de tumores. Una célula que entra en un estado de 
proliferación incontrolada producirá un tumor benigno, pero no necesariamente 
produce un cáncer. La progresión al estado maligno completo presumiblemente 
requiere mutaciones adicionales. La capacidad invasiva, permite que el tumor se 
extienda dentro de un tejido normal circundante y finalmente interferir con la función 
normal. El crecimiento del tumor (invasivo o no) puede también depender de la 
formación de vasos sanguíneos en él (angiogénesis). La etapa final de esta fase es la 
metástasis, que es la propiedad de las células del tumor original para migrar a sitios 
nuevos y establecer tumores secundarios. Los sitios nuevos pueden ser tejidos 
completamente distintos de los que proviene el tumor primario. Cada tipo celular 
puede requerir de diferentes mutaciones para originar un tumor. Una característica de 
la progresión tumoral es la acumulación de alteraciones cromosómicas en las células 
cancerosas; las anormalidades en los cariotipos son comunes en los tumores 
metastásicos y la mayoría de los cambios son al azar, sin embargo hay excepciones 
importantes (McConkey, 1993; Blasiak et al., 2000; Alison, 2001; Alberts et al., 2002). 
 2
1.2. TERAPIAS 
 En las terapias actuales contra el Cáncer, la ciencia dispone de tres 
opciones principales de tratamiento. La cirugía, es el retiro quirúrgico de la masa 
tumoral. La radioterapia que es el tratamiento con agentes físicos y la quimioterapia, la 
cual consiste en dar tratamiento con agentes químicos con actividad antineoplásica. La 
radioterapia y la cirugía algunas veces no pueden ser usadas en determinados 
pacientes, ya que en algunos casos fallan en erradicar todas las células cancerosas de 
un tumor. Por lo que los pacientes son sometidos a tratamientos de quimioterapia, que 
por definición es la administración de drogas antineoplásicas que viajan a través del 
cuerpo por el sistema circulatorio (Alison, 2001). 
Muchos compuestos son usados como agentes antineoplásicos y son, 
básicamente, de dos tipos: 
a) Los de acción citostática, los cuales, intentan impedir que las células 
cancerosas se multipliquen. 
b) Los de acción citotóxica, que destruyen por muerte celular las células 
cancerosas. 
En ambos casos, las drogas evitan que las células se multipliquen afectando la 
replicación del material genético (ADN, ácido desoxirribonucléico), así como 
induciendo apoptosis (muerte celular programada) o necrosis (muerte celular 
accidentada), entre otros efectos (Rojas del Castillo, 1992; Derradji y Baatout, 2003). 
De acuerdo con la forma en la que actúan las drogas usadas comúnmente en 
quimioterapia, a continuación se describen algunas de ellas y los mecanismos 
celulares y moleculares por lo cuales ejercen sus efectos. 
Los agentes químicos que actúan sobre el ADN, afectan la integridad de las 
cadenas impidiendo la replicación normal. Estos compuestos producen daño en 
cualquier fase del ciclo celular, sin embargo, su efecto se hace patente en el paso de 
la fase G1 a la de S y en fase S. En este grupo encontramos a la mayoría de los 
antineoplásicos clásicos, como por ejemplo los agentes alquilantes (mostazas 
nitrogenadas, nitrosoureas, etilenoiminas, alquilsulfonatos y triazenos) y los complejos 
de platino (cisplatino y carboplatino) que forman enlaces estables con las bases 
púricas y pirimidínicas, los antimetabolitos o análogos de bases nitrogenadas 
 3
(metotrexato), algunos antibióticos (antraciclinas, bleomicina y mitomicina C), 
derivados de epipodofilotoxina y campotecinas, con mecanismos variados como 
cambios en el metabolismo de los ácidos nucléicos e inhibición de topoisomerasas que 
finalmente conducen a errores en la reparación e inhibición de la síntesis de ADN. 
Otra clase de drogas son los inhibidores de la mitosis, estos interfieren en el 
proceso de división celular sin afectar directamente el ADN, influyen en los 
microtúbulos que forman el uso mitótico durante la división celular por lo que son 
específicos de fase con escasa acción en células que no se dividen. En estos 
compuestos encontramos a los alcaloides de vinca que se ligan a la tubulina e impiden 
la polimerización para formar los microtúbulos del huso, y los taxoides, que promueven 
la formación de microtúbulos por lo que se forman estructuras anómalas o 
excesivamente estables; así, ambos tipos de drogas detienen la mitosis en la 
metafase, impidiendo la división. 
Algunos fármacos son usados como factores externos de estímulo o de 
inhibición de la división celular ya sea directa o indirectamente; estos son llamados 
factores extracelulares, tales como los antagonistas de estrógenos y andrógenos 
que actúan como bloqueadores de receptores e inhibidores de la aromatasa, 
progestágenos que inhiben la secreción de estrógenos a nivel hipotalámico-hipofisiario 
y contrarrestan el estímuloproliferativo de los estrógenos en las células, análogos de 
LH-RH (hormona que estimula la producción de hormonas sexuales en hombres y 
mujeres) los cuales producen un aumento en la secreción de gonadotropinas y 
reducen los niveles de FSH (hormona estimulante del folículo) y LH (hormona 
luteinizante), interferones que reaccionan con la membrana celular para producir 
acciones en el núcleo e inducen la expresión y represión de determinados genes. 
El último grupo de drogas son los potenciadores de las defensas 
inmunitarias. Estos compuestos pueden reconocer y eliminar las células cancerosas, 
por ejemplo, el factor de necrosis tumoral, interleucinas, anticuerpos monoclonales y la 
vacuna de la tuberculosis, los cuales, solos o en combinación con otros 
quimioterapéuticos son administrados como paliativos y estimulantes de linfocitos T y 
B (Molina, 2005). 
En la actualidad, los quimioterapéuticos disponibles son incapaces de destruir 
selectivamente a las células cancerosas y dañan en forma simultánea a las células 
normales. Los efectos colaterales que acompañan a estos tratamientos limitan las 
 4
dosis que pueden ser administradas. Estos efectos pueden ser anemia, diarrea, 
nausea, vómito, pérdida de cabello e incluso daño en el sistema nervioso, entre otros 
(Karp, 1998; Blabosklonny, 2003). 
Por lo anterior, en las últimas décadas la producción de antineoplásicos se ha 
enfocado en la investigación de quimioterapéuticos de menor toxicidad o específicos 
para cada tipo de cáncer. Dentro de estas nuevas drogas se encuentran las 
conformadas por metales, tales como el platino, rutenio, oro, plata, mercurio, arsénico, 
zinc, vanadio y cobre (Xin y Lippard, 2003; Nasulewicz et al., 2004; Bergamo y Sava, 
2007). 
Estudios recientes han mostrado que los metales, incluidos el hierro, cobre, 
cromo y el vanadio, producen estrés oxidante y consecuentemente provocan 
alteraciones en los distintos componentes celulares como es incrementar la 
peroxidación de lípidos y dañar el ADN (Guecheva et al., 2001). 
1.3. COBRE 
1.3.1. IMPORTANCIA BIOLÓGICA 
El cobre (Cu) es un elemento esencial dado que es un factor requerido para la 
formación de enzimas que juegan papeles importantes en pruebas metabólicas en los 
seres vivos. Interactúa con enzimas que modifican neuropéptidos, generan energía 
mediante la respiración celular, sintetizan melanina, desintoxican radicales derivados 
de oxígeno, movilizan el hierro, coagulan la sangre y enlazan el tejido conectivo; 
además los factores de transcripción dependientes del Cu son determinantes en la 
expresión genética. Los requerimentos de Cu en la dieta diaria, se obtienen de 
alimentos como el fríjol, las nueces, el hígado de res y los mariscos. Es absorbido por 
el estómago y el intestino delgado, en el suero sanguíneo es transportado 
principalmente por la ceruloplasmina y en partes pequeñas por la histidina y la 
albúmina (Nasulewicz et al., 2004; Alebic-Juretic y Frkovic, 2005; Li et al., 2005). 
1.3.2. APLICACIONES TERAPÉUTICAS 
 Algunos estudios in vivo e in vitro que se han desarrollado en los últimos 
años confirmaron la conveniencia así como la eficacia de los agentes reductores de 
Cu y los agentes quelatos de Cu en el tratamiento antiangiogénico, evitando la 
formación de vasos sanguíneos en los tumores (Nasulewicz et al., 2004). 
 5
Algunos compuestos reductores de Cu, tales como, penicillamina, 
tetratiomolibdato (TM) y captopril, entre otros, pueden ser efectivos en la terapia 
antiangiogénica y ofrecen ventajas como efectividad en el tratamiento de varios tipos 
de tumores, bajo riesgo de toxicidad, posibilidad de combinación con alguna otra 
estrategia de tratamiento antitumoral, bajo costo de la terapia, además de que puede 
ser de interés especial como estrategia cuando los procedimientos médicos son 
limitados para monitorear la progresión del tumor antes de tomar una decisión 
terapéutica (Nasulewicz et al., 2004). 
Una seria limitación del uso de compuestos reductores de Cu en el tratamiento 
antitumoral, es el largo tiempo requerido para la administración de la droga. Para 
proporcionar efectos terapéuticos, el nivel de Cu en el suero de los pacientes necesita 
ser reducido al 20% de la concentración fisiológica, el cual toma, dependiendo de la 
droga usada, de algunas semanas a seis meses (Katano et al., 2002; Nasulewicz et 
al., 2004). 
1.3.3. CASIOPEÍNAS 
La necesidad de contar con quimioterapéuticos de baja toxicidad, ha impulsado 
la investigación y el desarrollo de nuevas drogas antineoplásicas. En la Facultad de 
Química de la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), el grupo de trabajo 
de la Dra. Lena Ruiz, inició un proyecto encaminado al desarrollo de fármacos 
antineoplásicos a partir de metales de transición, con el propósito de disminuir 
toxicidad y costos (Ruiz-Azuara et al., 1992; 1996; Ruiz-Ramírez et al., 1995). De esta 
forma se diseñó la familia de compuestos llamados CASIOPEÍNAS®, cuyo centro 
metálico es el Cu; las propiedades químicas de éste, le permiten la participación en 
procesos fundamentales en las células, por eso se espera que su toxicidad sea menor 
que la de los complejos de platino (Bravo-Gómez et al., 2002; De Vizcaya-Ruiz et al., 
2003). 
En el cuadro I se muestra un listado de las familias de Casiopeínas más 
importantes. La fórmula general de las Casiopeínas, según la familia a la que 
pertenecen, puede ser: Cu(N-N)(O-N)NO3 ó Cu(N-N)(O-O)NO3 . 
El diseño de estas moléculas está basado en tres factores principales: 
 6
1. los compuestos deben tener un metal esencial para disminuir la 
toxicidad, 
2. contienen quelatos que favorecen la configuración cis- alrededor el ión 
metálico, y 
3. la mezcla de quelatos contienen diferentes niveles de hidrofobicidad. 
 
Cuadro I. Familias de Casiopeínas sintetizadas * 
Familias Ligandos 
I N-N = 4,7- difenil-1,10- fenantrolina, y O-N = aminoacidato 
II N-N = 1,10- fenantrolina ó 4,7- dimetil –1,10- fenantrolina, y O-N = 
aminoacidato 
III N-N = 2,2-bipiridina ó 1,10- fenantrolina y O-O = acetilacetonato ó 
salicilaldehidato 
IV N-N = 4,4- dimetil-2,2- bipiridina y O-N = aminoacidato 
V N-N = 5R-1,10- fenantrolina y O-N = aminoacidato. R = Me, Cl, OH, 
NO2
VI N-N = 5,6-dimetil-1,10- fenantrolina y O-N = aminoacidato 
VII N-N = 3,4,7,8- difenil-1,10- fenantrolina ó 2,9-dimetil-4,7-difenil-1,10- 
fenantrolina y O-N = aminoacidato 
* Elaborado a partir de: Gracia-Mora et al., 2001; Fuentes-Noriega et al., 2002b; 
Reyes et al., 2003. 
Las Casiopeínas fueron creadas para tener actividad antitumoral, basados en 
trabajos previos sobre el cisplatino y otras series de metales de transición. (Gracia-
Mora et al., 2001; Fuentes-Noriega et al., 2002a; Reyes et al., 2003; Tovar-Tovar et al., 
2004). Algunas Casiopeínas inhiben el crecimiento y la proliferación celular e inducen 
muerte celular, en dosis semejantes o menores a las requeridas para ejercer el mismo 
efecto con otros quimioterapéuticos como el cisplatino y la mitomicina C. Además, 
retrasan la cinética de proliferación celular y disminuyen el índice mitótico en cultivos 
de linfocitos humanos normales. También han mostrado mayor actividad 
antineoplásica que el cisplatino en estudios in vitro e in vivo en una variedad de líneas 
celulares tumorales, actividad semejante a la oxidodismutasa y baja potencia para 
inducir inestabilidad genómica por medio de recombinación intracromosomal. (Gómez-
 7
Ruiz y De la Garza, 1994; Ruiz-Azuara et al., 1996; Fuentes-Noriega et al., 2002b; 
Rodríguez-Aguilera et al., 2002; De Vizcaya-Ruiz et al., 2003; Marín-Hernández et al., 
2003). 
1.3.4. CASIOPEÍNA III-ia 
En la actualidad se han sintetizado más de 100 de estas Casiopeínas. Dentro 
de ellas, las familias I, II y III son las que presentan mayor actividad anticancerígena 
en líneas celulares neoplásicas humanas, tales como HeLa, Calo, InBl y A 431 (Reyes 
et al., 2003; De Vizcaya-Ruiz etal., 2003; Bocanegra-Astivia, 2005). 
Dentro de la familia III se encuentra la Casiopeína III-ia, la cual, en células de 
leucemia L1210, produce muerte celular por apoptósis, induce una débil acción 
recombinogénica y tiene la habilidad para degradar ADN. También ha mostrado un 
potente efecto inhibitorio en las funciones mitocondriales; en experimentos con 
mitocondrias aisladas y células intactas de hematoma AS-30D. La Casiopeína III-ia 
presenta efectos cardiotóxicos ligeros en comparación con la adriamicina 
(antineoplásico que evita el crecimiento de las células cancerosas por 
entrecruzamiento con el ADN), bajo condiciones fisiológicas cerradas en corazón 
aislado y prefundido con ácidos grasos como sustrato oxidable. (Fuentes-Noriega et 
al., 2002b; Marín-Hernández et al., 2003; Hernández-Esquivel et al., 2006). 
 La fórmula de la Casiopeína III-ia es 4,4-dimetil 2,2-bipiridina acetilacetonato 
CuII Nitrato y su estructura química se presenta en la Figura 1. 
 
Figura 1. Estructura química de la Casiopeína III-ia 
 8
• 
¡,>--< 
N" / C u ( 11) /" O O 
~ 
El diseño químico de las Casiopeínas pretende que estas drogas sean menos 
tóxicas que los quimioterapéuticos clínicos usados actualmente; sin embargo, es 
necesario conocer de qué manera actúan. Por lo anterior en el presente trabajo se 
decidió estudiar la capacidad que tiene la Casiopeína III-ia de producir daño sobre el 
ADN, para lo cual se utilizó el modelo de tratamientos in vitro de células de sangre 
periférica humana. 
1.4. ELECTROFORESIS UNICELULAR EN GEL 
 La electroforesis unicelular en gel o “ensayo cometa” es uno de los métodos 
para evaluar daño y reparación en el ADN. Esta prueba es usada en diferentes 
ámbitos del quehacer científico como en genotoxicidad, biomonitoreo humano y 
epidemiología molecular. El ensayo es atractivo porque muestra ciertas ventajas en 
comparación con otras técnicas como las citogenéticas para determinar el daño al 
material genético. Entre las ventajas se encuentran su simplicidad, sensibilidad, 
versatilidad, rapidez, economía y su aplicación en células quiescentes o en 
proliferación, además, se puede manipular sutilmente para medir los rompimientos del 
ADN (Hartmann y Speit, 1999; Kassie et al., 2000; Tice et al., 2000; Collins, 2004). 
1.4.1. DESARROLLO DE LA ELECTROFORESIS UNICELULAR EN GEL 
 El primer intento para cuantificar directamente rompimientos de cadena de 
ADN fue hecho por Rydberg y Johanson, lisando células embebidas en agarosa en 
laminillas bajo ligeras condiciones alcalinas. La tinción de los nucleoides con naranja 
de acridina mostraron fluorescencia de color rojo (indicador de rompimientos de 
cadenas sencillas de ADN) o verde (indicador de rompimientos de cadenas dobles) en 
las células con daño. Después, una técnica electroforética conocida como ensayo 
cometa fue introducido por Östling y Johanson. En esta técnica, las células son 
embebidas en un gel de agarosa sobre laminillas y lisadas con detergentes y altas 
concentraciones de sal, la electroforesis del ADN liberado se lleva a cabo bajo 
condiciones neutras y se tiñen con naranja de acridina. La corriente eléctrica atrae la 
carga del ADN del núcleo en dirección al ánodo y el resultado es una imagen 
característica que se ve como un cometa, con una cabeza y una cola o tallo. Como 
resultado de la fragmentación del ADN por acción de diferentes genotoxinas, se 
observa más o menos fluorescencia en la cola del cometa en relación a la cabeza, 
dependiendo del daño que ocasionen estos compuestos. Los fragmentos de ADN que 
contienen menos bases migran a mayor distancia de la cabeza que los fragmentos 
 9
grandes y causan la formación de colas más largas. Como las condiciones usadas 
para la lisis son a pH neutro, solamente es posible la detección de rompimientos de 
cadena doble, ya que a este pH, el apareamiento de las bases del ADN no se 
disuelve, las discontinuidades en los rompimientos de cadena sencilla no son 
detectables (Revisado en: Collins, 2004; Rojas et al., 1999). 
 El ensayo fue modificado después por Singh y colaboradores en 1988, 
introduciendo una técnica que involucra la electroforesis bajo condiciones alcalinas 
(pH > 13), el cual permite la detección, no solamente de rompimientos de cadena 
sencilla, sino también sitios sensibles al álcali, entrecruzamiento de ADN y sitios de 
reparación por escisión incompleta. Actualmente, éste es el método más usado con 
ligeras modificaciones en diferentes pasos. Los cometas son observados en un 
microscopio de fluorescencia después de teñirlos con un colorante fluorescente 
adecuado para ADN. La intensidad relativa de la fluorescencia en la cola está en 
función de los rompimientos del ADN y pueden ser evaluados visualmente o usando 
un analizador de imagen. Esto proporciona una variedad de parámetros para cada 
cometa, tales como la longitud total de la imagen, la fluorescencia relativa de la cola 
(porcentaje de ADN en la cola) y el momento de la cola (producto de la longitud de la 
cola y el porcentaje del ADN en la misma) (Kassie et al., 2000; Herrera-Portugal et al., 
2005). 
 
 10
2. JUSTIFICACIÓN 
 El cáncer está reconocido como un problema importante de salud pública, 
debido, a la gran cantidad de casos reportados, a su impacto económico y sus 
implicaciones sociales. Por ello se le ha dado especial atención médica, de 
investigación y prevención. 
 La mayoría de los quimioterapéuticos actuales producen reacciones 
secundarias de gran impacto para el paciente; por lo que, constantemente se 
desarrollan nuevos fármacos antineoplásicos. El diseño y elaboración de las 
Casiopeínas muestran una nueva opción de tratamiento, por ello se requiere conocer 
totalmente sus mecanismos de acción para su posible aplicación en humanos. 
 Los tratamientos in vitro de sangre completa de humano es ampliamente 
utilizado como sistema de prueba para valorar los efectos sobre la viabilidad y 
proliferación celular, así como la actividad genotóxica de agentes químicos, físicos y 
biológicos en células quiescentes o en proliferación. Por lo que en este trabajo se 
evaluó el daño al ADN inducido por Casiopeína III-ia en leucocitos humanos de sangre 
periférica completa, mediante la aplicación del ensayo cometa, con la finalidad de 
contribuir al conocimiento de la manera como actúan estos fármacos y determinar la 
concentración más baja en la cual evidencia sus efectos son efectivas. 
 
 11
3. HIPÓTESIS 
Uno de los mecanismo por lo cuales los antineoplásicos actúan es provocando 
daño en el ADN. Pruebas bioquímicas demuestran que las Casiopeínas interaccionan 
con los ácidos nucleicos, por lo que, si estos efectos se producen a nivel celular, 
entonces la Casiopeína III-ia será capaz de inducir rompimientos en el ADN de células 
tratadas in vitro. 
 
 
 12
4. OBJETIVOS 
4.1. OBJETIVO GENERAL 
 Evaluar el daño al ADN en leucocitos humanos de sangre periférica que pueda 
ser inducido por la Casiopeína III-ia, empleando tratamientos in vitro y la metodología 
de electroforesis unicelular en gel. 
4.2. OBJETIVOS PARTICULARES 
 Evaluar la viabilidad celular de los leucocitos humanos expuestos a diferentes 
concentraciones de Casiopeína III-ia. 
 Estimar el daño al ADN de los leucocitos humanos expuestos a diferentes 
concentraciones y durante diferentes tiempos de tratamiento con Casiopeína 
III-ia, mediante electroforesis unicelular en gel. 
 Determinar la relación dosis-efecto y tiempo-dependiente en los leucocitos 
humanos expuestos a Casiopeína III-ia. 
 Establecer la concentración más baja a la cual la Casiopeína III-ia evidencia 
sus efectos. 
 Identificar las posibles diferencias en las respuestas entre individuos. 
 
 
 13
5. MATERIAL Y MÉTODOS 
5.1. OBTENCIÓN DE LAS MUESTRA 
 Se obtuvo sangre periférica de cuatro donadores sanos no fumadores 
(Donador A, mujer de 22 años; Donador B, hombre de 32 años;Donador C, hombre de 
23 años y Donador D, mujer de 22 años). Las muestras se tomaron con una jeringa 
heparinizada para evitar la coagulación de la sangre. 
5.2. TRATAMIENTO DE LEUCOCITOS 
Se colocaron 20 µl de sangre en un tubo eppendorf con 1 ml de medio de 
cultivo RPMI-1640, al cual previamente se le había adicionado la Casiopeína III-ia en 
concentraciones de 1.68, 4.21, 5.61 ó 8.42 µg/ml. Los tratamientos se determinaron de 
acuerdo a la concentración inhibitoria media para HeLa (CI50 = 16.84 µg/ml) (Gracia-
Mora et al., 2001) que equivalen a 1/16, 1/8, 1/4 y 1/2 de la concentración. Las células 
se incubaron a 37ºC por 2 ó 3 horas, después se colectaron por centrifugación (4 
minutos a 3000 rpm en una microcentrífuga Eppendorf Centrifuge 5415 C) y se 
hicieron las preparaciones para el ensayo cometa. En todos los casos se contó con un 
testigo negativo y uno positivo. Para el testigo positivo, se dieron tratamientos de 30 
minutos a 4ºC con 200 µM de peróxido de hidrógeno (H2O2). En todos los casos por 
donador se hizo un cultivo con su replica por cada tratamiento. 
5.3. VIABILIDAD DE LAS CÉLULAS 
En todos los tratamientos se evaluó la viabilidad utilizando la técnica descrita 
por Strauss y colaboradores (1991), en la cual se utilizan dos colorantes 
fluorocromados. Se preparó una solución de bromuro de etidio (Br-Et), para lo cual se 
disolvieron 50 mg de éste en 1 ml de etanol absoluto y se aforaron a 50 ml con 
solución salina (PBS), finalmente se tomaron 50 µl y se diluyeron en 2 ml de solución 
salina, para obtener una concentración final de 0.025 µg/µl. El segundo colorante, el 5-
6 diacetato de carboxifluoresceína (CFDA), se preparó disolviendo 3 mg en 1 ml de 
acetona y después se adicionaron 84 µl en 2 ml de solución salina para obtener una 
concentración de 0.125 µg/µl. Ambos colorantes se protegieron de la luz y se 
almacenaron en la oscuridad. En el momento de las determinaciones se preparó una 
solución de trabajo mezclando el Br-Et y el CFDA en proporción 1:1. 
 14
Después, se colocaron 40 µl de la suspensión celular en un tubo eppendorf y 
se adicionaron 10 µl de la mezcla de colorantes, se incubaron de 3-5 minutos a 37 °C, 
posteriormente se agregó 1 ml de medio de cultivo, se resuspendió y centrifugó 
durante 4 min a 3000 rpm en una microcentrífuga (Eppendorf Centrifuge 5415 C) para 
remover el exceso de colorante, este paso se repitió tres veces más con medio de 
cultivo y finalmente la muestra se observó al microscopio de fluorescencia. 
5.4. ELECTROFORESIS UNICELULAR EN GEL (ENSAYO COMETA) 
En láminas totalmente esmeriladas se colocaron, en una capa homogénea 110 
µl de agarosa regular al 0.5 %. Seguida de una segunda capa de 10 µl de la 
suspensión celular en 75 µl de agarosa de bajo punto de fusión a 37 ºC al 0.5 %, y una 
tercer capa de 75 µl de agarosa de bajo punto de fusión. Esta concentración del gel 
permite que se desplacen secuencias de ADN de 700 hasta 45 000 bases (Brown, 
1991). Las láminas se mantuvieron en frío hasta que solidificara cada capa, colocando 
un cubreobjetos para homogenizar cada una. 
Posteriormente, las láminas se colocaron durante 1 hora en una solución de 
lisis (NaCl 2.5 M, Na2-EDTA 100 mM, Tris 10 mM, a pH 10 a la cual se le adicionó 
sarcocinato de sodio al 1%, tritón X-100 al 1% y dimetil sulfoxido al 10%) preparada en 
el momento a 4ºC. Esta solución alta en sales y detergentes permite liberar el ADN de 
las células rompiendo las interacciones de las membranas citoplasmática y nuclear. 
Después, las láminas se colocaron en una caja de electroforesis horizontal, donde el 
ADN se dejó desenrollar por 20 minutos en una solución amortiguadora (NaOH 300 
mM y Na2-EDTA 1 mM a pH > 13), al terminar este tiempo se conectó la fuente y la 
electrofóresis se llevó a cabo por 20 minutos a 25 volts y 300 miliampers. Todos los 
pasos anteriores se efectuaron en la oscuridad o con luz amarilla. A continuación, las 
preparaciones se colocaron en una solución de Tris (0.4 M a pH 7.5) para neutralizar 
las condiciones alcalinas, realizando tres cambios de 5 minutos cada uno. Por último, 
las láminas se deshidrataron en etanol frío al 100% en dos cambios de 5 minutos cada 
uno y se dejaron secar al aire (Tice et al., 1996; Angelis et al, 1999; Tice et al., 2000). 
5.5. REACTIVOS 
Todos los reactivos usados fueron de Sigma, St. Louis MO, USA; excepto la 
heparina (Pisa Farmaceútica Mexicana, SA de CV); el cloruro de sodio (NaCl), 
peróxido de hidrógeno (H2O2) y el etanol absoluto (CH3-CH2-OH) (JT Baker de México, 
 15
S.A. de C.V.) y Casiopeína III-ia que fue proporcionada por la Facultad de Química de 
la UNAM. 
5.6. EVALUACIONES 
Para la viabilidad de las células se contaron 200 células, 100 células por 
tratamiento de cada donador más su duplicado, en un microscopio de fluorescencia 
Nikon (Optiphot-2, Japón) a 400 aumentos con excitación de luz de 515-560 nm. 
Para el ensayo cometa las láminas se codificaron y se tiñeron con 75 µl de Br-
Et con una concentración de 20 µg/ml. La longitud de la migración del ADN (en µm) se 
midió a 400 aumentos con un ocular graduado y un filtro de excitación de luz de 450-
490 nm, la evaluación se realizó en 50 células por preparación, 200 por tratamiento de 
cada donador. El daño se clasificó en cinco categorías, las cuales son dependientes 
del valor promedio del núcleo del cometa, donde, núcleos intactos se consideraron 
núcleos “sin daño”, núcleos con cola de hasta un núcleo de largo “daño bajo”, colas 
con hasta dos núcleos de largo “daño medio”, colas con más de dos núcleos de largo 
“daño alto” y donde el ADN migró completamente de la región del núcleo se considero 
como “daño severo” (figura 2) (Rodríguez-Mercado, 2001; Rodríguez-Mercado et al., 
2003). 
5.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO 
 Los resultados de la viabilidad celular fueron analizados con una prueba de ji 
cuadrada y los de migración en la electroforesis unicelular en gel se analizaron con la 
prueba no paramétrica de rangos para muestras independientes U de Mann-Whitney, 
comparando siempre el grupo testigo contra los grupos tratados, para esta prueba se 
utilizó el programa SPSS versión 13 (Freund, 1992; Milton, 2001). 
 
 16
 
 Núcleo sin daño 
 Daño severo 
 Daño alto 
 Daño medio 
 Daño bajo 
Figura 2. Clasificación del daño al ADN, de acuerdo a la longitud de la cola del 
cometa. 
 
 17
6. RESULTADOS 
 6.1. ESTIMACIÓN DE LA VIABILIDAD CELULAR 
Para realizar la evaluación de la viabilidad se registraron las células vivas, que 
tiñen de color verde y las células con daño en la membrana celular que tiñen su núcleo 
de color rojo. 
Se evaluó la viabilidad de las células después 2 o 3 horas de exposición con la 
Casiopeína III-ia; sin embargo, solo se muestran los valores de 3 horas de los cuatro 
donadores, debido a que los datos se comportan de manera similar y no presentan 
diferencias estadísticas entre los tiempos, ni entre los donadores. Los resultados se 
presentan en el cuadro II. 
En los tratamientos con peróxido de hidrógeno (200 µM de H2O2), tomado 
como testigo positivo, la viabilidad se redujo en 18% para el donador A, 12% para 
donador B, 16% para el donador C y 14.5% para el donador D. 
 
 Cuadro II. Viabilidad celular de leucocitos humanos tratados in vitro durante 
tres horas con Casiopeína III-ia. 
Concentraciones en µg/ml * 
 
Donador 
1.68 
 
4.21 
 
5.61 
 
8.42 
 
A 95.4 99.4 93.4 96.4 
B 100.0 98.3 99.4 99.0 
C 97.9 95.9 96.9 95.9 
D 96.8 98.4 99.4 95.8 
* Valores dados en porcentaje con respecto al 100% de su testigo. (200 células 
analizadas por tratamiento) 
 
 18
6.2. ENSAYO COMETA 
Los resultados del ensayo cometa se describen en los cuadros III a VI y de las 
figuras 3 a la 10. En los cuadros se muestran los porcentajes de las células sin daño y 
de las células con daño y la media de la longitud de la migración del ADN. En tanto 
que en las figuras3, 4, 5 y 6 se observa la distribución del daño (expresado como la 
longitud de la migración del ADN), por cada donador y por concentración durante los 
dos tiempos de tratamiento; y en las figuras 7, 8, 9 y 10 se observa la cantidad de 
células en cada categoría de daño para cada donador, para cada concentración y para 
cada uno de los tiempos de tratamiento. 
La longitud de la migración aumenta en todas las concentraciones empleadas 
durante los dos tiempos de tratamiento en los cuatro donadores y todos son 
estadísticamente diferentes con respecto a su testigo, excepto en el donador D a las 2 
horas de tratamiento en la concentración de 8.42 µg/ml (cuadro III a IV). Lo cual se ve 
reflejado en la cantidad de células en cada categoría de daño (figura 7 a 10). Es 
importante recordar que los valores de la longitud de la migración del ADN, no incluyen 
las células con daño severo, ya que en éstas, el ADN se desplaza totalmente del 
núcleo (figuras 3 a 6). 
En particular, para el donador A en los dos tiempos de tratamiento, los valores 
de la media de la longitud de la migración son más altos en las concentraciones más 
bajas. El donador B, a las 2 horas de tratamiento, tiene un comportamiento similar al 
descrito para el donador A, pero a las 3 horas de tratamiento el comportamiento se 
invierte, se incrementa conforme aumenta la concentración (cuadros III y IV). 
En el donador C, en los dos tiempos de tratamiento, la migración es mayor en 
las concentraciones más altas; mientras que para el donador D, se observa un 
comportamiento similar al del donador A (cuadros V y VI). 
En las figuras 3 a 6, se muestra la distribución de la longitud de la migración de 
los cuatros donadores, durante los dos tiempos de tratamiento. Los datos de las 
células tratadas con peróxido de hidrógeno no se graficaron, ya que presentan daño 
severo y se realizaron con la finalidad de comprobar que la electroforesis se llevó a 
cabo correctamente, ya que este compuesto causa fragmentación del ADN por estrés 
oxidante (Singh et al., 1988). 
 19
En los cuatro donadores, existe mayor número de células en la categoría de 
daño bajo y las cantidades disminuyen hacia el daño severo (figuras 7 a 10), excepto 
en los testigos positivos (H2O2), en los cuales la mayoría de las células presentan daño 
severo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 20
 
 
Cuadro III. Evaluación de daño al ADN inducido en leucocitos humanos de sangre 
periférica del Donador A tratados durante 2 y 3 horas con Casiopeína III-ia. 
 
% de células ** 
Casiopeína III-ia 
en µg/ml 
Sin daño Con daño 
Media de la migración del 
ADN ± EE 
2 horas 
0 74.5 25.5 12.98 ± 1.28 
1.68 21 79 40.32 ± 1.66 a
4.21 24.5 75.5 38.52 ± 1.76 a
5.61 35 65 33.41 ± 1.83 a
8.42 36 64 32.73 ± 1.90 a
H2O2 * 3 97 66.25 ± 3.47 a
3 horas 
0 66.5 33.5 19.17 ± 1.87 
1.68 15.5 84.5 44.43 ± 2.04 a
4.21 20.5 79.5 39.16 ± 1.79 a
5.61 35.5 64.5 31.65 ± 1.69 a
8.42 37 63 30.63 ± 1.76 a
H2O2 * 0.5 99.5 90.71 ± 3.80 a
EE, error estándar 
* Testigo positivo tratado con peroxido de hidrógeno (H2O2, 200 µM) 
a P < 0.001 comparado con su testigo 
** 200 células analizadas por tratamiento 
 
 21
 
 
Cuadro IV. Evaluación de daño al ADN inducido en leucocitos humanos de sangre 
periférica del Donador B tratados durante 2 y 3 horas con Casiopeína III-ia. 
 
% de células ** 
Casiopeína III-ia 
en µg/ml) 
Sin daño Con daño 
Media de la migración del 
ADN ± EE 
2 horas 
0 78.5 21.5 11.04 ± 2.15 
1.68 23.5 76.5 39.10 ± 2.27 b
4.21 37 63 28.81 ± 1.87 b
5.61 33 67 31.65 ± 1.86 b
8.42 40.5 59.5 26.00 ± 1.80 b
H2O2 * 5 95 66.25 ± 3.47 b
3 horas 
0 73.5 26.5 13.50 ± 1.74 
1.68 65.5 34.5 14.16 ± 1.24 a, c
4.21 42.5 57.5 24.49 ± 1.69 b
5.61 46.5 53.5 26.30 ± 1.95 b
8.42 33.5 66.5 34.47 ± 2.21 b
H2O2 * 2.5 97.5 73.63 ± 3.75 b
EE, error estándar 
* Testigo positivo tratado con peroxido de hidrógeno (H2O2, 200 µM) 
a P < 0.05 y b P < 0.001 comparado con su testigo 
c P < 0.05 comparado con la misma concentración en 2 horas de tratamiento 
** 200 células analizadas por tratamiento 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 22
 
Cuadro V. Evaluación de daño al ADN inducido en leucocitos humanos de sangre 
periférica del Donador C tratados durante 2 y 3 horas con Casiopeína III-ia. 
 
% de células ** 
Casiopeína III-ia 
en µg/ml 
Sin daño Con daño 
Media de la migración del 
ADN ± EE 
2 horas 
0 85 15 6.67 ± 1.24 
1.68 75 25 11.64 ± 1.47 b
4.21 78 22 10.57 ± 1.50 a
5.61 65 35 17.18 ± 1.79 c
8.42 52 48 23.09 ± 2.16 c
H2O2 * 2.5 97.5 67.16 ± 4.00 c
3 horas 
0 80.5 19.5 8.32 ± 1.12 
1.68 70 30 16.03 ± 1.99 a
4.21 59.5 40.5 18.45 ± 1.75 c
5.61 64 36 16.92 ± 1.83 c
8.42 52 48 21.77 ± 1.94 c
H2O2 * 1.5 98.5 72.91 ± 4.15 c
EE, error estándar 
* Testigo positivo tratado con peroxido de hidrógeno (H2O2, 200 µM) 
a P < 0.01, b P < 0.002 y c P < 0.001comparado con su testigo 
** 200 células analizadas por tratamiento 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 23
 
 
Cuadro VI. Evaluación de daño al ADN inducido en leucocitos humanos de sangre 
periférica del Donador D tratados durante 2 y 3 horas con Casiopeína III-ia. 
 
% de células ** 
Casiopeína III-ia 
en µg/ml 
Sin daño Con daño 
Media de la migración del 
ADN ± EE 
2 horas 
0 78.5 21.5 11.75 ± 1.64 
1.68 62.5 37.5 19.67 ± 2.12 c
4.21 65 35 17.85 ± 1.96 b
5.61 65.5 34.5 18.14 ± 1.96 a
8.42 70.5 29.5 14.60 ± 1.78 
H2O2 * 5 95 77.51 ± 5.70 c
3 horas 
0 79.5 20.5 12.18 ± 1.81 
1.68 46.5 53.5 32.55 ± 2.79 c
4.21 48.5 51.5 30.46 ± 2.57 c
5.61 57 43 23.43 ± 2.15 c
8.42 55.5 44.5 22.69 ± 2.55 c
H2O2 * 0.5 99.5 89.26 ± 5.74 c
EE, error estándar 
* Testigo positivo tratado con peroxido de hidrógeno (H2O2, 200 µM) 
a P < 0.01, b P < 0.005 y c P < 0.001comparado con su testigo 
** 200 células analizadas por tratamiento 
 
 
 
 
 
 
 24
0
50
10 T
1.68
4.21
5.61
8.42
0
50
100
150
N
úm
er
o 
de
 c
él
ul
as
Migración
 en µm
Tratamientos 
en µg/ml
(A)
a
a
a
a
 
0
50
100
150 T
1.68
4.21
5.61
8.42
0
50
100
150
N
úm
er
o 
de
 c
él
ul
as
Migración
 en µm
Tratamientos 
en µg/ml
(B)
a
a
a
a
 
Figura 3. Distribución de la longitud de la migración del ADN de leucocitos humanos 
del Donador A tratados con Casiopeína III-ia durante (A) 2 horas y (B) 3 horas (T, 
representa los cultivo sin tratamiento). a P < 0.001 comparado con su testigo. 
 
 25
0
50
100
150
T
1.68
4.21
5.61
8.42
0
50
100
150
N
úm
er
o 
de
 c
él
ul
as
Migración 
en µm
Tratamientos 
en µg/ml
(A)
b
b b
b
0
50
100
150
200
T
1.68
4.21
5.61
8.42
0
50
100
150
N
úm
er
o 
de
 c
él
ul
as
Migración 
en µm
Tratamientos 
en g/ml
(B)
a,c
b
bb
Figura 4. Distribución de la longitud de la migración del ADN de leucocitos humanos 
del Donador B tratados con Casiopeína III-ia durante (A) 2 horas y (B) 3 horas (T, 
representa los cultivo sin tratamiento). a P < 0.05 y b P < 0.001 comparado con su 
testigo. c P < 0.05 comparado con la misma concentración en 2 horas de tratamiento. 
 26
0
50
100 T
1.68
4.21
5.61
8.42
0
50
100
150
200
N
úm
er
o 
de
 c
él
ul
as
Migración 
en µm
Tratamientos 
en µg/ml
(A)
b
a c c
 
0
50
10
15 T
1.68
4.21
5.61
8.42
0
50
100
150
N
úm
er
o 
de
 c
él
ul
as
Migración
 en µm
Tratamientos
 en µg/ml
(B)
a c
c c
 
Figura 5. Distribución de la longitud de la migración del ADN de leucocitos humanos 
del Donador C tratados con Casiopeína III-ia durante (A) 2 horas y (B) 3 horas (T, 
representa los cultivo sin tratamiento). a P < 0.01, b P < 0.002 y c P < 0.001comparado 
con su testigo. 
 
 27
0
50
100
150 T
1.68
4.21
5.61
8.42
0
50
100
150
N
úm
er
o 
de
 c
él
ul
as
Migración 
en µm
Tratamientos 
en µg/ml
(A)
c
b
a
 
0
50
100
150
200
T
1.68
4.21
5.61
8.42
0
50
100
150
N
úm
er
ode
 c
él
ul
as
Migración
 en µm
Tratamientos
 en µg/ml
(B)
c
c c
c
 
 
Figura 6. Distribución de la longitud de la migración del ADN de leucocitos humanos 
del Donador D tratados con Casiopeína III-ia durante (A) 2 horas y (B) 3 horas (T, 
representa los cultivo sin tratamiento). a P < 0.01, b P < 0.005 y c P < 0.001comparado 
con su testigo. 
 28
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
 d
e 
cé
lu
la
s
Testigo 1.68 4.21 5.61 8.42
Concentración de Casiopeína III-ia en µg/ml
(A)
sin daño
bajo
medio
alto
severo
 
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
 d
e 
cé
lu
la
s
Testigo 1.68 4.21 5.61 8.42
Concentración de Casiopeína III-ia en µg/ml
(B)
sin daño
bajo
medio
alto
severo
 
Figura 7. Distribución del porcentaje de células en cada categoría de daño del 
Donador A tratados con Casiopeína III-ia durante (A) 2 horas y (B) 3 horas. 
 29
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%
 d
e 
cé
lu
la
s
Testigo 1.68 4.21 5.61 8.42
Concentración de Casiopeína III-ia en µg/ml
(A)
sin daño
bajo
medio
alto
severo
0
10
20
30
40
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%
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cé
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Testigo 1.68 4.21 5.61 8.42
Concentración de Casiopeína III-ia en µg/ml
(B)
sin daño
bajo
medio
alto
severo
 
Figura 8. Distribución del porcentaje de células en cada categoría de daño del donador 
B tratados con Casiopeína III-ia durante (A) 2 horas y (B) 3 horas. 
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Testigo 1.68 4.21 5.61 8.42
Concentración de Casiopeína III-ia en µg/ml
(A)
sin daño
bajo
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alto
severo
 
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s
Testigo 1.68 4.21 5.61 8.42
Concentración de Casiopeína III-ia en µg/ml
(B)
sin daño
bajo
medio
alto
severo
Figura 9. Distribución del porcentaje de células en cada categoría de daño del donador 
C tratados con Casiopeína III-ia durante (A) 2 horas y (B) 3 horas. 
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s
Testigo 1.68 4.21 5.61 8.42
Concentración de Casiopeína III-ia en µg/ml
(A)
sin daño
bajo
medio
alto
severo
 
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%
 d
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cé
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s
Testigo 1.68 4.21 5.61 8.42
Concentración de Casiopeína III-ia en µg/ml
(B)
sin daño
bajo
medio
alto
severo
 
Figura 10. Distribución del porcentaje de células en cada categoría de daño del 
donador D tratados con Casiopeína III-ia durante (A) 2 horas y (B) 3 horas. 
 
 32
7. DISCUSIÓN 
Las Casiopeínas son complejos de coordinación similares a los complejos de 
Pt, con la diferencia de que el centro metálico es de Cu. En estudios toxicológicos, las 
Casiopeínas han mostrado propiedades anticancerígenas y su toxicidad en modelos in 
vitro e in vivo es menor en relación a otros antineoplásicos utilizados actualmente en el 
tratamiento contra el cáncer (García et al., 1991; Gracia-Mora et al., 2001; Fuentes-
Noriega et al., 2002b; Rodríguez-Enríquez et al., 2006; Rivero-Müller et al., 2007). 
 Uno de los efectos que se deben conocer de los nuevos fármacos que se 
utilizarán contra una determinada enfermedad es la toxicidad celular, incluyendo 
alteraciones en la división celular y daño sobre el ADN, el cual puede desencadenar 
procesos como apoptosis o necrosis. En este trabajo únicamente se evaluaron 
aspectos de citotoxicidad, a través de la prueba de viabilidad la cual consiste en la 
combinación de colorantes fluorocromados, que permiten distinguir las células vivas, 
que metabolizan el CFDA a un compuesto fluorescente, de las que tienen huecos en la 
membrana, que finalmente conduce a cambios osmóticos y la muerte de la célula 
(Strauss et al., 1991; Hartmann y Speit, 1997). 
En los cuatro donadores y en las cuatro concentraciones empleadas, los 
valores obtenidos son mayores al 93% (cuadro II); al respecto, algunos autores 
sugieren que cuando va a ser empleada la electroforesis unicelular en gel, la viabilidad 
celular no debe estar por debajo del 70% en los grupos tratados con algún agente o 
droga; lo anterior se realiza como medida para evitar reportar falsos positivos, es decir, 
que la interpretación de los resultados del daño no sean confundidos con un efecto 
citotóxico (Hartmann et al., 2001). Los resultados obtenidos de este estudio, no 
mostraron diferencias estadísticas en la prueba de viabilidad entre el grupo testigo y 
los tratados con Casiopeína III-ia después de 3 horas de exposición. Estos datos, 
posiblemente se deben a que las membranas celulares, no son alteradas en tiempos 
cortos de exposición con esta Casiopeína, sin embargo, se conoce que este 
compuesto tiene efectos sobre la función mitocondrial (Marín-Hernández et al., 2003). 
La manera en que las Casiopeínas entran a las células no se conoce, su 
estructura química se diseñó con la intención de permitirle el libre paso a través de las 
membranas celulares. Los agentes quimioterapéuticos como los alcaloides, 
antibióticos, citocalacina D y los agentes alquilantes (mitomicina C y cisplatino), 
 33
atraviesan las membranas biológicas por dos vías, transporte pasivo y transporte 
activo; en el primero los compuestos entran por medio de canales iónicos y no se 
requiere de energía, mientras, en el segundo se requiere de energía y los compuestos 
pasan por canales iónicos y/o proteínas trasportadoras que responden a estímulos 
específicos y se abren por lapsos cortos de tiempo (Szchowicz-Petelska et al., 2001; 
Rodríguez-Mercado, 2006). 
Otra manera en que algunas drogas entran a las células, es por medio de los 
liposomas, los cuales tienen una importante actividad en la penetración de células 
tumorales (Szchowicz-Petelska et al., 2001; Alberts et al., 2002), y esta última, podría 
ser una posible ruta por medio de la cual, la Casiopeína III-ia cruza la membrana 
celular, debido a que la Casiopeína III-ia es soluble en agua. 
Cuando los sistemas biológicos tienen contacto con un agente químico externo 
(xenobiótico) o bien, cuando un cultivo celular es expuesto a dicho agente, este último 
puede sufrir biotransformaciones por diferentes enzimas y cambiar la actividad 
bioquímica de la sustancia dejando productos inactivos o formando metabolitos activos 
con propiedades toxicológicas. 
Los efectos tóxicos pueden medirse por diferentes marcadores que detectan 
cambios a nivel bioquímico, celular, de organismo e incluso poblacional, y a su vez 
pueden detectar respuestas diferenciales entre poblaciones o entre células del mismo 
tipo en individuos distintos (Timbrell, 1993). 
Existen diferentes tipos de marcadores biológicos, los cuales detectan el efecto 
producido por los xenobióticos desde, poblaciones celulares hasta individuos o 
poblaciones de personas que pueden ser más vulnerables, o bien, que muestran una 
respuesta diferente entre poblaciones o entre células del mismo tipo en individuos 
diferentes (Talmage et al., 1992; Rojas et al., 1996; Rodríguez-Mercado et al., 2003). 
Los marcadores biológicos son tres, de exposición, de efecto y de 
susceptibilidad. En los primeros, se requiere saber las concentraciones del xenobiótico 
o sus metabolitos en células, tejidos, fluidos corporales o excretas, y dan información 
acerca de los cambios citogenéticas, entre otros parámetros, en los individuos o en los 
cultivos celulares expuestos (Talmage et al., 1992; Rodríguez-Mercado, 2001). 
 34
Los marcadores biológicos de efecto son alteraciones a nivel bioquímico, 
celular o fisiológico que pueden ser asociadas a una enfermedad o deficiencia de 
salud establecida. Los marcadores de susceptibilidad, están relacionados con la 
respuesta que un individuo presenta después de la exposición a un xenobiótico, este 
marcador evidencia diferencias interindividuales e intraindividuales (Talmage et al., 
1992; Rodríguez-Mercado, 2001). 
La prueba de electroforesis unicelular en gel, es un marcador biológico de 
efecto en estudios in vitro, sin embargo, tambiénse considera un ensayo muy sensible 
para detectar las diferencias interindividuales, como el daño y la reparación del ADN 
(Rojas et al., 1996; Albertini et al., 2000; Blasiak et al., 2000; Tice et al., 2000; 
Rodríguiez-Mercado et al., 2003). Además, los rompimientos en el ADN, son 
considerados como marcadores importantes de genotoxicidad (Carrano et al., 1988). 
Como se mencionó antes, la Casiopeína III-ia no mostró toxicidad celular bajo 
las condiciones experimentales utilizadas, pero sí evidenció rompimientos en el ADN 
(cuadros III a VI; figuras 3 a 10) desde las 2 horas de tratamiento. También, se puede 
observar en los donadores A y B (mujer de 22 años y hombre de 32 años, 
respectivamente) (cuadro III y IV) una mayor sensibilidad a los efectos de la 
Casiopeína III-ia que los individuos C y D (hombre de 23 años y mujer de 22 años, 
respectivamente) (cuadro V y VI). 
Las disimilitudes anteriores, pueden ser causadas por la variabilidad individual 
como el metabolismo para la transformación de xenobióticos, la capacidad para la 
reparación del ADN, entre otros factores, tales como nutrición, género, edad, estilo de 
vida y aspectos neuropsicológicos (Talmage, 1992; Timbrell, 1993; Cortés et al., 2001; 
Pastor-Benito, 2002; Cuenca y Ramírez, 2004). 
Un fenómeno importante que puede ayudar a explicar con mayor certeza, las 
diferencias en las respuestas individuales, respecto a las concentraciones y tiempos 
empleados, en el daño al ADN, es la hormesis. Una respuesta hormeótica, se describe 
como el efecto bimodal que exhibe un agente químico (Ellman y Sunstein, 2004). 
En revisiones realizadas por Calabrese y Baldwin (2002; 2003), en la que se 
incluyen varios antineoplásicos, se concluye que numerosos agentes químicos y 
físicos, como la dioxina, fenobarbital, cloruro de cadmio y rayos X o gamma, 
respectivamente, entre otros, pueden inducir hormesis, provocando efectos adversos 
 35
en concentraciones altas y benéficos en concentraciones bajas. Esto implica que el 
mismo agente usado para tratar tumores en concentraciones bajas, también puede ser 
usado en concentraciones altas provocando el mismo efecto puede provocar toxicidad 
en concentraciones altas. 
En los donadores A, B y D, las concentraciones más bajas inducen colas más 
grandes (cuadro III, IV y VI), lo que parece indicar una respuesta hormeótica, por lo 
que es conveniente, realizar estudios con concentraciones más bajas a las utilizadas 
en este trabajo, para aclarar este comportamiento. 
El porcentaje del número de células sin daño y con daño obtenidos en este 
trabajo, también pueden mostrar la posible activación de los mecanismos de 
reparación del material genético (cuadro IV a VI, figura 8 a 10), que es uno de los 
factores que determinan la respuesta entre individuos. 
Para el donador B, es evidente que después de 3 horas de tratamiento, el 
porcentaje de células sin daño se incrementa y el porcentaje en las diferentes 
categorías de daño disminuye en comparación con los tratamientos de 2 horas (por 
ejemplo, 1.68 µg/ml de Casiopeína III-ia; figura 8). En el donador C, en la 
concentración de 4.21 µg/ml (figura 9), se presentan menos células sin daño, en 
comparación con 2 horas, lo que indica que las células siguen reparando; lo mismo 
sucede con el donador D, sólo que en las concentraciones de 1.68, 4.21 y 8.42 µg/ml. 
Lo anterior indica que, los leucocitos del donador B reparan las lesiones inducidas por 
Casiopeína III-ia, más rápido que los del donador C y que los del D, en 
concentraciones bajas. 
Existen diferentes tipos de daño al ADN, como la pérdida y modificación de 
bases o nucleótidos, el cruzamiento intra- catenario y las rupturas en las cadenas de 
fosfatos; los cuales son reparados por diferentes mecanismos como, la escisión de 
bases o nucleótidos, en la cual hay síntesis del material afectado, tomando como 
molde la cadena no dañada (Moustacchi, 2000; Pfeiffer et al., 2000; Hoeijmakers, 
2001, Rodríguez-Mercado, 2006). 
 Es importante resaltar que las alteraciones sobre el ADN, descritas en el 
párrafo anterior, pueden ser detectados por el ensayo cometa (Collins, 2004) y los 
resultados obtenidos, reflejan los efectos inducidos por la Casiopeína III-ia a pH>13, 
 36
como sitios sensibles al álcali, rompimientos de cadena sencilla y/o sitios de 
reparación por escisión (Rojas et al., 1999; Kassie et al., 2000; Collins, 2004). 
Pruebas bioquímicas demuestran que, por un lado, la Casiopeína III-ia tiene 
afinidad por la adenina, entre la bipiridina de la Casiopeína y adenina, y por el otro, 
entre el acetilacetonato y adenina (Tovar-Tovar et al., 1995; 2004), con lo cual se 
puede suponer que el daño observado en el ADN de los leucocitos humanos, es 
producto de la interacción con el compuesto probado. 
En estudios recientes (Rivero-Müller et al., 2007) se reporta que la Casiopeína 
IIgly y III-ia, son capaces de incrementar la producción de especies reactivas de 
oxígeno, por la reducción del Cu, en células de hígado de ratón y L1210 (leucemia 
murina), efecto que no está relacionado con daño en la membrana plasmática, puesto 
que Alemón-Medina y colaboradores (2004) no encontraron lipoperoxidación en 
linfocitos humanos y células HeLa, estudios que respaldan los resultados de la 
viabilidad y los del efecto sobre el ADN encontrados en este trabajo. 
A pesar de que las células utilizadas en este estudio se encuentran en fase de 
G0 y la Casiopeína III-ia tiene como objetivo afectar células cancerígenas, las cuales 
están en constante proliferación, la comparación entre ambos tipos celulares es válido, 
ya que el daño al ADN puede producirse en cualquier momento del ciclo celular, 
ocasionando arrestos en fase de G1, S, G2 o M, tanto de células normales como de 
células transformadas (Hoeijmakers, 2001). 
 Finalmente, una de las opciones para conocer más la manera en que la 
Casiopeína III-ia produce sus efectos, es evaluar el daño al ADN en tiempos cortos de 
exposición y en concentraciones menores, ya que en el trabajo de Florín-Ramírez 
(2005) se reportó que la Casiopeína IIgly da positivo con el ensayo cometa en 
concentraciones similares a las empleadas en este trabajo, desde los 20 minutos de 
tratamiento, en el mismo sistema de prueba, con un comportamiento dosis- y tiempo- 
dependientes; lo anterior, con el objeto de empezar a diseñar experimentos para 
elucidar la posible especificidad de estas drogas, no solo respecto a la Casiopeína que 
será utilizada para determinado tipo de cáncer, sino también, para las dosis 
empleadas en cada paciente, además de que aportan información valiosa para aplicar 
las Casiopeínas como quimioterapéuticos en el combate contra el cáncer en los 
próximos años. 
 37
8. CONCLUSIONES 
 
 La Casiopeína III-ia no es citototóxica ya que no produce cambios en la 
viabilidad celular después de 2 ó 3 horas de tratamiento. 
 La Casiopeína III-ia puede ser considerada un agente genotóxico debido a que 
induce daño sobre el ADN de leucocitos humanos de sangre periférica 
expuestos in vitro. 
 La Casiopeína III-ia no mostró respuestas dependientes de la concentración, ni 
dependiente del tiempo. 
 La Casiopeína III-ia ejerce sus efectos genotóxicos, apartir de la concentración 
más baja empleada en este estudio. 
 La respuesta interindividual entre los cultivos celulares de los cuatro donadores 
tratados con Casiopeína III-ia, puede ser atribuida a diferentes factores desde 
genéticos hasta estilo de vida. 
 
 38
.,¡. 
.,¡. 
8. CONCLUSIONES 
 
 La Casiopeína III-ia no es citototóxica ya que no produce cambios en la 
viabilidad celular después de 2 ó 3 horas de tratamiento. 
 La Casiopeína III-ia puede ser considerada un agente genotóxico debido a que 
induce daño sobre el ADN de leucocitos humanos de sangre periférica 
expuestos in vitro. 
 La Casiopeína III-ia no mostró respuestas dependientes de la concentración, ni 
dependiente del tiempo.La Casiopeína III-ia ejerce sus efectos genotóxicos, apartir de la concentración 
más baja empleada en este estudio. 
 La respuesta interindividual entre los cultivos celulares de los cuatro donadores 
tratados con Casiopeína III-ia, puede ser atribuida a diferentes factores desde 
genéticos hasta estilo de vida. 
 
 38
.,¡. 
.,¡. 
9. PERSPECTIVAS 
 
Los datos obtenidos en esta tesis coinciden con los estudios publicados por 
Alemón y colaboradores (2007) que aportan información acerca de los efectos de la 
Casiopeína III-ia sobre el ADN de leucocitos humanos normales de sangre completa, sin 
embargo, es necesario conocer totalmente los diferentes mecanismos de acción de estos 
compuestos para su posible aplicación como quimioterapéuticos; asimismo, con la 
metodología del ensayo cometa, se puede profundizar en la comprensión de estos 
mecanismos, por lo que es recomendable: 
 
 Evaluar con la misma metodología empleada en esta tesis, la cinética de 
reparación de las células expuestas en diferentes concentraciones y diferentes 
tiempos a Casiopeína III-ia, menores o iguales a las aquí utilizadas. 
 Utilizar células trasformadas, tomando en cuenta algunas líneas celulares, tales 
como HeLa, CaLo, InBl, L1210, AS-30D, así como diferentes estadíos, dada la 
posible especificidad de las Casiopeínas. 
 Realizar una electroforesis unicelular en gel en condiciones nuetras de pH, para 
determinar la capacidad de esta Casiopeína para inducir rompimientos de cadena 
doble de ADN. Así como otras modificaciones para determinar apoptosis o 
necrosis. 
 
 
 39
10. REFERENCIAS 
 
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	Portada
	Índice
	Resumen
	1. Marco Teórico
	2. Justificación
	3. Hipótesis
	4. Objetivos
	5. Material y Métodos
	6. Resultados
	7. Discusión
	8. Conclusiones
	9. Perspectivas
	10. Referencias