Desenvolvimento de cultivos de células vegetais em biorreatores

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Informe SIP 20070090. Mario Rodríguez 
 
Informe Parcial del Proyecto: 
 
Desarrollo de cultivos de células vegetales en biorreactores para la producción 
de compuestos bio-activos 
 
Director: Dr. Mario Rodríguez Monroy 
 
Claves asignadas SIP 20070090 
 
1.- Resumen 
En el presente informe se presentan una síntesis de los avances de la parte 
experimental. En donde se montaron las técnicas para la separación, identificación y 
análisis de Terpenos y las arabinogalactoproteinas de los cultivos de Galphimia 
glauca, Azadirachta indica y Beta vulgaris. Asimismo se realizó una caracterización 
parcial de los compuestos producidos in vitro. Por otro lado, se logró el establecimiento 
de los cultivos de callos de Prosopis levigada se hizo la caracterización de los 
impulsores (Rushton y de paletas inclinadas). 
 
2.- Introducción 
Este proyecto da continuidad a la línea de trabajo de CULTIVO DE CÉLULAS EN 
BIORREACTORES que se desarrollo en el CEPROBI y esta asociado con la 
participación de alumnos de Posgrado de los programas de Maestría y Doctorado en 
Desarrollo de Productos Bióticos. 
 
La propuesta agrupa dos grupos de metabolitos secundarios: 
Terpenoides, que incluyen a Galphimia glauca y Azadirachta indica. G. glauca se trata 
del estudio del potencial biotecnológico que tendrían los cultivos de células 
transformadas para la producción de terpenos con actividad farmacológica. Mientras 
que A. indica es una planta que acumula terpenos con actividad bioinsecticida contra 
diversas plagas agrícolas; existen antecedentes de su cultivo en matraces, pero no 
esta claro su factibilidad de escalamiento a biorreactores. Considerando la experiencia 
con otros cultivos, en este proyecto se estudiará la factibilidad de escalamiento de este 
cultivo a biorreactor, considerando las posibilidades de establecer un cultivo de alta 
densidad y productor de los principios bioinsecticidas. 
 
Arabinogalactanoproteinas (AGP), producidos por las especies de Prosopis levigada 
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y Beta vulgaris. P. levigada produce la goma del mezquite (AGP componente 
principal). Dado que no existen antecedentes sobre el establecimiento de los cultivos 
in vitro, es necesario contar con los cultivos de callos y de células en suspensión, 
analizando su potencial de producción de AGP in vitro. Para B. vulgaris, existe el 
antecedente de la producción de AGP durante el desarrollo de los cultivos en el 
biorreactor y se sugiere que la acumulación de las moléculas esta asociado con una 
respuesta de las células a las condiciones de estrés hidrodinámico. Sin embargo, no 
se conoce la cinética de producción de las AGP, ni de los cambios estructurales que 
pudieran estarse presentando en el transcurso de la cinética. 
 
3.- Objetivos 
Estudiar la capacidad de biosíntesis de Terpenoides y Arabinogalactoproteinas en 
cultivos de células vegetales in vitro y analizar la factibilidad técnica de su 
escalamiento a biorreactores. 
 
Nota: a continuación se presentan las metas, junto con la descripción de la 
metodología y los resultados respectivos. 
 
4.1 Técnicas para la separación, identificación y análisis de Terpenos 
 
4.1.1 Terpenos de G. glauca. 
Utilizando cultivos de G. glauca, se analizó la biomasa y el sobrenadante por 
separado. Los extractos presentan un perfil cromatográfico característicos al ácido 
maslinico reportado en raíces pilosas. Los resutados de HPLC corroboraron la 
presencia del compuesto 
 
Para corroborar la estructura química del acido maslinico se realizo un análisis 
comparativo de RMN, protónica que indica las características estructurales comunes 
del triterpeno., donde se observan las multiplicidades y constantes de acoplamiento 
esperado entre protones H-2 (td J=12-0;4. Hz), (d, J= 12.0Hz), H-12 (t, J=3.6 Hz) y H-
18 (dd, J=12; 4.4 Hz). 
 
Los resultados obtenidos del crudo de la extracción del sobrenadante contenían una 
mezcla de triterpenos del orden de las glaucacetalinas (Nor-fridelanos) la cual fue 
observada por CPF. 
 
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Cuando se realizo la purificación de este compuesto se pudo corroborar la presencia 
de la glaucacetalina A, con un Rf de 2.2 y un color violeta característico de estos 
compuestos. Sin embargo, fue necesario corroborar por CLAE su identidad, del 
compuesto. 
 
Para corroborar si el triterpeno correspondía a la estructura de la glaucacetalina A, se 
realizo un espectro comparativo de RMN-1H. La evidencia clara de ser un nor-
triterpeno es dada por la presencia de una aglicona de 29 átomos de carbono, la 
presencia de 3 metilos, 10 metilenos, 8 metinos y 8 carbonos cuaternarios por la 
aglicona. 
 
Los perfiles cromatográficos en CPF mostraron la presencia de un nuevo compuesto 
presente en la línea celular de GgBa, con un Rf de 2.8 y el color violeta característico 
de las glaucacetalinas y las galfiminas, este nuevo compuesto presentaba 
características de ser menos polar que las glaucacetalinas y las galfiminas. 
 
4.1.2. Análisis de los Terpenos producidos por A. indica 
 
La extracción de los metabolitos intra y extracelular de terpenoides relacionados con 
Aza, se realizó con solventes orgánico polares a partir de biomasa celular y del medio 
de cultivo (sobrenadante) los cuales se separaron mediante filtración al vacío. 
 
Los análisis de cuantificación de Aza por HPLC se realizaron en un equipo HPLC. 
Usando los tiempos de retención y los espectros de UV obtenidos en HPLC, se 
observaron casi 20 compuestos y se agruparon en seis clases de metabolitos 
secundarios (tabla 1). 
 
4.1.3. Análisis de la Arabinogalactoproteínas 
 
La proteína extracelular fue recuperada a partir del filtrado (caldo libre de células). Los 
componentes del medio de cultivo fueron separados de la proteína a través de una 
diálisis. El material dializado se concentró por liofilización y se almacenó a -20 ºC 
hasta su empleo. Para obtener los patrones electroforéticos se realizó la electroforesis 
de la proteína extracelular en geles de poliacrilamida. La electroforesis se llevó a cabo 
a una intensidad de corriente constante de 30 mA durante 2 horas y media. Para 
revelar las proteínas se realizó una tinción de los geles con una solución de azul de 
Coomasie al 0.2% durante 30 min. 
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Tabla 1. Máxima longitud de onda de los espectros de absorción característicos, de 
los metabolitos producidos por un cultivo de células de A. indica en un biorreactor de 
tanque agitado. 
Clase de metabolito Absorción característica, 
nm 
Número de metabolitos 
observados 
 
M1 200, 220 – 225 4 
M2 210 – 215, 260 – 265 3 
M3 240 – 243, 280 – 285 5 
M4 232 – 237 3 
M5 207 – 209, 260 – 400 3 
M6 310 – 320 2 
 
Durante la cinética de crecimiento del cultivo se observa que la células de B. vulgaris 
secretaron 6 proteínas de 23, 27, 39, 62, 77 y 138 kDa. Sin embargo, la proteína de 
138 kDa es más evidente a los 14 y 16 días del cultivo, a diferencia de las demás 
proteínas secretadas que son visibles en todos los días del cultivo estudiados. Por lo 
que, el patrón de bandeo en los diferentes días fue el mismo hasta los 11 días del 
cultivo. En los días posteriores este patrón electroforético cambió como consecuencia 
de la secreción de la proteína de mayor peso molecular (138 kDa). Esto indicó que la 
dinámica de pesos moleculares de las AGPs secretadas cambió durante el crecimiento 
del cultivo en el biorreactor. 
 
La identificación in situ de AGPs se hizo con el reactivo de Yariv. Las AGPs se 
identificaron por la formación en los geles de bandas rojas que se generaron por la 
interacción de las AGPs con el reactivo de Yariv. La cuantificación de AGPs se hizo 
mediante la técnica de difusión radial en gel de agarosa. Los geles se incubaron en 
una cámara húmeda y a temperatura ambiente durante 20 horas. Posteriormente se 
midió el diámetro de loshalos de precipitación formados por la reacción de las AGPs 
con el reactivo de Yariv. El área del halo se calculó mediante la ecuación del área de 
un círculo. Para obtener la cantidad de AGP en la alícuota, el valor de área del halo se 
interpoló en una curva tipo realizada con goma arábiga, usada como un estándar de 
referencia. 
 
 
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4.2. Establecimiento de los cultivos de callos de Prosopis levigata 
 
Se utilizaron semillas de P. laevigata que fueron colectadas de árboles silvestres 
productores de goma pertenecientes a un mezquital ubicado en el Ejido La Angostura, 
Municipio de Río Verde en San Luis Potosí, México. Para la desinfestación, 
escarificación y germinación de las semillas se siguió el protocolo reportado por 
Buendía y col. (2007). Las semillas se sometieron a proceso de desinfestación en un 
ambiente aséptico que consistió inmersiones consecutivas en soluciones de: 
detergente comercial (Roma®) al 1%, después en etanol al 50% y por último con una 
solución de hipoclorito de sodio (Cloralex®) al 10%, cada una durante 5 minutos. Las 
semillas desinfestadas se sembraron para su germinación en tubos de vidrio que 
contenían medio de cultivo MS (Sigma®), suplementado con 30 g L-1 de sacarosa 
(Sigma®), y 2.0 g L-1 de fitagel (Sigma®) como agente gelificante. El pH del medio se 
ajustó a 5.8 antes de esterilizarse. Las semillas se incubaron en una cámara de 
cultivo bajo las siguientes condiciones: 25±3ºC de temperatura, iluminación 200-300 
µmol m-2 s-1 y fotoperíodo con 16 h de luz y 8 de oscuridad. 
 
El medió de cultivo usado para la inducción de callos fue el mismo que se utilizó para 
la germinación de las semillas (MS, con 30 g L-1 de sacarosa y 2.0 g L-1 de fitagel), 
más la incorporación de auxinas y/o citocininas como reguladores de crecimiento 
vegetal (RCV). Se probaron 3 tipos de auxinas: Ácido 2,4 diclorofenoxiacetico (2,4 D); 
ácido α-naftalen acético (ANA) y ácido 2,4,5 triclorofenoxiacetico (2,4,5 T), así como 2 
tipos de citocininas: Cinetina (CIN) y bencil amino purina (BAP). Las combinaciones de 
estos reguladores arrojaron 12 tratamientos diferentes: 1. sin RCV (control); 2. CIN; 3. 
BAP; 4. 2,4 D; 5. 2,4 D + CIN; 6. 2,4 D + BAP; 7. ANA; 8. ANA + CIN; 9. ANA + BAP; 
10. 2,4,5 T; 11. 2,4,5 T + CIN y 12. 2,4,5 T + BAP. Para cada tratamiento se probaron 
3 concentraciones diferentes (0.5, 5.0 y 10 µM). Por otro lado, se evaluaron 3 tipos 
distintos de explante (segmentos de ≈ 1.5 cm de hipocotilo, cotiledón y primeras hojas) 
provenientes de plántulas de 15 días de edad germinadas in vitro. Los explantes se 
colocaron en frascos de vidrio (2 explantes por frasco; 8 frascos por tratamiento) que 
contenían 30 ml de medio de cultivo con la combinación de reguladores 
correspondiente y se incubaron en las mismas condiciones de germinación de las 
semillas. Después de 20 días de cultivo se evaluó la inducción de callo (%) y los callos 
inducidos se transfirieron a medio de cultivo fresco para su crecimiento. Los resultados 
se analizaron estadísticamente a través de un Análisis de Varianza Multifactorial y una 
prueba de comparación de medias por el método de Duncan, ambos con un 95% de 
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confianza. Para ello se utilizó el sofware Statgraphics Plus Ver 4.1 para Windows 
(Statistical graphics corp., USA). 
 
Las respuestas de las diferentes combinaciones de los RCV, su concentración y el tipo 
de explante sobre la inducción de callo, se muestran en la tabla 2. Los explantes 
cultivados en el medio sin RCV no produjeron callo y después de varios días de cultivo 
murieron. Con la concentración de 0.5 µM de todos los RCV evaluados, la inducción 
de callo solo se presentó en presencia de las combinaciones de RCV siguientes: 2,4 D 
+ CIN; 2,4 D + BAP; 2,4,5 T + CIN y 2,4,5 T + BAP y con cotiledón e hipocotilo como 
explantes, no obstante los porcentajes de inducción no alcanzaron el 20%. En 
contraste, con 5.0 y 10 µM de 2,4 D e hipocotilo se alcanzaron porcentajes de 
inducción de callos importantes (68.75 y 62.5%, respectivamente), sin embargo estos 
fueron significativamente menores al 100% de inducción de callo que se obtuvo con 
los tratamientos que incluyeron 5.0 µM de 2,4,5 T + CIN y 2,4,5 T + BAP como RCV, e 
hipocotilo como explante. El análisis estadístico de estos resultados indicó que los 
RCV, su concentración y el tipo de explante tienen un efecto significativo sobre la 
inducción del callo. En la figura 11C se muestra un aspecto de los callos de P. 
laevigata obtenidos con 5.0 µM de 2,4,5 T + BAP e hipocotilo como explante, estos 
callos tienen un color verde claro y presentan una consistencia suave al tacto. 
 
Tabla 2. Efecto de los reguladores de crecimiento vegetal (RCV), su concentración y el 
tipo de explante sobre la inducción de callo de Prosopis laevigata. 
 
Inducción de callo (%) 
Concentración 
(µM) 0.5 5.0 10 
 
Explante 
RCV 
Hip Cot Hoja Hip Cot Hoja Hip Cot Hoja 
CONTROL 0.0a 0.0a 0.0a 0.0a 0.0a 0.0a 0.0a 0.0a 0.0a 
CIN 0.0a 0.0a 0.0a 31.25ef 0.0a 0.0a 0.0a 0.0a 0.0a 
BAP 0.0a 0.0a 0.0a 31.25ef 0.0a 0.0a 0.0a 0.0a 0.0a 
2,4,D 0.0a 0.0a 0.0a 68.75j 18.75cd 43.75fg 62.5i 18.75cd 0.0a 
2,4,D/CIN 0.0a 18.75cd 0.0a 18.75cd 0.0a 25.0de 18.75cd 25.0de 0.0a 
2,4,D/BAP 0.0a 12.5bc 0.0a 75.0k 0.0a 0.0a 31.25ef 18.75cd 0.0a 
ANA 0.0a 0.0a 0.0a 62.5i 0.0a 0.0a 0.0a 0.0a 0.0a 
ANA/CIN 0.0a 0.0a 0.0a 62.5i 0.0a 0.0a 0.0a 0.0a 0.0a 
ANA/BAP 0.0a 0.0a 0.0a 25.0de 0.0a 31.25ef 18.75cd 31.25ef 0.0a 
2,4,5,T 0.0a 0.0a 0.0a 87.5l 50.0gh 43.75fg 50.0gh 31.25ef 0.0a 
2,4,5,T /CIN 12.5bc 6.25ab 0.0a 100m 50.0gh 75.0k 50.0gh 37.5fg 0.0a 
2,4,5,T /BAP 18.75cd 6.25ab 0.0a 100m 87.5l 93.75lm 37.5ef 25.0de 0.0a 
Los % de inducción de callo son promedio de 2 experimentos independientes. Letras 
distintas en columnas y renglones indican diferencia significativa (p≥0.05) 
 
 
 
 
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4.3. Caracterizar los impulsores 
 
Se utilizaron dos impulsores, uno tipo turbina Rushton (flujo radial) y un impulsor de 
paletas inclinadas a 45° (flujo axial). Las dimensiones de los impulsores son de 0.064 
m de diámetro y 0.004 m de espesor, manufacturados en acero inoxidable. 
 
Se utilizaron los biorreactores de 3 y 7 litros de volumen nominal (1.2 y 4 litros 
volumen de trabajo) con puertos para la entrada de aire, toma de muestra, entrada 
para electrodos de oxígeno y pH; ambos con tres mamparas de acero inoxidable para 
mejorar el mezclado y evitar vórtices Los biorreactores se instrumentaron con 
electrodos polarográficos esterilizables para medir oxígeno disuelto en el medio (TOD). 
Los registros de los valores de TOD se realizaron en módulos biocontroladores. 
 
Para llevar a cabo las determinaciones de KLa, se polarizó el electrodo de oxígeno. La 
determinación de KLa se llevo a cabo a través de una medición indirecta con la técnica 
de eliminación del gas. Se hicieron las determinaciones para cada sistema (3 y 7 litros) 
con cada uno de los impulsores (turbina Rushton e impulsor de paletas inclinadas) 
considerando y variando la velocidad de agitación (400, 500 y 600 rpm) y la velocidad 
de entrada del flujo de aire (0.1 y 0.5 vvm). Los datos se procesaron con el programa 
Excel, graficando datos de TOD (%) vs. tiempo y ln ((TODee-TOD1)/ (TODee-TOD)) 
vs. t-t1 tomando en cuenta que TOD en estado estacionario es a 100% y T1 es a 
tiempo cero. 
 
En la figura 1 se observan los gráficos correspondientes a las mediciones de KLa en el 
biorreactor de 3 litros tanto con el impulsor de paletas inclinadas (IPI) como con la 
turbina Rushton (TR). En ambos casos, se analizan los efectos de la velocidad de flujo 
de aire y las diferentes condiciones de agitación en los valores del KLa. 
 
Con el IPI, a la condición de aireación de 0.1 vvm y la velocidad de 400 rpm el valor de 
KLa esde 2.70 h-1; se observa como a medida que se aumenta la velocidad de 
agitación estos valores se incrementan llegando a 5.98 h-1 a 600 rpm. Por otra parte, 
al aumentar la entrada de flujo de aire a 0.5 vvm, los valores del KLa presentan un 
comportamiento similar. Para 400 rpm el valor de KLa fue 11.63 h-1 y con la condición 
de agitación más severa (600 rpm), el sistema generó un valor 38.00 h-1. 
 
Considerando la TR en la condición de aireación y agitación mínimas, 0.1 vvm y 400 
rpm, el valor de KLa que se genera es de 3.09 h-1 pero a medida que se aumenta la 
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velocidad de agitación, los valores del KLa se incrementan hasta alcanzar un valor de 
6.86 h-1 a 600 rpm. Por otro lado, con el flujo de aire de 0.5 vvm, se observa que el 
KLa pasa de un valor de 18.00 h-1 a 400 rpm a valores de 45.00 h-1 con 600 rpm de 
agitación. 
 
Comparando el efecto de el cambio de impulsor a la misma velocidad de agitación y 
aireación, observamos que para una velocidad de aireación baja (0.1 vvm) no existen 
diferencias entre los valores del KLa y el perfil de la curva, lo que indica que no existen 
efectos del patrón de mezclado axial (del IPI) al radial (de la TR) sobre el KLa. Sin 
embargo, para la aireación de 0.5 vvm, se observa que el cambio de impulsor provoca 
un aumento en los valores del KLa a la misma velocidad de agitación. Lo anterior 
indica que a bajas velocidades de aireación, la contribución que tiene el patrón de flujo 
radial de la turbina Rushton en los valores de KLa, no es tan evidente como a altas 
velocidades de aireación. 
 
En la figura 2 se muestran los resultados generados con las mediciones de KLa en el 
biorreactor de 7 litros con ambos impulsores; en cada una de ellas se analizan los 
efectos que traen consigo en los valores del KLa las diferentes condiciones de 
aireación y agitación. 
 
Con el IPI, a una condición de aireación de 0.1 vvm y a la velocidad de agitación de 
400 rpm, el sistema generó un valor del KLa de 2.38 h-1; a medida que se aumenta la 
velocidad de agitación, los valores de KLa se incrementan llegando a una valor de 8.40 
h-1 a 600 rpm de agitación. Considerando la velocidad del flujo de aire de 0.5 vvm , los 
resultados de los valores del KLa presentan un comportamiento similar. Se observa 
que a la condición mínima de agitación (400 rpm) el valor de KLa que genera el 
sistema es de 21.60 h-1; conforme se aumenta la velocidad de agitación a 600 rpm 
este valor llega hasta los 49.70 h-1. 
 
Por otra parte, considerando la TR y a las condiciones de medición mínimas, 0.1 vvm y 
400 rpm de agitación, el valor generado en el sistema es de 8.19 h-1. Al aumentar la 
velocidad de agitación, los valores del KLa se incrementan llegando a tomar un valor 
de 33.50 h-1 a 600 rpm de agitación. Con el flujo de aire más alto, a 0.5 vvm y a 400 
rpm se generó un valor de 45.72 h-1. Conforme se incrementa la velocidad de agitación 
se observa un aumento en los valores del KLa llegando hasta los 142.6 h-1 a los 600 
rpm. 
 
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Al comparar el efecto que genera el cambio de los impulsores a la misma velocidad de 
agitación y aireación, se observa que para una velocidad de aireación baja (0.1 vvm) 
los valores del KLa para la TR son ligeramente superiores a los que se obtienen con el 
IPI. Este efecto se ve mas evidente cuando se hace la comparación con el flujo de 
aire de 0.5 vvm. 
BIORREACTOR 3 L IPI
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
400 500 600
RPM
0.1 VVM
0.5 VVM
(A)
K
L
a 
(h
-1
)
 
 
 BIORREACTOR 3 L TR 
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
400 500 600
RPM
0.1 VVM
0.5 VVM
(B)
K
L
a 
(h
-1
)
 
Figura 1. Valores de KLa en el biorreactor de 3 litros con el impulsor de paletas 
inclinadas (A) y la turbina Rushton (B) (determinaciones hechas por triplicado). 
 
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 BIORREACTOR 7 L IPI
0
20
40
60
80
100
120
140
400 500 600
RPM
0.1 VVM
0.5 VVM
(A)
K
L
a 
(h
-1
)
 
 
 
 
 
 BIORREACTOR 7 L TR
0
20
40
60
80
100
120
140
400 500 600
RPM
0.1 VVM
0.5 VVM
(B)
K
L
a 
(h
-1
)
 
 
Figura 2. Valores de KLa en el biorreactor de 7 litros con el impulsor de paletas 
inclinadas (A) y la turbina Rushton (B) (determinaciones hechas por triplicado). 
 
 
 
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Los resultados anteriores indican que, tanto a bajas como altas velocidades de 
aireación existe un aumento considerable en los valores del KLa impuestos por el 
cambio de la TR al IPI. Lo cual quiere decir en el biorreactor de 7 litros se da un 
aumento por el cambio de impulsor que está asociado con el cambio de patrón de flujo 
(radial vs. axial). Estos datos resultan contrastantes con los obtenidos con el reactor 
de 3 litros. Este fenómeno puede sugerir que el escalamiento de los biorreactores, a 
las mismas velocidades de agitación y aireación, los valores del KLa no van a ser 
similares ni repetitivas. 
 
5. Crecimiento de los cultivos en biorreactor y obtención de los perfiles de 
producción de terpenos y AGPs de los cultivos. 
 
 
5.1. Cultivos de Beta vulgaris 
 
 Se utilizó el fermentador de 3 L conteniendo 0.9 L del medio de cultivo Gamborg´s B5 
El biorreactor se operó a 400 rpm, 0.1 vvm y 23 ± 2 oC, fotoperiodo de 16 h luz/8 h 
oscuridad provisto por 3 lámparas de luz fría. El pH y la tensión de oxígeno fueron 
monitoreados con electrodos durante toda la cinética de crecimiento y el pH se 
mantuvo entre 5.5 y 6.0 adicionando HCl 0.1 N mediante el uso de un biocontrolador. 
En los días de muestreo se retiraron 50 mL del cultivo para evaluar la biomasa, el 
contenido de proteína extracelular y realizar la recuperación del material secretado. 
 
La cinética de crecimiento del cultivo en el reactor se muestra en la Figura 3 , donde 
se observa una etapa de adaptación desde el día 0 al día 3 del cultivo, posteriormente 
se presentó la etapa de crecimiento exponencial prolongándose hasta los once días 
del cultivo y finalmente en tiempos posteriores se observó la fase de muerte celular. El 
cultivo creció con una velocidad máxima de 0.12 días-1 y alcanzó una biomasa máxima 
de 17.2 g L-1 a los 11 días del cultivo, que correspondió a un valor de 230 gPF L-1. 
 
El seguimiento de proteína extracelular se realizó como un indicativo de la posible 
secreción de AGPs durante el crecimiento de las células en el reactor. En la Figura 3 
se muestra que la proteína extracelular se acumula a partir del día 3, que es el tiempo 
en el que el cultivo comienza a crecer. El perfil de acumulación de proteína después 
del tercer día de cultivo mostró una tendencia similar al del crecimiento, la 
acumulación de proteína alcanzó su valor máximo de 70 mg L-1 en el día 14, momento 
en el que las células ya se encontraban en la fase de muerte (Figura 3). 
 
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La acumulación de AGPs en el medio extracelular comenzó en el día 3 y siguió una 
tendencia ascendente hasta alcanzar un máximo de 45.5 mg L-1 al final del cultivo 
(Figura 3). El hecho de que la acumulación de AGPs iniciara al mismo tiempo que el 
crecimiento celular y de que siguiera un comportamiento similar al del crecimiento 
durante la fase exponencial, indica que estos dos eventos podrían estar relacionados. 
(Figura 3). 
 
0
5
10
15
20
0 5 10 15 20
Tiempo (días) 
 
 
B
io
m
as
a 
 (g
P
S
 L
-1
) 
 
 
 
 
 
 
 
 
0
30
60
90
120
150
0 5 10 15 20
0
20
40
60
80
B 
P
ro
te
ín
a 
ex
tra
ce
lu
la
r 
(m
g
L-
1 )
A
G
P
s 
(m
g 
L-
1 )
 
Tiempo (días) 
 
Figura 3. Cinética de crecimiento (A) y acumulación (B) de proteína extracelular ( ) y AGPs 
( ) secretadas por los cultivos de B. vulgaris crecidos en el tanque agitado. Los datos 
representados son promedio de dos réplicas ± error estándar. 
 
Informe SIP 20070090. Mario Rodríguez 
 
5.2. Cultivos de A. indicaCon el fin de caracterizar las células de A. indica se realizó una fermentación en el 
biorreactor de tanque agitado de 7 L, con un flujo de aire 0.2 vvm, difusor de 7 orificios 
(1 mm diámetro) y un impulsor de paletas inclinadas (IPI) a 400 rpm. Durante el 
transcurso de la fermentación se analizó la concentración celular (peso seco), la 
concentración de sustrato o de azúcares reductores por el método fenol-sulfúrico, 
oxígeno disuelto (OD) y el contenido de azadiractina (Aza) y compuestos relacionados 
con Aza como se indican más adelante. 
 
Los resultados del crecimiento de A. indica en el biorreactor se presenta en la figura 4. 
El cultivo creció con µmáx = 0,117 día-1 y alcanzó una concentración celular de 14 g 
DW/L (día 17). Los azúcares fueron consumidos totalmente en el día 21. Aza no se 
detectó durante el cultivo. Sin embargo, se encontraron diferentes metabolitos 
secundarios (30 mg Equivalente a Aza/L). Estos compuestos absorben en una longitud 
de onda similar a Aza. Además, estos compuestos autofluorescen con la excitación UV 
de una manera similar a los compuestos de células secretoras encontrados en las 
semillas de A. indica. El pH disminuyó a 4.3 (día 3) y después del día 7 se controló en 
5.8. El oxígeno disuelto disminuyó a 0 % a partir del día 10, no obstante la viabilidad 
celular fue superior al 60 %. 
 
La concentración de biomasa obtenida en este trabajo fue menor que la reportada por 
Prakash y Srivastava (2007). Ellos reportaron una concentración de 20 g CS/L, con 82 
mg Aza/L en un biorreactor de tanque agitado operado con un impulsor centrífugo (125 
rpm) y controlando el oxígeno por encima del 30%. Es posible que la limitación del 
oxígeno observada en este trabajo, no fuera adecuada para obtener una 
concentración alta de biomasa y para la síntesis de Aza. Sin embargo, la agitación de 
400 rpm con el IPI es la mayor condición de agitación reportada para A. indica y 
facilitaría el escalamiento puesto que en biorreactores industriales, las células deben 
soportar una velocidad mayor en la punta del impulsor, ellas no se deben sedimentar 
fácilmente y el mezclado debe ser más eficiente. 
 
La figura 5 muestra la cinética de estas clases de metabolitos durante el cultivo. Los 
metabolitos M1 y M2 se produjeron en mayor cantidad durante la cinética y su 
producción se aumentó en la fase estacionaria. Las otras clases de metabolitos tenían 
una concentración menor y algunos de ellos, como M3, tenían una concentración 
variable durante el cultivo, pudiendo ser intermediarios en la ruta metabólica para la 
producción de M1 y M2. 
Informe SIP 20070090. Mario Rodríguez 
 
 
A 
Tiempo, día
0 5 10 15 20
B
io
m
as
a,
 g
 C
S/
L
0
2
4
6
8
10
12
14
A
zú
ca
re
s 
re
du
ct
or
es
0
5
10
15
20
25
30
M
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ab
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ito
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on
ad
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 c
on
 A
za
, 
m
g 
eq
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v 
A
za
/L
5
10
15
20
25
30
35
Biomasa
Azúcares
Metabolitos 
 
B Tiempo, día
0 5 10 15 20
O
D
, %
0
20
40
60
80
pH
0
1
4
5
6
7
DO, % 
pH 
 
 
Figura 4. Cultivo de A. indica en un biorreactor de tanque agitado con IPI. (A) 
Biomasa (células secas, CS), azúcares reductores y metabolitos totales (B) Oxígeno 
disuelto (OD) y pH. 
 
 
Informe SIP 20070090. Mario Rodríguez 
 
Tiempo, día
0 5 10 15 20
M
et
ab
ol
ito
s 
re
la
ci
on
ad
os
 c
on
 A
za
,
 m
g 
eq
ui
v 
A
za
/L
0
5
10
15
M1 (200, 223 nm)
M2 (213, 262 nm)
M3 (241 nm)
M4 (235 nm)
M5 (208, 260 - 400 nm)
M6 (320 nm)
 
 
Figura 5. Clases de metabolitos relacionados con Aza producidos por un cultivo A. 
indica en un biorreactor de tanque agitado. 
	4.1.2. Análisis de los Terpenos producidos por A. indica
	5. Crecimiento de los cultivos en biorreactor y obtención de los perfiles de producción de terpenos y AGPs de los cultivos.
	5.1. Cultivos de Beta vulgaris