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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE CIENCIAS “Purificación de las proteínas EscF y EscI del sistema de secreción de efectores de virulencia de Escherichia coli enteropatógena” T E S I S QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: BIÓLOGA P R E S E N TA: JULIA VICTORIA MONJARÁS FERIA DIRECTORA DE TESIS: DRA. BERTHA GONZÁLEZ PEDRAJO Agosto 2007 UNAM – Dirección General de Bibliotecas Tesis Digitales Restricciones de uso DERECHOS RESERVADOS © PROHIBIDA SU REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL Todo el material contenido en esta tesis esta protegido por la Ley Federal del Derecho de Autor (LFDA) de los Estados Unidos Mexicanos (México). El uso de imágenes, fragmentos de videos, y demás material que sea objeto de protección de los derechos de autor, será exclusivamente para fines educativos e informativos y deberá citar la fuente donde la obtuvo mencionando el autor o autores. Cualquier uso distinto como el lucro, reproducción, edición o modificación, será perseguido y sancionado por el respectivo titular de los Derechos de Autor. ÍNDICE GENERAL Resumen Lista de abreviaturas Introducción Escherichia coli 1 E. coli enteroinvasiva (EIEC) 4 E. coli enterotoxigénica (ETEC) 5 E. coli enteroagregativa (EAEC) 5 E. coli de adherencia difusa (DAEC) 6 E. coli enterohemorrágica (EHEC) 7 E. coli enteropatógena (EPEC) 7 Locus de esfacelamiento enterocítico (LEE) 16 Sistemas de secreción de bacterias Gram negativas 19 Sistemas de secreción Sec dependientes 20 Sistemas de secreción Sec independientes 21 Sistema de secreción tipo 3 (SST3) 22 Aguja 28 Eje interno 31 Objetivo general 33 Objetivo particular 33 Objetivos específicos 33 Materiales y Métodos Crecimiento de cepas bacterianas 34 Mantenimiento de las cepas bacterianas 35 Plásmidos y oligonucleótidos 35 Purificación de ADN cromosomal de EPEC 37 Amplificación 38 Clonación y secuenciación 39 Subclonación en el vector pET19b 42 Inducciones 43 Aislamiento de fracciones celulares 44 Inmunodetección de la proteína de interés en las fracciones 45 Purificación de las proteínas recombinantes 45 Diálisis 47 Cuantificación de proteína 47 Obtención de anticuerpos policlonales 47 Resultados 50 Discusión 63 Conclusiones 69 Apéndice: Medios y soluciones 70 Referencias bibliográficas 73 • Lista de abreviaturas A/E (Adherencia y Eliminación) Å (Amstrongs) AAF (Fimbria de adherencia agregativa) ADN (Ácido desoxiribonucléico) ARN (Ácido ribonucléico) BFP (Pilus formador de cordones) BSA (Albúmina de suero bovino) CaCl2 (Cloruro de calcio) CFs(Factores fibrilares de colonización) Da (daltones) DAEC (E. coli de adherencia difusa) DO600 (Densidad óptica a 600 nm de longitud de onda) E. coli (Escherichia coli) eae (E. coli attaching and effacing) EAEC (E. coli enteroagregativa) EAF (Factor de adherencia de EPEC) EAST1 (Enterotoxina termoestable 1 de EAEC ) EDTA (Ácido etilendiaminotetracético) EHEC (E. coli enterohemorrágica) EIEC (E. coli enteroinvasiva) EPEC (E. coli enteropatógena) Esp (Preteínas secretadas por EPEC) ETEC (E. coli enterotoxigénica) g (Gramos) h (Horas) HCl (Ácido clorhídrico) IP3 (Inositol 3 Fosfato) IPTG (Isopropil-ß-D-tiogalactopiranósido) kb (Kilobases) LEE (Locus de Esfacelamiento Enterocítico) LT (Enterotoxina termolábil) M (Molar) Map (Proteína asociada a la mitocondria) ME (Membrana externa) mg (Miligramos) MgCl2 (Cloruro de magnesio) MI (Membrana interna) µg (Microgramo) µm (Micrometro) min (Minutos) mM (Milimolar) NC (Complejo aguja) ORF (Marco de lectura abierto) ° C (Grado Celsius) PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida) PAI (Isla de patogenicidad) PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) PI (Fosfatidil Inositol) PKC (Proteína cinasa C) RNAasa (Ribonucleasa) SDS (Dodecilo sulfato de Sodio) spp (Especies) SST3 (Sistema de Secreción Tipo 3) ST (Enterotoxina termoestable) Stx (Toxina Shiga) Tir (Receptor translocado de intimina) x g (Fuerza centrífuga relativa ) Resumen Escherichia coli enteropatógena (EPEC) fue la primera E. coli en ser considerada la causa de epidemias diarréicas. Esta cepa está asociada con diarrea infantil (en niños menores de dos años), principalmente de países en vías de desarrollo. EPEC coloniza el epitelio intestinal e induce una histopatología característica denominada lesión de adherencia y esfacelamiento (lesión A/E), que consiste en la eliminación de las microvellosidades de la superficie intestinal, la adherencia íntima de la bacteria al enterocito, así como en la generación de una estructura en forma de pedestal rica en actina que se forma en el sitio de adhesión bacteriana. Una etapa fundamental en el proceso de infección es la secreción de efectores de virulencia desde el citoplasma bacteriano hasta el citoplasma de la célula hospedera. Estas proteínas se translocan utilizando un mecanismo de secreción denominado tipo III. El sistema de secreción tipo III (SST3) es utilizado por una gran variedad de bacterias Gram negativas patógenas de animales y plantas para transportar proteínas a través de las membranas bacterianas y translocar algunas de ellas (efectores) directamente al citoplasma de la célula eucarionte. Estructuralmente, el SST3 o inyectisoma de EPEC se compone de dos partes principales: (i) una base cilíndrica, compuesta de dos pares de anillos en la membrana interna y externa, unidos por un eje interno (periplásmico) (hipotéticamente formado por la proteína EscI) y (ii) una proyección que sale de la superficie celular denominada aguja (constituida por la proteína EscF) seguida de una estructura filamentosa que funciona como puente entre bacteria-célula hospedera y como canal de secreción. En el presente trabajose purificaron las proteínas EscF y EscI, y se obtuvieron anticuerpos policlonales contra las mismas. - 0 Introducción Escherichia coli Escherichia coli (Fig. 1) fue descrita por primera vez en 1885 por Theodor von Escherich, bacteriólogo alemán, quien la denominó Bacterium coli. Posteriormente se le adjudicó el nombre de Escherichia, en honor a su descubridor. Esta bacteria se ha utilizado como modelo para estudiar todo tipo de aspectos de genética, fisiología, evolución y ecología. Fig. 1. Fotografía de microscopía electrónica de transmisión de E. coli. (Tomada de images.photoresearchers.com). Algunas de las características generales de E. coli se describen a continuación. Es una bacteria Gram negativa (se tiñe de rojo con la tinción de Gram), de la familia Enterobacteriaceae. Las bacterias de esta familia se caracterizan por ser capaces de respirar de forma facultativa: anaeróbicamente en el interior del intestino y aeróbicamente en el ambiente exterior. Gracias a esta capacidad muchos de los miembros de la familia son de vida libre, mientras que otros son principalmente comensales de animales invertebrados, vertebrados o son patógenos de plantas (Souza et al). 1 En particular, E. coli prefiere utilizar azúcares sencillos como la glucosa, produce ácido y gas en presencia de lactosa y como no es una bacteria fijadora, requiere nitrógeno soluble como el sulfato de amonio. Es móvil por medio de flagelos localizados en toda la periferia celular y el tamaño promedio del bacilo es de 0.5 micras de ancho por 3 de largo (Eslava et al., 2001) Los miembros de la familia de enterobacterias presentan una amplia variedad de antígenos, de los cuales, los principales incluyen el de la cápsula, que se conoce como antígeno “K” y cuya composición es de polisacáridos. El antígeno somático, llamado “O”, también de composición polisacárida y el antígeno flagelar o “H”, de constitución proteica. Además de los antes mencionados, se conocen otros antígenos, como es el caso de proteínas de membrana externa y diversas fimbrias (Eslava et al., 2001). Mediante el análisis de sus propiedades metabólicas se han descrito las siguientes 5 especies del género Escherichia: E. blattae, E. coli, E. fergusonnii, E. hermannii y E. vulneris (Eslava et al., 2001). La densidad de E. coli en el intestino grueso es de 1 a 106 células por gramo de colon; por lo que es un componente significativo de la biota predominantemente anaerobia de esta parte del intestino, donde la densidad bacteriana total es de unas 1011 células por gramo. E. coli es una de las primeras especies que coloniza al mamífero recién nacido, que adquiere las primeras cepas del canal de parto y de las heces de su madre (Bettelheim, 1994). Las colonizaciones posteriores se deben por lo general a la ingestión de alimentos contaminados. Existen muchas clonas de E. coli altamente adaptadas que han adquirido atributos de virulencia específicos, que les confieren habilidad para adaptarse a nuevos nichos (Kaper et al., 2004). Entre éstas, se ha propuesto la emergencia de clonas que en el proceso evolutivo, han sufrido cambios genéticos (adquisición de material genético horizontalmente), que les han conferido 2 propiedades de virulencia mediante las cuales pueden causar enfermedad, incluso en individuos sin trastornos inmunes graves (Eslava et al., 2001). Estos atributos de virulencia están frecuentemente codificados en elementos genéticos que se pueden movilizar hacia diferentes cepas para crear nuevas combinaciones de factores de virulencia. De éstas, sólo las combinaciones más exitosas han persistido para generar patotipos específicos de E. coli (Kaper et al., 2004). Tres síndromes clínicos generales pueden resultar de la infección con alguno de estos patotipos: enfermedades entéricas o diarréicas causadas por patógenos intestinales, infecciones del tracto urinario causadas por E. coli uropatogénica (UPEC por uropathogenic E. coli) y sepsis/meningitis producidas por E. coli asociada a meningitis (MNEC por meningitis-associated E. coli) . Los patotipos de E. coli implicados en infecciones extraintestinales recientemente se han nombrado ExPEC (Kaper et al., 2004). Entre los patógenos intestinales se distinguen seis categorías (Fig. 2), la cuales se describirán brevemente en los párrafos siguientes. Citotoxinas y enterotoxinas (Pic, Pet, EAST1) Lisis de vacuola Movimiento en citoplasma Migración a célula adyacente Citotoxinas y enterotoxinas (Pic, Pet, EAST1) Lisis de vacuola Movimiento en citoplasma Migración a célula adyacente 3 Fig. 2. Mecanismos de patogénesis de las seis categorías reconocidas de E. coli diarreagénicas (a) E. coli enteropatógena (EPEC), 1. Adherencia localizada, 2. Translocación de proteínas por el SST3, 3. Formación de pedestal; (b) E. coli enterohemorrágica (EHEC) (Stx: toxina Shiga); (c) E. coli enterotoxigénica (ETEC) (ST: enterotoxina termoestable, LT: enterotoxina termolábil, CFA: antígeno factor de colonización, GM1 y GD1b: gangliósidos de superficie); (d) E. coli enteroagregativa (EAEC) (AAF: fimbria de adherencia agregativa, Pic: proteína involucrada en colonización intestinal, Pet: enterotoxina codificada en plásmido, EAST1: ST1 de E. coli enteroagregativa); (e) E. coli enteroinvasiva (EIEC) y (f) E. coli de adherencia difusa (DAEC) (F1845: adhesina fimbrial, DAF: factor de aceleración de descomposición) (Modificada de Kaper et.al, 2004). E. coli enteroinvasiva (EIEC por enteroinvasive E. coli ) Está estrechamente relacionada bioquímica, genética y patogénicamente a Shigella spp, sólo son distinguibles por pocas pruebas bioquímicas. Su mecanismo de patogenicidad se distingue por la capacidad de invadir y reproducirse dentro del citoplasma de la célula hospedera, ocasionando su destrucción. Diversos estudios han concluido que además de los genes cromosómicos involucrados en la virulencia, EIEC porta un plásmido de 140 MDa indispensable para conferir el fenotipo invasivo (Eslava et al., 2001), ya que ésta es la única de las cepas que invade de manera intracelular. El primer paso en el proceso de patogénesis es la adherencia de las bacterias a las microvellosidades de la mucosa intestinal, en donde comienzan a formar una vesícula en la membrana. Lo anterior da lugar a que se facilite la penetración de la bacteria, la que se establece y multiplica en el interior de la célula intestinal para de ahí invadir células adyacentes a través de su migración por el citoesqueleto. Las manifestaciones clínicas asociadas con esta infección son: evacuaciones escasas acompañadas de moco y sangre, dolor abdominal tipo cólico, fiebre y en ocasiones hasta disentería (Eslava et al., 2001). 4 E. coli enterotoxigénica (ETEC por enterotoxigenic E. coli) Coloniza la superficie mucosa del intestino delgado y elabora enterotoxinas que dan lugar a la secreción intestinal. La colonización está mediada por una o más fimbrias o factores fibrilares de colonización (CFs) (Kaper et al., 2004). ETEC elabora enterotoxinas pertenecientes a uno de dos grupos: termoestables (ST) y termolábiles (LT); las segundas son semejantes en estructura y función a la toxina causante del cólera producida por Vibrio cholerae. Se conocen dos variedades de LT, LT-I y LT-II, las cuales son antigénicamente diferentes (Eslava et al., 2001). Las LT pueden estimular la síntesis de prostaglandinas y estimular el sistema nervioso entérico; dichas actividades juntas estimulan la secreción e inhiben la absorción. Las enterotoxinas ST son de bajo peso molecular e incluyen dos clases, STa y STb, que difieren tanto en estructura como en mecanismo de acción; y sólo STa se ha relacionado a enfermedades en el humano (Kaper et al., 2004). ETEC se adquiere a través del consumo de agua y alimentos contaminados; el cuadroclínico que induce es similar al que se observa en el caso del cólera, presentándose de ocho a doce evacuaciones al día por un periodo de cuatro a cinco días. Las cepas ETEC son una causa importante de diarrea en niños menores de cinco años de edad y la causa más frecuente de la llamada “diarrea del viajero”. E. coli enteroagregativa (EAEC por enteroaggregative E. coli) Las cepas EAEC derivan su nombre de la forma de adherencia que presentan a células de cultivo de epitelioma humano tipo dos (HEp-2). Esta adherencia se 5 caracteriza por la formación de agregados bacterianos, con una apariencia de ladrillos apilados (Eslava et al., 2001). La estrategia básica de infección parece abarcar la colonización de la mucosa intestinal, predominantemente del colon, seguida por la secreción de enterotoxinas y citotoxinas. La adherencia de tipo agregativa ha sido asociada a un plásmido de 65 MDa, que codifica para fimbrias (AAF por aggregative adherence fimbriae) que les permiten adherirse de forma agregativa a las células HEp-2 y unirse al epitelio intestinal. Esta cepa sintetiza varias toxinas, de las que destaca una de bajo peso molecular (5-10 kDa), denominada enterotoxina termoestable 1 de EAEC (EAST1), que incrementa los niveles de GMPc (Eslava et al., 2001). Muchas cepas secretan una toxina autotransportadora llamada Pet, que ocasiona cambios en el citoesqueleto de la célula hospedera. Las características clínicas de la infección intestinal por EAEC son diversas, observándose cuadros de diarrea secretora con moco y sangre y con fiebre en bajo grado. El grupo EAEC ha adquirido relevancia en los últimos años por considerársele responsable de cuadros de diarrea persistente (más de 14 días) en niños y adultos de diversas regiones geográficas, principalmente en países en vías de desarrollo (Eslava et al., 2001). E. coli de adherencia difusa (DAEC por diffusely adherent E. coli) Se define por la presencia de un patrón de adherencia en monocapas a células HEp-2. DAEC induce un efecto citopático caracterizado por el desarrollo de extensiones celulares largas, las cuales resguardan a la bacteria adherente. Este efecto característico requiere unión y aglomeración del receptor DAF por 6 las fimbrias. La unión se acompaña de la activación de cascadas de transducción de señales, incluyendo la activación del fosfatidil inositol (PI). DAEC causa diarrea, particularmente en niños menores de un año (Kaper et al., 2004). E. coli enterohemorrágica (EHEC por enterohaemorrhagic E. coli) El principal reservorio de EHEC es el tracto intestinal de bovinos y los brotes iniciales fueron asociados con el consumo de carne de res mal cocida, por lo que al padecimiento se le denominó popularmente “enfermedad de la hamburguesa” (Kaper et al., 2004). EHEC, debido a la presencia de un plásmido de 60 MDa, tiene la capacidad de elaborar toxinas Shiga (Stx) que interrumpen la síntesis de proteínas y matan a las células epiteliales o endoteliales intoxicadas. Las Stx son producidas en el colon, viajan por torrente sanguíneo hasta el riñón, donde dañan las células renales endoteliales, induciendo producción de citocinas y quimiocinas que provocan inflamación renal. La bacteria produce también un daño celular en el intestino conocido como adherencia y esfacelamiento (A/E), los genes responsables de dicha histopatología están insertados en una isla de patogenicidad de 35 Kb llamada locus de esfacelamiento enterocítico (LEE) (Eslava et al., 2001). EHEC se ha asociado con la etiopatogenia de colitis hemorrágica afebril, síndrome urémico hemolítico y púrpura trombocitopénica (Kaper et al., 2004). E. coli enteropatógena (EPEC por enteropathogenic E. coli) 7 Por último, se describe la patogénesis de EPEC que constituye nuestro modelo de estudio. Estas cepas enteropatógenas están adaptadas a hospederos humanos causando diarrea aguda y gran mortandad en niños menores de 2 años de países en vías de desarrollo. Se estima que causa la muerte de muchos miles de niños al año (Goosney et al., 2000). La razón por la cual la incidencia en adultos es muy baja aún no es clara, pero podría deberse a la pérdida de receptores específicos con la edad o por desarrollo de inmunidad. Las epidemias son esporádicas y suceden en hospitales o guarderías. Cuando son adultos los infectados, se debe a la ingestión de gran cantidad de inóculo o a individuos inmunosuprimidos (Nataro y Kaper, 1998). La transmisión de EPEC es por vía fecal-oral y generalmente a través de manos u otros objetos contaminados. Se han encontrado serotipos característicos de EPEC en aire, agua, comida y en los excrementos de animales, que pueden servir como reservorios de estas bacterias (Nataro y Kaper, 1998). En 1995 durante el Segundo Simposio Internacional sobre EPEC se propuso una definición consenso: “las cepas que producen la lesión A/E, negativas para la toxina de tipo Shiga (Stx) y que poseen el plásmido EAF (del inglés EPEC Adherence Factor) son consideradas como EPEC típicas, mientras que las que no tienen el plásmido son cepas EPEC atípicas” (Nataro y Kaper, 1998). La cepa de EPEC más estudiada y denominada prototipo, es la E2348/69 (serotipo O127:H6). En 1991 Girón et al. identificaron unos filamentos en EPEC que se agregan formando un pilus tipo IV (BFP del inglés Bundle-Forming Pilus), los cuales se enmadejan de tal manera que forman una estructura tridimensional donde se embeben las bacterias (Fig. 3). Esta también llamada fimbria BFP es importante 8 en la patogenicidad de la bacteria, ya que es la responsable de las interacciones bacteria-bacteria que resulta en la formación de microcolonias y también participa en la adherencia inicial de EPEC a las células hospederas (Cleary et al., 2004). La producción del BFP se asocia con la presencia de un plásmido que codifica para factores de adherencia y que es llamado EAF. Las cepas de EPEC que carecen de este plásmido son menos virulentas en humanos y se adhieren pobremente a células HEp-2 (Kaper et al., 2004). Un estudio demostró que las EPEC que no tienen el plásmido EAF o el gen funcional bfpA (que codifica para la subunidad principal de la fimbria BFP), continúan infectando la mucosa y causando la lesión A/E pero no se forman microcolonias (Frankel et al.,1998). Fig. 3. Fotografías de microscopía electrónica que muestran la fimbria BFP de EPEC. (A) Nataro y Kaper, 1998, la barra representa 0.35 µm. (B) El BFP es responsable de las interacciones bacteria-bacteria, que resulta en la formación de microcolonias (Tobe y Sasakawa, 2001). Los patógenos bacterianos han desarrollado muchas estrategias para sobrevivir y persistir dentro de un hospedero. Entre estos mecanismos, patógenos como EPEC, EHEC y Citrobacter rodentium, poseen la habilidad de producir una lesión histológica llamada de adherencia y esfacelamiento (A/E). Este fenotipo está caracterizado por la eliminación o esfacelamiento de las microvellosidades 9 de la mucosa del intestino delgado y la adherencia íntima de la bacteria a la célula epitelial. Los genes que codifican para esta lesión se encuentran juntos en el cromosoma formando lo que se ha llamado una "isla de patogenicidad" (PAI por pathogenicity island), que en este caso en particular se denomina Locus de Esfacelamineto Enterocítico (LEE) (Elliott et al., 1998). La infección y la inducción de la lesión A/E por EPEC se ha descrito con un modelo patogénico de tres etapas (Donnenberg y Kaper, 1992). EPECETAPA 1: adherencia inicial Al comienzo de la infección la bacteria se adhiere de manera no íntima a las células del epitelio intestinal, en un patrón conocido como adherencia localizada (AL) que se caracteriza por la formación de microcolonias bacterianas (Fig 4B). Como se mencionó anteriormente, dicho fenotipo es mediado por el pilus BFP, fimbria codificadapor los genes plasmídicos bfp y que tiende a agregarse en forma de cordones, permitiendo así las interacciones entre bacterias y bacteria- hospedero. Otro componente de superficie que puede contribuir a la adherencia inicial es el filamento EspA, del que se hablará más adelante (Blank et al., 2002) y el flagelo (Fig. 4A) (Girón et al., 2002). Fig. 4. (A) Adhesión de EPEC a la célula hospedera (Modificada de Nougayré y col., B 10 2003) y (B) Fotografía de microscopía electrónica mostrando el patrón de adherencia localizada (Tomada de Donnenberg lab images: http://medschool.umaryland.edu/infemsd/Images.htm). ETAPA 2: secreción y transducción de señales Inmediatamente después de la adherencia inicial, EPEC inyecta una serie de proteínas efectoras que van a eliminar las microvellosidades del epitelio intestinal y a interferir con distintas rutas de señalización en las células hospederas (Fig. 5), dichas proteínas son secretadas por el sistema de secreción tipo 3 (SST3) (Vallance y Finlay, 2000). El SST3 es una estructura compleja de más de 20 proteínas que forma un aparato macromolecular denominado inyectisoma, el cual es utilizado por muchas bacterias patógenas y actúa como una jeringa molecular para inyectar proteínas efectoras directamente al citosol de la célula hospedera. Como consecuencia de la translocación de proteínas efectoras, se genera un aumento en los flujos intracelulares de calcio (Ca+2), inducido por el inositol trifosfato (IP3), lo que resulta en cambios importantes del citoesqueleto del enterocito debido al rompimiento y polimerización de la actina. El IP3 resulta del rompimiento del fosfatidil inositol (PI) por la enzima fosfolipasa C, la cual parece ser activada por la bacteria (Baldwin et al., 1991; Goosney et al., 2000). Otras alteraciones a las células epiteliales del hospedero causadas por EPEC son: interrupción de la función de la barrera intestinal, incluyendo un incremento en la permeabilidad de las uniones estrechas paralelo a un decremento en la resistencia transepitelial; pérdida del potencial de membrana mitocondrial, ocasionando la formación de mitocondrias anómalas; inhibición de las transición de la fase G2-M del ciclo celular y la inducción de apoptosis celular (Fig. 5) (Garmedia et al., 2005). 11 Fig. 5. Activación de rutas de transducción de señales en la célula huésped por proteínas efectoras de EPEC. La activación de diversas rutas de transducción de señales genera varios cambios en la célula huésped, como son, aumento en el nivel intracelular de calcio, activación de la cascada de inositol trifosfato y el reordenamiento de las proteínas del citoesqueleto (Modificada de Garmedia et al., 2005). ETAPA 3: adherencia íntima La adherencia íntima de la bacteria al enterocito (Fig. 6A) está mediada por la intimina (codificada por el gen eae), que es una adhesina de la membrana externa de EPEC, que se une a su receptor Tir (Goosney, 2000). Para que esto suceda la proteína Tir es translocada a través del SST3 desde la célula bacteriana hasta la membrana de la célula epitelial donde se inserta y es fosforilada (Nataro y Kaper, 1998). La fosforilación de Tir se da por cinasas de 12 Lesión A/E Aheración en secreción de iones ir uniones estrechas fibras aberrantes Dominios N-terminal "'º rr Reclutamiento de neutréfilos/ dañ:i tisular de intimina conser avdos o lnt290 alfa .,. lnt290gamma <:fJ Tirtyr-P 4 Nck .,, microtLbulos I N-WASP t" Arp2/3 0 CK8/CK18 ' proteínas de adhesién focal • actina f la célula hospedera, en dos residuos de tirosina (Y454 e Y474), y es un evento crítico para el remodelaje de actina ya que permite la unión de Nck, (una proteína adaptadora del hospedero), que recluta a la proteína N-WASP (proteína del síndrome neural Wiskott-Aldrich), la cual a su vez recluta y activa al complejo de proteínas relacionadas con actina 2 y 3 (Arp2/3). El complejo Arp2/3 lleva a cabo la nucleación, formación y ramificación de los filamentos de actina (Fig. 6B) (Hayward et al., 2006; Nougayrede et. al, 2003). Tir, una vez insertado en la membrana de la célula hospedera, funciona como receptor de la intimina produciéndose la unión íntima de EPEC a la célula intestinal. La interacción intimina-Tir promueve el reclutamiento de proteínas del citoesqueleto, principalmente actina, pero también de otras proteínas incluyendo α-actina, talina, ezrina, cadenas ligeras de miosina (MLC), VASP, N- WASP y el complejo Arp2/3. Este reclutamiento permite la formación de una estructura rica en actina en forma de pseudópodo o pedestal (Fig. 6C) (Chen y Frankel, 2005; Goosney et al., 2000). Esta estructura se forma por debajo del sitio de adhesión de la bacteria y se puede extender hasta 10 µm de longitud (Goosney et al., 2000). Dicha estructura es dinámica, con la capacidad de cambiar su longitud, forma y posición en el tiempo (Blank et al., 2002). Se cree que la unión de la bacteria al pedestal provee una fuerte adherencia de EPEC a la superficie celular, previniendo que EPEC sea eliminada al sobrevenir la diarrea. 13 Fig. 6. (A) Fotografía de microscopía electrónica que muestra la adherencia íntima de la bacteria y la eliminación de las microvellosidades del epitelio intestinal (Modificada de Frankel et al., 1998); (B) Interacción Tir-intimina y cascada de señalización (Modificada de Pizarro-Cerdá y Cossart, 2006) y (C) Fotografía de microscopía electrónica que muestra a EPEC sobre pedestales en células HeLa (Modificada de Pizarro-Cerdá y Cossart, 2006). Producción de diarrea La principal manifestación clínica de la infección por EPEC es la diarrea acuosa, que puede contener moco pero no sangre. Otros síntomas asociados pueden incluir fiebre, malestares, vómito, intolerancia a la comida, deshidratación y pérdida de peso. La diarrea puede durar de 5-15 días, pero puede convertirse en crónica (Blank et al., 2002). A pesar de los avances en el entendimiento de la patogénesis de EPEC a nivel celular y genético, la patofisiología de la diarrea resultante sigue siendo incierta. La pérdida de las microvellosidades y la consecuente mala absorción junto con la deficiencia de enzimas (disacaridasas) en esta región contribuyen a la diarrea (Chen y Frankel, 2005). Las causas de la aparición de diarrea en individuos infectados con bacterias que pertenecen a serotipos correspondientes a EPEC y EHEC son 14 multifactoriales. Varias investigaciones han involucrado la alteración del transporte de electrolitos y la apertura de canales durante la infección de EPEC. La alteración de la permeabilidad epitelial puede también contribuir. Como se describió, la secreción de efectores por EPEC es capaz de inducir una cascada de señalización dentro de la célula hospedera, resultando en la fosforilación de las cadenas ligeras de la miosina (MLC), ocasionando un incremento en la permeabilidad de las uniones estrechas y contribuyendo así a la diarrea, afectándose el proceso de transporte y absorción pasiva de agua como consecuencia de la disipación del gradiente electroquímico (Chen y Frankel, 2005; Manjarrez-Hernández et al., 1996). Estas alteraciones, junto con el esfacelamiento de las microvellosidades del epitelio, que impide la correcta función de absorción, son también responsables de la aparición de la diarrea intensa (Nataro y Kaper, 1998). Las investigaciones enfocadas hacia elucidar cómo EPEC causa diarrea se han realizado sobre todo en modelos in vitro con diversas líneas celulares ya que EPEC tiene una alta especificidad a su hospedero, el humano, y los estudios en éste son muy limitados. Sin embargo, hay algunas bacterias que comparten factores y mecanismos similares de virulencia con EPEC y que causan enfermedades análogas en animales; entre éstas se encuentra el patógeno de roedores Citrobacter rodentium, que proporcionauna alternativa de modelo in vivo conveniente para estudiar la patogénesis de EPEC. Recientemente, empleando modelos de infección in vivo con C. rodentium, se descubrió que las acuaporinas (canales de agua) juegan también un papel importante durante la producción de diarrea por patógenos A/E, alterándose la distribución de las mismas durante la enfermedad (Guttman et al., 2007). Sea cual sea el mecanismo, la diarrea es benéfica para EPEC, ya que interrumpe el equilibrio del hospedero, proporcionando a EPEC una ventaja competitiva sobre la biota intestinal normal. 15 Locus de esfacelamiento enterocítico (LEE) Las islas de patogenicidad (PAI) son regiones grandes de ADN (10-200kb) presentes en los genomas de cepas patógenas y ausentes en los genomas de miembros no patógenos de la misma especie o especies relacionadas. Las PAI están típicamente asociadas a genes que codifican para ARNs de transferencia y tienen un contenido menor de G+C (38.3%) comparado con el ADN cromosomal (50.8%), sugiriendo que provienen de transferencia horizontal de genes. A menudo llevan genes crípticos o funcionales que codifican factores de movilidad, como las integrasas y transposasas. Las PAI fueron descritas primero en cepas de E. coli patógenas y han sido encontradas subsecuentemente en muchas bacterias Gram negativas y positivas (Kaper et al., 2004) incluyendo EHEC, Hafnia alvei, Citrobacter rodentium y el patógeno de conejos RDEC-1 (Frankel et al., 1998). EPEC contiene una isla de patogenicidad cromosomal de 35.6 kb llamada locus de esfacelamiento enterocítico (LEE) que es un casete funcional (insertado en el gen selC tRNA) necesario y suficiente para la virulencia, ya que se ha introducido el LEE completo en E.coli K12 (cepa no patógena) resultando en una cepa patógena capaz de formar la lesión A/E (McDaniel y Kaper, 1997). Esto refuerza la noción de que una bacteria no virulenta puede ser transformada en patógena en un solo paso (Clarke et al., 2003). La secuenciación completa del LEE de EPEC mostró que contiene 41 marcos de lectura abierta (ORFs) organizados en 5 operones policistrónicos (LEE1 al LEE5), 2 operones bicistrónicos y 4 unidades monocistrónicas (Barba et al., 2005; Elliott et al., 1998) (Fig. 7). Los genes están separados en tres dominios funcionales: una región (LEE5) que codifica la adherencia íntima (Tir, intimina y la chaperona CesT), una región (LEE4) que codifica, entre otras, a las proteínas secretadas por EPEC (EspA, EspB, EspD y EspF) y la tercera región (LEE1-3) codifica al regulador transcripcional Ler así como las subunidades 16 estructurales del sistema de secreción tipo III, genes sep y esc (Chen y Frankel, 2005; Goosney et al., 2000). Fig. 7 Locus de esfacelamiento enterocítico (LEE) de EPEC (Dean et al., 2005 modificada por García E) La regulación de la expresión del LEE es compleja, depende de condiciones ambientales, quorum sensing y varios reguladores transcripcionales, incluyendo a Ler, GrlA y GrlR, que pertenecen a la isla LEE. El análisis de la regulación de los genes codificados en el LEE ha permitido establecer un modelo de la cascada reguladora que coordina dicha expresión. Ler, codificado por el primer gen del operón LEE1, regula positivamente la transcripción de los operones LEE2 a LEE5, además de otros promotores dentro y fuera del LEE como espC. Ler actúa como un desrepresor que contrarresta el efecto negativo que ejerce H-NS sobre la expresión de estos genes. GrlA es esencial para la activación eficiente de los genes de la isla ya que activa directamente al gen que codifica para Ler, con quien establece un circuito regulador positivo ya que Ler también activa la expresión del operón grlRA. Por su parte, GrlR parece actuar como modulador negativo de la actividad del mencionado circuito Ler- GrlA, a través de su interacción con GrlA (Barba et al., 2005). El regulador global Per pertenece a la familia de activadores transcripcionales denominada AraC y está codificado en el plásmido EAF, que también codifica para la fimbria BFP. El operón per codifica para las proteínas PerA, PerB y PerC. PerA regula la producción de la fimbria BFP a través de la activación de 17 los genes bfpA y perA. Por su parte, PerC activa la expresión del gen ler, dando lugar a una cascada reguladora dependiente de PerA ya que éste autorregula la expresión del operón per. En EPEC PerC y GrlA tienen una función redundante en la activación de ler, pero no en las mismas condiciones de crecimiento, lo cual sugiere que podrían actuar durante diferentes etapas de la infección (Barba et al., 2005; Frankel et al., 1998). LEE codifica 6 proteínas efectoras, Tir, Map, EspF, EspG, EspH y EspZ que son translocadas vía SST3 directamente a la célula hospedera para inducir cambios en la misma y son necesarias para la formación de la lesión A/E (Spears et al., 2006). Además de los efectores codificados en el LEE, existen otros localizados en profagos u otras PAI que también son translocados a la célula hospedera vía SST3; de los cuales se han identificado dos para EPEC, Cif y EspG2. El primero se requiere para la inducción de un efecto citopático irreversible caracterizado por el reclutamiento progresivo de placas de adhesión focal, ensamblaje de fibras y la inhibición de la transición G2/M del ciclo celular. EspG2 es un ejemplo de redundancia funcional de efectores ya que tiene un papel similar al de EspG, compartiendo 43.5% de identidad con dicha proteína. 18 Sistemas de secreción de bacterias Gram negativas Los sistemas de secreción secretan toxinas y proteínas efectoras al medio extracelular o directamente a las células del hospedero (Remaut y Waksman, 2004). La exportación de las proteínas a la superficie bacteriana involucra la transferencia a través de la membrana interna (MI), el periplasma y la membrana externa (ME). En bacterias Gram negativas se han identificado seis diferentes vías de secreción, que a su vez se dividen en dos grandes clases dependiendo del mecanismo que se utilice para el transporte a través de la membrana plasmática (interna): vías dependientes e independientes de Sec (González-Pedrajo y Dreyfus, 2003) (Fig. 8). Fig. 8 Presentación esquemática de las vías de secreción Sec-dependientes y Sec- independientes en bacterias Gram negativas. La vía tipo 1 está ejemplificada por la secreción de hemolisina A (HlyA) en E. coli, la vía tipo 3 por la secreción de YopE en Yersinia pestis, la vía tipo 4 por la proteína VirE2 de Agrobacterium tumefaciens, la vía 19 chaperona-usher por la secreción de la subunidad PapA del pilus en UPEC, la vía de los autotransportadores por la secreción de la proteasa IgA1 (IgAp) en Neisseria gonorrhoeae y la vía de secreción tipo 2 por la secreción de la pululanasa (PulA) en Klebsiella oxytoca ME:membrana externa, MI: membrana interna y P: periplasma (Modificada de Kostakioti et al., 2005). Sistemas de secreción Sec dependientes En esta vía se secretan proteínas parcialmente desplegadas a través de la bicapa lipídica por medio de un canal multiproteico formado en la membrana interna, denominado translocasa Sec, el cual facilita el paso de las proteínas. En los sistemas Sec dependientes las proteínas a secretarse presentan una secuencia señal o péptido líder en el extremo amino terminal, que es reconocido por la chaperona SecB, la que dirige a la proteína a secretarse a la ATPasa SecA asociada con la translocasa de membrana interna SecYEG; una vez que la proteína atraviesa la membrana interna la secuencia señal es removida por peptidasas periplásmicas (Hueck, 1998). En la vía Sec de E. coli participan las proteínas de membrana interna SecD, SecE, SecF, SecG y SecY, así como una serie de peptidasas. La ATPasa SecA, asociada a la parte citoplásmica de la membrana interna, provee la energíapara la exportación del sustrato y se encarga de la inserción membranal de éste; mientras que la chaperona citoplásmica SecB, se une a la proteína a secretarse para mantenerla desplegada y subsecuentemente dirigirla al complejo heteroproteico SecYEG que forma el canal de secreción (González-Pedrajo, 2003). ■Sistema de secreción tipo 2. Es responsable de secretar una gran cantidad de enzimas hidrolíticas y toxinas, como la toxina del cólera. Una vez que la proteína está en el periplasma, adquiere su conformación nativa en el espacio periplásmico para posteriormente ser secretada a través de la ME por un complejo sistema multiproteico denominado tipo 2 o secretón (González-Pedrajo y Dreyfus, 2003). 20 ■Chaperona-usher (guardián). Esta vía es utilizada para producir pili tipo 1 en la superficie de la bacteria. Requiere de una chaperona periplásmica que estabiliza las subunidades de pilina y de una proteína de ME llamada “usher”, que disocia a la chaperona de la proteína, permitiendo el ensamblaje de la subunidad al pilus (Remaut y Waksman, 2004; Thanassi y Hultgren, 2000). ■Autotransportadores o sistema de secreción tipo 5. Su principal característica es que los sustratos pueden mediar su propio transporte a través de la ME. Las proteínas secretadas por esta vía son típicamente factores de virulencia con diversos papeles en la patogénesis (Kostakioti et al., 2005). Sistemas de secreción Sec independientes En éstos no se utiliza la translocasa Sec, los sustratos se pueden secretar directamente desde el citosol hasta el exterior de la célula sin que exista un intermediario periplásmico, ni una secuencia señal en el amino terminal. Para ello, utilizan un canal que forma el propio sistema secretor (González-Pedrajo y Dreyfus, 2003). ■Sistema de secreción tipo 1 o ABC (ATP- binding cassette). Está involucrado en la exportación de toxinas, proteasas y lipasas. Contiene tres componentes: una proteína transportadora ABC en la membrana interna, una proteína de membrana externa (PME) y una proteína de fusión que conecta a las dos durante la translocación de sustratos (Remaut y Waksman, 2004). El prototipo para ejemplificar este sistema es la secreción de la toxina α-hemolisina (HlyA) en E. coli (González-Pedrajo y Dreyfus, 2003). ■Sistema de secreción tipo 4. Este sistema es una transportador versátil que secreta tanto ácidos nucleicos como proteínas. El sistema modelo es el del transporte del ADN oncogénico y proteínas efectoras hacia el núcleo de células vegetales por el fitopatógeno Agrobacterium tumefaciens. Este sistema consiste de 12 componentes denominados VirB1-11 y VirD4, que transfieren el complejo 21 proteína-ADN en un solo paso desde el citoplasma hasta la célula eucarionte a través del pilus-T (González-Pedrajo y Dreyfus, 2003). Esta maquinaria es accionada por tres ATPasas o proteínas de unión a nucleótidos (VirB4, VirB11 y VirD4) y los demás son componentes del núcleo (VirB6-10) (Remaut y Waksman, 2004). ■Sistema de secreción tipo 3 (SST3). Este sistema es de particular interés para nuestro grupo de trabajo por lo que se describirá más detalladamente. Sistema de secreción tipo 3 (SST3) El SST3 está presente en muchas bacterias que infectan tanto animales como plantas y también en endosimbiontes (Hueck, 1998; Mota et al., 2005). Es utilizado para translocar proteínas a través de las membranas e inyectar algunas de ellas (efectores) directamente hacia el citoplasma de la célula blanco (Garmedia et al., 2005). Entre los patógenos de animales, el SST3 ha sido intensamente estudiado en Yersinia spp, Salmonella spp., Shigella spp., Pseudomonas aeruginosa, EPEC y EHEC. En plantas el principal modelo de estudio es P. syringae (Mota et al., 2005). El análisis de los genes que codifican el SST3 revela que las subunidades que forman el aparato están altamente conservadas entre las especies bacterianas y dan lugar a estructuras similares, aunque los efectores que se secretan son divergentes; ilustrando así cómo un mismo mecanismo de patogenicidad puede dar lugar a múltiples daños o enfermedades (Hueck, 1998). El SST3 es utilizado para diferentes propósitos en cada bacteria. Los patógenos intracelulares como las especies de Salmonella y Shigella lo utilizan para la invasión y la multiplicación dentro de las células hospederas; Yersinia spp. lo usa para resistir el ataque de las células fagocíticas en las fases tardías de la 22 patogénesis; el SST3 de P. aeruginosa induce cambios morfológicos en las células epiteliales del pulmón, alterando la actina del citoesqueleto e induciendo apoptosis en macrófagos infectados, inhibiendo así la fagocitosis (He et al., 2004). Estructuralmente, el SST3 o inyectisoma (Fig. 9) se compone de dos partes diferentes: (i) una base cilíndrica, similar al cuerpo basal del flagelo bacteriano, compuesta de dos pares de anillos que atraviesan la membrana interna y externa, unidos por un eje y (ii) una aguja extracelular. Para el caso específico de EPEC que es un patógeno extracelular, el inyectisoma se compone también de una estructura flexible llamada filamento EspA (Mota et al., 2005; Ogino et al., 2006). . Fig. 9. Sistema de secreción tipo 3 flagelar (Salmonella) y de virulencia (Yersinia), donde se muestra la similitud morfológica entre ambas maquinarias. Los SST3 son máquinas moleculares multiméricas (organelo de multicomponentes) ensambladas a partir de los productos de aproximadamente 20 a 25 genes (Goosney et al., 2000; Ghosh, 2004), Además de su papel en la secreción de efectores de virulencia por bacterias patógenas, un SST3 se utiliza también en la biogénesis del flagelo bacteriano. Muchos de los componentes están ampliamente conservados entre los SST3 de 23 virulencia y flagelar, las dos estructuras consisten de una sucesión de anillos de proteínas que atraviesan ambas membranas bacterianas, conectados por un eje central en el espacio periplásmico y con una aguja o gancho, respectivamente, como extensión extracelular (Fig. 10) (Garmedia et al., 2005). También, algunos de sus componentes comparten similitud de secuencia, en el ensamblaje y en los mecanismos de secreción y regulación (Blocker et al., 2003; He et al., 2004). Son aproximadamente 20 las proteínas que se requieren para una secreción tipo 3 óptima, de las cuales 9, las que forman el aparato de exportación comparten alta similitud de secuencia (He et al., 2004). Fig. 10. (A) Representación esquemática del sistema de secreción tipo 3 flagelar y los sistemas de secreción tipo 3 de virulencia en (B) Yersinia, (C) Escherichia coli enteropatógena y (D) Pseudomonas syringae. Son 9 las proteínas del cuerpo basal que están altamente conservadas entre los SST3. ME: membrana externa, PL: capa de peptidoglicano, MI: membrana interna., EM: membrana eucarionte y CW: pared celular de célula vegetal (Modificada de Tampakaki et al., 2004). Dada esta similitud, se ha sugerido que el SST3 de virulencia evolucionó a partir del SST3 involucrado en el ensamblaje del flagelo, pero esta es sólo una hipótesis, ya que no hay evidencia de datos moleculares evolutivos (He et al., 2004). Se piensa que los SST3 son adquisiciones genéticas recientes en los genomas de los 24 patógenos, sin embargo su origen no se conoce (Goosney et al., 2000). Una de las teorías más aceptadas es que ambos SST3, flagelar y de virulencia, están evolutivamente relacionados y divergieron independientemente de un sistema ancestral común (He et al., 2004). El ensamblaje del inyectisoma es secuencial. Primero, los componentes cercanos a la membrana interna, que portan una secuencia señal Sec dependiente, son exportados por medio de la translocasa Sec para establecer la base de lo que será el complejo aguja (NC por needle complex). Los componentes citosólicos son añadidos a la estructurabasal. La segunda fase del ensamblaje del NC ocurre de una manera Sec independiente, a través de la base de la aguja previamente ensamblada. Entonces el aparato secretor del SST3 se utiliza para la secreción de los componentes que constituyen los elementos más distales (Garmedia et al., 2005). Todos los SST3 contienen ATPasas citoplásmicas o asociadas a la membrana (proteína EscN en EPEC), que comparten similitud de secuencia con la subunidad catalítica β de la ATPasa bacteriana F0F1 y se cree que energizan la maquinaria de exportación tipo 3 y promueven la secreción de proteínas (Garmedia et al., 2005). En cuanto a los demás componentes estructurales, la proteína EscC pertenece a la familia de las secretinas, se encuentra en todos los SST3 de virulencia, y está involucrada en el transporte de moléculas a través de la membrana externa gracias a la formación de un complejo anular homomultimérico (Garmedia et al., 2005). La proteína EscJ, que está altamente conservada en los SST3, forma un anillo en la membrana interna, y el cristal de la proteína y modelaje del anillo se dilucidaron recientemente (Yip y col. 2005). La característica única del SST3 de EPEC es la presencia de una extensión filamentosa, llamada filamento EspA, que es un polímero de la proteína EspA, 25 único constituyente de este conducto filamentoso hueco. Dado que EPEC es un patógeno extracelular, el filamento EspA forma una unión física entre la bacteria y el hospedero, a lo largo de la cual los efectores bacterianos pueden viajar (Sekiya et al., 2001). La polimerización de los filamentos EspA está mediada por interacciones de tipo “coiled-coil” entre las subunidades EspA. Las nuevas subunidades que se van sintetizando son incorporadas en la punta del filamento en crecimiento. Se ha visto que los filamentos se unen directamente a la aguja EscF (Garmedia et al., 2005). El filamento es un tubo helicoidal con un diámetro externo de ca. 120 Å y un canal central hueco de ca. 25 Å de diámetro, su longitud, como se ha probado in situ, depende de la cantidad de EspA monomérica producida, variando en promedio de 40 a 140 nm y alcanzando hasta 700 nm (Garmedia et al., 2005; Ghosh, 2004). La evidencia experimental de que las proteínas secretadas a través del SST3 viajan por el filamento EspA, proviene de estudios en los que se muestra que la proteína Tir es secretada de la punta del filamento al medio extracelular (Fig. 11) (Crepin et al., 2005). Posterior a la translocación de las proteínas efectoras, el filamento EspA es eliminado de la superficie de la bacteria; esto es necesario para permitir la adherencia íntima de la bacteria a la célula eucarionte, aunque el mecanismo mediante el que se lleva a cabo la despolimerización aún se desconoce (Garmedia et al., 2005; Ghosh, 2004). 26 Fig. 11. Fotografía de microscopía electrónica (tinción con partículas de oro acopladas a anticuerpos anti-Tir) donde se muestra la secreción de la proteína efectora Tir en el extremo distal del filamento EspA. Barrra, 0.1 µm. (Tomada de Crepin et al., 2005). Las proteínas efectoras son liberadas al citoplasma del hospedero desde el extremo distal del filamento EspA, a través de un poro de translocación, de 1.5 a 3 nm de diámetro, formado en la membrana plasmática de la célula hospedera, constituido por las proteínas EspB y EspD denominadas translocadores (Garmedia et al. , 2005). Por otra parte, las chaperonas son esenciales para la secreción eficiente y translocación de muchas de las proteínas efectoras y translocadoras. Son proteínas con un punto isoeléctrico ácido (menor de 5.5) y de bajo tamaño molecular (ca. 15 kDa). La ausencia de chaperonas puede ser perjudicial para sus sustratos específicos, al deteriorar su estabilidad y/o secreción. Participan también en prevenir el plegamiento de los sustratos y dar prioridad a la secreción de efectores (jerarquía de secreción) (He et al., 2004). Las chaperonas tipo 3 tienen baja similitud de secuencia, sin embargo muestran alta similitud estructural (Garmedia et al., 2005). 27 A E&pA 111.ime~ La expresión óptima del SST3 de EPEC se observa durante la fase de crecimiento exponencial de la bacteria, a temperaturas de 35 a 37ºC, pH 7.0 y osmolaridad fisiológica, en presencia de calcio, bicarbonato de sodio y concentraciones milimolares de Fe(No3) y NH4+ (Hueck, 1998). El SST3 es regulado a diferentes niveles y la secreción sólo ocurre cuando una señal específica (de naturaleza desconocida), comienza la expresión de los genes del SST3. Con base en evidencia en Yersinia y Shigella se ha visto que la señal que dispara la secreción de efectores, es el contacto de la aguja con la célula hospedera, aunque aún se desconoce el mecanismo que bloquea la actividad del inyectisoma antes del contacto. Estudios recientes reportan que la bacteria podría también detectar el colesterol de la membrana lipídica de la célula eucarionte, y hay teorías que dicen que la punta de la aguja funciona como el detector del sistema (Mota et al., 2005). A continuación se describirán las estructuras del SST3 formadas por las proteínas que se purificaron en el presente trabajo: EscF (aguja) y EscI (eje). Aguja La aguja es la porción extracelular del inyectisoma (Fig. 12). Es una estructura recta, rígida y hueca; en EPEC está compuesta de una sola proteína, EscF, homóloga a la proteína correspondiente en diferentes bacterias (Tabla 1). La aguja forma un canal necesario para la secreción de proteínas dependientes del SST3, ya que una mutante en escF no produce complejos aguja, es deficiente en la translocación de moléculas efectoras y formación de lesión A/E y no forma filamento EspA (Sekiya et al., 2001). 28 Fig. 12. Fotografías de microscopía electrónica que muestran el marcaje con partículas de oro de los filamentos EspA, donde se muestran las agujas (flechas) adyacentes a la superficie bacteriana que no se marcan con el anticuerpo anti-EspA (Tomada de Wilson et al., 2001). Barra: 0.1 µm. La longitud de la aguja varía entre 45 y 80 nm de acuerdo a la especie bacteriana (Tabla 1) (Ghosh, 2004; Kubori et al., 1998), y ésta parece estar firmemente controlada por proteínas como Spa32 de Shigella, InvJ de Salmonella e YscP de Yersinia. Aunque el regulador en EPEC no ha sido identificado, recientemente, mediante un análisis bioinformático (Pallen et al., 2005) propusieron al Orf16 del LEE de EPEC como el posible ortólogo de YscP; sin embargo, se desconoce la función de la proteína. La proteína Orf16 podría participar en la regulación de la longitud de la aguja del inyectisoma de EPEC y en el cambio de especificidad en la secreción de sustratos. Dicha longitud parece haberse ajustado evolutivamente en relación a las dimensiones de otras estructuras de la superficie bacteriana, como las adhesinas o los lipopolisacáridos. En Shigella la aguja tiene 7 nm de ancho (en general es de 6 a 13 nm), y es una estructura helicoidal con ~5.6 subunidades de la proteína MxiH por giro. Basándose en estudios utilizando difracción de rayos X, se propuso una reconstrucción tridimensional de la aguja de S. flexneri (Fig. 13) (Cordes et al., 2003). Recientemente se obtuvo el cristal de MxiH, siendo el primer cristal de la subunidad de la aguja reportado para los SST3 y revela similitud a otras dos proteínas con 29 arquitectura helicoidal, la porción Do de la flagelina y a EspA de EPEC, ya que poseen dos hélices antiparalelas, como lo encontrado para MxiH, sugiriendo que esta característica estructural se requiere para el ensamblaje helicoidal (Deane et al., 2006). Fig. 13. Varias vistas de la reconstrucción 3D de la aguja de Shigella flexneri. A y B muestran una vista superior y vista lateral, respectivamente, de las agujas y C imagen compuesta que muestra un modelo para el complejo aguja (Deaneet al., 2006). Se ha reportado que Salmonella tiene entre 10 y 100 agujas por bacteria (Kubori et al., 1998) y Yersinia de 50 a 100 por bacteria (Hoiczyk y Blobel, 2001), mientras que EPEC sólo tiene 12 inyectisomas por célula (Wilson et al., 2001). Los dominios de proteínas plegadas tienen diámetros de 20 a 30 Å, sugiriendo que las proteínas efectoras transportadas a través del interior de la aguja necesitan estar parcial o totalmente desplegadas. Especie Proteína que la conforma Longitud Control longitud Salmonella PrgI (8.7 kDa) 80 nm InvJ Shigella MxiH (9.1 kDa) 45.4 ± 3.3 nm Spa32 Yersinia YscF (9.3 kDa) 58.0 ± 10 nm YscP EPEC EscF (8.1 kDa) 50nm Orf16? Tabla 1. Resumen de las características de las agujas de diferentes especies bacterianas. 30 Eje interno El análisis estructural del complejo aguja del SST3 de Salmonella typhimurium reveló que la proteína PrgJ, se localiza en la base del inyectisoma, formando el eje interno o canal en el espacio periplásmico (Fig.14), que sirve como molécula adaptadora que media el anclaje de las subunidades de la aguja a la base (Marlovits K et al., 2004; Sukhan et al., 2003). Fig. 14. Modelo de la organización de los principales componentes estructurales del complejo aguja de Salmonella typhimurium: PrgH, PrgK, PrgJ, InvG y PrgI. El asterisco marca el sitio de anclaje de la aguja (Marlovits, 2004). En el sistema codificado por el LEE aún no se ha descrito un componente similar a PrgJ, sin embargo búsquedas realizadas por PSI-BLAST indican que rOrf8 del SST3 de EPEC, es la proteína homóloga a EprJ (EHEC), PrgJ (Salmonella), MxiI (Shigella) y a una proteína aún no caracterizada YscI del sistema Ysc-Yop de Yersinia, sugiriendo que pudiera jugar un papel similar como componente del eje interno (Fig.15). Debido a esto, la proteína se nombró como EscI (Pallen et al., 2005). 31 Fig. 15. Alineamiento múltiple de EscI con proteínas relacionadas de otros SST3. Las abreviaturas de organismos y genes son los siguientes: EHEC (Escherichia coli O157:H7) EscI y EprJ, Sf (Shigella flexineri) MxiI y MxiH, St (Salmonella typhimurium) PrgJ y PrgI y Yp (Yersinia pestis CO92) YscI (Tomado de Pallen et al., 2005). Por último, un análisis hecho por Deng y col. (2004), utilizando un modelo animal con el patógeno de ratones Citrobacter rodentium, que induce lesión A/E y que posee un LEE muy similar al de EPEC y EHEC, reveló que una mutante en el gen escI bloquea la secreción tipo 3, no forma pedestales y no causa virulencia en ratones, suponiendo entonces que es un componente estructural del SST3 necesario para la virulencia. 32 l4) ll6 lll 102 79 8) •• Objetivo general Caracterización del sistema de secreción de efectores de virulencia en Escherichia coli enteropatógena. Objetivo particular Purificar las proteínas EscF y EscI y crear anticuerpos policlonales contra estas. Objetivos específicos 1. Amplificación por PCR de los genes escF y escI de EPEC. 2. Clonación de escF y escI en vectores multicopia para su secuenciación. 3. Subclonación de los genes en el vector pET19b para su expresión. 4. Determinar las condiciones óptimas de inducción de las proteínas recombinantes His-EscF y His-EscI. 5. Purificar las proteínas recombinantes His-EscF y His-EscI mediante cromatografía de afinidad. 6. Producción de anticuerpos policlonales contra las proteínas a partir de inmunizaciones de conejos. 33 Materiales y Métodos Crecimiento de cepas bacterianas E. coli se creció en medio Luria Bertani1 (LB) a 37 ºC con agitación (250 rpm). El crecimiento de los cultivos se determinó siguiendo la absorbancia a 600 nm en un espectrofotómetro (Pharmacia Biotech). Cuando fue necesario el medio se suplementó con los antibióticos ampicilina (Amp 100 µg/ml), cloranfenicol (Cm 25 µg/ml), estreptomicina (Sm 25 µg/ml), tetraciclina (Tc 25 µg/ml), kanamicina (Km 50 µg/ml) o ácido nalidíxico (Nal 20 µg/ml) con el objetivo de seleccionar las bacterias con dichas resistencias, o que tengan el plásmido que confiere resistencia a los mismos. Para detalles respecto a las cepas y sus genotipos ver tabla 2. Organismos y cepas Genotipo/descripción Fuente EPEC E2348/69 Prototipo EPEC cepa silvestre, serotipo: O127:H6. Nal o Sm resistente. Levine et al, 1978 E. coli Nova Blue BL21(DE3)pLysS Es una cepa K-12 utilizada como hospedero inicial para clonación y expresión; recA- endA - que facilitan la producción de ADN plasmídico y una alta eficiencia de transformación Contiene el plásmido pLysS que posee resistencia a cloranfenicol, y a la lisozima T7, un inhibidor de la T7 ARN polimerasa. Deficiente en las proteasas Lon y OmpT que Novagen Stratagene 1 Ver apéndice de medios y soluciones 34 Top 10 pudieran interferir en el aislamiento de proteínas recombinantes. Para expresión de genes a partir del promotor T7. Ideal para clonación de alta eficiencia y propagación de plásmidos. Permite la replicación estable de plásmidos de alto número de copia. hsdR para transformación eficiente de ADN amplificado por PCR. Invitrogen Tabla 2. Cepas utilizadas en este estudio Mantenimiento de las cepas bacterianas: La conservación a largo plazo de las cepas bacterianas se realizó almacenando a –70 ºC el cultivo crecido en medio líquido LB y añadiendo 1:1 v/v de glicerol al 50%. Plásmidos y oligonucleótidos Los plásmidos y oligonucleótidos usados en este estudio se enlistan en la siguiente tabla. Plásmido Descripción Referencia pUC18 pET-19b Vector pequeño de clonación (2686 pb), de alto número de copia, codifica para beta-lactamasa que confiere resistencia a ampicilina. Sitio de multiclonación dentro del gen lacZ. El plásmido recombinante da lugar a colonias blancas. AmpR AmpR, T7 lac, agrega una etiqueta de 10 histidinas en Fermentas Novagen 35 pCR–Blunt II- TOPO pJUescF pJEescF pJRescI pJEescI el N-terminal. Utilizado para la expresión de genes a partir del promotor T7. Permite la clonación de productos de PCR, con la selección directa de recombinantes vía interrupción del gen letal ccdB. Posee el gen kan (KmR). escF clonado en pUC18 escF clonado en pET19b escI clonado en PCR-Blunt II-TOPO escI clonado en pET19b Invitrogen Este estudio Este estudio Este estudio Este estudio Oligonucleó tido Secuencia (5´- 3´) Sitio de restricción escF-F escF-R escI-F escI-R M13 Reverse TGA GGG AAA TCA TAT GAA TTT ATC GCA GAA ATA TCA GGA TCC ATA AAA AGA GAG CAT ATG GAT GCA TTA TGC GTT TTT GGA TCC TTA TTG CAT CGA CAG GAA ACA GCT ATG AC NdeI BamHI NdeI BamHI Tabla 3. Plásmidos y oligonucleótidos usados en este estudio. 36 Purificación de ADN cromosomal de EPEC A partir de dos colonias de EPEC NalR y StrepR respectivamente, se hicieron dos cultivos de 2 ml de medio LB con el respectivo antibiótico y se incubaron a 37 ºC con agitación toda la noche (14 h). Se inocularon 50 ml de LB, y el antibiótico respectivo, con 1ml (1/50) de volumen de cada uno de los pre-cultivos anteriores y se crecieron a 37 ºC en agitación hasta alcanzar una densidad óptica (DO) de entre 0.8 y 1.0 a 600 nm. Las células se colectaron por centrifugación a 7650 x g por 10 min. Se desechó el sobrenadante, la pastilla se lavó con 25 ml de amortiguador TE y las células se centrifugaron en las condiciones antes mencionadas. La pastilla se resuspendió en 500 µl de amortiguador de sacarosa que contenía también 225 µl de EDTA (0.25M, pH 8.0), 50 µl delisozima (5mg/ml en Tris 25 mM, pH 8.0) y 7.5 µl de ARNasa (10 mg/ml en Acetato de sodio 0.1 M, pH 5.0) y se incubó en hielo 15 min. Para lisar la membrana celular se agregaron 150 µl de mezcla lítica de tritón y se incubó 15 min en hielo; después se agregaron 500 µl de agua estéril, se centrifugó a 34,500 x g por 30 min, se descartó el sobrenadante y se resuspendió la pastilla en 50 µl de amortiguador “A”. Se agregaron 50 µl de proteasa K (5 mg/ml disuelta en el amortiguador “A”) preincubada a 37º C y se dejó incubando a 37° C por 12 h con agitación ligera. Al siguiente día se hizo extracción con fenol:cloroformo (1:1) y se centrifugó a 12,000 x g por 10 min; la extracción se repitió hasta eliminar la interfase proteica blanca. Se hicieron dos extracciones con cloroformo-alcohol isoamílico, guardando el sobrenadante y centrifugando entre cada extracción a 12,000 x g por 10 min. El ADN se precipitó con 1/10 del volumen de sobrenadante de acetato de sodio 5 M pH 5.3 y 2½ volúmenes de etanol absoluto frío y se mantuvo a –70 ºC por 2 h y se centrifugó como en los pasos anteriores. 37 La pastilla se lavó con un volumen de etanol frío al 80% dos veces, se centrifugó a 12,000 x g por 15 min, se secó al vacío por 5 minutos y el ADN se resuspendió en 400 µl de agua estéril. El ADN se almacenó a –20 ºC para su uso posterior. Amplificación Se utilizó PCR (reacción en cadena de la ADN polimerasa) para amplificar escF y escI de la isla de patogenicidad LEE de EPEC y su posterior uso en la clonación. Para la reacción se utilizó como templado el ADN cromosomal purificado de EPEC, los oligonucleótidos diseñados (Tabla 2) y las enzimas termoestables Taq para la amplificación de escF y la enzima Pfu Turbo para amplificar escI. Los parámetros de la reacción del PCR dependieron del tamaño del fragmento, la enzima y de los valores de las temperaturas medias de desnaturalización (Tm) de los oligonucleótidos (ajustándose 5 °C por debajo del oligonucleótido con Tm más baja) por lo que, para amplificar los genes, se siguieron los esquemas siguientes: Tabla 4. Esquema de los programas de PCR empleados para la amplificación de los fragmentos de ADN. A. para escF y B. para escI. Los fragmentos obtenidos se analizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% en TAE 1X. Para el caso de escF, el producto amplificado se purificó a partir del gel mediante el sistema “Gel extraction kit“ de Qiagen 38 siguiendo las instrucciones del fabricante; y se digirió con las enzimas de restricción BamHI y NdeI para su posterior clonación. escI amplificado se purificó con el “PCR purification kit” de Qiagen para su posterior clonación. Clonación y secuenciación El gen escF se clonó en los sitios NdeI y BamHI del vector pUC18 (Fig. 16). Se utilizó primero en este vector ya que es fácil detectar las clonas recombinantes. Para la ligación se empleó 1µl de la enzima T4 ADN ligasa (NEB) en un volumen final de 20 µl; la reacción se incubó a 16 ºC por 16 h, para dar lugar a la construcción pJUescF. La construcción se transformó, proceso mediante el cual el ADN exógeno es introducido en la bacteria, en células competentes (Método CaCl2. Jones et al., 1987) de E. coli Top-10. Las colonias transformantes se seleccionaron creciéndolas en medio sólido con ampicilina o por alfa complementación. Se hizo la purificación del ADN plasmídico de cinco colonias mediante lisis alcalina utilizando el sistema “QIAprep spin miniprep” de Qiagen y se analizaron mediante una doble restricción, utilizando las enzimas BamHI y NdeI. La digestión se visualizó en gel de agarosa al 1% en TAE1X. 39 Fig. 16. Arriba mapa del vector pUC18 en el que se puede ubicar al sitio de restricción NdeI y abajo dentro del MCS (sitio de multiclonación) al sitio BamHI, en los cuales se clonó el gen escF. Al verificar que las clonas contenían el gen de interés, se transformó la construcción pJUescF en células Nova Blue para obtener alta producción de ADN plasmídico de alta calidad y se mandó secuenciar a la unidad de Biología Molecular (IFC, UNAM) para confirmar que se tratara de escF y que no se hubieran introducido mutaciones durante la amplificación. Se hizo un alineamiento con la secuencia ya reportada de escF (Elliott SJ y col., 1998) y la secuencia obtenida en este estudio utilizando el programa DNAman. En cuanto al gen escI, éste no pudo ser clonado en el vector pUC18, por lo que se buscó otra alternativa. El vector pCR- Blunt II-TOPO (Fig. 17), tiene la ventaja de proveer una estrategia de clonación altamente eficiente, de un solo paso y en 40 5 minutos, para la inserción directa de productos de PCR con extremos romos. No se requiere ligasa ya que el vector está acoplado a una topoisomerasa I que permite incorporar productos de PCR, por lo que el gen escI obtenido se clonó en este plásmido siguiendo las recomendaciones del manual del usuario (Invitrogen). El producto de la reacción se transformó en células Top10, se seleccionaron cinco colonias positivas (resistentes a Km) y la construcción denominada pJRescI se analizó mediante una doble restricción, utilizando las enzimas BamHI y NdeI. La digestión se visualizó en gel de agarosa al 1%. Fig.17. Mapa del vector pCR-BluntII-TOPO utilizado para la clonación de escI. Al ver que las clonas contenían el gen de interés, se transformó la construcción pJRescI en células Nova Blue y se mandó secuenciar, (utilizando el oligonucleótido universal 41 M13 R), para confirmar que se tratara de escI. Se hizo un alineamiento con la secuencia nucleotídica ya reportada de escI (Elliott SJ y col., 1998) y la secuencia obtenida en este estudio. Subclonación en el vector pET19b Para la expresión de escF y escI se hizo la subclonación en el vector pET19b (Fig. 18). La subclonación se realizó extrayendo escF y escI de los vectores iniciales de clonación mediante una doble restricción con las enzimas NdeI y BamHI; el plásmido pET19b se digirió con estas mismas enzimas y los fragmentos fueron introducidos en el vector por ligación en las mismas condiciones antes descritas. Las construcciones se denominaron pJEescF y pJEescI, repectivamente. Para comprobar que el inserto se hubiera clonado en el vector, se hizo una purificación del ADN plasmídico de una colonia aislada mediante lisis alcalina utilizando el sistema “QIAprep spin miniprep” de Qiagen. 42 Fig. 18. Mapa del vector pET19b.En la parte inferior se muestra la región promotora con la etiqueta de 10 histidinas y los sitios de clonación BamHI y NdeI. Las construcciones se analizaron por restricción enzimática utilizando BamHI y NdeI. La digestión se visualizó en gel de agarosa al 1% en TAE1X. Una vez analizadas, las construcciones pJEescF y pJEescI se introdujeron por transformación, mediante un choque térmico, en la cepa BL21 (DE3) pLysS para su posterior expresión. En el sistema pET, la expresión se encuentra bajo el control del promotor del fago T7. Para inducir la expresión a partir de este promotor debe introducirse el plásmido en una cepa de E. coli, como la recomendada en el manual (pET system manual, 2002) BL21(DE3) pLysS, la cual lleva insertado en el cromosoma una copia del gen de la ARN polimerasa del fago T7 bajo el control del promotor lacUV5 inducible por IPTG. Al añadir IPTG al cultivo se produce el inicio de la trascripción del gen de la T7 ARN polimerasa, la polimerasa sintetizada reconoce el promotor del plásmido pET y se inicia la expresión del gen de interés. Además, el sistema de expresión del vector pET19b añade una cola o etiqueta de 10 histidinas en el extremo amino terminal de la proteína, lo que permite la purificación de la proteína recombinante mediante una columna con agarosa acoplada a níquel. Inducciones Para EscF, se hizo un cultivo inicial de 2 mlde medio LBamp con una colonia BL21 (DE3) pLysS transformada con pJEescF y se incubó a 37 ºC con agitación toda la noche (14 h). 43 Promotor T7 Operador /ac ...!e!.!.. ~ ~ ACAIC ICCA ICCCCCCAAA I IAA.IACCAC ICAC IAIACCCCAAI ICICACCCCAIAACAAI ICCCC IC IACAAAIAAI 11 ICI I IAAC 11 IAACAACCACA Neo I Etiqueta de hlsUdlnas Ndel BamHI TATACCATCCCCCATCATCATCATCATCATCATCATCATCACACCACCCCCCATATCCACCACCACCACAACCATATCCTCCACCATCCCCCTCCTAACAAA M&lC lyHISHISHISHISHISHISHISHISHISHIS$&r$&fC lyHISI l&AspAspAspAspLysHISM&tL&uC luAspProA loA loAs~Lys Bp,,1102 , Enteroq,~,,.•• 1 Terminador T7 CCCCCAAACCAACCTCACTTCCCTCCTCCCACCCCTCACCAATAACTACCATAACCCCTTCCCCCCTCTAAACCCCTCTTCACCCCTTTTTTC AloAr9LysCluA l0C luleuA l0A loA l0ThtA l0C luC lnEnd Después de varias pruebas, los mejores resultados se obtuvieron inoculando 500 µl del cultivo inicial en 50 ml de LBamp e incubando a 30 ºC con agitación (260 rpm) hasta el inicio de la fase exponencial, caracterizada por alcanzar una DO600 de entre 0.6-0.8. Se añadió IPTG a una concentración final de 0.1 mM y se dejó induciendo a 30 ºC en agitación durante 5 horas, pasado este tiempo se colectaron las células por centrifugación. El análisis de proteínas se llevó a cabo mediante electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) al 15% según el método de Laemmli (1970) y su posterior tinción con azul de Coomassie, que permite detectar desde 0.2-0.6 µg de proteína. En el caso de EscI, se siguió un esquema similar al realizado para la inducción de EscF, lo que cambió fue la temperatura de inducción a 37 ºC y la concentración de IPTG que fue 0.5 mM. El análisis de proteínas se llevó a cabo mediante SDS-PAGE al 15%. Aislamiento de fracciones celulares Antes de realizar la inducción de las proteínas a gran escala, se procedió a analizar las diferentes fracciones celulares, para ver en cuál de ellas se encontraba la mayor parte de las proteínas EscF y EscI. Las proteínas EscF y EscI se indujeron durante 4 horas en las condiciones arriba mencionadas, y pasado este tiempo las células se colectaron por centrifugación. Para ambos casos se siguió el siguiente protocolo: la pastilla de células se incubó 15 min con 10 ml de amortiguador de unión 1X y se resuspendió el sedimento. Se sometió a dos pulsos de sonicación de 1 min cada uno, dejando un periodo de 45 seg de reposo entre cada ciclo y se centrifugó a alta velocidad (34500 x g) durante 30 min a 4 ºC. El sobrenadante (fracción soluble) y la pastilla (fracción insoluble membranal o cuerpos de inclusión) se colectaron y guardaron en frío. 44 La solubilización de la pastilla se llevó a cabo resuspendiendo con 3ml de amortiguador de unión 1X. Se tomaron muestras de 50 µl de cada fracción y se les agregaron 12 µl de amortiguador de carga 4X y 1 µl de β-mercaptoetanol, se almacenaron a -20 ºC para su posterior comparación. El análisis de las fracciones se llevó a cabo mediante SDS-PAGE 15% y su posterior tinción con azul de Coomassie. Inmunodetección de la proteína de interés en las fracciones. La transferencia de proteínas de un gel SDS-PAGE a una membrana de nitrocelulosa se llevó a cabo poniendo en contacto ambos soportes y realizando una electroforesis a 25 V toda la noche en amortiguador de transferencia. Una vez terminada la transferencia, la membrana se tiñe con rojo Ponceau para visualizar que el traspaso de proteínas ha funcionado correctamente y se procede a la inmunodetección. La membrana se bloqueó 1 hora en TBS-T con leche en polvo desnatada al 5% para evitar uniones inespecíficas del anticuerpo (Ac). Tras el bloqueo, la membrana se incubó 1 h con anticuerpo anti-histidinas (Pierce) (α-His 1:10 000) diluido en TBS-T, el cual se encuentra acoplado a la peroxidasa de rábano. La membrana se lavó tres veces durante 15 min con TBS-T para eliminar restos de anticuerpos que no se han unido específicamente a la proteína, finalmente se hizo la detección con el sistema ECL (ECL “Advance Western Blotting Detection Kit”) por procedimientos estandarizados exponiendo la membrana sobre una película para autoradiografía. Purificación de las proteínas recombinantes. Las proteínas recombinantes se purificaron mediante cromatografía de afinidad utilizando una resina de Ni-NTA (Qiagen), ya que el níquel es un metal afín al anillo imidazol de las histidinas de las proteínas recombinantes. La proteína de 45 interés se produce como una proteína de fusión con una etiqueta de histidinas en su extremo N terminal. Este marcador interactúa con el NiSO4 y la proteína queda inmovilizada en la resina. La proteína se eluye de la resina con una solución que contiene altas concentraciones de imidazol, el cual compite con la interacción anterior, liberando a la proteína de interés. Las purificaciones se realizaron en condiciones desnaturalizantes como se describe a continuación: Las proteínas fueron inducidas en las condiciones anteriormente descritas durante 4 h y las células se colectaron por centrifugación a baja velocidad. El sedimento celular se incubó 30 min con 15 ml de amortiguador de unión con urea 6M y lisozima (100 µg/ml); se incubó a temperatura ambiente por 15 min y se resuspendió. Las células se rompieron por sonicación, mediante dos pulsos de 2 min cada uno con un periodo de reposo de 1 min. Las fracciones celulares se separaron centrifugando durante 30 min a 26 340 x g, a 4° C. El sobrenadante se ultracentrifugó durante 1 h a 116 340 x g, a 4° C. Cada uno de los lisados celulares se pasó por una columna que contenía 2 ml de resina Ni-NTA, previamente equilibrada con 10 volúmenes de amortiguador de unión con 6M de urea. Se colectaron 50 µl de las fracciones no unidas a la columna y se guardaron a 4 ºC. Para el caso de EscF se utilizaron 15 ml de amortiguador de lavado (30 mM de imidazol), 18 ml de amortiguador de lavado (60 mM de imidazol), 18 ml de amortiguador de lavado (100 mM de imidazol) y se eluyó con 4 ml de amortiguador de elución (500 mM de imidazol). Se colectaron 50 µl de cada una de las diferentes fracciones y se almacenaron a 4 ºC. Para el caso de EscI se utilizaron 35ml del amortiguador de lavado (30 mM de imidazol), 10 ml de amortiguador de lavado (60 mM de imidazol) y se eluyó con 3 ml de cada uno de los de amortiguadores de elución (300, 400 y 500 mM de imidazol). Se colectaron 50 µl de las diferentes fracciones y se guardaron a 4 ºC. 46 Los perfiles de purificación de las proteínas recombinantes His-EscF y His-EscI se visualizaron en geles desnaturalizantes SDS-PAGE al 15%, teñidos posteriormente con azul de Coomassie. Diálisis Para renaturalizar las proteínas recombinantes His-EscF y His-EscI se removió el agente desnaturalizante mediante una diálisis. Se utilizaron membranas de celulosa (Spectra/Por) con poros de 3,500 Daltones (Da) para His-EscF y de 6-8,000 Da para His-EscI, para permitir la salida de moléculas menores al tamaño del poro sin que se salieran las proteínas de interés. La membrana se preincuba 15 min en agua para remover el conservador (glicerina). La membrana, ya con la respectiva muestra de proteína, se sumerge en amortiguador de diálisis 1:1,000 v/v que contiene 4M urea y se deja al menos 1.5 h. Posteriormente se dializó con concentraciones decrecientes de urea: 4, 2, 1 y 0.5 M, hasta dializar con amortiguador sin urea. Cuantificación de proteína Las proteínas se cuantificaron mediante el método de Bradford (Bradford, 1976) utilizando el sistema “Bio-Rad Protein Assay” y siguiendo el protocolo estándar. Se empleó albúmina de suero bovino (BSA) como patrón para realizar la correspondiente curva de calibrado. Se determinó la DO595 mediante un espectrofotómetro. Obtención de anticuerpos policlonales Para la obtención de anticuerpos α-EscF y α-EscI se utilizaron conejos de laboratorio de la variedad Nueva Zelanda