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“Identificación de un sitio de fosforilación por proteína cinasa dependiente de AMP cíclico (PKA) en la Troponina I Humana”. T E S I S PARA OBTENER EL TÍTULO DE: B I O L O G A P R E S E N T A : ANA LILIA RAMÍREZ APODACA TUTOR: Dr. David Jonh Jay Gómez- Farías. FACULTAD DE CIENCIAS UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 2007 FACULTAD DE CIENCIAS UNAM UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. Jurado asignado: Presidente: M. en C. Ana María Velasco Velasco. Vocal: M. en C. José Luis Arreola Ramírez. Secretario: Dr. David John Jay Gómez-Farías. Tutor Suplente: Dr. Guillermo Mendoza Suplente: M. en C. Maria Elizabeth García Plascencia. El presente trabajo fue desarrollado en el Departamento de Biomedicina Cardiovascular del Instituto Nacional de Cardiología Ignacio Chavez. Dr. David John Jay Gómez-Farías. DIRECTOR. M. en C. Maria Elizabeth García Plascencia. SUPERVISOR TÉCNICO. Ana Lilia Ramírez Apodaca. SUSTENTANTE. AGRADECIMIENTOS. El presente trabajo de investigación fue apoyado en parte por el donativo realizado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT). Proyecto No. U40188-Q. Al Dr. David John Jay Gómez-Farías por permitirme realizar el presente trabajo en su laboratorio, formar parte de su equipo, por sus enseñanzas y consejos. A la M. en C. Maria Elizabeth Garcia Plascencía, por sus enseñanzas y consejos en el presente trabajo. Al equipo de Laboratorio, por su apoyo y amistad. Al Biol. Miguel Angel Beltrán por su apoyo, consejos, comentarios y sugerencias. A mi hijo Miguel Angel Beltrán por su paciencia y las sonrisas con las que siempre me recibe, al final de cada jornada. 1 Índice. 1. Abreviaturas. 6 2. Resumen 7 3. Introducción. 8 • Anatomía del Músculo Cardiaco. 9 • Histología. 10 • Fisiología del Corazón. 11 • Diferencias entre el Músculo Esquelético y Cardiaco. 16 • Organización del Músculo Esquelético. 17 • Organización de la Carcomerá. 23 • Bioquímica de la Contracción Muscular. 25 • Mecanismos de Contracción del Músculo Cardíaco. 26 • Complejo de Troponinas. 28 • Acoplamiento Contracción-Excitación. 30 • Transducción de señales β-adrenérgicas reguladoras de la Contracción del miocardio. 32 • Fosforilación de la Troponina I. 34 • Hipótesis. 41 Objetivo General. 41 4. Desarrollo. 42 Materiales. 44 Métodos. 45 2 • Obtención del cDNA, inserción de los distintos amplicones de TnIc y expansión clonal en E. coli TOP10. 46 • Reacciones y mutagénesis dirigida basada en PCR. 47 • Secuencia del cDNA de las construcciones recombinantes de TnIc 49 • Expresión de las proteínas TnIc recombinantes en E. coli BL21(DE3). 50 • Purificación de las TnIc recombinantes. 51 • Identificación de la proteína TnI por medio de SDS-PAGE y Western Blot. 51 • Fosforilación de TnI Nativa y Mutantes. 53 Autorradiogramas de las TnI recombinantes. 54 Cuantificación de la actividad especifica de las TnIcrh recombinantes. 54 5. Resultados. 55 6. Discusiones. 62 7. Conclusiones. 67 8. Bibliografía 70 9. Anexo. 78 10. Glosario. 80 6 ABREVIATURAS: cAMP Adenosín mono fosfato cíclico. cDNA DNA complementario. HRP Peroxidasa de rábano. IPTG Isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido. Da Daltones. OD578 Densidad óptica (a 578 nm). PAGE Electroforesis con gel de poliacrilamida. PBS Solución salina de fosfatos. PCR Reacción en cadena de la polimerasa. PKA Proteína Cinasa dependiente de AMPc. PMSF Fenilmetilsulfonil fluoruro. SB Buffer de solubilización de muestras para PAGE. SDS Duodecil sulfato de sodio. St Estándar de Pesos Moleculares de Color Dual. STE Solución NaCl 150mM, Tris-Cl 10mM y EDTA 1mM, pH 7.4. S22 Aminoácido Serina en el sitio 22. S23 Aminoácido Serina en el sitio 23. TnI Troponina I. T142 Aminoácido Treonina en el sitio 142 TCA Ácido tricloroacético. 7 RESUMEN. La Troponina I cardiaca(TnIc) es una proteína que interviene en la regulación de la contracción del músculo cardíaco, ya que inhibe la formación de los puentes cruzados entre la actina y la miosina (AL-Hillawi, et al., 1995). La fosforilación de TnI constituye el mecanismo a través del cual las propiedades del miofilamento son reguladas (Layland, et al., 2004). La TnIc es fosforilada en los residuos S22/23 por la proteína cinasa A (PKA) y en los residuos S42/44 y T142, por proteína cinasa C (PKC). La fosforilación en el extremo amino terminal de TnI disminuye la sensibilidad del miofilamento al calcio e inhibe la interacción de TnI con TnC, (Armour, et al., 1993; Ward, et al., 2002; Sakthivel, et al., 2005). El presente trabajo propone que la T142 de TnIc, puede ser fosforilable por PKA y que es capaz de regular el estado de fosforilación del extremo N-terminal de la TnIc, región modificable en respuesta a la estimulación β-adrenérgica. Tratando de demostrar esta propuesta, se construyeron dos mutantes cambiando al aminoácido T142 por alanina (A) y por ácido aspartico (D), previendo que ninguno de los dos fuera fosforilable. Los resultados mostraron que la sustitución T142A aumentaba la incorporación de fosfato (Pi) total en TnIc mientras que la sustitución T142D eliminaba completamente la incorporación de Pi en la proteína. Con la idea de determinar si el exceso en la incorporación de Pi de T142A ocurría en alguno de los sitios blancos para PKA previamente descritos, generamos la mutación S23A tanto en TnI nativa como en la T142A, observando que el exceso de incorporación había ocurrido en la S23. Del comportamiento de la fosforilación de los mutantes T142A y T142D con respecto a la nativa, se concluyó que: el sitio T142 puede ser un punto de regulación para la contracción del corazón, por que la T142 es un sitio de competitividad enzimática, debido a que se encuentra formando parte de dos regiones consenso tanto para PKA, como para PKC, de tal manera que puede funcionar como un alternador del estado de fosforilación de la TnIc y que va a determinar de forma inversa el grado de fosforilación del extremo terminal, propio de la isoforma cardiaca. 8 INTRODUCCIÓN. En todas las células eucariontes el movimiento depende de las proteínas del citoesqueleto, desde el movimiento ameboide hasta la contracción muscular. El movimiento celular depende del desplazamiento de las proteínas del citoesqueleto, unas con respecto a las otras. Existen dos tipos de movimiento celular, en uno el citoplasma se desplaza dentro de la célula, formando corrientes citoplasmáticas; en el otro, la célula se desplaza en relación con los objetos que la rodean, (Giese, 1975). El movimiento celular mediado por el citoesqueleto alcanza su mayor grado de desarrollo en las células musculares, las cuales están adaptadas a una función muy especial: La contracción (Giese, 1975). Los mamíferos, están constituidos por un 40% de músculo esquelético; otro 10% corresponde a músculo liso y cardíaco, a estos diferentes tipos de músculos se aplican en general los mismos principios de contracción (O’Rahilly, 1989, Guyton y Hall, 1997); por ello, aunque el estudio de este trabajo se enfoca en el músculo cardíaco, se explicarán estos principios en músculo estriado. La contracción es diferente en los tres tipos de células musculares, en el músculo liso es lenta, en el estriado es más bien rápida y en el cardíaco (que también es estriado) aparte de ser rápida es rítmica, esto último hace que la contracción en el músculo cardiaco sea más compleja. La actividad contráctil de las paredes del músculo cardiaco es importante, ya que impulsa la sangre a través del cuerpo, llevando nutrientes y removiendo los residuos de desecho de cada 9 órgano, lo que hace que el corazón como órgano sea vital para un gran número de animales vertebrados (Miller, 1985; Moore, 1993). En la sangre se transportan una gran cantidad de sustancias importantes para el buen funcionamiento del cuerpo, como son hormonas, neurotransmisores, etc., (Katz, 1992; Muñoz-Martínez, 1997). Por otro lado el corazón lleva presión al aparato excretor, el cual la requiere para poder llevar acabo el proceso de depuración sanguínea, (Miller, 1985). Estudiar el corazón es muy importante, por las proyecciones hacia la comprensión de los mecanismos moleculares que causan cardiomiopatías que con llevan a insuficiencia cardiaca (IC), como es el caso de la hipertrofia, (Carreño, et al., 2006). Anatomía del Músculo Cardíaco. El corazón de los mamíferos, está dividido en cuatro cámaras: las aurículas, derecha e izquierda, y los ventrículos, derecho e izquierdo, (Fig. 1). Entre las cavidades auriculares y ventriculares se localizan las válvulas atrioventriculares; del lado derecho se encuentra la válvula tricúspide y del izquierdo la válvula mitral, (O’Rahilly, 1989; Miller, 1985). Las válvulas semilunares1 se observan entre los ventrículos y las grandes arterias, y es a través de ellas por donde los ventrículos vierten sangre; la válvula pulmonar puede verse en la desembocadura del ventrículo derecho y el inicio de la arteria pulmonar; semejante a la 1 Nota.- La presencia de válvulas en el aparato circulatorio, se asocia, en la escala zoológica a los tramos venosos, donde la presión del circulante es muy baja y gracias a estas estructuras se logra una correcta canalización del circulante, evitándose su reflujo y el encharcamiento, de hecho el corazón de vertebrados procede de la región anterior de la vena intestinal. Las Válvulas Semilunares de mamíferos proceden evolutivamente, de la región llamada Válvula Espiral del corazón de los anfibios, la cual a su vez se origina del Cono Arterioso del corazón de peces, (Young, 1975; Romer y Parsons, 1981; Hildebrand, 1982). 10 anterior pero en relación con el ventrículo izquierdo y a la aorta encontramos la válvula aórtica2, (Fuster, et al., 2002; http://texasheart.org/HIC/Anatomy_Esp/anato_sp.cfm). Fig. 1. Se muestra las diferentes partes del corazón, en donde se incluyen las cámaras de bombeo como son las dos aurículas y los dos ventrículos, además de las válvulas que las comunican, incluyendo la válvula tricúspide y la mitral, (http://texasheart.org/HIC/Anatomy_Esp/anato_sp.cfm.) Histología. Las células endoteliales del endocardio son planas y poligonales recubren internamente las cavidades auriculares y ventriculares del corazón, así como las superficies de las válvulas. 2 Interpretación anatomofisiológica. Los cardiomiocitos son células alargadas, polarizadas en un solo eje para una mayor efectividad funcional, ya que con esta forma sus filamentos contráctiles, se encuentran alineados paralelamente lo cual es una adaptación de los músculos, ( la polarización de los músculos marca una diferencia con el resto de los tejidos conectivos ). Estas células no son simples cilindros sino que tiene bifurcaciones pues en su conjunto conforman un músculo circular a semejanza de un esfínter pero con proyección tridimensional oblicua, lo que le confiere una resultante helicoidal. La presencia de los discos intercalares se relaciona con la facilitación de la transmisión del estimulo electroquímico, conjugado con una gran tenacidad mecánica que sujeta a las fibras por sus bifurcaciones con su disposición tridimensional. La presencia de estriaciones con sus sarcómeras y su sistema T hace a las células del miocardio parecidas a las células del músculo esquelético, sin embargo estas son solo adaptaciones funcionales que les permite una contracción rápida. Sin embargo la presencia de un núcleo por célula en posición centro medial, la carencia de una terminación nerviosa por célula, su localización anatómica y su contracción rítmica nos hablande su origen en la fibra muscular lisa (visceral), (Patt y Patt, 1969; Romer y Parsons, 1981; Cormack, 1988; Fawcett, 1995 ). 11 Por debajo del endocardio hay láminas de fibras elásticas y de colágeno, además de una capa rudimentaria de músculo liso (Katz, 1992; Moore, 1993). Las fibras musculares del miocardio constituyen la gran parte del grosor de la pared del corazón. Las más importantes son las células trabajadoras del miocardio que se localizan en aurículas y ventrículos donde su principal tarea consiste en la realización de la contracción. Las células de Purkinje, están especializadas en la conducción de impulsos eléctricos a través del corazón. Las células del nodo senoauricular (SA) y del nodo auriculoventricular (AV), son responsables de la actividad del marcapasos y la conducción atrioventricular respectivamente (Katz, 1992; Moore, 1993). El epicardio, es una pared de células mesoteliales y cuboidales por encima de una red de tejido conectivo fibroelástico, que puede ser considerado como el pericardio visceral, (Katz, 1992; Miller, 1985). Fisiología del Corazón Todo el corazón es capaz de contraerse, sin embargo sus componentes tienen un gradiente de excitabilidad, la porción más excitable es el marcapaso (Todas las palabras marcadas en negritas dentro del texto se definen en el glosario). En los organismos inferiores el marcapasos principal está en el seno venoso3 y en el corazón de mamíferos quedó como un vestigio. El impulso eléctrico afecta primero a las aurículas, extendiéndose luego por el nodo 3El Seno Venoso, es la cavidad del corazón de vertebrados, que recibe la sangre proveniente de las grandes venas y la envía a la aurícula única en peces, o a la aurícula derecha en Anfibios, Reptiles y Aves, no existe en Mamíferos. Los Cefalocordados carecen de corazón pero en su localización se encuentra un seno venoso contráctil, que presumiblemente dio origen al corazón de los vertebrados (Young, 1975; Romer y Parsons, 1981; Hildebrand, 1982; Pough, 1990). 12 AV, pasa por el haz de His hasta llegar al ventrículo (Miller, 1985). Las fibras de Purkinje en el haz de His conducen el potencial de acción a una velocidad de casi cinco metros por segundo, hasta las distintas partes del corazón, (Fig. 2), lo que permite una contracción coordinada, (Muñoz- Martínez, 1997; Ruch y Patton, 1965). Fig. 2.-Sistema de formación y conducción del estímulo. El nodo sinoatrial forma el estímulo y lo conduce a través de las vías internodales hacia el nodo auriculovetricular y de aquí hacia el haz de His, el cual incluye las ramas derecha e izquierda y que termina en un retículo de fibras de Purkinje. Tomado de http://texasheart.org/HIC/Anatomy_Esp/anato_sp.cfm. Potencial de acción. El potencial de acción se disemina por la membrana celular, en milésimas de segundo los iones de calcio se difunden a las miofibrillas, catalizando las reacciones químicas que promueven el desplazamiento de los filamentos de miosina sobre los de actina, lo cual genera la contracción muscular (Guyton y Hall, 1997). 13 El potencial empieza en el nodo SA, al cual se debe el automatismo del corazón. El estímulo eléctrico se distribuye por todo el miocardio gracias a la excitabilidad, conductibilidad y cronotropismo de sus células, (Chávez, et al., 1993). El potencial de acción en el miocardio es causado por dos tipos de canales; los canales rápidos de sodio y los canales lentos de calcio, estos últimos se abren más lentamente y lo que es más importante, permanecen abiertos durante varias décimas de segundos. Durante este tiempo, fluyen al interior de la fibra grandes cantidades de iones de sodio y calcio, que mantiene un período de despolarización prolongado (la membrana permanece despolarizada en un tiempo de 0.2 seg. aproximadamente en la aurícula y de 0.3 seg. en el ventrículo) (Fig. 3), lo cual, es la causa directa de la meseta en el potencial de acción (Guyton y Hall, 1997). La permeabilidad de la membrana por el potasio disminuye cinco veces, lo que es causado por la entrada de grandes cantidades de iones de calcio. Por otro lado, la baja en la concentración de potasio, disminuye rápidamente la salida de iones de calcio durante la meseta en el potencial de acción, lo cual, evita que éste vuelva a su nivel de reposo. Sin embargo, una vez transcurrido el tiempo, se cierran los canales de sodio y calcio, con ello aumenta rápidamente la permeabilidad de la membrana al potasio, aunado a una pérdida de iones de calcio, causando que el potencial de membrana regrese a su nivel de reposo, terminando así el potencial de acción (Guyton y Hall, 1997). 14 A.) Diagrama del ciclo cardiaco. B.) C.) Ciclo de la Miosina. Fig. 3.- Muestra el diagrama comparativo: A.) del ciclo cardíaco, un electrocardiograma y el potencial de acción, B.) Se observa la contracción de la sarcómera, como se van dando los eventos de contracción y relajación puntualizados en el ciclo cardíaco, C.) Se aprecia el ciclo de la miosina en relación con los eventos que ocurren en el filamento grueso de miosina y el filamento delgado de la actina, como se muestra en el diagrama, se hace una comparación también con el potencial de acción, en donde se ubica a cada evento del ciclo de la miosina. Tomados de Guyton y Hall, 1997 y Katz, 1992. 15 Ciclo Cardíaco. Desde el comienzo de un primer latido del corazón hay una sucesión de eventos que se repiten y que pueden ser enmarcados en etapas que siempre cumplen un ciclo (ciclos cardíacos). El ciclo se refiere a un latido completo del corazón, que consta de un periodo de relajación, denominado diástole, durante el cual el corazón se llena de sangre, seguido de un período de contracción llamado sístole en donde se vacía (Chatain, y Bustamante 1986; Guyton y Hall, 1997). En la primera etapa del ciclo (diástole), el corazón se llena de sangre, en este momento la sangre fluye desde las venas cavas hacia la aurícula derecha relajada, y de ésta al ventrículo ipsilateral (del mismo lado) también relajado, a través de la válvula tricúspide abierta. Al mismo tiempo, la sangre de las venas pulmonares fluye hacia la aurícula izquierda relajada y también, por la válvula mitral abierta, al ventrículo izquierdo relajado (Cormack, 1988). En la siguiente etapa del ciclo, se contraen las dos aurículas (sístole auricular), proceso que se inicia en la derecha cerca del orificio de la vena cava superior. La contracción se disemina por ambas aurículas de modo que la mayor parte de su sangre pasa de manera forzada a los ventrículos, sin embargo la onda de contracción que se propaga por las aurículas no se transmite inmediatamente a los ventrículos, sino que hay una breve demora (retraso superior a 1/10 de seg.), tiempo suficiente para que termine la contracción de las aurículas, (Fig. 3). La contracción ventricular (sístole ventricular), se inicia en las cercanías del vértice cardíaco, a partir de tal área, la onda de contracción se disemina rápidamente por el miocardio de ambos ventrículos y hace que éstos desplacen su contenido hacia el tronco de la pulmonar y la aorta, respectivamente (Cormack, 1988). 16 Diferencias entre el Músculo Esquelético y Cardíaco. El corazón está constituido por fibras musculares estriadas que difieren en algunos aspectos de las del músculo esquelético; la primera diferencia es que las fibras no forman un sincicio, sino que son unidades celulares separadas, unidas en los extremos por uniones particulares llamadas discos intercalares, mismas que son exclusivas de los cardiomiocitos, (Guyton y Hall, 1997). Los discos intercalares, proveen una unión mecánicamente fuerte y duradera por un lado, pero por el otro, facilitala difusión relativamente libre de iones y por lo tanto, la conducción del impulso cardíaco (Katz, 1992; Guyton y Hall, 1997). Los discos intercalares en células del nodo SA y el AV contienen pocos y pequeños nexus. Este hecho anatómico es importante para entender la resistencia interna alta, la cual es en parte responsable de la lenta velocidad con la cual el impulso eléctrico se propaga a través de estas estructuras (Katz, 1992). La segunda diferencia en cuanto a las fibras del músculo cardíaco, es que no son unidades cilíndricas simples, sino que más bien se bifurcan para tener contacto con otras fibras adyacentes, con lo que forman una red tridimensional compleja, (Fawcett, 1995). Los núcleos son alargados y están localizados en posición centromedial, (Fig. 4). Existen también diferencias en la estructura y función del músculo; ambas son más complejas en el cardíaco. Por ejemplo, los mecanismos que regulan el control de las propiedades de contracción del miocardio son completamente diferentes que la del músculo esquelético, ya que, cada fibra del músculo esquelético es estimulada por las vías nerviosas motoras del sistema nervioso central, mientras que cada célula del músculo cardiaco está 17 provista de un sistema de control complejo, que modula el latido del corazón en respuesta a las constantes demandas de cambio del cuerpo; por lo tanto ni el inicio, ni la conducción de la señal que activa al corazón involucra al sistema nervioso, en su lugar existen células del miocardio especializadas en iniciar un signo eléctrico y el potencial de acción (células nodales), estos son propagados a través del corazón por otro tipo de células diferenciadas para la conducción (fibras de Purkinge). El sistema nervioso está relacionado solamente con la regulación y sirve para incrementar o disminuir varios aspectos de la función cardiaca (Getty, 1982; Katz, 1992). Organización del Músculo Esquelético. La unidad de organización histológica del músculo esquelético es la fibra muscular, una célula larga, cilíndrica y multinucleada que presenta estriaciones transversales muy evidentes, que dan a este tipo de músculo su nombre, (Fig. 4), también se observan estriaciones longitudinales dentro de la fibra, debido a que cada miofibrilla está hecha de segmentos cilíndricos o bandas de diferente refringencia, que alternan de modo regular en toda su longitud, (Stebbings y Hyams, 1983). Cada fibra muscular está revestida por una membrana delicada, llamada tradicionalmente el sarcolema. El sarcoplasma de una fibra muscular corresponde al citoplasma de otros tipos celulares, está constituido por una matriz citoplasmática típica, los organelos e inclusiones ordinarias y también por las miofibrillas que son peculiares del músculo (Guyton y Hall, 1997). Los aparatos de Golgi son pequeños y numerosos, se localizan cerca de los polos de cada núcleo y a lo largo de toda la fibra. Las mitocondrias ocupan el 85% del volumen de las 18 células del miocardio; son abundantes en los polos de los núcleos y por debajo del sarcolema, (Fig. 4), también se localizan en gran abundancia en los estrechos espacios que quedan entre las miofibrillas, (Guyton y Hall, 1997). Fig.4 Fotografía del ventrículo del corazón de ratón, se aprecia una mitocondria (Mito) cerca de las miofibrillas (Mfl), su núcleo (N) y las miofibrillas con sus sarcómeras. Fotografía tomada por Ana Lilia Ramírez A. El retículo endoplásmico de las fibras musculares está desprovisto de ribosomas, rodea a las miofibrillas por lo que fue llamado retículo sarcoplásmico (Fawcett, 1995), es un sistema continuo de sarcotúbulos limitados por membranas, formando una red canalicular de malla fina en torno a cada miofibrilla, (Fig. 5). Los sarcotúbulos muestran un patrón de repetición, especialización y diferenciación local, porque mantienen una relación constante con las bandas de miofibrillas estriadas (Fawcett, 1995). Los sarcotúbulos longitudinales confluyen en canales orientados transversalmente y de mayor grosor, llamados cisternas terminales que corren transversalmente por las miofibrillas 19 en estrecha relación con un elemento intermedio más delgado, el túbulo transverso, llamado túbulo T, (Fig. 5). Estas estructuras asociadas (un túbulo T entre dos cisternas) constituyen las llamadas tríadas del músculo esquelético, (Fig. 5), (Fawcett, 1995). La luz del túbulo T, no se abre en las cisternas y no es parte del retículo sarcoplásmico. La membrana limitante del túbulo T, se continúa con el sarcolema y su luz comunica con el espacio extracelular a nivel de la superficie de la célula, (Fawcett, 1995). Fig. 5 Muestra en A).- Fotografía electrónica de los túbulos transversos T, se pueden apreciar las tríadas y los canales de calcio. En B).-La estructura de la sarcómera, en donde se puede apreciar el sistema de túbulos longitudinales del retículo sarcoplásmico, dichos túbulos se abren en las cisternas, las cuales están relacionadas con los túbulos T para formar las tríadas, se aprecia también como los túbulos T, forman parte de la membrana plasmática y comunican a la célula con su medio extracelular. Tomada de Alberts, et al., 2002. El sarcolema y las membranas del sistema T, contienen bombas de iones que estabilizan las diferencias electroquímicas de estos dos medios ambientes; así como canales iónicos cuyos cambios afectan los potenciales de acción, porque permiten el paso de los iones al otro lado de las membranas, (Fawcett, 1995). 20 Por otra parte, los túbulos longitudinales y las cisternas terminales del retículo sarcoplásmico regulan la concentración de iones de calcio en el microambiente de las miofibrillas. La membrana que delimita al retículo tiene un mecanismo activo para el transporte de este ión y lo almacena dentro de este órgano (Fawcett, 1995; Hole, 1993). El interior de la fibra muscular está ocupado por miofibrillas cuyo diámetro miden de 1 a 2μm de diámetro, en cortes transversales aparecen en forma de puntos pequeños ya sea distribuidos uniformemente o bien agrupados en áreas poligonales llamadas campos de Cohnheim, (Fawcett, 1995). Las células del miocardio funcional son estriadas y muestran la misma característica, al repetir el patrón de bandas transversales claras y obscuras, (Hildebrand, 1982), (Fig. 6). Las miofibrillas contienen miofilamentos constituidos por dos tipos de proteínas, uno formado por actina (filamento delgado) y el otro por miosina (filamento grueso), los miofilamentos están dispuestos transversalmente y muestran diferencias tanto en sus dimensiones como en su composición química, además el patrón de bandas transversales refleja la disposición de estos filamentos. Los filamentos de miosina son más gruesos que los de actina, miden 15nm de diámetro y 1,5μm de largo, son paralelos y están separados entre sí por 45 nm, (Hildebrand, 1982; Lodish, et. al., 2000). Miosina. En 1864, la miosina fue descrita por Kϋhne y aislada en los años 40`s del siglo XX a partir de pequeños pedazos de músculos, se asumió entonces que se había aislado una proteína 21 simple; sin embargo al ser purificada se dieron cuenta que contenía otra proteína adicional a la cual llamaron actina. El filamento de miosina consiste en un rosario compuesto de 200 moléculas de miosina, cada una con un peso molecular de aproximadamente 480 000 Da. La molécula de miosina está formada por seis cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas de 200 000 Da; en el extremo C-terminal, presenta una conformación α-helicoidal, esta porción es llamada “cola” (Sodeman y Sodeman, 1985; Katz, 1992) Un extremo de cada una de las cadenas pesadas de proteína está plegado formando una estructura polipeptídica globulosa denominada “cabeza”, la cual está acompañada por dos pares de “cadenas ligeras” conun peso molecular de aproximadamente 19,000 y 27,000 Da, son parte de la cabeza de la molécula y ayudan a controlar la función de está durante la contracción muscular (Katz, 1992). En el filamento de miosina, “las colas” de la molécula se agrupan formando el cuerpo, “las cabezas” se disponen hacia la periferia del cuerpo y se presume que son las que forman los puentes cruzados que se desplazan axialmente con respecto del conjunto en 120 grados. La cabeza es la encargada de la contracción, presenta actividad de ATPasa, que permite romper ATP y utilizar la elevada energía derivada del enlace para el proceso de contracción (Sodeman y Sodeman, 1985). También tiene la propiedad de fijarse a la actina. La molécula de miosina presenta dos puntos de flexibilidad llamados bisagras, uno en la “cola” y otro en la “cabeza”, el primero ayuda a que la “cabeza” se desplace hacia la periferia 22 o hacia el centro del cuerpo del filamento, el segundo que lo conforman la “cabeza” y sus dos cadenas ligeras, ayuda a que la “cabeza” se doble formando así los puentes cruzados con la actina, (Katz, 1992). Actina. La actina es una proteína pequeña con respecto a la miosina, presenta una conformación globular, su peso molecular es de 41,700 Da, tiene forma ligeramente ovoide con un diámetro de aproximadamente 55Ǻ, puede ser estabilizada in vitro en su forma monomérica llamada G-actina (G = globular), así como también en su forma filamentosa polimérica asimétrica nombrada F-actina (Geneser, 2000). La actina tiene dos propiedades biológicas relevantes en el proceso de la contracción muscular, una es activar a la miosin-ATPasa y la otra, su interacción fisicoquímica con la miosina formando el complejo actomiosina, (Fig. 3) (Katz, 1992). La actina se encuentra en la sarcómera en su forma de polímero F-actina, conforma la estructura principal del filamento delgado. El polímero F-actina está constituido por dos fibras de monómeros de G-actina en forma de hélice macromolecular. Cada nudo del polímero de F-actina tiene una distancia de aproximadamente 385Ǻ, por lo que cada giro en la F-actina tiene siete pares de monómeros de actina. Estas características cuantitativas nos ayudan a entender la organización funcional del filamento delgado, aclarándose las interacciones entre la actina y las proteínas reguladoras como la tropomiosina y el complejo troponina (Katz, 1992). 23 La actina puede combinarse con una amplia variedad de proteínas para llevar a cabo diversas funciones, sin embargo una de las más importantes es la contracción muscular la cual se da cuando la actina se une a la miosina. El filamento delgado, está compuesto de tres proteínas, una de ellas es la actina, pero además también se encuentran la tropomiosina y el complejo de troponinas (Sodeman y Sodeman, 1985). Organización de la Sarcómera. La sarcómera es la unidad morfológica fundamental del músculo, se puede delimitar entre la región de dos líneas Z, (Fig. 6). Cada sarcómera la constituye una banda A delimitada por dos mitades de bandas I adyacentes, (Sodeman y Sodeman, 1985). Las bandas A con luz polarizada se observan más obscuras porque rotan los rayos de luz, son anisotrópicas o birrefringentes; lo cual indica que las bandas tienen un arreglo altamente ordenado y paralelo de macromoléculas. Las bandas I se observan más claras, es decir que son menos refringentes o isotrópicas, las bandas I están limitadas hacia la mitad, por una línea Z muy obscura (Fig. 6), en cambio las bandas A son divididas por las bandas M, (Fleckenstein, et. al., 1983; Stebbings y Hyams, 1983). Los conjuntos paralelos de filamentos de miosina son el componente fundamental de las bandas A y determinan su longitud. Los filamentos se mantienen en registro por medio de unas delgadas conexiones transversales que están alineadas en el punto medio de la banda A, dando origen a una banda densa, llamada la línea M, (Fig. 6). En cortes transversales, los 24 filamentos se pueden observar a nivel de la banda H con un arreglo de orden muy regular, corresponde a la distancia entre las fibras de actina (Sodeman y Sodeman, 1985). Fig. 6.- Célula muscular del ventrículo del corazón de ratón, en donde se pueden apreciar las miofibrillas (Mfl), sarcómeras y su organización histológica. Se aprecian las bandas de miosina (A), actina (I), así como las bandas M, H y las líneas Z. Fotografía; Ana Lilia Ramírez A. Los filamentos de actina de 5 nm de diámetro, se extienden a lo largo de 1μm en ambas direcciones a partir de la línea Z y constituyen la banda I, la profundidad en la que los filamentos de actina penetran en la banda A, varía con el grado de contracción; desplazándose por los intersticios de los filamentos gruesos que tienen un arreglo hexagonal, quedando así seis filamentos de actina espaciados en torno a cada filamento de miosina (Fawcett, 1995), La línea Z, incluye a la alfa actinina que une a las actinas (Schumm, 1989). En el momento de la relajación los filamentos delgados se extienden hacia la banda A sin llegar a tocarse, por lo que la distancia entre sus extremos determina lo ancho de la banda H, 25 la cual se puede definir como la parte central de la banda A y en donde no penetran los filamentos de actina, (Fig. 3); así en estado de relajación esta banda es más ancha, mientras que en la contracción es estrecha o casi desaparece, reduciéndose el tamaño de la sarcómera unos 10 nm, (Fawcett, 1995; Ganong, 2004). Bioquímica de la Contracción Muscular. La actomiosina formada solamente de actina y miosina puede convertir la energía química derivada de la hidrólisis de ATP en trabajo mecánico, por lo que resulta claro entender que los procesos contráctiles puedan surgir de interacciones que involucren a la actina, miosina y el ATP. La miosina tiene la propiedad de fijar actina y por lo menos al principio de esta fijación no se libera energía, ni se produce desplazamiento en la orientación del puente transverso de actina y miosina. Sin embargo, en presencia de calcio, la actina es un potente activador de la miosina ATPasa, (Katz, 1992). La reacción de la actomiosina, puede ser reducida a cuatro pasos que caracterizan la interacción entre la miosina, la actina y el ATP. La simplicidad de la reacción en cuatro pasos describe dos estados de la miosina y dos de la combinación entre la miosina y la actina, (Fig. 3). Los estados de relajación están representados por la interacción de la miosina con el ATP y la miosina con el ADP + Pi. Aquí los puentes cruzados entre la miosina y la actina están separados. En los otros dos estados los puentes cruzados interactúan, viéndose involucrada la actomiosina, (Katz, 1992). En uno (complejo activo), la energía de ATP se encuentra aún en el puente cruzado con la miosina. En cambio, en el último (complejo de rigor) la traducción de la energía química a mecánica ha tomado lugar, energía que fue utilizada para cambiar de 26 posición el puente cruzado, (Katz, 1992). La energía liberada por la hidrólisis de ATP hace que la cabeza de miosina se curve en su unión flexible con la cola y por un mecanismo análogo a la acción del remo, lleva los filamentos finos hacia el centro de cada sarcómera (Smith, et. al., 1988). Una vez que se ha completado ésta tracción, la hidrólisis del ATP por la miosina hace también que se rompa el puente de actina y miosina, así cada cabeza de miosina vuelve a tomar su orientación perpendicular y se halla lista para otra interacción con el monómero de actina siguiente (Smith, et. al., 1988). Siguiendo el punto de vista fisiológico del ciclo cardiaco que comienza en la diástole, el análisis del ciclo de la actomiosina empieza después de que la miosina se une al ATP (complejo de rigor), en el cual se forma el complejo miosina-ATP, que causa la disociaciónentre la actina y la miosina, (Fig. 3). Así los cuatro pasos que siguen son: 1) Hidrólisis de la unión del ATP con la miosina, 2) Formación del complejo activo con la actina, 3) Disociación de los productos de la hidrólisis del ATP y 4) Disociación de la actina y miosina, (Katz, 1992). Mecanismos de Contracción del Músculo Cardíaco. En las células del miocardio además de las dos proteínas contráctiles primarias, que son la actina y la miosina, se encuentran a lo largo del filamento delgado de actina otras proteínas reguladoras, llamadas: tropomiosina, troponina C, troponina I, y troponina T., (Fig. 7). La Tropomiosina y las troponinas no son proteínas contráctiles como tales, sino que desempeñan 27 un papel modulador en el mecanismo contráctil, inhibiendo la interacción actina-miosina, (Sodeman y Sodeman, 1985). Fig.- 7. Proteínas de la miofibrilla en la célula muscular y su interacción para el desarrollo de la contracción. A) filamento delgado de la sarcómera en donde se muestra el complejo troponina, la tropomiosina y la actina cuando el calcio no esta unido al complejo y cuando este se une. B) Cuando el calcio se une al TnC del complejo troponina la TnI se mueve de su posición de inhibición y los sitios de unión en la actina para la miosina son expuestos permitiendo que se lleve a cabo su interacción, llevándose a cabo la contracción muscular. Tomado de Cooper 2000. Tropomiosina La tropomiosina es una proteína que se descubrió en 1948, es filamentosa, con una longitud de aproximadamente 400Å, formada por dos cadenas peptídicas helicoidales unidas por un puente disulfuro. Al purificarla no se le encontró función biológica, no hidrolizaba ATP, ni 28 interaccionaba con la miosina. Sin embargo es semejante a la “cola” de la miosina, por su forma helicoidal y rígida, (Katz, 1992). La tropomiosina regula la interacción entre la actina y la miosina, (Murria, et al., 1982). Estos efectos son complejos y pueden ser estimulantes o inhibitorios dependiendo del estado de interacción entre la actina y la miosina. Su mayor importancia reside en la interacción con la troponina para mediar las señales que se dan por el incremento del Ca2+ en el citosol, lo que activa la interacción de la actina y miosina, responsables de la contracción muscular. La tropomiosina se encuentra unida al polímero F-actina del filamento delgado, una molécula de tropomiosina se tiende longitudinalmente entre el surco de los dos filamentos de actina; en esta posición la tropomiosina añade más rigidez al filamento delgado (Katz, 1992; Tresguerres, 1992). Complejo de Troponinas. En 1965 Ebashi describió por primera vez el complejo de troponinas, actualmente se sabe que está constituido por tres proteínas que son: La troponina I, que regula por inhibición la interacción entre la actina y la miosina. La troponina T (TnT) une al complejo de troponinas con la tropomiosina. La troponina C (TnC) tiene el sitio de unión a calcio que ayuda a regular la contracción muscular (Al-Hillawi, et al., 1994, 1995; Stebbings y Hyams, 1983). Los tres componentes del complejo se encuentran a lo largo del filamento delgado, pegados a la tropomiosina y junto a la actina, a intervalos de 400Ǻ a lo largo del filamento. Las tres unidades de complejo interactúan de una manera cooperativa la con la otra (Katz, 1992). 29 La troponina C: es una proteína con forma de mancuerna que contiene cuatro dominios de unión a calcio (I-IV), cada una de las cuales es un miembro de la familia de proteínas que pegan calcio, como calmodulina y las cadenas ligeras de miosina. Las secuencias son de dos tipos: una que solo pega calcio en dos sitios (I; II) en el extremo N-terminal y éstos son designados sitios específicos a Ca2+, la otra que también tiene dos (III; IV) pero que además de calcio se une a magnesio y son llamados sitios de Ca2+ y Mg2+ localizados hacia el extremo C-terminal, (Ward, et al., 2002). Como la concentración de Mg2+ es más alta que la de Ca2+ los sitios III y IV son generalmente ocupados por magnesio; por lo que no juegan un papel en el acoplamiento excitación-contracción. Se piensa que estos sitios probablemente sirvan para estabilizar la interacción de TnC con los otros dos componentes del complejo. Así que los sitios I y II son los que sirven para que la troponina C reconozca la elevación en la concentración del calcio en el citosol, como una señal para iniciar las interacciones entre la actina y miosina que activan la contracción muscular (Katz, 1992). La unión del Ca2+ a los sitios I y II produce una abertura estructural del dominio N-terminal exponiendo adicionalmente los sitios de unión de TnI. Si el sitio I en la TnC cardiaca (TnCc) es inactivado, el calcio se une al sitio II, que es el regulador primario de la contractibilidad cardiaca. La unión del Ca2+ a un solo sitio regulatorio simple de TnCc no es suficiente para estabilizar la conformación abierta del dominio N-terminal en ausencia de TnI. Sin embargo, en presencia de TnI y Ca2+ el dominio N-terminal de TnCc también adopta la conformación abierta (Ward, et al., 2002). 30 La troponina T: es la más grande de los tres componentes del complejo, es una molécula asimétrica que une al complejo con la tropomiosina. Aunque por sí sola la troponina T no se une al calcio, la sensibilidad al calcio en el desarrollo de tensión es influenciada por esta proteína (Sodeman, y Sodeman, 1985). La troponina I: Es una fosfoproteína del filamento delgado, juega el papel de llave reguladora en la contracción del músculo cardíaco, a través de inhibir la formación de los puentes cruzados entre la actina y la miosina, (Ward, et al., 2003). Dada la importancia de esta proteína en el presente trabajo se tratará con mayor amplitud, en la sección: Fosforilación de Troponina I, (pág. 34). Acoplamiento Contracción-Excitación. Las células del miocardio usan calcio en la última etapa del acoplamiento excitación- contracción, proceso en el cual la despolarización en la superficie de la membrana celular conlleva al acortamiento de las miofibrillas como resultado de un juego complejo de interacciones moleculares entre las proteínas contráctiles, que conducen al desarrollo de la tensión y acortamiento en las paredes del corazón, (Moffet, et al., 1993). Cada cabeza globular de miosina fija una molécula de ATP, la cual es hidrolizada a ADP y Pi. La energía liberada en la reacción queda retenida en el brazo transversal, el cual adopta una conformación “tensa”. Para que esta energía se transforme en movimiento de la miofibrilla, las cabezas de miosina deben establecer contacto con los filamentos de actina, formando puentes entre filamentos gruesos y delgados (Blanco, 1993), aquí la regulación del 31 calcio es la llave que permite al filamento grueso de miosina separar la unión entre la troponina I y la actina, entonces se dan cambios conformacionales en el filamento delgado lo que conlleva al inicio de la sístole, cuando el calcio se une a la troponina C, hasta entonces se da un rearreglo de las proteínas del filamento delgado, creando tensión (Tao, et al., 1990). La maquinaria contráctil responde al calcio con una serie de interacciones conjuntas entre las troponinas C, I, T y la tropomiosina; donde el paso final de las interacciones sucede cuando hay un cambio en la posición de la tropomiosina que se encuentra entre los surcos de la doble cadena helicoidal del polímero F-actina en el filamento delgado, iniciando una serie de cambios en la posición de la tropomiosina, la cual expone el sitio activo de la actina, permitiendo más tarde la interacción con la miosina. Si el calcio se pega a la troponina C, el enlace que une a la troponina I con la actina se debilita y estas dos proteínas comienzan a disociarse (Tresguerres, 1992; Fuster, etal., 2002). Cuando la troponina C no se encuentra ligada al calcio, el músculo regresa a su estado de relajación, causando que el filamento de tropomiosina regrese a su posición original de inhibición en el filamento delgado, es decir, se sitúa acostado hacia el lado exterior del surco entre las dos cadenas de actina, bloqueando el desarrollo de las interacciones actina-miosina, lo que nos da como resultado que la troponina I sea altamente afín a la actina, (Katz, 1992). Las interacciones conjuntas se amplifican debido a que el complejo de troponinas está espaciado aproximadamente unos 400 Å uno de otro, a lo largo del eje del filamento delgado de actina, influenciando a la tropomiosina, que también tiene aproximadamente la misma 32 longitud, por lo que al pegarse el calcio en cada complejo de troponinas, aplica un efecto a lo largo de aproximadamente siete pares de monómeros de actina (Fuster, et al., 2002; Katz, 1992) En el músculo cardiaco los túbulos T dan una cantidad extra de iones de calcio, debido a que su diámetro es 5 veces superior al del esquelético proporcionando un incremento en el volumen, (Moffett, et al., 1993). Por otro lado, en su interior hay una gran cantidad de mucopolisacáridos de carga electronegativa que fijan una buena provisión de calcio, manteniéndolo disponible para cuando sea utilizado y así difundirlo al sarcoplasma. Sin este calcio extra no se daría una contracción adecuada, porque el retículo sarcoplásmico no almacena lo suficiente para una contracción completa. Transducción de señales β-adrenérgicas reguladoras de la contracción del Miocardio. En el sarcolema y posiblemente en las membranas del sistema T de las células cardiacas, se encuentran los receptores adrenérgicos cardíacos α y β, que tienen la capacidad de reconocer específicamente la señal que lleva la hormona adrenalina (procedente del sistema nervioso simpático y de la médula suprarrenal), (www.biopsicología.net/fichas/page_155.html), esta unión hormona-receptor, ocasiona cambios conformacionales en el receptor, lo cual constituye la señal para desencadenar la cascada de sucesos intracelulares que proporcionan la especificidad de la respuesta, (Pérez, et al., 2005). La cascada media el sentido y procesamiento del estimulo, este circuito molecular detecta, amplifica e integra las señales externas, (Berg, et. al., 2002). 33 Los receptores están acoplados a través de las proteínas G, al adenilato ciclasa, presentes en las membranas de las células cardiacas. La proteína G se une al receptor en el sitio de unión, expuesto por los cambios conformacionales sufridos por la presencia de la hormona, el receptor interacciona con la subunidad αβ de la proteína G, permitiendo que la subunidad α intercambie el GDP unido por GTP, lo que provoca la separación entre las subunidades de la proteína G, en la superficie de la subunidad α se origina un sitio de unión para la interacción con la adenilato ciclasa, la subunidad α se une a la adenilato ciclasa y activa el centro catalítico, de modo que el ATP es convertido en cAMP, (http://med.unne.edu.ar/catedras/bioquimicaanterior/receptor.htm). La formación de cAMP en la célula cardiaca activa la PKA, el cAMP se une a la subunidad reguladora de la proteína PKA, liberando la subunidad catalítica, estas últimas inician una cascada de fosforilaciones, en el citoplasma, (Pérez, et. al., 2005). La PKA fosforila residuos de serina presentes en TnI, modificando la ritmicidad del corazón. (http://med.unne.edu.ar/catedras/bioquimicaanterior/receptor.htm., Stryer, 1993; Layland, et al., 2004). La inotropía del corazón está controlada por los β-adrenérgicos que pueden modificar el ritmo cardíaco, sin ellos el corazón seguiría latiendo a un solo ritmo sin alteración, es decir sin poder aumentarlo ni disminuirlo. (Guyton y Hall, 1997). La estimulación de los receptores β en el músculo cardíaco da como resultado un aumento en la contractibilidad, un incremento en el ritmo cardíaco y una sístole breve debido a la relajación acelerada, cambios que son benéficos durante la respuesta huída o enfrentamiento, por que el resultado neto es 34 un poderoso incremento en el bombeo del miocardio (Pi, et al., 2002). Por ello se dice que los agentes que incrementan los niveles de cAMP tienen un efecto inotrópico fuerte. Fosforilación de la Troponina I. La fosforilación de proteínas es un fenómeno altamente dinámico. Debido a ello el papel de la fosforilación reversible de proteínas en la regulación e integridad de la actividad de las células eucarióticas ha comenzado a ser ampliamente apreciada durante las últimas décadas (Higgins y Hames, 1999). El sistema de fosforilación de proteínas celulares incluye varios componentes: • La fosforilación de proteínas por sí misma. • De un gran número de proteínas cinasas las cuales catalizan la incorporación del fosfato terminal de ATP en la serina, treonina, tirosina y posiblemente histidina, que son residuos específicos del substrato de fosfoproteínas, siendo serina y treonina los frecuentemente reportados para TnI. • Que tales aminoácidos tengan una secuencia consenso especifica de acuerdo a las distintas cinasas, en el sitio T142 de TnIc la secuencia consenso para PKA es RR-X- T y para PKC es T-X-RK, (Fig. 9). • Una combinación distinta de fosfoproteínas fosfatasas responsables de la defosforilación de los varios residuos desfosforilados en las proteínas substratos (Higgins y Hames, 1999). 35 Troponina I. TnI, es una proteína formada por 210 aminoácidos, tiene un peso molecular de 23 906 ( ± 1) Da (Ward, et al., 2001). La TnI cardiaca (TnIc) tiene 31 aminoácidos más hacia el extremo N-terminal, no presentes en otras isoformas (Vallins, et al., 1990). En estos aminoácidos extras se encuentran dos residuos de serina en la posición 22 y 23, los cuales son substratos para la PKA, (Armour, et al., 1993; Ward, et al., 2002; Sakthivel, et al., 2005), esta región N- terminal de TnI, modula la liberación del calcio del complejo troponina y modula la unión de ella con la región N-terminal de TnC, en donde las uniones cruzadas son realzadas por calcio y reducidas por fosforilación (Ward, et al., 2003). La sobre elevación de los niveles de calcio en el citosol y la unión de este a la TnC, incrementa la afinidad de TnI por TnC, mientras que su afinidad por actina decrece (Chandra, et al., 1997). Cuando TnI se encuentra sola, inhibe débilmente la interacción entre la actina y miosina, pero es fuerte cuando se combina con la tropomiosina. TnI es una proteína extendida que adopta una orientación antiparalela hacia TnC, con respecto a las terminaciones amino y carboxilo, en el complejo binario, (Vassylyev, et al., 1998; Sakthivel, et al., 2005) (Fig. 8). En la región N-terminal media de TnIc los residuos 32-80 forman una alfa hélice que se une fuertemente al dominio C-terminal de TnC. En dicha región de TnI se encuentran dos sitios de fosforilación, S42/44, los cuales se fosforilan por PKC y los efectos de esta fosforilación son; un decremento en la actividad de la actomiosina ATPasa (Sakthivel, et al., 2005). 36 Figura 8. Complejo TnC/TnI, de ratón, A) TnC unida a TnI defosforilada, se unen de manera antiparalela. El lóbulo C de TnC interactúa con los residuos N-terminal de TnI, y el lóbulo N de TnC interactúa con la región C- terminal. La región N-terminal (residuos 1-31) especifica de TnIc (Vallins, et al., 1990), seguida de los residuos 32-80 en verde, una región helicoidal en los residuos 81-129, continúa la región inhibitoria que incluye los residuos 128-147 (en color naranja) (Lindhout and Sykes, 2003), el dominio regulatorio (residuos 148-167, en amarillo), y por último la región C-terminal (residuos 168-211). En B) la fosforilación de TnIc en los residuos S22/23, no cambia la conformaciónde la región C-terminal de TnC. En C) se muestra todos los puntos de fosforilación de TnIc. Tomada de Sakthivel, et al., 2005. A continuación se localiza un sitio putativo de unión a TnT, además de las regiones: “Inhibitoria” (128-147 residuos) (Lindhout y Sikes, 2003) y “Regulatoria”, hacia la región C-terminal de TnI. En la primera región se encuentra el punto de fosforilación que se considera en este trabajo: T142, (Fig. 9). Esta región es altamente conservada evolutivamente y se une alternadamente con actina-tropomiosina o con TnCc, dependiendo de la concentración de calcio intracelular (Lindhout y Sikes, 2003). Estas regiones se unen a TnC saturada en Ca2+, pero en ausencia de Ca2+ se unen a la troponina anclada a la actina y tropomiosina en estado de bloqueo (Ward, et al., 2002). 37 Fig.- 9 A).- Secuencia completa de TnI cardiaca humana, la región N-terminal (1-31) en verde (Vallins, et al., 1990), la región dominio N que se une a TnC (residuos 32-80), la región en espiral (81-129), la región inhibitoria (residuos 128-147) en rojo (Lindhout y Sykes, 2003), la región regulatoria (residuos 148-167) y la región C-terminal (residuos 168-211) (Sakthivel, et al., 2005). La región inhibitoria incluye a T142, marcada con un asterisco, cuya fosforilación por PKA es la materia de estudio de este trabajo, e incluye las regiones consenso para PKA y PKC. Tomada de: http://www.pir.uniprot.org/datebase/uniprot La fosforilación de TnI tiene un significado especial en la regulación de la contracción muscular del miocardio. Kentish, et al., (2001), han provisto de considerables evidencias para involucrar la fosforilación de TnI como respuesta a la estimulación ß-adrenérgica del corazón. Esto ha conducido ha estudiar acerca de cómo los latidos del corazón están relacionados al grado de inotropía positiva a través de la anterior correlación, ya que la elevación del cAMP, seguido de la activación de PKA, ha sido comprobada in vitro e in vivo con la fosforilación de S22/23 en TnIc. Las consecuencias funcionales de estas modificaciones reversibles postraduccionales pueden incluir un decaimiento en la sensibilidad al calcio del sistema regulatorio del filamento delgado, debido a un incremento en la velocidad de disociación del Ca2+ en la extensión terminal-N de la troponina C, lo que incrementa la velocidad de relajación y por último un incremento en la velocidad cíclica de los puentes cruzados (Kentish, et al., 2001; Pi, et al., 38 2002; Ward, et al., 2002). Mientras que la fosforilación por PKC de otros sitios (S42 y S44) de TnI baja al máximo la actividad de la ATPasa miofibrilar, (Bodor, et al., 1997). La TnIc tiene un papel regulador en la contracción del músculo cardíaco a través de inhibir la formación de los puentes cruzados entre la actina y la miosina, en donde la fosforilación de la TnIc se ve involucrada en la modulación de las respuestas de los procesos contráctiles dado por los cambios en la concentración del calcio en la célula, (AL-Hillawi, et al., 1995), es decir la fosforilación constituye un mecanismo fisiológico más fino, a través del cual las propiedades del miofilamento son moduladas. (Layland, et al., 2004). Por otro lado, la fosforilación de TnI juega un papel tanto en la relajación misma, como en la aceleración de la relajación, necesario para la respuesta cardiaca adecuada a la estimulación β-adrenérgica (Sakthivel, et al., 2005). Puede también jugar un papel en la modulación de la relación tensión/longitud del miocardio (Ward, et al., 2001). Existen estudios encaminados a contestar la pregunta de cómo la fosforilación de la troponina I contribuye al mejoramiento en el grado de relajación (lusotropía) del músculo cardíaco durante la estimulación β-adrenérgica (Pena y Wolska, 2004). Se ha observado en ratones con ablación de genes de TnIc, una respuesta reducida del miofilamento por el calcio, además de una disfunción diastólica, el desarrollo de un corazón enfermo y muerte a una edad más temprana (Huang, et al., 1999). 39 A la T142 se le reconoce ampliamente como sustrato para PKC, sin embargo, estudios realizados por Noland, et al., (1995) sugieren la posibilidad de que el aminoácido T142 de TnIc sea fosforilado por PKA, determinándolo como sitio de fosforilación menor. Ward, et al., (2001) encontró 5 sitios de fosforilación para PKA, en la proteína TnIc, de los cuales ampliamente describe cuatro, y uno no, este puede ser T142 ó S146, refiriéndose al artículo de Noland, et al., (1995)., sin embargo Ward no encontró fosforilación en estos sitios. La TnIc en T142 también presenta secuencia consenso para PKA, dejando abierta la posibilidad, de que este aminoácido sea sustrato para PKA, así T142 se encuentra en medio de las dos regiones consenso. Debido a su localización en la molécula de TnIc (región inhibitoria), se cree que la fosforilación de este sitio es importante para comprender el papel inhibitorio de TnIc. Una mutación de TnIc que ha sido relacionada con la cardiomiopatía hipertrófica es la que Kimura, et al., (1997), encontraron en una familia que presentaba esta enfermedad, y que era causada por una mutación en el sitio R145G, donde la arginina estaba sustituida por la glicina. La mutación R145G, se encuentra en la región inhibitoria de TnI, esta región incluye aproximadamente 20 aminoácidos que van del 128-147 en la TnIc, la región tiene como sitio de fosforilación bien conocido a la T142. Pero R145 esta dentro de la secuencia consenso para que T142 sea fosforilada por PKC. Recordemos que la hipertrofia cardiaca (HC) se define macroscópicamente como un incremento del grosor de la pared y/o el septo ventricular; en la célula se caracteriza por un 40 incremento del tamaño del cardiomiocito, con aumento en la síntesis proteínica y un cambio en la organización de la estructura sarcomérica (Carreño, et al., 2006). Lindhout y Sikes, (2003), mencionan que las funciones relacionadas a esta mutación son anormales; ya que afecta el desarrollo de la fuerza, debido a que reduce la habilidad de inhibición de la actomiosina ATPasa, incrementando la sensibilidad al calcio de la regulación de la actomiosina ATPasa. La mutación rompe la interacción funcional con la TnC, esta mutación puede relacionarse con la pérdida de la función de TnIc en la contracción del músculo cardíaco. La mutación R145G en TnIc puede afectar el grado de relajación en la contracción del músculo cardíaco. Debido a que la fosforilación de TnI bajo estimulación adrenérgica se da por la enzima cinasa PKA, para la cual sus sitios blancos principalmente son S22 y S23. Esta fosforilación reduce la afinidad al calcio de TnIc. Estos eventos se ven relacionados con un aumento en el grado de relajación en la contracción. Por el contrario en corazones enfermos se ve una fosforilación reducida, lo cual esta directamente relacionado con un incremento en la sensibilidad al calcio (Deng, et al., 2001). Deng, 2001 menciona que los cambios estructurales en el sistema regulatorio del filamento delgado causado por la fosforilación de S22 y S23 de TnI, pueden ser vinculadas con las alteraciones causadas por la mutación R145G en TnIc, ya que ésta fosforilación causa la supresión de la actividad máxima de la actoS1-ATPasa y de la velocidad máxima de deslizamiento in vitro de los miofilamentos. 41 Esta relación tal vez tenga que ver con el hecho de que como ya se mencionó anteriormente la R145, está dentro de una región consenso para la fosforilación de T142 por PKC, pero ¿Qué relación tiene este hecho con la fosforilación de S22 y S23?, Todavía no se ha estudiado. Sin embargo nosotros pensamos que ésta región inhibitoria podría tener más importancia, así que, nos interesamos por él aminoácido T142 como punto de partida para el presente trabajo, ya que es el único sitio de fosforilacióndentro de ésta región inhibitoria, el cual presenta además la secuencia consenso para ser fosforilado por PKA. Hipótesis: Propongo que la fosforilación de T142 (PKA o PKC) puede afectar la fosforilación de la serina 22 y/ó 23, alterando por lo tanto la inotropía y lusotropía del corazón. Objetivo General: Determinar, si las sustituciones T142A y T142D afectan la fosforilación de las serinas 22 y 23 por PKA. Se hará un análisis crítico, para establecer la forma en que estas mutaciones, pueden simular estados fisiológicos de fosforilación por PKA o PKC. 42 DESARROLLO. Modelo de Investigación. Los genes para una gran variedad de proteínas eucariontes pueden ser clonados en los vectores de expresión de Escherichia coli (E. coli), sistema bacterial ampliamente usado de rutina. Tal sistema ha sido empleado usualmente para la producción de productos genéticos heterógenos tanto de origen eucariótico como procariótico, aún mejor por su alto nivel de expresión de proteínas, las cuales pueden ser purificadas y usadas para la investigación (Higgins y Hames, 1999). En este sistema los genes para los isofórmos de TnI y TnC de varias especies de eucariontes han sido clonados y secuenciados con éxito, (Gahlman, et al., 1988; Vallins, et al., 1990). Hay varias consideraciones que se toman en cuenta para la selección del sistema de expresión en E. coli. Una de ellas es que para el crecimiento y manipulación de estos organismos se usa un sencillo equipo de laboratorio, la disponibilidad de docenas de vectores y cepas hospederas que han sido desarrolladas para la máxima expresión, surgiendo una gran variedad de conocimientos acerca de su fisiología y genética (Higgins y Hames, 1999). Así la expresión puede ser completamente exitosa muy rápido cuando se comienza con un DNA eucariótico clonado, lo que hace posible expresar a la proteína en E. Coli, pudiéndose purificar una cantidad de miligramos en días (Higgins y Hames, 1999). Un promotor ideal debe ser suficientemente capaz de permitir la acumulación del producto, por encima del 50% de las proteínas celulares totales; estrictamente regulado para prevenir la toxicidad producida por el nivel de expresión basal, (Higgins y Hames, 1999). All-Hillawi, 43 et al., (1994) reporta una sobreexpresión de TnI en E. coli usando la RNA polimerasa del bacteriófago T7. Las proteínas recombinantes requeridas fueron así usadas para transformar la cepa competente BL21 (DE3), el hospedero de expresión. Las células BL21 (DE3) llevan el gen T7 RNA polimerasa en su genoma bajo el control del promotor Lac UV5 (All-Hillawi, et al; 1994). La inducción se hace con el IPTG, que es un análogo de la lactosa, la cual activa al promotor del gene Lac (promotor Lac UV5), que se encuentra en el cromosoma bacteriano, este normalmente se encuentra bloqueado por el Lac represor (proteína de regulación negativa) (Griffiths, et al., 1999). Una vez activado el Lac UV5, empieza una alta producción de RNA polimerasa del T7, mismas que van a actuar en el promotor tardío del T7 que se encuentra en el vector del plásmido de expresión, donde se encuentra la secuencia de programación para la proteína que se desea amplificar, en nuestro caso la TnIc, (Fig.10) (Griffiths, et al., 1999). Fig.10. Muestra dos pasos de la expresión del sistema basado en la RNA polimerasa del bacteriófago T7 y el promotor tardío del T7. Tomada de Griffiths, et al., 1999. 44 Este gene es activado tardíamente durante la infección, en esta fase el DNA bacteriano se encuentra inactivo, por lo que, grandes cantidades de proteína se sintetiza de manera exclusiva, (Studier y Moffatt, 1986). En nuestro caso TnIc, (Fig.10). Materiales. E. coli TOP10 (Invitrogen) fue usada para la propagación del plásmido en la clonación de las proteínas, la cepa BL21(DE3) fue utilizada como sistema de expresión bacterial para las proteínas recombinantes de TnIc, (García, et al., 2005). E. coli XL-Gold fue usada para la propagación del plásmido en los ensayos de Mutagénesis. Medios: LB-Medio (Invitrogen) Agar con ampicilina imMedia (Invitrogen) NYZ Broth. Medio S.O.C. (Invitrogen). Los plásmidos usados fueron los siguientes: PT7/NT-TOPO para la Mutagénesis de TnI nativa (Mutadas y Mimética). pT7/NT para la expresión de las proteínas en BL21. Los Anticuerpos utilizados: Anticuerpo monoclonal antiXpress 1:500 (Invitrogen) Anticuerpo policlonal antiratón marcado con HRP (Zymed). Anticuerpo policlonal antiTroponina 1:250. Anticuerpo anticabra marcado con HRP. PKA (Kinase Catalytic Subunit); 10X PKA (Assay Buffer) de New England. BioLabs. 45 Métodos. Obtención del cDNA Inserción de TnIcrh nativa, en el vector pCRT7/NT-TOPO y expansión clonal en células E. coli TOP10 y generación de mutantes (T142A, T142D, T142A/S23A, S23A) sobre el mismo plásmido generado. Secuenciación de todas las construcciones recombinantes: nativa, mutadas (T142A, T142D, S23 y T142/S23A). Expresión de los péptidos recombinantes en el sistema E. coli. BL21(DE3). Purificación de los péptido recombinantes, por medio del Sistema de Purificación ProBond. Identificación de las proteínas recombinantes, con Western Blot por medio de los anticuerpos AntiTroponina y AntiXpress, que reconocen el epítope Xpress en el péptido de fusión de las especies recombinantes. Fosforilación con [γ32 -P] ATP de los péptido recombinantes. Cuantificación en contador de centelleo líquido, para determinar la actividad especifica de la marca radioactiva, incorporada. Autorradiograma de los Western Blot, para observar la incorporación de marca radioactiva. 46 Obtención del cDNA de TnIc. Inserción de los distintos amplicones de TnIc en el vector pCRT7/NT-TOPO. Expansión clonal en células E. coli TOP10. Se sintetizó el cDNA utilizando transcripción reversa, a partir de mRNA tomado de una muestra en fresco de un corazón humano clínicamente muerto, el cual se aisló y purificó para poder realizar la subclonación directa del cDNA en el vector pCRT7/NT-TOPO (Invitrogen) (Fig. 11). Fig. 11.) Muestra el plásmido utilizado para llevar a cabo la subclonación directa del cDNA de la proteína Troponina I. Se uso como molde en la mutagénesis y para la expresión de las proteínas recombinantes. Se utilizó este plásmido porque adiciona una región que sirve de marcada (Flag) que contiene una región de polihistidinas (6xHis), un epítope para Xpress, un sitio de reconocimiento y una región para BamHI. Estas regiones son importantes para la expresión, cuantificación y purificación de TnIc. Tomada de http://www.invitrogen.com/search/index 47 Se transforma la cepa TOP10 mediante un choque térmico con el plásmido pT7/NT que contiene el DNA de TnI, para introducir el plásmido a la célula. Después las células se incuban en un medio S.O.C., por 30 min. y posteriormente se siembran en placas con medio de agar con ampicilina imMedia (Invitrogen) y se incuban por 16hrs a 37ºC, para su óptima selección y crecimiento. De las colonias que crecieron, se eligieron seis colonias al azar, para volverlas a crecer, pero en medio líquido con ampicilina en las condiciones de incubación ya mencionadas anteriormente, con estas seis colonias se estima que por lo menos una, tuviera el plásmido en el sentido y secuencia correctas. El DNA del PCR usado en la subclonación, fue separado por geles de agarosa al 8% y purificado, mediante el uso del Kit Rapid Plasmid Purification Systems (Marlyn Biosciences), para utilizarlo en el análisis de secuenciación. Reacciones y mutagénesis dirigida basada en PCR. Reacciones de PCR y mutagénesis dirigida obtenida por PCR, la proteína TnI ligadaal plásmido pT7/NT fue usado como molde, en un bloque de calentamiento programable (GeneAmp PCR System 2400, PerkinElmer), se siguieron las recomendaciones descritas por Jay, et al., (2000). Los parámetros de ciclicidad del PCR fueron: Se inició la reacción a 95oC por un minuto, seguido de 18 ciclos de 95 oC por 50 segundos, 60 oC por 50seg y 68 oC por 7 minutos. Se usaron 10μM de cada primer, 12.5ng del DNA templete, Buffer de reacción 1X, 2.5 U de DNA Turbo polimerasa, 0.2 mM de dNTPMix y 48 3.0μl de Quick Solution en un volumen final de 50μl. Los primers usados para la introducción de la mutación puntual T142A fueron: MutTropTh R1: 5’TTTAAGCGGCCCGCCCTGCGGAGAG3’ y MutTropThR2: 3’CTCTCCGCAGGGCGGGCCGCTTAAA 5’. Para la mutación puntual T142D fueron: Mimét TropThR3: 5’TTTAAGCGGCCCGACCTGCGGAGAG 3’ y MimétTropThR4: 3’CTCTCCGCAGGTCGGGCCGCTTAAA5’. Los nucleótidos subrayados son los que se cambiaron, durante la mutagénesis. La sustitución T→ C corresponde a la sustitución A → G en el codón ACC → GCC 142 en donde una Treonina es sustituida por Alanina para TnI (T142A). Para TnI mimética (T142D), la sustitución fue sobre la especie mutante (T142A), cambiando G → T correspondiente a la sustitución C → A en el codón GCC → GAC 142, por lo que en el sitio correspondiente a Treonina se cambió para obtener la Alanina de la mutante y que a su vez fue sustituida por Ácido aspártico en la mimética. Después de amplificadas, las muestras fueron tratadas con la enzima DpnI (10 unidades) para digerir el DNA híbrido y el parenteral metilado in vivo. Se incubo por 1hr a 37˚C (Sambrook, et al., 1989). Las ligaciones del DNA fueron llevadas a cabo con el Rapid DNA Ligation Kit, directamente en el vector de expresión pT7/NT, con una reacción de ligación, en presencia de la Topoisomerasa, y el plásmido, en un tiempo de 5 seg. 49 Se transformó a la cepa XL-Gold con los plásmidos, la cepa se descongeló en hielo. Después las células se incubaron en hielo por 30min, con el DNA. Se les dio un choque térmico para poder introducir el plásmido a la bacteria. Las células se pusieron en medio NZY Broth, se incubaron a 37 ºC a 250rpm durante 1hr. Posteriormente se sembraron en placas con medio de agar con ampicilina imMedia (Invitrogen). Se incubaron por 16hrs a 37 ºC. Al término de la incubación, se apreció crecimiento de las colonias en las placas, de las cuales se tomaron seis colonias de cada placa para crecerlas en 3 ml de medio líquido con ampicilina imMedia de Invotrogen, en las condiciones de incubación mencionadas anteriormente. Se realizó un miniprep con el kit Raplid Plasmid Miniprep System de Marligen Bioscience INC para obtener el DNA del plásmido. Una vez obtenido el DNA, se tomó una alícuota (250 ng) para hacer el análisis de secuenciación y el resto se guardó a -20ºC. Secuenciación del cDNA de las construcciones recombinantes de TnIc. Se diseñaron en el laboratorio los oligonucleotidos usados en la amplificación del DNA correspondiente a las diferentes proteínas de TnI, (Jay, et al., 2000). La amplificación de los plásmidos se llevó a cabo con PCR: Iniciando la reacción con un ciclo de 95 ºC por 5min, seguido de 25 ciclos de 96 ºC por 10seg, 50 ºC por 5seg y 60 ºC por 4min. Para ampliar la secuencia codificante para TnIc, los oligos usados y la mezcla están descrito en Jay, et al. (2000). 50 El DNA del PCR fue separado por geles de agarosa al 8%, y purificado mediante el uso del Kit para purificar el DNA descrito anteriormente, para eliminar el exceso de reactivos, con la finalidad de tener una muestra limpia y obtener un buen análisis para utilizarlo en el análisis de secuenciación. Las mutaciones S23A, T142A, T142A/S23A y T142D se confirmaron con el análisis de secuenciación del DNA por fluorescencia, para esto se utilizó un secuenciador 310 Genetic Analyzer ABI PRISM, así se confirmó que las mutaciones eran las correctas. Expresión de las proteínas TnIc recombinantes en E. coli BL21(DE3). La cepa BL21 (DE3) se descongeló en hielo, al igual que los plásmidos que incluían a las distintas proteínas de TnI. La cepa se transformó con los plásmidos correspondientes. Se incubaron en hielo durante 30 min. Posteriormente se dió a la muestra un choque térmico (˚42 C/30seg). En tubos de ensayo Falcon se puso LB-Medio con ampicilina (200μg/ml), se inoculó con E. coli, BL21(DE3) transformada, dejando crecer las bacterias en este medio hasta que alcance una D.O.600nm=1; se mantienen en el incubador a 280rpm a 36.5 ˚C. Se tomaron las primeras muestras (tiempo cero, este es la muestra control, sin IPTG), se indujo con 0.4mM de IPTG y en intervalos de una hora se tomaron más alícuotas, hasta los 240min de crecimiento, así los cursos temporales de expresión de las proteínas fueron obtenidas, (Fig. 13). 51 Las proteínas se lavaron con Buffer STE (ver anexo) y se resuspendieron en amortiguador de muestras [Sample Buffer, (SB, 1X)]. Se desnaturalizaron por 3 min. Las muestras se mantuvieron en refrigeración a –20 ˚C. Purificación de las TnIc recombinantes. Las proteínas recombinantes (expresadas en E. coli), fueron lavadas con STE y los botones fueron resuspendidos en Native Binding Buffer pH: 7.8. Las membranas se rompieron por sonicación con un disrruptor sónico y por ciclos repetidos de congelación-descongelación. La suspensión de células se centrifugó a 6000rpm durante 20min, se eliminan los restos celulares y se recuperó el sobrenadante que contiene las proteínas. La purificación de las proteínas recombinantes se llevó a cabo mediante condiciones nativas utilizando una resina ProBond de níquel (Invitrogen), mediante una columna de afinidad a polihistidinas, siguiendo las condiciones de pegado recomendadas por el fabricante (protocolo de ProBond). La concentración de las proteínas se llevó a cabo mediante un filtro de 10 000kDa, y después se equilibraron con un buffer Tris-Cl 10mM, pH: 7.4. Se centrifugaron a 23 000rpm durante 40min. Identificación de las TnIc recombinantes por medio de SDS-PAGE y Western Blot. A las proteínas expresadas en E. coli, se caracterizaron por medio de geles de poliacrilamida y por medio de transferencia en Western Blot, métodos simples y rápidos (Berzins, 1998). Se tomaron alícuotas de cada proteína para disolverlas en un tampón de corrida con SDS para geles de poliacrilamida. El fraccionamiento de las proteínas permitió su separación de 52 acuerdo a su peso molecular en SDS-PAGE al 12.5% electroforéticamente, método descrito en Laemmli, 1970. Se tiñe el gel mediante azul de Coomassie para visualizar las bandas de las proteínas. Con el fin de corroborar la presencia de la proteína, se hizo una transferencia (protocolo de inmunodetección), en donde se utilizan anticuerpos primarios que pueden ser: 1.- policlonal (α-Troponina) o 2.- monoclonal (α-Xpress) y también con secundarios marcados con peroxidasa específicos para cada anticuerpo primario. Este método está basado en una interacción antigeno-anticuerpo, (Berzins, 1998). La transferencia permite que la proteína migre del gel hacia un papel de Nitrocelulosa (Micrón Hybond), en presencia de un buffer de transferencia frío (ver anexo). Pasado el tiempo el papel se retiró de la placa y se tiño con rojo de Ponceau (1%), una tinción rápida y reversible, que sirve para corroborar que la transferencia se haya realizado, el colorante se retiro lavando con agua destilada y PBS a pH: 7.2. El papel de nitrocelulosa se bloquea con una solución de leche descremada al 5% (ver anexo), para saturar los espacios libre de la membrana con está solución de proteínas neutrales (Berzins, 1998). Se retiro la leche y la membrana se incubo con el primer anticuerpo específico para la proteína (AntiTroponina). Se dejaron así durante 12hrs en agitación y a 4 ˚C. 53 Se incubaron
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