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Miranda
Rios

 



Suplente

 Dr.
José
Luis
Reyes
Taboada

 



Suplente

 Dr.
Jesús
Valdés
Flores
 









CONTENIDO

RESUMEN
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 1

ABSTRACT
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 2

INDICE
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 3

ABREVIATURAS
UTILIZADAS
 
 
 
 
 
 
 6

I.
INTRODUCCION
 
 
 
 
 
 
 
 
 7

A.
Las
Plantas
y
el
estrés
por
déficit
hídrico
 
 
 
 7

B.
Regulación
de
la
expresión
genética
por
RNAs
pequeños
 
 10

C.
Silenciamiento
de
genes
por
RNAs
pequeños
de
interferencia
(siRNA)

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 11

C.1.
Mecanismo
de
Co‐supresión
 
 
 
 
 11

C.2.
Mecanismo
de
silenciamiento
por
RNAs
que
actúan
en
trans

(tasiRNAs)
 
 
 
 
 
 
 
 15

C.3.
Mecanismo
de
defensa
anti‐viral
 
 
 
 18

D.
Silenciamiento
de
genes
por
microRNAs
 
 
 
 22

II.
HIPÓTESIS
29

III.
OBJETIVO
GENERAL
 29

III.1
Objetivos
Particulares
 29

IV.
RESULTADOS
 30

E.
Tratamientos
de
estrés
en
plántulas
de
frijol.
 
 
 
 30

F.
Construcción
y
análisis
de
bibliotecas
de
RNAs
pequeños.
 
 31

G.
Análisis
de
miRNAs
conservados
y
nuevos
candidatos
en
Phaseolus

vulgaris
 
 
 
 
 
 
 
 
 34

H.
Análisis
de
dos
RNAs
pequeños
clonados
e
identificación
de
sus

mensajeros
blanco.
 
 
 
 
 
 
 
 35

H.1
Un
nuevo
microRNA
conservado
en
leguminosas.
 
 35

I.
El
pvu‐miRRH18
es
un
miRNA*.
 
 
 
 
 
 40

J.
Probables
mRNAs
regulados
por
pvu‐miRRH18/miR482*.
 
 44

K.
Pvu‐small
RNA‐1,
una
historia
de
sequía.
 
 
 
 45

L.
Biogénesis
de
pvu‐sRNA‐1.
 
 
 
 
 
 45

L.1.
Fosforilación
del
extremo
5’.
 
 
 
 
 45

L.2.
Metilación
del
extremo
3’.
 
 
 
 
 46

M.
 Dependencia
de
DCL‐1
en
su
procesamiento.
 
 
 46

N.
Acumulación
de
pvu‐sRNA‐1
como
un
miRNA
o
un
siRNA
en
la

infección
por
Potyvirus.
 
 
 
 
 
 
 47

Ñ.
¿Existe
un
pre‐miRNA
de
pvu‐RNA‐1?
 
 
 
 
 49

O.
Acumulación
diferencial
del
pvu‐sRNA‐1.
 
 
 
 54

P.
Análisis
de
los
probables
mensajeros
blanco
de
pvu‐sRNA‐1
 
 56

Q.
Ensayos
para
conocer
la
función
del
pvu‐sRNA‐1.
 
 
 64

Q.1.
Transformaciones
estables
en
Hairy
roots
con
un
gen

reportero
susceptible
a
pvu‐sRNA‐1.
 
 
 
 64

Q.2.
Transformaciones
transitorias
del
gen
reportero
susceptible
a

pvu‐sRNA1
con
el
Pre‐artificial‐miR‐sRNA1
(a‐miR‐1).
 
 66

V.
DISCUSIÓN
69

R.
Obtención
de
material
biológico,
construcción
y
análisis
de
bibliotecas

de
RNAs
pequeños.
 
 
 
 
 
 
 
 69

S.
Análisis
de
miRNAs
conservados
en
Phaseolus
vulgaris
 
 70

T.
Análisis
de
dos
RNAs
pequeños
clonados
e
identificación
de
sus

mensajeros
blanco.
 
 
 
 
 
 
 
 71

T.1.
Un
nuevo
microRNA
conservado
en
leguminosas.
 
 71

T.2.
El
microRNA‐RH18
es
un
miRNA*
y
los
probables
mensajeros

regulados
por
pvu‐miRRH18/miR482*.
 
 
 
 73

U.
Pv‐small
RNA‐1,
una
historia
de
sequía.

 
 
 
 75

U.1.
Biogénesis
de
Pv‐sRNA‐1.
 
 
 
 
 75

U.2
Patrones
de
expresión
de
pvu‐sRNA1
 
 
 
 76

U.3.
Probables
mensajeros
blanco
y
ensayos
para
conocer
la

función
de
pvu‐sRNA‐1.
 
 
 
 
 
 77

VI.
CONCLUSIONES
 
 
 
 
 
 
 
 
 80

VII.
PERSPECTIVAS
 
 
 
 
 
 
 
 
 81

VIII.
MATERIALES
Y
MÉTODOS
 
 
 
 
 
 
 82

Cultivo
de
plántulas
 
 
 
 
 
 
 
 82

Plántulas
de
frijol
 
 
 
 
 
 
 
 82

Plántulas
de
Arabidopsis
thaliana

y
Nicotiana
tabacum
 
 
 82

Cultivo
de
diferentes
leguminosas
y
monocotiledoneas.
 
 
 83

AISLAMIENTO
DE
RNAs
PEQUEÑOS
 
 
 
 
 83

Purificación
de
RNA.

 
 
 
 
 
 
 83

Construcción
de
bibliotecas
de
RNAs
pequeños.
 
 
 
 84

IDENTIFICACION
DE
RNAs
PEQUEÑOS
 
 
 
 
 85

Electroforesis
de
RNAs
pequeños
en
geles
de
poliacrilamida

desnaturalizantes
al
15%.
 
 
 
 
 
 
 85

Electroforesis
de
RNAs
pequeños
en
geles
de
poliacrilamida

desnaturalizantes
al
20%.
 
 
 
 
 
 
 85

Marcaje
de
sondas
 
 
 
 
 
 
 
 86

Ensayos
tipo
Northern
blot
para
microRNAs
 
 
 
 87

Ensayos
de
defosforilación
 
 
 
 
 
 
 87

Ensayos
de
β‐eliminación
 
 
 
 
 
 
 87

Ensayos
de
5’RACE
modificado
 
 
 
 
 
 88

TRANSFORMACION
EN
DIFERENTES
PLANTAS
 
 
 
 89

Transformación
transitoria
en
Nicotiana
benthamiana
por
Agrobacterium

tumefaciens
(PGV2260/C58)

 
 
 
 
 
 89

Transformación
en
raíces
aéreas
de
Phaseolus
vulgaris
por
Agrobacterium

rhizogenes
(K599)
 
 
 
 
 
 
 
 90

Infección
por
Virus
del
Mosaico
Común
de
Frijol
(BCMV)
 
 
 90

Vectores
utilizados
 
 
 
 
 
 
 
 91

Tabla
de
oligonucleótidos
utilizados

 
 
 
 
 91

BIBLIOGRAFÍA
 
 
 
 
 
 
 
 
 95





RESUMEN 
 
Los RNAs pequeños de plantas son conocidos con los nombres de RNAs de interferencia 
(siRNAs) y micro RNAs (miRNAs), estos son secuencias de 21-24 nucleótidos que participan 
en el silenciamiento de la expresión genética, ya que pueden guiar eventos de silenciamiento 
transcripcional (Allshire, 2002) o bien, modular la traducción o estabilidad de un transcrito 
(Lee et al., 1993). Este último proceso se conoce como silenciamiento de genes 
postranscripcional (PTGS). Las plantas han desarrollado múltiples mecanismos de regulación 
de genes para contender con las condiciones de un día común de desarrollo, como son el 
riego/sequía, frío/calor, luz solar/oscuridad, infección por bacterias/virus etc. En los últimos 
años se ha explorado la participación de los RNAs pequeños en los procesos de desarrollo y 
morfogénesis de hojas y flores, así como en el déficit de fósforo y sulfato en el medio. En 
este proyecto de investigación se estudiaron a los miRNAs presentes en Phaseolus vulgaris 
(frijol), los cuales incluyen a miRNAs conservados y nuevos, así, como los probables 
mensajeros blanco regulados por estos miRNAs. De los nuevos miRNAs encontrados, se 
caracterizaron dos, incluyendo sus patrones de expresión y su conservación en otras 
especies. Todo este trabajo fue realizado para conocer su contribución en la respuesta a 
déficit hídrico por limitación de agua y conocer los mecanismos que provocan el desarrollo 
de estrategias por parte de las plantas para lograr su supervivencia y un buen 
funcionamiento ante este estrés. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ABSTRACT 
 
The small interfering RNAs (siRNA) and micro RNAs (miRNA) are 21-24 nucleotide sequences 
involved in the silencing of gene expression, including events that can guide transcriptional 
silencing (Allshire, 2002) or modulate the translation or stability of a transcript (Lee et al., 
1993). The later process is known as postranscriptional gene silencing (PTGS). Under normal 
conditions, plants have to contend with variations during commun developmental day, such 
as irrigation / drought, cold / heat, sunlight / darkness, infection by bacteria / virus etc. In 
recent years the involvement of small RNAs in development and morphogenesis of different 
plant organs has been explored, as well as under deficit of phosphorus and sulfate in the 
medium. In this research project we studied the miRNAs present in Phaseolus vulgaris 
(common bean), and their contribution in response to water deficit. miRNA mechanisms may 
be involved in the development of strategies that ensure their survival and proper 
functioning during stressful conditions. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
I. INTRODUCCION 
 
A. Las Plantas y el estrés por déficit hídrico 
 
Las plantas son organismossésiles, por tal motivo han desarrollado múltiples estrategias 
para adaptarse y contender ante diversos cambios ambientales, evitando daños y 
manteniendo su permanencia. Algunas de las condiciones ambientales que pueden estimular 
este tipo de respuestas son conocidas como estreses abióticos: deshidratación, inundación, 
temperaturas altas y bajas, excesiva salinidad, alta o baja intensidad de luz solar y 
deficiencia de minerales, entre otros (Buchanan et al., 2002). Así mismo, en las plantas se 
han seleccionado respuestas de defensa invasión de diferentes patógenos como virus, 
bacterias y hongos (estreses bióticos), que se presentan de manera natural. Las diferentes 
respuestas de las plantas ante los diversos cambios en el ambiente se han establecido en 
respuestas complejas que dependen de la severidad y/o duración del estrés; así como del 
estado del desarrollo, tipo de órgano de la planta y la posible interacción de múltiples 
estreses (Bray, 1997). 
Algunos estreses abióticos como sequía, salinidad y baja temperatura generan un 
déficit hídrico en las plantas, puesto que la pérdida de agua por transpiración en estas 
situaciones es mayor en relación a la toma de la misma debido a la disminución en su 
disponiblidad en el suelo (Bray, 1997). El déficit hídrico también se genera en condiciones 
normales durante procesos como la embriogénesis. En esta condición las plantas 
experimentan cambios en el volumen celular o en el área de las membranas, disminución o 
pérdida de turgor, modificación de la integridad de las membranas y pared celular perdiendo 
la interacción de proteína-ligando; así como, un incremento en la concentración de solutos 
intracelulares lo que lleva a un cambio en su potencial hídrico y osmótico lo que le permite 
ajutar su estatus hídrico a las nuevas condiciones del ambiente. Los diferentes cambios que 
sufre la célula vegetal, en particular aquellos relacionados con su cambio de volumen y, por 
tanto con modificaciones en las interacciones entre proteínas y ciertos ligandos ha sugerido 
un mecanismo similar al observado por bacterias y levaduras que construyen un sistema 
regulatorio de dos componentes, aunque éste no se ha podido esclarecer (Posas et al., 
1996). Como un mecanismo de protección para la maquinaria celular, tanto en el déficit 
hídrico como en la embriogénesis, se ha identificado la acumulación de proteínas altamente 
hidrofílicas conocidas como LEAs (late embryogenesis abundant), para las que se sugiere 
una función protectora durante estos proceso en donde la limitante es el agua (Battaglia et 
al., 2008). La mayor parte de estas proteínas pertenecen a una grupo de proteínas con 
características fisicoquímicas similares conocidas como hidrofilinas. 
En la respuesta fisiológica, una de las más importantes es la síntesis de osmolitos, los 
cuales son solutos compatibles que se acumulan sin interferir con la función de proteínas, 
para realizar ajustes osmóticos y mantener la turgencia celular. Los osmolitos incluyen 
aminoácidos como prolina, azúcares, alcoholes y compuestos de amonio cuaternarios. La 
síntesis de proteínas transportadores (acuaporinas), decanales iónicos (canales Na+/K+) y de 
acarreadores de iones y solutos es importantes ya que influyen en el control del transporte 
de agua y la tolerancia a la salinidad, ésta última generada por el incremento en las sales del 
suelo da la disminución en la disponibilidad del agua (Bray, 1997). 
Dentro de las respuestas metabólicas, diferentes estudios en Arabidopsis thaliana han 
servido para identificar distintas vías de señalización que regulan la expresión de genes y/o 
proteínas específicas en respuesta a estrés por déficit hídrico (Seki et al., 2001). Entre ellas, 
la fitohormonas ácido abscísico (ABA) ha sido íntimamente relacionado con la respuesta 
adaptativa, particularmente por su función como inductora de la expresión de específicas y, 
por tanto como uno de los señalizadores de este tipo de estrés, de cuyavía de señalización 
no se han podido reconocer a todos sus componentes (Covarrubias et al., 2006). Otra 
respuesta dependiente de ABA es la regulación del cierre de estomas para limitar la pérdida 
de agua por transpiración (Schroeder et al., 2001). El ABA también se encuentra involucrado 
en los procesos de desarrollo durante la maduración de la semilla para la adquisición de 
reservas nutritivas que en la semilla le confiere tolerancia a la desecación y dormancia 
(Finkelstein et al., 2002; Zhu, 2002). En los genes inducidos por ABA, se han encontrado 
elementos de respuesta en las zonas promotoras así como proteínas que reconocen a esos 
elementos que se requieren para que estos genes respondan a esta hormona. Uno de ellos 
es conocido como elemento de respuesta a ABA (ABRE). Otros elementos que no está 
relacionados con la respuesta al ABA pero si con a respueta al déficit hídrico han sido 
identificados, uno de ellos es el elemento de respuesta a deshidratación (DRE), lo cual es 
consistente on el hecho de que existen vías de respuesta a la limitación de agua 
dependientes del ABA (figura 1) (Baker et al., 1994; Covarrubias et al., 2006). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura
1.
Esquema
general
de
estrés
por
déficit
hídrico.
Resumen
de
eventos
relacionados
a
la
respuesta
por

déficit
 hídrico
 en
 distintas
 etapas
 del
 desarrollo
 de
 las
 plantas.
 En
 azule
 se
 presentan
 eventos
 de
 respuesta

dependientes
 a
 ABA
 y
 en
 verde
 se
 presentan
 eventos
 de
 respuesta
 que
 pueden
 ser
 independientes
 a
 ABA.

DREB,
 factores
 de
 transcripción
 de
 unión
 a
 elementos
 DRE.
 AREB,
 factores
 de
 transcripción
 de
 unión
 a

elementos
ARE.
MYB
y
MYC
factores
de
transcripción
de
unión
a
elementos
MYB
y
MYC.

 
Múltiples datos en la literatura muestran que la respuesta de las plantas al déficit 
hídrico se da a diferentes niveles los cuales deben ser regulados eficaz y eficientemente. 
Puesto que una buena parte de la respuesta se regula a nivel transcripcional, la mayor parte 
de los estudios han estado dirigidos a conocer los mecanismos relacionados con este nivel de 
regulación; sin embargo, cada vez hay mas evidencias de que la regulación a nivel post-
trancripcional juega un papel muy importante en la generación de una respuesta eficiente. 
Por ello, en este trabajo concentramos nuestra atención en el estudio de nuevas moléculas 
implicadas en los mecanismos de regulación post-transcripcional, específicamente en los 
RNAs pequeños involucrados en esta respuesta. 
B. Regulación de la expresión genética por RNAs pequeños 
La regulación de la expresión genética se lleva a cabo a diferentes niveles. Principalmente se 
ha estudiado la participación de proteínas en los procesos de regulación transcripcional, 
postranscripcional, traduccional y postraduccional. Sin embargo, el hecho de que 
recientemente se haya reconocido la función de algunos RNAs no codificantes en la 
regulación de la expresión genética a diferentes niveles, ha cambiado dogmas y ha abierto 
nuevas preguntas y líneas de investigación en esta área. Algunos de estos RNAs son 
llamados RNAs interferentes pequeños del inglés small interfering (siRNAs) (Ambros et al., 
2003) y otros se conocen como micro-RNAs (miRNAs) (Reinhart et al., 2002). Estos RNAs 
pequeños pueden guiar eventos nucleares como la metilación del DNA, lo cual provoca un 
silenciamiento transcripcional (Allshire, 2002) o bien, modular la degradación o estabilidad 
de un transcrito (Lee et al., 1993). Este último proceso se conoce como silenciamiento de 
genes postranscripcional (PTGS) en plantas, en animales se utiliza comúnmente el término 
de interferencia de RNA (RNAi) y “quelling” en hongos (Fagard et al., 2000). También se ha 
establecido que cierto tipo de RNAs pequeños son capaces de inhibir la traducción de un 
transcrito. El descubrimiento de moléculas de RNA pequeñas que datan desde el final de la 
década de los 80s y 90s, y su auge en estadécada, han abierto un nuevo universo 
relacionado a los mecanismos que la célula puede utilizar para modular la expresión de sus 
genes y proteínas además, y para contender con infecciones virales. Esta extraordinaria 
diversidad de posibilidades de regulación es un reflejo de la complejidad y el orden que 
predomina en la naturaleza. Estos descubrimientos también nos revelan el gran universo de 
los RNAs pequeños, que comprenden una enorme diversidad de funciones en las que 
participan y de mecanismos realmente extraordinarios de los que se vale para lograr el buen 
funcionamiento de un organismo. 
Por lo anteriormente descrito, en la siguiente sección se expondrá una pequeña 
muestra de este universo a través de resumir la información publicada hasta el momento 
sobre la biogénesis, funcionamiento y mecanismos de regulación de estos RNAs pequeños 
no codificantes (small-RNA), sobre la predicción de genes regulados por éstos de manera 
bioinformática, sobre los mecanismos de acción en los diversos organismos en los que se 
han encontrado; así como sobre la gran diversidad de procesos celulares regulados por 
estos. 
C. Silenciamiento de genes por RNAs pequeños de interferencia (siRNA) 
En el año del 2006 se otorgó el premio Nobel en Medicina o Fisiología a los investigadores 
Andrew Z. Fire y Craig C. Mello por su descubrimiento de la interferencia por RNA (RNAi), la 
cual provoca el silenciamiento de genes a través de RNAs de doble cadena (dsRNA) “RNA 
interference, gene silencing by double-stranded RNA”. Este trabajo reporta la existencia de 
un mecanismo celular que puede degradar a un RNA mensajero (mRNA) de manera 
específica (Fire et al., 1998). Estos ensayos se basaron en introducir el mRNA del gen que 
codifica a una proteína de músculo en sentido y en antisentido al mismo tiempo, en su 
modelo de nemátodo Caenorhabditis elegans, provocando la formación de moléculas de 
dsRNA. El resultado mostró que C. elegans presentaba cambios en sus movimientos, los 
cuales eran similares en líneas de C. elegans mutantes en ese gen. La explicación de este 
resultado es debido a que las células activaron una maquinaria bioquímica inducida por la 
existencia de moléculas de RNA que forman estructuras de doble cadena, provocando la 
degradación de mRNAs que son idénticos a las especies que generaron dsRNA, induciendo el 
PTGS. 
 RNAi es un mecanismo adaptativo que ocurre tanto en plantas como en animales, 
para contender ante ciertos eventos como en la respuesta de infección viral o ante la 
presencia de ácidos nucleicos exógenos (transposones y/o transgenes). Antes de la 
publicación de Fire y Mello, en plantas ya se conocía que la presencia de un antisentido de 
un mRNA provoca el silenciamiento del gen (van der Krol et al., 1988). Casi al mismo tiempo 
también se comprobó que la sobre-expresión de una trans-gen particular producía en 
algunos casos la co-supresión del mismo (Napoli et al., 1990; van der Krol et al., 1990; van 
der Krol et al., 1990). Así que de algún modo, las observaciones expuestas por Fire y Mello 
acerca del fenómeno de RNAi en C. elegans, en plantas ya se habían descrito algunas de 
ellas desde diez años antes y otras uno y dos años antes de que lo publicaran Fire y Mello 
(Voinnet and Baulcombe, 1997). 
C.1. Mecanismo de Co-supresión 
La co-supresión es el término que se le dá a la expresión del sistema de vigilancia de la 
planta para detectar la presencia de un gen que es introducido para su sobre-expresión 
(transgen), que causa la degradación tanto del transgen como del mRNA endógeno. 
Finalmente estamos hablando del mecanismo de PTGS por RNAi. Este fenómeno se observó 
en ensayos de sobre-expresión de un gen que codifica a una enzima de la biosíntesis de 
flavonoides, implicada en la pigmentación de flores de petunia. Esta enzima es la chalcona 
sintasa (CHS), que cataliza la condensación de una molécula de 4-coumaronil-CoA con tres 
moléculas de malonil-CoA para formar una molécula de naringenina chalcona, la cual es una 
especie importante para la biosíntesis de flavonoides, flacones, isoflavonides y antocianinas. 
A pesar de que CHS pertenece a una familia multigénica, sólo un miembro se expresa en 
altos niveles en pétalos. Este gen se introdujo a plantas de petunia para sobre-expresar a 
esta enzima y determinar si era limitante para la biosíntesis de antocianinas, esperando la 
producción de flores pigmentadas (violetas) (Napoli et al., 1990). Inesperadamente los 
resultados mostraron que la enzima estaba ausente, por lo que las flores producidas fueron 
blancas o con patrones mixtos de pigmentación (Napoli et al., 1990; van der Krol et al., 
1990). Inicialmente, las plantas que presentaban fenotipos de silenciamiento de RNA, fueron 
aquellas en las que se producían mRNAs sentidos, más que la introducción de mRNA 
antisentido del gen, a diferencia de animales en donde la introducción al mismo tiempo del 
sentido y antisentido del mensajero provocaban los fenotipos de silenciamiento (Fire et al., 
1998). Estas observaciones, promovieron el uso de esta estrategia como una herramienta 
para el silenciamiento de genes particulares; es decir, la introducción de construcciones en 
donde se expresaran al mismo tiempo segmentos de sentido y antisentido del mRNA a 
silenciar (IR-PTGS). Sin embargo, a pesar de ello, una explicación alternativa para la co-
supresión de los transgenes sobre-expresados fue su posible inserción en múltiples sitios que 
de alguna manera pudieran quedar invertidas generando la transcripción de repetidos 
invertidos que pudieran generar dsRNA (Baulcombe, 2003), y por tanto inducir la respuesta 
de IR-PTGS. Sin embargo, otros modelos proponen que el transgen en ciertas circunstancias 
pudiera verse como un RNA aberrante (abRNA), con terminación prematura u otras 
características no definidas, o simplemente que la planta lo percibe como un RNA viral 
(sobre-expresado) (Hamilton and Baulcombe, 1999), provocando la síntesis complementaria 
del mensajero, generando dsRNAs y desencadenando el PTGS iniciado por un mRNA sentido 
(S-PTGS). Actualmente se ha postulado que para los mensajeros altamente expresados 
como es el caso de los transgenes o mensajeros de virus (este último se tratará en otro 
capitulo), pudieran existir eventos no específicos de corte del mensajero que generen 
fragmentos sin sus extremos 5’ cap o de extremos 3’ poli-A correctos (figura 2A), 
propiciando sustratos fácilmente reconocidos como abRNAs para iniciar la cascada de S-
PTGS (Axtell et al., 2006). 
Hasta el momento no se conocen detalladamente los mecanismos sobre el desarrollo 
del PTGS por dsRNA, debido a que sólo se cuenta con la información de pocas mutantes, 
(Llave et al., 2002; Dunoyer et al., 2005). Sin embargo los datos permiten recrear un modelo 
de procesamiento inducido por la presencia de dsRNA en Arabidopsis thaliana (figura 2). En 
todos los casos, la detección de especies de dsRNA grandes los hace sustrato de 
ribonucleasas tipo III conocidas como DCLs (DICER-LIKE). En A. thaliana existen cuatro 
diferentes genes, las proteínas DCL4 y DCL3 procesan a estas especies de dsRNA generando 
fragmentos de 21 y 24 nt respectivamente, conocidos como siRNAs (Hamilton and 
Baulcombe, 1999; Dalmay et al., 2000). Todas estas especies de RNAs pequeños de plantas 
son estabilizadas por la metilación del grupo OH del carbono 2’ de la ribosa del último 
nucleótido, evitando su subsecuente degradación o previniendo su uridilación (Li et al., 
2005). La enzima encargada de modificarlos es HEN1 (HUA ENHANCER 1) (Yang et al., 
2006). Las especies de siRNAs de 21 nt son las que se encargan del procesamiento de los 
mensajeros de los cuales fueron generados, realizando así una regulación en cis, que modula 
el número de mensajeros presentes en la célula (figura 2A). Por otro lado se ha propuesto 
que las especies de 24 nt pueden estar involucrados en la modificación de la cromatinaproduciendo una regulación transcripcional (TGS) (Hamilton and Baulcombe, 1999; Dunoyer 
et al., 2005; (Henderson et al., 2006). Los siRNAs de 21 nt son incorporados dentro del 
complejo proteico de silenciamiento inducido por RNA (RISC), en donde se ha descrito la 
presencia de proteínas ARGONAUTA (AGO). AGOs son una familia de proteínas existentes en 
todos los organismos que presentan mecanismos de silenciamiento por RNA En Arabidopsis y 
en arroz se han identificado 10 y 18 diferentes miembros de la familia, respectivamente 
(Vaucheret, 2008). Estas proteínas presentan un dominio amino terminal variable y un 
dominio carboxilo terminal conservado con tres dominios distintivos: PAZ, MID y PIWI, el 
primer dominio es llamado así por las siglas PIWI-ARGONAUTE-ZWILLE, el cual reconoce los 
extremos 3’ de los RNAs pequeños. El dominio MID se une al extremo 5’ fosfato de los RNAs 
pequeños. El último dominio PIWI, es llamado así por sus siglas P ELEMENT-INDUCED 
WIMPY TESTIS. Este dominio en algunos miembros adopta una conformación similar al sitio 
catalítico de la RNasa H, exhibiendo un motivo conformado por los aminoácidos Asp-Asp-His 
(DDH), capaz de cortar cadena sencilla de un duplex (Vaucheret, 2008) lo que pudiera 
explicar el corte del mensajero apareado al siRNA provocando su silenciamiento. Se ha 
propuesto que la proteína AGO1 está implicada en el S-PTGS y en el IR-PTGS, ya que en 
análisis genéticos en las que se rescatan o complementan alelos mutantes de ago1 muestran 
la reactivación del PTGS cuando se rescata la función (Fagard et al., 2000). La propuesta 
hasta el momento es que la función de RISC que contenga a AGO1 es de asistir el 
apareamiento de los siRNAs con su mensajero blanco y cortar a este último, llevándolo a la 
degradación (figura 2A) y/o mantener un proceso de RNAi en la célula (figura 2C). 
 
Figura
 2.
 Mecanismo
 propuesto
 de
 silenciamiento
 postranscripcional
 por
 RNA
 (PTGS).
 A.
 Vía
 de

silenciamiento
por
RNA
sentido
(S‐PTGS).
B.
Vía
de
silenciamiento
por
RNAs
repetidos
invertidos
(IR‐PTGS).
C.

Paso
de
“transitivity”,
 formación
de
siRNAs
secundarios.
D,
silenciamiento
célula‐célula.
Esquema
modificado

de
Dunoyer
et
al.,
2005;
Axtell
et
al.,
2006;
Baulcombe,
2007;
Voinnet,
2008.

 
En plantas también se ha descrito el llamado el silenciamiento célula a célula, en la 
cual se ha detectado silenciamiento en órganos distantes al sitio de producción de los siRNAs 
(Palauqui et al., 1997). Una posible explicación a estas observaciones es el movimiento a 
través de floema de las molécula interferentes, aunque otra posibilidad es que exista 
transporte por canales plasmodesmales que conectan a las células entre sí. Esta última 
posibilidad parece ser la mas viable, debido a que las células que presentan esta información 
amplifican su señal movilizando a otras células, las cuales producen siRNAs secundarios y 
promoviendo PTGS (figura 2D). Este proceso genera la consecutiva amplificación del 
silenciamiento (Baulcombe, 2007), generando un silenciamiento célula-célula no autónomo 
(Chitwood et al., 2009). 
C.2. Mecanismo de silenciamiento por RNAs que actúan en trans (tasiRNAs) 
Los tasiRNAs, son un grupo de RNAs pequeños encontrados muy recientemente (Vazquez et 
al., 2004), los cuales se forman por la maquinaria de biogénesis y función de miRNAs, así 
como por la maquinaria de biogénesis de siRNAs. Los tasiRNAs se encuentran codificados en 
un loci específico conocido como TAS. Se transcriben por la RNA polimerasa II como una 
especie de pri-TAS. De manera general, estos mensajeros no codificantes presentan uno o 
dos sitios de unión a miRNAs, por lo que pueden ser procesados por acción de uno de estos. 
El resultado de ese procesamiento lo hace sustrato de una polimerasa dependiente de RNA 
(RDR6) y de la asistencia de SGS3 para generar dsRNA (como un RNAi) (Vazquez et al., 
2004). Esta especie de dsRNA es sustrato para el procesamiento por DCL4, la cual corta el 
duplex de RNA en fragmentos de 21 nt generando diferentes tasiRNAs (figura 3). El 
procesamiento del pri-TAS por miRNAs, es importante ya que generalmente determina la 
fase de procesamiento por parte de DCL4 (Axtell et al., 2006) (figura 3). A su vez los 
tasiRNAs tienen a su vez como blancos otros mensajeros diferentes a los pri-tasiRNAs, de ahí 
su nombre ya que actúan en trans. Los resultados del análisis de las mutantes en diferentes 
proteínas AGO sugieren que los tasiRNAs pueden asociarse a complejos RISC, el cual 
contiene en algunos casos a AGO1 y en otros a AGO7 para regular a sus mensajeros blanco 
(Yoshikawa et al., 2005; (Adenot et al., 2006). Hasta el momento se conocen cuatro familias 
de genes TAS. Tres isoformas de TAS1 (TAS1a-c) y TAS2 que son procesados por miR173 
(Allen et al., 2005; Yoshikawa et al., 2005) (figura 3A); TAS3 es el mensajero blanco de 
miR390, el cual es un caso especial, ya que en plantas como Arabidopsis este mensajero 
presenta dos sitos de unión al miRNA (figura 3B). La unión de miR390 en uno de estos sitios 
en el extremo 5’ del mensajero no es completamente complementario, presentando unos 
desapareamientos en la región media del apareamiento con el miRNA; el segundo sitio está 
hacia el extremo 3’ del mensajero y es complementario en la parte media, por lo que se ha 
reportado que los dos sitios son importantes para la biogénesis de tasiRNAs, aunque sólo se 
procese por corte del mensajero el segundo sitio de unión (Adenot et al., 2006; Axtell et al., 
2006). Finalmente, TAS4 es regulado por miR834 (Rajagopalan et al., 2006). 
Los mensajeros blancos de algunos tasiRNAs (siR255/siR482) producto de TAS1 son 
mRNAs que codifican a proteínas con función desconocida (Vazquez et al., 2004; Allen et al., 
2005). Los mRNAs blanco de tasiRNAs de TAS2 (como siR1511) codifican para proteínas de 
repetidos pentatricopéptido (PPR) (Peragine et al., 2004; Yoshikawa et al., 2005). Los 
siRNAs producto de TAS3 regulan negativamente a un grupo de mensajeros que codifican a 
factores de respuesta a auxina (ARFs): ARF3 y ARF4. Mutantes en los genes que están 
involucrados en la biogénesis de los tasiRNAs (rdr6, sgs3 y ago7), presentan una 
acumulación de ARF3 y ARF4 e inducen una cambio acelerado de la fas vegetativa juvenil a 
la adulta en hojas (Adenot et al., 2006; (Fahlgren et al., 2006). 
La función de los tasiRNAs que regulan a mensajeros de ARF3 (tasiR-ARF) es 
bloquear la actividad del gen ARF3, quien define la identidad de las células de los primordios 
de las hojas para la generación de un patrón de desarrollo correcto. De esta manera permite 
que ARF3 se exprese en las células correctas de la cara abaxial y que disminuyan sus niveles 
en la cara adaxial de las hojas (Chitwood et al., 2009), ya que se ha confirmado que se 
produce un gradiente de movilidad de estos tasiRNAs hacia las células vecinas creado un 
cambio profundo en sus patrones de actividad, debido a que componentes de biogénesis 
como AGO7 y miR390 se encuentran exclusivamente en la capa superior celular (adaxial) 
(Tretter et al., 2008; Chitwood et al., 2009) (figura 3). 
Todavía no se ha caracterizado la función de todos los tasiRNAs producidos. Sin 
embargo, lo encontrado hasta el momento para los tasiR-ARFs nos permite especular acerca 
de la participación en la regulación postranscripcional de estos RNAs pequeños en el 
desarrollo de las plantas. 
 
 
 
 
 
 
 


Figura
3.
Formación
de
tasiRNAs.
Modelo
de
biogénesis
de
diferentes
tasiRNAs
en
A.
thaliana.
A.
Biogénesis
de

TAS1,
2
ó
4.
B.
Biogénesis
de
TAS3,
en
el
cual
existe
la
unión
de
miR390
en
dos
sitios
del
mensajero
de
TAS3,
en

uno
de
ellos
es
procesado
por
un
RISC
que
contiene
a
AGO7
a
diferencia
de
A,
el
cual
es
procesado
por
RISC

con
AGO1.
También
se
muestra
 la
comunicación
por
silenciamiento
de
célula‐célula.
Esquema
modificado
de

Yoshikawa
et
al.,
2005;
Gasciolli
et
al.,
2005;
Allen
et
al.,
2005;
Axtel
et
al.,
2006;
Brodersen
andVoinnet,
2006.

 
C.3. Mecanismo de defensa anti-viral 
Las plantas y los invertebrados pueden protegerse de una infección viral a través del 
mecanismo de RNAi. Este mecanismo explicado en la sección C.1, es una respuesta natural 
en donde se producen dsRNAs de novo, seguida de una producción de siRNAs (viRNAs) que 
median el silenciamiento de los RNAs virales. 
De manera detallada, en este capitulo se tratarán dos mecanismos que inducen las 
plantas durante la infección viral y un mecanismo viral para contrarrestar la respuesta de las 
plantas. El objetivo principal de cualquier organismo ante una infección viral es limitar la 
replicación de mensajeros virales en las células infectadas. El segundo es de iniciar una 
respuesta antiviral a distancia, en la que se produce una señal de silenciamiento sistémica. 
También se tratarán los mecanismos de evasión de algunos virus ante la respuesta de 
defensa montada por las plantas (Ding and Voinnet, 2007; Mlotshwa et al., 2008). 
C.3.1. Inhibición de la replicación de RNAs virales 
En base a la producción de siRNAs virales, éstos pueden ser agrupados en tres clases, 
tomando en cuenta al dsRNA del cual fueron generados. Los siRNAs conocidos como 
primarios, son los producidos por la replicación del RNA viral en el citoplasma o por la 
transcripción bidireccional de DNAs virales en el núcleo (figura 4), en cualquiera de los dos 
casos se generan moléculas de dsRNA que inducen el mecanismo de RNAi. Los siRNAs 
secundarios conocidos como “transitive silencing”, son producidos a partir de moléculas de 
ssRNAs virales las cuales son sustrato de RNA polimerasas dependientes de RNA (RDR) de la 
planta, para generar moléculas de dsRNA. Se conoce que en Arabidospsis existen seis genes 
que codifican a RDRs, de las cuales tanto RDR1 (Xie, 2001) como RDR6 (Dalmay et al., 
2000) participan en la producción de los siRNAs secundarios. Se ha descrito que la pérdida 
de la actividad de RDR en la planta aumenta la susceptibilidad a una infección viral. En 
cualquiera de estas dos vías para producir siRNAs virales, se da una acumulación similar 
entre siRNAs que provienen tanto de la cadena sentido como de la antisentido (cadena + y 
cadena -); sugiriendo que la generación de estos viRNAs es debida a la producción de 
dsRNAs (Mlotshwa et al., 2008). Para la producción de ambos tipos de siRNAs o viRNAs, es 
importante la participación tanto de DCL2 como la de DCL4 (Moissiard et al., 2007). Por 
último se conocen que los siRNAs pueden ser producidos por estructura secundaria de algún 
RNA viral como en el transcrito policistrónico 35S del virus del mosaico de coliflor (CaMV) 
(virus de dsDNA) forma una estructura secundaria larga, la cual se cree que es vital para 
dirigir al ribosoma durante la traducción (Moissiard and Voinnet, 2006). Se ha encontrado un 
mayor número de siRNAs de CaMV de sentido + de la secuencia que forma la estructura 
secundaria, sugiriendo que este tallo-asa es procesado por la maquinaria de la planta para 
producir siRNAs (Moissiard and Voinnet, 2006), en mayor medida que por la formación de un 
dsRNA largo. Finalmente, para cualquiera que fuese el origen de la producción de viRNAs, el 
objetivo de la planta es el de inducir el mecanismo de silenciamiento por RNAi para eliminar 
los RNAs virales (figura 4). 
C.3.2. Respuesta antiviral a distancia 
Se ha propuesto que la señal de silenciamiento debe dispersarse en la misma ruta que sigue 
la infección viral. Esto es, la movilización de la señal de célula a célula a través de 
plasmosdesmos, posteriormente su entrada al floema y su distribución a distancia; 
finalmente estas moléculas se movilizan nuevamente de célula a célula (Voinnet and 
Baulcombe, 1997; Kalantidis et al., 2008; Chitwood et al., 2009). En la dispersión de RNAi de 
célula a célula, se encuentran involucrados dos procesos, el primero es la señal de corto 
rango, en la cual están involucradas de 10 a 15 células con la actividad específica de DCL4, 
pero no de RDR6 o SDE3, así como la de tres genes SMD1-3 (silencing movement deficient) 
(Voinnet, 2005; Dunoyer et al., 2007). Para la señal a largo rango, se requiere de RDR6, 
SDE3 y posiblemente de SDE5 para generar los nuevos transcritos de dsRNAs en moléculas 
de 21 nt y generar nuevamente la señal de 10-15 células (Voinnet, 2005). Finalmente, estos 
mecanismos propuestos de cómo existe una defensa sistémica en la planta ante una 
infección viral (figura 4), es construida en base a diferentes análisis de mutantes en los 
genes para las proteínas involucradas tanto en el mecanismo de siRNA como de miRNA ante 
la infección viral; sin embargo, hasta el momento no esta totalmente documentados. 
C.3.3. Mecanismos de evasión de los virus ante la respuesta de la planta 
Para contrarrestar el mecanismo de defensa implementado por las plantas, los virus 
evolucionaron y produjeron proteínas capaces de interferir con el mecanismo de defensa. En 
1998 fue descubierta la primera proteína que funciona como supresora del silenciamiento 
(vSS) (Anandalakshmi et al., 1998). Estas proteínas participan a diferentes niveles, algunas 
secuestran dsRNAs virales largos, otros secuestran a viRNAs, pero en cualquiera de esos 
mecanismos el resultado se traduce en la interferencia de la función de los viRNAs en RISC 
(Merai et al., 2006). Básicamente se han encontrado dos grupos de vSS que presentan 
características de unión muy particulares. En el primero de ellos, se ha reconocido tanto a 
las proteínas P19 de Tombusvirus, P1/HC-Pro de Potyvirus, γB de Hordeivirus y P15 de 
Pecluvirus, entre otros, los cuales son capaces de unirse a dsRNAs pequeños, (Hamilton and 
Baulcombe, 1999; Vargason et al., 2003; Ye et al., 2003; Merai et al., 2006; Moissiard and 
Voinnet, 2006); el segundo grupo como P14 de Aureusvirus y CP de Tombusvirus son 
capaces de unirse tanto a moléculas de dsRNA pequeños como grandes (Merai et al., 2006). 
Así, como la proteína P21 de Closterovirus presenta una afinidad similar por RNAs largos, 
pequeños, de cadena sencilla o doble (Ye et al., 2003). Estos análisis indican que estas 
proteínas son capaces de intervenir en el punto de evitar el procesamiento por DCLs de los 
dsRNAs grandes producidos por la célula para evitar la producción de viRNAs o de secuestrar 
a los viRNAs evitando que puedan asociarse con RISC minimizando el silenciamiento (figura 
4). Se han realizado algunos estudios para conocer en que momento estos vSS intervienen 
en el silenciamiento, en algunos casos interfieren en la generación de los viRNAs primarios o 
secundarios. Las proteínas vSS como P1/HC-Pro, P38 de Tombusvirus y P19 bloquean 
específicamente la acumulación de siRNAs secundarios, lo cual sugiere que su mecanismo es 
independiente de la producción de viRNAs primarios (Mallory et al., 2001; Mlotshwa et al., 
2008). La proteína P19 secuestra específicamente a los dsRNAs de 21 nt producidos 
preferentemente por DCL4 (Vargason et al., 2003). En resumen, los datos sugieren que las 
proteínas P19, P21, HC-Pro y P15 pueden unirse a sus viRNAs y también son capaces de 
unirse a dsRNA pequeños como los siRNAs endógenos y a miRNAs, dado que su unión es 
más estable con moléculas de dsRNA pequeñas que presenten dos nucleótidos 
sobresalientes en sus extremos 3’-OH (Merai et al., 2006). 
En estudios recientes se ha encontrado que los vSS también pueden alterar la 
estructura bioquímica de los siRNAs endógenos y exógenos así como de los miRNAs, ya que 
son metilados en sus extremos 3’, y algunos vSS interfieren con este proceso, afectando a 
toda la estirpe de RNAs pequeños de la célula (Yu et al., 2006). 
Finalmente, el otro nivel de inhibición por parte de vSS es en la función de RISC. Se 
han reportado algunos casos en donde vSS interviene previniendo el ensamble del RISC en 
donde normalmente proteínas AGO, particularmente AGO1 se unen para formar el complejo 
(Chellappan et al., 2005). Un ejemplo claro deeste tipo de mecanismo es el de la proteína 
2b del virus del mosaico de pepino (Cucumovirus), la cual interactúa físicamente con el 
siRNA cargado con AGO1 (RISC), inhibiendo el silenciamiento (Zhang et al., 2006). 
 
Figua
4.
silenciamiento
viral
y
supresores
virales
del
silenciamiento.
En
este
esquema
se
representa
el
posible

mecanismo
 de
 respuesta
 antiviral
 montada
 por
 la
 planta,
 tanto
 en
 virus
 de
 DNA
 como
 en
 virus
 de
 RNA.

También
se
muestra
en
círculos
rojos
la
proteínas
sVV
y
su
posible
intervención
como
respuesta
supresora
del

silenciamiento.
Esquema
obtenido
de
Ding
and
Voinnet,
2007
y
Ye
et
al.,
2003.

C.3.4. Virus del Mosaico Común de Frijol (BCMV) 
El virus de BCMV pertenece al género Potyvirus, se encuentra ampliamente distribuido en el 
mundo, ocasionando pérdidas en el rendimiento de las cosechas y una baja calidad del 
producto (Flores-Estévez et al., 2003). Este virus es clasificado como uno de los virus 
importantes que infectan naturalmente a los cultivos de frijol. BCMV es trasmitido por áfidos 
y propagado por semilla, convirtieéndola en una de las principales fuentes de inóculo y por 
tanto, fundamental en la distribución de la infección (McKern et al., 1992). Los síntomas que 
produce son decoloraciones en las hojas mostrando un mosaico, malformaciones, hojas 
curvas y clorosis. En algunos casos, dependiendo si la temperatura se encuentra por arriba 
de los 30ºC, puede presentar necrosis, debido a una respuesta de hipersensibilidad montada 
de la planta (Flores-Estévez et al., 2003). Este virus es de ssRNA cadena +, presenta una 
organización con dos regiones no traducidas (UTRs) cortas en los extremos 5’ y 3’ y una 
región de traducción como poliproteína, la cual es procesada en nueve diferentes proteínas 
(Dougherty et al., 1988). La segunda proteína es un vSS conocido como HC-Pro, por lo que 
muchos de los síntomas en las plantas de frijol estén probablemente relacionados con la 
participación de este vSS evitando el mecanismo de defensa montado por la planta, además 
de interferir con la función de RNAs pequeños endógenos como tasiRNAs o miRNAs. En 
infecciones por BCMV indirectamente se puede obtener una acumulación de la mayoría de 
los RNAs pequeños celulares. Esta característica pudiera ser útil para la identificación de 
siRNAs y miRNAs endógenos y funcionales. 
D. Silenciamiento de genes por microRNAs 
Los miRNAs son secuencias endógenas con un locus identificado, los cuales se 
transcriben como transcritos primarios (pri-miRNA) que son procesados en precursores de 
longitudes de aproximadamente 70 nt (pre-miRNA) en animales y en pueden ser mayores a 
200 nt, son procesados por una RNasa tipo III localizada en el núcleo (Lee et al., 2002). Esta 
enzima se ha identificado como “Drosha” en animales (Lee et al., 2003) mientras que en 
plantas estos pri-miRNA parecieran ser procesados por otra RNasa tipo III llamada “Dicer-
like-1” (DCL1). En animales, estos pre-miRNAs son exportados activamente al citoplasma por 
Ran-GTP y el receptor exportina-5 (Yi et al., 2003; Lund et al., 2004). Los pre-miRNAs son 
procesados por una RNasa III con un dominio de helicasa “Dicer”. En plantas se tienen 
evidencias de que DCL1 es el que procesa a los pre-miRNA en núcleo. El procesamiento de 
DCL1 tanto de los pri- como de los pre-miRNAs es asistido por una proteína de unión a doble 
cadena de RNA llamada HYL1 (hyponastic leaves1) y por una proteína con estructura de 
dedos de Zn-C2H2 conocida como SE (Serrate), estas interactúan con DCL1 para formar los 
centros de procesamiento conocidos como D-bodies o SmD3/SmB-bodies (Fang and Spector, 
2007). Finalmente, la maduración termina con la metilación del 2’-OH de la ribosa de los 
extremos 3’ por HEN1 (Yu et al., 2005). Posteriormente los veinteámeros de doble cadena (o 
par miRNA/miRNA*), son exportados hacia citoplasma por HASTY (Bollman et al., 2003; Park 
et al., 2005). Los intermediarios de doble cadena tienen una vida media corta (Lee et al., 
2003), una de las cadenas de este RNA duplex se acumula como un miRNA maduro, que 
también se incorpora a un complejo ribonucleoproteíco (miRNPs) que pudiera ser el RISC 
(Bartel and Bartel, 2003). Este complejo regula la expresión de mRNAs blanco de los 
miRNAs, ya sea por corte y degradación de los mensajeros o inhibiendo su traducción (Lee 
et al., 1993) (figura 5). En plantas este complejo contiene proteínas AGO, principalmente 
AGO1 (Mi et al., 2008). 
Es importante mencionar que en plantas se han encontrado 21 familias de miRNAs 
conservadas entre las angiospermas (Axtell and Bowman, 2008). Sin embargo, sólo cuatro 
de ellas estan conservadas en musgo, indicando que el origen de estas familias es ancestral, 
lo que correlaciona con que sus mRNAs blanco son factores de transcripción altamente 
conservados (Garcia, 2008). Por otra parte, existen miRNAs poco conservados, la existencia 
de ellos sugiere que son una clase de miRNAs de generación más reciente, que 
probablemente se expresen en condiciones determinadas o en órganos determinados 
propias de cada especie (Talmor-Neiman et al., 2006). 
Tanto en plantas como en animales, se han desarrollado estrategias tanto 
computacionales como experimentales para entender los principios generales que 
determinan el reconocimiento entre el miRNA y su mensajero blanco. Específicamente en 
plantas el miRNA regula a su transcrito por la unión altamente complementaria en un sitio a 
lo largo del mensajero, generando una respuesta de la planta de corte y degradación del 
mensajero o raramente por inhibición de la traducción (Brodersen and Voinnet, 2009). Este 
apareamiento del miRNA predominantemente se presenta en la región codificante aunque 
también en algunos casos se encuentra en regiones UTRs. La evidencia indica que la unión 
del miRNA con su blanco en su región inicial del miRNA de los nucleótidos 2-7 conocidos 
como “seed” o región semilla es la mas importante, particularmente en la región central en 
las bases 9-11 contando desde el extremo 5’ del miRNA (Brodersen and Voinnet, 2009), lo 
hace candidato para el procesamiento por corte y degradación. Experimentalmente se puede 
comprobar este proceso: de los dos extremos generados en el mensajero por el corte 
provocado por la unión del miRNA, el extremo 5’ es poco estable; sin embargo, el extremo 3’ 
del mensajero procesado presenta un grupo fosfato el cual puede ser utilizado para realizar 
una reacción de 5’RACE (rapid amplification of 5’ cDNA ends) (Dunoyer et al., 2004). 
 
 
Figura
5.
Biogénesis
de
miRNAs
en
Plantas.
Esquema
representativo
de
la
producción
de
miRNAs
en

plantas.
Esquema
basado
en
Zhu,
2008
y
Voinnet,
2009.

 
En los últimos años en donde se han encontrado y clasificado diversos RNAs 
pequeños, se han realizados grandes esfuerzos para generar criterios de clasificación para el 
grupo de miRNAs (Meyers et al., 2008). El criterio primario es encontrar RNAs pequeños que 
fueron producto del procesamiento de una RNasa tipo III junto con su miRNA*, presentando 
extremos 5’-fosfato y dos nucleótidos sobresalientes de su apreamiento, que a su vez este 
par miRNA/miRNA* se encuentre como producto de un probable precursor de miRNA que 
presente una estructura tipo tallo-asa (secuencia proveniente de una base de datos 
genómica o de ESTs). El apareamiento miRNA/miRNA* debe presentar cuatro o menos 
desapariamientos entre ellos principalmente. Como criterios auxiliares, los cuales no son 
necesarios pero pueden ser considerados: a) la conservación de la secuencia en otras 
especies, b) el que presente una dependencia directa del procesamiento por DCL1, c) 
comprobar que es capáz de regular a su mensajero blanco. Así es que todos los criterios son 
importantes para poder clasificar a una secuencia como nuevo miRNA. 
En plantas se han realizado diferentes estudios para conocer la función de los 
miRNAs. En la biogénesis de miRNAs, se ha estudiado principalmenteen plantas de 
Arabidopsis en donde mutantes en el gen para la enzima DCL1 presenta defectos en los 
meristemos florales, generando un estado indeterminado en el desarrollo de esos tejidos 
(Jacobsen et al., 1999), indicando que esta proteína es necesaria para la viabilidad de la 
planta (Schauer et al., 2002). Actualmente se han encontrado cuatro diferentes proteínas 
DCL en plantas, que son responsables de las diferentes vías de procesamiento para generar 
diferentes clases de RNAs pequeños (Papp et al., 2003). Por otro lado, en Arabidopsis se han 
realizado estudios de sobre-expresión de un miRNA (miR319), fenómeno que genera una 
disminución de los mRNA de los genes CIN, los cuales codifican un grupo de factores de 
transcripción (TCPs) que controlan el desarrollo de la hoja. Este trabajo mostró que el 
apareamiento del miRNA con el mensajero genera que éste último se degrade. El fenotipo 
de la hojas de las plantas que sobre-expresan este miRNA es similar al de las plantas 
transformadas que no expresan las proteínas TCP (Palatnik et al., 2003). 
Otros estudios han mostrado la interacción de diferentes miRNA con sus mRNA 
blanco que se expresan en distintas etapas del desarrollo, así como en órganos específicos. 
Existen evidencias experimentales que indican que al menos miR172 participa en el 
desarrollo floral. Se ha propuesto que éste modula la traducción del mRNA del gen 
APETALA2 y de otros mRNA relacionados con éste, ya que ésta proteína se expresa 
diferencialmente en algunos tejidos de la flor, indistintamente de los niveles del mRNA, el 
cual se encuentra en niveles similares en todos los tejidos de este órgano (Aukerman and 
Sakai, 2003; Chen, 2004). Estos reportes, entre otros, demuestran la participación de los 
miRNAs en la regulación de la expresión genética en plantas, ya sea a través de un 
mecanismo de modulación postranscripcional, al inducir la degradación de ciertos mRNA 
(como en el caso de los genes CIN); o bien, al inhibir la traducción por aparearse con su 
región homóloga, como en los genes de APETALA2, o bien, silenciando genes al producir 
modificaciones epigenéticas, (inducción de la metilación de novo en regiones promotoras) 
(Grewal and Rice, 2004). En general, los genes blanco predichos para los miRNAs 
identificados a la fecha en Arabidopsis incluyen diversos factores transcripcionales, además 
de diversas familias génicas lo cual sugiere que están involucrados en la regulación de 
numerosos procesos en la planta (Rhoades et al., 2002). 
Así como los miRNAs participan en mecanismos de desarrollo, también participan en 
el mantenimiento celular, como es el caso de la de miR824 que sólo se encuentra en el linaje 
de Brassicaceae y que está implicado en la organización del estoma (Kutter et al., 2007). 
Además, de manera general los miRNAs participan en los mecanismos sofisticados y 
eficientes que las plantas han desarrollado para contender a las diferentes condiciones de 
estrés abiótico como es la sequía, frío, salinidad, además de la alta intensidad de luz y estrés 
mecánico entre otros (Jones-Rhoades and Bartel, 2004; Sunkar and Zhu, 2004; Fujii et al., 
2005; Sunkar et al., 2006; Lu et al., 2008; Sire et al., 2009; Liu et al., 2009; Liu et al., 
2008). 
Uno de los casos que ha sido caracterizado con mayor detalle es el de miR398 que 
regula negativamente a mensajeros que codifican a la enzima Cu-Zn superóxido dismutasa 2 
(CDS2) plastídica y CSD1 citosólica, cuyas proteínas están implicadas en la desintoxificación 
de radicales superóxido, por tanto en una circunstancia de estrés oxidativo los niveles de 
miR398 disminuyen evitando la regulación negativa de los genes CDSs para ayudar a la 
desintoxificación. Sin embargo, cuando se requiere evitar su acumulación, como podría ser 
un caso de tolerancia oxidativa, la acumulación de los mensajeros son finamente modulados 
por este miRNA (Sunkar et al., 2006). 
En otro ejemplo más de la participación de un miRNA en estrés, se encuentra dado 
por miR159 que participa en la respuesta a estrés osmótico, en donde la hormona ABA 
participa (además de ser importante en el programa de maduración de las semillas) al 
inducir la acumulación del miR159 que provoca la regulación de factores de transcripción 
MYB33 y MYB101, generando un mecanismo de homeostasis ya que a su vez se requieren a 
estos factores transcripcionales respuesta a ABA (Reyes and Chua, 2007). 
También se ha caracterizado la participación de miR399 y miR395 en la regulación de 
la respuesta a estrés por bajos niveles de fosfato (Fujii et al., 2005) y sulfato (Jones-
Rhoades and Bartel, 2004) en el medio, respectivamente, representan otros ejemplos de la 
inducción de miRNAs en diferentes situacines de estés. 
Lo anteriormente descrito son ejemplos de la participación de algunos miRNAs cuya 
función en la respuesta a estrés abiótico ha sido caracterizada; sin embargo, recientemente 
se han realizado esfuerzos para comprender la participación de otros miRNAs en diferentes 
estreses abióticos, lo cual puede ampliar el panorama y ayudar al entendimiento de los 
mecanismos implementados por las plantas para resistir al estrés. En algunos trabajos se 
han podido reconocer y relacionar los elementos promotores encontrados en diferentes 
genes de miRNAs y su acumulación en ciertos estreses en A. thaliana (Liu et al., 2008). En 
otros trabajos se han caracterizado en condiciones particulares de diferentes estreses 
abióticos y en diferentes etapas del desarrollo de las plantas (tabla 1). 
 
Tabla
1.
miRNAs
conservados
que
presentan
una
respuesta
a
diferentes
estreses
abióticos



(+),
 Sobre‐expresión
 con
 respecto
 a
 su
 control.
 (–),
 Disminución
 ante
 el
 estrés.
 Datos
 según
 las
 condiciones

ensayadas. 
Posiblemente la caracterización de la participación de miRNAs en estos eventos 
podría dar respuesta a la regulación de mecanismos que no se podían contestar con el 
análisis de mutantes de genes que ahora se sabe que son regulados por miRNAs. Esta 
información también podría ayudarnos a entender porque mutantes de proteínas que 
participan en la biogénesis de miRNAs presentan efectos que compromenten la viabilidad de 
las plantas, presentando efectos desde pleiotrópicos hasta letales (Mallory and Vaucheret, 
2006). 
Por la poca información que existe hasta la fecha sobre la función de los diferentes 
miRNAs es importante continuar con el análisis de la participación de estos, en los diferentes 
procesos y en diferentes especies durante diversas etapas del desarrollo, para comprender 
los enigmas de la regulación genética que presentan las plantas a lo largo del desarrollo y en 
diferentes circunstancias de estrés. Es por ello que es de nuestro interés realizar un análisis 
de la participación de miRNAs en la regulación de la expresión de diferentes genes en estrés, 
en particular en una planta de interés agronómico, en donde se han caracterizado diferentes 
aspectos de la respuesta a déficit hídrico. Por otro lado, el estudio en plantas como frijol 
ofrece la posibilidad de explorar la existencia y función de estas moléculas en plantas que 
poseen diferentes estrategias adaptativas a las seleccionadas en A. thaliana que hasta ahora 
ha sido la planta modelo por excelencia para su análisis y que por lo tanto, ha limitado en 
gran medida el conocimiento de su función y biogénesis en otras especies vegetales, las 
cuales presentan una gran diversidad en el reino vegetal por su historia evolutiva. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 


II. HIPÓTESIS 
En plantas de frijol (Phaseolus vulgaris) existen miRNAs involucrados en la percepción 
o transducción de la respuesta a la limitación de agua. 




III. OBJETIVO GENERAL 
Determinar la presencia de miRNAs asociados a las respuestas a estrés por limitación 
de agua y/o al tratamiento con ABA en frijol. 
 
 
III.1 Objetivos Particulares 
 
1. Cultivar plántulas de frijol en condiciones de irrigaciónóptima, estrés por limitación de 
agua, rehidratación y en tratamiento con ABA. 
 
2. Construir bibliotecas de los cDNAs correspondientes a RNAs de tamaño molecular 
equivalentes a la población de los miRNAs obtenidas en cada tratamiento. 
 
3. Analizar las clonas de las diferentes bibliotecas por secuencia. 
 
4. Comparar las secuencias obtenidas con los bancos de secuencias disponibles de miRNAs. 
 
5. Analizar los patrones de expresión de los miRNAs identificados en diferentes condiciones 
de crecimiento por ensayos tipo Northern blot. 
 
6. Identificar los posibles genes blanco de los miRNAs aislados y analizar la actividad sobre 
ellos. 
 
 


IV. RESULTADOS 
E. Tratamientos de estrés en plántulas de frijol. 
Las plántulas de frijol (Phaseolus vulgaris L. cv Pinto Villa) se obtuvieron al germinar semillas 
y cultivarlas en condiciones etioladas por un periodo de 4 días de crecimiento 
posgerminación. A esa edad, se formaron cuatro grupos a los que se les dieron diferentes 
tratamientos: sequía por dos días, sequía por dos días con rehidratación por dos días más y 
adición de ácido abscísico (ABA) también por dos días. Además de tener un grupo de plantas 
con irrigación óptima como control. 
En el caso de las plántulas sometidas a sequía y a tratamiento con ABA, se colectaron 
de 3 y 10 plántulas (entre experimentos independientes) a las 4, 8, 12, 24, 36 y 48 h con la 
finalidad de poder monitorear tanto a los genes de expresión temprana como tardía. El 
estrés por sequía y el tratamiento con ABA, provocan que las plántulas detengan el 
crecimiento, entre otros cambios fisiológicos y moleculares, por tal motivo se midió el 
crecimiento del hipocotilo a lo largo del tratamiento de sequía, lo cual permitió tener una 
referencia del efecto diferencial de las condiciones de crecimiento (figura 6A). El efecto del 
tratamiento con ABA también se confirmó utilizando como referencia la acumulación de un 
transcrito (lea-IV) que se acumula en este estrés por sequía y bajo estas condiciones de 
tratamiento (Colmenero-Flores et al., 1997), (figura 6B). 
 
 
Figura
 6.
 Efecto
 de
 los
 estreses
 aplicados.
 A,
 Crecimiento
 del
 hipocotilo;
 en
 verde
 claro
 se
 muestra
 el

crecimiento
de
plántulas
con
irrigación
óptima,
en
amarillo
se
muestra
el
crecimiento
de
plántulas
en
sequía
y

en
 verde
 obscuro
 se
 muestra
 el
 crecimiento
 del
 hipocotilo
 en
 plántulas
 con
 sequía
 previa
 y
 subsecuente

rehidratación.
 B,
 Ensayo
 tipo
 Northern
 blot
 para
 detectar
 al
 mensajero
 de
 Pvlea‐IV,
 que
 se
 induce
 por

tratamientos
con
ABA.

F. Construcción y análisis de bibliotecas de RNAs pequeños. 
Se aisló RNA de las plántulas que fueron colectadas en cada uno de los diferentes periodos 
de tiempo de cada condición (control, sequía, sequía-rehidratación y tratamiento con ABA), 
luego se mezclaron para obtener 1mg de RNA total para cada condición, de este material se 
construyeron tres bibliotecas de RNAs pequeños (condiciones control, sequía y sequía-
rehidratación). El RNA de las plántulas de tratamiento con ABA se utilizó para construir otra 
biblioteca, cuyos resultados no se tratarán en esta tesis. 
Se analizaron las secuencias de las tres bibliotecas construidas y hasta el momento se 
obtuvieron 407 RNAs pequeños con longitudes de 16-30 nt (figura 7A). Posteriormente se 
realizó el análisis bio-informático de las secuencias clonadas que ayudó a clasificarlas, 
mostrando que el 75.2% de las secuencias corresponde a fragmentos de RNAs ribosomales y 
tRNAs; el 1.3% fueron homólogos a miRNAs reportados y registrados en el sitio 
“miRBase::Sequences” (Griffiths-Jones et al., 2008) y el 23.5% de “otras secuencias” mostró 
identidad. Del 2% de secuencias exploradas, el 0.5% resultaron ser a nuevos miRNAs de un 
(figura 7B). 
 
A B 
 
Figura
7.
Características
de
los
RNAs
pequeños
clonados.
A.
Longitud
y
frecuencia
de
las
secuencias
clonadas.

B.
Distribución
porcentual
de
las
poblaciones
de
RNAs
pequeños
identificadas
en
las
bibliotecas.
t/rRNA,
RNAs

de
tranferencia
y
ribosomales.
N‐miRNAs,
Nuevos
miRNAs.




Las secuencias que mostraron un alto porcentaje de identidad con mRNAs de plantas 
presentaron una distribución de longitudes como se muestra en la figura 8, en donde se 
puede apreciar que las secuencias mas numerosas fueron las de 24 nt de longitud. Estas 
pudieran tratarse de secuencias no relacionadas específicamente con miRNAs, aunque se 
conocen varios RNAs pequeños de 24 nt implicados en la regulación transcripcional, 
específicamente en mecanismos de metilación de DNA y silenciamiento de genes (Vaucheret, 
2008). 


Figura
8.
Características
de
 los
RNAs
pequeños
clonados.
Distribución
de
 la
 longitud
de
RNAs
pequeños
con

alto
porcentaje
de
identidad
con
mRNAs. 
 
En plantas se han identificado 21 familias de miRNAs que se conservan desde musgo 
hasta plantas superiores (miR156/157, miR159, miR160, miR162, miR164, miR165/miR166, 
miR167, miR168, miR169, miR170/miR171, miR172, miR319, miR390, miR393, miR394, 
miR395, miR396, miR397, miR398, miR399 y miR408), de los cuales se clonaron miR160 y 
miR319. Por ensayos tipo Northern blot se confirmó que frijol también expresa los miRNAs 
conservados (figura 9). Para algunos de estos miRNAs como miR395 y miR399 los cuales se 
inducen bajo condiciones de ayuno de sulfato y fosfato, respectivamente, no se realizaron 
ensayos tipo Northern blot. Sin embargo, para miR399 se ha demostrado que se induce en 
condiciones de ayuno o deficiencia de fosfato en el medio, en raíces de plantas de frijol 
(Valdes-Lopez et al., 2008). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura
9.
Presencia
de
miRNAs
conservados
en
Frijol.
Ensayos
tipo
Northern
blot
de
los
miRNAs
conservados,

la
 hibridación
 con
U6
 snRNA
 es
 utilizada
 como
 control
 de
 carga.
 R,
 raíz.
 L,
 hoja.
 IE,
 embrión
 inmaduro.
 DE,

embrión
seco.
Pv,
Phaseolus
vulgaris
At,
Arabidopsis
thaliana.
Os,
Oriza
sativa.



En la fracción de “otras secuencias” se realizó un análisis en la base de datos de ESTs 
(www.ncbi.nlm.hin.gov) que mostró mRNAs que presentaban homología tanto en su 
secuencia sentido como en algunos casos también de forma complementaria. Las secuencias 
con identidades en la cadena sentido las hace candidatas a ser una de dos opciones: 1. 
productos de degradación de mRNAs o 2. si este mRNA no presenta un marco de lectura 
abierta y puede formar una estructura secundaria estable de tipo tallo-asa, pueden ser 
potencialmente un precursor de miRNA. Para el caso en que la homología con algún mRNA 
se encuentre en sentido complementario, pudiera tratarse de un mensajero que fuese 
regulado por el miRNA. Además de este análisis, de estas secuencias se seleccionaron las 
que presentaran tamaños de 21-22 nt, que iniciaran principalmente con Uridina (como la 
mayoría de los miRNAs), así como realizar ensayos tipo Northern blot para comprobar si se 
acumulan en tamaños de 21-22 nt. En el capitulo 4 y 5 de este trabajo de investigación se 
realizó el análisis de dos de estas secuencias. 
G. Análisis de miRNAs conservados y nuevos candidatos en Phaseolus 
vulgaris 
El análisis de las diferentes bibliotecas de RNAs pequeños nos permitió elaborar la 
publicación de “Conserved and Novel miRNAs in the legume Phaseolus vulgaris in response 
to stress” publicado en la revista Plant Molecular Biology. Este artículo contiene los 
resultados obtenidos del análisis de los miRNAs conservados y nuevos que se clonaron de las 
bibliotecas a partir de diferentes tejidos como plántulas en diferentes estreses así como de 
hojas de plantas en sequía y raíces noduladas. Este trabajo se realizó con la colaboración de 
la Biol. Beatriz Pérez, Fernando Rabanal, Daniel Blanco-Melo, Carlos De la Rosa, Georgina 
Estrada-Navarrete, Dr. Federico Sánchez, Dra. Alejandra Alicia Covarrubias y Dr. José Luis 
Reyes. A continuación se anexa el artículo.H. Análisis de dos RNAs pequeños clonados e identificación de sus 
mensajeros blanco. 
H.1
Un
nuevo
microRNA
conservado
en
leguminosas.

Del grupo de “otras secuencias” (mencionados en la sección 2) se obtuvo una de 21 nt 5’-
GGAATGGGCTGATTGGGAAGC-3’ (secuencia num. 18), de la biblioteca de plántulas 
rehidratadas, la cual se nombró pvu-miRRH18. La expresión de este RNA pequeño fue 
probada en ensayos tipo Northern blot, en donde se observó que migraba con un tamaño 
molecular de 22 nt. Por lo que se realizó ensayos de “primer extension” para determinar si 
en el extremo 5’ faltaba una base la cual no se hubiera clonado. El resultado mostró que 
hacia ese extremo no faltaba ninguna base, lo que sugirió fuertemente que la base faltante 
se encontraba hacia el extremo 3’ (datos no mostrados). Por otra parte el análisis por BLAST 
de esta secuencia mostró una identidad del 100% con una secuencia de la base de datos de 
ESTs de plantas que fue aislada de soya (Glycine max) en vainas inmaduras (banco Gm-
c1071). El análisis de predicción de estructura secundaria (Zuker, 2003), mostró que esta 
secuencia es capaz de pregarse como una estructura secundaria tipo tallo-asa (135 nt) con 
un ΔG = -87 kcal/mol, indicando una gran estabilidad de la estructura secundaria. Lo cual 
sugiría que se trataba del RNA precursor del miRNA (figura 10). A partir de esta secuencia se 
diseñaron diferentes pares de oligos para amplificarlo por PCR y clonar al precursor de frijol. 
Las amplificaciones por PCR se realizaron utilizando como molde cDNA o DNA genómico 
tanto de soya como de frijol. No se logró amplificar ningún producto tomando como molde 
cDNA. Sin embargo, se logró amplificar y clonar a este precursor utilizando DNA genómico 
tanto para soya como para frijol. El análisis de la secuencia del pre-miRNA de soya reveló 
que es idéntica a la secuencia reportada en el banco de ESTs Gm-c1071. Por otro lado, al 
comparar esta secuencia con la secuencia amplificada de frijol, se encontró que difieren en 
un nucleótido (T/C) localizado en la base del tallo, lo que no modifica la estabilidad del tallo-
asa (figura 10A). En base a la secuencia de nucleótidos de este precursor, se puede deducir 
que la base numero 22 faltante en el extremo 3’ de la secuencia madura corresponde a una 
Adenina (figura 10A). 
 
 
 
 
 
Figura
10.
 Estructura
 secundaria
 y
alineamiento
de
pvu‐miRRH18.
A.
 Se
presenta
 las
diferentes
estructuras

secundarias
de
las
secuencias
encontradas
con
identidad
a
pvu‐miRRH18,
en
rectángulo
azul
se
presentan
las

secuencias
que
corresponden
a
pvu‐miRRH18
y
en
línea
roja
a
su
miRNA*
correspondiente,
con
flecha
azul
se

identifica
el
nucleótido
de
diferencia,
con
flecha
roja
se
señala
el
nucleótido
22.
B.
Alineamiento
de
las
mismas

por
Tcoffee,
la
línea
azul
señala
la
zona
en
donde
se
encuentra
la
secuencia
18
y
la
línea
roja
corresponde
a
su

miRNA*.

A 
B 
En la base de datos de ESTs se encontró otra secuencia de Malus domestica que es 
muy parecida a pvu-miRRH18, además es capaz de plegarse como tallo-asa de manera 
similar a las secuencias de frijol y soya (figura 11), lo que sugirió fuertemente que este RNA 
pequeño también se acumularía en Rosales, que son muy cercanas evolutivamente a 
Fabales. 
La secuencia de frijol fue utilizada para realizar ensayos de transformación transitoria 
en hojas de Nicotiana benthamiana para comprobar in vivo que esta secuencia tiene todas 
las características necesarias para que la maquinaria de la planta la reconozca y la procese 
correctamente generando al miRNA maduro (figura 11). El resultado por ensayos tipo 
Northern blot nos indicó que este precursor se procesó correctamente. 
 
 
Figura
11.
Procesamiento
de
pre‐miRRH18.
Transformación
transitoria
de
hojas
de
N.
benthamiana
con
el
pvu‐
pre‐miRRH18
 y
 análisis
 por
 Northern
 blot
 del
 procesamiento
 correcto
 del
 mismo,
 a
 uno
 y
 dos
 días
 post‐
transformación.

 
Para estudiar las condiciones de crecimiento en las cuales este microRNA se acumula, 
se realizaron ensayos tipo Northern blot en diferentes órganos. Se encontró que en embrión 
seco se encuentra poco abundante en comparación con germinados de 24 horas donde sus 
niveles aumentan rápidamente. Su presencia es evidente en plántula de 4 días de edad, así 
como en hipocotilo y raíz de ese mismo estado del desarrollo. Los niveles son menores en 
hoja, en flores no podemos decir algo en concreto, ya que no observamos ninguna señal de 
control de carga por parte de la señal de 5S rRNA (5S). Es importante hacer notar que 
durante el desarrollo del embrión (desde vainas verdes hasta la maduración) ocurre una 
desecación natural en la semilla, durante este proceso los niveles de pvu-miRRH18 
disminuyen (figura 12). 
 


Figura
12.
Expresión
de
pvu‐miRRH18
en
diferentes
órganos.
A.
Ensayos
tipo
Northern
blot
a
partir
de
RNA

obtenido
de
diferentes
órganos
de
 frijol.
 Los
niveles
de
5S
 rRNA
 (5S)
 se
utilizaron
como
control
de
carga.
B.

Densitometría
de
A,
por
Phosphorimager
(Typhoon,
Amersham).




 La expresión de este miRNA en plántulas sometidas a diferentes estreses, reveló que 
pvu-miRRH18 no se acumula en respuesta a estrés por sequía, tratamiento con ABA, por 
calor (42 °C) o por frío (4 °C) (figura 13). 
 
 
Figura
 13.
 Expresión
 de
 pvu‐miRRH18
 en
 respuesta
 a
 diferentes
 estreses.
 A
 y
 B.
 Muestran
 ensayos
 tipo

Northern
blot
para
detectar
pvu‐miRRH18
en
condiciones
de
sequía
y
tratamiento
con
ABA
en
A,
y
estrés
por

frío
 y
 calor
 en
 B,
 se
muestra
 las
 gráficas
 de
 la
 densitometría
 obtenida
 de
 cada
 ensayo
 tipo
Northern
 blot
 y

analizadas
por
Phosphoimager
(Typhoon,
Amersham).
Todas
las
gáficas
representan
valores
normalizados
con

respecto
a
control
de
carga
y
al
valor
obtenido
para
el
tiempo
cero
de
tratamiento.

 
Se comprobó la presencia de pvu-miRRH18 utilizando ensayos tipo Northern blot en 
algunas plantas pertenecientes a grupos filogenéticos lejanos (Monocotiledoneas, 
Solanaceas, Brasicales y Cucurbitales) y cercanos a frijol (Fabales y Rosales), encontrando 
que este miRNA sólo esta presente en Fabales y en Malus domestica (Rosales) (figura 14). 
 
 
Figura
14.
Expresión
de
pvu‐miRRH18
en
diferentes
especies
vegetales.
A.
Ensayos
tipo
Northern
blot
a
partir

de
RNA
obtenido
de
plantas
perteneciente
a
diferentes
grupos
filogenéticos.
B.
Filogenia
de
Plantas.
C.
Ensayos

tipo
Northern
blot
a
partir
de
RNA
obtenido
de
plantas
de
diferentes
leguminosas
y
rosales.
La
sombra
de
las

letras
en
color
identifican
a
los
diferentes
grupos
filogenéticos
en
B
(Soltis
et
al.,
1999).

 
I. El pvu-miRRH18 es un miRNA*. 
Recientemente se reportaron los miRNAs nuevos y relacionados en la regulación de la 
nodulación en raíces de soya (Subramanian et al., 2008). En dicho trabajo se encontraron 35 
nuevas familias, para alguna de esas familias fueron determinadas su acumulación y 
participación en nodulación de algunos miRNAs por ensayos tipo Northern blot. En ese 
trabajo se reportó al miR482 maduro (5’-UUCCCAAUUCCGCCCAUUCCUA-3’), a su miRNA* y 
su pre-miRNA. Al comparar la secuencia de pvu-miRRH18, resultó evidente que era idéntica 
a miR482*, así que en el resto se renombrará como miRRH18/miR482* (figura 15). Hasta 
ahora, se ha registrado en MiRbase la presencia de miR482 de Glycine max (Fabales), 
Populus trichocarpa (Malpighiales) (Lu et al 2005), Vitis vinifera (Myrtales) (Jaillon et al., 
2007) y Pinus taeda (Pinaceae) (Lu et al., 2007), correspondientes a diferentes 
eudicotiledoneas y a una gimnosperma. Esta secuencia no se encuentra en el genoma 
secuenciado de Arabidoposis. Adicionalmente, en este trabajo encontramos los precursores 
en Phaseolus vulgaris (Fabales) y Malus domestica (Rosales) (Arenas-Huertero et al., 2009) 
(figura 10). 
 
Figura
15.
Diferentes
pre‐miR482.
 Se
muestran
 las
diferentes
estructuras
secundarias
de
 los
pre‐miR482,
en

letras
 azules
 se
muestra
 la
 secuencia
 de
miR482*/miRRRH18y
 en
 letras
 rojas
 se
muestra
 las
 secuencia
 de

miR482
 (secuencias
 obtenidas
 de
 miRbase).
 gma,
 G.
 max.
 pvu,
 P.
 vulgais.
 mdo,
 M.
 domestica.
 ptc,

P.trichocarpa.
vvi,
V.
vinifera.
pta,
P.
taeda.

 
Por tal motivo se realizó un alineamiento de las secuencias precursoras de miR482, 
en donde encontramos que la secuencia de miR482 está conservada en estas plantas (figura 
16A). Sin embargo, la secuencia de miRRH18/miR482* esta conservada en Fabaceas y 
Rosales que son grupos filogenéticos cercanos y no así entre Malpighiales, Myrtales y 
Pinaceae. 
Fue extraño encontrar en el análisis de alineamiento en GeneBee 
(http://www.genebee.msu.su/services/malign_reduced.html), que las secuencias que más se 
parecían a miRRH18/miR482* (figura 16A), no fuesen exactamente el par de miRNAs* y sus 
miR482, según reportados en miRBase mostrado en sombra gris y en letras negras del 
alineamiento en la figura 16B y en su conformación de tallo-asa (figura 16C). 
 
Figura
16.
Alineamiento
de
 las
 secuencias
de
 los
pre‐miR482.
A.
Muestra
el
 alineamiento
de
 todos
 los
pre‐
miR482
 publicados
 y
 encontrados
 en
 este
 trabajo,
 en
 sombra
 gris
 se
muestra
 las
 secuencias
 equivalentes
 a

miRRH18/miR482*
y
miR482.
B.
Muestra
en
sombra
gris
con
letras
negras
los
verdaderos
miR482*.
C.
Muestra

el
 duplex
 miR482*/miR482.
 gma,
 G.
 max.
 pvu,
 P.
 vulgaris.
mdo,
M.
 domestica.
 ptc,
 P.
 trichocarpa.
 vvi,
 V.

vinifera
y
pta,
P.
taeda.
Las
letras
azules
corresponde
a
miRRH18/miR482*
y
en
letras
rojas
a
la
secuencia
de

miR482.

Otro aspecto que se exploró sobre miR482 fue su patrón de expresión para 
compararlo con pvu-miRRH18/miR482*, por lo que se realizó un ensayo tipo Northern blot 
preliminar apartir de RNAs obtenidos de diferentes órganos (figura 17). De manera general, 
se puede observar que se acumulan ambos miRNAs en mayor proporción en órganos como 
hipocotilo, botones florales, flores y vainas de 9 cm. Con menor intensidad se observó en 
órganos como embrión seco, germinado 14h, plántula 4 días, y en diferentes edades de 
desarrollo embrionario. Sin embargo, es importante mencionar que este ensayo no refleja 
exactamente que exista una acumulación diferencial entre los dos miRNAs a lo largo de los 
diferentes órganos ya que fueron hibridados en la misma mebrana en ocasiones diferentes y 
con diferente tiempo de exposición. 
 
 
Figura
 17.
 Expresión
 de
 miR482
 y
 miRRRH18/miR482*
 en
 diferentes
 órganos.
 Ensayos
 tipo

Northern
blot
de
diferentes
órganos
de
 frijol
Pinto
Villa.
5S
es
utilizado
como
control
de
 carga.
 En

botones
florales,
flor,
vainas
de
5cm
y
9cm
de
longitud
no
se
aprecia
el
control
de
carga.

J. Probables mRNAs regulados por pvu-miRRH18/miR482*. 
Para encontrar el mRNA que podría estar regulado por este pvu-miRRH18/miR482*, se 
realizó un análisis por BLAST para tratar de identificar una secuencia en bases de datos de 
ESTs que presente similitud en sentido complementario. 
El EST mas relevante proviene de Gossypium, y presenta similitud con una probable 
alfa-glucosidasa identificada en papa (gi|2648032|), A. thaliana (gi|101776| y gi|746924 ) y 
de jitomate (gi|383229393|). Con la finalidad de clonar la secuencia de este probable mRNA 
blanco, se alinearon las secuencias de los ESTs similares y se diseñaron dos oligos con bases 
degeneradas y en sentido complementario para utilizarlo en una primera amplificación y 
como un PCR anidado. Sin embargo, no ha sido posible amplificar una banda definida para 
posteriormente clonarla. Recientemente se realizó una búsqueda bioinforméatica para 
predecir el probable mensajero blanco en la base de datos de leguminosas (Arenas-Huertero 
et al, 2009). Entre los mejores candidatos se encuentra un mensajero con anotación de 
proteína relacionada con la subunidad ribosomal 60S. Es importante mencionar que el 
mensajero blanco de miR482 se ha validado experimentalmente en Populus trichocarpa, 
tratándose de un transcrito que codifica una probable proteína de resistencia a infección (Lu 
et al., 2005). 
K. Pvu-small RNA-1, una historia de sequía. 
En la búsqueda de nuevos miRNAs, se encontró en el banco obtenido a partir de plántulas 
en sequía una secuencia de 21 nt (5’-TGATACACTAGCACGGGTCAC-3’) la cual fue nombrada 
pvu-sRNA-1. Sin embargo, no se ha encontrado ninguna secuencia en los bancos de datos 
de ESTs que sugiera ser el precursor de este RNA pequeño y que lo permita identificar como 
un posible miRNA, por lo tanto se diseñó una estrategia diferente para estudiar sus 
características y poder determinar si este RNA pequeño es funcional y no un producto de 
degradación. Esto incluye el estudio de sus características químicas que nos pudieran sugerir 
la vía de su biogénesis, así como su patrón de expresión en diferentes órganos y condiciones 
de estrés hídrico, sin olvidar comprobar la distribución y conservación en las diferentes 
plantas y principalmente tratar de conocer su función en plantas. 
L. Biogénesis de pvu-sRNA-1. 
L.1.
Fosforilación
del
extremo
5’.


Durante el procesamiento de los miRNAs por proteínas de la familia de RNasas III, DCLs 
(Kurihara and Watanabe, 2004), se generan extremos 5’ fosforilados y dos nucleótidos no 
apareados en los extremos 3’ (Reinhart et al., 2002). Para comprobar si el pvu-sRNA-1 se 
encontraba fosforilada en su extremo 5’, se comparó el cambio de su patrón electroforético 
en un ensayo tipo Northern blot utilizando una muestra de RNA total tratada con fosfatasa 
alcalina (retraso en su migración), con respecto a una sin tratar. El resultado indicó un 
retraso en la migración de pvu-sRNA-1 después de la defosforilación, lo que indicó que se 
encontraba fosforilada en su extremo 5’ (figura 18). Como control del ensayo se utilizó un 
oligonucleótido de RNA con su extremo 5’ fosforilado o no (figura 18). 
 
 
L.2.
Metilación
del
extremo
3’.


Durante de la biogénesis de miRNAs de plantas, se requiere de HEN1, esta proteína es una 
metilasa que se encarga de modificar en la posición 2’ de la ribosa del último nucleótido del 
extremo 3’ con un metilo (-CH3). Esta proteína es importante en la biogénesis tanto de 
miRNAs como de siRNAs en plantas (Yu et al., 2005). Para demostrar si pvu-sRNA-1 se 
encuentra metilado se realizó un ensayo de β-eliminación, que consiste en una oxidación de 
la ribosa del extremo 3’. Si ésta no estuviera metilada, la oxidación generaría la pérdida del 
último nucleótido (cambio de migración electroforética). Si la ribosa se encuentra metilada 
no existe dicha oxidación y por tanto no habría cambio electroforético. Después del 
tratamiento de oxidación se analizó el resultado en un ensayo de tipo Northern blot y el 
resultado reveló que no existe cambio en su migración y por lo tanto concluimos que este 
RNA pequeño se encuentra modificado en su extremo 3’ (figura 18). 
 
Figura
18.
Ensayo
de
fosfatasa
alcalina
y
de
β‐eliminación.
En
 la
parte
superior
de
 la
 figura
se
encuentra
el

ensayo
 con
 un
 oligonucleótido
 control
 el
 cual
 se
 encuentra
 fosforilado
 en
 el
 extremo
 5’
 y
 no
 se
 encuentra

modificado
en
el
extremo
3’.
En
 la
parte
 inferior
se
encuentra
un
ensayo
tipo
Northern
blot
para
detectar
a

pvu‐sRNA‐1
 de
muestras
 de
 RNA
 total.
 –AP,
 no
 tratadas
 con
 fosfatasa
 alcalina.
 +AP,
 tratadas
 con
 fosfatasa

alcalina.
–β,
sin
tratamiento
de
β‐eliminación.
+ β,
tratamiento
de
β‐eliminación.

M. Dependencia de DCL-1 en su procesamiento. 
Los RNAs pequeños interferentes y los microRNAs en plantas son producidos por una familia 
de RNasas III-like conocidas como “Dicer-like” (DCLs). DCL-1 participa en la biogénesis de la 
mayoría de los miRNAs y en el procesamiento de cis nat-siRNAs (Borsani et al., 2005). Por 
ello, para determinar su dependencia de DCL-1 en la generación del pvu-sRNA-1 en frijol, se 
realizó una construcción de represión de DCL-1 por RNAi en frijol (iDCL1) (Valdes-Lopez et 
al., 2008). Los resultados obtenidos