La-expresion-de-cfos-como-marcador-de-fotosincronizacion-en-el-acocil-Pracambarus-clarkii

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO
FACULTAD DE CIENCIAS
LA EXPRESION DE C-FOS COMO MARCADOR
DE FOTOSINCRONIZACION EN EL ACOCIL
Procambarus clarkii
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE:
BIOLOGA
PRESENTA
LlLY MAGALLY GRANADOS DOMINGUEZ
DIRECTORA DE TESIS : DRA. MARIA LUISA FANJUL PEÑA
FACULTAD DE CIENCIAS
UNAM 2005
" .~ Ll "-:J C~; C- : ro.Neevia docConverter 5.1
· / ' j i' li k 'r! ¡.Id ~ .
r"JII' lj Í' , ~ A I ~
. ·v~! Ü l~ .
ACT. MAURICIO AGUILAR GONZÁLEZ
Jefe de la División de Estudios Profesionales de la
Facultad de Ciencias
Presente
Comunicamos a usted que hemos revisado el trabajo escrito:
" La expresión de e-fos como marcador de fo tosi nero niz aeián en el
aeoeil Proeambarus eIarkii"
realizado por
Li I y Ma gaI Iy Granado s nom in gue z
con número de cuenta 0 9 51 9 O82 - O , quien cubrió los créditos de la carrera de: Bi o l o ?: í a
Dicho trabajo cuenta con nuestro voto aprobatorio.
Atentamente
Director de Tesis
Propietario n ra . Ma ría Lui s a r.anj ul Peña ......' ...1:
e ' .., ..... '
':L---" .:»
f!p;f -···
/ . }nra. EIsa Guadalupe Es e arn i I I a
Dr . Ra 61 A~uilar Ro bl ero
n r a . Bon ap a r t e iÍ/~
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nr a . Si l v i a Let i c i a Ver du go Di a z !¿/-:.~;~.J.:í ...
JI ' ?Y" \ ,1;
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Consejo Departamental de Biol o gía ",' FACULTADDllCfHNl'CJAS
Propietario
Propietario
Suplente
Suplente
C. Juan Man el Rodrí guez C h~ ve z
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Dedicatoria
JI mi adorada y liermosafamiiia,
Que me lía enseñado
JI ver e{mundo a través de sus ojos
CYsu corazón.
jIlni papá,
CJ'e agradezco e[habernos enseñado
}1 no desfa[Cecer por nuestros sueñosy
Siempre seguiradelante con nuestra 'Vida.
'Eres mi másgrande ejemplo de constancia
Tenacidad, disciplina y amor.
}1 mi mamá,
ere agradezco tu amor, tu dedicación, tu sabiduria y
Tu aleqria de vivir. graciaspor enseñarnos a ser
Libres en pensamiento y espíritu
Para recorrer e{mundo con pies ligeros.
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}l David,
}l migran hermano, quien ha
}l6ierto brechas, marcado vidas, caminos
ry tia sabido compartir sus experiencias en todo su esplendor.
qraciaspor tus consejos, tu nohleza,
cru comprensión y por tu gran
Sentido de! humor
)1 Claudia,
)1 mi comadre y iiermana con quien fíe
}lprendido de fa mano de fas aleqriasy fas tristezas,
Éxitos y fracasos, pero so6re todo a reconocer
Que son todas ellas experiencias
Queforman parte de fa que somos.
Son {o más importante en mi vida.
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Agradecimientos
Quiero agradecer deforma muy especial a la Dra. Maria Luisa Fanj ul de Moles porque no
solo he aprendido con sus enseñanzas a ser una mejor investigadora, sino también una
mejor persona. Gracias por todo el apoyo que me brindó durante mi estancia en el
laboratorio.
Agradezco incansablemente al M en C Julio A. Prieto Sagredo por todo el apoyo técnico,
académico y moral en el laboratorio, por su infinita paciencia y sentido del humor. Por tus
amenas charlas científicas y de la vida y sobre todo por tu amistad.
Agradezco especialmente a la Dra. EIsa G. Escamilla Chimal por el apoyo técnico,
académico y moral para la realización de esta tesis. Por ser una amiga admirable llena de
f ortaleza y experiencias que compartir.
Agradezco enormemente al Biólogo Octavio G. López Riquelme por ser un gran amigo que
sabe crear momentos memorables en donde quiera que se encuentre. Gracias por tu apoyo
académico, técnico y moral. Por fin he comprendido el trasfondo de tus ense ñanzas.
A mis sinodales externos: Dr. Raúl Aguilar, Dra. María Eugenia Gonsebatt y Dra. Leticia
Verdugo por sus enseñanzas y ayuda en el enf oque de este trabaj o.
Agradezco al Dr. Raúl Aguilar, Parménides Guadarrama y M en C José Luis Ch ávez por
sus consejos y apoyo en la realización de la técnica de DAB.
A mis compañeros y amigos que han laborado, aprendido y compartido conmigo a lo largo
de estos años en el laboratorio, a todos ellos todo mi reconoc imiento y cariño:
Abud, quien me introdujo brillantem ente al estudio de la cronohiología y la
neurofisiologia. Mary, quien hizo divertido el aprendizaje en el laboratorio, por tu
compañerismo y sentido del humor. A Mario por compartir una etapa importante en mi
vida. A mi gran amiga Gaby, quien me ha enseñado a sortear obstáculos en el laborat orio
yen la vida, por todo tu apoyo en la realización de esta tesis. A Aixchel por brindarme su
amistad, su compañerismo y buen sentido del humor. A Andrea por su ejemplo de
constancia y tenacidad. A Bianca por brindarme su amistad, y por llevar la tranquilidad y
comprensión al laboratorio. A Marlen por su amistad y comprensión. A Nancy y a Oiga
por su amistad y compañerismo. A la Sra. Lupita por su compañerismo y ejemplo.
A mis amigas e inseparables comadres:
Iskra, que siempre estás cuando más te necesito, por ser tan especial, por tu sabiduria, tu
sentido del humor, tu comprensión y por ser tú siempre. Por compartir conmigo tu visión
de la vida y hacerla más divertida. Por la gran amistad que tenemos.
Samantha, por tu enorme corazón, sinceridad, tu comprensión, por compartirme siempre tu
sentir y tu pensar y porque seguiremos resolviendo la vida juntas, siempre adelante.
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Ludmila, por compartir tu alegría, tu comprensión de las cosas y por tu sinceridad. Porque
seguimos construyendo nuestra amistad.
Susana, por ser una amiga muy especial con la que comparto momentos inolvidables,
siempre en pos de la aventura.
A mi amigo Héctor quien me ayudó a mejorar la presentación de este trabajo y que me ha
enseñado con su experiencia de vida, su creatividady sentido del humor.
Mil gracias a mis amigos tan especiales con los que he compartido momentos inolvidables:
Apolo, Beto, Amanda, Huitzil, Diego, Fabiola.
Agradezco especialmente a Javier Malcolm porque has iluminado nuestra vida para vivir
plena y felizmente en cualquier lugar en donde nos encontremos.
De forma especial agradezco y dedico este trabajo a mi cuñada María Inés Tapia Urbina
por su entereza, amistady cariño que ha traído consigo a la familia. A mi futuro sobrino(a)
que es una bendición de la vida y un aliciente para disfrutarla en cada momento .
A mis tíos y primos más cercanos: Tía Coco, Carlos, Bety , Rebeca y mi sobrino Salomon,
Pepe y familia , Mimi y [amilia, Tío Beto, Tía Elvira, Mariel, Beto y familia , Eric y [amília.
A mis maestros y amigos de quienes aprendí tanto en tan poco tiempo para mi fo rmación
científica y personal en Bermudas : Dr. Charles Derby, Dr. Hank Trapido, Rachelle. José ,
Erick . Marlene. Amy, Sco tt, Skip, Caroline, Birgitt, Kevin.
A todas aquellas personas que sin duda alguna contribuyeron a mi formación personal.
cientifica. artística y deportiva.
A quien por falta de memoria he omitido.
A la Univers idad Nacional Autónoma de México, por brindarme un espacio para
superarme. Porque es un honor ser parte de una comunidad llena de conocimiento, cultura
y sabiduria que enriquece al país.
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Esta tesis fue realizada en el Laboratorio de Neurofisiologia Comparada de
Invertebrados de la Facultad de Ciencias, UNAM bajo la dirección de la Dra.
Maria Luisa Fanjul Peña yfuefinanciada por PAPIlT lN-20840S-] y PAPIlT
IN-2/290/ .
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,
Indice
1 Resumen
2 Introducción
2.1 Ritmos Biológicos 2
2.1.1 Características, Defin ición y Clasificación 2
2.1.2 Ritmos Circadianos 3
2.1.3 Oscilación Espontánea 4
2.1.4 Sincronizadores o Zeitgebers 4
2.1.5 Sincronización de los Reloj es Biológicos 5
2.1.6 Curva de Respuesta de Fase (Reiniciando el Reloj) 6
2.2 Reloj Biológico 9
2.2.1 Reloj Molecular de Drosophila 11
2.2.2 Reloj Molecular de Mamiferos 15
2.2. 3 Fotoperiodo , Reloj Molecular y c-fos 19
2.3 c-fos Gen de Expresión Temprana 20
2.3.1 Induccion Lumínica de c-fos 23
2.3.2 Sistemas de Regulación de c-fos 24
2.-1 El Acocil como Modelo de Estudio 25
2.-1.1 Organizacián de! Sistema Nervioso ( 'entra! 26
2.-1.2 Características de! Lobulo Óptico 27
2.-1.3 Características de! Ganglio Supraesofúgico o Cerebro 28
2.5 RitmosBiológicos en el Acocil 32
3 Justificació n del problema 33
-1 Objetivos 34
5 Hipótesis 34
6 Método 35
6.1 Cuidado de los Acociles 35
6.2 Diseño Experimental 35
6. 3 Histología 36
6.4 InmUllOhistoq uimica 36
6.5 Análisis y Procesamiento de las Imágenes 37
6.6 A nálisis Estadístico 39
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7 Resultados 40
7.1 Experimento I 40
7. 2 Experimento 2 44
7. 3 Análisis del Área Inmunorreactiva del Experimento I 46
7.4 Análisis de Intensidad Inmunorreactiva Promedio
(Experimentos I y 2) 47
8 Discusión 48
9 Conclusiones 51
la Referencias 52
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1 Resumen
Durante los procesos de fotosincronización, las estructuras neural es responsables de la
generación y sincronización de los ritmos circadianos de los mamíferos muestran cambios
en la expresión de la proteína FOS . Esta respuesta es considerada como un buen marcador
de actividad temprana que podría ser utilizada en otros grupos animales para caracterizar
las diferentes estructuras del sistema circadiano. Por lo anterior, el objetivo de este trabajo
fue determinar posibles cambios en la inmunorreactividad a FOS durante la
fotosincroni zación en el protocerebro del acocil Procambarus clarkii, una estructura
propuesta como un posible marca paso circadiano. Un grupo de acoci les adultos (n= 18)
mantenido en ciclos de LO 12:12 se div idió en dos grupos, un grupo experimental y un
control subdivididos a su vcz cn tres subgrupos. Durante la escotofasc de l día experimental
y en tres diferentes horas. cada subgrupo recibió un pulso de luz blanca de 30 minutos ( 170
lux) al final de la cual los animales se sacrificaro n y procesaron mediante
inmun ohistoquímica . Los individuo s del segundo grupo experimental (control) se
sacrificaro n a las mismas horas circadianas y puestos en oscuridad constante 24 h antes del
sacrificio y sin es timulaci ón luminosa. Una vez capturadas las im ágenes del cerebro se
procesa ron en un sistema computarizado y se analizaron mediante técn icas de imagen,
determinando tanto área como intensidad del área reactiva. Los datos obtenidos se
analizaro n estadísticamente mediante ANO VA de una vía y Scheffé post-hoc. Tanto el
grupo experimental como el control mostraron inmunorreacti vidad a FOS en la región
protocerebral, específicamente en el conjunto anterior medial (CAM ). Aunque el análi sis
del área inmunorreactiva no mostró diferencias estadísticas para el primer grupo
experimental, el análisis de la intensidad mostró diferencias estadísticamente signi ficativas
entre las horas circadianas de cada grupo, así como entre el grupo control y el grupo
experimental. Esto indica una fotosensibilidad circadiana diferencial. Lo anterior prueba
que la región protoce rebra l part icipa en los mecanismos de generación y sincronización del
ritmo circadiano de l acocil. Este es el prime r reporte sobre FOS en crustáceos y sugiere que
este marcad or podrí a ser una herramienta útil en la caracterización de las estructuras
neurales subyacentes al sistema circadiano.
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2
2 Introducción
2.1 Ritmos Biológicos
2.1.1 Características, Definición y Clasificación
La variabilidad genética y la selección natural a lo largo de la historia evolutiva han dado
origen a un sin fin de estrategias que han permitido que la vida en la Tierra sea viable,
sustentable y sobre todo dinámica.
Por definición, cualqui er evento recurrente que se manifiesta en intervalos regulares de
tiempo dentro de un sistema biológico es considerado como un ritmo biológico (Kalmus,
1935). Los ritmos se distinguen por características tales como frecuencia de osci lación,
proceso(s) que lo(s) genera(n). sistema(s) biológico(s) en donde se observan y función(es)
desempeñada( s).
Posiblemente en etapas previas a la radiaci ón de especie s o por paralelismos evolutivos se
ha presentado la capacidad (mediante diversas estrategias) de recibir y dar información
acerca del paso del tiempo. Algunos de los ritmos fisiológ icos y conductuales exis tentes
son similares a la recurrencia de ciertas claves ambientales tales como los ciclos de luz-
oscuridad causados por la rotación de la Tierra, el ciclo lunar, las mareas y las estac iones
originadas por el movimiento de traslación de la Tierra han dado pie a que estos ritmos
puedan ser sincronizados y por ende adaptados al medio ambiente, en donde no solo es
importante el ser precisos al sincronizarse y establecer ritmos de duración similar a estas
claves ambientales, sino también percibir y accionar mecanismos oportunos acordes a las
vanaciones en las mismas que permitan la supervivencia de los organismos (Pitte ndrigh,
1993).
Los ritmos biológicos pueden ser clasificados por su capacidad de sincronización a cambios
geofísicos en circadianos, circamareales, circalunares y circanuales. De acuerdo a su
frecuencia y en base a los ritmos circadianos (duración cercana a 24 h) los ritmos
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3
biológicos se subdividen en: ritmos ultradianos (alta frecuencia) con periodos menores a 20
h Yritmos infradianos (baja frecuencia) con periodos mayores a 28 h. Ejemplos de ritmos
ultradianos son losritmos respiratorio y cardiaco y de ritmos infradianos el ciclo menstrual
y la hibernación (Aschoff, 1981).
Las distintas clases de ritmos presentes en un organismo se encuentran altamente
correlacionados entre sí, por ejemplo, el sueño MOR (movimientos oculares rápidos)
ubicado como un ritmo ultradiano está modulado en frecuencia por la escala de tiempo
circadiana queregula el sueño-vigilia y esta a su vez puede depender de algunos parámetros
dados por un ritmo circanual (Aschoff, 1981).
2.1.2 Ritmos Circadianos
Los ciclo s de luz-oscuridad causados por la rotación de la Tierra probabl emente han sido la
mayor fuerza evo lutiva para la existencia de los ritmos circadianos prese ntes en la mayoría
de los organ ismos. desde proca riontes hasta cucario ntes )' desde unicelulares hasta
multi celulares.
Los ritmos circadianos tienen una duración cercana a las 24 h de ahí que se utilice el
término circadiano (del latín cirea "cercano de" y dien "diario") y presentan las siguientes
características:
1. Son endógenos (programados genéticamente)
2. Son sincronizables
3. Debido a que son endó genos persisten en oscilación espontánea (luz u oscuridad
constante)
4. Se ha observado de forma general que para especies diurnas el periodo es mayor a
24 h y menor para especies nocturnas (Regla de Aschoff)
5. Compensan ciertos cambios de temperatura evitando la alteración del ritmo
6. Por lo general pueden desaparecer bajo condiciones intensas de luz
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4
. Cabe hacer mención que dada la gran diversidad de sistemas circadianos conocidos, todos
los organismos multicelulares comparten una organización temporal a nivel molecular,
celular, tisular y organísmica basada en la interacción entre múltiples osciladores (Aschoff,
1981).
2.1.3 Oscilación Espontánea
Los ritmos circadianos presentan de forma intrínseca la capacidad de mantener oscilaciones
autosostenidas en condiciones constantes (temperatura y luz u oscuridad constantes). Este
proceso se conoce como oscilación espontánea. El periodo de un ritmo en oscilación
espontánea, denominado como r, depende de la especie, variación interindi vidual y las
características fisiológicas en las distintas condic iones ambientales.
En la mayoría de las especies el periodo del ritmo r depende direc tamente de la intensidad
lumínica. A mayor iluminación la act ividad locomotora se vuelve arrítmica y otros ritmos
se amortiguan (la frecuencia disminu ye y el periodo se modifica) (Pittendrigh, 1960).
2.1.4 Sincronizadores o Zeitgebers
Cualquier ciclo externo (clave ambiental) que confiera duración a un ritmo se le conoce
como zeitgeber (dador de tiempo) o sincronizador. El ciclo luz-oscuridad es el
sincron izado r por excelencia para la mayoría de los sistemas circad ianos presentes en los
distintos grupos de organismos. Este ciclo posiblementees una de las seña les más precisas
de todos los ambientes conocidos. En el caso de la iluminación continua que se presenta
durante el verano ártico y antártico es probable que otros zeitgebers puedan aportar claves
importantes para la sincronización de los ritmos (Aschoff, 1981).
Se ha observado que otros factores ambi entales, como la temperatura, pueden ser poderosos
sincronizadores en animales poiquilotermos. Los animales homeotermos son propensos en
menor medida a ser sincronizados a ciclo s térmicos (Aschoff, 1981).
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5
Los estímulos sociales son ampliamente utilizados como señales temporales en mamíferos,
estos estímulos pueden afectar los programas de conducta circadiana regulando la fase y
periodo de los relojes biológicos, modulando los ritmos sincronizados a partir de un
fotoperiodo o por procesos de asociación aprendidos. En diversos mamíferos las señales
maternas son el sincronizador primario dentro del útero y previo al destete. Los adultos de
algunas especies también pueden presentar cambios de fase o sincronización por uno o
varios períodos de interacción social. Sin embargo aún no hay evidencia suficiente de las
vías de entrada del reloj circadiano no relacionadas con la luz (Mistlberger, 2004). La
sincronización por alimento es otro zeitgeber del cual aún se desconoce también las vías de
entrada al reloj , así como el sitio de transducción del estímulo. Se ha observado en peces
dorados que los alimentos con menor número de calorías no son buenos zeitgebers del
oscilado r sincronizado por la alimentación mientras que las dietas altas en calorías tienen
mayor posibilidad de sincronizarlo (Sánchez-Vázquez, 2001). Se han utilizado diversos
tipos de sustancias que afect an la sincronización induciendo cambios de fase en los
marcapasos circadianos, como en el caso de la mclatonina en ratas (Armstrong, 1989) y en
humanos (Lewy el al. 1992).
2./.5 Sincronización de los Relojes Biológicos
Los relojes biológicos actúan de acuerdo a características genéticas particulares esto es, el
mantenimiento de una fase estable en los ritmos es necesario para conservar un adecuado
balance de los distintos procesos que lleva a cabo un organismo, así mismo tienen la
habilidad de expresar un ritmo independientemente de las claves ambientales (son
engódenos) y la capacidad de guiar un ritmo de acuerdo a la duración de las mismas.
Un ejemplo que ilustra lo anterior, se da en el caso de la recurrencia cíclica del ritmo de
actividad locomotora de un ratón, en donde la duración de un ciclo completo de actividad y
descanso es de 23.2 h (r) en oscuridad constante (00) y cuando el ratón es expuesto a un
ciclo LO 12:12 h (12 horas de luz por 12 de oscuridad) (T = 24 h) el ritmo tiene la habilidad
de asumir un periodo (r") de 24 h. De esta forma un ritmo circadiano es sincronizado a un
ciclo LO 12:12 (con un periodo T) el periodo del marcapaso (r) es cambiado de 't a 't* = T.
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6
A este evento se le conoce como sincronización de un ritmo biológico. En esta
sincronización se puede decir que la relación de fase entre el programa seguido por el
marcapaso del ratón y el ciclo externo de luz se ha establecido. Dada la estabilidad del
ritmo sincronizado al ciclo LO, el marcapasos puede anticiparse temporalmente y, en dado
caso, preparar la síntesis de enzimas digestivas tomando en cuenta la aproximación al
momento de alimentación (Aschoff, 1981) .
Resumiendo lo anterior y anexando ciertas premisas la sincronización comprende: 1) el
ajuste de la frecuencia y la fase de los ritmos endógenos a un zeitgeber, 2) la
resincronización de un ritmo después de un periodo de oscilación espontánea o de un
cambio de fase del zeitgeber se caracteriza generalmente por la presencia de ciclos de
transición antes de alcanzar una fase estable y 3) la actividad observada después de un
periodo de sincronización durante osc ilac ión libre, deberá empezar en la fase del día
determinada previam ente por el ze itgeber .
La sincronizac ión requiere de la sensibi lidad de los rece ptores externos a las
particularidades de las claves ambienta les. aunado al funcionamiento de los osciladores
endógenos para llevar a cabo oportunamente los procesos fisio lógicos y cond uctua les
result ado de la actividad integral del sistema circadiano (Aschoff, 1981).
2.1.6 Curva de Respuesta de Fase (reiniciando el reloj)
Una característica fundamental de l osci lador circadiano es su habilidad de aj ustar su propia
fase para sincro nizarse con la fase externa dictada por el fotoperiodo. Muchos estudios
referentes a la entrada de la luz al reloj se han realizado mant eniendo a los organismos en
oscuridad constante o luz tenue constante con un breve pulso de luz (sincronización no
paramétrica) (Harmer el al. 200 1). Existen 6 protocolos para obtener una curva de respuesta
de fase obtenidas a part ir de un ciclo LO (Asc hoff, 1965). Una de las estrategias para
obtener una curva de respuesta de fase (CRf), es dejando a un animal en un ciclo LO en
condiciones constantes, posteriormente se pondrá en osc ilación libre apli cando un pulso de
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7
luz durante los primeros días subjetivos en esta condición, el siguiente paso será determinar
el cambio de fase causado por la perturbación lumínica. Este acercamiento tiene varias
ventajas: antes del pulso de luz los animales han estado en un régimen en el cual los efectos
a largo plazo o las secuelas son predecibles. Este método permite además elegir el
momento adecuado para la aplicación de la señal temporal externa desde el ciclo LO previo
a la liberación en oscilación libre .
Otra estrategia para el análisis de los cambios de fase de un ritmo comprende las siguientes
premisas: 1) comprobar la sensibilidad del sistema circadiano mediante la administración
de pulsos breves de luz en diferentes fases en oscuridad constante y medir las posibles
transiciones de fase y 2) aplicar una serie de pulsos idénticos de manera que puedan
cumplir la función de un sincronizador, comprobando que cada pulso puede producir un
cambio de fase instantáneo controlado de acue rdo a la fase circadiana o por el contrario no
producirl o. Si esta hipótesis es co rrecta deberá ser posible predecir el curso del marcapasos
en cualquier clase de diseño experimental (Pittcndrigh, 1958).
Cuando los cambios de fase en respuesta a pulsos de luz son graficados en función de la
fase del sistema circadia no en el mome nto del pulso se obt iene una CRF. La primer CRF
fue medida para el ritmo circadiano de eclosión pupal en la mosca de la fruta Drosophila
pseudobscura (Pittendrigh, 1958). Un ejemplo de CRF se presenta en la Figura 1.
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8
Día
B e D EA
-4
-3
-2
-1
O
1
2
3 .--r -y- -.r
+ 4 ···
Avances
+2
o
-2
Atrosos
A B
-4
.- ora subjetivo -+ .- Noche subjetiva -+
o 6 12 18 24
Tie m ¡:::oCirc adia no (Hr)
Figura 1. Ejemplificac ión de la construcci ón de una curva de respuesta de fase (CR F). (A-
E) cinco cond iciones ex peri menta les de un animal noctu rno. La osc ilac ión libre se observa
en los días -4 a - l. En e l día ce ro, se da un pulso de luz a la mitad del día subjetivo (A) ,
durante el día subj et ivo tardío (8), durante la noche subjetiva temprana (C), durante la
noche subj etiva tardía (D) y en el día subj et ivo temprano (E). El pulso de luz en la mitad
del día subjetivo (A) no tiene ningún efecto, mientras que los pulsos en el día subjetivo
tardío y en la noch e subjetiva temprana (8 y C) producen retrasos de fase en el ritmo de
acti vidad. El pulso de luz administrado durante la noche subj etiva tardía y durante el día
subj et ivo temprano (O y E) produce un avance de fase. En la gráfica se encuentra la
con strucción de la curva de respuesta de fase a partir de la dirección, duración e intensidad
de los cambios de fase producidos por el pulso de luz (Modificado de Moore el al. 1982)
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9
El resultado es un cambio en la fase sobre eloscilador el cual se atrasa o se adelanta debido
a un cam bio de velocidad reflejado en las vías de salida. Con un pulso de luz se obtendrá un
pequeño cambio de fase dado durante el día subjetivo pero causará un gran retraso de fase
si este es dado durante la tarde temprana o adelanto de fase si es dado al atardecer subjetivo
(Harmer el al. 200 1).
2.2 Reloj Biológico
Se puede definir al reloj biológico como aquel sistema orgánico capaz de generar un orden
temporal en los procesos fisiológicos del organismo, oscila con un periodo regular y usa las
claves ambiental es como una referencia temporal interna (Pittendrigh y Oaan , 1976 ;
Aschoff, 198 1; Halberg el al. 1977 ; Granados el al. 1995). De esta forma pueden genera r y
exp resar ritmos a nive les molecu lares, bioquímicos , fisiológicos y conductua les de un
individuo en el momento adec uado según las condiciones ambientales.
En cuan to a la actividad del reloj a nivel molecular, se le divide en 3 partes centrales: vías
de entrada que recibe n y sincro nizan al oscilador cent ral con las claves am bientales, un
oscilador central (genera ritmicidad) y los componentes de salida que dan origen a la
expresió n de los ritmos biológicos (Figura 2). También algunos de los componentes de las
vías de entrada como los fotorreceptores pueden ser parte de las vías de salida del reloj
(Bognar el al. 1999; Emery el al. 1998), a pesar de lo anterior, el paradigma del oscilador
central es de gran utilidad (Harmer, el al. 200 1).
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10
• • • .c.
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Figura 2. Esquema que representa las fases de funcionamiento del reloj
biológico. Las vías de entrada del reloj en donde un zeitgeber (representado
por el Sol) sincroniza las asas de retroalimentación de los genes del reloj
(oscilador centra l) a un fotoperiodo y que resultará en la expresión
conductual (salida) de los ritmos del reloj (Modificado de Harmer, el al
2001).
Los elementos esenciales para que un sistema biológico oscile son el asa de
retroalimentación negativa con una o más variables y la capacidad del asa de
retroalimentación de generar retrasos (Friesen y Block, 1984). La naturaleza de los re lojes
circadianos es endógena y se encuentran regulados por genes que han sido caracterizados,
entre otros más que han sido descubiertos en fechas recientes.
A nivel genético y molecular el reloj se ha propuesto como un sistema de retroalimentación
en el cual la expresión de los genes del reloj es regulada por su producto proteico; el
período de renovación de este proceso es de alrededor de 24 horas generando así un ritmo
circadiano. De acuerdo a este esquema, el reloj por sí mismo consiste en una serie de genes
que codifican componentes que conducen e inhiben la expresión de otros genes
subsecuentes. Estas asas de retroalimentación representan el sistema central del reloj.
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11
Se han descrito los relojes moleculares de organismos pertenecientes a distintos grupos
como son: Cianobacteria (bacterias), Neurospora (hongos), Arabidopsis (plantas) además
de animales como: invertebrados Drosophila me/anogaster (mosca de la fruta) y
vertebrados como Mus muscu/us (ratón). En primer lugar nos referiremos al reloj molecular
de Drosophila me/anogaster, ya que al igual que los crustáceos, pertenece al subphylum de
los invertebrados y en segundo lugar al reloj de los mam íferos .
2.2.1 Reloj Molecular de Drosophila
Ciertas proteínas actúan como factores de transcripción de otros genes del reloj y regulan
negativa e indirectamente su propia transcripción , de esta forma originan patro nes de
osci lación genética. En todas las asas de retroalimentación descritas todos los elementos
negativ os y algunos de los positivos presentan ciclos a nivel de RNAm y/o de proteínas.
Existen elementos negati vos los cuale s son los primeros afectados por las señal es
ambientales para reiniciar el reloj y su fase se impone a los demás elementos de l reloj
(Harmer. el al. 200 1).
El estudio genético y molecular de los ritmos circadianos fue iniciado en Drosophila al
identi ficar y event ualmente clonar al gen mutante de period (dper) dado que su ausenc ia
altera la eclosión de las moscas (emergencia de los adu ltos de la pupa) y los ritmos de
actividad (Konopka y Benzer, 1971 ; Redd y el al. 1984). El siguiente gen clonado fue
timeless (dl im) el cual fue identificado por la habilidad de su producto, la proteína dTIM , de
unirse a la proteína dPER (Gekakis el al. 1995). La proteína dP ER contiene al dominio
proteico PAS. PAS es un acrónimo de las tres proteínas que contienen este dominio: la
proteína r ER, el producto S.IM del gen de Drosophila sing/e-minded y la proteína de
mamíferos ARNT (receptor de aril hidrocarbono de l trans locador nuclear) (Crews el al.
1988). El dominio PAS se conoce por su importancia en la interacción proteína-proteína.
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Los niveles de abundancia tanto del RNAm de dper como de la proteína dPER oscilan de
forma circadiana (Hardin el al. 1990). Los niveles de ambos RNAm de dper y dtim oscilan
y presentan máxima actividad en la noche temprana alrededor del tiempo circadiano 14 (14
h TC) (Hardin el al. 1990; Sehgal el al. 1995). Los niveles proteicos también oscilan con un
retraso en su fase respecto al RNAm , su máxima actividad la presentan a las 18 h TC
(Siwicki el al 1988; Zerr el al. 1990; Hunter-Ensor el al. 1996; Myers el al. 1996; Zeng el
al. 1996).
En moscas tipo silvestre el patrón de expresión espacial de dTIM es muy parecido al de
dPER ; el dímero dPER:dTIM se acumula en el núcleo de las neuronas del reloj con una
duración cercana a un día (Saez y y oung, 1996). Se ha propuesto a dper y dtim (con sus
respectivos productos) como parte del asa de retroalimentación negativa; dPER y dTIM
forman un heterodímcro y de esta forma dPER:dTIM se trasladan hacia el núcleo, y de
acuerdo a su abundancia, inhiben su propia transcripción (Kyriacou y Hastings; 200 1;
Stanewsky, 2002).
Los genes dclock (clk) y dcycle (cyc) codifican a las proteínas dCLOCK (dCLK) y
dCYCLE (dCYC) que pueden formar heterodímeros dCLK:dCYC y unirse a la caja-E (E-
box) presente en los promotores de dper y dtim , estimulando así la transcripción de estos
genes. De esta forma el dímero dCLK:dCYC es el factor positivo que regula la
transcripción de dper y dtim. Asimismo, el asa de retroalimentación autorregulada de
transcripción y traducción de RNAm y proteínas, ha sido definida como la fuerza que
conduce el mecanismo del reloj molecular.
Los niveles de las proteínas dPER y dTIM cont inúan elevándose a lo largo del día y
alcanzan su máxima actividad al comienzo del atardecer algunas horas después de la
máxima actividad del RNAm de dper y dtim. Las proteínas se heterodímerizan y se
trasladan al núcleo para inhibir la actividad transcripcional del dímero dCLK:dCYC, de
esta forrna reprimen su propia transcripción. A medida que dPER y dTIM son degradados
antes del amanecer liberando el proceso, y por consiguiente dejando de reprimir al dímero
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13
dCLK:dCYC, se inicia de nuevo el ciclo al comenzar la acumulación de dPER y dTIM
(Figura 3), Contrario a su nombre, la proteína dCYC producto del gen dcycle no oscila ni a
nivel de RNAm ni de proteína (Rutila el al, 1998, Bae el al . 2000)
1..
Figura 3. Interrelación molecular de las proteínas del reloj en las asas de
retroalimentación circadiana de Drosophila. La elipse representa la región nucl ear y la
región exte rna el citoplasma. La tra nscripción de dper y dtim se activa por el
heterodímero bHLH-PAS contenido en dCLK y dCYC. La fosforilación de dPER
depende de DBT y la proteína PER fosfori lada se degrada directamente. La proteína
dPER degradada se representa por e l círculo divid ido. dTI M en el citoplasma forma un
hete rod ímero co n dPER para estabilizarse. Ta nto dPER co mo dT IM entran al núc leo ,
posiblemente con DBT. SGG fosforila a dT IM y facilitala tran slocación al núcleo. El
het erodímero formado por dPER y dTIM suprime la actividad de dCLK:dCY C. Cuando
los niveles de dP ER y dTIM descienden, se inicia un nuevo ciclo de tran scripción .
Mientras que la transcripción de de/k es regu lada positivamente e indirectamente po r
dPER y dT IM, tamb ién es regulada negativamente por la tran scripción de VRI
(Modificado de Sh irasu el al. 2003).
En Drosophila, la sincronización del reloj circadiano estriba en la degradación de la
respuesta de TIM a la luz (Zeng el al. 1996). Otro de los componentes del reloj es la
proteína dCRIPTOCROMO (dCRY) la cual es una de las proteínas que intervienen en la
rápida degradación de dTIM por la luz (Ceriani el al. 1999). El gen dcriptocromo (dcry) se
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14
encuentra en los procesos de sincronización, así como en la generación de los ritmos
circadianos de múltiples organismos.
La expresión de RNAm de los genes mcry en el núcleo supraquiasmático (NSQ) y en la
retina presenta un ritmo circadiano en ratones (Miyamoto y Sanear, 1998). La expresión de
estos genes en la retina los hace fuertes candidatos a fotorreceptores circadianos, en
especial por los trabajos en donde se demostró que las células fotorreceptoras de la retina
(conos y bastones) no son necesarias para la sincronización del reloj circadiano de
mamíferos (Freedman el al. 1999), aún cuando este gen aún no se ha comprobado que actúe
como fotorreceptor, es probable que sea una ruta alternativa de entrada de luz al reloj
circadiano (Hsu el al. 1996). En Drosophila se encontró que la mutación de la proteína
dCR Y altera la sincronización de la ritmicidad circadiana (Stanewsky el al. 1998). La
proteína dCR y participa en la fotosincronización mediada por dTIM tanto en el marcapasos
central ubicado en las neuronas laterales (NL) como en el marcapasos periférico ubicado cn
los túbulos de Malphighi (TM) . El criptocromo también es indispensable para el
mecanismo endógeno del reloj de los TM, pero no del cerebro. Se puede observar de esta
forma que algunos de los componentes y las vías de sincronización a la luz parecen tener
roles específicos de acuerdo al tejido, ya sea este neura l o epite lial (Ivanchenko , 2001).
El gen double-time (dbt¡ de Drosophila es un homólogo del gen casein cinasa l e en
mamíferos (Kloss el al. 1998) (T abla 1). Se ha demostrado que la proteína DBT se asocia
con dPER y con el heterodímero dPER:dTIM y que fosforila a dPER en el día subjetivo
tardío cuando dPER es sintetizado en el citoplasma, DBT se une a dPE R y promueve su
fosforilac ión, de esta forma dPER se degrada y dTIM se acumula. La elevada
concentración de dTIM promueve la formación del complejo estable dPER:dTIM:DBT que
entra al núcleo durante la noche subjetiva temprana. En un período de 8-10 horas el
complejo dPER:dTIM :DBT es convertido en el complejo dPER:DBT y la progresiva
represión de la transcripci ón de dper y dtim resulta en la disminución del compl ejo
dPER:dTIM:DBT (Kloss el al. 200 1).
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15
El gen syaggy (sgg), homólogo del gen cinasa-3fJ glicógeno sintasa de mamíferos,
transcribe a la cinasa SGG que promueve la fosforilación de TIM y a su vez, regula el
momento de la entrada de dPER:dTIM al núcleo (Martinek el al. 2001). Por otra parte, la
proteína SLIMB es un componente esencial del reloj circadiano de acuerdo a recientes
investigaciones (Grima el al. 2002 ; Ko el al, 2002) en donde se demuestra que las moscas
mutantes para el gen slimb presentan una conducta arrítmica. SLIMB interactúa
principalmente con dPER previamente fosforilado por DBT y promueve su rápida
degradación.
Se han realizado algunos estudios que demuestran la capacidad de dPER y dTIM de
estimular la transcripción del gen dclk y la del heterodímero dCLK:dCYC para reprimir la
transcripción del gen dclk, formando así la intersección de las asas de retroalimentación
(Bae el al. 1998; Glosso p el al. 1999). La habilidad de las proteínas del reloj de funcionar
tanto de elementos negativos como positivos es de gran importancia, ya que permite la
modulación de la amplitud en la oscilación circadiana y a la vez permite ajustar con mayor
deta lle el funcionamiento del reloj circadiano. En estud ios recientes la proteína VRILLE
(VR1) producto del gen vrille, es el puente entre la intersección de las asas de
retroalimentación del reloj de Drosophila (Cyran el al. 2003; Glossop el al. 2003). De
forma independiente Glossop el al. (200 3) y Cyran el al. (2003) reportaron que VRl regula
la transcripción de dclk uniéndose específic amente a los elementos promotores de dclk y
funcionand o como un elemento negativo del asa de retroalimentación de dclk. La
regulación positiva de dclk en este contexto está dada indirectamente por dPE RldTIM,
previniendo la activac ión del gen vri por el dímero dCLK:dCYC. Este mecanismo se
encuentra también presente en el reloj de mam íferos.
2.2.2 Reloj Molecular de Mamíferos
Los componentes negativos del reloj de mamíferos son los 4 genes que codifi can para
mcriptocromo 1 (mcry l), mcriptocromo 2 (mcry2), mperiod 1 (mperl) y mperiod 2
(mper2). Estos genes son activados por el dominio PAS hélice-asa-hélice de los factores de
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transcripción mCLOCK y BMAL1 , los componentes positivos del oscilador circadiano. Las
proteínas mPER y mCRY forman dímeros y una vez que alcanzan una concentración crítica
en el núcleo celular, interactúan con el dímero mCLOCK:BMALl (BMAL1: homólogo de
la proteína CYCLE de Drosophila) y anulan la activación potencial de estos factores de
transcripción. En consecuencia el RNAm Y las proteínas mCRY:mPER disminuyen en
concentración una vez que la cantidad es insuficiente para auto-reprimirse entonces un
nuevo ciclo de transcripción de mper y mcry da comienzo (Albrect y Eichele, 2003 ;
Reppert y Weaver 2002).
Existen muchos componentes adicional es que contribuyen a fortalecer el sistema del reloj
molecular. Por ejemplo, el receptor nuclear y represor REY-ERBa (análogo a YRI en
Drosophila) interconecta la transcripción circadiana entre los componentes negativos y
positivos. La transcripción de rev-erba es regulada por los mismos componentes que
controlan la de per y cry, la acumulación de REV-ERBa conlleva a la represión periódica
de bmall uniéndose a su promotor. Esto permite la expresión rítmica de bmall y del
RNAm de clock que se presenta en am i- fase a la expresión de rev-erb a (Preitner el al.
2002).
La proteína CASEIN CINASA Ie (CKI E) fosfori la a las proteínas mPER, mCRY y
BMAL 1 (Eide el al. 2002 ; Eide y Yirshup 200 1; Lee el al . 2004). En hamsters con alelos
mutantes de ckle se acorta de forma importante el periodo de osc ilación del reloj molecular
(Lowrey el al. 2000). En Drosophila, la proteína CASEIN CINASA 11 (CKII) fosforila a
PER y aumenta su actividad represora (Lin el al. 2002 ; Nawathean y Rosbash , 2004).
Dadas las similitudes entre CKII de insectos y mamíferos se considera que la proteína CKII
de mamíferos también participa en la regulación de PER en el sistema (Gachon, 2004). La
Figura 4 esquemati za lo anterior.
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17
.....
.......
\
.
.....
..•...•
............................
.. •• .. • .. • .... • • • • t • •••• " .. . . •• ..... • • • • • •
Figura 4. Modelo s implifica do del osc ilado r circad iano de mam íferos. Este
modelo ex plica los hall azgos bioquímicos y las obse rvac iones hechas en ratones o
ham sters co n mutaciones de ge ncs de l reloj . Aún no se sa be co n ce rteza si la
fosforilac ión CKI y CK II aumenta la activ idad del co mplejo PER-CR Y. Ver
info rmación cn el texto (Tornado de Gac hon el al. 2003).
Es de gran importancia rnencionar que los genes del reloj molecular, genética y
funcionalmente, se encuentran conservados a lo largo de la historia evolutiva de los grupos
taxonómicos existentes. Los ritmos biológicos se observan en los organismos unicelulares
hasta los pluri celul ares. La Tabla 1 muestra las diferenciasy similitudes entre las proteínas
del reloj de Drosophila (insectos) y ratón (mamíferos).
Proteínas de Funciones y Proteínas de Funciones y
Drosophila Propiedades Ratón Propiedades
Proteína PASo No Proteína PASo
dPERIOD contiene mPERIOD1 , 2, 3 Interactúa con las
(dPER) dominios de unión (mPER1 , 2, 3) proteínas mCRY y
con DNA. Interactúa mPER y se traslada al
con dTIM. Inhibe la núcleo.
actividad de
dCLK:dCYC.
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"~: .r
dCLOCK
(dCLK)
dCYCLE
(dCYC)
-Factor ., ' bHLH-PAS.
Interactúa con
dCYC : Promueve la
transcripción de
dper y dtim a través
de la caja-E. Inhibe
la transcripción de
su propio gen.
Factor de
transcripción bHLH-
PASo Interactúa con
dCLK y promueve la
transcripción desde
la caja-E. Proteína
constitutiva.
. ' ..:;.~
" 1 \
mCLOCK
. (mCLK>' .
BMAL1
18
. 'Factor detranscrip'ción1
bHLH:.PAS: InteraCtúa:
'COn } -,~';'~ (' tBMAli 1 ~:;
Promueve . "~ . la'
transcripción de mper
y mcry a través de la
caja-E.
Factor de transcripción
bHLH-PAS, Análogo a
dCYC en Drosophila.
Expresión circadiana
de mRNA. Forma
heterodímeros con
mCLK y promueve
transcripción de mper
me .
OOUBLE-TIME
(DST)
dCRIPTOCROMO
(CRY)
Fosforila a dPER y
promueve su
degradación. Se
transloca al núcleo
junto con dPER.
Flavoproteina de
unión. Fotorreceptor
circadiano.
Promueve la
degradación
dependiente de la
luz por medio de la
interacción con
dTIM.
Casein Cinasa le
(CKIl':)
mCRIPTOCROMO
1,2 (mCRY1 y 2)
Fosforila amPER,
afecta la estabilidad de
mPER y su
localización
intracelular.
Mecanismo central del
reloj en ratones. Se
une a mPER y lo
estabiliza. Funciona
como translocador
nuclear de mper y-ery.
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19
Similar ' a' SGG de '
Drosophila. Su función ;
en el reloj no ha sido
del todo elucidada.
:.E4BP4·,
.; DBP ,
Glicógeno Cinasa
Sintasa 3p .
GSK313
a ' dTIM.
localización
de
Fosforila
Facilita la
nuclear
dPER:dTIM.
Factor: ',< '. ,.
J~ - "-'.'",. ~ ")~ -'.
transcripción ,
sin' do l11inio '
Suprime ·' .,
tra'l1scripción .,', '
de/k.
.Factor de
transcripción b-~~~
PAR. " <', ' Activa:
transcripción ,; " de';
de/k. <',
.,.....:..
VRILLE
(VRI)
SHAGGY
(SGG)
:Protelna-Domlnlo
PAR 1·(POP1)
Tabla 1. (Modificada de Shirasu el al. 2004) .
2.2.3 Fotoperiodo, reloj molecular y c-fos
Se ha demostrado que las variaciones en el fotopcriodo afectan el mecanismo central del
reloj en el NSQ (Sumová el al . 2004). Los estudios IIcvados a cabo con hamsters y ratones
indican que el fotoperiodo modula la expresión de los genes per sensibles a la luz y de su
respectiva expresión de proteínas en el NSQ (Messager el al. 2000; Nuesslein-Hildesheim
el al . 2000; Toumier el al. 2003 ; Steinlechner el al. 2002) . De forma similar en el NSQ de
ratas, la expresión inmunorreactiva de PERI (Sumová el al . 2002a , b) y del mRNA del gen
per1 (Sumová el al . 2003) es dependiente del fotoperiodo . Probablemente la inducción
lumínica de los genes perl y per2 presenten sensibilidad a la luz debido a la activación
dada por los factores de transcripción CREB o "terceros mensajeros" (Trávnícková-
Bendová el al. 2002; Tischkau el al. 2003). El papel que juega la proteína PER en el
reinicio del reloj activado por estímulos luminosos de corta duración durante la noche, aún
no se ha esclarecido.
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20
En mamíferos los niveles del RNAm de e-Jos (gen de expresión temprana) y la
inmunorreactividad de la proteína FOS presentan un elevado incremento de actividad en
presencia de la luz en la región ventrolateral (VL) del NSQ (Jác el al. 2000a). Esta relación
de eventos se debe a que la región VL del NSQ recibe aferencias directamente de la retina,
siendo diferente en el caso de la región dorsomedial (DM) del mismo NSQ, debido a que
no está comunicada con la retina de forma directa (Jác el al. 2000b; Van den Poi, 1991,
Sumová el al. 1998, Guido el al 1999, Schwartz el al . 2000). De acuerdo a lo anterior, la
región VL sincroniza la expresión del gen e-fos a la luz recibida por la retina y la región
DM presenta un ritmo espontáneo (Jác el al. 2000a), sin embargo se correlaciona a la luz
posiblemente por la comunicación que exista con la región VL (Sumová el al. 2000).
La luz afecta al reloj molecular al activar factores de transcripción que regulan la expresión
de los genes del reloj (Morse y Sassone-Corsi, 2002). La caracterización de los mecanismos
por medio de los cuales la luz induce un cambio de fase en el osc ilador circadia no es uno de
los mayores problemas que deben ser desentrañados para comprender la fisiología
circadiana (Pittendrigh, 1981). Aún en fechas reciente s se sabe muy poco de cómo la luz
inicia los eventos celulares que con lleva n a un cambio de fase en los ritmos circad ianos
(Cymborowski y King, 1996).
2.3 c-fos Gen de Expresión Temprana
En los mamíferos la información acerca de los periodos luminosos que llega al NSQ a
través de vías glutamaérgicas induce una cascada de 20s mensajeros dependiendo del
momento del día (Eblig el al. 1991, Ding el al. 1994), activándose más tarde los 30s
mensajeros CREB (elemento responsivo de AMPc) (Trávnicková-Bendová el al . 2002;
Tischkau el al. 2003) al fosforilar proteínas y al modi ficar la fase del NSQ en presencia de
estímulos lumin osos (Kornhauser el al. 1990, Ginty el al. 1993). (Figura SA. La propuesta
alternativa de esta vía de actividad se muestra en la Figura SB en donde el complejo AP- l
formado por FOS y JUN presenta actividad previa a CREB probablemente regulando su
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RNAm formando un asa de retroalimentación positiva en el control de plasticidad
sináptica.)
La fosfoproteína nuclear FOS producto del protooncogen c-fos es parte de una compleja
secuencia especí fica que se une al DNA y que altera la ex presión genética regulando la
transcripción de otras proteínas (Curran y Franza, 1988; Jác el al. 2000a). La expresión de
c-fos ocurre a los 5 mino a nivel del RNAm después de una estimulación y continúa
posteriormente entre 15 y 20 mino a nivel proteico (Greenberg y Zi ff, 1984; Greenberg el
al. 1985). La acumulación de RN Am tiene un máximo de act ividad de entre 30 y 45 m ino
(MüIler el al. 1984); la proteína FOS sintetizada tiene una vida media ce rcana a las 2 h
(Curran el al. 1984; MüIl er el al . 1984).
FOS actúa en conj unto co n los factores de transcripción JUN, ATF, bZlP y sus respectivas
familias form ando hom od ímero s y heterodímeros que integran el grupo de factores de
transcripción llamados AP - I (proteína act ivadora 1). Las pro teínas JUN forman
homodímero s entre ellas y heterodímero s mu y es tables co n las prote ína s de la familia FO S
y ATF. La ac tividad del co mplejo AP- I es regul ada por la abundanci a y ac tiv idad de las
proteínas que forman el co mplejo medi ant e es tímulos ex trace lulares . La abunda nc ia del
complejo AP-I es reg ulada por el mismo mecani sm o de transcr ipción (Sonne nberg, el al.
1989):
En cereb ros de animales SIl1 nin gún tratamiento, la inmunorreacti vidad a FOS se
incrementa sólo en el núcleo de ciertas neuronas después de una estimulación cortical
(Sagar el al. 1988), periférica (Hunt el al. 1987; Menetrey el al . 1989) o de la privación de
agua (Aronin, el al. 1990). La exposición de ratas a pulsos de luz incrementa la
inmunorreacti vidad a FOS en algunas células del núcleo interno y de las capas de células
ganglionares de la retina (Sagar y Sharp, 1990).
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22
A
I
\
- - - ....~ A P -:1..........'
....... CR.~
0 ·0
B
AMP c
j
s
Figuras 5a y 5b. A. Esquema de la actividad propuesta de la proteína FaS en mamíferos a partir
de un pulso de luz. La luz se trasduce en la retina y su señal viaja por la vía ret inohipotalámica hasta
llegar a las neuronas del NSQ en donde se activan cascadas de AMP cíclico a través de las vías
glutamaérgicas y el factor CREB que activa los genes de expresión temprana c-fos y e-jun. Las
proteínas FaS y JUN forman un dímero y activan a los genes del reloj. GLU, vías g lutamaérgicas;
GET RNAm,RNAs mensajeros de los genes de expresión temprana (Modificado de Takahashi,
1993).
B. Esquema de una propuesta alternativa de la actividad del complejo AP-I formado por FaS y
JUN. JNK activa la transcripción del los genes AP-I y regula la actividad de CREB en donde
ambos forman un asa de act ividad positiva (Sanyal, 2002).
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2.3.1 Inducción lumínica de c-fos
En el NSQ, los genes c-fos y junB comienzan su actividad después de un estímulo luminoso
(Kornhauser, el al. 1993; Schwartz, el al. 1995); la actividad de las proteínas FaS y JUNB
puede regular la expresión de genes tardíos (Kornhauser, el al. 1993; Schwartz, el al.
1995). La luz induce la expresión de c-f os y de junB en el NSQ sólo durante la noche
subjetiva, en donde también se presentan los cambios de fase circad ianos (Kornhauser, el
al. 1993; Schwartz, el al. 1995; Trávnícková, el al. 1996). Los estudios en mamíferos han
demostrado la expresión inducida de varios genes de expresión temprana como c-fos en el
NSQ en las horas en donde puede cambiar su fase (Cymborowski y King, 1996) y de esta
forma acoplar la luz a las vías de señalización en el NSQ (Dkhissi-Benyahya, 2000). Estas
observaciones han sido realizadas para hamsters (Kornhauser, el al. 1990; Rea, 1992),
ratones (Colwell, el al . 1993) o ratas (Sutin y Kilduff, 1992).
La vía mediante la que el reloj molecu lar regula la respuesta a un estím ulo luminoso aún no
ha sido descrita (Sumová el al. 2004). Al utilizar la fase de un ritmo controlado por el reloj
como marcador de actividad y administrar un estímulo luminoso durant e la tarde o durante
el principio de la noche de la rata, se induce un retraso en la fase del ritmo, mientras que un
estímulo luminoso aplicado durante la noche tardía o durante las primeras horas de la
mañana adelantan la fase (Daan y Pittendrigh, 1976; llInerová y Vanecek, 1982; 1987;
Sumová e I1I nerová, 1998). Estos eventos se encuentran relacion ados con las vías de
entrada del reloj (Kornhauser et al. 1990). La sincronización al fotoperiodo mantiene al
reloj endógeno en una fase apropiada que provee información al organismo acerca de la
temporada del año en que se encuentre y prepararse para la próxima estación (Sumová el al .
2004).
En la mosca Calliphora vicina la expresión de la proteína FaS aumenta en el cerebro en
presencia de un estímulo luminoso dado durante la noche subjetiva, especialmente en las
neuronas de la región llamada pars inlercerebralis (principal marcapasos en insectos) se
relacionan con la luz y con una hora del día específica; la expresión de FaS se presenta
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durante cualquier momento de la noche subjetiva, no siendo así en el día subjetivo
temprano. Los cambios de fase en la actividad locomotora presentan la misma relación
(Cymborowsky y King , 1996).
2.3.2 Sistemas de regulación de c-fos
Algunos elementos median la inducción de c-fos: cerca de la región TATA en el DNA se
encuentra unida una de las proteínas de la fami lia CREB o proteínas de la fami lia ATF que
regulan la inducción de c-fos por medio de cAMP y dependiente de Ca2+ de las vías de
señalización de neurotransmisores y hormonas (Sheng , et al. 1991). El segundo elemento
que regula la transcripción de c-fos es SIE reconocido por el grupo de factores de
transcripción STAT (acti vadoras y transductoras de la señal de transcripción) (Damell , el
al. 1994). Las proteínas STAT son activadas y traslocadas en el núcleo en respuesta a
seña les de activación del grupo de cinasas JAK (cinasas Janus) (Damell, el al. 1994) . Un
tercer elemento que regula la transcri pción de c-fos es SER reconocido por el dímero SRF
que a su vez requ iere del co mplejo de factores monoméricos tem arios (TCF) (Treisman,
1992).
Las primeras señales derivadas de la actividad neuronal inducen la señalización de Ca2+ y
de AMPc. El mecanismo postulado de la actividad mediadora de AMPc para regular la
transcripción del complejo AP-I se desconoce (Sanyal el al. 2002).
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2.4 El Acocil como Modelo de Estudio
Los acociles pertenecen al extenso taxón de los crustáceos Decápodos, siendo los únicos
representantes de agua dulce del grupo Reptantia Macrochelata (Scholtz y Richter, 1995).
Los acociles son fácilmente aclimatables fisiológicamente y conductualmente, y han podido
extender su localización léntica y lótica a ambientes subterráneos o semiterrestres, así como
a ambientes acuáticos semisalobres (Holdich, 2002).
Se conocen más de 540 especies de acociles con mayor diversidad en Norteamérica y
Australia. Ciertas especies son extremadamente invasivas y se establecen rápidamente en
nuevas zonas (Gherardi y Holdich, 1999) como es el caso del acoci l Procambarus clarkii.
Aunque los acoc iles por lo general son omnívoros existen algunas especies depredadoras
que afectan de forma importante su ambiente físico y biológico debido a la construcción de
madrigueras que utilizan para su protección.
El acoci l Procambarus clarkii utilizado en este trabajo es recolectado en Delicias.
Chihuahua (2345 msnm y 27°45'N). Se encue ntra en charcas y fondos lodosos y es
abundante en pantanos estacionales yagua cenagosas en donde forma madrigueras y
túneles, tanto en cautiverio como en su habitat natural es de hábitos nocturnos. P. clarkii es
una especie invasora que ha ampliado su distribución geográfica, ya que a principi os de
siglo no se encontraba en el territorio nacional y sin embargo ahora se encuentra en el norte
de Chihuahua, por su capacidad de desplazar a las especies nativas de diversos ambientes
(Huner, 1988).
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26
2..1.1 Organización del Sistema Nervioso Central
El sistema nervioso central del acocil está compuesto por cerebro (ganglio supraesofágicoi,
lóbulos ópticos y cadena ganglionar localizada debajo del tracto alimenticio. (Figura 6)
(Huxley , 1879; Keim, 1915; Holdich y Reeve , 1988).
Nervio de lo
glándula antenal
Esófago
Comisura postesofágica
Nervio podal
Nervio genital
Cerebro
Ganglio de lo cornsu-
Ganglio subesofágico
Ganglio torácico 1
Ganglio torác ico 5
Ganglio abdominal 1
Nervio natatorio
71- .~-. Nervios de músculos
;;y •.-
~._ _ ...,...., . extensoresy flexores
Ganglio terminal
i..- - '
Figura 6. Esquema de la cade na ganglionar y las regiones que inerva. La cadena ganglionar del
acoc il se encuentra en la región ventral (Modificado de Keim, 1915 ).
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27
2.4.2 Características del Lóbulo Óptico
Los acociles adultos poseen ojos de tipo compuesto y pedunculado. Cada ojo compuesto
está forrnado por 2500 omatidias y cada una posee sus propios elementos ópticos. Cada ojo
está recubierto por una cutícula transparente de aproximadamente 60rnm de ancho, la
córnea. La omatidia es la unidad funcional donde se encuentra el rabdomo principal
formado por rabdomos individuales de 8 células retinulares, la membrana de cada uno se
encuentra plegada y en las región interna formada por los rabdomos individuales se
encuentra una célula del tapetum. En el rabdomo principal se concentra la rodopsina que es
un pigmento fotosensible. Las células pigmentarias contienen gránulos de pigmento denso
y rodean a cada cono cristalino. Dentro de estas células la rodopsina se ubicará de acuerdo
a su grado de adaptación a la luz. Cada una de las omatidias se encuentra sobre la
membrana basal la cual es perforada por axones de las células retinul ares de l lóbul o óptico
el cual está comunicado con el cerebro (Holdich y Rceve, 1988 ).
Los ncuróp ilos periféri cos de los lóbulos ópticos son: l ámina ganglionaris, médula externa,
médula interna , médula terminalis y cuerpo hemielipsoidal (Figura 7). La función de la
lámina y de las médulas externa e interna está relac ionada con procesos visuales mientras
que la médula terminal y el cuerpo hemielipsoidal al derivar embriológicamente del
protocerebro medio, podr ían intervenir en la integración olfator ia (Sandeman, 1990).
Neevia docConverter 5.128
Pedúnculo del
Lóbul o ó onco
Glónduia
5'nusol
Médu!a
Terminal
Tracto
Cerebro-
GlándlJla
Sinuscl
Figura 7. Esquema de las subdivisiones internas del lóbulo óptico de acocil (M odificado de
Barrington, (979) .
Entre la médula interna y la médula tcrmin alis se locali za una región de células
ganglionares que se caracterizan por tener un gran núcleo (de 12 a 16 mm) y esca so
citoplasma, a este conjunto de células se le conoce como órgano-X. En la periferia del
tracto óptico, entre la médula externa e interna, se localiza una estructura neurohemal
altamente vascularizada que contiene proyecciones de la médula externa, interna, del
quiasma óptico interno y del órgano-X conocida como glándula sinusal.
2.4.3 Características del Ganglio Supraesofágico o Cerebro
El cerebro o ganglio supraesofágico se localiza en la parte anterior del cefalotórax y se
conecta al ganglio subesofágico por medio de dos conectivos circumesofágicos. A partir del
ganglio subesofágico da comienzo la cadena ganglionar ventral integrada por 5 ganglios
torácicos y 6 abdominales, unidos entre sí mediante nervios conectivos. Los nervios de los
ganglios se encuentran pareados, de esta forma funcionan unitariamente.
Neevia docConverter 5.1
29
El cerebro da origen a 5 pares de nervios y 2 no pareados. Los nervios pareados incluyen el
nervio óptico, nervio oculomotor, nervio antenular, nervio antenal y nervio tegumentario.
Los no pareados unen al cerebro con los nervios del esófago. Cada ganglio que integra la
cadena inerva distintas regiones del acocil (ver Figura 6). El ganglio subesofágico tiene 11
raíces nerviosas de cada lado. Siete nervios corren de la glándula antenal, mandíbula,
maxilula, maxila y de los maxilípedos 1-3, cuatro nervios van de los músculos
dorsoventrales y longitudinales del tórax.
El cerebro del acocil incluye por lo menos 80 000 neuronas (Elofsson, 1986) organizadas
en neurópilos, conjuntos neuronales periféricos y tractos nervio sos. Los lóbulos accesorios
son las estructuras más grandes del cerebro en contraste con muchos otros decápodos
(Holdich, 200 1).
El cerebro (F igura 8) puede ser dividido en 3 regiones originadas de los elementos
neura les: protocerebro, deut erocerebro y tritocerebro (Sandeman, 200 1).
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~ ... ,~
'1pj CC
esF.
Figura 8. Esquema que muestra las principales divisiones y subdivi siones del cerebro
del acoci l. PR, protocerebro; DE, deuteroc erebro; T R, tritocerebro; TO, tracto
óptico; PP, puente protoce rebral; ce, cuerpo central ; eAM, conjunto anterior-
media l; LA, lóbulo accesorio; LO, lóbulo olfatorio; eSE, conec tivos
subesofágicos (Modificado de Sandeman el al. 1988).
Neevia docConverter 5.1
30
El protocerebro incluye las siguientes regiones:
Ganglio óptico: Contiene 3 neurópilos que probablemente se dediquen a procesar la
información recibida por los fotorreceptores provenientes de la retina.
l. Lámina: Primer neuropilo detrás de la retina
2. Médula externa: Detrás de la lámina, se encuentra organizada en capas
transversales.
3. Médula interna: Región más próxima de los 3 neurópilos en el ganglio óptico, se
observan bandas transversales claramente definidas. Las 3 regiones están
organizadas geométricamente.
Protocerebro lateral: Integrado por dos neurópilos encontrados en el segmento distal del
tallo ocular muy próximo al ganglio óptico.
l. Médula terminal: Neurópilo complejo no geométrico con vanas subdivisiones
(Blau stein et al. 1988). Contiene célu las neurosecretora s del órgano-X y se asocia al
órgano neurohemal mejor conocido como glándula sinusal; ambos constituyen uno
de los sistemas neuroendocrinos más importantes en los crustáceos.
2. Cuerpo hemielipsoidal: Se encuentra en la parte anterior respecto a la médula
terminal.
Protocerebro medio: Forma la parte anter ior de los neurópilos medio situados en el cerebro .
Se encuentran dos neurópi los med ios pareados y dos no pareados.
1. Neurópi lo anterior del protocerebro medio (NAPM): Estos dos neurópilos se
encuentran en ambos lados de la línea media en la parte anterior del protocerebro
medio.
2. Neurópilo posterior del protocerebro medio (NPPM): Se encuentran dos neurópilos
a ambos lados de la línea media, posteriores a los dos neurópilos descritos
anteriormente.
Neevia docConverter 5.1
31
3. Puente protocerebral: Se encuentra embebido en el filo anterior del NAMP. Este
neurópilo en forma de V está formado por varios axones largos con ramificaciones
muy finas . En el acocil Cherax destructor, los fotorreceptores extraretinianos se
encuentran en la región anterior terminando en el neurópilo del puente protocerebral
(Sandeman et al. 1990).
4. Cuerp o central: Neurópilo en forma de puro atravesando el cerebro y dividiendo la
región medial de la posterior. El cuerpo central es un área bien definida en donde se
han realizado estudios inmunocitoquímicos en donde se ha observado un gran
variedad de sustancias neuroactivas como la serotonina, la octopamina y la
sustancia P entre otras (Schürmann et al. 1991).
Se pueden localizar dos quiasmas ópticos entre lámin a ganglionaris y médula externa y
entre médula externa y médul a interna. Estos quiasmas son el resultado de la rotación
completa de la médula externa durante el desarrollo embriológ ico (Elofsso n y Dahl, 1970).
El protocerebro parece enca rgarse de procesar las seña les visuales y se piensa que contro la
el sistema endocrino de las neuronas que regulan la vía glándu la sinusa l- órgano-X.
El deuterocerebro incluye los lóbulos olfator ios, los lóbulos accesorios y los neurópil os
antenulares y los conj untos celulares asoc iados . Esta región del cerebro es responsable de
procesar e integrar las señales olfativas . El tritocerebro comprende los neuropilos
antenales, los ganglios de la comisura y los ganglios de la comisura postesofágica
(Holdich, 2000).
Se han reportado 65 tipos de neuronas en el cerebro del acoc il Orconectes virilis (Seabrook
y Nesbitt , 1966). Treinta y un neuronas ubican sus somas en el protocerebro (lóbu los
ópticos y cerebro) de éstas, diez están localizadas en la zona cerebral y la mayoría son
interneuronas con eferencias en el mismo cerebro o hacia al nerv io óptico. Diecinueve
neuronas se han descrito para el deutorocerebro y diez para el tritocerebro (Bliss, 1982).
Neevia docConverter 5.1
32
2.5 Ritmos Biológicos en el Acocil
El estudio de la organización anatómica y fisiológica de los sistemas circadianos en
invertebrados ha tenido una larga y productiva historia. Los acociles presentan una gran
variedad de ritmos circadianos a nivel fisiológico y conductual. Locomoción, contenido
hormonal en sangre, actividad del corazón, posición de los pigmentos de protección de la
retina, etc. (Aréchiga el al. 1993).
Los estudios dedicados a la localización de los marcapasos en invertebrados -
(principalmente en artrópodos y moluscos) se han enfocado al sistema nervioso. En el caso
de los artrópodos parece que los marcapasos circadianos se localizan en el cerebro (o
ganglio supraesofágico) (Aschoff, 1981; Fanjul-Moles y Prieto-Sagredo. 2003) . El más
importante probabl emente se encuentre localizado en el protocerebro (So l órzano-García et
al. 1999).
El acoc il Procam barus clarkii ha serv ido corno modelo expe rimental para la observación
de diversos ritmos desde los estudios de la amplitud del [:RG (clectrorretinograma) hasta
ritmos de naturaleza pigmentaria y metabólica (Rodríguez-Sosa el al . 1994). El lóbulo
óptico y el cerebro han sido dos de los marcapasos primarios propuestos para esta especie
(Page, T. y Larim er, J., 1975; Fanjul-Moles el al. 1987, 1992; Fanjul-Moles y Fuentes-
Pardo, 1988; Fanjul-Moles y Prieto-Sagredo, 2003), se ha estudiado el papel de los lóbul os
ópticos y del fotorrece ptor caudal en la sincronización del ritm o de actividad locomotora
(Page y Larimer , 1972), las variaciones diarias de la horm ona hipergl icem iante de
crustáceos (C HI-I) durante los estadíos de desarroll o (Escamilla-Chimal,el al. 200 1).
Actualm ente el sistema circadiano del acoc il se considera co mo un sistema marcapaso
distribuido que podría ser de natural eza jerárquic a. Se han propu esto tres posibles
marcapasos: la retina, (Aréchiga y Rodríguez-Sosa, 1998) el lóbul o óptico (Sánchez y
Fuentes-Pardo, 1977) y el cerebro (Page y Larimer, 1980).
Neevia docConverter 5.1
33
3 Justificación del problema
En los acociles se han propuesto diferentes marcapasos y fotorreceptores extrarretinianos
que participan en la fotosincronización circadiana (Page y Larimer, 1980), sin embargo las
estructuras neurales específicas que regulan este fenómeno no se conocen aún. El ganglio
supraesofágico o cerebro y los lóbulos ópticos son los posibles marcapasos primarios,
(Page, el al. 1976; Barrera y Block, 1990) en particular el complejo médula terminalis-
glándula sinusal que forma parte del protocerebro lateral y las regiones anterior y media del
protocerebro ubicado en el ganglio supraesofágico (Fanjul -Mol es y Prieto-Sagredo, 2003).
Una de las estrategias utilizadas en mamíferos para localizar la actividad de las regiones
marcapasos es a través de la expresión del RNAm del gen c-fos que a su vez transcribe a la
proteína f OS en el NSQ. La expresión de FOS inicia después de haber recibid o una señal
lumínica durante la noche subjetiva de los organismos. Hasta el momento se sabe poco
acerca de los mecanismos mediante los cuales la luz inicia un even to que conlleva un
cambio de fase en los ritmos circadianos del acocil. Estos evento s probablement e se
generan en las estructuras respo nsab les de reiniciar el reloj y se encuentran en función del
tiempo circadiano en el cual la luz se presenta. Si la proteína FOS es un indicador de
actividad temprana del NSQ de mamíferos, probablemente en el acocil Procambarus
clarkii sea un marcador de las estructuras marcapasos y/o de las estructuras involucradas en
la fotosincroni zación .
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34
4 Objetivos
1. Investigar mediante técnicas inmunorreactivas si la inducción de la proteína FaS es
un indicador de la sensibilidad circadiana en el acocil Procambarus clarkii.
2. Determinar si la fotoestimulación induce la expresión de la proteína FaS en el
protocerebro del acocil, una estructura marcapaso del sistema circadiano.
3. Determinar si la intensidad de la expresión de la proteína FaS está relacionada con
el tiempo circadiano del animal.
5 Hipótesis
• Si c-fos es un marcador de la sens ibilidad circad iana del acoc il entonces la
fotocs timulación del protocerebro inducirá la ex presión de la pro teí na fOSo Esta
inducción es tará relacion ada co n la hora circadiana.
Neevia docConverter 5.1
35
6 Método
6.1 Cuidado de los Acociles
Los acociles de la especie Procambarus clarkii fueron recolectados en Delicias, Chihuahua
(270 24' latitud norte) y llevados al laboratorio para su manutención. Los acuarios se
encontraban constantemente aireados a un intervalo de temperatura de 20 a 22°C en
fotoperiodo LO 12:12. La aclimatación de los organismos durante esta fase duró al menos
una semana. Se alimentaron con verduras cocidas como zanahorias, chayotes y calabazas
cada tercer día.
De este grupo se utilizaron 18 acociles adultos en fase de intermuda escog idos al azar sin
importar el sexo. La fase de luz del fotoperíodo fue regulada por una lámpara fluorescente
conectada a un interruptor program ado para encenderse a las 19:00h y apagarse a las
07:00h. Los acociles se mantuvieron en estas condic iones por lo menos 7 días antes de la
fase experimenta l.
6.2 Diseño experimental
Se llevaron a cabo 2 tipos de experimentos:
1) En un primer experimento un grupo de nueve acociles dividido en tres grupos se
sincronizó a ciclos de luz oscuridad 12:12 (encendido 07:00) durante 2 semanas, el último
día del experimento durante la fase oscura de l ciclo se administró un pulso de luz blanca de
170 lux durante 30 minutos a diferentes tiempos de la noche subjetiva correspondiendo
respectivamente a las 13:00 TC, 17:00 TC y 23:00 TC.
2) Un segundo expe rimento (tomado como control del experimento 1) fue conformado
por nueve acociles y fue dividido en tres grupos. Los animales se sincronizaron a ciclos de
luz oscuridad con las mismas características del primer experimento. Los animales
permanecieron 24 h en oscuridad después del apagado de la luz antes de sacrificarse. En la
Neevia docConverter 5.1
36
noche subjetiva correspondiente cada uno de los 3 grupos de organismos sin estimulación
luminosa se sacrificó en las horas circadianas correspondientes a las del experimento
(13:00 TC , 17:00 TC y 23:00 TC).
6.3 Histología
Los acociles fueron sacrificados hac iendo un corte rápido por la línea que divide el
cefalotórax y el abdomen, se fijaron únicamente la cabeza en PBS pH 7.6 con formol al
10% al menos durante 4 h a 4°C. El ganglio supraesofágico fue disectado bajo el
microscopio de disección (Olympus SZ-STU 1) Y se colocó en formol al 10% con PBS por
4 h más a la temperatura mencionada anteriormente. El tej ido nervioso fue deshidratado
gradualmente mediante alcoholes preparados en el siguiente orden: al 50% (24 h), 70% (24
h), 96%( 12 h) Y 100% ( 12 h). Al término de la deshidratación, se aclaró el tej ido con xilol
(EM Science) por 30 minutos y se colocó en paraplast (Oxford Labware) líquido por 12 h
en una estufa a 59°C. Inmediatamente después, el tejido se incluyó en paraplast y se dejó
secar a temperatura amb iente durante un día . En un microtomo (Americ an Optical Modelo
820) se realizaron cortes horizontales de 5 um de espesor. Los cortes fueron puestos en
baño de flotación (Lab-Line lnstruments, Inc.) con grenetina de grado bacteriológico
(Sigma) y montados en portaobjetos.
6.4 Lnmunohistoquimica
Para cada serie de cortes de un mismo organismo se escogieron laminillas al azar del
principio, mitad y final de la serie, y fueron desparafinadas en xilol por 15 min. ,
rehidratadas en alcoholes graduales comenzando en 100% (lO min.), 96% (lO min.), 70%
(5 min.), 50% (5 min.) y finalmente puestas en agua destilada. Se colocaron en una cámara
húmeda a temperatura ambiente y se realizaron los siguientes pasos: 1) lavado con una
solución PBS pH 7.6 por 10 minutos, 2) aplicación de bloqueador de proteínas (BioGenex)
por 20 minutos, 3) incubación del anticuerpo policlonal primario de conejo anti-Fos (Santa
Cruz Biotechnology) con dilución de 1:I000 durante una noche a 4°C, 4) lavado con PBS,
Neevia docConverter 5.1
37
5) incubación con el anticuerpo secundario biotinilado anti-IgG (BioGenex) por 20
minutos, 6) marcaje con el complejo fosfatasa alcalina/estreptavidina (BioGenex), 7)
revelado con el cromógeno rojo rápido (BioGenex) en conjunción con Levamisole
(BioGenex). Con el fin de observar la ubicación de los núcleos, algunas preparaciones
fueron contrastadas con hematoxilina de Mayer.
6.5 Análisis y Procesamiento de Imágenes
Por cada organismo se seleccionaron tres secciones, de acuerdo a los pnncipios
estereológicos, la primera fue escogida al azar y las dos siguientes fueron seleccionadas
tomando una distanci a de 3 preparaciones con relación a la primera (Howard y Reed,
1988).
La captura de imágenes se realizó mediante un microscopi o óptico (Nikon) con una cámara
digital (Media Cybernetics) integrada al microscopio fueron capturados cada uno de los
cortes y grabados en la computadora con el programa de cómputo RS lmage (versión
1.9.1). Debido a que el campo de visión de la cámara digi tal es reducido conforme se
incrementa el valor del objetivo en el mic rosco pio, se grabaron microfotografías
secuenciales que conforman en su totalid ad la imagen de un corte individual. Las
microfotografí as se unieron y los cortes se reconstruyeron mediante el programa Corel
Draw (versión 9.337). Se repitió el mismo proceso en los cortes de las ser ies analizadas de
cada condición por cada hora. Ver Figura 8.
Neevia docConverter 5.1
38
Cámara digital montada
en el microscopio
LaminillaconcortesMicrofotografía individual
porción de un corte
Reconstrucción de microfotografías
enCarel Draw
Figu ra 8 . Esquema ilustrati vo de la metodol ogía utilizada en la captura de una se rie de
microfotografías de un cort e y su recon strucción en un programa de có mputo .
Para analizar la diferenci a inm unorreactiva a FOS en las tres co ndiciones del ex perimento
1, se determinaron dos parámetro s: 1) área inmunorreacti va y 2) intensidad promedio de
cada imagen reconstruida del protocerebro. Esto se realizó mediante el programa de
procesamiento y análisis de imágenes Sigma Sean Pro (versión 4.0 1.003) . El área
inmunorreactiva fue medida por fracción volumen (FV), midiendo el área total del
protocerebro y por separado el área inmunorreactiva del mismo (núcleos y citoplasma) .
La relación es la siguiente:
Área inmunorreactiva (núcleos y citoplasma)
F V=
Área total (área protocerebral total)
Esta relación nos permite medir el área relati va indispensable en este caso ya que de
organismo a organismo el tamaño total del protocerebro varía y por consiguiente también el
área inmunorreactiva. El índice con mayor correlación de área teñida y área tota l de cada
Neevia docConverter 5.1
39
protocerebro es aquel donde el resultado sea =1 ; cualquier índice de correlación menor, será
>1, de esta forma los datos obtenidos fueron comparables entre las distintas condiciones.
La intensidad inmunorreactiva promedio de las imágenes de ambos experimentos (1 Y 2)
fue medida mediante el programa Sigma Sean Pro. El programa indica la intensidad de
pixeles, el valor para ausencia de coloración es de 255 y el valor más bajo O equivalente a
la máxima saturación de pixeles. La escala fue invertida para evitar errores de
interpretación, de esta forma los valores más bajos fueron los que tendieron al blanco y los
más altos los que se acercaron más al negro.
6.6 A nálisis Estadístico
Las diferencias entre la condición con trol y los grupos experimentales fueron analizadas
media nte análisis de varianza (ANOVA) seguida de la prueba post hoc Schcffé en el
programa Statistica (versión 5.1, StatSoft lnc .).
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40
7 Resultados
7.1 Experimento 1
El análisis de los cortes mediante microscopía óptica mostró inmunorreactividad a FOS en
la región protocerebral mostrada en su totalidad por una reconstrucción microfotográfica en
la Figura 1. De forma particular se observa tinción en la región anterior, de forma
particular en el conjunto anterior medial (CAM) del protocerebro, así como en el puente
protocerebral. En ciertas regiones citoplásmicas de las regiones deuterocerebral y
tritocerebral (resultados no mostrados) se observó inmunorreactividad la cual no fue
evaluada en este trabajo.
p
Figura 1. Ejemplo de una reconstrucción de microfotografías de un corte en
direc ción longitudinal con vista ventral de la región protocerebral (núcleos
contrastados con hematoxilin a). A, anterior; P, posterior; CAM, conjunto
anterior medial ; RA, región anterior; NAPM, neurópil o anterior del protocerebro
medio; NPPM, neurópilo posterior del protocerebro medio; PP, puente
protocerebral; CC, cuerpo central. Barra de ca librac ión: lOOJ1m.
Neevia docConverter 5.1
41
Las figuras 2, 3 Y 4 muestran microfotografias de cortes en dirección longitudinal con vista
ventral del protocerebro los cortes histológicos que corresponden respectivamente a las
condiciones experimentales en donde se administró el pulso de luz durante la noche
subjetiva temprana (13 :00 h TC), mitad de la noche subjetiva (17 :00 h TC) y en la noche
subjetiva tardía (23:00 h TC) respectivamente. Se observa inmunorreactividad a FOS en el
citoplasma de la región anterior y algunos núcleos sin tinción.
La figura 2 es una microfotografl a representati va de las 13:00 h TC en donde el prom edio
de intensidad de tinción presenta diferencias estadís ticamente significa tivas (ver figura 6)
en comparación con las demás horas experimentales muestreadas. Obsé rvese la diferencia
en la intensidad de tinció n de l cito plasma en las 3 microfotografí as representati vas de las
tres horas experi mentales.
Neevia docConverter 5.1
Figura 2. Microfotografía de la región anterior protocerebral ace rca miento de la región CAM
co rres pondie nte a las 13:00 h TC de la noch e subjetiva en dond e se obse rva tinci ón
c itoplásmica. (La s flechas representan la tinción c ito plásmica y las puntas de flecha
los núcleos prácticamente s in inmunorreact ividad). Barra de ca librac i órr- l üüum.
Figura 3. Microfotografía de la región ant erior del protoeerebro correspondientes
a las 17:00 h TC de la noch e subj etiva. Se observa mayor tinción
citopl ásmica (flecha) de la región CA M, asimismo se encuentran
algunos núcleos sin tinción (punta de flecha). Barra de
ca librac ión=1OO~m.
42
Neevia docConverter 5.1
A
B
Figura 4. Microfotografías de la región media del protocerebro corresponden a
las 23:00h TC en donde se pueden observar núcleos sin tinción (punta de
flecha) y regiones del citoplasma teñidas (flechas). A. Muestra la región
CAM (conjunto anterior medial) en donde se observa inmunorreactividad
citoplásmica menor a las 2 horas anteriores. B. Muestra la región PP
(puente protocerebral) en donde se observa una mayor tinción del
citoplasma comparada a otras regiones protocerebrales. Barra de
calibraci órr-lüüpm.
43
Neevia docConverter 5.1
44
7.2 Experimento 2
El experimento 2 se consideró como el control del experimento 1. Varios núcleos y
citoplasma inmunorreactivos del conjunto medial anterior del protocerebro (Sandeman el
al. 1998) fueron observados en el experimento 2 para las tres horas experimentales, así
como se muestra en la Figura 5. Todas las figuras muestran una menor tinción
citoplásmica y una marcada tinción nuclear comparable a la observada en las horas
observadas para el experimento l.
Neevia docConverter 5.1
A
B
e
45
.,
Figura 5. A. Corresponde al control de las ]3:00 h TC en donde se observa un gran
número de núcleos teñidos en la región CAM . B. Control de las 17:00 h TC
en donde se observan núcleos (puntas de flecha) teñidos en la región CAM y
mayor intensidad de tinción citoplásmica (flecha) en CC (cuerpo central). C.
Control de las 23:00 h TC muestra tinción nuclear y citoplásmica en la región
CAM. Barras de calibración= 50 um
Neevia docConverter 5.1
46
7.3 Análisis del Área Inmunorreactiva del Experimento 1
Los resultados del análisis de área inmunorreactiva analizada por fracción volumen (como
se describe en el método) correspondientes al experimento 1 se muestran en la Figura 7.
Las tres horas experimentales no muestran diferencias estadísticamente significativas para
el análisis del área inmunorreactiva.
04,.-----------------------,
r-'~ Exper imen to 1
03
r::
ll)
E
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> 02
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'o.....
u
u
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01
,'o
13 17 23
Tiempo Circadiano
Figura 7. Análisis de los resultados de fracc ión volumen correspondientes a l área
inmunorreactiva de toda la región protocerebral. No muestra cambios
estadísticamente significativos para los 3 momentos de la noche subjetiva
correspondientes al experimento l .
Neevia docConverter 5.1
47
7.4 Análisis de Intensidad Inmunorreactiva Promedio (Experimentos 1 y 2)
En la figura 6 se muestra la gráfica del análisis de inmunorreactividad a FOS de las tres
horas experimentales para cada condición experimental tomado a partir de la intensidad
promedio. La prueba post hoc Scheffé muestra diferencias significativas en las 13:00 h TC
con respecto a las 17:00 h y 23:00 h TC (p<O.OS) para las dos condiciones experimentales.
23
:: ':-::1Experimen to '1
_ Experi mento 2 (Co n tro l)
17
Tiempo Ci rca diano
*
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40
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O
L
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Figura 6. Gráfica de análisis del porcentaje de la intensidad inmunorreactiva promedio a FOS.
Cada barra corresponde a tres individuos. El asterisco muestra diferencias estadística