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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS FACULTAD DE CIENCIAS EVALUACIÓN DE LAS POSIBLES ALTERACIONES GAMÉTICAS EN TRADESCANTIA PRODUCIDAS POR INSECTICIDAS PIRETROIDES LIBERADOS POR VAPORIZADORES ELÉCTRICOS TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE MAESTRO EN CIENCIAS (ECOLOGÍA Y CIENCIAS AMBIENTALES) PRESENTA BIOL. MIGUEL ANGEL RICO RODRÍGUEZ DIRECTOR DE TESIS: DR. RAFAEL VILLALOBOS PIETRINI MEXICO, D.F. MAYO 2006 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. AGRADECIMIENTOS A DIOS Gracias por permitirme lograr esta meta tan importante que permitirá ejercerla con mis alumnos y la sociedad. Te doy gracias señor A MI FAMILIA. A mi esposa Angélica y mis hijos Miguel Angel, Mariana y Carolina que son la razón de mí ser. También quiero agradecer sinceramente a aquellas personas que me compartieron sus conocimientos para hacer posible la conclusión de esta tesis. Agradezco a mi director de tesis el Dr. Rafael Villalobos Pietrini, por brindarme la oportunidad de realizar este proyecto, por confiar y creer en mí. También por la ayuda incondicional que siempre me brindo. A la Dra Sandra Gómez Arroyo por su constante ayuda y consejos para culminar esta investigación. También agradezco a mi asesora la Dra. Patricia Ramos Morales, por la revisión y recomendaciones respecto a este trabajo A la Dra. Irma Aurora Rosas Pérez, por la revisión de este trabajo así como al Dr. Daniel Piñero Dalmau, gracias por sus sugerencias. A la M en C Ana Rosa Flores Márquez, por su incondicional apoyo tanto en su asesoría técnica como académica para este proyecto. El presente trabajo se realizó en el laboratorio de Mutagénesis Ambiental del Centro de Ciencias de la Atmósfera de la Universidad Nacional Autónoma de México, bajo la dirección de Dr Rafael Villalobos Pietrini con el apoyo del Centro de Estudios Académicos sobre Contaminación Ambiental de la Universidad Autónoma de Querétaro. ÍNDICE RESUMEN 3 I. INTRODUCCIÓN 4 II. ANTECEDENTES 5 INSECTICIDAS ORGANOCLORADOS 5 INSECTICIDAS ORGANOFOSFORADOS 6 CARBAMATOS 6 PIRETRINAS 6 PIRETROIDES 7 Clasificación de los piretroides 8 Piretroides en el ambiente 9 Vías de absorción de los piretroides 10 Metabolismo degradador de los piretroides 11 Toxicidad de los piretroides 13 Genotoxicidad de los piretroides 14 GENOTOXICIDAD 15 ABERRACIONES CROMOSÓMICAS 15 Micronúcleos 16 ENSAYOS PARA EVALUAR ACTIVIDAD GENOTÓXICA 17 SISTEMA BIOLÓGICO DE PRUEBA GENOTÓXICA 18 Tradescantia clon 4430 18 III. HIPÓTESIS 22 IV. OBJETIVOS 22 V. MATERIALES Y MÉTODOS 22 Selección de la sustancia tóxica 22 Mantenimiento del material biológico y su propagación 24 VI. DISEÑO EXPERIMENTAL 26 Proceso de tratamiento 26 Recuperación 27 Fijación 28 Realización de preparaciones 28 Preparaciones permanentes 28 Lectura de preparaciones 28 Análisis estadístico de los datos 29 VII. RESULTADOS 29 VIII. DISCUSIÓN 45 IX. CONCLUSIONES 47 X. REFERENCIAS 48 3 RESUMEN Cada vez es mayor la demanda de plaguicidas debido a la necesidad de proteger el desarrollo de cultivos que son importantes para el consumo humano y otros que son de uso doméstico para evitar la acción de los insectos en la población humana como es el caso de los piretroides. Algunos son liberados a la atmósfera por medio de vaporizadores eléctricos y la principal razón para estudiarlos radica en que son muy empleados en la ciudad de Querétaro. En una encuesta que yo realice, demostró que el 80 % de las personas reconocieron que utilizan esta clase de insecticida. Por otra parte, también se han desarrollado diversos bioensayos que permiten determinar a corto plazo el daño genético que causan estos agentes químicos, como es el caso de la prueba de micronúcleos en las tétradas de Tradescantia clon 4430 (TRAD-MCN). Por lo que en este estudio se expusieron cortes de Tradescantia (en una cámara cerrada) durante 2, 4, 6, 8, 10 y 12 horas por la noche a los vapores de tres insecticidas cuyas marcas comerciales son: Raid 45 noches, Baygon plaquitas y Raid plaquitas. Los tres contienen como ingrediente activo al piretroide: esbiotrina o d-aletrina y la diferencia entre ellos es solamente la concentración del piretroide y que el primero, cuando fue empleado en los experimentos, contenía dihidrobutiltolueno como disolvente. Los resultados con el Raid 45 noches mostraron diferencias significativas con los testigos (prueba ¨U¨·de Mann Whitney, p<0.05), se encontró un incremento en el número de micronúcleos en las tétradas de las plantas expuestas por periodos de 4, 6 y 8 horas. Mientras que con los otros tiempos de exposición y los otros vaporizadores, las frecuencias no presentaron diferencias significativas (p>0.05). Cuando se probó el disolvente dihidrobutiltolueno, a la concentración que se encontraba en el vaporizador eléctrico con los mismos tiempos de exposición, también fue genotóxico, por lo que el efecto del Raid 45 noches se le puede atribuir al disolvente y no al piretroide. 4 I. INTRODUCCIÓN Los daños ocasionados al ambiente se deben en su mayoría a la gran cantidad de agentes químicos vertidos al mismo, como es el caso de los plaguicidas (término que se aplica a cualquier producto químico destinado a luchar contra pestes, plagas o vegetales que amenacen a los cultivos agrícolas, a la ganadería o a la salud pública) y según el tipo de plaga a la que vayan a contrarrestar son: insecticidas, acaricidas, nematicidas, molusquicidas, herbicidas, etc. La forma desmedida de aplicación ha alterado la salud humana, ya que la mayoría son muy persistentes en el ambiente y se cuenta con información amplia sobre los daños que producen varios de ellos a nivel genético (Ma et al.1983). La mayor parte de los plaguicidas que se utilizan en salud pública y en agricultura son insecticidas y todos son peligrosos para el hombre, ya que pueden producir intoxicaciones agudas, cuando penetran al organismo en cantidades excesivas, en un tiempo corto o intoxicaciones crónicas provocadas por pequeñas cantidades, aplicadas sistemáticamente durante largo tiempo (Centro Panamericano de Ecología y Salud 1986). Muchos plaguicidas modernos son auxiliares de gran valor para el desarrollo de la agricultura, lo que posibilita la obtención de cosechas más abundantes mediante el control de plagas y enfermedades. Algunos de esos compuestos también contribuyen de manera importante en las campañas de salud pública, por ejemplo, en el combate contra el dengue. Asimismo, los insecticidas que son relativamente poco tóxicos para el hombre, pueden aplicarse en el hogar para eliminar insectos molestos o transmisores de enfermedades. Se tiene una gama amplia de plaguicidas, desde los que provocan baja toxicidad a los extremadamente tóxicos para el hombre y otros mamíferos, aves,peces e insectos útiles. Frecuentemente aparecen nuevos plaguicidas en el mundo, se mencionan más de 900 compuestos de acción plaguicida, se producen nuevos constantemente y se presentan en diversidad de formulaciones. 5 Las sustancias activas con diferentes grados de toxicidad para el hombre y con distintos mecanismos de acción, se clasifican toxicológicamente de acuerdo con su dosis letal media (DL50), indicada en miligramos de la sustancia activa por kilogramo de peso corporal de los animales de prueba (Cuadro I). Esta clasificación es útil para considerar el riesgo de intoxicación aguda, pero no aporta indicaciones de otros problemas que pueden aparecer como consecuencia de la absorción continua de pequeñas dosis durante lapsos largos. Por lo anterior se han buscado otras alternativas tales como productos naturales y este es el caso de las piretrinas, que son poco tóxicas para el hombre (Forget 1991). Cuadro I Clasificación de los plaguicidas de acuerdo con su dosis letal media (DL50). CLASE DL50 mg/kg Extremadamente tóxicos < 5 Muy tóxicos 5 a 50 Medianamente tóxicos 50 a 500 Poco tóxicos 500 a 5000 Prácticamente no tóxicos > 5000 II. ANTECEDENTES Según sus estructuras químicas, los insecticidas se dividen en cuatro grupos principales que son: organoclorados, organofosforados, carbamatos y piretroides. INSECTICIDAS ORGANOCLORADOS Tienen elevada actividad tóxica sobre los insectos, baja toxicidad en mamíferos pero se acumulan fácilmente en tejido adiposo, baja solubilidad en agua y notable resistencia a la descomposición por microorganismos. Los insecticidas organoclorados más conocidos son aldrín, dieldrín, endrín, 5 Las sustancias activas con diferentes grados de toxicidad para el hombre y con distintos mecanismos de acción, se clasifican toxicológicamente de acuerdo con su dosis letal media (DL50), indicada en miligramos de la sustancia activa por kilogramo de peso corporal de los animales de prueba (Cuadro I). Esta clasificación es útil para considerar el riesgo de intoxicación aguda, pero no aporta indicaciones de otros problemas que pueden aparecer como consecuencia de la absorción continua de pequeñas dosis durante lapsos largos. Por lo anterior se han buscado otras alternativas tales como productos naturales y este es el caso de las piretrinas, que son poco tóxicas para el hombre (Forget 1991). Cuadro I Clasificación de los plaguicidas de acuerdo con su dosis letal media (DL50). CLASE DL50 mg/kg Extremadamente tóxicos < 5 Muy tóxicos 5 a 50 Medianamente tóxicos 50 a 500 Poco tóxicos 500 a 5000 Prácticamente no tóxicos > 5000 II. ANTECEDENTES Según sus estructuras químicas, los insecticidas se dividen en cuatro grupos principales que son: organoclorados, organofosforados, carbamatos y piretroides. INSECTICIDAS ORGANOCLORADOS Tienen elevada actividad tóxica sobre los insectos, baja toxicidad en mamíferos pero se acumulan fácilmente en tejido adiposo, baja solubilidad en agua y notable resistencia a la descomposición por microorganismos. Los insecticidas organoclorados más conocidos son aldrín, dieldrín, endrín, 6 diclorodifeniltricloroetano (DDT), lindano, clordano y heptacloro (Arias et al. 1990, Forget 1991). INSECTICIDAS ORGANOFOSFORADOS Son normalmente ésteres derivados de los ácidos fosfórico y fosfónico, que a veces poseen grupos amidas o tioles. La mayor parte son ligeramente solubles en agua con alto coeficiente de partición aceite/agua y baja presión de vapor. Actualmente, más de cuarenta de ellos están registrados para usarse como insecticidas y todos implican el riesgo de provocar toxicidad aguda y subaguda. Los organofosforados son utilizados en la agricultura, en el hogar, en los jardines y en la práctica veterinaria. Aparentemente todos comparten el mecanismo común de inhibición de la colinesterasa y pueden causar síntomas similares (EPA 1999). CARBAMATOS Los insecticidas carbámicos, son muy empleados en el hogar, en jardines y en agricultura, comparten con los organofosforados la capacidad de inhibir las actividad colinesterásica y por lo tanto tienen una sintomatología similar durante las exposiciones agudas y crónicas. Los ésteres del carbamato de N-metilo causan carbamilación reversible en la acetilcolinesterasa, lo que permite la acumulación de acetilcolina, sustancia neuromediadora de las uniones neuroefectoras parasimpáticas (efectos muscarínicos) y de las uniones mioneurales del músculo esquelético. Los aldoxicarbamatos son considerados muy tóxicos (EPA 1999) PIRETRINAS Son derivados vegetales muy utilizados por su eficacia y rapidez de acción como insecticidas en aplicaciones domésticas, este piretro natural proviene de las cabezas florales del crisantemo (Chrysantenum cinerarieaefolium). Fue introducido a Europa en forma de extracto en el siglo 7 XVIII, provocando curiosidad científica y técnica, lo que ha conducido a profundizar en el conocimiento de las piretrinas. Se les considera insecticidas naturales porque provienen de ésteres del ácido crisantémico y del ácido pirétrico, obtenidos por la extracción de las flores del piretro. Las flores secas contienen de 1 a 2 % en peso de piretrinas. Las piretrinas naturales contienen: piretrina I y II, jasmolina I y II, cinerina I y II. Los crisantematos (piretrina I, cinerina I y jasmolina I) son generalmente más potentes; mientras que los piretratos (piretrina II, cinerina II y jasmolina II) causan aturdimiento rápido (Dorman y Beasley 1991, Forget 1991). Las piretrinas son líquidos viscosos, solubles en varios disolventes orgánicos e insolubles en agua, son muy sensibles a la luz y sufren rápida fotodegradación, son inestables al calor y no son volátiles (Casida et al.1983, Dorman y Beasley 1991). Debido a su inestabilidad y alto costo, su uso fue limitado, principalmente para fines agrícolas y fueron desplazados en la década de los 40 y 50 por los insecticidas organofosforados y carbamatos. Sin embargo, a partir de 1945 se empezaron a sintetizar los piretroides con base en las características principales de los constituyentes de las piretrinas. Se buscó una estructura química con mayor estabilidad (menos sensible a la oxidación) y un aumento en su capacidad insecticida, conservando su baja toxicidad sobre mamíferos (Casida et al. 1983). Por tal razón, a las piretrinas se les ha considerado de uso doméstico, lo que ha conducido en los últimos años, al desarrollo de nuevos insecticidas con las características de las piretrinas como son los piretroides con toxicidad baja y menos sensibles a la fotodescomposición y por lo tanto más estables, lo que facilitó extender su empleo (Barberá 1989). PIRETROIDES El primer piretroide sintetizado fue la aletrina (Schechter et al. 1949) mediante el acortamiento y la simplificación de la cadena lateral pentadienil de los ésteres naturales (Elliott 1980); con esto se logró mayor efectividad en comparación con las mezclas de ésteres naturales contra insectos. Cuando las piretrinas fueron retiradas del mercado los piretroides se utilizaron como 8 sustitutos, y en la actualidad son empleados en espirales antimosquitos debido a su alta volatilidad y estabilidad térmica (Elliott 1980, Matsumara 1985). La tetrametrina (neopinamin) fue el siguiente piretroide sintético producido comercialmente en 1964 y descubierto por Sumitomo como 3, 4, 5, 6-tetrahidro, que resultó más activo y accesible que muchos ésteres. La tetrametrina es un agente esencialmente de aturdimiento y su actividad es limitada (Elliot 1980). En 1966, se sintetizaron otros dos piretroides, resmetrina y biorresmetrina, desarrollados en Japón y utilizados en aerosoles (Barberá 1989) Las tetrametrinas, resmetrinas y fenotrinas, tienen como base la fórmula general de las piretrinas (constituidas por radicales orgánicos y elalcohol fenoxibencílico); la causa de la rápida fotodescomposición se le adjudicó al grupo alcohol, lo que significó una pauta para futuras investigaciones. Un avance se logró al substituir al alcohol fenoxibencilico por el isobutileno, pero como también lo oxidaba la radiación ultravioleta, se sustituyó el grupo metilo (CH3) del isobutileno por radicales halógeno, originándose grupos diahalovinilos, este es el caso de los insecticidas cipermetrina y deltametrina. Estos insecticidas fueron los primeros piretroides suficientemente estables destinados al uso agrícola (Elliot et al.1978). Las modificaciones del grupo primitivo de piretrinas para la producción de los piretroides han sido muy profundas, lo que ha provocado la pérdida de su identidad, por lo que cabe considerar hasta que punto estos productos pueden ser denominados piretroides (Barberá 1989). En algunas de sus propiedades fisicoquímicas los piretroides son similares a los compuestos organoclorados, como lo son el coeficiente de partición, la volatilidad y la solubilidad, entre otras, que pueden influir en su comportamiento en el ambiente y en el tipo de acción sobre los mamíferos (Elliot 1980) Clasificación de los piretroides Son ésteres (derivados de la reacción de un ácido y de un alcohol) del ácido 2,2-dimetilciclo-propancarboxílico ó son análogos del ácido 2-aril-3- 9 metilbutírico que carece del anillo ciclopropano y pueden ser formados por moléculas ácidas y moléculas alcohólicas (Elliot 1980). La clasificación de los piretroides en grupos I y II se basa en los signos clínicos y en las respuestas electrofisiológicas que provocan, así como en su estructura química. Los piretroides del grupo I causan el síndrome T (temblores) y son los que no contienen el grupo cianuro (CN) en su estructura (permetrina, resmetrina, aletrina, transflutrina, d-fenotrina y tetrametrina, entre otros) y los del grupo II originan el síndrome CS (convulsión-salivación), que incluyen el grupo CN (deltametrina, cihalotrina, fenvalerato cipermetrina y fenpropatrina, entre otros) (Hutson y Roberts 1985). C H 3 C H3 C H3 C C-C H 2-C H= C H2 C C H3 C H2 C C H2 C O C H -C H -C H -C O O -C H Figura 1. Estructura química de la esbiotrina o d-aletrina que pertenece al grupo I (Kaloyanova y El-Batawi 1991). Piretroides en el ambiente Después del uso doméstico de la cipermetrina, se han encontrado residuos de este piretroide en el polvo y en las alfombras de casas habitación en concentraciones hasta de 4 mg/kg (RAPAM 1996). Mientras que en otras investigaciones, se incrementa rápidamente la concentración en el aire, después de aplicar domésticamente estos insecticidas. Además, cuando permanecen a concentraciones relativamente constantes entre 3 y 8 mg/m3 durante meses, pueden causar efectos adversos para la salud (RAPAM 1996) Coats (1990) y Hayes et al. (1990) mencionan que este tipo de insecticidas son hidrolizados rápidamente en el tracto intestinal y en otros tejidos de animales de sangre caliente. Los piretroides muestran ventajas comerciales, ""-1 /\ I ~ 10 ya que no son caros, su empleo requiere de dosis muy bajas, presentan peligros mínimos en su manejo y tienen bajo impacto sobre el ambiente (Carter 1989). Hace diez años, aproximadamente estos insecticidas fueron lanzados al mercado en México y a nivel mundial abarcan ya 1/4 del total de los insecticidas utilizados (Covarrubias y Sosa 1994) y la razón de su uso es debida a su rápida forma de acción y baja toxicidad para los mamíferos, su efectividad en espacios cerrados y por ello han sido formulados de distintas maneras como aerosoles, líquidos y vapores (Elliot et al. 1978) Al parecer los mamíferos metabolizan lentamente a los piretroides, aunque en comparación con el metabolismo y la excreción de los insectos y de los peces, éste es más rápido. Bainova y Kalayanova (1985) encontraron que la eliminación de la cipermetrina y sus metabolitos en tejido adiposo de ratón es lenta. En realidad aunque los piretroides son estables en el medio, se aplican en forma desmedida y sin control, tanto en casas habitación como en la industria y en la agricultura. Vías de absorción de los piretroides Son absorbidos por las vías oral, dérmica y respiratoria. La absorción a través de la piel es la más frecuente en las intoxicaciones que ocurren entre los aplicadores de plaguicidas. Estas sustancias son absorbidas sin quemar la piel, sin irritación local, sin dolor y sin indicación de su penetración. Este es un problema nuevo para los aplicadores o para la gente expuesta que no aceptan que una sustancia en contacto con la piel pueda ser absorbida y causar intoxicaciones graves o letales sin provocar algún síntoma local (Hutson y Roberts 1985). La absorción oral es la ruta común de intoxicaciones en los niños que ingieren restos de insecticidas que se encuentran en el ambiente así como los residuos acumulados en casas habitación (El-Sharkawy et al. 1994). La absorción respiratoria puede ocurrir durante las aplicaciones, cuando se utilizan equipos para producir gotitas muy pequeñas (de menos de 20 micrómetros). Esta es también la vía de absorción de personas que trabajan con 11 insecticidas en ambientes confinados y no utilizan las mascarillas adecuadas (El- Sharkawy et al. 1994). Metabolismo degradador de los piretroides El factor más importante durante la degradación de piretroides, como la cipermetrina, es el rompimiento del enlace éster, que es catalizado por las carboxiesterasas, abundantes en el tejido muscular de los mamíferos. Esta reacción se realiza mediante un mecanismo oxidante sobre este enlace, en donde los isómeros cis, están menos disponibles que los isómeros trans. Además, el grupo cianuro (CN) de algunos piretroides, no permite que las esterasas actúen libremente por lo que al no realizarse su hidrólisis, la toxicidad se mantiene. Debido a estas diferencias configuracionales entre los isómeros cis y trans, los primeros por ser difícilmente degradados por las enzimas mencionadas, presentan mayor toxicidad con respecto a los segundos. Esto se debe a que la longitud del enlace éster, es más corta en los cis que en los trans, por lo tanto en los primeros existe mayor impedimento estérico (amontonamiento de átomos) lo que dificulta su degradación (WHO 1989). Por otro lado, debido a que los insectos manifiestan baja capacidad para hidrolizar ambos isómeros, la toxicidad en ellos es más alta (Hutson y Roberts 1985). La degradación de los piretroides a partir de la esterasa, da lugar a algunos metabolitos como tiocianatos conjugados con aminoácidos, alcoholes, fenoles, ácidos carboxílicos, sulfatos glucósidos, etc. Las esterasas microsómicas del hígado de ratón hidrolizan los isómeros trans de algunos piretroides (tetrametrina, resmetrina, fenotrina y permetrina), más rápidamente que a sus correspondientes isómeros cis (tetrametrina, resmetrina, fenotrina y permetrina) (El-Sharkawy et al. 1994) La mayoría de los estudios in vitro han utilizado enzimas microsómicas de hígado de ratón y rata como fuente de esterasas para la degradación de piretroides, siendo estas más activas que otras fracciones de homogeneizados hepáticos. Diversos estudios con piretroides han manifestado su inocuidad 12 principalmente en el ser humano, debido a su fácil degradación que, como se ha mencionado, es promovida por algunas esterasas microsómicas; sin embargo, esta vía de desintoxicación puede ser interrumpida cuando las esterasas son inhibidas por la acción de otros insecticidas como son los organofosforados y algunos carbamatos (Casida et al. 1983), comúnmente encontrados en el ambiente y en los alimentos (Hileman 1993), permaneciendo así latente su toxicidad. El proceso degradante de los piretroides en mamíferos se desarrolla mediante reacciones hidrolíticasy oxidantes, dependiendo del tipo de compuesto. Los isómeros trans de los ésteres crisantémicos de alcoholes primarios como fenotrina, furametrina, propartrina, resmetrina, tetrametrina y posiblemente permetrina, son metabolizados principalmente mediante hidrólisis del enlace éster, con la subsecuente oxidación y/o conjugación de los componentes alcohólicos y ácidos de la molécula. Generalmente, estas rápidas degradaciones metabólicas, así como la posible absorción incompleta en el tracto gastrointestinal, contribuyen a la baja toxicidad aguda de algunos piretroides (Miyamoto 1976). Sin embargo, Lessenger (1992), informó de cinco casos de envenenamiento con cipermetrina en trabajadores que inhalaron accidentalmente dicho piretroide, suministrado mediante los flujos de aire acondicionado. Las personas expuestas al piretroide mencionado manifestaron síntomas de deficiencia respiratoria, dolores de cabeza, náuseas e irritabilidad general (Barberá 1989). La cipermetrina inicia su metabolismo en el humano con el rompimiento del enlace éster, es transformada en algunos conjugados en forma de glucorónidos o pueden ser hidroxilados varios de los grupos metilo y nuevamente conjugado u oxidado. La molécula alcohólica es transformada a un aldehído (compuesto volátil e inflamable que resulta de la deshidrogenación u oxidación de ciertos alcoholes), que es rápidamente oxidado en ácidos aromáticos que son conjugados u oxidados posteriormente para formar anillos aromáticos (Demoute 1989). El grupo ciano es convertido principalmente a tiocianato y es excretado por la vía renal como principal ruta. 13 Toxicidad de los piretroides Los efectos tóxicos generados por los piretroides, se basan en la modificación de la permeabilidad iónica de las membranas nerviosas produciendo envenenamiento en insectos y animales superiores (Eells et al. 1992). En algunos experimentos realizados en fibras nerviosas tratadas con piretroides se ha manifestado una despolarización en las mismas, resultando en el aumento de la activación de los canales de sodio (Brown et al. 1988), que provoca alteraciones neuronales. Todos los piretroides tienen esencialmente el mismo mecanismo básico de acción en los canales de sodio, pero difieren en la magnitud del efecto. Sin embargo, parece que los piretroides del tipo II, además de los signos mencionados, inhiben canales complejos regulados por los receptores GABA, así como los canales de calcio activadores de voltaje (Valentine 1990). Estos receptores GABA permiten el flujo de iones cloro, de ahí que su inhibición provocaría también el desequilibrio en el flujo de iones sodio generando hiperexcitación del sistema nervioso. Se halló que los insecticidas piretroides permetrin, fenvalerato y cipermetrina son letales a concentraciones bajas sobre organismos acuáticos como salmón, langosta y camarón, encontrándose además que a concentración de 2 mg/L de cipermetrina fue letal para salmón y langosta, mientras que 0.01 mg/L lo fue para camarón (McLeese et al. 1980) En experimentos tanto de exposición larga como de corta con piretroides en ratas Wistar, se han observado daños en hígado, especialmente cuando es usado con un compuesto coadyuvante y propelente de freón, causando además reacciones alérgicas. Además se ha notado que personas con problemas respiratorios, presentan mas sensibilidad a los piretroides. También pacientes con esclerosis múltiple que están bajo medicamentos, muestran mayor daño de tipo neurológico. Estos insecticidas pueden provocar dolor de cabeza, depresión, náuseas y desvanecimiento (Landrigan 1999). 14 Algunos piretroides como la deltametrina son activos en concentraciones muy bajas (10 a 12 ppm) y su acción repercute principalmente sobre el sistema nervioso (Satelle y Yamamoto 1988). Se ha observado que piretroides como la cipermetrina, deltametrina, permetrina y fenvalerato a bajas concentraciones (0.01 mg/L), redujeron la tasa de reproducción de una población de plancton de agua dulce (Day 1989). Genotoxicidad de los piretroides Estudios recientes (Gandhi et al. 1995) demostraron que dosis de 162 mg/kg de peso corporal de deltametrina en ratones, fue suficiente para inducir daño genético (micronúcleos) en células de la médula ósea de ratón.. Bhunya y Pati (1990) reportaron que el insecticida deltametrina a dosis entre 10 a 20 mg/kg de peso corporal, incrementó significativamente anormalidades en los espermatozoides e indujo aberraciones cromosómicas y micronúcleos en células de médula ósea de ratón. Similarmente cuando se trataron raíces de Allium cepa con deltametrina se observó el incremento de micronúcleos al aumentar la concentración (Gandhi 1995). También se han inducido intercambios de cromátidas hermanas sobre linfocitos humanos in vitro, tratados con deltametrina a diferentes concentraciones (Dolara et al. 1992). En otro estudio con macrófagos de los alvéolos pulmonares de ratas, que fueron expuestas intermitentemente a vapores estáticos liberados de piretroides, en una cámara de inhalación cerrada en tratamientos cortos de 1 día (15 min/h, 8 h/día) y largos de 7 días (15 min/h, 8 h/día, 7 días/semana), se evaluó el potencial genotóxico de los vapores, encontrándose un incremento significativo de micronúcleos, lo que demostró la capacidad genotóxica de este piretroide (Das y Sahu 1996). Herrera et al. (1992) encontraron efectos clastogénicos en células de ovario de criceto chino. Estos mismos piretroides también fueron probados a concentraciones por debajo de las recomendadas en la etiqueta del producto comercial sobre un sistema vegetal de prueba induciendo la formación de 15 micronúcleos en células meristemáticas de las raíces de Allium cepa (Covarrubias y Sosa 1994). La cipermetrina indujo micronúcleos en la médula ósea de ratón (Amer y Aboul-Ela 1985). Debe considerarse que los daños causados por la toxicidad de un compuesto al inducir daño genético sobre un sistema de prueba vegetal, puede ser indicio de severos daños en las células de mamíferos (Fiskesjo 1981). Actualmente existe gran cantidad de insecticidas en el mercado que contienen un piretroide como ingrediente activo y que los medios masivos de comunicación han catalogado como insecticidas que no dañan ni al hombre ni a las plantas. GENOTOXICIDAD Desde hace varios años existe preocupación de que las sustancias tóxicas sean factores que contribuyen al incremento de varias clases de enfermedades como el cáncer y los ataques al corazón, entre otras. La genotoxicidad puede entenderse como el resultado de la interacción de agentes químicos o físicos con el sistema hereditario de la célula (Clayson y Grant 1992). Los cambios en la estructura y en la función de las células germinales pueden resultar en infertilidad, abortos espontáneos, defectos en el nacimiento y cambios heredables en la estructura genética (Craigmill 1982). ABERRACIONES CROMOSÓMICAS Las alteraciones cromosómicas pueden ser numéricas o estructurales, en este último se involucran la morfología de los cromosomas y se producen cuando se insertan o eliminan porciones de cromosomas y estas pueden ser; deleciones, duplicaciones, inversiones y translocaciones. Estas alteraciones pueden ser detectadas con la ayuda de un microscopio examinando rompimientos cromatídicos y cromosómicos, fragmentos acéntricos, cromosomas dicéntricos y cromosomas en forma de anillo (cuando las células están en metafase), puentes y fragmentos (cuando están en anafase) y 16 micronúcleos (cuando están en interfase) (Covarrubias y Sosa 1994) . Micronúcleos Se forman a partir de fragmentos cromosómicos acéntricos o de cromosomas completos cuyo centrómero se inactivó. Esto origina que el huso acromático durante la anafase, no los jale hacia los polos quedando excluidos del conjunto de cromosomas que formaran al núcleo (figura2). Figura 2. Micronúcleos en una tétrada de Tradescantia clon 4430. Micronúcleos }Tétrada 17 ENSAYOS PARA EVALUAR ACTIVIDAD GENOTÓXICA Los ensayos genéticos a corto y largo plazos se han estado utilizando para la detección de mutágenos y carcinógenos ambientales (Brockman y De Marini 1988). La existencia de una infinidad de sustancias producidas por las industrias y difundidas en el ambiente, hace necesario la identificación de aquellas que son capaces de inducir mutaciones, con el objeto de prevenir sus efectos sobre la población humana. Los experimentos con sistemas biológicos no humanos resultan valiosos para evaluar los efectos genéticos de los agentes químicos y en ellos se busca su reproducibilidad, facilidad de realización, relativa economía y corta duración. Diversos bioensayos han sido desarrollados con virus, bacterias, hongos, insectos, cultivo de células de mamíferos, plantas etc., para medir efectos mutagénicos, producidos por compuestos químicos (Ennever et al. 1988). Cuando se diseña un estudio utilizando algunos de los bioensayos antes mencionados, es importante tomar en cuenta su costo. Para esto se cuenta con algunas plantas, entre ellas Tradescantia, que necesita poco equipo, material y personal por lo que resulta un bioensayo económico y eficaz (De Serres 1978). En 1978, el National Institute of Environmental Health Sciences, revisó el uso de una variedad amplia de sistemas vegetales para detectar la inducción de daño genético por agentes mutagénicos ambientales (De Serres 1978). Los sistemas vegetales permiten reconocer una gama amplia de daño genético como son mutaciones génicas y aberraciones cromosómicas, que además tienen gran variedad de aplicaciones en el ambiente, incluyendo la detección de mutágenos en plantas manufacturadoras que vierten contaminantes en arroyos, ríos o aire, tanto en regiones urbanas como en rurales. Una de las principales ventajas de los sistemas vegetales, es que no están restringidas solamente al uso de laboratorio sino que se pueden utilizar en el campo o en la industria en donde se efectúa la contaminación. Entre los sistemas vegetales más utilizados está Tradescantia en cuyas 18 células madres de polen se inducen alteraciones cromosómicas que se observan como micronúcleos en el estado de tétrada (Trad-MCN). Es un bioensayo a corto plazo que permite determinar la genotoxocidad causada por contaminantes ambientales (Ma et al. 1978). Algunos aspectos favorables de esta técnica son el poder almacenar a las inflorescencias por tiempos prolongados una vez que han sido fijadas, la facilidad en la realización de las preparaciones para el análisis de los micronúcleos, el bajo costo, el tiempo relativamente corto (24 a 48 horas) para la obtención de resultados (Ma 1981a, b) y que la planta posee su propio sistema microsómico por lo que no necesita de activación enzimática. También tiene desventajas, como la detección relativa de daño, puesto que las translocaciones, las inversiones y otros tipos de rearreglos cromosómicos no son revelados como MCN en las tétradas por lo tanto es recomendable que se realicen estudios a la par con otros sistemas biológicos para confirmar los resultados. SISTEMA BIOLÓGICO DE PRUEBA GENOTÓXICA Tradescantia clon 4430 Es una planta de la familia de las comelinaceas, con hojas estrechas que terminan en punta (figura 3), que se puede propagar fácilmente por reproducción asexual y mantener en condiciones de invernadero, florece por periodos prolongados, tiene elevada sincronización de las células madres de polen en las yemas de la inflorescencia en diferentes estados meióticos (figura 4) (Shairer et al. 1979) lo que facilita el conocimiento del ciclo microsporogénico. Las inflorescencias contienen yemas con diversas etapas de la meiosis, en la de tétrada se observan los micronúcleos inducidos en la meiosis temprana (profase I). Esta planta se reproduce asexualmente mediante macoyos y aunque forma brotes y flores no se lleva a cabo la fecundación. Tiene la capacidad de sostener su estado sexual y producir botones y flores sin que se lleve a cabo la fecundación, solo crece en condiciones de invernadero con la ayuda de la luz 19 suplementaria (Ma 1981b) ó en cámaras de crecimiento con condiciones de humedad y temperatura controladas (Schairer 1983, Schairer et al. 1983). Tradescantia tiene número cromosómico bajo (2n=12), es una planta muy sensible a contaminantes ambientales lo que permite someterla a diferentes maneras de tratamiento. Si las muestras son líquidas o solubles, el tratamiento es por vía del tallo, con agentes físicos o vapores se pueden utilizar cámaras especiales para exponer a las plantas, también es posible monitorear in situ cuando se desea muestrear agentes contaminantes presentes en la atmósfera (Ma 1980, Ma et al. 1984, 1996). Tradescantia es una de las plantas más eficientes para la detección de mutágenos como agentes gaseosos del ambiente (Ma et. al. 1978), teniendo validez en experimentos de laboratorio y para monitorear in situ el ambiente, detectando efectos producidos por radiaciones a dosis muy bajas y mutágenos químicos a la cual podrían estar expuestas las poblaciones (Ichikawa 1992). Figura3. Plantas de Tradescantia clon 4430 20 Figura 4. Esquema de la inflorescencia de Tradescantia mostrando la relación entre los diversos estados de desarrollo de la célula madre del polen con el tamaño de las yemas florales (modificado de Schairer et al. 1979). El bioensayo Trad-MCN fue utilizado para determinar la genotoxicidad de un insecticida común, el malatión, mediante diferentes formas de exposición (absorción vía tallo y vía yema floral) que ocasionó un alto índice de micronúcleos como resultado del daño genético (Ma et al. 1983). En 1980 este sistema fué positivo en estudios sobre contaminantes ambientales en Qingdao en la República Popular de China (Ma et al. 1982). Se obtuvieron resultados genotóxicos con la hidrazida málica (herbicida) en los 1 3-4 6-8 10-12 13-15 16-18 21 cromosomas de linfocitos humanos y en células madres de polen de Tradescantia (Iftikharuddin et al. 1980). Este bioensayo fue utilizado también para monitorear in situ los contaminantes del aire de diferentes localidades como complejos industriales, estacionamientos públicos, garages y paradas de autobuses en donde se obtuvieron frecuencias elevadas de micronúcleos en tétradas (Ma et al. 1980, 1981). La sensibilidad de Tradescantia se muestra cuando bajas concentraciones de cualquier contaminante, pueden inducir altas frecuencias de fragmentos cromosómicos acéntricos. Los efectos clastogénicos ocasionados por el humo emitido de máquinas diesel, fue determinado por el bioensayo Trad-MCN (Ma et al. 1981). Mediante la colecta de diferentes muestras de agua de un lago en Springfield, EUA durante 1980 y 1981, se determinó que el agua contenía residuos con actividad genotóxica ya que indujo micronúcleos en las tétradas de Tradescantia (Ma et al. 1985). Siegfried et al. (1992), determinan la genotoxicidad del ácido tánico que comúnmente se utiliza como aditivo para alimentos y aún más para todo tipo de bebidas como vino, cerveza, te y café por medio Trad-MCN. Por otra parte el arsénico, dieldrín, tetracetato y una mezcla de ellos fueron evaluados por la prueba de Trad-MCN demostrándose su actividad genotóxica (Gill et al. 1992). Con el sistema Trad-MCN se logró evaluar la genotoxicidad de muestras de agua del lago Hongzhe en China, notándose que existen uno o varios agentes con actividad mutagénica sobre Tradescantia clon 4430 (Yang 1999). También se tienen datos de la clastogenicidad provocada por partículas colectadas en muestras de aire de lugares con tráfico vehicular, dando resultados positivos (Monarca et al. 1999). Asimismo 140 agentesquímicos y físicos fueron evaluados, para determinar su posible mutagenicidad relacionados con la salud humana, se probaron sustancias de uso común en forma liquida y gaseosa, así como diferentes tipos de radiación y muchas de ellas fueron positivas con este sistema (Ma et al. 1984). 22 III. HIPÓTESIS Los insecticidas piretroides contenidos en las diferentes marcas comerciales de vaporizadores eléctricos ocasionan daño genético en las células madres de polen de Tradescantia clon 4430. IV. OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL • Evaluar la inducción de micronúcleos en las células gaméticas de Tradescantia clon 4430 por insecticidas piretroides y la relación de la respuesta con el tiempo de exposición. OBJETIVO ESPECIFICO • Evaluar el efecto genotóxico de la esbiotrina ó d-aletrina contenida en tres diferentes vaporizadores elèctricos (Raid 45 noches, Baygon plaquitas y Raid plaquitas) en las células madres del polen de Tradescantia clon 4430 y comparar su efecto. V. MATERIALES Y MÉTODOS Selección de la sustancia tóxica: piretroides. Con el objeto de seleccionar los piretroides que se emplearon para verificar sus efectos genotóxicos se realizó, en la ciudad de Querétaro, una encuesta acerca del consumo doméstico en diferentes sitios de la ciudad, encontrándose que el 80 % utilizaban insecticidas liberados por un vaporizador 23 eléctrico, cuyo ingrediente activo fue un piretroide y el 20 % restante utilizaban otro tipo de insecticida. La razón que dieron de su uso estaba basada en la propaganda de los medios televisivos que mencionan que, como se indicó antes, estos de productos pueden ser empleados con confianza por no ser tóxicos para el hombre. Al realizar la búsqueda de este tipo de insecticidas en el supermercado se notó que sus presentaciones en aerosol, líquida y en espirales contienen como ingrediente activo a un piretroide lo que da idea de que estos insecticidas día con día acaparan el mercado, aumentando así el riesgo de estar expuestos a ellos. Con base en esto se consideró de importancia llevar a cabo estudios con estos insecticidas y se seleccionaron tres de los más empleados en la ciudad de Querétaro en presentación de vaporizador eléctrico que son: Raid eléctrico 45 noches, Raid Plaquitas y Baygon Plaquitas (figura 5). Figura 5 Presentación comercial de los tres vaporizadores eléctricos. Raid eléctrico 45 noches Raid plaquitas Baygon plaquitas ElECTRICO 11''''-UlfII DlIIC 24 El insecticida Raid eléctrico 45 noches (Johnson), está compuesto de una mezcla líquida de ingrediente activo la esbiotrina (2,2-dimetil-3-(2-metil-1- propenil) ciclopropanocarboxilato de 2-metil-4-oxo-3-(2-propenil)-2-ciclopenten-1- ilo) con algunos compuestos inertes. Según la etiqueta, contiene esbiotrina, 200 g/kg, dihidrobutiltolueno (HBT) 200 g/kg, además de otros compuestos inertes no especificados. En el caso del Raid Plaquitas (Johnson), cada laminita contiene 100 mg de lo siguiente: esbiotrina 200 g/kg, y de ingrediente inerte 800 g/kg. El Baygon Plaquitas (Bayer) contiene según su etiqueta: d-aletrina 40 mg, 77 mg de coadyuvante, colorante y perfume, así como 883 mg de celulosa inerte. Es importante mencionar que después de una exhaustiva búsqueda se llegó a la conclusión de que la esbiotrina y la d-aletrina es el mismo compuesto por lo que los tres vaporizadores eléctricos contienen el mismo ingrediente activo. Esto fue difícil de lograr porque los fabricantes retienen la información. Mantenimiento del material biológico y su propagación Las plantas de Tradescantia clon 4430 se mantuvieron en un invernadero del Centro de Estudios Académicos sobre Contaminación Ambiental de la Universidad Autónoma de Querétaro. Esta planta es un híbrido entre T. hirsutiflora y T. subacaulis, que requiriere condiciones óptimas para su crecimiento y su mantenimiento por lo que debe estar en un invernadero (figura 6) ó en una cámara de crecimiento para proporcionar material durante todo el año. Esta planta necesita una intensidad de luz fluorescente de alrededor de 1,800 pies-candela y de luz incandescente de 180 pies-candela en la punta de la planta, la temperatura adecuada debe ser entre 19 y 25 0C y de noche alrededor de 16 0C. La humedad relativa debe ser entre 60 y 80 % (Programa Internacional de Seguridad Química 1988). Ya que el clon es estéril porque presenta autoincompatibilidad, la propagación en macetas se lleva a cabo mediante la separación del tallos del macoyo de la planta madre. Durante este proceso de reproducción vegetativa, algunas de las plantas viejas deben de ser removidas o bien cortadas en la 25 punta para permitir que los retoños jóvenes crezcan. La tierra común que se utilizó para cada maceta se preparó de la siguiente forma (dos partes de tierra, una de hojarasca de encino y una de arena de río). Después de un mes de llevarse a cabo la propagación, a cada maceta se le agrega la siguiente mezcla de fertilizantes: nitrógeno (0.4602 g/maceta), fósforo (0.967 g/maceta), potasio (0.157 g/maceta) y micronutrientes (0.028 g /maceta) (Rodríguez et al.1996) La fertilización se repite mensualmente, se procede al riego con agua de la llave a saturación para que la mezcla de nutrientes se disuelva en la tierra. Figura 6. Plantas de Tradescantia en condiciones de fotoperiodo, humedad y temperatura controladas en un invernadero en la Universidad Autónoma de Querétaro. 26 VI. DISEÑO EXPERIMENTAL: Proceso de tratamiento Se seleccionaron 20 plantas con inflorescencias jóvenes para cada grupo y se hicieron cortes a nivel del tallo de aproximadamente 10 cm de largo, después se colocaron en solución nutritiva de Hoagland. Los cortes de Tradescantia fueron introducidos a una cámara de vidrio cerrada conteniendo el insecticida. Los tiempos de exposición con cada uno de los tres vaporizadores eléctricos fueron de 2, 4, 6, 8, 10 y 12 horas, los testigos negativos y el positivo (hidrazida málica 1mM) se mantuvieron por el mismo período dentro de una cámara (figura 7) sin insecticida. Figura 7. Cámara para la exposición de los cortes de Tradescantia a los diferentes vaporizadores eléctricos. 27 Recuperación Después de la exposición de las plantas se les dio un tiempo de recuperación en función a la duración del tratamiento, haciendo un total de 30 ó 36 horas, por ejemplo 12 h de tratamiento y 24 h de recuperación. Posteriormente los cortes sumergidos en solución nutritiva de Hoagland fueron llevados al invernadero con aireación constante y temperatura óptima (Figura 8) hasta cumplir el tiempo de recuperación necesario para que las células dañadas en profase 1, continúen su división y alcancen la etapa de tétrada, fase en la cual se realiza la observación (Ma et al. 1978). Figura 8. Recuperación de los cortes de Tradescantia después de ser sometidos a la acción del piretroide. 28 Fijación Las inflorescencias fueron cortadas de sus tallos y colocadas en una solución de etanol-ácido acético (3:1) por un período de 24 horas. Una vez concluido éste tiempo, se disectaron para realizar las preparaciones o se conservaron en etanol al 70 %. Realización de preparaciones Por su tamaño entre 2 y 3.5 mm se toma la yema que contiene células en etapa de tétrada, se disecta, se separan las anteras sobre un portaobjetos y se exprimen para liberar las células meióticas en una gota de acetocarmin al 0.5 %, se corrobora la presencia de tétradas en un microscopio óptico, de corresponder a la etapa correcta se quitan los desechos y se coloca el cubreobjetos. La preparación se calienta de 2 a 3 veces con una lámpara de alcohol, luego se presiona suavemente con la palma de la mano, amortiguando con una toalla de papel, esto con la finalidad de extender lastétradas para su mejor observación. Preparaciones permanentes Las preparaciones se hicieron permanentes siguiendo la técnica de Conger y Fairchild (1953). Se pusieron sobre hielo seco unos minutos y se les separó el cubreobjetos con un bisturí, para deshidratar a las células se les cambió rápidamente dos veces el butanol absoluto (Baker), posteriormente se montaron en bálsamo de Canadá y se dejaron secar a temperatura ambiente o en una estufa. Lectura de preparaciones Se leyeron 7 preparaciones de cada grupo experimental en un microscopio óptico bajo una amplificación de 40X. Se registró el número de células en etapa de tétrada que contenían 0, 1, 2, 3 ó más micronúcleos cuantificando un total de 500 células por preparación. Las lecturas se hicieron con clave para evitar prejuicios durante la observación y los resultados fueron anotados en hojas para registro de micronúcleos. La 29 cantidad de micronúcleos se dividió entre el número total de tétradas observadas, multiplicado por cien para obtener el porcentaje, posteriormente se obtuvo el promedio y el error estándar de cada grupo. Análisis estadístico de los datos Para comparar las diferencias entre los grupos testigos y tratados se obtuvo la mediana del número de micronúcleos observados, analizándose con el estadístico ¨U¨ de Mann Whitney. El nivel de significancia establecido fue p<0.05 (Winer 1971). Se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis para verificar las diferencias entre cada experimento y para observar una posible correlación de la frecuencia de micronúcleos con el tiempo de exposición se aplicó la correlación de Spearman. VII. RESULTADOS Los resultados obtenidos aparecen en los cuadros II a VI, en los que se presenta la respuesta de las células meióticas de Tradescantia clon 4430 cuando sus inflorescencias fueron sometidas a los vapores de los insecticidas cuyos nombres comerciales son: Raid eléctrico 45 noches, Raid Plaquitas y Baygon Plaquitas en una cámara cerrada por períodos de 2, 4, 6, 8, 10 y 12 horas durante la noche, para simular el uso doméstico. En el cuadro II se incluyen los promedios ± los errores estándar de los porcentajes de micronúcleos observadas en las células madres de polen de Tradescantia para cada grupo experimental con diferentes tiempos de exposición con el insecticida Raid 45 noches. En las exposiciones con duración de dos horas para cada experimento no hubo aumento significativo de micronúcleos (p>0.05, ¨U¨de Mann Whitney), mientras que para los siguientes tiempos de exposición 4, 6 y 8 horas, la frecuencia de MN fue mayor, encontrándose diferencias significativas para cada tiempo de exposición con respecto a sus testigos (p<0.05). 29 cantidad de micronúcleos se dividió entre el número total de tétradas observadas, multiplicado por cien para obtener el porcentaje, posteriormente se obtuvo el promedio y el error estándar de cada grupo. Análisis estadístico de los datos Para comparar las diferencias entre los grupos testigos y tratados se obtuvo la mediana del número de micronúcleos observados, analizándose con el estadístico ¨U¨ de Mann Whitney. El nivel de significancia establecido fue p<0.05 (Winer 1971). Se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis para verificar las diferencias entre cada experimento y para observar una posible correlación de la frecuencia de micronúcleos con el tiempo de exposición se aplicó la correlación de Spearman. VII. RESULTADOS Los resultados obtenidos aparecen en los cuadros II a VI, en los que se presenta la respuesta de las células meióticas de Tradescantia clon 4430 cuando sus inflorescencias fueron sometidas a los vapores de los insecticidas cuyos nombres comerciales son: Raid eléctrico 45 noches, Raid Plaquitas y Baygon Plaquitas en una cámara cerrada por períodos de 2, 4, 6, 8, 10 y 12 horas durante la noche, para simular el uso doméstico. En el cuadro II se incluyen los promedios ± los errores estándar de los porcentajes de micronúcleos observadas en las células madres de polen de Tradescantia para cada grupo experimental con diferentes tiempos de exposición con el insecticida Raid 45 noches. En las exposiciones con duración de dos horas para cada experimento no hubo aumento significativo de micronúcleos (p>0.05, ¨U¨de Mann Whitney), mientras que para los siguientes tiempos de exposición 4, 6 y 8 horas, la frecuencia de MN fue mayor, encontrándose diferencias significativas para cada tiempo de exposición con respecto a sus testigos (p<0.05). 30 Cuadro II. Porcentaje de micronúcleos en tétradas de Tradescantia expuestos a vapores del insecticida Raid 45 noches. Con los tiempos de exposición de 10 y 12 horas no se presentó genotoxicidad, pero se provocó marchitamiento y color amarillo de las hojas y los tallos mostraron flacidez. Se aplicó el análisis de regresión el cual nos demuestra que no existe correlación de los valores obtenidos con 2, 4, 6, 8, 10 y 12 horas de exposición y las frecuencias de micronúcleos (p=0.876, r=0.0395) (Figura 9). Horas de exposición Tétradas analizadas Experimento I Experimento II Experimento III Testigo Tratado Testigo Tratado Testigo Tratado x ± E.E. x ± E.E. x ± E.E. x ± E.E. x ± E.E. x ± E.E. 2 3500 2.0 ± 0.54 1.2 ± 0.41 2.0 ± 0.26 1.9 ± 0.12 2.3 ± 0.50 3.0 ± 0.29 4 3500 1.9 ± 0.30 3.9 ± 0.40* 1.7 ± 0.49 3.9 ± 1.00* 1.8 ± 0.55 3.5 ± 0.59* 6 3500 1.9 ± 0.30 3.5 ± 0.29* 1.7 ± 0.56 3.9 ± 0.41* 2.5 ± 1.02 5.6 ± 1.12* 8 3500 2.3 ± 0.50 6.1 ± 0.72* 2.7 ± 0.45 5.3 ± 1.02* 2.5 ± 0.39 7.4 ± 1.94* 10 3500 3.2 ± 0.28 3.3 ± 0.51 3.3 ± 0.34 3.4 ± 0.35 2.9 ± 0.46 2.8 ± 0.47 12 3500 1.4 ± 0.22 1.9 ± 0.81 2.1 ± 0.37 1.2 ± 0.14 3.9 ± 0.34 3.7 ± 0.39 Significativo* p<0.05 31 Para conocer la distribución de los datos de las frecuencias de micronúcleos, aunque sea de forma preliminar o exploratoria, en los grupos de los testigos y los tratados se hicieron diagramas de caja y bigotes con el método de Tukey, este análisis, además, muestra los valores extremos y los datos posiblemente erróneos comúnmente llamados “0utliers” (Winer 1971). Estos diagramas ubican a la mediana, más que al promedio, en la posición central de cada caja, dividiendo en dos partes la distribución de los datos. El rango o amplitud de la caja permite notar los valores mínimo y máximos normales; el rango intercuartil ayuda a describir la ubicación en la muestra total del 50 % de la distribución de los datos, no importando su forma en cada una de las cajas. En la figura 10 se muestran datos correspondientes al cuadro II, que presentan una tendencia hacia la derecha para el grupo de los testigos. para el caso de los tratados, la distribución es asimétrica hacia la izquierda y presenta valores de Y anormalmente atípicos (“outliers”). Figura 9. Análisis de regresión para el grupo tratado con el insecticida Raid eléctrico 45 noches. Horas de exposición F re cu e n ci a d e m ic ro n ú cl eo s/ 1 0 0 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 p=0.876 r=0.0395 e o o o o o o o o 8 o o o o o o 32 En el cuadro III aparecen los resultados promedio ± error estándar de los micronúcleos cuando los cortes de Tradescantia se sometieron a vapores del insecticida Baygon plaquitas y los valores no difieren estadísticamente de los testigos (p>0.05, ¨U¨ de Mann Whitney). F re cu en ci a de m ic ro nú cl eo s/ 10 0 0 2 4 6 8 Testigos Tratados Figura 10. Diagrama de caja que compara los porcentajes de micronúcleos en las tétradas de Tradescantia expuestos al insecticida esbiotrina y los testigos. Io o I 33 Cuadro III. Porcentaje de micronúcleos en tétradas de Tradescantia expuestos a vapores del insecticida Baygon plaquitas. El análisis de regresión (figura 11) determinó que no existe correlación de la frecuencia de micronúcleos con el tiempo de exposición al insecticida Baygon plaquitas (p=0.2520, r=0.2848). Horas de exposición Tétradas analizadas Experimento I Experimento II Experimento III Testigo Tratado Testigo Tratado Testigo Tratado x ± E.E. x ± E.E. x ± E.E. x ± E.E. x ± E.E. x ± E.E. 2 3500 2.6 ± 0.63 3.0 ± 0.81 3.0 ± 0.26 4.0 ± 1.0 2.7 ± 0.76 3.1 ± 0.61 4 3500 4.2 ± 1.02 5.0 ± 1.10 3.4 ± 0.98 5.9 ± 0.97* 4.3 ± 0.36 4.6 ± 0.50 6 3500 2.3 ± 0.30 4.3 ± 0.68 3.8 ± 0.14 3.6 ± 0.19 4.1 ± 0.55 5.3 ± 0.49 8 3500 3.0 ± 0.10 3.5 ± 0.59 4.5 ± 1.25 4.8 ± 0.98 3.3 ± 0.28 3.4 ± 0.27 10 3500 3.6 ± 0.16 3.4 ± 0.06 3.3 ± 0.24 3.3 ± 0.07 3.6 ± 0.12 4.4 ± 0.39 12 3500 1.8 ± 0.33 2.9 ± 0.20 3.2 ± 0.37 3.3 ± 0.51 3.1 ± 0.29 3.9 ± 0.41 Significativo* p<0.05 34 El análisis exploratorio de los datos (figura 12) demuestra que la tendencia de los testigos es ligeramente asimétrica hacia la derecha con un valor atípico mientras que el grupo de los tratados se comporta de manera asimétrica con tendencia hacia la derecha sin algún valor atípico (Winer 1971) Horas de exposición F re cu en ci a de m ic ro nú cl eo s/ 10 0 0 2 4 6 8 10 12 2.9 3.4 3.9 4.4 4.9 5.4 5.9 6.4 Figura 11. Análisis de regresión para el grupo de tratados con el insecticida d- aletrina. p=0.2520 r=0.2848 <> <> <> <> <> <> <> <> 35 En el cuadro IV no se observó diferencia significativa de la frecuencia de micronúcleos con respecto a los testigos para cada experimento, a los distintos tiempos de exposición (p>0.05, ¨U¨ de Mann Whitney), ni tampoco correlación entre la frecuencia de MCN de los grupos tratados y los tiempos de exposición al aplicar un análisis de regresión simple (p=0.4956, r= 0.1717) (figura 13). El análisis exploratorio de los datos (figura 14) muestra que la distribución de los mismos, tanto para el grupo de los tratados como los testigos de los tres experimentos tienen una tendencia hacia la izquierda presentando una asimetría sin ningún valor atípico sobre el eje Y. F re cu en ci a de m ic ro nú cl eo s/ 10 0 1.5 2.5 3.5 4.5 5.5 6.5 7.5 Testigos Tratados Figura 12. Diagrama de caja de los porcentajes de micronúcleos en tétradas de Tradescantia inducidos para los testigos y tratados en los tres experimentos expuestos al insecticida d-aletrina. + I o 36 Cuadro IV. Porcentaje de micronúcleos en tétradas de Tradescantia expuestos a vapores del insecticida Raid Plaquitas. Horas de exposición Tétradas analizadas Experimento I Experimento II Experimento III Testigo Tratado Testigo Tratado Testigo Tratado x ± E.E. x ± E.E. x ± E.E. x ± E.E. x ± E.E. x ± E.E. 2 3500 3.5 ± 0.57 4.5 ± 1.32 2.3 ± 0.45 2.5 ± 0.39 4.3 ± 1.20 4.8 ± 1.50 4 3500 3.8 ± 0.57 3.8 ± 0.65 3.1 ± 0.24 2.8 ± 0.32 3.9 ± 0.40 3.1 ± 0.28 6 3500 3.6 ± 0.47 4.7 ± 0.71 4.3 ± 1.20 4.2 ± 1.10 2.0 ± 0.54 2.5 ± 0.39 8 3500 3.5 ± 0.59 4.1 ± 0.52 2.7 ± 0.32 3.2 ± 0.20 3.4 ± 0.28 3.4 ± 0.30 10 3500 2.9 ± 0.74 3.1 ± 0.37 3.9 ± 0.34 3.8 ± 0.12 3.6 ± 0.12 4.4 ± 0.39 12 3500 3.0 ± 0..76 4.5 ± 1.39 3.0 ± 1.65 4.1 ± 1.17 4.0 ± 0.14 3.9 ± 0.41 37 Horas de exposición F re cu en ci a de m ic ro nú cl eo s/ 10 0 0 2 4 6 8 10 12 2.5 2.9 3.3 3.7 4.1 4.5 4.9 5.3 Figura 13 Análisis de regresión para el grupo de tratados con el insecticida Raid-plaquitas. p=0.4956 r=0.1717 <> <> <> <> <> o <> <> <> 38 En el cuadro V aparecen los resultados de micronúcleos cuando los cortes de Tradescantia se sometieron a vapores de hidrazida málica 1mM (herbicida) como testigo positivo, presentándose diferencia significativa con p <0.05 (¨U¨ de Mann Whitney) en las exposiciones de 2, 4, 6, 8 y 10 horas. Mientras que para las 12 horas de exposición se presentó daño fisiológico (marchitamiento de las plantas con color amarillento) lo que impidió el análisis de los micronúcleos en este grupo. F re cu en ci a de m ic ro nú cl eo s/ 10 0 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 Testigos Tratados Figura 14 Diagrama de caja que compara los porcentajes de micronúcleos en tétradas de Tradescantia en los grupos testigo y tratados en los tres experimentos expuestos al insecticida Raid-plaquitas. f-t- f- f- T f- 1 1 + f- + - l F- _1 E:... - 39 Se encontró que existe correlación entre el porcentaje de micronúcleos de los tratados con hidrazida málica de los tres experimentos y el tiempo de exposición (p= 0.003, r = 0.8064) (figura 15), mientras que el gráfico de cajas y bigotes (figura 16) muestra la distribución de los datos de los dos grupos, testigos y tratados durante los tres experimentos, los testigos casi presentan una simetría mientras que el grupo tratado tiende a presentarse hacia la izquierda sin ningún valor atípico para los dos grupos. Horas de exposición Tétradas analizadas Experimento I Experimento II Experimento III Testigo Tratado Testigo Tratado Testigo Tratado x ± E.E. x ± E.E. x ± E.E. X ± E.E. x ± E.E. x ± E.E. 2 3500 3.7±0.57 6.5±1.32* 3.6±0.45 6.8±0.39* 3.3±1.20 6.3±1.50* 4 3500 3.2±0.57 5.8±0.65* 2.5±0.24 8.7±0.32** 3.0±0.40 7.5±0.28** 6 3500 3.1±0.47 6.0±0.71* 3.5±1.20 9.3±1.10** 3.7±0.54 9.0±0.39** 8 3500 3.3±0.59 11.6±0.52** 4.3±0.32 10±0.20** 4.4±0.28 10.1±0.30** 10 3500 3.6±0.74 9.9±0.37** 3.6±0.34 9.9±0.12** 3.9±0.12 10.4±0.39** Significativo*p<0.05 Muy significativo**p<0.01 Cuadro V. Porcentaje de micronúcleos en tétradas de Tradescantia expuestos a vapores de hidrazida málica como testigo positivo. 40 Horas de exposición F re cu en ci a de m ic ro nú cl eo s/ 10 0 0 2 4 6 8 10 5.8 7.3 8.8 10.3 11.8 Figura 15. Análisis de regresión para el grupo de tratados con la hidrazida málica p=0.003 r=0.8064 <> <> <> <> 41 Como solo para el insecticida Raid 45 noches se encontraron diferencias significativas en los porcentajes de micronúcleos (p <0.05, ¨U¨ de Mann Whitney) (cuadro II), que fue el único de los piretroides que contiene un disolvente, el dihidrobutiltolueno (HBT), entonces se realizó un experimento nuevo aplicando la misma concentración que indica su formulario en la etiqueta 200 g/kg. Estos resultados se presentan en el cuadro VI y muestra que para los tres tiempos de exposición y sus réplicas hubo diferencias significativas con sus respectivos testigos. F re cu en ci a de m ic ro nú cl eo s/ 10 0 0 2 4 6 8 10 12 Testigos Tratados Figura 16 Diagrama de caja que compara los porcentajes de micronúcleos en tétradas de Tradescantia en los grupos testigo y tratados en los tres experimentos expuestos a hidrazida málica. I + I 42 Cuadro VI Porcentaje de micronúcleos en tétradas de Tradescantia expuestos a vapores del dihidrobutiltolueno. El análisis de regresión determinó que no existe una correlación , dado que el valor de p es mayor que 0.05 (p=0.2253) y el coeficiente de correlación fue (r=0.449). Lo que significa que no existe relación entre los tratados de los tres experimentos con las horas de exposición (figura17). Horas de exposición Tétradas analizadas Experimento I Experimento II Experimento III Testigo Tratado Testigo Tratado Testigo Tratado x ± E.E. x ± E.E. x ± E.E. x ± E.E. x ± E.E. x ± E.E. 4 3500 2.5 ± 0.08 4.4 ± 0.09 * 2.9 ± 0.11 4.9 ± 0.21* 2.7 ± 0.06 4.9 ± 0.21* 6 3500 2.5 ± 0.06 4.7 ± 0.10* 2.6 ± 0.08 4.7 ± 0.11* 3.1 ± 0.14 4.9 ± 0.19* 8 3500 2.7 ± 0.08 4.9 ± 0.15* 2.9 ± 0.08 4.7 ± 0.21* 3.0 ± 0.15 5.7 ± 0.14* Significativo* p<0.05 43 Mientras que en el gráfico de cajas y bigotes del análisis exploratorio de Tukey En la figura 18 se observa la distribución de los datos (porcentaje de micronúcleos), tanto para el grupo testigo como los tratados con el dihidrobutiltolueno (HBT). La prueba no paramétrica ¨U¨ de Mann Whitney nos permite demostrar que si existe diferencia significativa entre estos dos grupos a una p<0.01. Horas de exposición F re cu e n ci a d e m ic ro n ú cl eo s/ 1 0 0 2 4 6 8 10 4.4 4.7 5 5.3 5.6 5.9 Figura 17. Análisis de regresión para el grupo de tratados con dihidrobutiltolueno. p=0.2253 r=0.449 o 44 F re cu en ci a de m ic ro nú cl eo s/ 10 0 2.5 3.5 4.5 5.5 6.5 Testigos Tratados Figura 18. Diagrama de caja de los porcentajes de micronúcleos en tétradas de Tradescantia inducidos en los tres experimentos expuestos y no expuestos al dihidrobutiltolueno (HBT). " ± I 45 VIII. DISCUSION Las frecuencias de micronúcleos inducidas por las exposiciones a 4, 6 y 8 horas a Raid eléctrico 45 noches (cuadro II), corroboran lo observado por Das et al. (1994), quienes encuentran una incidencia alta de aberraciones cromosómicas y de micronúcleos en los macrófagos de los alvéolos pulmonares en ratas que estuvieron expuestas intermitentemente a vapores estáticos del insecticida piretroide esbiotrina (el mismo que contiene el Raid eléctrico 45 noches) en una cámara de inhalación cerrada por 1 día (15 min/h, 8 /h/día). En nuestros experimentos en los tiempos de exposición de 10 y 12 horas (cuadro II), no se encontró diferencia significativa con respecto al testigo negativo. Aunque los piretroides se han reportado en Salmonella como no mutagénicos, en células V79 de criceto (Bartsch et al. 1980) y en células de mamíferos in vivo fueron clastogénicos (Ammer y Aboul Ela 1985, Bhunya y Pati 1988, 1990, Pati y Bhunya 1989). Liu y Wong (1987), Liu y Sun (1988) y Liu et al. 1989) observaron cambios morfológicos y bioquímicos en células del tracto respiratorio en ratas que fueron expuestas a vapores liberados a partir del piretroide (cipermetrina). Esto implica que estos insecticidas podrían ser riesgosos en cuanto a toxicidad y a permanencia en el ambiente y posiblemente repercutir sobre la salud humana. En los cuadros III y IV, se muestran los porcentajes de micronúcleos producidos con los otros dos vaporizadores eléctricos, Baygon plaquitas y Raid plaquitas, cuyos valores no difieren estadísticamente con los testigos. Cabe mencionar que los insecticidas comerciales se presentan en una plaquita de cartón impregnada del insecticida piretroide esbiotrina, en el primer caso a la concentración de 40 mg y en el segundo de la mitad (20 mg), mientras que en el Raid eléctrico 45 noches la esbiotrina se encuentra exactamente en la misma concentración que el Raid Plaquitas pero es una mezcla líquida con el disolvente dihidrobutiltolueno (HBT). Es posible que en ocasiones los efectos toxicológicos o genotóxicos que se adjudican a los insecticidas pueden ser provocados por sus agentes inertes o emulsificantes como lo indica la Agencia de Protección 46 Ambiental de los EUA (EPA 1999). Entre los más comunes son los destilados de petróleo que pueden ser mezclas de hidrocarburos aromáticos o como el tolueno o xileno (fuertemente odoríferos) que estabilizan la solución del insecticida o lo hacen más emulsificante Van-Kreijl y Sloof (1985) y Mavournin et al. (1990), reportan la eficiencia del tolueno en inducir aberraciones cromosómicas y al liberar compuestos orgánicos cuando exponen la kerosina a una fuente de calor, inducen mutaciones en Salmonella typhimurium (Mumford et al. 1992). Löfroth (1988), menciona que las partículas colectadas durante la combustión del insecticida piretroide, resmetrina de tipo espiral que poseen además compuestos inertes, deben también de influir en los resultados encontrados con la prueba de Ames (Salmonella typhimurium), ya que se inducen mutaciones revertantes con este bioensayo. También se ha encontrado que el tolueno produce aberraciones de tipo subcromatídico en Vicia faba (haba) en tiempos de exposición de 1 a 2 horas (Gómez-Arroyo et al. 1986). Como el dihidrobutiltolueno es un ingrediente catalogado inerte en la mezcla líquida del insecticida Raid 45 noches (esbiotrina), podría ser el causante del daño genotóxico observado en Tradescantia y esto concuerda con lo mencionado por Das y Sahu (1996), que seria importante probar los diferentes componentes de este tipo de insecticidas para determinar en que proporción esta contribuyendo cada componente en provocar daño al ADN. Para corroborar esto, se realizó otro experimento solo con los tiempos de exposición que resultaron significativos con el insecticida Raid 45 noches (4, 6 y 8 h), en el que se utilizó el dihidrobutiltolueno (HBT) en la proporción marcada en la etiqueta. Los resultados demostraron diferencias significativas (p<0.05) con respecto al testigo para los tres tiempos de exposición aplicados por lo que se puede considerar que el ingrediente ¨inerte¨, el dihidrobutiltolueno (HBT) en la mezcla del Raid 45 noches es el responsable de la producción de los micronúcleos en la células gaméticas de Tradescantia. En el cuadro V están los resultados de la exposición al plaguicida hidrazida málica empleado como testigo positivo. La frecuencia de micronúcleos 47 se incrementa conforme aumenta el tiempo de exposición existiendo una relación tiempo de exposición respuesta p=0.0003 con 2, 4, 6, 8 y 10 horas mientras que, en 12 horas no se pudieron realizar las lecturas correspondientes; ya que se observó marchitamiento con color amarillento que hace suponer que hubo retardo en la meiosis, lo que explica lo ocurrido con el cuadro II, en las exposiciones de 10 y 12 horas en que se observan algunas manchas amarillentas, en este caso no se pudieron realizar las lecturas y no se encontraron diferencias significativas entre los experimentos (p>0.05, ¨U¨ de Mann Whitney). Los piretroides son insecticidas sintéticos que se han ido introduciendo en los mercados sustituyendo tal vez a los que comparados con éstos ocasionan mayor daño a la salud. En algunos trabajos ya mencionados se cita a estos insecticidas como seguros para la salud humana por su baja toxicidad, mientras que en otras investigaciones se cuestiona hasta que punto se les puede considerar de esta manera, ya que continuamente su estructura está siendo modificada para incrementar su persistencia en el ambiente. Una gama de insecticidas piretroides como resmetrina, esbiotrina, cipermetrina, transflutrina y bifentrina, entre otros, se han encontrado en una variedad de marcas de insecticidas y son utilizados para el control intramuros de insectos voladores en lugares como casas habitación, hospitales, restaurantes, escuelas, oficinas, supermercados, guarderías, asilos, cines y hoteles. IX. CONCLUSIONES Los efectos toxicológicos que se adjudican a los insecticidas en diversas ocasiones es posible que sean debidos a otros agentes como los inertes o los emulsificantes, que son sustancias que se añaden a los plaguicidas para incrementar el poder letal de los ingredientes activos. En este trabajose dedujo que el producto conocido como Raid eléctrico 45 noches que tiene como ingrediente activo al piretroide esbiotrina o d-aletrina, en una mezcla 48 IX. CONCLUSIONES Los efectos toxicológicos que se adjudican a los insecticidas en diversas ocasiones es posible que sean debidos a otros agentes como los inertes o los emulsificantes, que son sustancias que se añaden a los plaguicidas para incrementar el poder letal de los ingredientes activos. En este trabajo se dedujo que el producto conocido como Raid eléctrico 45 noches que tiene como ingrediente activo al piretroide esbiotrina o d-aletrina, en una mezcla considerada inerte que actúa como inductora de genotoxicidad, que no produce el ingrediente activo. La US-EPA menciona que existen en la actualidad una enorme cantidad de sustancias inertes que son utilizadas como disolventes de diversos productos químicos y lo más preocupante es que no se conoce aun su toxicología (EPA 1999). La utilización de algunos sistemas biológicos para monitorear el ambiente in situ o in vitro son herramientas muy versátiles en la mutagénesis y en la citogenética actual, la finalidad de estos sistemas es establecer el nexo que existe entre los factores ambientales a los que está expuesto el organismo y el desarrollo de alteraciones biológicas como resultado a dicha exposición. 49 X. REFERENCIAS Amer M.S. y Aboul-Ela E. (1985). 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Neurotoxicology of pyrethrin and the pyrethroid Portada Índice Resumen I. Introducción II. Antecedentes III. Hipótesis IV. Objetivos V. Materiales y Métodos VI. Diseño Experimental VII. Resultados VIII. Discusión IX. Conclusiones X. Referencias
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