Identificacion-del-gen-candidato-de-la-region-cromosomica-5p-relacionado-a-la-carcinogenesis-cervical

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO 
 
 
POSGRADO EN CIENCIAS 
BIOLÓGICAS 
FACULTAD DE MEDICINA 
 
 
" IDENTIFICACION DEL GEN CANDIDATO DE LA REGION 
CROMOSOMICA 5P RELACIONADO A LA CARCINOGENESIS 
CERVICAL " 
 
T E S I S 
 
 
 
QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE: 
 
MAESTRA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS 
(BIOLOGÍA EXPERIMENTAL) 
 
 
P R E S E N T A: 
 
KARLA ITZEL VÁZQUEZ SANTILLÁN 
 
 
DIRECTOR DE TESIS: DR. MAURICIO SALCEDO VARGAS 
 
 
 MÉXICO D.F. Octubre, 2007 
 
 
 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Agradezco a la Universidad Nacional Autónoma de México en 
especial al Posgrado de Ciencias Biológicas, al Consejo Nacional 
de Ciencia y Tecnología (CONACYT) y al Instituto Mexicano del 
Seguro Social IMSS por darme la oportunidad de continuar con mi 
superación académica y personal. 
 
Agradezco también a los miembros de mi comité tutoral por la 
revisión que hicieron de mi trabajo y por sus valiosas sugerencias y 
comentarios que sirvieron para enriquecerlo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
A mis padres por todo el apoyo que me han brindado, gracias por creer en mi y 
apoyarme siempre que lo he necesitado …… los amo. 
 
A toda mi familia por el cariño y apoyo que me han otorgado durante toda mi 
vida, en especial a mi abuelita, mi hermana , mi tía rosa gracias por quererme 
tanto. 
 
A mi tutor, el Dr. Mauricio Salcedo, por el invaluable apoyo que me brindo para 
la realización de este proyecto. 
 
A mis amigos y compañeros de laboratorio por su convivencia y amistad y por 
todos esos momentos tan divertidos, especialmente a Brenda, Paty, Jellow, 
Charlos, Hugo, gracias por todo, he aprendido mucho de ustedes, bueno de 
Hugo no. (jaja). 
 
A mis amigas anita, mir, wendy, barbara, gracias por apoyarme siempre y por 
todos esos momentos tan divertidos que hemos vivido. 
 
 
 
 
 
 
INDICE 
 
Resumen….…………………………………………………………………………………...1 
Abstract………………………………………………………………………………………..2 
Introducción 
El cáncer cérvico uterino como un problema de salud mundial…………………………..2 
Historia natural del Cáncer de Cérvix………………………………...…………………….3 
Factores de riesgo asociados a CaCU……………………………………………………..5 
CaCU y virus de papiloma humano………………………………………………………….5 
Alteraciones Cromosómicas …………………………………………………………………6 
Hibridación genómica comparativa en metafases (HGCm)......………………………….9 
Hibridación genómica comparativa sobre microarreglos (HGCa) ………………………14 
Antecedentes……………………………………………………………………………..…...16 
Justificación………………………………………………………………………….………..21 
Objetivos……………………………………………………………………………………...22 
Metodología …………………………………………………………………………………23 
Resultados ……………………………………………………………………………………32 
Discusión …………………………………………………………………………………….46 
Conclusiones ………………………………………………………………………………..54 
Referencias ………….……………………………………………………………….……. 55 
 
RESUMEN 
 
El cáncer cérvico uterino representa un importante problema de salud a nivel mundial y en 
México este representa la primer causa de muerte entre la población femenina. La 
infección con virus de papiloma humano es considerada como el principal agente 
etiológico de la enfermedad, sin embargo, la infección por si sola no es suficiente para el 
desarrollo del CaCu, por lo que otros eventos como la acumulación de alteraciones 
cromosómicas son requeridos para el desarrollo del CaCU. Mediante metodologías de 
análisis genómico se ha identificado un patrón de alteraciones cromosómicas específico 
0para este tipo de neoplasia y se ha determinado que la amplificación del brazo corto del 
cromosoma 5 es un evento que ocurre frecuentemente en carcinomas cervicales, lo cual 
sugiere la presencia de genes cuya ganancia de función puede ser ventajosa para la 
progresión hacia etapas avanzadas del CaCU. Sin embargo, aún no se han identificado 
los genes que son los verdaderos blancos de amplificación dentro de esta región, por lo 
que en este trabajo se analizaron los resultados derivados de Hibridación Genómica 
Comparativa sobre microarreglos (HGCm) aplicada a 5 líneas celulares derivadas de 
CaCU y en base a estos datos se identificó que el gen TRIO se amplifica en todas las 
líneas celulares. TRIO codifica una proteína con tres dominios funcionales, un dominio 
serina treonina cinasa y dos dominios de intercambio de guaninas que activan a GTPasas 
de la familia Rho. TRIO está involucrada en la remodelación del citoesqueleto de actina, 
proliferación celular, migración etc. Para determinar la amplificación de TRIO en 53 
carcinomas cervicales y 20 lesiones premalignas, se realizó PCR en tiempo real con 
oligonucleótidos específicos para TRIO. La presencia de VPH y la tipificación de las 
secuencias virales también fue realizada en las muestras analizadas. TRIO se encontró 
amplificado en 75% de los tumores VPH+ y en 25% de los tumores VPH- sin embargo, 
ninguna de las lesiones premalignas presentó amplificación del gen. 
ABSTRACT: 
 
Cervical Cancer is a very important health problem World Wide and in Mexico it represents 
the first cause of death between female population. HPV infection is the principal 
aethiological factor involved in this disease, however single infection is not enough for the 
development of cervical cancer and others events like chromosomic alterations are 
required for cervical carcinogenesis. Several genomic analysis methods have detected a 
specific pattern of chromosomal imbalances in this type of tumor, and the amplification of 
chromosme 5p has been described as a recurrent event in cervical carcinomas. 
Amplification of short arm of chromosome 5 suggests the presence of genes whose gain 
of function seems to be highly advantageous in the progresion towards advanced stages 
of cervical carcinomas. However, at present, specific genes that suffer copy increase in 
the 5p region have not yet been identified, by such reason the results generated by 
Comparative Genomic Hybrization Arrays in 5 cancer cervical cell lines were analized and 
TRIO gene was amplified in all cell lines. Trio codes for a protein with a serine/threonine 
kinase domain and two guanine nucleotide exchange factor domains for the family of Rho-
like GTPases. Trio has been involved in remodeling cytoskeletal actin. migration and cell 
proliferation. 53 cervical carcinomas and 20 premalignant lessions were analized by Real 
Time PCR to determinate if Trio gene was amplified. HPV presence was examinated in all 
simples too. Trio amplification was detected in 75% of tumors HPV positives and in 25% of 
tumors HPV negatives, none of premalignant lessions showed trio amplication. 
 
 
 
 
 
INTRODUCCIÓN: 
 
EL CÁNCER CERVICO UTERINO COMO UN PROBLEMA DE SALUD MUNDIAL 
 
El cáncer cervico uterino (CaCU) constituye un importante problema de salud pública en 
todo el mundo. La incidencia de CaCU es una de las mas altas, representando el segundo 
cáncer en frecuencia entre las mujeres a nivel mundial, y ocupa el primer lugar en muchos 
países en desarrollo. Aproximadamente 510,000 nuevos casos son reportados cada año 
de los cuales 80% se presentan en los países en vías de desarrollo; 68,000 casos en 
Africa, 77,000 en Latino América y 245,000 en Asia. Enel 2005 se registraron mas de 
250,000 muertes por esta causa (1). 
 
En México, el CaCU ocupa el primer lugar en incidencia y mortalidad por tumores 
malignos, entre la población femenina, representando mas del 24% de todas las 
neoplasias malignas reportadas. (Gráfica 1). En el 2001 el 8% del total de muertes por 
neoplasias se debió a este cáncer, el cual registró una tasa de 21 por 100,000 mujeres de 
entre 25 y 64 años (2). El CaCU es una enfermedad que manifiesta pocos síntomas, esto 
aunado a la falta de información y a la ausencia de una cultura del autocuidado de la 
salud provocan que el diagnóstico del CaCU se realice en etapas muy avanzadas cuando 
el pronóstico es poco alentador. 
 
Aunque esta enfermedad puede evitarse en gran medida, las tasas de incidencia y 
mortalidad no han descendido significativamente en los últimos 40 años, por lo que hoy en 
día el CaCU sigue siendo uno de los problemas sociales y de salud más graves en 
nuestro país (3). 
 
 
Gráfica 1. Neoplasias más comúnmente reportadas en el Registro histopatológico de 
neoplasias malignas (2) 
 
HISTORIA NATURAL DEL CÁNCER DE CÉRVIX 
 
EL CaCU evoluciona a partir de neoplasias cervicales intraepiteliales (NIC) las cuales se 
han agrupado en NIC I, II y III de acuerdo con el porcentaje de alteraciones presentes en 
el epitelio cervical. En las NIC I o displasia leve hay alteraciones en el arreglo regular de la 
tercera parte del epitelio y existen escasos cambios celulares superficiales constituidos 
por células con abundante citoplasma y ligero crecimiento del núcleo. Las NIC II o 
displasia moderada se caracterizan por presentar alteraciones en las dos terceras partes 
inferiores del epitelio, las células presentan núcleos grandes y hay una pérdida de la 
relación núcleo/citoplasma. Las NIC III o displasia grave presentan alteraciones en todo el 
epitelio cervical, las células carecen de citoplasma y tienen núcleos aneuploides 
hipercrómicos (4). 
11 % 
13,60% 
24,40% 
. Cervix 
D Piel 
Mama 
D Prostata 
• Estomago 
Estos tipos de lesiones pueden revertirse, persistir o progresar hacia cáncer, numerosos 
estudios han demostrado que las NIC 1 revierten a menudo espontáneamente, por el 
contrario, solo un pequeño porcentaje de las NIC II y III regresan o desaparecen, siendo 
su conducta mas frecuente hacia la persistencia o a la progresión (5, 6, 7). Hoy en día la 
clasificación mas utilizada para definir estas lesiones premalignas, es la del sistema 
Bethesda el cual considera a la NIC I como lesión intraepitelial de bajo grado (LIEBG) y a 
la NIC II y III como lesión intraepitelial de alto grado (LIEAG) (Figura 1) (8), 
Figura 1. Lesiones premalignas del cérvix 
 
El tiempo que tarda en evolucionar una NIC I hacia cáncer es desconocido, sin embargo 
se ha calculado que son aproximadamente 4 años los que tarda una lesión en progresar a 
su siguiente fase (9) y de 10 a 30 años lo que le toma a una NIC III para evolucionar a 
carcinoma invasor (10). 
 
La lesión se considera un carcinoma invasor cuando las células transformadas del epitelio 
cervical han rebasado la membrana basal e invadido el tejido adyacente, histológicamente 
hay varios tipos de carcinoma invasor, el mas frecuente (90 a 95%) es el carcinoma 
escamoso o epidermoide, siguiéndole en importancia el adenocarcinoma (4%) y otros 
tipos menos frecuentes entre los que se encuentran el carcinoide y el carcinoma de 
células claras (4). 
NIC I NIC 11 NIC 111 
OISPLASIA LEVE DISPLASIA MODERADA OISPLASIA SEVERA 
LlEBG LlEAG 
FACTORES DE RIESGO ASOCIADOS A CACU 
 
Numerosos factores de riesgo han sido implicados en la etiología del CaCU, entre los 
cuales se encuentran: el consumo prolongado de anticonceptivos orales, inicio de vida 
sexual a temprana edad, elevado número de parejas sexuales (6 o mas), alta paridad 
(mas de 5 partos), hábitos higiénicos deficientes, tabaquismo y la infección con virus de 
papiloma humano (VPH) (11, 12). Las infecciones de transmisión sexual provocadas por 
Chlamydia trachomatis, (13) virus del Herpex simple 2 y virus de la insuficiencia humana 
(14) así como condiciones de bajo nivel socioeconómico y deficiencias nutricionales 
pueden también interferir como cofactores en el CaCU. 
 
Son varios los factores de riesgo que han sido implicados en diferentes momentos en la 
etiología del CaCU, sin embargo, el factor etiológico mas importante para el desarrollo del 
CaCU lo constituye la infección con virus de papiloma humano de alto riesgo (15-17). 
 
CACU Y VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO. 
 
Actualmente es bien conocida la relación existente entre el VPH y el CaCu y numerosos 
estudios han revelado que la prevalencia de infección con VPH en CaCU es superior al 
99.7%, lo cual significa que secuencias del VPH pueden ser encontradas virtualmente en 
todos los tumores cervicales (17,18). El VPH ha sido asociado claramente tanto con 
lesiones precursoras como en carcinoma invasor (19). A nivel mundial se estima que del 
2% al 20% de la población femenina esta infectada con algún tipo de VPH. (20) En 
México se ha observado un porcentaje de infección de 16.7 % en mujeres menores de 25 
años mientras que este porcentaje se reduce a 3.7 % en el grupo de edad de 35-44 años 
e incrementa progresivamente a 23% en mujeres mayores de 65 años (21). 
Hasta el momento se han identificado y secuenciado 85 tipos de VPH y se han 
caracterizado parcialmente 120 genotipos potenciales (22). Los VPH pueden agruparse 
en tipos cutáneos que infectan células epiteliales básales de la piel y tipos mucosos que 
infectan el tracto respiratorio y el epitelio anogenital. En base a su asociación con el CaCU 
y las lesiones precursoras, los VPH se clasifican como de alto riesgo (VPH-AR) , aquellos 
que se encuentran preferentemente en tumores invasores; los de mediano riesgo y los de 
bajo riesgo (VPH-BR), que se encuentran presentes en lesiones benignas, como los 
condilomas; los VPH-BR incluyen los tipos 6, 11, 42, 43 y 44 y los VPH-Ar incluyen los 
tipos 16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 45, 52 56, 58, 59, 66, 68 y 70, siendo el tipo 16 el que se 
encuentra con mayor frecuencia (23). 
 
Los VPH-AR contribuyen a la progresión maligna debido a la expresión continua de sus 
oncogenes virales E6 y E7, el principal efecto de la expresión de E6/E7 es interferir con el 
control del ciclo celular e iniciar un proceso a través del cual el genóma de la célula 
acumule cambios y adquiera un fenotipo maligno (revisado en 22). De tal manera que la 
infección con VPH-AR juega un papel importante en la carcinogénesis cervical, sin 
embargo, el hecho de que solo un pequeño porcentaje de las mujeres infectadas con el 
virus eventualmente desarrolla cáncer, aunado a los largos periodos de latencia entre el 
inicio de la infección y el desarrollo de la lesión, sugiere que la infección con algún tipo de 
VPH, incluso uno de alto riesgo es necesario pero no es suficiente para inducir el 
desarrollo del CaCU. Por lo tanto, es claro que otros eventos tales como amplificaciones o 
deleciones de regiones cromosómicas o cromosomas completos, deben de estar 
involucrados en el desarrollo del cáncer y que en conjunto con el virus estén provocando 
el desarrollo de las neoplasias cervicales. 
 
 
ALTERACIONES CROMOSÓMICAS 
 
La transformación maligna se inicia generalmente por una lesión genética debido a un 
error provocado durante la división celular o debido a daño genotóxico no reparado, este 
evento inicial ofrece0 una oportunidad para el desarrollo de otras altertaciones genéticas. 
De tal manera que cuando la combinación propia de lesiones genéticas se acumula en 
una célula, esta llega a ser maligna. Estas alteraciones genéticas son requeridas para el 
desarrollo y progresión tumoral (24). 
 
Los carcinomas cervicales frecuentemente adquieren alteraciones cromosómicas 
estructurales y numéricas, como translocaciones cromosómicas, deleciones y 
amplificacionesde ciertas regiones cromosómicas. 
 
Las alteraciones cromosómicas pueden acumularse a través de un proceso conducido por 
la inestabilidad genómica (25). La inestabilidad genómica crea un estado permisivo en el 
cual una célula puede adquirir sufcientes mutaciones y alteraciones, que le permiten llegar 
a ser una célula cancerosa, otorgándole de esta forma un mecanismo de plasticidad que 
le permite adaptar su genoma a las exigencias que se presentan durante la progresión 
tumoral (26). La inestabilidad genómica es una característica de los tumores epiteliales 
(27); en cancer de cérvix se desarrolla en etapas tempranas y puede ser detectada 
incluso en lesiones premalignas (28). La inestabilidad genómica puede dar lugar a células 
que no son viables y experimenten apoptosis o senecencia, pero también abre una 
ventana de oportunidades para la acumulación de aberraciones cromosómicas que den 
lugar a células capaces de superar los diferentes retos ambientales que surgen durante la 
progresión del cáncer (29). Esta acumulación de cambios genéticos permite a la célula 
alcanzar el umbral crítico necesario para la transformación maligna (26). 
El incremento en el número de copias (amplificación) es un mecanismo que conlleva a la 
expresión anormal de oncogenes y juega un papel importante en la patogénesis de 
muchos tumores sólidos (30). La amplificación ocurre como un resultado de rearreglos 
cromosómicos tales como duplicaciones, formación de isocromosomas, inserciones, 
translocaciones, fragmentos cromosómicos acéntricos, etc, lo cual puede afectar la dosis 
génica de numerosos genes simultáneamente. La amplificación ha sido asociada con la 
progresion tumoral, un peor pronóstico y resistencia a quimioterapia en una variedad de 
tumores (31). 
 
La descripción de alteraciones cromosómicas en células tumorales es de vital importancia 
para la identificación de oncogenes y genes supresores de tumor involucrados en el 
desarrollo y progresión de las neoplasias (30-33). 
 
Con la introducción de las técnicas de bandeo cromosómico en los 70s se lograron 
identificar algunas alteraciones cromosómicas en una gran cantidad de tumores malignos. 
En carcinomas cervicales se encontraron alteraciones que involucran principalmente a los 
cromosomas 1,3,5,17 y X, cabe destacar que el cromosoma 5 se encontró alterado en un 
mayor porcentaje de los tumores (77%), en donde la alteración mas común fue la 
formación de isocromosomas del brazo corto del cromosoma 5 (34-36). Esta alteración ha 
sido también detectada en líneas celulares derivadas de CaCu (37). 
 
Mediante técnicas citogenéticas empleadas en el análisis del CaCU hemos tenido una 
visión limitada de los cambios cromosómicos que se presentan en las células tumorales, 
debido principalmente a las dificultades técnicas para cultivar células epiteliales 
neoplásicas y a la complejidad de las alteraciones y rearreglos cromosómicos 
encontrados en las células tumorales, haciendo difícil la identificación de todas las 
alteraciones cromosómicas presentes en CaCU, por tal motivo se han desarrollado otras 
metodologias que nos permiten una mejor caracterización de las alteraciones 
cromosómicas presentes en las neoplasias. 
 
HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARATIVA EN METAFASE 
 
En los últimos años ha existido un avance impresionante en el estudio de la genética 
molecular del cáncer y se han desarrollado diversas metodologías de alto rendimiento que 
nos permiten analizar un amplio panorama del genoma en un solo experimento; una de 
estas técnicas es la hibridación genómica comparativa en metafase (HGCm). La HGCm 
desarrollada por Kallionieme en 1992 (38) representa una poderosa herramienta para 
identificar cambios en el número de copias en el ADN, la principal ventaja de la HGCm es 
la posibilidad de crear un mapa genómico con las regiones de pérdida o ganancia de 
material genético, a apartir de pequeñas cantidades de ADN, permitiendo un análisis 
global de los desbalances cromosómicos presentes en los tumores, los cuales pueden ser 
relevantes en la etiología de las neoplasias, o pueden tener importancia en el diagnóstico 
o pronóstico de la enfermedad (39). 
 
La HGCm se basa en la comparación de dos poblaciones de ADN genómico, una 
derivada de células tumorales y la otra derivada de células con cariotipo normal, las 
cuales son marcadas con fluorocromos diferentes, por lo general, se utiliza fluoresceina 
(verde) para marcar el genoma tumoral y rodamina (rojo) para el genoma normal, ambos 
ADN son mezclados en cantidades equimolares e hibridados sobre cromosomas en 
metafase de un sujeto cariotípicamente normal. La hibridación se llevará a cabo de una 
manera competitiva sobre sus secuencias complementarias en los cromosomas en 
metafase, de tal manera que la cantidad relativa de ADN que se une a sus secuencias 
blanco está directamente relacionada con la abundancia relativa de esta secuencia. Las 
diferencias en las intensidades de fluoresencia sobre los cromosomas reflejan el cambio 
en el número de copias de secuencias correspondientes en el genoma tumoral, si los 
cromosomas o regiones cromosómicas se presentan en igual número de copias tanto en 
el tumor como en la muestra normal, la fluoresencia observada será una mezcla de igual 
contribucion de fluorecencia verde y roja, pero si existen deleciones de regiones 
cromosómicas en el genoma tumoral la señal sera predominantemente roja y si existen 
amplificaciones la señal se reflejara predominantemente verde. Figura 2. De esta forma, la 
HGCm permite obtener un mapa de las regiones que sufren cambios en el número de 
copias de ADN en todo el genoma en un solo experimento (38). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Esta técnica ha sido usada para identificar regiones cromosómicas involucradas en la 
carcinogenesis de un amplio espectro de tumores y ha servido como un punto de partida 
inicial para la busqueda de nuevos genes implicados en cáncer (40-43). En CaCu, la HGC 
sobre metafases ha sido aplicada para el análisis de todos los estadios de la enfermedad, 
DNA 
Control DNA Tumora
l 
Sin 
cambio
s 
Perdida 
Ganancia 
Resultado de 
la hibridación 
 hibridación 
Figura 2. Hibridación Genómica Comparativa sobre metafases 
 
desde lesiones premalignas hasta carcinoma invasor, detectándose un patron de 
alteraciones cromosómicas particulares para este tipo de tumor (44-50). 
 
La figura 3 muestra un histograma de las aberraciones cromosómicas presentes en 383 
carcinomas cervicales invasores, provenientes de datos generados mediante HGCm, los 
cuales se encuentran depositados en la base de datos Progenetix (www.progenetix.com). 
En este histograma podemos observar la suma de los cambios cromosómicos presentes 
en carcinomas invasores, en donde la amplificación del cromosoma 3q y 5p, así como la 
perdida del cromosoma 2q son uno de los eventos mas comunes en esta neoplasia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Desbalances cromosómicos detectados en 383 casos de CaCU mediante 
HGCm. 
 
Las alteraciones descritas hasta el momento reflejan un patron de cambios cromosómicos 
asociados con estados particulares de la transformación cervical y con comportamientos 
biológicos específicos, encontrándose que el número de aberraciones cromosómicas 
incrementa significativamente en la transición de lesiones premalignas a carcinoma 
invasores y continúa incrementando con el estadio del tumor, indicando que la 
acumulación de alteraciones cromosómicas puede ser importante para la progresión del 
CaCU (45, 48, 49, 51, 52). 
 
Mediante el uso de HGCm se han descrito varias alteraciones cromosómicas recurrentes 
en tumores y en líneas celulares derivadas de CaCU, estas regiones incluyen ganancias 
en el cromosoma 3q, 5p, 1q, 8q, 20q, 17q y pérdidas de los cromosomas 2q, 3p, 4, 6q, 
11q, 13q y 18q. La ganancia del cromosoma 3q ha sido reportada en todos los estudios 
de HGC y fue primero consideradacomo un posible marcador para la transición entre NIC 
III y carcinoma invasor. Ried et al 1999, propusieron un modelo en el cual las lesiones 
premalignas aún no presentan alteraciones específicas, siendo la ganancia del 
cromosoma 3q el evento inicial en el desarrollo de carcinoma cervical etapa 1, seguido de 
la ganancia del cromosoma 1q, 5p, 8q, 20q y la pérdida del 2q en etapas avanzadas del 
CaCU (52). Figura 4. Sin embargo, otros grupos han reportado que la ganancia del 
cromosoma 3q es un evento frecuente aún en lesiones premalignas del cérvix (44). 
 
Figura 4. Modelo de 
adquisición de alteraciones 
cromosómicas en diferentes 
etapas de la progresión del 
CaCu (Ried et al, 1999) 
 
 
Además de la ganancia del 3q, también se han encontrado alteraciones como ganancias 
en 1q, 8q, y pérdidas en 11q, 13q y 6q en etapas tempranas de la progresión, sugiriendo 
que otros eventos además de la ganancia del cromosoma 3q están involucrados en la 
carcinogénesis cervical. Muchas de estas alteraciones también están presentes en 
tumores invasores, indicando que juegan un papel importante en la progresión del CaCU. 
 
Estudios recientes reportan que la amplificación con alto número de copias del brazo corto 
del cromosoma 5 es un evento recurrente durante la progresión de etapas avanzadas del 
CaCU, observándose en la mayoría de los casos la amplificación de todo el brazo (44, 47, 
52, 53). 
 
Algunos estudios que combinan el uso de HGCm con otras técnicas como la 
cariotipificación espectral (SKY) han descrito la formacion de isocromosomas del 5p en 
carcinomas cervicales (54). La amplificación de todo el brazo corto del cromosoma 5 
sugiere la presencia de genes cuya ganancia de funcion puede ser altamente ventajosa 
en la progresion hacia estados avanzados del CaCU. 
 
La mayoría del los estudios concuerdan que la ganancia del cromosoma 5p solo es 
observada en etapas avanzadas del CaCU, sin embargo, Aubele et al (1998) encuentran 
ganancia del 5p en lesiones premalignas y consideran este evento como un marcador de 
la progresión (55). 
 
Algunos autores han descrito alteraciones cromosómicas con valor pronóstico, como la 
pérdida del cromosoma 11p y 18q y la sobreexpresión de EGFR asociadas con un peor 
pronóstico en CaCU y la pérdida del cromosoma 9p asociado a metastasis, lo cual refleja 
la importancia de identificar alteraciones cromosómicas particulares en esta neoplasia (48, 
56). 
 
Gracias a la aplicación de HGC sobre metafase se han logrado definir alteraciones 
cromosómicas recurrentes en todas las etapas del CaCU, destacando de esta manera las 
regiones que pueden contener genes importantes involucrados en la progresión del 
Carcinoma Cervical. Sin embargo, mediante la HGCm, tenemos solo cierta idea acerca de 
los genes que son los verdaderos blancos de amplificación o deleción, ya que las 
alteraciones genéticas reportadas por esta metodología involucran regiones citogenéticas 
que pueden contener una gran cantidad de genes dentro de ellas. Por tal motivo, 
actualmente se ha desarrollado una técnica llamada Hibridación Genómica Comparativa 
sobre microarreglos. 
 
HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARATIVA SOBRE MICROARREGLOS 
 
La Hibridación Genómica Comparativa sobre microarreglos (HGCa) permite la detección 
de amplificaciones y deleciones específicas que no pueden ser identificadas por medio de 
HGCm (57). Esta técnica tiene la ventaja de que las pérdidas y/o ganancias pueden ser 
mapeadas por la posición del gen en cuestión y no de acuerdo a bandas citogéneticas 
como en HGCm convencional, obteniendo así una lista de genes candidatos dentro de la 
región de interés. 
 
Al igual que la HGCm, la HGC sobre microarreglos compara la abundancia relativa de 
secuencias genómicas específicas en el genoma tumoral, utilizando el genoma normal 
como referencia. En la HGCa los cromosomas en metafase son reemplazados por clonas 
genómicas bien definidas, generalmente representadas en cromosomas artificiales de 
bacterias (BACs), las cuales son arregladas en soportes sólidos y son utilizadas como 
blancos de hibridación. (58). La HGCa también utiliza como fuente de análisis el ADN 
proveniente de células tumorales y células normales, los cuales son marcados 
diferencialmente, mezclados en cantidades equimolares e hibridados sobre las clonas 
impresas en el arreglo. De esta forma las clonas con una señal predominantemente verde 
son las secuencias que están ganadas en el tumor, las clonas con una señal roja son las 
que han sufrido pérdidas y las clonas representadas en amarillo son las que se 
encuentran en el mismo número de copias en ambos genomas (Figura 5). 
 
Figura 5.- Hibridación Genómica Comparativa sobre microarreglos 
 
Gracias a que la información de las clonas esta vinculada directamente con bases de 
datos genómicas, podemos conocer la posición exacta de las clonas a lo largo del 
cromosoma y los genes que se encuentran dentro de estas. De manera que la HGCa nos 
ofrece una mayor posibilidad de identificar los genes o las secuencias blanco específicas 
cuya amplificación puede ser importante en la biología del tumor. 
 
C,omooomo. 
(50 M b) 
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Los otros dos reportes combinan la aplicación de microarreglos de expresión con HGCa 
para analizar los perfiles de expresión y el cambio en número de copias de un gran 
número de genes en CaCU. En 2006, Lying et al identifican genes asociados con 
fenotipos metastásicos de carcinomas cervicales e investigan si el cambio en el número 
de copias de estos genes juega un rol en la regulación de los transcritos, ellos encuentran 
31 genes diferencialmente expresados en tumores con nodos positivos y negativos, de los 
cuales 8 están fuertemente asociados con fenotipos metastásicos, 5 de ellos exhibieron 
una expresión relacionada significativamente con el volumen tumoral, por lo que 
probablemente juegan un rol en el crecimiento tumoral. Ninguno de los genes 
identificados se encuentra en el brazo corto del cromosoma 5. Los cambios en el número 
de copias de los genes diferencialmente expresados parecen estar involucrados en el 
desarrollo de los fenotipos metastásicos solo en algunos casos, pero en la mayoria de los 
tumores otros mecanismos de regulación transcripcional deben estar involucrados (60). 
 
En 2007, Narayan et al, utilizaron arreglos de 9206 ADNcs para analizar 29 carcinomas 
cervicales, ellos reportan 17 amplicones recurrentes y 6 regiones deletadas, esas 
regiones contienen varios genes conocidos involucrados en transcripción, apoptosis, 
remodelación del citoesqueleto, transporte iónico, metabolismo de drogas y respuesta 
inmune. La mayoria de las clonas fueron mapeadas a los cromosomas X, 1, 5, 3, 19 y 20. 
Mediante microarreglos de expresión se analizaron los patrones de expresión de los 
genes dentro de los amplicones reportados por HGCa y se identificaron algunos genes 
sobreexpresados en CaCU, entre los cuales esta el gen SKP2 (proteina asociada a cinasa 
fase S) localizado en el 5p12-13 (61). SKP2 es una F-box proteína y parte del complejo 
SCF que actua como una ubiquitina ligasa E3 en reguladores del ciclo celular como p21, 
p27 y ciclina D1. La sobreexpresión de SKP2 ha sido reportada en linfomas, carcinomas 
colorectales, orales y de próstata. La expresión de SKP2 ha sido relacionada con el grado 
de malignidad y con un peor pronóstico en carcinomas orales y linfomas (revisado en 62). 
 
ANTECEDENTES 
 
Numerosos estudios han demostrado el enorme potencial de la HGC sobre 
microarreglos para identificar genes candidatos involucrados en el desarrollo de 
muchas neoplasias. 
 
En Cáncer Cervico Uterino solo existen tres reportes que emplean HGCa para definircambios específicos en el número de copias. En 2005, Hidalgo et al utilizaron arreglos 
de 861 clonas que representan 287 regiones cromosómicas que son comúnmente 
alteradas en cáncer y reportan amplificación en los genes: RBP1-RBP2 (proteína de 
unión a retinol) mapeado en la región cromosómica 3q21-q22, DAB2 (disabled 
homolog 2, mitogen-responsive phosphoprotein) en el cromosoma 5p13, TP63 (3q27-
129) y EGFR (Receptor del factor de crecimiento epidermal) en el cromosoma 7p12.3-
p12.1. DAB2 localizado en el 5p13 se encontró amplificado en el 58.8% de los 
tumores, este gen ha sido identificado como un gen supresor de tumor en carcinoma 
de próstata y de ovario. DAB2 está involucrado en mediar el requerimiento para el 
anclaje de las células epiteliales a la membrana basal, y la pérdida de expresión de 
este gen ha sido asociada con la transicion de células epiteliales de ovario a lesiones 
premalignas, sin embargo, la amplificación de este gen parece contraria a su papel 
como un gen supresor de tumor (59). 
 
Los otros dos reportes combinan la aplicación de microarreglos de expresión con 
HGCa para analizar los perfiles de expresión y el cambio en número de copias de un 
gran número de genes en CaCU. En 2006, Lying et al identifican genes asociados con 
fenotipos metastásicos de carcinomas cervicales e investigan si el cambio en el 
número de copias de estos genes juega un rol en la regulación de los transcritos, ellos 
encuentran 31 genes diferencialmente expresados en tumores con nodos positivos y 
negativos, de los cuales 8 están fuertemente asociados con fenotipos metastásicos, 5 
de ellos exhibieron una expresión relacionada significativamente con el volumen 
tumoral, por lo que probablemente juegan un rol en el crecimiento tumoral. Ninguno de 
los genes identificados se encuentra en el brazo corto del cromosoma 5. Los cambios 
en el número de copias de los genes diferencialmente expresados parecen estar 
involucrados en el desarrollo de los fenotipos metastásicos solo en algunos casos, 
pero en la mayoria de los tumores otros mecanismos de regulación transcripcional 
deben estar involucrados (60). 
 
En 2007, Narayan et al, utilizaron arreglos de 9206 ADNcs para analizar 29 
carcinomas cervicales, ellos reportan 17 amplicones recurrentes y 6 regiones 
deletadas, esas regiones contienen varios genes conocidos involucrados en 
transcripción, apoptosis, remodelación del citoesqueleto, transporte iónico, 
metabolismo de drogas y respuesta inmune. La mayoria de las clonas fueron 
mapeadas a los cromosomas X, 1, 5, 3, 19 y 20. Mediante microarreglos de expresión 
se analizaron los patrones de expresión de los genes dentro de los amplicones 
reportados por HGCa y se identificaron algunos genes sobreexpresados en CaCU, 
entre los cuales esta el gen SKP2 (proteina asociada a cinasa fase S) localizado en el 
5p12-13 (61). SKP2 es una F-box proteína y parte del complejo SCF que actua como 
una ubiquitina ligasa E3 en reguladores del ciclo celular como p21, p27 y ciclina D1. 
La sobreexpresión de SKP2 ha sido reportada en linfomas, carcinomas colorectales, 
orales y de próstata. La expresión de SKP2 ha sido relacionada con el grado de 
malignidad y con un peor pronóstico en carcinomas orales y linfomas (revisado en 62). 
 
La amplificación de SKP2 se ha descrito en líneas celulares derivadas de CaCU, y se 
ha encontrado una correlación entre la expresión del transcrito y la proteína con la 
amplificación de este gen. La expresión de SKP2 fue también monitoreada en una 
línea celular derivada de una lesión intraepitelial de bajo grado, la cual exhibe cambios 
morfológicos progresivos de acuerdo al número de pases, formación de un 
isocromosoma 5p en el pase 24 y adquicisión de un fenotipo invasor en un pase 
posterior. La expresión de SKP2 fue analizada en los pases 11 y 20 (antes de la 
formación del isocromosoma) y en los pases 24, 43 y 60 (despues de la ganancia del 
5p), encontrándose un incremento en la expresión de 4 veces en el pase 24, 
manteniéndose este nivel de expresión en los pases posteriores. SKP2 no se expresa 
en queratinocitos cervicales normales pero en líneas celulares derivas de CaCU su 
expresión correlaciona con la amplificación del 5p (62). El incremento en la expresión 
de SKP2 correlaciona con la expresión reducida de p27. P27 y SKP2 han sido 
implicados en el desarrollo de metástasis. Se han observado bajos niveles de p27 en 
muchos tumores y son asociados con la sobreexpresión de SKP2. Estos resultados 
sugieren que la sobreexpresión de SKP2 está asociada con la amplificación del 
cromosoma 5p y puede juegar un papel importante en la progresión del tumor. 
 
hTERT (la subunidad catalítica de la telomerasa) localizado en el 5p15.33 ha sido 
también propuesto como un gen candidato, debido al papel que la telomerasa juega 
en una gran cantidad de neoplasias, sin embargo, Mattwehs et al demostraron que no 
existe correlación alguna entre la ganancia del cromposoma 5p y el nivel de actividad 
de la telomerasa (53). 
 
La mayoría de los estudios que han utilizado HGCm han revelado que la amplificación 
en alto número de copias del brazo corto del cromosoma 5p es un evento recurrente 
durante la progresión de etapas avanzadas del CaCu. Esto sugiere la presencia de 
genes, que al alterar su número de copias puedan desempeñar algún papel importante 
para la progresión del CaCU. Gracias a la utilización de la HGC sobre microarreglos 
en CaCU se han podido definir los genes que son los verdaderos blancos de 
amplificación, sin embargo hasta el momento solo el gen SKP2 dentro de la región 
cromosómica 5p ha podido ser identificado. 
 
Análisis detallados de las alteraciones en el número de copias del brazo corto del 
cromosoma 5 han sido realizados en carcinomas de vejiga, pulmón, carcinomas orales 
de células escamosas y sarcomas (63, 64, 66-68). 
 
Coe et al en 2005 elaboraron un arreglo que consiste de 491 clonas que abarca el 
brazo corto del cromosoma 5 desde la región 5p11 hasta 5p15.33 para analizar 15 
líneas celulares derivadas de cáncer de pulmón. Ellos describen además de la 
ganancia conocida de los genes SKP2 y TERT, la amplificación recurrente de dos 
clonas, en las cuales se encuentra el gen TRIO (proteína con triple dominios 
funcionales) y el gen ANKH (ankylosis, progressive homologue) respectivamente y los 
proponen como nuevos posibles oncogenes (63). 
 
Garnis et al, también utilizaron un arreglo con clonas específicas correspondientes al 
cromosoma 5p, y describen regiones mínimas de amplificación en carcinomas in situ 
de pulmón, dentro de las cuales identifican 2 genes candidatos para cáncer de 
pulmón, el gen GNDF (factor neutrófico derivado de una línea celular glial) y el gen 
TRIO. El gen GNDF es un ligando para el producto del oncogen RET y se expresa 
normalmente durante el desarrollo del pulmón pero está ausente en la etapa adulta. La 
reactivación de esta proteína en lesiones tempranas y su amplificación en carcinomas 
in situ sugieren que este desempeña un rol en la tumorigenesis (64). El producto del 
gen TRIO es una proteína con tres dominios funcionales que está involucrada en 
coordinar los rearreglos del citoesqueleto y la matriz celular necesarios para el 
crecimiento y la migración celular (65). 
 
Por otra parte Adamowicz et al, identificaron genes localizados dentro del cromosoma 
5p posiblemente involucrados en la progresión tumoral en 34 sarcomas de tejido 
suave usando arreglos de 418 clonas que representan el 99% del brazo corto del 
cromosoma 5. En este estudio identifican 4 regiones con amplificación recurrente en 
alto número de copias y analizan la expresión de los genes localizados dentro de 
estas regiones, entre los cuales están TERT, TRIO, SKP2, NKD2 y IRX2. De los 
genes analizados TRIO se encontró sobreexpresado en todos los casos, mientras que 
IRX2 y NKD2 solo se sobreexpresaron en 30% de los casos. El análisisde expresión 
de estos genes revela que TRIO, IRX2 y NKD2 son afectados por la amplificación en 
alto número de copias así como sobre regulados en una manera dependiente de la 
dosis génica. Estos genes representan blancos de amplificación en sarcomas de tejido 
suave y pueden jugar un rol importante durante la progresión de la enfermedad (66). 
 
En carcinomas orales escamosos, Baldwin et al (67) reportan una ganancia de una 
región de 0.58 megabases localizada en el 5p15.2, en 45% de los casos, dentro de 
esta región se encuentra el gen TRIO. En este estudio también analizaron la expresión 
de TRIO, la cual fue significativamente mas alta en las células cancerosas en 
comparación con las células normales. 
 
En carcinoma de vejiga, Zheng et al, (68) analizan 7 genes localizados en la región 
5p15.31-5p15.1 mediante hibridación in situ fluorescente (FISH) usando tumores y 
líneas celulares con amplificación del cromosoma 5p conocida previamente por HGC. 
De los 7 genes analizados TRIO se encontró amplificado en un mayor número de 
casos. La amplificación de este gen fue analizado en 2317 tumores y se encontró 
asociado fuertemente con un fenotipo invasor, con la etapa del tumor y con 
proliferación celular rápida. La expresión de RNAm y el número de copias fue 
evaluado en 59 tumores y se encontró una gran correlación entre la sobreexpresión y 
la amplificación de TRIO. La fuerte asociación de la amplificación del gen TRIO con la 
proliferación celular y con etapas avanzadas de la enfermedad sugieren que TRIO 
puede actuar como un oncogen en tumores de vejiga (68). 
 
JUSTIFICACIÓN 
 
El Incremento en el número de copias es un mecanismo importante que conlleva a la 
expresión anormal de oncogenes que pueden ser importantes en el desarrollo y 
mantenimiento del CaCu. La amplificación de oncogenes es un mecanismo genético 
involucrado en el desarrollo de muchos tumores sólidos. Además los genes 
amplificados frecuentemente actúan como marcadores de comportamiento tumoral, 
pronóstico, respuesta a drogas, y pueden representar blancos para futuras terapias 
moleculares contra el cáncer. 
 
La caracterización detallada de las regiones cromosómicas amplificadas ha facilitado 
la identificación y caracterización de los genes involucrados en el desarrollo del 
cáncer. Sin embargo, en la mayoría de las regiones cromosómicas amplificadas en 
CaCU aún no se conocen oncogenes que puedan contribuir con el desarrollo y 
progresión de esta neoplasia, sugiriendo que muchos genes blancos de amplificación 
aún no han sido identificados. 
 
La amplificación del brazo corto del cromosoma 5 es un evento recurrente durante la 
progresión de etapas avanzadas del CaCU, lo cual sugiere la presencia de genes cuya 
ganancia de función puede ser ventajosa para la progresión hacia etapas avanzadas 
del CaCU. 
Varios genes candidatos situados en el cromosoma 5p han sido analizados, sin 
embargo solo la amplificación del gen Skp2 ha sido involucrada en la progresión del 
cáncer cérvico uterino. Skp2 parece jugar un papel importante en la adquisición de un 
fenotipo invasor, ya que puede favorecer el crecimiento de las células tumorales 
independiente de la adhesión celular. 
 
Aunque el papel de Skp2 parece ser importante en la progresión del CaCU, la 
amplificación de todo el brazo corto del cromosoma 5 sugiere la activación de mas 
genes los cuales pueden ser relevantes en la patogénesis y progresión del CaCU. Por 
lo que la identificación de estos genes puede contribuir enormemente a nuestro 
entendimiento de las bases moleculares del desarrollo del CaCU. 
 
OBJETIVO GENERAL: 
 
Identificar un gen blanco de amplificación localizado en la región cromosómica 5p 
como posible marcador asociado a CaCu. 
 
OBJETIVOS PARTICULARES: 
 
-Identificar in sílico el gen candidato asociado a CaCU 
 
-Detección de la amplificación del gen mediante PCR en tiempo real 
 
-Identificación del tipo viral presente en las muestras derivadas de CaCU. 
 
METODOLOGÍA: 
 
IDENTIFICACIÓN DE LAS CLONAS AMPLIFICADAS 
 
Salcedo et al (datos no publicados), utilizaron arreglos que consisten de 3200 BACs 
por triplicado, que representan la mayor parte del genoma, para identificar las 
alteraciones cromosomicas presentes en 5 líneas celulares derivadas de CaCU. A 
partir de esos datos generados por HGC sobre microarreglos, se detectaron los 
cambios en el número de copias de las clonas correspondientes al brazo corto del 
cromosoma 5 mediante la relación de fluorescencia entre el ADN tumoral y el normal y 
se determinaron como ganancias aquellas regiones donde la relación fluorescencia 
T/N sea mayor a 1.25 y como amplificaciones a las regiones con una relación mayor a 
2. 
 
Para determinar la localización citogenética de las clonas y los genes que representan, 
se utilizó la base de datos Genome browser (http://genome.ucsc.edu/) de la 
Universidad de California Santa Cruz (UCSC), que nos permitió mapear las clonas de 
acuerdo a su localización exacta en el genoma, así como también nos brindó 
información acerca de los genes conocidos dentro de esa región. Sin embargo, 
algunas de estas clonas no pudieron ser localizadas por este método, por lo que se 
utilizó un programa llamado Match Minner que está disponible públicamente 
(http://discover.nci.nih.gov/matchminer) y que utiliza información de cuatro bases de 
datos publicas como UCSC, Omim, Unigene, Locus Link y affimetrix, lo cual nos 
permite obtener información automatizada como localización citogenética, información 
de los genes, su función, genbank, unigene, etc. 
 
Para algunas de las clonas no pudo obtenerse información con respecto a los genes 
que representan, por lo que se utilizó el programa Map Viewer 
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/) del Centro Nacional de Información 
Biotecnológica (NCBI), el cual nos permite navegar sobre la secuencia del genoma 
para obtener información acerca de los genes, los transcritos y las clonas que se 
encuentran en esa región. 
 
Una vez obtenida esta información, se utilizaron las herramientas disponibles en la 
página SOURCE de la Universidad de Stanford (http://genome-www5.stanford.edu/cgi-
bin/source/sourceSearch) para determinar las función de dichos genes y las rutas en 
las que pueden intervenir. SOURCE es una herramienta que de forma dinámica 
colecta datos derivados de diversas bases de datos científicas y que compila 
información genética y de biología molecular disponibles acerca de los genes de 
diversas especies, incluido el ser humano. En base a todo ello se identificó el gen 
candidato de la región 5p. 
 
OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS 
 
Se utilizaron 53 carcinomas invasores y 20 lesiones intraepiteliales de alto y bajo 
grado obtenidas del Departamento de Patología del Hospital General de México y del 
Departamento de Ginecología Oncológica del Hospital de Oncología del Centro 
Médico Siglo XXI. Todos los tumores analizados corresponden al tipo histológico 
epidermoide. Las muestras obtenidas corresponden a tejidos incluidos en parafina, de 
los cuales se realizaron cortes de 5m y se tiñeron con hematoxilina eosina, con la 
finalidad de identificar las áreas en donde se encuentra el tejido tumoral o las lesiones. 
 
EXTRACCIÓN DE ADN 
 
Una vez identificadas las áreas de interés, se obtuvieron cilindros de tumor de 2mm de 
diámetro mediante una aguja de extracción de médula ósea y se depositaron en un 
tubo eppendorf de 1.5ml. Los tejidos fueron desparafinados en 150µl de Xilol a 56°C 
dos veces por 20 minutos, se centrifugaron, decantaron, y finalmente se les adicionó 
alcohol al 100%, se centrifugaron, se elimino el alcohol y se dejaron secar. El ADN se 
purificó mediante el kit de extracción Wizard (Promega) siguiendo las 
recomendaciones del fabricante. Brevemente las muestras fueron digeridas con 200µl 
de solución de lisis nuclear y 5µl de proteínasa K (20mg/ml) durante 48 horas a 56°C.Posteriormente se les agregó 3µl de RNAsa (10µg/ml), y se incubó durante 30 minutos 
a 37°C. La proteínas fueron removidas con 200µl de solución precipitadora de 
proteínas (acetato de amonio), se centrifugó por 3 minutos a 14,000 rpm y el 
sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo con 600µl de isopropanol para precipitar 
el ADN, finalmente la pastilla se lavó dos veces con etanol al 70% y se resuspendió en 
50µl de agua destilada. La calidad del ADN fue analizada en un gel de agarosa al 1% 
y la concentración del ADN se determinó mediante un espectrofotómetro (nanodrop 
ND 100). 
 
DETECCIÓN DEL VPH 
 
La detección de VPH se llevó a cabo mediante PCR utilizando oligonucleótidos 
específicos que reconocen una secuencia del gen E6 del VPH16 y amplifican una 
región de 126 pares de bases. La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 50µl 
que contenía MgCl2 2Mm, buffer de PCR 10x, 10mM de cada dNTP, 50 picomoles de 
oligonucleótido, y 1 unidad de Taq Polimerasa (Promega) la reacción se llevó acabo 
en 40 ciclos, cada ciclo incluyó 1 minuto de desnaturalización a 94º, la alineación a 40º 
durante 2 minutos, y finalmente la extensión a 72º durante 1.5 minutos. Se utilizaron 
150 ng de ADN genómico como templado en cada reacción; como control positivo se 
utilizó ADN de la línea celular SIHA (VPH16) y para el control negativo solo se omitió 
el templado. Las muestras negativas para VPH16 fueron sometidas a otra PCR con 
los oligonucleótidos GP5/GP6 que reconocen la región L1 de una gran cantidad de 
tipos virales (11, 16, 18, 30, 31, 33, 35, 39, 40, 43, 45, 51, 52, 54, 55, 56, 58, 59, 66 
etc.). Los oligonucleótidos amplifican un producto de 150 pares de bases. La reacción 
se llevó a cabo en un volumen final de 50µl, la cual contenía MgCl2 3.5mM, buffer de 
PCR 10X, 10mM de cada dNTP, 50 picomoles de oligonucleótidos, y 1 unidad de Taq 
Polimerasa (Promega). La reacción consistió de 40 ciclos, cada uno incluyó 
desnaturalización por 1 minuto a 94ºC, alineación a 40ºC durante 2 minutos, y 
finalmente la extensión a 72ºC durante 1.5 minutos. Se utilizaron 150 ng de ADN 
genómico como templado en cada reacción; como control positivo se utilizó ADN de la 
línea celular SIHA y para el control negativo solo se omitió el templado. 
 
Para la visualización, los productos se corrieron en un gel de agarosa al 1.5% teñidos 
con bromuro de etidio y se visualizaron en un transiluminador de luz U.V EaglyEye 2 
(Stratagen). 
 
SECUENCIACIÓN 
 
Los productos de PCR fueron purificados con el kit Wizard SV Gel and PCR Clean Up 
System (Promega), el cual remueve nucleótidos no incorporados, oligonucleótidos, y 
otros residuos, dejando solamente el producto de PCR. Los productos fueron 
cuantificados mediante un gel de agarosa al 2% con el sistema Low Mass 
(Fermentas). Posteriormente los productos fueron marcados mediante una reacción de 
PCR con el kit BigDye Terminator v3 Cycle Sequencing Ready Reacción. La mezcla 
de reacción se llevó a cabo en un volumen final de 20ml, la cual contenía 0.5 ml del 
Terminador Ready Mix, 3.2 picomoles del oligonucleótido GP5+ y 3 ng del producto. 
La reacción de marcaje consistió de un ciclo de desnaturalización a 96ºC por un 
minuto, seguido de 25 ciclos de desnaturalización a 96ºC por 30 segundos, 
alineamiento a 55ºC por 10 segundos, y elongación a 60ºC por 4 minutos y finalmente 
un ciclo de extensión a 72ºC por un minuto. Posteriormente las muestras fueron 
purificadas con el kit DyeEx (Quiagen), liofilizadas y desnaturalizadas con formamida. 
La secuenciación se realizó en el secuenciador automático Applied Biosystems 373. 
Para determinar el tipo viral de las muestras, las secuencias obtenidas fueron 
comparadas con las secuencias reportadas en el GeneBank mediante el programa 
BLAST. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) 
 
AMPLIFICACIÓN DEL GEN TRIO 
 
Para determinar la amplificación del gen TRIO se realizó una cuantificación relativa 
mediante PCR en tiempo Real utilizando el sistema de oligonucleótidos D-Lux 
(invitrogen). Este sistema consta de un par de oligonucleótidos, uno de los cuales esta 
marcado con un fluoróforo en el extremo 3’. El oligonucleótido marcado tiene una 
secuencia de 4 a 6 nucleótidos en su extremo 5’ que es complementaria a la 
secuencia del extremo 3’ formando una estructura de tallo y burbuja, cuya 
configuración evita la emisión de fluorescencia, de manera que cuando el 
oligonucleótido se incorpora al ADN este efecto es interrumpido resultando en un 
incremento significativo en la señal de fluorescencia. 
 
 
El diseño de los oligonucleótidos se realizó con el programa D-Lux designer 
(https://orf.invitrogen.com/lux/); a partir de la secuencia obtenida del ensembl genome 
browser www.ensemble.org, sin embargo el programa no soporto las 380,000 pares 
de bases del gen, por lo que se tuvo que partir de una secuencia mas pequeña. El 
programa de diseño, utiliza el algoritmo de BLAST para identificar secuencias únicas y 
secuencias compartidas por otros genes, y en base a esto se eligió una parte del gen 
con regiones únicas, porque los oligonucleótidos diseñados a partir de regiones con un 
gran número de secuencias compartidas resultaron en oligonucleótidos inespecíficos y 
que pueden alinearse con una gran cantidad de genes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Una vez obtenida una serie de posibles oligonucleótidos, estos fueron cargados en el 
programa BLAST para asegurar que fueran específicos para el gen de interés. Los 
oligonucleótidos se eligieron de acuerdo a su especificidad, contenido de GCs, Tm y al 
tamaño del amplicon generado. 
Así mismo, se obtuvieron oligonucleótidos para el gen microglobulina b2 para utilizarlo 
como gen de referencia y realizar la cuantificación relativa. Ambos oligonucleótidos 
(TRIO y β2m) fueron marcados con el fluoroforo FAM (6-carboxifluoresceina) 
 
La PCR en tiempo real se llevó a cabo en el equipo LightCycler 2.0 de Roche, como 
control positivo se utilizó una línea celular derivada de CaCU (INBL) la cual tiene 
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amplificado el brazo corto del cromosoma 5, y como control negativo se utilizó agua. 
La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 10ml, que contenía 5ml de QPCR 
super mix (1.2 Unidades de Taq Polimerasa, Tris-HCL 20mM pH 8.4, KCL 50mM, 
MgCl2 4mM, 200mM de cada dNTP y 1 Unidad de Uracil ADN Glicosilasa) , 2mM de 
cada primer y 1 ml BSA (2.5mg). La amplificación de ambos productos (TRIO y β2m) 
se llevó a cabo mediante el siguiente programa: activación de la enzima UDG 2 min a 
50oC, un ciclo de desnaturalización a 95oC por 10 segs, seguido por 45 ciclos de 
denaturalización 95oC por 10 segs, alineamiento 62oC por 5 segs y extensión 72oC por 
10 seg. La adquisición de la fluorescencia se llevo a cabo durante el ciclo de 
alineamiento. Por último para evaluar la especificidad de la amplificación, se llevó a 
cabo un ciclo adicional de 95oC, 70oC por 10 segs y finalmente 95oC realizándose la 
adquisición continua de la fluorescencia en esta ultima temperatura. Todas las 
muestras fueron analizadas por duplicado y solo se tomaron en cuenta los duplicados 
conun coeficiente de variación menor a 0.5 
 
Para evaluar la eficiencia de la reacción se construyó una curva de eficiencia con 
diluciones de un ADN control a 1 ng, 5 ng, 10 ng y 50 ng. La curva se realizó con 
todas las diluciones por duplicado hasta obtener una eficiencia cercana a 2. 
 
El equipo Roche Light cycler mide los cambios de fluorescencia ciclo a ciclo en cada 
muestra y genera un perfil cinético de la amplificación del ADN en los 45 ciclos de 
reacción. El número de ciclos en el cual la amplificación entra a la fase exponencial 
(llamado punto de cruzamiento o CP) fue determinado con ayuda del software del 
Light cycler version 4.0 y este número fue utilizado como un indicador de la cantidad 
de ADN blanco en cada tejido; de esta manera, un valor de CP bajo, indica una alta 
cantidad de ADN inicial. Para la cuantificación relativa se utilizó un gen de referencia 
con una sola copia (microglobulina β2), de manera que una copia del gen debe ser 
encontrado en todas las muestras. Para normalizar los resultados finales se utilizó 
como calibrador ADN de tejido cervical sin alteraciones, en el cual ambos genes TRIO 
y β2m deben tener igual número de copias ya que las células normales no presentan 
alteración alguna en dosis génica. Los resultados fueron expresados como la relación 
TRIO/β2m de cada muestra dividido por la relación TRIO/β2m del calibrador. Los datos 
generados de la amplificación de TRIO y β2m en las muestras y el calibrador, fueron 
cargados en el software de cuantificación relativa del Light Cycler, el cual calcula la 
razón TRIO/β2m automáticamente. Las muestras con una razón TRIO/β2m mayor a 
2.00 fueron consideradas positivas para amplificación de TRIO y las muestras con una 
razón TRIO/β2m menor a 2.00 fueron consideradas negativas para la amplificación de 
TRIO. 
 
La especificidad de la amplificación se evaluó mediante una curva de disociación; de 
esta manera es posible identificar la temperatura en la que se disocian las cadenas de 
ADN correspondientes al producto amplificado, esta temperatura es específica de 
cada fragmento de ADN según su tamaño, esto nos permite identificar la presencia de 
dímeros o amplificaciones inespecíficas ya que al graficarse se observan varios picos 
de disociación o un solo pico si se trata de un producto único. El software del sistema 
LightCycler lleva a cabo automáticamente este proceso construyendo una gráfica de la 
detección de fluorescencia en función de la temperatura. 
Tabla 1. oligonucleótidos utilizados 
 
 
Oligonucleótido 
Secuencia Gen Fragmento 
Sentido 5’-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3’ 
Antisentido 5’-GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3’ E6 126 pb 
Sentido 5’-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3’ 
Antisentido 5’-GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3’ GPs 150 pb 
Sentido 5´- CATCAGGGACAGGGAACTCTCA -3´ 
Antisentido 5’- cgactcAAAGCCTGAACGGAGAGTcG -3’ 
TRIO 107 pb 
Sentido 5´ ACATACCTTGGTTGATCCACTT-3´ 
Antisentido 5- catctgTTGCTCTATACGTGGCAGATG-3´ 
B2M 
 
68 pb 
ANÁLISIS ESTADÍSTICO 
 
Para determinar si existía alguna relación entre presencia de VPH y amplificación de 
TRIO se realizaron pruebas de Chi cuadrada con el paquete estadístico SPSS 12.0 
para MacOS. Las pruebas fueron consideradas como significantes cuando los valores 
de P fueron menores a 0.05. 
 
 
 
RESULTADOS 
 
Salcedo et al (datos no publicados), utilizaron arreglos que comprenden todo el 
genoma para analizar las alteraciones en el número de copias de 5 líneas celulares 
derivadas de CaCu (HELA, CASKY, INBL, SIHA, VIPA). Las clonas impresas en el 
arreglo que corresponden al brazo corto del cromosoma 5p son 27 y abarcan desde la 
región 5p12 hasta la 5p15.33. 
 
Para determinar la localización citogenética de las clonas y los genes que representan, 
se utilizaron los programas Match minner y Genome Browser. La tabla 2 muestra la 
localización citogenética de cada clona así como los genes que se encuentran dentro 
de cada región. 
 
En la figura 6 se muestra la estrategia seguida para identificar los genes que se 
encuentran dentro de las clonas que no pudieron ser relacionadas con ningún gen 
conocido mediante los programas Match Minner y Genome Browser. A través del 
programa Map Viewer se identificaron los genes que se encuentra dentro de la región 
correspondiente a cada clona. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. 
Estrategia utilizada 
para la 
identificación de 
los genes 
correspondientes a 
cada clona. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Table 2. Identificación de las clonas y genes que representan 
Genes 
Banda 
Citogenética Clonas 
 RP1-24H17 
CRR9, SLC6A3, AYTL2 5p15.33 RP11-94J21 
IRX2, CE1 5p15.33 RP11-20B3 
 5p15.33 RP11-103L11 
IRX1 5p15.33 RP11-82M24 
 RP11-227M19 
LOC340094 5p15.32 RP11-58A5 
 5p15.32 RP11-35K22 
MED10 5p15.31 RP11-36H5 
ADCY2 5p15.31 RP11-46O23 
CMBL, MARCH6, CCT5 5p15.2 RP11-145B1 
DAP 5p15.2 RP11-72C10 
CTNND2 5p15.2 RP11-29N3 
TRIO 5p15.2 CTD-2040C2 
LOC402198 5p15.2-5p15.1 RP11-5N8 
FBXL7 5p15.1 RP11-135M13 
FBXL7 5p15.1 RP11-261B20 
MYO10 5p15.1 RP11-260E18 
 
 
5p15.1 RP11-269º14 
LOC285697 5p15.1 RP11-88L18 
PDZD2 5p13.3 RP11-5N11 
PDZD2, GOLPH3 5p13.3 RP11-67P13 
ADAMTS2 5p13.3 RP11-94E6 
KIAA1770 5p13.2 RP11-85N3 
FLJ23577 5p13.2 RP11-253B9 
 5p12 RP11-9G14 
 
Mediante la relación de la fluorescencia entre el ADN tumoral y ADN normal se 
determinaron las clonas que sufren cambios en su número de copias y se determinó 
que las clonas CTD-2040C2(TRIO), RP1129N3 (CTNND2) y RP1158A5 (LOC340094) 
estuvieron amplificadas en las 5 líneas celulares analizadas. 
 
Una vez conocidos los genes que sufren ganancias en su número de copias, se 
realizó una búsqueda de las funciones principales de cada gen y de los procesos 
biológicos en los cuales participan. 
 
La mayoría de los genes analizados participan en procesos metabólicos celulares, 
procesos metabólicos de macromoléculas, comunicación celular y adhesión celular 
principalmente. También se encontraron genes que participan en la organización de la 
matriz extracelular y apoptosis. (Tabla 3) 
 
De los genes analizados solo 3 han sido asociados con el desarrollo de cáncer; el gen 
PDZD2 cuyas funciones aún no son bien conocidas, puede participar en etapas 
tempranas de la tumorigénesis en próstata (69); sin embargo, en un estudio más 
reciente se demostró que PDZD2 ejerce efectos antiproliferativos en células 
cancerosas de próstata y puede disparar apoptosis independiente de p53 (70). Por tal 
motivo, PDZD2 puede funcionar como un supresor de crecimiento para las células 
cancerosas de próstata en lugar de actuar como un oncogen que favorezca el 
desarrollo tumoral. El gen ADAMTS12 codifica una proteína involucrada en la 
regulación de la adhesión celular, y puede jugar un rol en células pulmonarias durante 
el desarrollo fetal o en procesos tumorales a través de su actividad proteolítica. Por 
último el gen TRIO que ha sido involucrado con los procesos de remodelación del 
citoesqueleto y la matriz extracelular necesarios para el crecimiento y migración 
celular y ha sido considerado un oncogen en carcinomas de vejiga. 
 
Tabla 3.- Principales funciones de los genes presentes en el arreglo. 
Gen Simbol Nombre Función Proceso 
Biológicos 
Asociado con 
enfermedad 
CRR9 Proteína 
relacionada a 
resistencia a 
cisplantino 
Asociado con la apoptosis 
mediada por cisplantin 
Ciclo celular y 
apoptosis 
 
SLC6A3 Familia de 
transportador de 
solutos 6 
(transportador de 
neurotransmisor, 
dopamina) 
miembro 3 
Transportador. Termina la 
acción de dopamina por su 
alta afinidad a la reabsorción 
dependiente de sodio dentro 
de las terminales 
presinápticas. Es un blanco 
de estimulantes 
psicomotores como 
anfetamina y cocaína. 
Transporte de 
neurotransmisor 
Déficit de 
atención, 
trastorno 
bipolar y otros 
desordenes 
psiquiátricos. 
AYTL2 Como 
acetiltransfersa2 
Respiración. Sintetiza 
fosfatidilcolina en pulmón. 
Desarrollo de 
músculo 
 
IRX2 Proteína iroquois 
homeobox 2 
Juega múltiples roles durante 
la formación de embriones 
vertebrados. 
Regulación de la 
Transcripción 
 
IRX1 Proteína iroquois 
homeobox 1 
Desarrollo embrionario, 
incluyendo regiones 
específicas del sistema 
nervioso central 
Regulación de la 
Transcripción 
 
CEI Expresión 
coordinada al gen 
homeobox IRXA2 
- - 
ADCY2 Adenilate ciclasa 2 Involucrada en la Biosíntesis 
de AMPc, 
Cascada de 
señalización 
intracelular. 
Biosíntesis de 
nucleótidos 
cíclicos 
 
CMBL Homólogo de 
Carboxymetileno 
butenolidasa 
- - 
MARCH6 Dedos de aro 
asociados a 
membrana 
(C3HC4) 6 
 
Actividad de proteína 
ubiquitina ligasa 
Proteolisis 
dependiente de 
ubiquitina 
 
CCT5 chaperonina que 
contiene TCP1, 
subunidad 5 
Juega un rol en el 
plegamiento de actina y 
tubulina 
Plegamiento de 
proteínas 
 
DAP Proteína asociada 
a muerte 
Mediador positivo de 
apoptosis. 
Ciclo celular y 
apoptosis 
 
CTNND2 Catenina (Proteína 
asociada a 
caderina), delta 2 
(proteína con 
brazos repetidos 
relacionada con 
plakofolina neural) 
Involucrado en la 
organización molecular de 
uniones sinápticas 
Regula moléculas de 
adhesión. 
Adhesión Celular 
Transducción de 
señales 
Desarrollo 
Adhesión de 
neuronas 
 
 
TRIO Tres dominios 
funcionales 
Migración celular 
Promueve el intercambio de 
GDP por GTP 
Coordina los rearreglos de la 
matriz extracelular y el cito 
esqueleto necesarios para la 
migración celular y 
crecimiento 
Comunicación 
celular 
Fosforilación 
 
Amplificación 
en sarcomas y 
carcinoma de 
vejiga. Rol en 
tumorigenesis. 
FBXL7 Proteína con caja F 
y repeticiones ricos 
en leucina 7 
Involucrada en 
reconocimiento del sustrato 
para la degradación 
dependiente de ubiquitina 
Elemento de respuesta 
requerido para la 
interpretación o generación 
de señales que conducen a 
la represión de glucosa 
 
Proteólisis 
dependiente de 
ubiquitina 
 
MYO10 Miosina X Unión a actina 
Actividad motora 
Transducción de 
señales 
 
PDZD2 Proteína que 
contiene dominios 
PDZ 2 
Unión al C Terminal de 
receptores 
transmembranales o canales 
iónicos 
Señalización 
intracelular 
 
Sobreexpresa-
do en próstata. 
Puede 
participar en 
etapas 
tempranas de 
la 
tumorigénesis. 
GOLPH3 Golgi fosfoproteína 
3 
Juega un rol regulador en el 
trafico de golgi 
Transporte 
Trafico celular 
 
 
ADAMTS12 Metaloproteasa y 
desintegrina con 
motivos 
trombospondina 
tipo 1 
Enzima procesadora de 
procolageno I y aminopéptido 
II. 
Regulación de adhesión 
celular 
Degradación de 
proteínas 
Modificación 
post-traduccional 
de proteínas 
Ampliamente 
expresado en 
carcinomas 
gástricos. 
Puede jugar 
un rol en 
procesos 
tumorales por 
su actividad 
proteolítica 
 
 
El gen TRIO consiste de 58 exones los cuales están distribuidos en una región de 
380kb en el cromosoma 5p15.2 (71). El gen codifica para una proteína que comprende 
dominios parecidos a espectrina, dos dominios de factor de intercambio de guaninas 
(GEF) y un dominio cinasa serina/treonina. Los factores de intercambio de guaninas 
(GEF) activan a las GTPasas acelerando el intercambio de GDP por GTP. Uno de los 
dominios (GEFD1) activa a RhoG y a Rac, mientras que el otro (GEFD2) activa a 
RhoA. (72). Las GTPasas de la familia Rho tienen diferentes efectos en la estructura y 
función celular; dependiendo del tipo celular estas GTPasas pueden inducir 
protrusiones particulares de la superficie generadas por reacciones de remodelación 
de actina que cambian la forma de la célula e influencian la adhesión y locomoción 
celular (73, 74). GTPasas de la familia Rho también afectan el ciclo celular y la 
transcripción génica, y participan como intermediarios en la transformación maligna 
causada por mutantes Ras (75). 
 
Todos los factores de intercambio de guaninas que activan a GTPasas de la familia 
Rho incluyendo a TRIO, comparten el dominio DH, el cual es una región catalítica de 
la proteína que es responsable de la actividad de intercambio de guaninas, y el 
dominio PH que es responsable de la localización subcelular de la proteína. Mediante 
su dominio PH TRIO puede interactuar con el extremo C- terminal de filamina A y 
mediante esta interacción puede participar en la remodelación del citoesqueleto (76). 
 
TRIO se expresa normalmente en una gran variedad de tejidos; principalmente en 
corazón, músculo esquelético, cerebro, páncreas, placenta, riñón, hígado y pulmón. La 
amplificación de TRIO ha sido asociada con crecimiento tumoral y proliferación celular 
en carcinoma de vejiga (68). TRIO también se ha encontrado amplificado en 
carcinomas de pulmón y sarcomas (63,64,66). 
 
En base a que TRIO parece jugar un papel importante en el desarrollo tumoral y a que 
este gen es blanco de amplificación en líneas celulares derivadas de Cáncer Cervico-
uterino, se decidió realizar un análisis para conocer el estatus del gen en carcinomas 
escamosos del cérvix y en lesiones premalignas. 
 
 
Para este propósito se obtuvieron y procesaron 53 carcinomas cervicales y 20 
lesiones premalignas incluidas en parafina, de las cuales se extrajo el ADN y se corrió 
en un gel de agarosa al 1%. El ADN obtenido de las muestras se encuentra 
degradado, como se observa en la figura 7. 
 
El ADN obtenido de tejidos embebidos en parafina no es muy útil para ciertas 
metodologías en donde se requiere ADN de alto peso molecular, sin embargo, este 
ADN aunque se encuentra degradado por el efecto de los fijadores, es muy útil cuando 
se realizan análisis de PCR en tiempo real y se pueden obtener excelentes resultados 
(77), además de que los tejidos embebidos en parafina representan una manera fácil y 
óptima de obtener ADN proveniente de células tumorales en su mayoría. 
 
 
 
Figura 7.- ADN extraído a partir de tejidos embebidos en parafina 
 
Una vez obtenido el ADN de todas las muestras, se realizó una PCR con 
oligonucleótidos específicos para VPH16 y se encontró un 40% de muestras positivas 
para este tipo viral (figura 8). 
 
 
 
Figura 8. Amplificación del Virus de Papiloma Humano tipo 16 
 
Las muestras negativas para VPH16 fueron sometidas a otra PCR con 
oligonucleótidos que reconocen la región L1 de un gran número de tipos virales (figura 
9). 85% de los tumores, 57% de las LIEBG y 83% de las LIEAG fueron positivos para 
VPH (Figura 10). 
126pb 
 C+ C- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 
 
 
 
 
Figura 9. Amplificación del Virus de Papiloma Humano con oligonucleótidos Gps 
 
Figura 10. Prevalencia de VPH en tumores y lesiones premalignas. 
Las muestras positivas fueron purificadas y secuenciadas, en la figura 10 se muestra 
un ejemplo del resultado de la secuenciación del fragmento de PCR del gen L1 de 
VPH. Posteriormente, para determinar el tipo viral, las secuencias fueron comparadas 
con las ya reportadas en el genebank mediante el programa BLAST. 
 
Figura 10. Electroferograma de la secuencia de un fragmento del gen L1 de VPH16 
 
 C- C+ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 
150pb 
Los tipos virales mas frecuentes encontrados en los tumores fueron el VPH16 (70%), 
VPH31 (9%) y VPH11 (7%), también se encontraron VPH18, VPH45, VPH39 y VPH58 
en menor frecuencia. 
 
Grafica 2. Tipos de VPH detectados en carcinomas invasores. 
 
 
En lesiones premalignas los tipos virales encontrados fueron VPH16(50%), 
VPH58(20%), VPH18(10%) VPH33(10%), VPH11 (10%). 
 
Grafica 3. Tipos de VPH encontrados en lesiones premalignas. 
 
9% 
10% 
.~ 
", I 
, ' , 
. VPH16 
. VPH31 
VPHll 
. VPH18 
. VPH45 
. VPH39 
. VPH58 
. VPH16 
. VPH58 
50% VPH18 
. VPH33 
. VPHll 
Para detectar la amplificación del gen TRIO se utilizaron oligonucleótidos D-Lux 
específicosque amplifican un fragmento de 107 pares de bases. Los oligonucleótidos 
se alinean en uno de los intrones del gen, el fragmento amplificado corresponde a una 
región que va desde el nucleótido 339,570 al 339, 677. Para realizar la cuantificación 
relativa se utilizaron oligonucleótidos que amplifican un fragmento de 68 pares de 
bases del gen microglobulina β2. 
 
En la figura 11 se observa una curva de eficiencia realizada con diluciones seriales de 
un ADN con concentración conocida. Se realizaron dos curvas de eficiencia, una para 
el gen TRIO y otra para el gen β2m, en ambos casos la eficiencia fue cercana a 2, este 
valor indica que en cada ciclo se duplica la cantidad de producto durante la reacción, 
por lo que las reacciones tuvieron una buena eficiencia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 11. Curva de eficiencia con diluciones seriales de ADN 
 
Se realizó un análisis de curvas de disociación para ambos productos (TRIO y b2m), 
en este análisis se identificó la temperatura a la cual el producto de doble cadena se 
disocia en ADN de cadena sencilla. En las figuras 12 y 13 se muestran curvas de 
disociación para el gen TRIO, en la primera reacción se observan dos picos, uno que 
corresponde probablemente a dímeros de oligonucleótidos y el otro correspondiente al 
producto amplificado (T=87). En la segunda curva se observa solo un pico específico 
50ng 
5ng 
1ng 
del producto amplificado del gen TRIO. En ambas reacciones se utilizaron las mismas 
condiciones, a diferencia que en la segunda reacción se utilizó una concentración 
menor de cada oligonucleótido. 
 
 
 
 
 
 
Debido a que la 
La Debido a que 
la presencia de 
dímeros de oligonucleótidos disminuye la eficiencia de la reacción y obscurece el 
análisis y determinación del punto de cruzamiento (CP), todas las reacciones de PCR 
en tiempo real se realizaron con 2mM de cada oligonucleótido a la cual no se forman 
dímeros de oligonucleótidos. 
 
El gen TRIO se encontró amplificado en 66% (35/53) de los tumores analizados; sin 
embargo, este porcentaje se eleva al tomar en cuenta solo las muestras infectadas 
con algún tipo de VPH (73% 33/45); con respecto a las muestras negativas para VPH, 
TRIO solo se encontró amplificado en el 25% de los tumores (2/8). El análisis 
estadístico mostró que existe una relación dependiente entre presencia de VPH y 
amplificación del gen en los tumores analizados. En cuanto a las lesiones 
intraepiteliales de bajo y alto grado, ninguna presentó amplificación del gen (Grafica 
4). 
Figura 13.- Curva de 
disociación utilizando 
una concentración de 
2mM de cada 
oligonucleótido. 
 
Grafica 4.- Amplificación del gen TRIO en tumores y lesiones premalignas 
 
También se realizaron pruebas estadísticas para determinar si existía una relación 
entre el tipo viral y amplificación del gen, sin embargo no se encontraron diferencias 
significativas (P > 0.05). 
 
En la figura 14 y 15 se muestran las amplificaciones del gen TRIO y β2m en 7 tumores 
y un tejido normal. En ambas reacciones se utilizaron 25ng de ADN geonómico. En la 
figura 14 se puede observar que todos los tumores tienen CPs menores al CP del 
genoma normal, lo cual indica que hay un mayor número de copias del gen en el 
genoma tumoral y por lo tanto son requeridos menos ciclos para alcanzar la fase 
exponencial. En la figura 15 se observa que los tumores analizados tienen CPs 
similares. 
35 
30 
25 
20 
15 
10 
5 
O ~----~------~----~------~------r 
Tumores Tumores Tumores LIEBG LIEAG 
VPH+ VPH-
. Trio amplificado 
• Trio normal 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
La figura 16 muestra la amplificación del gen TRIO en tumores y lesiones premalignas. 
En esta gráfica se observa que las lesiones tienen CPs muy similares al del genoma 
normal, además de que los CPs de las lesiones premalignas son mayores que los CPs 
de los tumores analizados lo cual indica que hay menor número de copias del gen en 
las lesiones y por lo tanto se requieren mas ciclos para alcanzar el umbral de 
detección. 
Figura 14. Amplificación 
de TRIO en carcinomas 
cervicales. 
Figura 15. Amplificación 
de β2m en carcinomas 
cervicales. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 16. Amplificación de TRIO en tumores y lesiones premalignas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DISCUSIÓN 
 
La amplificación del brazo corto del cromosoma 5 ha sido reportada en varios tipos de 
tumores y es un evento recurrente durante la progresión del cáncer cervico uterino. 
Alteraciones dentro de la región cromosómica 5p fueron primero descritas mediante el 
uso de técnicas de citogenética clásica, observaron pequeños cromosomas 
metacéntricos en metafases de carcinomas cervicales, los cuales corresponden a 
isocromosomas del 5p (34-37). Posteriormente, estudios empleando HGC describieron 
alteraciones en esta región y la mayoría coinciden en que la ganancia del cromosoma 
5p es observada solo en etapas avanzadas de la enfermedad (44, 47, 52, 53). 
 
A pesar de la innegable utilidad de estas técnicas, su limitada resolución solo ha 
permitido describir alteraciones a nivel de bandas cromosómicas y aún no se han 
identificado los genes blancos de amplificación. 
 
Mediante HGC sobre microarreglos se han podido definir alteraciones específicas 
identificándose los genes que se amplifican frecuentemente en una gran variedad de 
tumores; en cérvix solo existen tres reportes que han empleado esta plataforma para 
describir alteraciones específicas de esta neoplasia, y hasta el momento solo se ha 
logrado identificar al gen SKP2(5p13); SKP2 es una proteína que actúa como ubiquitin 
ligasa en proteínas reguladoras del ciclo celular como p21, p27 y ciclina D1 (78x). 
Numerosos estudios describen la amplificación del gen SKP2 en un gran número de 
tumores y han encontrado una relación entre la sobrexpresión de este gen con el 
grado de malignidad y con un pobre pronóstico (79-81), esto sugiere que la 
amplificación de SKP2 puede jugar un papel importante en la progresión tumoral. Pese 
a que ya se ha demostrado que hay alteraciones en el número de copias del gen 
SKP2 en tumores derivados del cérvix, la amplificación de todo el brazo corto del 
cromosoma 5 sugiere la presencia de mas de un gen cuya amplificación puede ser 
importante en el desarrollo o progresión del CaCU. 
 
En este trabajo se analizaron los resultados obtenidos mediante HGC sobre 
microarreglos aplicada a 5 líneas celulares derivadas de CaCU con la finalidad de 
identificar un gen blanco de amplificación dentro de la región cromosómica 5p cuya 
función pueda jugar un rol importante para la progresión del CaCu. A partir de estos 
datos, se identificaron 3 clonas (CTD-2040C2-TRIO, RP1129N3-CTNND2 y 
RP1158A5-LOC340094) que están amplificadas en las 5 líneas celulares; con 
respecto al gen SKP2 no obtuvimos ninguna información ya que este no se encuentra 
dentro de las regiones del arreglo; el componente de la telomerasa (hTERT) que 
también ha sido involucrado en la tumorigénesis, tampoco se encuentra en el arreglo, 
sin embargo Dowen et al consideran que la actividad de hTERT no esta relacionada 
con la amplificación del cromosoma 5p (62). 
 
De los genes analizados dentro del arreglo, la mayoria participa en procesos 
importantes para la progresión tumoral, como la adhesión celular, comunicación 
celular, organización de la matriz extracelular etc (82), sin embargo de todos los genes 
presentes en el arreglo, solo 3 han sido relacionados directamente con algún tipo de 
cáncer; el gen PDZD2 que participa en etapas tempranas de la tumorogenesis en 
próstata, el gen ADAMTS12 involucrado en cáncer de pulgmón y el gen TRIO 
involucrado en cáncer de vejiga, pulmón, sarcomas, carcinomas orales (63, 64, 66-68). 
 
El gen TRIO no ha sido aún implicado en el desarrollo y/o progresión del cáncer 
cérvico uterino, este es el primer trabajo en el que se reporta la amplificación