Papel-del-factor-inhibidor-de-la-migracion-de-macrofagos-MIF-en-la-respuesta-inmune-innata-a-la-infeccion-por-Toxoplasma-gondii-en-un-modelo-murino

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U N I V E R S I D A D N A C I O N A L A U T O N O M A 
 D E M É X I C O 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 TLALNEPANTLA, ESTADO DE MÉXICO NOVIEMBRE 2007 
 
 
IZTACALA 
 
 FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA 
T E S I S 
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE: 
B I O L O G O 
P R E S E N T A : 
M A R C O S F L O R E S R E Y E S 
 
 DIRECTORA DE TESIS: DRA. MIRIAM RODRÍGUEZ SOSA 
 
Papel del factor inhibidor de la migración de macrófagos 
(MIF) en la respuesta inmune innata a la infección por 
Toxoplasma gondii en un modelo murino. 
 
 
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respectivo titular de los Derechos de Autor. 
 
 
 
A mis padres y hermanos, quienes siempre me han dado todo su apoyo. Gracias por 
todo su cariño. Los amo. 
 
A toda mi Familia, con mucho cariño para todos. 
 
A mi gran amigo Rick Gardner. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Dedicado a una bella dama, 
quien me enseñó 
el verdadero significado del amor 
a mi querida mamá Emily. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Agradecimientos 
 
Con especial dedicatoria a la Dra. Miriam Rodríguez Sosa y Dr. Ignacio Terrazas. 
Gracias por todo el apoyo brindado. 
 
A Irma Rivera, Gracias por su apoyo y valiosas observaciones en la realización de este 
trabajo. 
 
Al Dr. John David y Dr. Abhay Satoskar por la donación de los ratones transgenicos. 
 
Al Dr. Rafael Saavedra por la donación de la cepa del parásito. 
 
A todos mis sinodales, por sus valiosos consejos y observaciones. 
 
A todos mis compañeros de laboratorio, por su amistad. 
 
 
 
 
 
 
 
Este trabajo fue apoyado por los proyectos: 
 
PAPIIT IN2086-06 
CONACYT 49812-Q 
PAPCA 2006 – 2007 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
GRACIAS A TODOS. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El hombre se forma o se aniquila a sí mismo. 
Mediante una elección adecuada, asciende. Como 
un ser de poder, inteligencia y amor y como el 
amo de sus propios pensamientos, él guarda la 
llave para cada situación... 
JAMES ALLEN 
 
Indice 
 
1. Lista de abreviaturas 1 
 
2. Resumen 2 
 
3. Introducción 4 
 3.1 Principios de la inmunidad innata y adaptativa 4 
 3.1.1 Inmunidad Innata 4 
 3.1.2 Inmunidad Adaptativa 5 
 3.2 Factor inhibidor de la migración de 
 macrófagos (MIF) 6 
 3.3 Antecedentes de MIF 7 
 3.4 La Toxoplasmosis 10 
 
4. Justificación 14 
 
5. Hipótesis 14 
 
6. Objetivo general 15 
 6.1 Objetivos particulares 15 
 
7. Material y métodos 16 
 7.1 Animales 16 
 7.2 Confirmación del genotipo por PCR 16 
 7.2.1 Amplificación del gen 17 
 7.2.2 Electroforesis 17 
 7.3 Infección y mantenimiento de la cepa 
 del parasito en laboratorio 18 
 7.4 Sobrevida 18 
 7.5 Parasitemia 18 
 7.5.1 Nivel de parasitemia en cerebro por PCR 19 
 7.5.2 Electroforesis 19 
 7.6 Obtención de suero 20 
 7.7 Determinación de anticuerpos específicos 
 en suero 20 
 7.8 Detección de citocinas en suero 21 
 7.9 Análisis de nitrito total 21 
 7.10 Citometría de flujo 22 
 7.11 Histología 23 
 7.12 Análisis estadístico 23 
 
8. Resultados 24 
 
9. Discusión 41 
 
10. Conclusiones 47 
 
11. Apendice 1 48 
 
12. Apendice 2 50 
 
13. Referencias Bibliográficas 51 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2. Resumen 
 
Los microorganismos que causan patología en humanos y animales entran al 
cuerpo por diferentes sitios y son capaces de producir enfermedades por una gran 
variedad de mecanismos. Las invasiones son inicialmente enfrentadas por mecanismos 
de defensa innata preexistentes que actúan en minutos una vez que se enfrentan con el 
agente infeccioso, pero cuando las defensas innatas del huésped son evadidas se genera 
una respuesta inmune adaptativa. Una respuesta inmune ya sea innata o adquirida, 
requiere de la interacción de diferentes moléculas, células y tejidos. El factor inhibidor 
de la migración de macrófagos (MIF) es una citocina pleiotropica producida durante la 
respuesta inmune por células T activadas, monocitos, macrófagos, células dendríticas y 
en una gran variedad de células no inmunes, como en las células de la pituitaria 
anterior. MIF ha sido asociada con funciones pro-inflamatorias y es sobre-expresada 
bajo varias condiciones patológicas en varias enfermedades inflamatorias como artritis 
reumatoide. En este trabajo determinamos la participación de MIF en la susceptibilidad 
y/o resistencia a la toxoplasmosis experimental. La toxoplasmosis es una enfermedad 
considerada como oportunista y es causada por el protozoario intracelular Toxoplasma 
gondii, capaz de infectar virtualmente cualquier animal vertebrado de sangre caliente, 
incluyendo humanos. Puede infectar cualquier órgano y permanecer en forma de quiste 
tisular que provoca una reacción inflamatoria y una reacción inmunológica con la 
formación de anticuerpos, limitando el crecimiento del mismo, quedando los parásitos 
en vida latente, durante toda la vida del hospedero o hasta que suceda un evento 
inmunodepresivo. Durante el embarazo, T. gondii puede infectar al feto y provocar 
daño severo en el desarrollo o muerte fetal. Una respuesta inmunológica tipo Th1 es 
esencial para la protección contra este parásito intracelular. La participación de MIF en 
esta infección se abordo utilizando ratones deficientes del gen MIF (MIF-/-) y ratones 
silvestres (MIF+/+) ambos con fondo genético Balb/c. Estos ratones se inocularon vía 
i.p. con 40 quistes de la cepa semi virulenta ME49 de T. gondii. Los ratones MIF-/- 
desarrollaron severos signos clínicos de enfermedad y alta mortalidad a la infección con 
T. gondii, mientras que los ratones MIF+/+ sobrevivieron a la infección. Esto 
correlacionó con un mayor numero de quistes en el cerebro de los ratones MIF-/- 
comparado con los ratones MIF+/+. Estas observaciones en los ratones MIF-/- fueron 
acompañadas de bajos niveles de IL-12, IFN-gamma, TNF-alfa, oxido nítrico, 
implicando una reducida respuesta tipo Th1, asociada al incremento a la susceptibilidad 
a la infección. Por otro lado el reclutamiento de linfocitos TCD4+, TCD8+ y células 
NK, no se vio modificado en ambos grupos experimentales, tampoco el receptor para 
IL-10. Sin embargo se encontraron disminuidos los receptores para IFN-γ y TNF-α en 
macrófagos de los animales MIF-/-, además también mostraron modificada la expresión 
de CCR5. El análisis histológico de hígado revelo una hepatitis reactiva no específica 
en los ratones MIF-/- mientras que en los ratones MIF+/+ el daño fue menor. Estos 
datos nos indican que MIF es un mediador clave para controlar esta enfermedad, ya 
que la respuesta inmune innata es seriamente afectada en los ratones deficientes para 
este gen. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3. Introducción 
Los microorganismos que causan patología en humanos y animales entran al 
cuerpopor diferentes sitios y son capaces de producir enfermedades por una gran 
variedad de mecanismos. Las invasiones por organismos patógenos son inicialmente 
enfrentadas en todos los vertebrados por mecanismos de defensa innata que preexisten 
en todos los individuos y que comienzan a actuar en minutos una vez que se enfrenta 
con el agente infeccioso. Solamente cuando las defensas innatas del hospedero son 
desviadas, evadidas o abrumadas es entonces cuando se requiere una respuesta inmune 
adaptativa (37). La generación de una respuesta ya sea inmune innata o adquirida, 
requiere de la interacción de diferentes moléculas, células y tejidos. El sistema inmune 
incluye las moléculas, células, tejidos y órganos, que son asociados con la inmunidad 
adaptativa, así como los mecanismos de defensa del hospedero (19). 
 
3.1 Principios de la inmunidad innata y adaptativa 
3.1.1 Inmunidad Innata 
La inmunidad innata es la primera línea de defensa contra agentes infecciosos. 
Los mecanismos de la inmunidad innata existen antes del encuentro con los organismos 
patógenos y son rápidamente activados por estos microbios antes de que se genere una 
respuesta adaptativa. La inmunidad innata es un mecanismo de defensa poderoso, pero 
un tanto inespecífico basado en mecanismos físicos, bioquímicos y celulares de defensa 
como el epitelio, que constituye una barrera física que impide la entrada de microbios. 
Filogenéticamente es un mecanismo de protección primitivo, ya que esta presente en 
todos los organismos multicelulares incluyendo vegetales y animales, los mamíferos 
reconocen específicamente patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) a 
través de receptores tipo Toll-like receptors (TLRs). La respuesta inmune innata 
incluye células fagocíticas como macrófagos y neutrófilos, citotóxicas como las 
asesinas naturales (NK) y granulocitos como eosinófilos y basófilos. La inmunidad 
innata también actúa reclutando respuestas antígeno-especificas, no solo atrayendo 
células al sito de infección, también a la presentación de antígeno por las células 
dendríticas que transportan antígeno al tejido linfoide para activar respuestas inmunes 
primarias. La respuesta inmune innata también participa en la producción de citocinas 
que pueden regular la calidad de la respuesta inmune a través de cascadas de 
señalización para coordinar la respuesta inmune, así como la activación del sistema 
complemento para lisar a los patógenos. Este tipo de inmunidad carece de memoria 
inmunológica, ya que un encuentro previo con un antígeno (Ag) no garantiza que se 
genere una respuesta de manera más rápida, ni más amplificada en el segundo 
encuentro con el mismo Ag (1). 
 
3.1.2 Inmunidad Adaptativa 
La generación de una respuesta inmune adaptativa tiene la capacidad de responder 
al tipo de infección y distinguir entre diferentes microbios y moléculas, además de 
generar memoria inmunológica manteniendo o almacenando células adaptadas para 
dicho estimulo conocido. Esta comienza cuando un patógeno es ingerido por una célula 
dendrítica inmadura en el tejido de infección. Estas células profesionales fagocíticas 
son residentes de la mayoría de los tejidos y migran a través de la linfa para 
interaccionar con linfocitos vírgenes recirculantes. 
Existen dos tipos diferentes de linfocitos: los linfocitos B provenientes de la 
medula ósea, los cuales cuando son activados en células plasmáticas secretan 
anticuerpos específicos para cada patógeno, ayudados por las células presentadoras de 
antígeno (APC), por macrófagos y moléculas del complejo mayor de 
histocompatibilidad MHCI y MHCII, reconocidas por linfocitos CD8 y CD4 
respectivamente (1). 
 Los linfocitos T, también provienen de la medula ósea, pero maduran en el timo 
y cuando son activados, activan otras células como linfocitos B y macrófagos. Los 
linfocitos son capaces de montar respuestas inmunes específicas virtualmente contra 
cualquier antígeno extraño. Esto es posible ya que cada linfocito madura portando una 
variante única de receptor de antígeno, de tal forma que la población de linfocitos B y T 
portan un gran repertorio de receptores altamente diversos en los sitos de unión 
antígeno. Los linfocitos T se subdividen a su vez en linfocitos T citotóxicos (CTL) o 
células con el marcador de membrana CD8, encargadas de eliminar células infectadas o 
posibles células tumorígenas, y en linfocitos T cooperadores (helper) CD4, los cuales se 
pueden diferenciar en células Th1 o Th2, dependiendo del tipo de citocinas y capacidad 
de coordinar la respuesta celular a través de la producción de estas citocinas. Estos dos 
tipos de subpoblaciones celulares derivan de un precursor preinmune o virgen, 
denominado subpoblación Th0, localizado en los nódulos linfáticos, que se diferencia 
en Th1 o Th2 según el tipo de antígeno presentado por el complejo mayor de 
histocompatibilidad (MHC) por las células presentadoras de antígeno (APC), y por el 
microambiente local de citocinas (66). Así, en presencia de linfocitos T CD8α+ y/o 
interferón-gamma (IFN-γ), los precursores Th0 se diferencian en linfocitos Th1. Este 
proceso es dependiente de transducción de señal, con participación del factor activador 
de transcripción-1 (STAT-1), así como del factor de transcripción T-bet (51, 25). De 
manera análoga, en presencia de linfocitos T CD8α- e IL-4, los linfocitos Th0 derivan 
en Th2. Este proceso incluye la transducción de señales por STAT-6 y la activación de 
varios factores de transcripción, como GATA-3, NFATc y c-maf (75, 58). 
Las células cooperadoras Th1 se caracterizan por la secreción de citocinas pro-
inflamatorias como: interleucina IL-2, interferón gamma (IFN- ) y el factor de necrosis 
tumoral alfa (TNF- ), lo cual promueve la generación de linfocitos T citotóxicos y de 
células asesinas naturales NK (65) mientras que las células cooperadoras tipo Th2 
producen IL-4, IL-5, IL-10, e IL-13, también conocidas como citocinas anti-
inflamatorias y son citocinas involucradas en la proliferación y diferenciación de los 
linfocitos B en células plasmáticas secretoras de anticuerpos. Las citocinas tipo Th1 son 
importantes promotores de la respuesta inmune mediada por células, mientras que las 
citocinas Th2 inducen la respuesta inmune mediada por anticuerpos (74). 
Adicionalmente, hay un mecanismo de autorregulación entre linfocitos y citocinas Th1 
y Th2, de modo que cada subpoblación de linfocitos es capaz regularse negativamente 
una a la otra promovido por el patrón de citocinas opuesto (49). 
 
3.2 Factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF) 
El factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF) fue una de las primeras 
citocinas en ser descrita a mediados de la década de los años 60 como un producto 
secretado por linfocitos T activados. En un inicio MIF se relacionó con linfocitos T 
activados y con la respuesta de hipersensibilidad retardada y, como su nombre lo indica, 
por inhibir la migración azarosa de los macrófagos (11, 21). Durante dos décadas, 
fueron pocos los nuevos descubrimientos alrededor de esta molécula, sin embargo, en 
los últimos 10 años ha renacido el interés por estudiar la participación de MIF en la 
respuesta inmune, reconociéndose a MIF como una molécula fundamental en la 
regulación de la respuesta inmune debido a su amplio rango de efectos inmunológicos. 
MIF es una citocina con acción pleiotropica, es producida en el sistema inmune, 
además de los linfocitos (4), por monocitos, macrófagos, células dendríticas, células B, 
neutrófilos, eosinófilos, mastocitos y basófilos (14) y en una gran variedad de células 
no inmunes, como en las células de la pituitaria anterior (8), células parénquimales en el 
hígado, cerebro, riñón y células del páncreas (3, 42, 76). Notablemente, en muchos de 
estos tejidos la expresión y producción de MIF es significativamente sobre-expresada 
bajo condiciones patológicas como son la arteroesclerosis,glomérulonefritis, esclerosis 
múltiple, colitis, diabetes tipo 2 y pancreatitis (3, 45), implicando, en todos los casos, 
que MIF participa en los procesos de la enfermedad. Estas observaciones se han 
corroborado usando anticuerpos neutralizantes para MIF y/o ratones deficientes para el 
gen que codifica para MIF. Quedando claramente demostrado que MIF es un mediador 
crucial que participa activamente en diversos desordenes inmuno-inflamatorios como 
glomérulonefritis (12, 42), artritis, encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) 
(22), miocarditis autoinmune experimental (EAM) (45), sepsis Gram-negativa (6, 7, 13, 
16, 56) y Gram-positiva (18, 56), hipersensibilidad de tipo retardada (11, 21), colitis y 
asma (47). 
El desarrollo específico de anticuerpos (Ac) neutralizantes anti-MIF (77), así 
como la clonación del cDNA humano y murino que codifica para MIF (79) impulsó el 
estudio de esta molécula, permitiendo, el análisis de las características biológicas, 
bioquímicas, biofísicas, y las funciones de esta citocina. Sin embargo, a pesar de estos 
avances aún no se ha establecido específicamente como MIF ejerce estos efectos sobre 
células inmunes y no inmunes. Por ejemplo, no se ha identificado un receptor específico 
para MIF y solo se ha descrito la unión de MIF a la molécula CD74 sin establecerse 
definitivamente que esta sea la vía de señalización utilizada para ejercer sus efectos 
(15). 
 
3.4 La Toxoplasmosis 
La toxoplasmosis es una enfermedad considerada como oportunista y es causada por 
el protozoario-intracelular Toxoplasma gondii, capaz de infectar virtualmente cualquier 
animal vertebrado de sangre caliente (9) y puede generar severas enfermedades, a veces 
fatales como encefalitis. T. gondii es un importante patógeno del agua y comida que 
puede ser adquirido después del nacimiento por dos vías: 1) por ingesta de ooquistes: un 
tipo de espora que se encuentra en las heces de los gatos (Fig. 1a), ó 2) por el consumo 
de carne contaminada con quistes de animales intermediarios crónicamente infectados 
(Fig. 1b). Aproximadamente una cuarta parte de la población de los E.U. (3) y 
aproximadamente 1 billón de humanos en el mundo están crónicamente infectados con 
el parásito T. gondii (60). 
 T. gondii realiza dos ciclos en la naturaleza y requiere como hospedero definitivo a 
miembros de la familia Felidae (gato doméstico o silvestre), (Fig. 2). El ciclo intestinal 
sucede solamente en felinos cuando ingieren tejidos animales contaminados por el 
protozoario o huevos infectantes del medio ambiente. Los parásitos pasan al intestino, 
se reproducen sexualmente y forman huevos ooquistes, que se eliminan con la materia 
fecal. Al cabo de 1-5 días maduran en el medio ambiente y se convierten en ooquistes 
infectantes que se diseminan por aire, agua e insectos. El ciclo extraintestinal sucede 
cuando los ooquistes maduros son ingeridos por otros animales incluyendo a los felinos, 
el parásito pasa del intestino a la sangre y se dirige hacia cualquier tejido (músculo, 
ojos, tejido nervioso, ganglios, hígado, etc. (26, 30). Así, la fase aguda de la infección 
esta marcada por la proliferación de taquizoitos de crecimiento rápido que pueden 
invadir diversos órganos, mientras que en la fase crónica los taquizoitos logran 
enquistarse en los tejidos como bradizoitos de crecimiento lento. Una vez llegado al 
órgano, el bradizoito se reproduce en forma asexual, formando quistes tisulares que 
provocan una reacción inflamatoria y una reacción inmunológica con la formación de 
anticuerpos, limitando el crecimiento del mismo, quedando los parásitos en vida latente, 
durante toda la vida del hospedero o hasta que suceda un evento inmunodepresivo. 
 
 
a) b) 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1.- a) ooquiste de T. gondii en heces de gato domestico, y b) quiste de T. gondii en 
cerebro de ratón (contiene miles de bradizoitos). 
 
 La patología de la fase aguda se caracteriza por la alta proliferación de taquizoitos 
que se disemina en el hospedero. En individuos inmuno-competentes esta fase puede ser 
asintomática, sin embargo varios síntomas pueden presentarse como encefalitis, 
neumonía y retinocoroiditis (33). En la fase crónica, donde el parásito puede 
diferenciarse en bradizoitos de crecimiento lento, los individuos inmunodeficientes, 
como los que presentan SIDA, puede ocasionarles la muerte por encefalitis si no se 
tratan (34). En mujeres embarazadas los taquizoitos cruzan la placenta e infectan los 
tejidos finos del feto y pueden provocar aborto, o alteraciones fetales que conllevan 
malformaciones y discapacidad mental. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2.- Ciclo de vida de Toxoplasma gondii. El gato elimina ooquistes por medio de las 
heces, los cuales pueden ser ingeridos por hospederos intermediarios como el cerdo y 
establecerse en forma de quiste tisular que puede infectar a humanos a través del consumo 
de carne mal cocida o por medio de la ingesta directa de ooquistes. 
 
Utilizando modelos murinos de infección con T. gondii, se ha establecido que la 
respuesta inmune se caracteriza por la inducción vigorosa de la respuesta mediada por 
células tipo Th1, y altos niveles de IFN- , que resultan necesarios para el control del 
parásito, tanto en la fase aguda como en la crónica (55, 81). La infección inicial por 
este parásito estimula una potente respuesta de citocinas proinflamatorias 
particularmente de interleucina IL-12 que lleva a la producción de IFN- que a su vez 
lleva al control de la replicación del parásito y genera protección (29, 32, 71). 
Estudios in vivo e in vitro han demostrado que neutrófilos (10) y macrófagos (71) 
producen altos niveles de IL-12 cuando son estimulados simultáneamente con IFN- y 
antígenos (Ags) de T. gondii (28), mientras que las células dendríticas (DC) producen 
IL-12 directamente en respuesta a Ags de T. gondii in vitro e in vivo (24, 59, 72). La 
Hospedero 
definitivo 
Ooquistes esporulados 
 en agua y comida 
Hospederos 
intermediarios 
Ingesta de Quistes en 
carne infectada 
Taquizoitos 
 transmitidos 
a través de 
la placenta 
 
inducción temprana de IL-12 en respuesta a Ags de T. gondii es dependiente del factor 
de diferenciación mieloide 88 (MyD88) (69), una proteína adaptadora crucial en la vía 
de señalización de los receptores tipo Toll-like receptors (TLRs) (73), sugiriendo así un 
importante papel de la respuesta inmune innata en el control de la infección a través de 
la existencia de estos receptores (TLRs) en las células dendríticas, capaces de reconocer 
directamente a los antígenos de este parásito (27), lo que promueve rápidamente una 
respuesta inflamatoria y de tipo Th1 que ha sido asociada a resistencia. Lo anterior ha 
sido confirmado en pacientes con cáncer y SIDA, quienes presentan una respuesta 
inmune comprometida, ya que cuando hay una infección latente con T. gondii esta 
infección se manifiesta (35). 
 
Aún cuando la participación de MIF en la respuesta inmune a infecciones 
parasitarias no esta bien definida, se ha propuesto que MIF participa regulando la 
expresión de moléculas importantes para el control de diversos parásitos pero aún no se 
conoce el mecanismo exacto por el cual esta citocina actúa para contener el crecimiento 
parasitario. 
 
3.3 Antecedentes de MIF 
En los últimos años se han descrito diversas características de MIF, incluyendo su 
destacado papel en la regulación de la respuesta inmune innata activando distintos tipos 
de células centrales en esta primera línea de defensa, como macrófagos (MΦ) y 
neutrófilos. Recientemente, ha sido reportado que también las células dendríticas son 
células blanco para MIF así como productoras del mismo, participando de esta manera 
activamente en el aumento de fenómenos inflamatorios. Los monocitos ymacrófagos 
contienen grandes cantidades de MIF preformado en el citosol que puede ser liberado 
bajo condiciones de estimulación con lipopolisacárido (LPS) (3, 8), glucocorticoides 
(4), endotoxinas Gram-positivas (18), citocinas proinflamatorias (TNF- , IFN- ) (4). 
También se sabe que la adición de MIF a macrófagos estimulados con LPS 
incrementa la producción de TNF-α y oxido nítrico (NO) (13) y que por el contrario, 
macrófagos deficientes en MIF tienen una menor expresión de estos mediadores 
inflamatorios. 
Calandra y colaboradores han demostrado que ratones deficientes para el gen de 
TNF- fueron protegidos contra el choque séptico cuando eran tratados con anticuerpos 
antagonistas de MIF, sugiriendo que existe posiblemente un mecanismo independiente 
de TNF- como el responsable de los efectos benéficos del bloqueo de MIF (16). Por 
otro lado, la neutralización de MIF mostró efectos protectores similares en el choque 
inducido por bacterias Gram-positivas (estafilococos) (18) y los ratones deficientes en 
MIF fueron resistentes a la infección con dosis letales de estafilococos B (16). 
Los macrófagos provenientes de ratones deficientes en el gen MIF tienen una 
respuesta disminuida a LPS, a bacterias Gram negativas y Gram-positivas, pero no a 
otros estímulos. Se estableció experimentalmente que este comportamiento se debía a 
una regulación negativa de la expresión de TLR-4, molécula involucrada en el 
reconocimiento del LPS (63, 64). Estas observaciones establecieron que la presencia de 
MIF inducía la expresión de TLR-4, un mecanismo por el cual MIF podría promover el 
desarrollo de la respuesta inmune innata. 
MIF es secretado por macrófagos tras la estimulación con glucocorticoides en una 
curva dosis respuesta. Una vez secretado MIF antagoniza la supresión de los 
glucocorticoides sobre la producción de las citocinas TNF- , IL-1 , IL-6, IL-8, por los 
macrófagos. La magnitud de estos fenómenos es dependiente de la concentración tanto 
de MIF como de los glucocorticoides, sugiriendo que los dos mediadores actúan de 
manera contrareguladora para controlar mutuamente la producción de citocinas e 
inflamación (17). 
En la inmunidad adquirida MIF participa de manera importante como activador de 
linfocitos T. Se ha demostrado que hay inducción de RNAm de MIF en células T 
cuando son estimuladas con anticuerpos anti-CD3 y superantígenos (4). Además, 
cuando se neutraliza la producción de MIF en las células T con la adición de 
anticuerpos monoclonales anti-MIF, se inhibe la producción de IL-2 bajo el estímulo de 
anti-CD3 o por superantígenos, y se reduce la proliferación en un 40-60 %. in vivo los 
tratamientos con anticuerpos anti-MIF resultan en un decremento de la proliferación 
celular y una reducción en la producción de anticuerpos IgG antígeno específicos (62, 
68). 
MIF también ha sido involucrado en la patogénesis de algunas enfermedades de 
tipo autoinmune como artritis reumatoide (AR) y miocarditis (45, 46, 43); y en otras 
donde la respuesta inflamatoria esta exacerbada como gastritis y colitis (52, 53), y en 
reacciones alérgicas (15, 47). En todos los casos es evidente la participación de MIF en 
la respuesta inmune, ya sea de forma patogénica o de forma protectora. En conjunto 
estos datos, sugieren a MIF como una citocina importante en la patogénesis de estas 
enfermedades. 
En contraste con las claras evidencias del papel de MIF en las enfermedades 
autoinmunes, su participación en la respuesta inmune a infecciones parasitarias es poco 
clara. En 1991, el Dr. David y su grupo reportaron por primera vez la participación de 
MIF en el control de una infección parasitaria. Usando MIF recombinante humano, en 
experimentos in vitro, demostraron que MIF activaba los macrófagos, incrementando su 
capacidad fagocítica, y disminuyendo e incluso eliminando al parásito intracelular 
Leishmania donovani, estableciendo que MIF funcionaba como un potente activador de 
los macrófagos y como un factor importante en las defensas del hospedero (78). 
En el año 2000, el Dr. Bucala y su grupo reportaron una correlación de niveles 
elevados de MIF en suero de ratones infectados con Plasmodium chabaudi y la 
severidad de la enfermedad. Se estableció que P. chabaudi inducía la producción de 
MIF en los macrófagos (44). 
Usando ratones deficientes en el gen MIF, el Dr. Satoskar y colaboradores 
demostraron que la ausencia de esta citocina evita el desarrollo de la inmunidad 
protectora contra parásitos intracelulares como Leishmania major. Los ratones 
deficientes en el gen MIF (MIF-/-) fueron significativamente más susceptibles a la 
infección que los controles (MIF+/+). Demostrándose, nuevamente, que MIF participa 
de manera importante en el desarrollo de la inmunidad protectora contra un parásito 
intracelular como L. major a través de una regulación de la actividad leishmanicida de 
los macrófagos (68). 
Se ha analizado el curso de la infección de T. crassiceps en ratones MIF-/- y 
MIF+/+, demostrando que la ausencia de MIF favorece significativamente el 
establecimiento de T. crassiceps, los cuales desarrollaron una mayor carga parasitaria 
asociada a niveles disminuidos en suero de IgG2a específica y a una producción 
disminuida de IL-12, TNF- y óxido nítrico en los macrófagos peritoneales de estos 
ratones (62). 
 
4. Justificación 
 
 
La importancia de MIF como blanco estratégico terapéutico esta siendo cada vez 
más valorada y estudiada. Sin embargo, aun cuando se reconoce a MIF como una 
molécula fundamental en la regulación de la respuesta inmune innata y adaptativa 
debido a su amplio rango de efectos inmunológicos, todavía es escaso el conocimiento 
preciso y completo de los mecanismos en los que interviene MIF en las enfermedades 
parasitarias, particularmente en la infección con Toxoplasma gondii. Por lo tanto los 
nuevos conocimientos para comprender estos mecanismos son necesarios para tratar de 
entender la forma básica en que MIF regula la respuesta inmune ante los diferentes 
patógenos, así como en las enfermedades parasitarias. 
 
 
5. Hipótesis 
 
 
El factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF) tiene un papel relevante 
en el desarrollo de la inmunidad protectora contra Toxoplasma gondii a través de la 
regulación de la respuesta inflamatoria. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6. Objetivo General 
 
Determinar la participación de MIF en la susceptibilidad y/o resistencia a la 
toxoplasmosis experimental en ratones deficientes en el gen MIF (MIF-/-) y en ratones 
silvestres (MIF+/+) ambos con fondo genético BALB/c. 
 
6.1 Objetivos Particulares 
 
 Analizar la respuesta inmune innata en la infección por Toxoplasma gondii en 
diferentes tiempos post-infección, en ratones deficientes para el gen MIF-/- y 
MIF +/+. 
 
 Evaluar la respuesta inmune innata en suero de IL-12, TNF-α, IL-18, IFN-γ. 
 
 Evaluar la expresión de CCR5, IFN-γR, TNF-αR en macrófagos de los animales 
MIF-/- y MIF+/+ infectados con Toxoplasma gondii. 
 
 Realizar cortes histológicos de hígado de los ratones experimentales para observar 
daño tisular e infiltrado celular. 
 
 Evaluar la respuesta inmune adaptativa analizando subclases de anticuerpos T. 
gondii específicos. 
 
 Analizar la expresión de IFN-γR en linfocitos CD4/CD8, TLR-2, TLR-4 por 
medio de citometría de flujo. 
 
7. Material y Métodos 
 
7.1 Animales 
Se utilizaron ratones hembras con edades entre 8-10 semanas, genéticamente 
deficientes del gen MIF (MIF-/-) en un fondo genético BALB/c. Como controles se 
utilizaron ratones BALB/c “silvestres” (MIF+/+). Los ratones MIF-/- fueron 
desarrollados originalmente de las cepas B6/129Sv. Posteriormente estos ratones 
MIF-/- fueron retrocruzados por mas de 12 generaciones en ratones BALB/c. Estos 
animales fueron donados por el Dr. John R. David de la escuela de Salud Publica de 
Harvard, y nosotroslos hemos mantenidos en reproducción bajo condiciones estándares 
en el bioterio de la Facultad de Estudios Superiores Iztacala, UNAM, donde son 
checados genéticamente de manera rutinaria. El fondo genético Balb/c ha sido 
reportado como resistente a la infección por Toxoplasma gondii, de ahí la importancia 
de usar esta cepa de ratones para determinar si la ausencia del gen que codifica para 
MIF hace susceptible a esta cepa de animales. 
 
7.2 Confirmación del genotipo por PCR. 
Todos los animales fueron checados para determinar la ausencia de MIF por PCR 
siguiendo la técnica previamente descrita (41). Brevemente utilizando material nuevo, 
estéril y libre de DNAsas-RNAsas se hizo un corte de aproximadamente 0.5 cm. de la 
parte final de la cola de los ratones experimentales, se colocaron en tubos eppendorf de 
1.8 ml previamente etiquetados y se adiciono 500 µl de buffer Pk lisis (Apéndice 1) y 
20 µL de Proteinasa K (In vitrogen 4000 µg/ml) y se dejo incubar en termoblock toda 
la noche a 56
o
C para la digestión del tejido. 
Posteriormente se agitaron los tubos en vortex y se centrifugaron por 10 minutos a 
8000 rpm, se obtuvo el sobrenadante con micropipeta en tubos nuevos y se agrego 
500 µl de isopropanol frió, se homogenizo invirtiéndolos de manera suave hasta que la 
concentración del DNA se hizo evidente. Después se centrifugaron por 10 minutos a 
10,000 rpm y se obtuvo la pastilla, decantando el sobrenadante y se añadió etanol frió al 
75%, se resuspendió la pastilla por inversión y se centrifugo por 5 minutos a 14,000 
rpm. Se obtuvo el botón de DNA y se dejo secar por una hora a temperatura ambiente y 
finalmente se resuspendió el botón de DNA con 200 µl de agua grado biología 
molecular, para nuevamente incubarlo a 56
o
C en el termoblock toda la noche para 
disolver el DNA. 
La cuantificación de DNA se realizo utilizando una dilución 1:200 de muestra de 
DNA en agua. Se calibro con agua grado molecular el espectrofotómetro (Jenway, 
Genova) y se leyeron las muestras a 260nm. 
 
7.2.1 Amplificación del gen 
Para el reconocimiento del gen para MIF se utilizaron oligonucleotidos 
específicos, referidos en Apéndice 2. 
En este proceso de PCR se utilizaron tubos nuevos libres de DNAsas-RNAsas con 
capacidad de 0.2 ml, los cuales en una reacción final de 25 µl se colocaron los 
siguientes reactivos (kit taq Platinum polimerase, In vitrogen) en el siguiente orden: 
 
 MIF NEO 
Buffer 10x 2.5 µl 2.5 µl 
MgCl2 0.75 µl 0.75 µl 
DNTP mix (10mM) 0.5 µl 0.5 µl 
Primer F (50pM) 5.6 µl 3.8 µl 
Primer R (50pM) 4.1 µl 3 µl 
DNA Taq polimerase (5U/µl) 0.25 µl 0.25 µl 
Agua (sigma) 9.3 µl 12.2 µl 
Muestra DNA 2 µl 2 µl 
 
Una vez que se tuvieron los tubos rotulados y con los respectivos reactivos se 
colocaron en el termociclador (corbett Research) con la temperatura de alineación 
mencionada en apéndice 2. 
 
7.2.2 Electroforesis 
Se utilizo un gel de agarosa (ICN Biochemicals) 1% en buffer TBE 1x (Apéndice 
1) sobre un molde y un peine de 20 pozos, que se mantuvo a 4
o
C por 30 minutos para 
que el gel solidificara. 
Una vez solidificado el gel se coloco en la cámara de electroforesis con buffer de 
TBE 1x y se colocaron por pozo 2 µl de muestra previamente diluidos en 3 µl de 
buffer de carga blue juice (In vitrogen), y 3 µl de Sybr Green. A partir del segundo 
pozo ya que en el primero se colocaron 3 µl del marcador de peso molecular 100 pb (In 
vitrogen). 
Se colocaron las muestras en la cámara de electroforesis hacia el extremo positivo 
y se corrió a 90 volts, 150 mA durante 50 minutos. Finalmente se observó en un 
transluminador con luz UV (ultravioleta) y la imagen se capturo utilizando el programa 
Alphaimagen. 
 
7.3 Infección y mantenimiento de la cepa del parasito en laboratorio. 
Se utilizaron quistes de la cepa semi-virulenta ME49 de T. gondii obtenidos de 
homogenizado de cerebro de ratones C57BL/6 previamente infectados crónicamente y 
suspendidos en solución salina. Tanto el grupo silvestre (MIF+/+), como el grupo de 
ratones deficientes del gen para MIF (MIF-/-) fueron infectados vía intraperitoneal con 
40 quistes de la cepa ME49 de T. gondii (donada por el Dr. Rafael Saavedra, IIB-
UNAM) y mantenida por nosotros en el laboratorio infectando ratones C57BL/6 vía 
intraperitoneal, durante todo el proyecto. La cepa de ratones C57BL/6 ha sido reportada 
como susceptible a la infección por T. gondii, además que la relación de tamaño en los 
quistes en la infección crónica es mayor en esta cepa en comparación con la cepa de 
animales BALB/C, por eso decidimos usar la cepa de ratones C57BL/6 para mantener 
la cepa semi-virulenta ME49 de T. gondii. 
 
7.4 Sobrevida 
El monitoreo de la sobrevida de los ratones infectados MIF+/+ y MIF-/-, se llevo 
a cabo diariamente en el laboratorio de inmunoparasitología y bioterio de la FES-
Iztacala, UNAM, durante y hasta 40 días posteriores a la infección. 
 
7.5 Parasitemia en PECs y Cerebro 
Para determinar el número de parásitos en células peritoneales se realizó la 
técnica de cytospin. Se obtuvieron las PEC´s inyectando vía i.p. 6ml de solución CS 
(cloruro de sodio 0.9%, PiSA
®
) y recuperándola, después se ajustaron las células a 1 
millón /ml en cámara de Neubauer y se tomaron 150,000 cels., para centrifugar a 1000 
rpm por 7 minutos. Posteriormente las células se tiñeron con colorante de Wright-
Giemsa y fueron fijadas con resina para observación y conteo final en microscopio 
óptico. 
El cerebro de los ratones muertos en diferentes tiempos post-infección fue 
macerado y mantenido en solución salina (CS 9%), para identificar y contar quistes. 
También se sacrificaron ratones del grupo control MIF+/+ a los tiempos que los ratones 
morían para realizar la misma técnica en cerebro. 
 
7.5.1 Nivel de parasitemia en cerebro por PCR 
Para la obtención de DNA en cerebro se utilizó el mismo procedimiento arriba 
mencionado en la confirmación del genotipo por PCR. 
Para el reconocimiento del gen para Toxoplama gondii se utilizaron 
oligonucleotidos específicos, referidos en apéndice 2 (80). Brevemente, se colocaron 
los siguientes reactivos (taq platinum polimerase, In vitrogen) en el siguiente orden: 
 
 Toxo 
Buffer 10x 2.5 µl 
MgCl2 2.0 µl 
DNTP mix (10Mm) 1.0 µl 
Primer F (50pM) 1.O µl 
Primer R (50pM) 1.0 µl 
DNA Taq polimerase (5U/µl) 0.2 µl 
Agua (sigma) 15.3 µl 
Muestra DNA 2 µl 
 
Una vez que se tuvieron los tubos rotulados y con los respectivos reactivos se 
colocaron en el termociclador (corbett Research) con la temperatura de alineación 
mencionada en apéndice 2. 
 
7.5.2 Electroforesis 
Se utilizo un gel de agarosa (ICN Biochemicals) 1% en buffer TBE 1x (Apéndice 
1) sobre un molde y un peine de 20 pozos, que se mantuvo a 4
o
C por 30 minutos para 
que el gel solidificara. 
Una vez solidificado el gel se coloco en la cámara de electroforesis con buffer de 
TBE 1x y se colocaron por pozo 2 µl de muestra previamente diluidos en 3 µl de 
buffer de carga blue juice (In vitrogen), y 3 µl de Sybr Green. A partir del segundo 
pozo ya que en el primero se colocaron 3 µl del marcador de peso molecular 100 pb (In 
vitrogen). 
Se colocaron las muestras en la cámara de electroforesis hacia el extremo positivo 
y se corrió a 90 volts, 150 mA durante 50 minutos. Se observo en un transluminador 
con luz UV y la imagen se capturo utilizando el programa Alphaimagen. 
 
7.6 Obtención de suero 
Los ratones fueron sangrados en diferentes tiempos post-infección. Se utilizó una 
caja de madera con un foco de 60 watts (phillips), para inducir dilatación en la vena 
caudal y de esta manera facilitar el sangrado. Con un bisturí se hizo un corte en la vena 
más notoria y se obtuvo de 500 a 700 µl de sangre en tubos eppendorf. Los tubos 
fueron mantenidos a baja temperatura hasta su centrifugación durante 10 minutos a 
2500 rpm. Se obtuvo el suero en tubos nuevos y debidamente etiquetados.Las muestras 
se mantuvieron a -20
o
C hasta su uso para la determinación de citocinas y anticuerpos 
específicos. 
 
7.7 Determinación de anticuerpos específicos en suero 
El suero de cada animal fue procesado individualmente para medir los niveles de 
IgG1 e IgG2a específicos contra antígenos de T. gondii por medio de ensayo de ELISA-
sandwich. Posteriormente, placas de 96 pozos fueron sensibilizadas con 0.5 mg de 
antígeno soluble (STAg) de Toxoplasma gondii, en un buffer de Tris 0.075M (pH 7.8), 
las placas fueron incubadas toda la noche a 4
o
C, después de la incubación las placas 
fueron lavadas dos veces con buffer de lavado (PBS-T) y se bloquearon con PBS-BSA 
1% durante dos horas. Las placas fueron lavadas tres veces con PBS-T y se duplicaron 
por duplicado los estándares y los sueros de los distintos grupos de animales (MIF+/+ y 
MIF-/-), diluidos 1:100 en PBS-BSA 1%, 100 µl por pozo, se incubaron por 1 hora a 37 
o
C. Las placas fueron lavadas cuatro veces con PBS-T y se agregaron 100 µl por pozo 
de los anticuerpos monoclonales diluidos en PBS-BSA al 1% contra los isotipos IgG1 e 
IgG2a (Zymed) marcados con peroxidasa, las placas se volvieron a incubar por 1 hora a 
37
 o
C y finalmente las placas fueron lavadas seis veces con PBS-T y se revelaron con el 
sustrato ABTS durante 30 minutos y fueron leídas en el lector de ELISA (Termo 
Labsystems) a 405 nm. Los datos fueron procesados por el software Multiskan Ascent 
y evaluados en el software de GraphPad Prism 4.0. 
 
 
 
7.8 Detección de citocinas en suero IL-12, IL-18, IFN, TNF, IL-4 e IL-10. 
Estas citocinas fueron evaluadas en suero de los ratones a diferentes tiempos de la 
infección por medio de la técnica de ELISA-Sandwich y de acuerdo a las instrucciones 
de los fabricantes (Peprotech México). Las placas de 96 pozos (High binding, Costar) 
fueron sensibilizadas con 100 µl por pozo del anticuerpo de captura (purified anti-
mouse IL-12, IL-18, IFN-, TNF-, IL-4, IL-10) diluido en PBS a una concentración 
de 1 µg/ml. Se cubrió la placa y se dejo incubar toda la noche a 4
 o
C. Pasada la 
incubación la placa fue lavada 3 veces usando buffer de lavado PBS-Tween 0.05% 
(PBS-T). Posteriormente la placa fue secada, después se bloqueo la placa con 300 µl de 
buffer de bloqueo PBS-BSA 1% (200 µl por pozo) y se dejo incubar al menos por una 
hora a temperatura ambiente. Después se lavo la placa 4 veces con PBS-T, y se 
procedió a hacer la curva de citocina recombinante murina por duplicado en los 
primeros pozos de la placa. La curva se realizó a una concentración de 20 ng/ml y se 
realizaron diluciones a la mitad, hasta el pozo 11 y en el último pozo solo se agregó 
PBS-BSA 1%. A los pozos restantes se agregaron por duplicado 50 µl de las muestras 
de los sueros. Se incubaron toda la noche a 4
o
C. Posteriormente se lavo la placa 4 veces 
con PBS-T y se agregó el anticuerpo biotinilado diluido en PBS-BSA a una 
concentración de 0.5 µg/ml, y se agrego 100 µl por pozo. Se dejó incubando a 
temperatura ambiente por dos horas. Después de transcurrida la incubación la placa se 
lavo por cinco veces con PBS-T, y se agregó a cada pozo 100 µl de avidin peroxidasa 
diluida 1:2000 en PBS-BSA 1% y se dejo incubar a temperatura ambiente por 30 
minutos. Después de la incubación la placa se lavo por seis veces con PBS-T y se 
añadió a cada placa 10 ml de ABTS y 100 µl de H2O2 al 3%, se dejo incubar por 15 
minutos a temperatura ambiente y se procedió a leer la placa en un lector de ELISA 
(Thermo LabSystems) a 405 nm. Los datos arrojados por el lector de ELISA fueron 
procesados por el software Multiskan Ascent y evaluados en el software de GraphPad 
Prism 4.0. 
 
7.9 Análisis del nitrito total (NO2
-
+NO3
-
) en suero por la reacción de Griess para 
óxido nítrico 
Este ensayo provee los reactivos usados en la determinación de nitrito (NO2
-
) 
como un indicador de la producción de NO en muestras biológicas. El ensayo consiste 
en preparar dos soluciones por separado, sol. A y sol. B (Sol. A 0.1% 
naphthylethylenediamine dihydrochloride en agua destilada y Sol. B 1% 
sulphanilamide en H3PO4 (concentrado) al 5%. Poco antes de realizar la prueba, se 
mezclan la sol. A y B a igual volumen, para obtener el reactivo de Griess (57). 
Esta prueba se realizó por medio de una reducción enzimática de NO3
-
 por nitrato 
reductasa, seguida por un análisis espectrofotométrico del nitrito total usando el reactivo 
de Griess. Para proveer todos los componentes necesarios para una microtitulación, se 
empleó una nitrato reductasa Zea mays con afinidad purificada (affinity-purified Zea 
mays nitrate reductase) y NADPH (nicotinamide adenina dinucleotide fosfato), y por 
último Ácido tricloroacético 10%. 
En una placa de 96 pozos se coloco una curva de oxido nítrico como control y 
referencia para extrapolar las concentraciones, se agregaron 100 µl por cada pozo por 
duplicado de las diferentes concentraciones diluidas (0.01, 0.005, 0.0025, 0.00125, 
0.000625, 0.000315 M). 
Para las muestras: 30 µl de cada muestra se incubaron por 30 min. a temperatura 
ambiente con 5 µl de nitrato reductasa (5 U/ml: Boehringer Mannhheim, laval) y 15 µl 
de NADPH (1.25 mg/ml: Boehringer Mannhheim), después de la incubación, 100 µl 
del reactivo de Griess se añadió y 100 µl de ácido tricloroacético (solución acuosa al 
10%). Se removieron las proteínas precipitadas por centrifugación a 13,800 rpm por 5 
min. y se transfirieron 100 µl de cada muestra por duplicado a la placa de 96 pozos, de 
fondo plano y se leyeron a 550 nm usando un lector de ELISA (Thermo LabSystems). 
 
7.10 Citometría de flujo 
Células del Bazo o esplenocitos y células reclutadas en la cavidad peritoneal 
fueron analizadas en la infección aguda de T. gondii. En la campana de flujo, se 
inyectaron 6 ml de solución salina estéril vía intraperitoneal para reclutar células y 
recuperarlas posteriormente, después se colocaron en tubos de 15 ml y se centrifugaron 
por 10 minutos a 2000 rpm para obtener el concentrado celular y decantar el 
sobrenadante, se resuspendieron las células con 3 ml de buffer para FACs (apéndice 1). 
Se homogenizo la suspensión y se contaron en cámara de Neubauer y se ajustaron con 
buffer de FACs a 1 millón de células por ml. y se pasaron a tubos para FACs (Falcon, 
B.D.), donde se volvieron a centrifugar las células 10 minutos a 2000 rpm para 
decantar y resuspender con 200 μl de buffer para FACs. Finalmente se agregaron los 
anticuerpos conjugados con los distintos marcadores de fluorescencia y un anticuerpo 
isotipo (IgG2a) como control para pegado inespecífico, a una concentración de 0.2 μg 
marcados de la siguiente manera: 
CD-8 PE (ficoeritrina, Caltag Laboratories) 
CD-4 PE (ficoeritrina, Caltag Laboratories) 
CD-19 PE (ficoeritrina, Caltag Laboratories) 
IFN-γR- FITC (fluoresceína, Santacruz Biotechnology) 
TNF-αR FITC (fluoresceína, Santacruz Biotechnology) 
CCR5 PE (ficoeritrina, PharMingen) 
Mac-3 FITC (fluoresceína, Santacruz Biotechnology) 
TLR-2 FITC (fluoresceína, eBioscience) 
TLR-4 PE (ficoeritrina, Santacruz Biotechnology) 
F4/80 PE (ficoeritrina, eBioscience) 
 
Posteriormente la muestra se incubo durante 30 minutos a 4
o
C, se lavaron las 
células 2 veces con buffer para FACs y se utilizo la maquina FACsCalibur (Becton 
Dickinson) para la captura y análisis de las muestras y el análisis se hizo con el 
programa CellQuest Pro. 
 
7.11 Histología
 
Se realizaron cortes histológicos de hígado después de 10 y 20 días post-
infección. Se fijaron en paraformaldehido al 4% y se realizaron cortes de 10 micras en 
el micrótomo y se tiñeron los cortes con hematoxilina-eosina, para identificar daño 
tisular, así como infiltrado celular. El análisis histopatológico se realizó con la 
colaboración del Dr. Angulo (Patólogo de la FES-Iztacala, UNAM). 
 
7.12 Análisis estadístico 
Las comparaciones entre los diferentes grupos consideradosen este trabajo se 
llevaron a cabo mediante prueba de t-Student (GraphPad Prism 4.0). Se consideraron 
significativas las comparaciones con valores de p menores a 0.05. 
 
8. Resultados 
 
Determinación de la ausencia del gen MIF por PCR 
Con el propósito de comprobar si los ratones usados en este trabajo fueron los 
adecuados para la experimentación, todos los animales fueron checados para determinar 
la ausencia del gen MIF por PCR. En la figura 3 se muestra una electrofóresis en gel de 
agarosa del amplificado del gen para MIF y NEO (neomicina), en los carriles del 1 al 3 
se muestra la amplificación del gen para MIF, de los ratones MIF-/- y del carril 4 al 6 la 
amplificación de NEO para el mismo grupo de ratones. El producto de amplificación 
para MIF tiene un tamaño de 200 pb y 500 pb para NEO. En los carriles 7, 8 y 9 se 
muestra la amplificación del gen para MIF de los ratones silvestres (MIF+/+) y en los 
últimos carriles se muestran los mismas muestras amplificadas para el gen NEO. 
 
 1 2 3 4 5 6 100pb 7 8 9 10 11 12 
 
 
 MIF -/- Ladder MIF +/+ 
Figura 3.- Genotipo de los ratones MIF-/- y del grupo control MIF+/+, por PCR. En el carril 
central (ladder) se muestra el marcador de peso molecular cada 100 pb. 
 
 
 
 
 
 
500 pb 
200 pb 
Sobrevida 
La sobrevivencia de los ratones experimentales fue monitoreada diariamente hasta 
40 días post-infección. En la figura 4 se muestra la susceptibilidad de los ratones MIF-/- 
a la infección por Toxoplasma gondii. Los datos son resultados promediados de 6 
experimentos independientes (n=8). Se infectaron i.p. ratones hembras MIF-/- y 
MIF+/+ con una dosis de 40 quistes por ratón de la cepa semivirulenta ME49 de T. 
gondii. Se siguió la sobrevivencia de estos animales hasta por 40 días, al inició se 
observó el erizamiento, postramiento clásico asociado a los primeros días de infección 
en ambos grupos de ratones. Sin embargo, como se muestra en la fig. 4, los ratones 
MIF-/- sucumbieron en mayor proporción y en menor tiempo que los ratones MIF+/+ a 
la infección por T. gondii. 
 
0 10 20 30 40 50
0
20
40
60
80
100
MIF+/+
MIF-/-
*p< 0.0001
*
Días después de la infección
S
o
b
r
e
v
iv
e
n
c
ia
 (
%
)
 
Figura 4.- Porcentaje de sobrevivencia de los ratones deficientes para el gen MIF (MIF-/- ●) vs. 
ratones MIF silvestres (MIF+/+ ○), infectados con 40 quistes de la cepa semi virulenta ME49 
de T. gondii. Se muestran datos representativos de 6 experimentos (n=8 por grupo). 
 
 
 
 
 
 
 
 
Pérdida de peso 
Además de que los ratones MIF-/- desarrollaron severos signos clínicos de enfermedad 
y la mortalidad en estos ratones fue alta, presentaron una considerable pérdida de peso 
en comparación con los ratones MIF+/+, como consecuencia de la severa patología que 
estos enfrentaron (Fig. 5). 
0 5 10 15 20 25 30
50
75
100
125
MIF+/+
MIF-/-
Días post-infección
P
er
d
id
a
 d
e 
p
es
o
 
(%
)
*
* *
 
Figura 5.- Porcentaje de pérdida de peso en los ratones MIF+/+ (○) vs. MIF-/- (●) infectados 
con T. gondii. Los datos aquí mostrados representan el promedio +/- ES de al menos 8 ratones 
por grupo, *p<0.005 (Graphpad Prism). 
 
Parasitemia 
Para determinar el número de quistes de T. gondii en cerebro entre los ratones 
silvestres (MIF+/+) y los ratones knock-out (MIF-/-) se obtuvo el cerebro de los ratones 
muertos y sacrificados en dos tiempos post-infección (10 y 30 días). Los cerebros 
fueron macerados y mantenidos en solución salina (CS 0.9%). En la fig. 6 se muestran 
los ratones MIF-/- con mayor número de quistes en cerebro en ambos tiempos post-
infección (10 y 30 días), comparados con los ratones silvestres (MIF+/+). 
 
 
10 30
0
100
200
300
400
500
600
MIF +/+
MIF -/-
*
*
*p<0.025
Días después de la infección
N
o
. 
d
e 
q
u
is
te
s/
ce
re
b
ro
 
Figura 6.- Quistes de Toxoplasma gondii en macerado de cerebro de ratones MIF+/+ y MIF-/-. 
Los datos ilustrados representan el promedio y ES (error estándar); n=6 ratones por grupo. 
 
Como los ratones fueron infectados vía intraperitoneal con quistes ME49 de T. 
gondii, decidimos recuperar las células peritoneales (PECs) a los 5 días post-infección, 
para conocer el número de PECs infectadas en ambos grupos experimentales. La fig. 
7A muestra que el porcentaje de células infectadas en los ratones MIF-/- es 
significativamente mayor comparada con los ratones MIF+/+. En la fig. 7B se puede 
observar un macrófago de los ratones MIF-/-, infectado con numerosos taquizoitos a los 
5 días post-infección, comparado con macrófagos de los ratones MIF+/+ que 
presentaron menor cantidad de células infectadas (Figura no mostrada). 
 
A) B) 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7.- A) Porcentaje de células peritoneales infectadas a los 5 días post-infección de los 
animales MIF+/+ vs. MIF-/-. Este experimento fue realizado mediante la técnica de cytospin. 
Porcentaje de PECs infectadas
5 días post-infección
0 5 10 15
MIF +/+
MIF -/- *
*
%
B) Macrófago de ratón MIF-/- infectado con quistes ME49 de T. gondii, obtenido de la cavidad 
peritoneal, infectado con numerosos taquizoitos a los 5 días post-infección. 
Nivel de parasitemia en cerebro por PCR 
Para corroborar la evidencia anterior de la existencia de parásitos en cerebro 
desde un tiempo relativamente corto (10 dpi), decidimos realizar la técnica de PCR a 
partir de la extracción de DNA en cerebro de los ratones MIF+/+ y MIF-/-, infectados 
con quistes de T. gondii. Se confirmó la presencia de quistes en cerebro mediante la 
expresión de DNA especifico para T. gondii desde los 10 días post-infección y 
conforme avanzaba el tiempo de infección el número de parásitos en cerebro va 
aumentando en ambos grupos experimentales (MIF+/+ y MIF-/-), pero existe una clara 
diferencia en los ratones MIF-/- con mayor expresión de DNA especifico. La fig. 8 
muestra una electroforesis en gel de agarosa del amplificado del gen para Toxoplasma 
gondii. 
 
 
 
 
Figura 8.- Expresión de DNA especifico para T. gondii en cerebro de ratones MIF+/+ y MIF-/-. 
Se utilizo la técnica de PCR (dpi, días post-infección). Se realizaron diluciones del DNA 
(*ng/µl) para corroborar las diferencias entre los dos grupos experimentales. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Histología 
Con el propósito de observar si se modificaba la morfología del hígado y si presentaba 
daño tisular, así como infiltrado celular en el hígado de los animales MIF+/+ y MIF-/-
infectados con T. gondii, decidimos realizar cortes histológicos. El análisis 
histopatológico se realizó con la colaboración del Dr. Angulo (Patólogo de la FES-
Iztacala, UNAM). En la fig. 9 se muestran los cortes histológicos de hígado infectados 
a los 10 dpi. En esta etapa de la infección se puede observar que los ratones MIF-/- 
tienen mayor infiltrado celular proinflamatorio localizado, así como regeneración de 
hepatocitos, como consecuencia mostraron una hepatitis reactiva no especifica; 
determinada por áreas de necrosis local con infiltración de mononucleares, dilatación 
de sinusoides e infiltración portal con células mononucleares (Ramachandra, 1974). En 
contraste el hígado de los animales MIF+/+ presentaron una distribución homogénea 
del infiltrado celular y el daño fue menor comparado con los ratones MIF-/-. 
 
 
 
 
Figura 9.- Se muestra un corte de hígado representativo de los animales MIF+/+ y MIF-/-, 
infectados con 40 quistes ME49 de T. gondii. Los cortes fueron realizados a los 10 dpi. La 
figura presentada esta con un aumento de 40x. 
 
 
 
 
 
 
 
Cuantificación de anticuerpos específicos en suero 
Con el propósito de conocer la respuesta inmune humoral contra Toxoplasma 
gondii en los ratones MIF+/+ y MIF-/-, se analizó la presenciade dos isotipos de los 
anticuerpos específicos contra antígeno de T. gondii. Los dos isotipos fueron detectados 
hasta el día 15 post-infección en ambos grupos experimentales. 
 
Nivel de Ig G1 anti-Toxoplasma gondii en suero 
Actualmente se considera a IgG1 como marcador de una respuesta tipo Th2. La 
Fig. 10a muestra los datos de dos experimentos con resultados muy similares a los 15 
días post-infección. Los niveles de IgG1 se observan ligeramente disminuidos pero 
significativos en los ratones MIF-/-, comparados con los animales MIF+/+. 
 
Nivel de IgG2a anti-Toxoplasma gondii en suero. 
La Fig. 10b muestra los datos representativos de dos experimentos independientes 
con datos idénticos, a los 15 días post-infección. El isotipo IgG2a es un marcador de 
una respuesta tipo Th1, ya que esta bien establecido que el cambio o switch de este 
isotipo es favorecido por este tipo de respuesta, específicamente por los niveles de 
IFNγ. 
La cinética de este anticuerpo fue muy similar a la producción de IgG1, 
mostrando al hacer diluciones que los ratones MIF-/- producen ligeramente menor 
cantidad de este anticuerpo en comparación a los ratones MIF+/+, a los 15 días post-
infección. 
 
 
 
 
 
 
IgG1 anti-T.gondii
10 2 10 3 10 4 10 5 10 6
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
a)
Dilución
D
.O
. 
(4
0
5
 n
m
)
*
*
*
*
 
Figura 10.- a) Cuantificación de anticuerpo IgG1 anti-Toxoplasma gondii en suero de ratones 
MIF +/+ y MIF-/- a los 15 días post-infección. b) Cuantificación de anticuerpo IgG2a en los 
ratones MIF +/+ y MIF-/- a los 15 días post-infección. Los resultados se muestran en diluciones 
para poder observar las diferencias entre ambos grupos experimentales. Los valores presentados 
son el promedio y ES de la cuantificación de estos anticuerpos en 2 experimentos 
independientes con una n=8, con resultados similares y *p<0.001 prueba de “t” (Graphpad 
Prism). 
 
Nivel de citocinas en suero 
Cuantificación de citocinas pro inflamatorias. 
Con el objetivo de evaluar la producción de algunas citocinas pro-inflamatorias 
como IL-12, IFN-γ, IL-18, TNF-α, secretadas por los ratones MIF+/+ y MIF-/-, se 
cuantifico la producción de estas citocinas en suero en diferentes tiempos post-
infección. 
En la Fig. 11 se observa la producción de IL-12, principal mediador de la 
respuesta innata temprana, se denota que desde el inicio de la infección con T. gondii, 
los ratones MIF-/- producen valores significativamente menores comparados con los 
ratones MIF+/+, y no logran elevar la producción de esta citocina, en comparación los 
ratones MIF+/+ producen cantidades mayores y conforme avanza la respuesta innata 
elevan considerablemente la producción de IL-12. 
En cuanto a la producción de la citocina IFN-gamma, los ratones MIF-/- 
produjeron menos cantidad de IFN-gamma en el inicio de la infección y mantuvieron 
concentraciones mas bajas que los ratones MIF+/+ hasta el día 15 post-infección donde 
la producción de esta citocina se mantiene baja en los ratones MIF-/- (Fig.12). 
IgG2a anti-T.gondii
10 2 10 3 10 4 10 5 10 6
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
MIF+/+
MIF-/-
b)
Dilución
D
.O
. 
(4
0
5
n
m
)
*
*
*
*
0 3 6 9 12 15
0
1000
2000
3000
4000
5000
*
*
*
*
*
*
*
IL- 12
MIF+/+
MIF-/-
Días después de la infección
 (
p
g
/m
l)
 
Figura 11.- Cuantificación de IL-12 en suero de los ratones MIF+/+ y MIF -/- en diferentes 
tiempos post-infección. El análisis se hizo por medio de la técnica ELISA-Sandwich Los datos 
representados son el promedio y ES de 6 experimentos con resultados muy similares. *p<0.05 
prueba de “t” (Graphpad Prism). 
 
0 3 6 9 12 15
0
1000
2000
3000
4000
*
*
*
*
IFN-
MIF+/+
MIF-/-
Días después de la infección
(p
g
/m
l)
 
Figura 12.- Producción de IFN-gamma en los ratones MIF+/+ y MIF-/-. El análisis se hizo por 
medio de la técnica ELISA-Sandwich. Los datos representados son el promedio y la ES de 6 
experimentos con resultados muy similares. *p<0.05 prueba de “t” (Graphpad Prism). 
 
Producción de Oxido Nítrico. 
Existe una elevada correlación entre los niveles de IFN-γ y los niveles de oxido nítrico 
(NO) que se producen, por lo que se decidió cuantificar este parámetro en suero de los 
ratones experimentales. En la Fig. 13 puede observarse que la producción de NO en los 
ratones MIF-/- infectados con T. gondii, tuvieron niveles disminuidos estadísticamente 
significativos con respecto a los ratones MIF+/+. 
0 3 6 9 12 15
1.75
2.25
2.75
3.25
*
*
*
*
MIF+/+
MIF-/-
Días después de la infección
C
o
n
c
e
n
tr
a
c
ió
n
 (

M
)
Oxido Nítrico
 
Figura 13.- Análisis de oxido nítrico por la reacción de Griess en los ratones MIF+/+ y MIF-/- 
infectados con quistes ME49 de T. gondii. Los ratones MIF-/- produjeron menor cantidad de 
óxido nítrico desde el inicio de la infección. Se muestran datos de dos experimentos 
independientes con una n=8, prueba de “t” *p=0.05 (GraphPad Prism). 
 
En cuanto a la producción de IL-18 en suero, se pudo observar que no hubo 
diferencias entre los ratones MIF+/+ y los ratones MIF-/- a lo largo del tiempo de 
infección estas mostraron una cinética muy similar (Fig. 14). 
En cuanto a la producción de TNF-α los ratones MIF+/+ mantuvieron una 
elevada producción de esta citocina desde el inicio de la infección y lograron aumentar 
la producción conforme transcurrió el tiempo post-infección, en contraste los ratones 
MIF-/- no produjeron altas concentraciones de TNF-α y aunque mantuvieron la 
producción lo largo del tiempo post-infección esta fue en concentraciones muy bajas 
(Fig. 15). 
 
 
0 3 6 9 12 15
0
250
500
750
1000
IL-18
MIF+/+
MIF-/-
Días después de la infección
 (
p
g
/m
l)
 
Figura 14.- Producción de IL-18 en suero de ratones MIF+/+ y MIF-/-, infectados con quistes 
ME49 de Toxoplasma gondii. Se midió la producción de esta citocina hasta el día 15 post-
infección y los datos que se muestran en la figura son el promedio y la ES de cuatro 
experimentos independientes. prueba de “t” (Graphpad Prism). 
 
0 3 6 9 12 15
0
100
200
300
400
*
*
*
*
*
*
TNF-
MIF+/+
MIF-/-
Días después de la infección
 (
p
g
/m
l)
 
Figura 15.- Nivel de TNF-alfa en suero de los ratones MIF+/+ y MIF-/-, infectados con quistes 
ME49 de Toxoplasma gondii. El análisis se hizo por medio de la técnica ELISA-Sandwich. Se 
muestran datos de cinco experimentos independientes con una n=10 ratones y *p<0.001 prueba 
de “t” (Graphpad Prism). 
 
 
 
 
 
 
Nivel de Citocinas anti-inflamatorias 
Se midieron niveles en suero de algunas citocinas de respuesta tipo Th2 anti-
inflamatorias como IL-4 e IL-10, secretadas por los ratones MIF+/+ y MIF-/-, 
infectados con quistes de la cepa ME-49 de Toxoplasma gondii. 
En la fig. 16 se observan los niveles de producción de IL-4 donde solo se aprecian 
cambios significativos a partir del día 15 post-infección en los ratones MIF+/+, con 
niveles mas elevados en comparación con los ratones MIF-/-. Sin embargo la 
producción de IL-4 se observa sin cambios significativos conforme avanza el tiempo 
post-infección (días 2-30), aunque cabe mencionar que la producción de esta citocina se 
mantiene constante en ambos grupos experimentales durante casi todo el tiempo 
transcurrido en que la infección fue monitoreada. 
En cuanto a la producción de IL-10 se observa que no hubo diferencias 
significativas entre los ratones MIF+/+ y MIF-/- desde el inicio de la infección con 
quistes de T. gondii, solamente en el día 12 dpi los animales MIF+/+ presentaron un 
aumento en la producción de esta citocina, sin embargo para el día 15 post-infección, 
la producción decrece y se iguala a la de los ratones MIF-/- (Fig.17). 
 
0 5 10 15 20 25 30
200
300
400
500
600
MIF+/+
MIF-/-
*
IL-4
Días post-infección
 (
p
g
/m
l)
 
Figura 16.- Producción de IL-4 en suero de ratones MIF+/+ y MIF-/- infectados con quistes de 
T. gondii. La cuantificación de IL-4se hizo por medio de la técnica ELISA-sandwich y los 
datos son representativos de seis experimentos independientes con una n=8, se realizó prueba 
de "t" *p=0.05 (GraphPad Prism). 
 
0 3 6 9 12 15
0
1000
2000
3000
4000
*
IL-10
MIF+/+
MIF-/-
Días post-infección
 (
p
g
/m
l)
 
Figura 17.- Secreción de IL-10 en suero de ratones infectados con quistes ME-49 de 
Toxoplasma gondii. La cuantificación de IL-10 se hizo por medio de la técnica ELISA-
sandwich. Se muestran datos representativos de cinco experimentos independientes con una 
n=8, prueba de “t” *p=0.05 (GraphPad Prism). 
 
Citometría de Flujo 
Se realizó el análisis de marcadores de membrana en células peritoneales y de 
Bazo a través de citometría de flujo de dos colores, para determinar si había algún 
cambio en la expresión de algunas moléculas en los linfocitos y PECs. El reclutamiento 
de linfocitos TCD4+, TCD8+ y células NK, no se vio modificado en los ratones MIF-/- 
y tampoco en los ratones MIF+/+ (datos no mostrados). Buscamos si estaba modificada 
la expresión de algunos receptores en los macrófagos para citocinas como IL-10, y 
tampoco se encontró modificado (dato no mostrado). Sin embargo encontramos 
diferencias significativas (50% disminuidos) en los receptores para IFN-gamma y TNF-
alfa en los macrófagos de los ratones MIF-/- (Fig. 18a). 
Dado que del receptor para IFN-γ estaba modificada en los macrófagos, buscamos 
si este se encontraba modificado en los linfocitos CD4+ y CD8+, curiosamente y 
aunque el reclutamiento celular no se vio modificado, la expresión de estos receptores 
se vio significativamente disminuido en los ratones MIF-/- en comparación con los 
ratones MIF+/+ (Fig. 18b). 
 
En la Fig. 19 se observa la expresión de TLRs (Toll-like receptors) en macrófagos 
de células peritoneales a los cinco días post-infección. La expresión de TLR-2 no se ve 
modificada en ambos grupos experimentales. Aunque el reclutamiento celular tampoco 
se ve modificado en ambos grupos experimentales, la expresión de la molécula TLR-4 
si se vio seriamente disminuida en los ratones MIF-/- a comparación de los ratones 
MIF+/+. 
 
Finalmente también mostraron modificada la expresión de CCR5 (Fig. 20) 
 
18. a) 
 
 
 
 
 
 
 
IFN-γR 
 MIF+/+ F4/80 MIF-/- 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
TNF-αR F4/80 
 
 
 
 
 
 
 
 
18. b) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 18.- a) Citometría de flujo de células de peritoneo obtenidas a los 5 dpi., muestran la 
expresión de marcadores de membrana de IFN-γR en macrófagos (F4/80) y de TNF-α, y b) 
Células de Bazo obtenidas a los 5dpi., muestran la expresión de IFN-γR en linfocitos TCD4+ y 
TCD8+. El número en los cuadrantes de la derecha indica el porcentaje que expresan estos 
marcadores. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
F480 
 CD4 
CD8 
MIF+/+ MIF-/- 
 
IFN-gR 
 
100 101 102 103 104
IFN-gR FITC
Data.002
17.3% 
100 101 102 103 104
IFN-gR FITC
Data.011
9.4% 
100 101 102 103 104
IFN-gR FITC
Data.007
4.9% 
100 101 102 103 104
IFN-gR FITC
Data.005
12.5% 
19. a) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 TLR-2 
 MIF+/+ MIF-/- 
19. b) 
 
 
 
 
 
 
 
TLR-4 
 F4/80 
 
Figura 19. - Citometría de flujo de células peritoneales a los 5 días post-infección. a) Los 
ratones MIF-/- y MIF+/+ muestran niveles comparables de expresión de TLR-2. b) F4/80 es un 
marcador de presencia de macrófagos. Los macrófagos de los ratones MIF-/- muestran 
significativamente disminuida la expresión de TLR-4 (número en el cuadrante superior- 
derecha). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CCR5 
 
 MIF+/+ MIF-/- 
Figura 20.- Citometría de flujo de células peritoneales a los 5 días post-infección. Los 
ratones MIF-/- muestran significativamente disminuida la expresión de CCR5 en 
comparación con los animales MIF+/+. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
9. Discusión 
 
El mediador inmunológico conocido como (MIF) tiene su origen en reportes que 
datan desde 1932, cuando Rich y Lewis observaron una aparente inhibición celular in 
vitro (39). Fue hasta mediados de 1960 cuando recibió el nombre de Factor Inhibidor de 
la Migración de Macrófagos, en un inicio MIF se relacionó con linfocitos activados y 
con la respuesta de hipersensibilidad retardada y, como su nombre lo indica, por inhibir 
la migración azarosa de los macrófagos (11, 21). Pero el progreso científico fue limitado 
debido a dificultades en producir una proteína pura recombinante. Actualmente ha 
renacido el interés por estudiar esta molécula y se sabe que MIF es una citocina 
proinflamatoria con acción pleiotropica, producida por la glándula pituitaria y por 
múltiples tipos celulares como los linfocitos T, así como células no inmunes. MIF tiene 
una característica fisiológica única debido a su relación con la glucocorticoides, ya que 
la síntesis y liberación de MIF es inducida por esta glándula. 
Actualmente se usan anticuerpos neutralizantes para MIF y/o ratones deficientes 
para el gen que codifica para MIF. De esta manera se sabe que MIF es un mediador 
crucial en la respuesta inmune ya que participa activamente en diversos procesos 
inflamatorios. Sin embargo, aun cuando se ha demostrado la importancia de MIF en la 
respuesta inmune innata y adaptativa, aun no se conoce del todo el mecanismo por el 
cual MIF actúa en infecciones parasitarias. Por lo tanto, con la finalidad de conocer el 
papel de MIF en las enfermedades parasitarias y su papel en la respuesta inmune innata, 
en este trabajo se utilizó un modelo murino de Toxoplasmosis. 
En el presente estudio, se utilizaron ratones con fondo genético Balb/c, deficientes 
del gen MIF (MIF-/-) y ratones silvestres con el mismo fondo genético (MIF+/+). 
Ambos grupos fueron infectados con 40 quistes de la cepa semi-virulenta ME49 de T. 
gondii. Se determinó la ausencia del gen que codifica para MIF por PCR (Fig. 3). Se 
monitoreó la sobrevida de los ratones y se demostró que los ratones MIF-/- murieron en 
mayor proporción y en menor tiempo que los ratones MIF+/+. Adicionalmente fue 
monitoreada la perdida de peso y como se esperaba los ratones MIF-/- desarrollaron una 
importante pérdida de peso, en comparación con el grupo silvestre (MIF+/+) (Fig. 4, 5). 
Quisimos determinar si estos datos se relacionaban con el número de parásitos en 
células peritoneales (PECs) a los 5 dpi, ya que es bien conocido que T. gondii puede 
infectar casi cualquier tipo de célula nucleada como macrófagos residentes y 
posteriormente invadir varios órganos, tales como hígado. Como era esperado los datos 
nos indicaron que los ratones MIF-/- tenían triplicado el número de parásitos comparado 
con los ratones silvestres (MIF+/+) (Fig. 7). El siguiente paso fue examinar los cerebros 
de los ratones conforme iban sucumbiendo y fue hasta el día 10 post-infección cuando 
se hizo notoria la formación de pequeños pero evidentes quistes en cerebro, los ratones 
MIF-/- tenían hasta 5 veces mas número de quistes que los ratones MIF+/+ y conformeavanzó el tiempo post-infección en el día 30 la relación en el número de quistes fue 2:1 
sucesivamente en la infección crónica (Fig.6). Lo cual hacía evidente que la alta 
mortalidad en la infección aguda o temprana estaba relacionaba con el alto número de 
parásitos en los ratones MIF-/-. Adicionalmente decidimos analizar los mismos cerebros 
usados en el experimento anterior, y así corroborar la presencia de parásitos de T. gondii 
por PCR a los 10, 20 y 30 días post-infección y los datos comprobaron la anterior 
evidencia donde los ratones MIF-/- muestran mayor expresión de DNA especifico para 
T. gondii, indicando un aumento en la presencia del parásito en cerebro desde los 10 
días post-infección, siendo este el punto mas importante de la infección ya que fue en la 
infección temprana donde sucumbieron la mayoría de los animales MIF-/- usados en 
cada experimento (Fig. 8). Es bien conocido que MIF actúa de manera paracrina y 
autocrina y promueve la activación de diferentes tipos celulares, así como la inducción 
de citocinas proinflamatorias como TNF-α e IL-12 en macrófagos (4, 21), esenciales 
para la resistencia contra patógenos, además de que MIF aumenta la capacidad 
fagocítica de los macrófagos y mata patógenos intracelulares como Leishmania (39). 
Los cortes histológicos en hígado de los ratones MIF-/- a los 10 dpi revelan la 
susceptibilidad a la Toxoplasmosis, debido a grandes infiltrados celulares así como 
necrosis local como resultado del rompimiento de quistes y por la alta replicación del 
parásito, en contraste en los ratones MIF+/+, hubo menor infiltración celular (Fig. 9). 
En esta etapa de la infección temprana (10 dpi) se pudo observar que los ratones MIF-/- 
tuvieron mayor infiltrado celular proinflamatorio localizado, así como regeneración de 
hepatocitos, y como consecuencia una hepatitis reactiva no especifica; determinada por 
áreas de necrosis local con infiltración de mononucleares, dilatación de sinusoides e 
infiltración portal con células mononucleares (Ramachandra, 1974). En contraste el 
hígado de los animales MIF+/+ presentaron una distribución homogénea del infiltrado 
celular y el daño fue menor comparado con los ratones MIF-/-. 
Estudios anteriores con este parásito intracelular han establecido la importancia 
de la inducción de una respuesta inmune tipo Th1, y altos niveles de IFN-γ, que 
participan en el control del parásito (55, 81). De esta manera analizamos la producción 
de citocinas pro-inflamatorias en ambos grupos experimentales (MIF+/+, MIF-/-) y 
observamos que la infección inicial por T. gondii en los ratones MIF+/+ estimula una 
potente producción de citocinas proinflamatorias, tal es el caso de la IL-12 que lleva a la 
producción de IFN-γ, que a su vez lleva al control de la replicación del parásito y genera 
protección (29, 32, 71). En contraste, los ratones MIF-/- mostraron que la producción 
de estas citocinas esenciales para generar protección esta asociada con niveles bajos de 
estas citocinas proinflamatorias en suero (Fig. 11, 12). Adicionalmente se sabe que 
existe un alto grado de correlación entre los niveles altos de IFN-γ y la producción de 
óxido nítrico (NO) por macrófagos (70). Por lo tanto se analizó la producción de nitrito 
total en suero por medio de la reacción de Griess para óxido nítrico y los datos 
obtenidos concuerdan con los niveles de IFN-γ encontrados en ambos grupos, ya que 
los ratones MIF-/- tienen disminuida la producción de óxido nítrico en la infección 
temprana (Fig. 13), esto concuerda con estudios previos de producción de NO por 
macrófagos, ya que esta molécula ayuda en la resistencia a infecciones parasitarias 
intracelulares (69). Por lo tanto los niveles altos de parásitos encontrados en los ratones 
MIF-/-, en la infección aguda, así como la baja producción de IL-12 e IFN-γ y TNF-α, 
podrían explicar el incremento de parásitos circulantes en la cavidad peritoneal de estos 
ratones, así como la migración temprana a otros órganos y el establecimiento de quistes 
en cerebro. 
Con respecto a la interleucina IL-18 (Fig.14), no encontramos diferencias 
significativas en ambos grupos experimentales. Esta citocina ha sido identificada por su 
capacidad para inducir la producción de IFN-γ por células T y aumentar la actividad 
citolítica de las células naturales asesinas (NK) (31, 54). Aunque IL-18 es un miembro 
de la familia IL-1 (5), funcionalmente es similar a la IL-12 y al igual que esta 
incrementa la producción de IFN-γ por células NK y TCD8+ (83) y aumenta la 
actividad citotóxica de estas células (20). Por lo tanto, es posible que aunque no hubo 
diferencias de IL-18 entre los grupos experimentales, la principal producción de IFN-γ 
es IL-12-dependiente en la infección por T. gondii, mientras que IL-18 parece tener un 
papel menor en la resistencia a esta infección. Además estos datos son consistentes en 
estudios con Salmonella typhimurium, donde IL-18 tiene un papel limitado en la 
producción de IFN-γ necesario para la eliminación de S. typhimurium (23). 
Interesantemente T. gondii y S. typhimurium inducen altos niveles de NO durante la fase 
aguda de la infección, además que otros estudios han demostrado que el óxido nítrico 
puede inhibir la producción de IL-18 (40), lo cual podría explicar los niveles parecidos 
de IL-18 en ambos grupos experimentales detectados en nuestro trabajo, sugiriendo 
estrategias de los patógenos intracelulares para inhibir la capacidad de la respuesta 
inmune. 
La respuesta inmune contra T. gondii esta caracterizada por la consistente 
inducción de una adecuada respuesta tipo Th1 y altos niveles de IFN-γ (81), así como 
IL-12 es requerida para generar resistencia tanto en la fase aguda como crónica en la 
Toxoplasmosis, debido a su papel en estimular la producción de IFN-γ (29, 71). Con el 
fin de conocer si la respuesta tipo Th2 estaba asociada a la susceptibilidad de los ratones 
MIF-/- en la infección con T. gondii, como lo han establecido diferentes estudios que 
han demostrado que las citocinas tipo Th2 favorecen la infección (61), decidimos 
cuantificar la producción de IL-4 e IL-10. Sorprendentemente el nivel de estas citocinas 
anti-inflamatorias fue similar en ambos grupos experimentales (MIF+/+, MIF-/-), tanto 
en la infección aguda como en la crónica (Fig. 16, 17). Por lo tanto, el aumento en la 
susceptibilidad en los ratones MIF-/- parece estar asociada a una deficiente respuesta 
proinflamatoria mediada por IFN-γ, TNF-alfa y ON en la inmunidad innata, ya que la 
respuesta tipo Th2 no se encuentra afectada. Estos resultados sugieren que la respuesta 
inmune de tipo Th1 y Th2 no son del todo excluyentes una de la otra, ya que se 
encontraron niveles altos de IL-12 e IFN-γ en presencia de citocinas anti-inflamatorias. 
Una vez observada la alta susceptibilidad en los ratones deficientes del gen MIF a 
la Toxoplasmosis, decidimos conocer como estaba relacionada la respuesta humoral 
contra T. gondii. Se midió la producción de anticuerpos específicos a este parásito a los 
15 dpi de los subtipos IgG2a e IgG1. Los resultados obtenidos revelaron que la 
respuesta humoral para ambos isotipos se vio ligeramente modificada en los ratones 
MIF-/-, ya que estos ratones mostraron niveles disminuidos de ambos isotipos. Se sabe 
que IgG2a es un marcador de una respuesta tipo Th1 y que IFN-γ es el factor mas 
relevante para la producción de dicho isotipo (1), de modo que este tipo de respuesta 
humoral confiere protección contra este parasito intracelular. De esta forma la 
producción de IgG2a en estos ratones no pudo verse modificada por la producción de 
IFN-γ, ya que en este punto hubo niveles similares de esta citocina en ambos grupos 
experimentales, sin embargo podría ser el receptor para esta citocina (IFN-γR) en 
macrófagos el que este modificado como consecuencia de la ausencia del gen MIF. Por 
su parte los niveles de IgG1 están asociados a la baja producción