Mecanismos-de-activacion-de-la-via-ERK-12-por-el-factor-liberador-de-corticotropinas

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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA 
 DE MÉXICO 
FACULTAD DE CIENCIAS 
T E S I S 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE : 
B I Ó L O G A 
P R E S E N T A : 
ALMA MARIANA FUENTES GONZÁLEZ 
Tutor: Dr. Jesús Alberto Olivares Reyes 
2007. 
“Mecanismos de activación de la vía ERK 1/2 
por el factor liberador de corticotropinas.” 
 
UNAM – Dirección General de Bibliotecas 
Tesis Digitales 
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reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el 
respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
 
Datos del Jurado: 
 
1. Datos del Alumno: 
Fuentes 
González 
Alma Mariana 
57833535 
Universidad Nacional Autónoma de México 
Facultad de Ciencias 
Biología 
40106615-3 
 
2. Datos del Tutor 
Dr 
Jesús Alberto 
Olivares 
Reyes 
 
3. Datos del sinodal 1 
Dr 
Adolfo 
García 
Saínz 
 
4. Datos del sinodal 2 
Dra 
Marina 
Macias 
Silva 
 
5. Datos del sinodal 3 
Dr 
Luis Felipe 
Jiménez 
García 
 
6. Datos del sinodal 4 
Dra 
Guadalupe 
Reyes 
Cruz 
 
7. Datos del trabajo escrito 
Mecanismos de activación de la vía ERK 1/2 por el factor liberador de 
corticotropinas 68 p 
2007 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El presente trabajo fue realizado en el Departamento de Bioquímica del Centro 
de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), bajo la dirección del 
Dr. Jesús Alberto Olivares Reyes. Durante el desarrollo del mismo la autora fue 
becaria del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), dentro del 
Proyecto: 39485-Q. Este trabajo fue apoyado parcialmente por CONACYT 
(Proyecto 39485-Q) y UCMEXVS-2006. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Las ciencias aplicadas no existen, sólo las aplicaciones de la ciencia. 
 
 Luís Pasteur 
 
 
 
El hombre que ha perdido la facultad de maravillarse es como un hombre muerto. 
 Albert Einstein 
 
 
 
Estudia no para saber más, sino para saber algo mejor. 
 
 Lucio Anneo Séneca 
 
 
 
La ciencia se compone de errores, que a su vez son pasos hacia la verdad. 
 
 Julio Verne 
 
 
 
La ciencia es un magnífico mobiliario para el piso superior de un hombre, siempre y cuando su 
sentido común este en la planta baja. 
 
 Oliver Wendell Holmes 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RECONOCIMIENTOS 
 
 
A la Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), por la formación académica 
recibida y por el orgullo de pertenecer a nuestra máxima casa de estudios. 
 
 
A la Facultad de Ciencias, a toda la comunidad que contribuyo en mi formación 
profesional, intelectual y humano. 
 
 
Al Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), por el apoyo 
económico brindado para la culminación de este trabajo. 
 
 
Al Laboratorio 17 del Departamento de Bioquímica en el Centro de Investigaciones y 
de Estudios Avanzados (CINVESTAV), al Dr. Jesús Alberto Olivares Reyes por la 
dirección del presente trabajo y por todas las facilidades, apoyo y enseñanza que me 
brindo en su realización. 
 
 
A mis sinodales por la revisión de mi trabajo, por sus críticas, comentarios y 
sugerencias muchas gracias: 
 
 
Dr. Adolfo García Saínz. 
Dra. Marina Macias Silva. 
Dr. Luís Felipe Jiménez García. 
Dra. Guadalupe Reyes Cruz. 
 
 
 
Agradezco a la Bióloga Judith Hernández Aranda por el apoyo técnico durante la 
elaboración de este trabajo. 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
Agradezco fundamentalmente a mi familia quienes me han apoyando en todo 
momento quienes han sido mi soporte en el camino que llevó andado. A mis padres 
Martha González Peña y Arturo Fuentes Guerrero por todos sus sacrificios, a mi 
papá por todos sus consejos y su amor ,a mi mamita; el pilar fundamental en mi vida, 
quien a dedicado su vida entera a mi y mi hermana, gracias por el gran amor y 
comprensión que siempre nos ha brindado sin esperar nada a cambio, por todos su 
consejos y noches de desvelo, por ponernos todos los días el ejemplo para siempre 
salir adelante ante las adversidades, gracias mamá por que sin ti no hubiera llegado 
hasta aquí, te debo todo lo que soy y pueda ser en un futuro. 
 
A mi hermanita Martha, mi mejor compañera en esta vida, a quien amo y adoro 
muchísimo, gracias por tu apoyo y cariño. 
 
A mis abuelitos Ignacio q.e.p.d. y Luisita, tías, por estar al pendiente de mi desde la 
infancia y apoyarme, a todos mis primos en especial a mi prima Yatziry por todos los 
momentos de alegría y tristeza que compartimos desde pequeñas, por ser para mi 
como otra hermana gracias. 
 
A Alejandro gracias por el gran apoyo que me das en todo momento, en todos los 
aspectos de mi vida, por impulsarme para salir adelante y no dejarme caer, por tu 
cariño y por formar parte de mi vida. 
 
A mis amigos de siempre,quienes han estado conmigo en las buenas y en las malas, 
les agradezco por escucharme y apoyarme siempre que los he necesitado, gracias 
Iván y Nancy ,por estos años de amistad desinteresada. 
 
A mis amigos y compañeros de la carrera, con los que compartir tantos momentos 
buenos, de tristeza, alegría y estrés: Tanis, Daf, Julieta, Nay, Pili, Eleonora, Varenka, 
Héctor, Miguel, Ásael, Pedro, Raúlsito, Jorge, Enrique, gracias por su apoyo, y su 
amistad. 
 
A mis amigas y compañeras de laboratorio Eva (Evis) y Mónica (Moninena), gracias 
por su apoyo, amistad y por todos los momentos buenos que compartimos. 
 
 “!!!México, Pumas, Universidad; Goooya,Goya………Universidad!!!” 
Í N D I C E 
 
RESUMEN.....................................................................................................................1 
ABREVIATURAS………………………………………….………………....…….…………2 
1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………….……….3 
1.1 RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEINAS G……………………….………....…3 
1.1.2 Clasificación estructural de los receptores acoplados a proteínas G.6 
1.2 EL FACTOR LIBERADOR DE CORTICOTROPINAS (CRF)…………………..…..9 
1.2.1 Factor liberador de corticotropinas y sus análogos……………........11 
1.2.2 Tipos de receptores para el factor liberador de corticotropinas…...11 
1.2.3 Respuestas reguladas por los receptores CRF1 y CRF2………….....13 
1.2.3.1 Estructura del receptor CRF1……………………………….......15 
1.2.4 Características de señalización del receptor del CRF1…………..….16 
1.3 CINASAS ACTIVADAS POR MITÓGENO (MAPK)………………….……..…......20 
1.3.1 Funciones de las cascadas de MAPKs………………………...….....….22 
1.3.1.1 Papel de las MAPKs en diferentes procesos celulares…....22 
1.3.2 Mecanismos de activación de las cascadas de MAPKs………...…....23 
 
2. ANTECEDENTES……...….…………………………………......................................26 
3. OBJETIVOS………………….……………………………………..........................…..29 
General………………………..……………….………………….………………..29 
Particulares…………………………………………..…….………….…………..29 
 
4. HIPÓTESIS…………………….…………………………..…….......……………...…...30 
5. MATERIALES Y MÉTODOS………………….………………………………..……….31 
 
 
 
6. RESULTADOS…………………….………………………………...............................35 
6.1. Efectos del CRF y EGF sobre la activación de las ERK1/2……………..….…..35 
6.2. Rol de la PKA y PKC en la activación de ERK1/2 mediada por CRF…….....38 
6.3. El CRF induce la transactivación del receptor para el EGF.………………....41 
6.4. El CRF nocausa la fosforilación de las ERK1/2 a través de la activación de 
 metaloproteasas……………….………………………………………….….….43 
6.5. Participación de la cinasa PI3K en la activación de las ERK1/2 mediada por 
el CRF ………………………………………………………………………….……..45 
6.6. Participación de la proteína de tirosina cinasa Src en la fosforilación de 
ERK1/2 mediada por el receptor de CRF1 y EGF…………………………….........47 
6.7. Participación de la cinasa PYK2 en la fosforilación de ERK1/2 mediada por 
acción del receptor CRF………………...…………………….………………..…...49 
6.8. Participación de βγ en la fosforilación de ERK1/2 mediada por el receptor de 
CRF1 y EGF……………..………………………………………………...........…….50 
 
 
7. DISCUSIÓN………………………………………..……………….........................…...52 
8. CONCLUSIONES……………………………………..…….................…………….....58 
9. LITERATURA CITADA……………………………..……….…............................…...59 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ABREVIATURAS 
 
ATP Adenosina trifosfato. 
AMPc Adenosina monofosfato cíclico. 
BIM Bisindolilmaleilmida. 
CRF Factor liberador de corticotropinas. 
CRF1 Receptor para CRF tipo 1. 
CRF2 Receptor para CRF tipo 2. 
CREB Proteína de unión al elemento de respuesta al AMPcíclico. 
DAG Diacilglicerol. 
EGF Factor de crecimiento epidermal. 
ERK Cinasas reguladas extracelularmente, por sus siglas en inglés 
Extracellular-signals-regulated kinase. 
GRK cinasa de receptores acoplados a proteínas G, por sus siglas en 
inglés G-protein coupled receptor kinase. 
GPCRs Receptores acoplados a proteínas G. 
HPA Eje hipotalámo-pituitaria-suprarrenales. 
IP3 1,4,5-inositol trisfosfato. 
MAPK Proteína cinasa activada por mitógenos, por sus siglas en inglés 
mitogen-activated protein kinase. 
MEK Proteína cinasa de la MAPK, por sus siglas en inglés mitogen-
activated protein kinase kinase. 
MEKK Proteína cinasa de la MEK, por sus siglas en inglés mitogen-
activated protein kinase kinase kinase. 
PKA Proteína cinasa A. 
PKC Proteína cinasa C. 
PLC Fosfolipasa C. 
RTKs Receptores con actividad de cinasa de tirosina. 
TPA Forbol miristato acetato. 
SVG Sauvagine. 
URO Urotensina I. 
UCN I-III Urocortina tipo 1-3. 
 
 2
RESUMEN 
Recientemente se demostró que la activación de los receptores para el factor liberador 
de corticotropinas (CRF), estimulan la vía de las MAPKs, en particular a las ERK1/2, la 
cual varía de acuerdo al tipo celular y se ha asociado a la citoprotección, diferenciación 
y sobrevivencia celular. Sin embargo, aun no es claro el o los mecanismos 
moleculares involucrados en la regulación de la actividad de las ERK1/2 por CRF en 
células COS-7, transfectadas transitoriamente con el receptor CRF1 de humano. En 
este sistema, el CRF induce una rápida activación de las ERK1/2, que fue dependiente 
del tiempo y la concentración del estímulo. La fosforilación de las ERK1/2 mediada por 
CRF fue completamente bloqueada por acción del AG1478 (un inhibidor específico de 
la actividad de cinasa de tirosina del receptor para EGF). Además, el CRF indujo la 
fosforilación del receptor para EGF, evento indispensable para su activación. Ambos 
resultados sugieren que el efecto de CRF es mediado por un mecanismo de 
transactivación del receptor para el EGF. Sin embargo, esta transactivación no fue 
dependiente de la activación de metaloproteasas y la liberación de HB-EGF. De igual 
manera, inhibidores específicos de la PKA (H89) y de la PKC (BIM) no tuvieron efecto 
sobre la fosforilación de ERK1/2 mediada por CRF, lo que sugiere que la activación de 
las ERK1/2 es independiente de ambas cinasas. Un inhibidor especifico de la PI3K, la 
wortmanina, disminuyó la fosforilación de las ERK1/2 inducida por CRF, sugiriendo 
que la activación de la vía PI3K/Akt se encuentra involucrada en la activación de las 
ERK1/2 por CRF. Sin embargo, la activación de la vía PI3K/Akt es independiente de la 
transactivación del receptor para el EGF ya que la activación de las ERK1/2 por efecto 
del EGF no fue bloqueada por la wortmanina. Esto abre la posibilidad de que una 
isoforma de PI3K pueda ser activada directamente por CRF de manera independiente 
de la transactivación del receptor EGF. Se ha demostrado que PI3Kβ y PI3Kγ pueden 
ser activadas por el complejo Gβγ en la activación de las ERK1/2 por CRF. Células 
COS- 7 fueron cotransfectadas con el receptor CRF1 y con el extremo carboxilo de la 
βARK, el cual es capaz de unir y secuestrar al complejo Gβγ observándose una 
disminución en la activación de las ERK1/2 por CRF. Esto sugiere que dicho complejo 
participa en la activación de la PI3Kβ, ya que la PI3Kγ se encuentra confinada a un 
número limitado de tipos celulares. Finalmente, se evaluó el papel de las cinasas Src 
y PYK2 implicadas en la activación de la vía de MAPK por un gran número de GPCRs. 
La inhibición de la cinasa Src por el inhibidor PP2, bloqueó por completo el efecto del 
CRF sobre la activación de las ERK1/2. De igual manera se encontró que la activación 
de CRF induce la fosforilación de Src y PYK2. Estos resultados nos sugieren que el 
CRF induce la activación de las ERK1/2 a través de una vía que depende de la 
transactivación del receptor para EGF a través de Gβγ, PI3K, Src y PYK2. 
 1
1. INTRODUCCIÓN 
 
1.1 RECEPTORES ACOPLADOS A PROTEINAS G 
 
Las células de todos los organismos vivos poseen mecanismos de señalización que 
les permiten recibir estímulos ambientales y responder adecuadamente a ellos. El 
éxito de estos mecanismos asegura que el organismo sobreviva a sus diversos 
cambios ambientales. En los organismos multicelulares estos mecanismos forman 
redes de comunicación más complejas, que garantizan que la célula funcione y 
responda a una diversidad aún mayor de estímulos y que lo hagan coordinadamente 
con las otras células del organismo. De esta red de comunicación dependen funciones 
tan importantes como el desarrollo embrionario, la proliferación y diferenciación 
celular, las respuestas de estrés, la percepción sensorial, la respuesta inmune, la 
regulación metabólica, etc. 
Los mecanismos de señalización celular se pueden resumir en los siguientes 
eventos: a) síntesis y liberación de moléculas mensajeras (denominadas generalmente 
ligandos), las cuales son transportadas y recibidas por la célula blanco apropiada, que 
puede ser una vecina cercana (señalización parácrina) o lejana (señalización 
endócrina), o incluso ella misma (señalización autócrina); b) la detección de moléculas 
mensajeras por proteínas receptoras específicas en las células blanco; c) la 
generación por parte del complejo receptor-ligando de una segunda señal intracelular 
o segundo mensajero, encargado de activar a proteínas encargadas de transmitir la 
información intracelularmente; d) la amplificación intracelular de la señal a través de la 
participación de enzimas; e) la generación de la respuesta celular, y finalmente d) la 
activación de mecanismos encargados de disminuir la respuesta celular. 
Existen tres grupos principales de receptores membranales, definidos por su 
estructura y por sus mecanismos de transducción de señales: a) receptores que son 
canales iónicos o ionotrópicos, b) receptores acoplados a proteínas G o GPCRs (G 
protein-coupled receptors) y c) receptores con actividad enzimática. 
Los GPCRs son proteínas que conforman la familia más grande de receptores 
membranales involucrados en la transmisión de señales, activados por una amplia 
variedad de ligandos, tales como neurotransmisores, hormonas, olores, sabores y la 
luz (Luttrell, 2005). Este tipo de receptores de membrana controlan una gran 
diversidad de procesos fisiológicos y de suma relevancia, entre los que se pueden 
mencionar la diferenciación y el crecimiento celular; la neurotransmisión; la regulación 
de la secreción endócrina y exócrina; la quimiotaxis; respuestas inflamatorias e 
 3
inmunes; el control de la presión arterial; la embriogénesis; la percepción de la luz, así 
como la oncogénesis entremuchos otros (Luttrell, 2005). 
Aunque todos los GPCRs comparten entre sí una estructura común que 
consiste en una cadena polipeptídica cuya estructura posee siete hélices α 
transmembranales unidas por asas alternadas intracelulares y extracelulares, todos 
ellos difieren, tanto en su secuencia primaria como en el tamaño y complejidad de las 
asas intra y extracelulares (Luttrell, 2005) (Figura 1). 
Los GPCRs han recibido el nombre por su habilidad de reclutar, interaccionar y 
regular la función de las proteínas G heterotriméricas, constituidas por las subunidades 
α, β, y γ. La unión del ligando al receptor promueve cambios conformacionales en el 
receptor que se transmiten a través de los siete dominios transmembranales 
permitiendo la interacción con la proteína G asociada. 
Una vez activados por su ligando, los GPCR interaccionan con proteínas 
heterotriméricas recambiadoras de nucleótidos de guanina (o proteínas G). En su 
estado inactivo, la subunidad α de las proteínas G tiene unido GDP (α-GDP). La unión 
del ligando a los GPCRs estabiliza al receptor en una conformación activa, permitiendo 
el contacto entre los dominios intracelulares del receptor y la subunidad α-GDP de la 
proteína G heterotrimérica. Esta interacción cataliza el recambio de GDP por GTP en 
la subunidad α y permite la disociación de la subunidad α-GTP del heterodímero βγ. 
Una vez disociados ambos, la subunidad α-GTP y el dímero βγ regulan la actividad o 
la inhibición de efectores enzimáticos como la adenilato ciclasa, la fosfolipasa C, así 
como la regulación de la actividad de canales de calcio y de potasio. 
Dos ejemplos típicos de cascadas de señalización iniciadas por GPCRs son las 
que conducen a la formación de los segundos mensajeros, inositol (1,4,5) trisfosfato 
(IP3)/diacilglicerol (DAG) y AMPc . 
También se ha descrito la activación por proteínas G de sistemas efectores que 
clásicamente se creían activados por receptores de factores de crecimiento a través 
de la activación de cinasas de tirosina. Un ejemplo característico es la activación de 
las rutas de señalización de las cinasas activadas por mitógenos (o MAP cinasas, 
mitogen activated protein), entre las que se encuentran las cinasas reguladas 
extracelularmente o ERKs (extracellular regulated kinases) y p38 (Crespo and Gutkind, 
2004), fenómeno que diversifica aún más el campo de acción de los GPCRs. 
 4
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Receptores acoplados a proteínas G. Representación esquemática de un receptor 
acoplado a proteínas G, su unión con el ligando y el sistema efector, encargado de generar 
mensajeros intracelulares (modificada de www.jenabioscience.com). 
 
 
La similitud de las subunidades α, permite clasificar a las proteínas G en cuatro 
categorías: Gs, Gi, Gq y G12/13. La estimulación de la subfamilia Gs activa a la 
enzima adenilato ciclasa (AC), mientras que la estimulación de la subfamilia Gi lleva a 
su inhibición. Por otro lado, la estimulación de la subfamilia Gq activa a la enzima 
fosfolipasa C (PLC) y la subfamilia G12/13 está implicada en la regulación de 
proteínas G pequeñas. 
Los GPCRs varían en su especificidad, ya que algunos sólo activan un tipo de 
proteína G para generar un tipo de transducción de señal, mientras que otros 
receptores más promiscuos, se acoplan a varias clases de proteínas G para generar 
múltiples cascadas de señalización. Más que eso, los GPCRs pueden asociarse entre 
ellos para formar homodímeros o heterodímeros que pueden resultar en una compleja 
variedad de eventos de señalización (Minneman, 2007). Es por ello que la respuesta 
que los GPCRs producen es compleja, debido a que depende tanto de la diversidad de 
las subunidades de las proteínas G, como de las moléculas efectoras río abajo 
presentes en el modelo celular. La especificidad, por lo tanto, depende de los 
heterotrímeros de proteína G reconocidos por el receptor, de las moléculas efectoras 
expresadas en la célula o tejido y de las concentraciones relativas de varios 
componentes en las rutas de señalización. 
Cuando un receptor es estimulado durante mucho tiempo, o bien está en 
presencia de una gran cantidad de ligando, se reduce su capacidad de ser estimulado 
 5
en el futuro (desensibilización), mientras que una baja activación incrementa la 
habilidad de ser estimulado (sensibilización). 
Los GPCRs se activan de una manera dependiente de la dosis por lo que la 
concentración del agonista es el control de la transducción de señal de un receptor 
dado. Los receptores también difieren en su actividad basal o constitutiva, por lo que la 
señalización celular mediada por la activación de los GPCRs inducida por el agonista, 
debe ser rigurosamente regulada para prevenir un nivel inconveniente de la 
estimulación del receptor. Han sido descritas dos formas de regular la señalización de 
los GPCRs, las cuales son la desensibilización homóloga y heteróloga. 
La desensibilización homóloga se refiere al mecanismo de adaptación celular 
dependiente de la activación del receptor por su ligando. Es decir, comienza con la 
localización selectiva de las cinasas de los GPCRs (GRKs) del citosol a la membrana, 
en donde fosforilan residuos de serina y treonina presentes en el extremo carboxilo 
terminal o bien, en la tercera asa intracelular de los GPCRs (Kohout and Lefkowitz, 
2003;Luttrell, 2006). 
 Por el contrario, los mecanismos heterólogos pueden atenuar las respuestas 
del receptor de manera independiente a la unión de su ligando. Típicamente, la 
desensibilización heteróloga ocurre cuando un receptor no activado es fosforilado por 
una cinasa activada por un segundo mensajero generado por otro GPCR. 
 
1.1.2 Clasificación estructural de los receptores acoplados a proteínas G 
Los GPCRs no comparten en general una gran homología de secuencia aminoacídica. 
La única característica estructural común a todos ellos es la presencia de siete hélices 
α que atraviesan la membrana y que están conectadas por tres asas intracelulares y 
tres extracelulares, quedando el dominio N-terminal orientado hacia el medio 
extracelular y el C-terminal hacia el intracelular (Ulloa-Aguirre et al., 1999). Los GPCRs 
se han clasificado según diferentes sistemas, uno de los más populares es el sistema 
de Kolakowski (Kolakowski, Jr., 1994), el cual los clasifica en tres familias en función 
de la homología en su secuencia de aminoácidos. La primera familia (familia A), 
incluye a los receptores relacionados con la rodopsina y los receptores β adrenérgicos, 
siendo ésta la más numerosa de las tres (Figura 2). La homología global de los 
receptores de la familia A es baja y restringida a un número de residuos altamente 
conservados. En esta familia, el ligando es normalmente reconocido en una cavidad 
formada por los dominios transmembranales, aunque para algunas subfamilias, 
activadas por pequeños péptidos, el reconocimiento se produce a nivel de las asas 
extracelulares y del dominio N- terminal. El único residuo que está conservado en 
todos los receptores de la familia A es la arginina, presente en el motivo Asp-Arg-Tyr 
 6
de la región C- terminal del tercer segmento transmembranal. Este motivo se cree 
puede desempeñar un papel importante en la activación de la proteína G (Fraser et al., 
1988). La segunda familia (familia B), contiene a los receptores relacionados con el 
receptor de glucagón e incluye aproximadamente 20 diferentes receptores para una 
variedad de hormonas peptídicas y neuropéptidicas tales como la calcitonina, el 
glucagón y factor liberador de corticotropinas (CRF) (Figura 2). Estos péptidos son 
reconocidos por el relativamente extenso dominio N-terminal que presentan los 
receptores de esta familia. 
 La tercera familia (familia C), incluye a los receptores relacionados con los 
receptores metabotrópicos de glutamato, y en ella se encuentra los receptores 
sensibles a calcio y los receptores de GABA (Figura 2).Esta familia se caracteriza por 
tener unos dominios C-terminal y N-terminal excepcionalmente largos. El dominio N-
terminal de estos receptores presenta una baja pero significativa homología con las 
proteínas PBPs bacterianas (proteinas ligadoras situadas en la superficie 
periplasmatica bacteriana, por sus siglas en inglés perisplasmatic binding proteins) 
encargadas del transporte de moléculas tales como péptidos, aminoácidos, azúcares o 
iones. En esta familia el dominio N- terminal es el que está involucrado en la unión del 
ligando. 
Recientemente, Fredriksson et al., (2003) han propuesto un nuevo sistema de 
clasificación para los GPCRs según su relación filogenética. Este sistema se reconoce 
como GRAFS, por las iniciales de los cinco principales grupos que los componen 
(Glutamato, Rodopsina, Adhesión, tacto/gusto/térmico) (Fredriksson et al., 2003). 
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 FAMILIA A 
• La rodopsina y los receptores β-
adrenérgicos. 
• Receptores de aminas biogénicas 
(serotonina, dopamina, histamina). 
• Receptores de adenosina, canabinoides. 
• Receptores de opiodes, vasopresina, 
somastostina. 
FAMILIA B 
• Receptores de calcitonina. 
• Receptores de glucagón. 
• Receptores de VIP y PACAP. 
• Receptores del CRF. 
FAMILIA C 
• Receptores metabotrópicos de glutamato. 
• Receptores metabotrópicos de GABA. 
• Receptores de calcio. 
 
Figura 2. Las tres principales familias de receptores acoplados a proteína G. Representación 
esquemática de un miembro prototípico para cada familia. Se muestran varios de los residuos más 
conservados (letra negra dentro de círculo blanco) y dos cisteínas características que se supone 
conectarían las asas extracelulares 2 y 3 mediante un puente disulfuro (letra blanca en círculo negro). 
Para la familia A también se representa una tercera cisteína en el dominio C-terminal que para la 
mayoría de miembros de esta familia aparece palmitoilada (modificado de Kolakowski, Jr, 1994, 
(Kolakowski, Jr., 1994)). 
 8
1.2 EL FACTOR LIBERADOR DE CORTICOTROPINAS (CRF) 
El factor liberador de corticotropinas o CRF (por sus siglas en inglés, 
corticotropin releasing factor), es sintetizado a partir de un precursor de 91 
aminoácidos denominado pre-pro-CRF que posteriormente es procesado en un 
péptido de 41 aminoácidos; éste fue aislado y caracterizado de extractos de 
hipotálamo de ovino en 1981, como uno de los mediadores importantes en la 
inducción de respuestas adaptativas al estrés mediadas por el eje hipotálamo-
pituitaria-suprarrenal, el cual juega un rol central en la vía del CRF, que regula la 
secreción de adenocorticotropina de la pituitaria anterior (Vale et al., 1981;Rivier et al., 
1982). 
El factor liberador de corticotropinas es el encargado de regular varias acciones 
en el sistema nervioso central (CNS) y periférico, las cuales regulan funciones críticas 
en la integración y coordinación de la actividad de diversos sistemas fisiológicos. Las 
acciones del CRF son mediadas a través de la secreción de norepinefrina en neuronas 
y otros neurotransmisores importantes para la regulación de estados de ánimo en 
mamíferos (Diamant and de Wied D., 1991;Jedema and Grace, 2004). Además 
también se le relaciona con trastornos alimenticios, en enfermedades tales como la 
anorexia (Uehara et al., 1998), se encuentra implicado también en la reproducción en 
mamíferos y la implantación embrionaria, es secretado en la placenta humana 
regulando la modulación de la contractilidad del miometrio (Grammatopoulos and 
Hillhouse, 1999). 
Desde el descubrimiento de la estructura del CRF, diversos estudios han 
contribuido significativamente al estudio de la respuesta al estrés y a la regulación del 
eje hipotálamo-pituitaria-suprarrenal (eje HPA). En el hipotálamo, el CRF es secretado 
por neuronas del núcleo paraventricular y luego es transportado por circulación portal 
hipotálamo-hipófisis a la hipófisis anterior, en donde estimula la secreción de la 
hormona adrenocorticotrópica (ACTH). La ACTH entra entonces a la circulación 
periférica y estimula la secreción de glucocorticoides por la corteza suprarrenal (el 
cortisol en los primates y la corticosterona en la mayoría de los roedores). Los 
glucocorticoides, a su vez generan retroalimentación negativa sobre la hipófisis 
anterior, el hipotálamo y el hipocampo, a través de receptores para glucocorticoides lo 
cual normalmente mantiene los niveles de cortisol dentro del rango esperado (Figura 
3) (Charmandari et al., 2005). 
El cortisol tiene múltiples funciones, destacándose el incremento a la respuesta 
fisiológica al estrés. Bajo distintas condiciones estresantes incluyendo el ejercicio, el 
trauma, la ansiedad y la depresión, los niveles de cortisol se incrementan, llevando a 
una cadena de eventos en los que en última instancia proveen de energía inmediata a 
 9
los organismos y mantiene al individuo en alerta a través de la estimulación del 
sistema adrenérgico. Sin embargo, cuando el cortisol es hipersecretado en forma 
crónica, pueden producirse secuelas fisiológicas deletéreas, tales como incremento de 
la presión arterial, diabetes, arterioesclerosis, supresión inmunológica y atrofia 
muscular (figura 3) (Charmandari et al., 2005). 
El incremento o la secreción crónica del CRF conducen a trastornos como la 
ansiedad, la melancolía, la depresión, el dolor, la fatiga crónica, desórdenes del sueño, 
el desarrollo de adicciones, la neurodegeneración, alergias, desórdenes autoinmunes, 
enfermedades estomacales, cardiovasculares y el síndrome metabólico (Hauger et al., 
2006;Hillhouse and Grammatopoulos, 2006). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3. Regulación del factor liberador de corticotropinas. En el hipotálamo el CRF es 
secretado por las neuronas del núcleo paraventricular y es transportado por circulación portal 
hipotálamo-pituitaria donde hay una secreción de la adrenocorticotropina la cual entra a 
circulación periférica y estimula la secreción de glucocorticoides generando retroalimentación 
negativa sobre la hipófisis anterior, el hipotálamo y el hipocampo (imagen tomada y modificada 
de Arborelius et al.,1999), (Arborelius et al., 1999). 
 10
1.2.1 Factor liberador de corticotropinas y sus análogos 
Después de la caracterización del CRF, diferentes estudios dieron evidencia de la 
existencia de análogos estructurales al CRF: la sauvagina en anfibios (SVG), la 
urotensina I en peces (URO), y las urocortinas I, II y III en mamíferos (UCN-I, UCN-II y 
UCN-III, respectivamente). Todos estos análogos constan de una sola cadena 
polipeptídica de aproximadamente 40 aminoácidos y controlan respuestas 
neuroendócrinas, autonómicas y conductuales al estrés mediante su interacción con 
dos receptores de membrana denominados CRF1 y CRF2 (Figura 4) (Dautzenberg and 
Hauger, 2002;Hauger et al., 2006). 
En mamíferos, el CRF y las urocortinas se encuentran diferencialmente 
distribuidos en el cerebro y tejidos periféricos. Así, el RNA mensajero (RNAm) de la 
UCN-I se ha detectado en diferentes áreas del cerebro incluyendo regiones del 
cerebelo, hipocampo, neocorteza, sistema olfativo, amígdala, ganglio basal, núcleo 
ventromedial y paraventricular del hipotálamo y núcleos del tegumento latero-dorsal 
entre otros. Además, se sabe que puede estar expresado en tejidos periféricos tales 
como corazón, músculo esquelético, placenta, piel, sistema inmune y tracto 
gastrointestinal (Martinez et al., 2004). En el caso del RNAm de UCN-II (conocida 
como péptido relacionado a la estrescopina o SRP) puede ser detectado en órganos 
tales como: corazón, glándula suprarreral, placenta, piel, ovario, tracto gastrointestinal, 
útero, músculo esquelético, estómago y en células sanguíneas, además de regiones 
específicas del cerebro. Por último, el RNAm de la UCN-III (estrescopina ó SCP) es 
predominantemente expresado en el hipotálamoy amígdala media, en tejidos 
periféricos tales como: sistema adrenal, hígado y principalmente en los túbulos distales 
está relacionado con funciones fisiológicas tales como la regulación neuroendócrina y 
la ingesta de alimentos (Spina et al., 1996). 
 
1.2.2 Tipos de receptores para el factor liberador de corticotropinas 
Las acciones biológicas del CRF y las urocortinas son mediadas por receptores de la 
membrana plasmática pertenecientes a la superfamilia de receptores acoplados a 
proteínas G. A la fecha, dos distintos tipos de receptores han sido caracterizados en 
mamíferos: los receptores CRF1 y CRF2, los cuales presentan marcadas diferencias en 
su distribución tisular, su especificidad farmacológica y las respuestas que regulan 
(Chalmers et al., 1995;Steckler and Holsboer, 1999;Keck, 2006;Lovenberg et al., 
1995). En el caso de los receptores CRF2 existen en isoformas generadas por 
”splicing” (CRF2(a), CRF2(b) y CRF2(c)) y se expresan diferencialmente en cerebro y 
tejidos periféricos lo que sugiere que se encuentran vinculados a diversas funciones 
fisiológicas. (Dautzenberg and Hauger, 2002;Charmandari et al., 2005;Keck, 2006). 
 11
Altos niveles del receptor CRF1 son encontrados en la corteza cerebral, cerebelo, 
amígdala, hipocampo y bulbo olfativo (Charmandari et al., 2005) (Figura 4). En tejidos 
periféricos de humanos, el receptor CRF1 se expresa en testículos, ovarios, 
endometrio, miometrio, placenta, sistema adrenal, tejido adiposo, piel, bazo, corazón y 
en células del sistema inmune (Charmandari et al., 2005)(Charmandari et al., 2005, 
Vamvakopoulos & Sioutopoulou, 1994). Por otro lado, el RNA mensajero del receptor 
CRF2 es expresado también en cerebro, principalmente en el núcleo del septo lateral, 
núcleo ventromedial del hipotálamo, bulbo olfativo y núcleo mesencefálico (Figura 4). 
El receptor CRF2 también se le puede encontrar expresado en tejidos periféricos como 
piel, músculo esquelético, liso y cardiaco (Hillhouse and Grammatopoulos, 2006). 
En cuanto a las funciones que regulan, en general se ha propuesto que el 
receptor CRF1 se encarga de regular los efectos del CRF sobre el eje HPA y 
conductas relacionadas a la ansiedad (Liebsch et al., 1999;Liebsch et al., 
1995;Skutella et al., 1998), mientras que el receptor CRF2 se encuentra 
predominantemente asociado a la regulación de conductas relacionadas a la 
alimentación y a la ansiedad, a la función cardiovascular y a la regulación del eje HPA 
(Coste et al., 2000;Keck, 2006;Spina et al., 1996). 
Estudios recientes han demostrado que el CRF y sus análogos presentan 
distintas afinidades por los receptores CRF1 y CRF2: UCN-I>CRF para el receptor 
CRF1, y UCN-I>UCN-2>UCN-3>>CRF para el receptor CRF2 (Grigoriadis et al., 
1996;Donaldson et al., 1996;Lovenberg et al., 1995). Estos estudios sugieren que el 
CRF y la UCN-I representan los ligandos naturales para el receptor CRF1, mientras 
que las UCN-I, UCN-II y UCN-III lo son para el receptor CRF2 (figura 5). 
 12
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4. Regiones del cerebro humano. Los receptores CRF1 se localizan en la corteza 
cerebral, cerebelo, amígdala, hipocampo y bulbo olfatorio; por su parte los receptores CRF2 se 
expresan también en el cerebro, principalmente en el núcleo del septo lateral, núcleo 
hipotalámico ventromedial, bulbo olfatorio y núcleo mesencefálico (imagen tomada y 
modificada de http://www.hopkins-gi.nts.jhu.edu/.../shared_9473_IB-11.jpg). 
 
1.2.3 Respuestas reguladas por los receptores CRF1 Y CRF2 
El desarrollo, comportamiento y efectos fisiológicos producidos por el CRF y su familia 
de péptidos relacionados, pueden atribuirse a las diferentes respuestas producidas por 
cada uno de sus receptores (CRF1 y/o CRF2). Estudios realizados en ratones 
muestran que los receptores CRF2 disminuyen el comportamiento de ansiedad y 
estrés, mientras que el receptor de CRF1 puede incrementar el comportamiento de 
ansiedad, acelerar la respuesta a estrés y funciones cardiovasculares. En mamíferos 
se sabe que el receptor CRF1 está implicado en la fisiopatología de varias 
enfermedades endócrinas, psiquiátricas, neurológicas e inflamatorias. Se sabe que la 
activación del receptor CRF1 por el CRF inicia la respuesta de estrés mediante la 
activación del eje hipotálamo-pituitaria-suprarrenal (Hauger et al., 2006;Hillhouse and 
Grammatopoulos, 2006). Además, la hipersecreción del CRF en cerebro puede 
contribuir al aumento en la sintomatología considerada en desórdenes 
neurosiquiátricos tales como: depresión, ansiedad y anorexia nerviosa (Arborelius et 
al., 1999;Dautzenberg and Hauger, 2002). En relación a lo anterior, recientemente se 
demostró que el uso de antagonistas específicos para el receptor CRF1 reducen el 
desarrollo de conductas de ansiedad en roedores y primates (Lundkvist et al., 
1996;Griebel et al., 1998;Habib et al., 2000). 
 13
En el caso de los receptores CRF2, se ha postulado que estos modulan 
principalmente los efectos del CRF sobre conductas alimenticias, mientras que su 
participación en conductas de estrés y ansiedad es menor (Smith et al., 1998;Spina et 
al., 1996). No obstante, se ha demostrado que los receptores CRF2 también pueden 
modular respuestas de ansiedad y estrés, aunque aun existen resultados 
controversiales en relación a su capacidad de promover (Takahashi, 2001;Risbrough 
et al., 2003) o disminuir (Kishimoto et al., 2000) ambas respuestas. A pesar de los 
resultados anteriores, es comúnmente aceptado que las acciones del receptor CRF2 
se asocien a contrarregular los efectos mediados por el receptor CRF1 (ver figura 5). 
Finalmente, podemos decir que la variabilidad de datos que reportan la 
expresión de ambos receptores CRF1 y CRF2 en tejidos periféricos de humanos, 
apoya la diversidad y contraste de efectos con los cuales se les vincula (Figura 5). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Interacción entre los receptores CRF1, CRF2 y sus ligandos. El CRF puede 
unirse tanto al receptor CRF1 como al receptor CRF2, pero presenta una mayor afinidad por el 
receptor CRF1. En contraste la UCN I tiene igual afinidad por ambos receptores, mientras que 
la UCNII y la UCNIII son ligandos selectivos para el receptor CRF2. La activación de CRF1 y 
CRF2 estimula diversas repuestas fisiológicas como la ansiedad, la depresión, el apetito, entre 
otras, las cuales son reguladas de manera diferencial por ambos receptores (imagen tomada y 
modificada de (Grammatopoulos and Chrousos, 2002)). 
 
 
 
 14
1.2.3.1 Estructura del Receptor CRF1
Como se mencionó en las secciones anteriores, los receptores CRF1 y CRF2, 
pertenece a la clase B de los GPCRs. En este grupo se incluyen a los receptores de, 
calcitonina, péptido inhibitorio gástrico, hormona de crecimiento, hormona de 
paratiroides (PTH), glucagón, y polipéptido vasoactivo intestinal (VIP). Todos estos 
receptores se caracterizan, aparte de su homología estructural en que estimulan la 
formación de cAMP cuando son activados por sus ligandos respectivos. 
 Al igual que los GPCRs pertenecientes a la clase B, los receptores para CRF 
poseen un extremo amino terminal largo que permite el reconocimiento y la unión del 
ligando con una alta afinidad. Sin embargo, esta interacción al parecer no es suficiente 
para estimular el acoplamiento del receptor a las proteínas G, por lo que una 
interacción adicional entre el dominio juxtamembranal de los receptores y los primeros 
residuos del CRF localizados dentro de su porción amino terminal es requerida para 
inducir la activación de la señal intracelular. Además, en el caso del receptor CRF1, 
cuya secuencia consta de aproximadamente 415 aminoácidos, se han identificado 
cuatro sitios de N-glucosilación en el extremo amino terminal los cuales al parecer son 
glucosilados significativamente. En este sentido la N-glucosilación del receptor parece 
ser importante su expresión, para su localización en la membrana plasmática ypara la 
unión del ligando (Hillhouse and Grammatopoulos, 2006). 
Otra característica estructural de los receptores para el CRF, es la presencia de 
múltiples residuos de cisteínas en el extremo amino y las asas extracelulares, que 
permiten la formación de puentes disulfuro que parecen ser críticos para el 
reconocimiento del ligando (Hillhouse and Grammatopoulos, 2006). 
Al igual que los miembros de la superfamilia de GPCRs, los receptores para el 
CRF tienen la habilidad intrínseca de acoplarse a las proteínas G, una asociación que 
estabiliza al receptor en una conformación de alta afinidad. De manera interesante, un 
número de estudios ha demostrado que la unión de diferentes agonistas a los 
receptores para CRF exhibe variación en su sensibilidad al acoplamiento a las 
proteínas G. De esta forma se ha identificado que los receptores CRF1 y CRF2 
muestran promiscuidad en su interacción a diferentes tipos de proteínas G, siendo el 
acoplamiento a Gs y Gq las mejor caracterizadas (Hillhouse and Grammatopoulos, 
2006;Hauger et al., 2006;Dautzenberg et al., 2004). Los sitios involucrados en la 
interacción con las proteínas G se localizan principalmente en la tercera asa 
intracelular del receptor (IC3 ver figura 6), y es 100% conservado en los dos tipos de 
receptores para el CRF. 
El receptor CRF1 se caracteriza por poseer sitios de fosforilación para la PKC 
localizados en la primera y segunda asa intracelular. Además, la tercera asa 
 15
intracelular y la cola carboxílica poseen un gran número de sitios posibles de 
fosforilación los cuales al parecer están involucrados en la regulación del receptor. Un 
aspecto interesante es que estos sitios se encuentran altamente conservados en los 
dos tipos de receptores (CRF1 y CRF2), lo que sugiere que los mecanismos que 
regulan la actividad de estos receptores es muy parecida y se ha conservado a través 
del proceso evolutivo (Hauger et al., 2006) (ver figura 6). 
 
Figura 6. Diagrama de los receptores CRF1 y CRF2 en humanos. Descripción de la 
secuencia indicando la importancia de aminoácidos extracelulares comprendiendo el dominio 
del ligando selectivo para los receptores de CRF. Serinas y treoninas (círculos rojos) 
localizados en las asas intracelulares del receptor CRF y en el carboxilo terminal sitos 
potenciales para fosforilación por GRK e isoformas PKC (imagen tomada y modificada de 
(Hauger et al., 2006)). 
 
 
1.2.4 Características de señalización del receptor CRF1 
a) Acoplamiento a Gs y activación de la vía de la adenilato ciclasa/PKA 
Un gran número de estudios dirigidos a investigar las vías transduccionales reguladas 
por el receptor CRF1 han claramente demostrado que la activación de la vía de la 
adenilato ciclasa/PKA es la vía preferencial activada por estos receptores (Hauger et 
al., 2006;Hillhouse and Grammatopoulos, 2006). La unión de CRF o UCN-I al receptor 
CRF1 cambia la conformación del receptor de un estado inactivo a uno activo, 
incrementando su afinidad por la proteína Gs. El acoplamiento de la subunidad α de la 
 16
proteína Gs a la tercera asa intracelular del receptor activado por su agonista, estimula 
la actividad de la adenilato ciclasa, la cual genera el segundo mensajero AMPc. El 
acoplamiento de Gsα a la tercera asa intracelular del receptor CRF1 produce 
aproximadamente 1300 veces de incremento en la afinidad del receptor por el CRF 
(Hoare et al., 2004;Hauger et al., 2006). De esta forma, la señalización del receptor 
CRF1 mediada por Gs lleva a la activación dependiente de AMPc de la PKA y los 
eventos subsecuentes río abajo como lo es la fosforilación y activación del factor 
transcripcional CREB (Dautzenberg et al., 2002;Hauger et al., 2006;Chen et al., 1993) 
(figura 7). 
 
b) Acoplamiento a Gq y activación de la vía de la fosfolipasa C/PKC. 
Los receptores CRF1 endógena y recombinantemente expresados en diversos tipos 
celulares activan la vía de la fosfolipasa C/PKC, posiblemente por su acoplamiento a la 
proteína Gqα (figura 7). Estas evidencias han surgido debido a que se ha observado 
que el CRF induce una rápida translocación de la PKC a la membrana celular y 
estimula la formación de inositol trisfosfato (IP3) y la movilización intracelular de calcio 
(Dautzenberg et al., 2004;Hauger et al., 2006;Hauger et al., 2003;Grammatopoulos 
and Chrousos, 2002). Además, y de manera interesante, se ha observado que en 
algunos sistemas celulares el CRF induce la acumulación simultánea de AMPc y de 
IP3, lo que sugiere el acoplamiento de las proteínas Gs y Gq al receptor activo. A 
pesar de estas evidencias aun se desconocen los mecanismos por los que el receptor 
CRF1 puede activar ambas proteínas G (Dautzenberg et al., 2004;Grammatopoulos et 
al., 2000;Hauger et al., 2006). 
 
c) Activación de la vía de ERK/MAP cinasas. 
Diversos estudios han mostrado que los receptores para el CRF activan la vía de las 
cinasas reguladas extracelularmente (ERK)/cinasas activadas por mitógenos (MAPK) 
en diferentes tipos celulares incluyendo neuronas, células cardiacas, células del 
miometrio, así como en sistemas celulares de expresión recombinante (figura 7). La 
sauvagina y la UCN-I (pero no el CRF) activan la vía de MAP cinasas en células CHO 
y HEK293 que sobreexpresan a los receptores CRF1 (Grammatopoulos et al., 
2000;Rossant et al., 1999), evento que al parecer es mediado por una vía 
independiente a la activación de la PKA (Rossant et al., 1999). En contraste, se ha 
reportado que la activación del receptor CRF1 induce el crecimiento neuronal de 
células CATH.a (una línea celular catecolaminérgica de origen neuronal) a través de 
una vía dependiente de PKA y MAP cinasas (Cibelli et al., 2001). De manera similar, la 
PKA, pero no la PKC, inducen la fosforilación de las ERK1/2 en una línea celular 
 17
tumoral de hipófisis (AtT20) (Brar et al., 2004;Kovalovsky et al., 2002). La exposición 
de células de miometrio humano o de células HEK293 que sobreexpresan receptores 
CRF1, a la UCN-I estimula la fosforilación de las MAP cinasas, posiblemente a través 
de la activación de la vía de la fosfolipasa C (Grammatopoulos et al., 2000). Estos 
estudios sugieren que en un sistema celular determinado el contexto celular determina 
las vías de señalización activadas por el receptor CRF1 que regulan la actividad de las 
MAP cinasas. En cuanto a las acciones reguladas por la activación de la vía de MAP 
cinasas se sabe que éstas regulan la plasticidad sináptica (Sweatt, 2004), y el control 
de la expresión genética, por la activación de factores transcripcionales nucleares 
(Lefkowitz and Shenoy, 2005;Sweatt, 2004). Además, recientemente se demostró que 
el receptor CRF1 puede activar la cascada de las MAP cinasas a través de su 
interacción con la proteína β-arrestina2, la cual estimula el reclutamiento y la 
activación de las ERK1/2, evento que podría estar involucrado en la movilidad celular, 
la quimiotaxis y la apoptosis (Lefkowitz and Shenoy, 2005;Hauger et al., 2006). 
 
d) Activación de la vía de Akt/proteína cinasa B-PI3K. 
Los receptores de CRF también pueden promover sus efectos a través de la vía de 
Akt/proteina cinasa B (PKB). Por ejemplo, la activación de receptores CRF1 que se 
expresan en neuronas del cerebelo de ratas recién nacidas, con CRF o UCN-1, resulta 
en la fosforilación e inactivación de la cinasa de la glucógeno sintasa-3β (GSK-3β) por 
acción de la Akt. La GSK-3β es una cinasa multifuncional de serinas/treoninas que en 
su estado no fosforilado es activa. La GSK-3β desempeña un papel muy importante en 
la regulación de diferentes eventos celulares en sistema nervioso central, incluyendo la 
síntesis proteica, la proliferación y la diferenciación celular y la apoptosis, entre otros. 
De esta forma la activación de la vía de PI3K/Akt por el CRF, lleva a la fosforilación e 
inactivación de la GSK-3β, ejerciendo un efecto neuroprotector (Facci et al., 
2003;Hauger et al., 2006). 
 18Figura 7. Vías de señalización de los receptores CRF1 y CRF2. La activación de los 
receptores CRF1 y CRF2 lleva a su asociación con proteínas Gs y Gq, las cuales regulan la 
actividad de la adenilato ciclasa (AC) y la fosfolipasa C (PLC), respectivamente. La generación 
de segundos mensajeros por estos efectores lleva a la activación de cinasas como la PKA y la 
PKC, las que se encuentran involucradas en la regulación de diversas señales intracelulares 
como la transcripción genética. Evidencias recientes indican que los receptores para el CRF 
son regulados por fosforilación en la tercera asa intracelular y en su cola carboxilica por acción 
de la PKC y de las GRKs y por su interacción con las proteínas β-arrestinas (Hauger et al., 
2006). 
 
 19
1.3 CINASAS ACTIVADAS POR MITÓGENO (MAPK) 
Las casacadas de cinasas de proteína activadas por mitógenos (MAP cinasas) son 
componentes frecuentes en la transducción de señales de células eucariótas. Su 
principal función consiste en transducir los estímulos extracelulares reconocidos por 
los receptores de la célula a un gran número de moléculas blanco que en relevo 
integran respuestas intracelulares altamente específicas al estímulo inicial. 
 Las cascadas de MAP cinasas están integradas por tres elementos 
consecutivos: la cinasa de la cinasa de la MAP cinasas (MEKK ó MAPKKK), la cinasa 
de la MAP cinasa (MEK ó MAPKK) y las MAP cinasas (MAPK) (Pearson et al., 
2001;Chang and Karin, 2001) (Figura 8); su secuencia indica el orden en el que los 
componentes se van activando consecutivamente mediante reacciones de fosforilación 
(MEKK→ MEK→ MAPK). Las MEKKs no se encuentran asociadas directamente con el 
receptor membranal, necesitan activarse por componentes intermediarios cuya 
actividad sí puede depender de él, ejemplo de ellos son la PKC, la PKA y las proteínas 
G monoméricas y/o heterotriméricas, si bien estos elementos transductores pueden 
activarse por cross-talk. Los intermediarios que activan a las MEKKs fosforilan 
residuos localizados en los sitios catalíticos de la MEKs y que pueden corresponder a 
dominios de homología a pleckstrina (secuencias con estructuras típicas que facilitan 
la interacción proteína-proteína o proteína-lípido), secuencias ricas en prolina 
involucradas en la unión a SH3, motivos de dedos de Zinc, cierres de leucina, 
secuencias de unión a proteínas G o los residuos fosforilados Ser/Thr (Pearson et al., 
2001;Chang and Karin, 2001). 
Las estructuras primarías de las MEKKs no están conservadas entre sí. Su 
heterogeneidad estructural y la de sus dominios reguladores confiere una serie de 
características muy peculiares a las cascadas de MAP cinasas, como son la 
flexibilidad para responder a una gran variedad de estímulos y la capacidad de activar 
varias cascadas simultáneamente. 
Las MEK se consideran proteínas con doble especificidad, pues además de ser 
activadas por una MEKK corriente arriba, activan a una MAPK corriente abajo. Las 
MEKKs poseen una especificidad muy limitada hacia su sustrato, pues únicamente se 
ha identificado a las MAPKs. 
La activación de las MAPKs requiere la fosforilación de los residuos de treonina 
y tirosina localizados entre los subdominios VII y VIII del núcleo catalítico; su 
estructura primaria, además de incluir esta región catalítica, posee un dominio de 
anclaje común cuya secuencia le permite su unión con las MEKs activadoras, con 
fosfatasas que las inactivan o bien, con los sustratos a los que fosforila, siendo todas 
éstas interacciones excluyentes entre sí. 
 20
En células de mamíferos se ha demostrado que la activación de las MAPKs en 
el citoplasma lleva a su translocación hacia el núcleo donde activan factores de 
transcripción, o a otros sitios del citoplasma en donde fosforilan enzimas especificas 
como cinasa de proteínas, fosfatasas, lipasas, o bien, componentes del citoesqueleto. 
(Chang and Karin, 2001;Pearson et al., 2001). 
En mamíferos se han identificado cuatro subfamilias de cinasas pertenecientes 
a la familia de las MAPKs las cuales son: 1) subfamilia de las ERKs (ERK1/2); 2) 
subfamilia de las Junk (JNK1/2/3); 3) subfamilia de la proteína P38 (P38α/β/γ/δ), y 5) 
subfamilia de las ERK5. Todas estas cinasas son activadas específicamente por 
diferentes MEKs: MEK1/2 para ERK1/2, MKK3/6 para p38, MKK4/7(JNKK1/2) para 
JNKs y MEK5 para ERK5 (Pearson et al., 2001). Cada MEK, de cualquier modo puede 
ser activada por más de una MEKK, incrementando la complejidad y diversidad de la 
señalización de las MAPKs (Figura 8). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8. Cascada de señalización de MAP cinasas. En vertebrados la familia de MAPK esta 
compuesta principalmente por cuatro subgrupos: ERK1/2, ERK5, JNK y P38 los cuales son 
activados por la fosforilación de MAPKKs específicas. Las MAPKKs son activadas en respuesta 
a factores de crecimiento, citocinas y factores de estrés. La activación de las MAPKs lleva a la 
fosforilación de varios sustratos incluyendo a factores de transcripción (ElK-1, Sap 1,c-jun y 
MEF2c), cinasas (p90SRK,MAPKAPK2/3 y SGK) y proteínas del citoesqueleto que son críticos 
para la apropiada respuesta celular ante estímulos extracelulares (Imajo et al., 2006). 
 21
1.3.1 Funciones de las cascadas de MAPKs 
Las MAP cinasas han sido muy estudiadas en levaduras y mamíferos, en donde su 
activación está asociada a respuestas de hipo e hiperosmolaridad, luz ultravioleta, 
agentes genotóxicos, mediadores inflamatorios, choque de calor; también se les ha 
relacionado en la patogénesis de enfermedades como: cáncer, diabetes, distrofia 
muscular, enfermedad de Parkinson y otros desórdenes neurológicos caracterizados 
por muerte celular anormal. Este tipo de enzimas y su señalización intracelular se han 
relacionado con procesos celulares tales como proliferación, desarrollo, 
diferenciación, apoptosis, respuesta inmune y ciclo celular. 
 
1.3.1.1 Papel de las MAPKs en diferentes procesos celulares 
Proliferación: Numerosas publicaciones describen la activación de Raf-1 
(MEKK, de la vía de las ERK1/2, ver figura 8), en la respuesta a varias señales 
mitogénicas, lo cual sugiere que el crecimiento celular es regulado por la cascada de 
MAP cinasas. Existen varias evidencias en las cuales se observa el papel que juega 
MAP cinasas en la proliferación celular; un ejemplo de ello es el que observaron el 
grupo de Miltenberger en 1993 cuando probaron el papel de Raf-1 en la regulación de 
la proliferación celular en la línea NIH-3T3, demostrando que cuando Raf-1 se 
encuentra constitutivamente activa puede acelerar la proliferación celular y que este 
evento es necesario para la activación subsiguiente de respuesta temprana o tardía de 
genes (Miltenberger et al., 1993;Seger and Krebs, 1995). 
Desarrollo y diferenciación: Otra respuesta fisiológica que parece estar 
regulada también por la vía de señalización de las MAP cinasas es la diferenciación 
celular. Diferentes miembros de la cascada de MAP cinasas son implicados en 
procesos tales como diferenciación monocítica, diferenciación neuronal en células 
PC12, maduración de células T, entre otros. Ya que las MAP cinasas son activadas en 
células somáticas en respuesta a muchos estímulos extracelulares, no es 
sorprendente que las MAP cinasas también se encuentren involucradas en procesos 
de proliferación celular que se requieren para el desarrollo y la formación de órganos 
durante el crecimiento de un organismo. 
 Existen infinidad de ejemplos en donde se encuentra bien caracterizada la 
participación de la cascada de las MAP cinasas como es el caso del desarrollo 
embrionario de Drosophila, Xenopus y Caenorhabditis elegans. 
Uno de los sistemas de diferenciación más estudiados es el de las células PC-
12 en el que ambos factores, el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y el factor de 
crecimiento neuronal (NGF) activan la cascada de las MAP cinasas: el EGF induce 
proliferación mientras que el NGF inducela diferenciación celular. 
 22
Ciclo celular: Se sabe que ERK1/2 comparten similaridad con dos proteínas 
cinasas de levadura, KSS-1 y FUS-3. Estas cinasa de levadura funcionan como 
antagonistas en la regulación del ciclo celular en respuesta a factores de crecimiento. 
Estos sugiere que ERK1 /2 pueden estar involucrados en la regulación del ciclo celular 
en células eucariontes en respuesta a señales extracelulares. 
 Además se ha observado que las vías de MAP cinasas pueden regular eventos 
celulares completamente distintos. La activación de las ERK1/2 pude estar involucrada 
en la supervivencia celular, mientras que JNK y p38 participan en la inducción de la 
respuesta contraria es decir en el proceso de apoptosis (muerte celular programada). 
 
1.3.2 Mecanismos de activación de las cascadas de MAPKs 
Las subfamilias de MAP cinasas mejor caracterizadas son las cinasas reguladas 
extracelularmente (ERKs, extracellular regulated kinases) y las cinasas de c-Jun (JNK, 
c-Jun N-terminal Kinase) y las p38-MAPKs (Sugden and Clerk, 1998;Sugden and 
Clerk, 1997;Seger and Krebs, 1995). La activación de las ERKs está asociada a la 
diferenciación y crecimiento celular, inducida por factores de crecimiento. En contraste, 
las JNKs y las p38-MAPKs se encuentran involucradas a la regulación de respuestas 
asociadas al estrés ambiental (Sugden and Clerk, 1997). 
Las ERKs fueron originalmente identificadas como proteínas cinasas que 
fosforilan a la proteína-2 asociada a mocrotúbulos en respuesta a la activación de 
receptores con actividad de cinasa de tirosinas (ó RTKs, receptor tyrosine kinases). La 
cascada de ERK consiste de una secuencia lineal de activación de tres proteínas 
cinasas: Raf (miembro de la subfamilia de MEKK), MEK1/MEK2 (miembro de la 
subfamilia de MEK) y las ERKs. La participación de las ERKs en el crecimiento y la 
diferenciación celular se ha demostrado experimentalmente mediante el uso de 
mutantes constitutivamente activas de MEK, las cuales pueden inducir la 
diferenciación o transformación celular (Cowley et al., 1994;Sugden and Clerk, 1997). 
Un mayor número de evidencias experimentales sugieren que la activación de 
la cascada de las ERKs no solamente es regulada por la activación de los RTKs si no 
también por acción de ligandos que activan a GPCRs (Figura 9). En este contexto, la 
activación de cualquiera de las subfamilias de proteínas G heterotriméricas (Gs, Gi, Gq 
y G12/13) por los GPCRs lleva a la modulación del estado de activación de la cascada 
de las ERKs (Figura 9). Las subfamilias de proteínas G que han sido estudiadas con 
más detalle con respecto a la regulación de la cascada de las MAP cinasas, son las de 
Gq y Gi. 
Aunque las ERKs fueron parcialmente caracterizadas a finales de los años 80s 
y principios de los 90s, las evidencias experimentales claramente demostraron que 
 23
estas cinasas pueden ser activadas por factores de crecimiento que actúan a través de 
la activación de RTKs, y por ésteres de forbol, los cuales activan a la PKC (isoformas 
de PKC dependientes de diacilglicerol (DG) para su activación). Por lo tanto, las 
evidencias anteriores sugirieron que ligandos que activan a GPCRs acoplados a 
proteínas Gq y que activan (a través de DG y Ca2+) a la PKC, también podrían estar 
involucrados en la activación de las ERKs. Estudios subsecuentes dieron evidencia de 
que la activación de algunos GPCRs por sus agonistas, incluyendo al ácido 
lisofosfatídico (LPA), a la endotelina, a la adrenalina, a través de sus receptores β-
adrenérgicos y a la trombina activan a las ERKs a través de una vía sensible a la 
toxina pertussis, dando evidencia de la participación de proteínas Gi/s (Maudsley et al., 
2000;Sugden and Clerk, 1997;Arai et al., 2003). Por otra parte, el hallazgo de que el 
AMPc activa a las ERK en algunas células, sugirió la participación de vías activadas 
por Gs. La transfección de subunidades αs y αq constitutivamente activas en 
diferentes sistemas celulares, llevó a la activación de las ERK, confirmando de esta 
manera la participación de vías reguladas por Gs y Gq. En contraste, diversos estudios 
mostraron que la subunidad αi no parece participar en la activación de MAPK cinasas. 
Sin embargo, también quedo claro que en el caso de vías reguladas por Gi que activan 
a las ERK, es el dímero βγ, mas que αi, el encargado de este evento. 
En años recientes se ha demostrado que diversos GPCRs pueden acoplarse a 
más de una proteína G en un sistema celular determinado, lo que lleva a que las vías 
activadas por dicho acoplamiento converjan en la estimulación de las cascadas de 
MAPK. Ejemplo de lo anterior son los receptores para la endotelina-1, los cuales 
pueden acoplarse a Gq, Gi y G12/13 activando a las ERKs y a JNK en cultivos 
primarios de miocitos de ratas recién nacidas (Arai et al., 2003). Este estudio demostró 
que el acoplamiento específico a un tipo de proteína G determina la vía de MAPK que 
se activa. Mientras que el dímero βγ proveniente de Gi regula la vía de las ERKs, el 
acoplamiento del receptor activo a Gq y G12/13 activa a las JNKs (Arai et al., 2003). 
 24
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 9.Cascadas de señalización de MAP cinasa. La vía de MAP cinasas juega un rol 
central en el control de diversas funciones celulares. Esta vía se liga a muchos receptores de la 
superficie celular, incluyendo los receptores acoplados a proteínas G y sus isoformas, RTKs e 
integrinas y es así como la mayoría de las citocinas, factores de crecimiento, hormonas y 
neurotransmisores pueden activar selectivamente estas cascadas y la activación subsecuente 
de segundos mensajeros intracelulares (www.cellsignal.com). 
 
 25
2. ANTECEDENTES 
 
Las respuestas celulares mitogénicas son generadas principalmente por estimulación 
de los receptores con actividad de cinasa de tirosinas (RTKs) que activan la vía de 
Ras/Raf/Mek/Erk, la cual ha sido ampliamente estudiada. La activación de la vía por 
los GPCRs había sido poco estudiada hasta hace un década, conociéndose sólo que 
el mecanismo involucraba a proteínas G sensibles a la toxina pertussis, y que 
dependía del complejo βγ de la proteína G y de cinasas de tirosina no identificadas. 
Sin embargo, tiempo después apareció un número significativo de investigaciones, las 
cuales indicaron que en ausencia de ligandos para RTKs, la activación de los GPCRs 
inducía la fosforilación de la proteína Shc y la formación del complejo Shc-Grb2, 
siendo ambas proteínas adaptadoras en la activación de la vía Ras/Raf/MEK/ERK a 
través de su unión a las fosfotirosinas de un RTK activado. 
La activación de un RTK en ausencia de su ligando respectivo no era un 
concepto nuevo, ya que anteriormente grupos de investigación tales como los de 
Greenber, Rahmsdorf, Kruijer y Ullrich, entre otros; habían demostrado que el receptor 
para el factor de crecimiento epidérmico (EGF) podía ser regulado al activarse canales 
de Ca2+ dependientes de voltaje, y que tanto este receptor como receptores para la 
insulina y para el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), eran activados 
por radiación ultravioleta (Sachsenmaier et al., 1994). Sin embargo, el hallazgo de que 
los GPCRs, la familia más grande de receptores membranales podría inducir la 
activación de los RTKs y por lo tanto generar señales mitogénicas, llevo a la aparición 
de diversos trabajos. 
El fenómeno de transactivación fue expuesto por el grupo de Ullrich, utilizando 
la línea celular de fibroblastos Rat-1 que expresa diversos GPCRs y al receptor de 
EGF; dicho estudio muestra que la activación de los receptores para la endotelina, el 
ácido lisofosfatídico y la trombina indujo en todos los casos la fosforilación del receptor 
de EGF en ausencia del ligando para este último (Sachsenmaier et al., 1994). 
Dicho fenómeno de transactivación se sabe que ocurre en diferentes especies 
y tipos celulares, entre losque se encuentran la línea celular Rat-1 de fibroblastos 
(Daub et al., 1996;Daub et al., 1997), el cultivo primario de células de músculo liso 
vascular, la línea PC12 derivado de fenocromocitona de rata, la línea celular HaCaT 
de queratocitos, y la línea celular COS-7 de riñón de mono (Linseman et al., 
1995;Daub et al., 1996). 
Estudios iniciales sobre los mecanismos de activación de las ERK1/2 por los 
GPCRs, dieron evidencia de que los mecanismos de activación de estas cinasas no se 
podían explicar del todo en base al modelo clásico de señalización de los GPCRs. Sin 
 26
embargo, estudios recientes han evidenciado que los GPCRs emplean 
aparentemente, distintos mecanismos de activación que varían en función del tipo 
celular y del receptor. En muchos casos la activación de las ERKs por los GPCRs se 
asemeja a la señalización empleada por los receptores con actividad de cinasa de 
tirosina para factores de crecimiento, como el receptor de EGF o el receptor para el 
PDGF. Un hallazgo importante para descifrar parte del mecanismo que emplean los 
GPCRs para activar vías proliferativas, fue el descubrimiento de que los GPCRs son 
capaces de transactivar a al menos dos receptores para factores de crecimiento: al 
receptor para el EGF y al receptor para el PDGF. El receptor para el EGF, también 
identificado como ErbB1 es expresado endógenamente en numerosos tipos celulares, 
incluyendo en neuronas y la corteza cerebral, cerebelo, hipocampo y otras regiones 
del sistema nervioso central. Es un factor importante involucrado en muchos procesos 
biológicamente fundamentales, incluido el ciclo celular, migración celular, metabolismo 
y supervivencia, proliferación y diferenciación celular (Jorissen et al., 2003). 
El CRF es el principal regulador eje hipotálamo, pituitario, suprarrenal 
encargado de la respuesta fisiológica al estrés, definido este último como el estado 
alterado de la homeostasis en un organismo. En el caso del ser humano, éste y su 
mente reaccionan al estrés con la activación repetida del complejo mecanismo 
fisiológico que involucra la activación del eje HPA así como su respuesta periférica 
adaptativa la cual es inadecuada o excesiva y prolongada, ocasionando efectos 
negativos en la conducta y funciones fisiológicas tales como: crecimiento, 
metabolismo, reproducción, circulación, respuesta al sistema inmune entre otros. 
También el estado crónico de estrés puede causar neurodegeneración y conducir a 
desórdenes mentales como la depresión, ansiedad; además de su asociación con 
enfermedades psiquiátricas tales como trastornos alimenticios que desencadenan en 
anorexia (Glowa et al., 1991;Uehara et al., 1998). El incremento de CRF o su 
secreción crónica altera los niveles de ansiedad, patrones de sueño y cambios 
cardiovasculares, metabólicos y funcionales del sistema inmune (Jones, 1990;Wahle 
et al., 2002). 
Información reciente ha demostrado que la activación de los receptores para el 
CRF estimula la vía de las MAPK, en particular de las ERKs1/2, evento en el que solo 
existen un número limitado de evidencias de los mecanismos involucrados tales como 
la participación de la PKA y la PKC en neuronas de hipocampo de rata que expresan 
receptores CRF1 endógenos (Pedersen et al., 2002). En contraste, en células de 
ovario de hámster chino (CHO) que expresan de manera estable tanto a receptores 
CRF1 como CRF2, la activación de las ERK1/2 es independiente de la PKA (Rossant et 
 27
al., 1999). Sin embargo, aún son poco claros los mecanismos activados por CRF a 
través de sus receptores que llevan a la activación de la vía de las ERKs. 
La activación de las ERK1/2 por CRF se ha asociado a la citoprotección, la 
diferenciación celular y posiblemente con la contractilidad del miometrio. Estudios 
recientes sugieren que la activación de la vía de las MAPK participa en la regulación 
de la proliferación, supervivencia y adaptación celular. El presente trabajo permitirá 
conocer los mecanismos involucrados en la regulación de las vías de MAPK por el 
CRF a través de la activación de los receptores CRF1, generando de esta manera 
conocimientos de investigación básica para el desarrollo posterior de terapias 
farmacológicas destinadas a la disminución del estrés inducido por la hipersecreción 
de CRF. 
 
 28
3. OBJETIVOS 
 
Objetivo General 
Estudiar los mecanismos por los cuales el factor liberador de corticotropinas, a través 
del receptor CRF1, regula la actividad de las MAPK (ERK1/2) en células COS-7. 
 
 
Objetivos Particulares 
• Identificar el papel de la PKA y la PKC, importantes mediadores de las 
acciones del factor liberador de corticotropinas, en la regulación de las 
ERK1/2. 
 
• Estudiar el papel de la transactivación del receptor para el factor de 
crecimiento epidérmico como posible regulador de las acciones de CRF 
sobre la regulación de la actividad de las ERK1/2. 
 
• Estudiar el papel de las proteínas de cinasa de tirosina Src y PYK2 como 
proteínas involucradas en la posible regulación de CRF sobre la activación 
de MAPK. 
 
• Evaluar el papel del complejo βγ sobre las acciones de CRF en la 
activación de las ERK1/2. 
 
 
 29
4. HIPÓTESIS 
 
 
Ya que en muchos casos la activación de las ERKs por los GPCRs se asemeja a la 
señalización empleada por los receptores con actividad de tirosina cinasa para 
factores de crecimiento, entonces el mecanismo de transactivación de estos 
receptores podría ser el implicado en la regulación de las acciones del CRF sobre la 
actividad de las MAPKs, sin descartar la activación de vías independientes de la 
transactivación que involucren la participación de diferentes cinasas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 30
5. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
Cultivo Celular 
Para la realización del presente proyecto se utilizó como modelo de estudio celular a 
las células COS-7 (ATCC, Manassas,VA), fibroblastos provenientes de riñón de mono 
verde africano Cercopithecus aethiops. Las células COS-7 fueron cultivadas en medio 
DMEM (Dulbecco´s modified Eagle´s médium) suplementado con 10% (v/v) de suero 
fetal de bovino, 100µg/ml de estreptomicina y 100IU/ml de penicilina (medio completo). 
Las células fueron mantenidas en una atmósfera húmeda con 5% de CO2 a 37 °C. 
Todos los reactivos empleados para el cultivo celular fueron obtenidos de la compañía 
Invitrogen/GIBCO,BRL. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Figura 10. Células COS-7 (ATCC, Manassas,VA). 
 
Transfección Celular 
La transfección transitoria es una herramienta muy importante para el estudio y control 
de la expresión de genes. Cuando una célula es transfectada transitoriamente, el DNA 
es introducido al núcleo de la célula pero no se integra a los cromosomas, generando 
una alta expresión temporal de la proteína de interés, por medio de los promotores que 
contiene el DNA introducido. 
Las células COS-7 fueron transfectadas en cajas de 10 cm a una confluencia 
de entre 70 y 80 %, con el plásmido pcDNA3.1/CRF1R que contiene la secuencia del 
receptor CRF1 (Dautzenberg et al., 1999). Para ello se empleó la técnica de liposomas 
catiónicos utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen/GIBCOBRL), siguiendo las 
especificaciones del fabricante. Dicha técnica se basa en la formación de complejos 
entre lípidos catiónicos y DNA; el complejo tiene afinidad por la membrana y permite la 
entrada del DNA en el citosol. Después de 24 horas de la transfección las células, 
fueron resembradas en cajas de 6 pozos y utilizadas para los experimentos. 
 
 31
Cotransfecciones célulares 
En algunos experimentos las células COS-7, con una confluencia de entre 70 y 80 % 
fueron cotransfectadas en cajas de 10 cm, con los plásmidos pcDNA3.1/CRF1R y 
pRK5/ct- βARK, que contiene la secuencia carboxilo terminal de la cinasa del receptor 
β-adrenérgico (ct-βARK) (0.5µg/µl/ 0.755µg/µl respectivamente). 24 horas después de 
la transfección las células, fueron resembradas en cajasde 6 pozos y utilizadas para 
los experimentos. El plásmido pRK5/ct- βARK fue amablemente donado por el Dr. 
Walter Koch (Profesor e investigador de la Universidad CSC Australia) (Koch et al., 
1994). 
 
Ensayos de Western Blot 
El día del experimento, a las células transfectadas se les retiró el medio completo y se 
mantuvieron en medio sin suero por 6 horas. Transcurrido este tiempo se realizaron 
estimulaciones con los agentes indicados (CRF, UCN-I, EGF ó TPA) por diferentes 
tiempos y concentraciones. Cuando se emplearon inhibidores específicos para 
diferentes cinasas (bisindolilmaleilmida I, BIM; H89 dihydrocloride; tyrfostin, AG1478; 
wortmanina, y PP2), éstos fueron incubados por 30 minutos a las concentraciones 
indicadas antes de los estímulos con los agonistas. 
 Después de los estímulos, el medio fue removido y las células se lavaron dos 
veces con buffer de fosfatos (PBS, NaCl 137mM, KCL 2.1mM, Na2HPO4O 10mM, 
KH2PO4O 2mM, pH 7.4) frío y lisadas con 100 µl de buffer Laemmli 1X (SDS-protein 
gel loading solution 2X Quality Biological, INC, β-mercaptoetanol y agua). Las 
muestras fueron sonicadas dando pulsos de 40 Khz durante 5 seg/muestra (Sonios 
Vibra cell TM, Utrasonic Processor), se calentaron a 95°C por 5 minutos (Termomixer 
Comfort eppendorf) y finalmente se centrifugaron a 13,000 rpm durante 5 minutos 
(MiniSpinPLUS eppendorf). Los sobrenadantes se cargaron en geles de poliacrilamida 
al 8 ó 10% y se realizó una electroforesis durante hora y media. Al término de la 
corrida las proteínas se transfirieron a membranas PVDF por medio de una cámara de 
transferencia semiseca por una hora y media, a 15V. Las membranas fueron 
incubadas con los anticuerpos primarios durante toda la noche a 4°C y posteriormente 
se lavaron las membranas 3 veces con buffer TBS-Tween (Tris-base 20 mM, NaCl 137 
mM y Tween 20 0.1%-0.5%, pH 7.5), antes de su incubación con anticuerpos 
secundarios, conjugados con la peroxidasa de rábano (HRP) por una hora a 
temperatura ambiente. Las membranas fueron visualizadas con ECL (reactivo de 
inmunudetección de proteinas por quimioluminicencia por sus siglas en inglés 
enhanced chemiluminescence reagent, Amersham Biosciences) y cuantificadas con un 
densitómetro (Fotodyne incorpoted). 
 32
Detección de fosfo-MAPK por Western Blot 
Para la detección de las ERK1/2 activas y fosforiladas, se utilizó como anticuerpo 
primario anti-fosfo-p44/42 MAPK (Thr202/Tyr204) (Cell Signaling Technology) a una 
dilución de 1:4000 y como anticuerpo secundario HRP anti–ratón, a una dilución de 
1:3000 (Amersham Bioscience). 
 
 
Detección de fosfo-EGF (pY1173) y fosfo-EGF (pY845) por Western Blot 
Para la detección del receptor de EGF fosforilado, se utilizó como anticuerpo primario 
anti-fosfo-EGFR [pY1173] a una dilución de 1:2000 (Biosource), y como anticuerpo 
secundario HRP-conjugado anti- conejo a una dilución de 1:5000 (Zymed). 
 
 
Detección de fosfo-Src y fosfo –PYK2 por Western Blot 
Para la detección de la cinasa Src fosforilada, se utilizó el anticuerpo anti-fosfo-Src 
(pTyr 416) a una dilución de 1:1000 (Cell Signaling Technology), y como anticuerpo 
secundario HRP-conjugado anti-conejo a una dilución de 1:2000 (Zymed), y para la 
detección de PYK2 fosforilada se utilizó el anticuerpo anti-PYK2 (pTyr402) a una 
dilución de 1:1000 (Calbiochem), y como anticuerpo secundario HRP-conjugado anti-
conejo a una dilución de 1:3000 (Zymed/Invitrogen). 
 
 
Detección de fosfo-Akt por Western Blot 
Para la detección de la cinasa Akt fosforilada, se utilizó el anticuerpo anti-fosfo-Akt-1 
(pSer 473) clona SK703 (Upstate/Millipore), a una dilución de 1:2500 y como 
anticuerpo secundario se utilizó HRP-conjugado anti- conejo, a una dilución de 1:5000 
(Zymed/Invitrogen). 
 
 
Detección de PI3-K P110β por Wester Blot 
Para la detección de la isoforma β de PI3-K, se utilizó como anticuerpo primario anti-
PI3-Kinase, a una dilución de 1:2000 se utilizó secundario HRP-conjugado anti–
conejo, a una dilución de 1:3000 (Zymed/Invitrogen). 
 33
Análisis de resultados 
Por cada experimento se realizan al menos tres repeticiones para tener al menos una 
n=3. Para cuantificar los Western Blott se utilizó el programa CollageTM Worksheet 
Versión 3.0 (Fotodyne Incorporated). Los datos de Western Blott son reportados como 
unidades arbitrarias de la ∑píxeles – ∑del fondo ± error estándar. Para determinar las 
diferencias estadísticas se realizó la prueba de ANOVA, utilizando como prueba de 
comparación múltiple, post- test Bonferroni y Dunnett utilizando el programa de 
estadística GraphPad Prism 4.0 y tomando como diferencias significativas a p≤0.05. 
 34
6. RESULTADOS 
 
6.1 Efectos del CRF y EGF sobre la activación de las ERK1/2 
Con el fin de establecer el efecto del CRF sobre la activación de la cascada de las 
MAP cinasas en células COS-7 que sobreexpresan al receptor CRF1, se evaluó el 
efecto de 100nM de CRF, el cual induce una rápida activación de las ERK1/2, con 
efecto máximo a los 5 minutos el cual se mantiene hasta los 10 minutos para 
posteriormente disminuir después de 15 minutos de estímulo (Figura 11A). Este efecto 
fue también dependiente de la concentración del CRF, ya que como se observa en la 
figura 11B, el CRF induce una clara activación de las ERK1/2 a partir de 1 nM, 
alcanzando una estimulación cercana al efecto máximo a una concentración de 
1000nM. Como un control positivo de la funcionalidad del sistema celular y del efecto 
de CRF, se evaluó también el efecto del EGF, para el cual las células COS-7 expresan 
receptores endógenos. Como se observa en las figuras 12A y 12B respectivamente, el 
EGF induce una clara activación de las ERK1/2 en función del tiempo y de su 
concentración. Por otra parte, también se estudió el efecto de la urocortina I (UCN-I), 
uno de los agonistas del receptor CRF1, sobre la fosforilación de las ERK1/2 en células 
COS-7 transfectadas con el receptor CRF1. En la figura 11C se observa que a 5 y 10 
minutos de estímulo con 100nM de UCN-I, se incrementa la fosforilación de las 
ERK1/2 de manera similar al efecto con CRF. 
De esta manera, los datos anteriores sugieren que el CRF induce la activación 
de las ERK1/2, un efecto que depende tanto de la concentración como del tiempo de 
estímulo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 35
 
 
0 2 5 10 15 30
0
500
1000
1500
2000
Tiempo (min)
Fo
sf
or
ila
ci
ón
 d
e 
la
s
ER
K
1/
2
(%
 d
el
 b
as
al
)
A) 
 
 
 
 
 
 
0 0.1 1 10 100 1000
0
500
1000
1500
CRF [nM]
Fo
sf
or
ila
ci
ón
 d
e 
la
s
ER
K
1/
2
(%
 d
el
 c
on
tr
ol
)
B) 
 
 
 
 
 
 
C) 
 
 
 
 C CRF5' CRF10' C UCN5' UCN10'0
100
200
300
400
500
600
700
Fo
sf
or
ila
ci
ón
 d
e 
la
s
ER
K
1/
2
(%
 d
el
 c
on
tr
ol
)
 
Figura 11. Efecto del CRF sobre la activación de las ERK1/2. Células COS-7 fueron 
transfectadas con el plásmido que contiene la secuencia del receptor CRF1. A) Las células 
fueron estimuladas con 100 nM de CRF por 2, 5, 10, 15 y 30 minutos. B) Ensayos de dosis-
respuesta fueron realizados empleado diferentes concentraciones de estímulo con CRF (1nM-
100nM), por 5 min. C) Las células fueron estimuladas con 100 nM de CRF y UCN-1 por los 
tiempos indicados. En todos los casos (A, B y C), extractos totales de células COS-7 fueron 
obtenidos y se determinó la presencia de las ERK1/2 en su estado fosforilado mediante la 
técnica de Western blot que fue descrita en la sección de materiales y métodos. Las gráficas 
representan el promedio de entre 3-5 experimentos ± el error estándar. Imágenes 
representativas de cada experimento y de la cantidad total de proteína, que se muestra como la 
cantidad total de la cinasa Akt, se presentan a la izquierda de cada gráfica. 
 
 
 
 36
 
 
A) 
 
 
 
0 2 5 10 15 30
100
300
500
700
900
Tiempo (min)
Fo
sf
or
ila
ci
ón
 d
e 
la
s
ER
K
1/
2
(%
 d
el
 b
as
al
)
 
 
 
B) 
 
 
 
0.01 0.1 1 10 100
0
200
400
600
800
1000