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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA i INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE: PROYECTO DE INVESTIGACIÓN DIRECTOR INTERNO: M. en C. YOLANDA DE LAS MERCEDES GÓMEZ Y GÓMEZ DIRECTOR EXTERNO: DR. JESÚS HERNÁNDEZ FALCÓN México, D. F. Mayo 2008 PRESENTA: ITZEL ÁVILA CABELLO SUEÑO EN EL ACOCIL: MAPEO DE LA ACTIVIDAD CEREBRAL DURANTE EL SUEÑO UNA PREPARACIÓN NO DEAMBAULANTE ii AGRADECIMIENTOS Primero que nada agradezco a Dios por permitir que llegará este momento que desde niña anhele y por dejarme compartirlo con todos mis seres queridos, que aunque falta una persona muy importante para mi, estoy segura, él también estaría orgullosos de mi, gracias abuelito. A mis padres, por el apoyo incondicional, por la motivación y la fuerza para seguir adelante con mis estudios que siempre me han dado, pero sobretodo por darme la vida y esforzarse brindarme lo mejor de ellos. A mis hermanas por confiar en mí y por regalarme momentos felices cuando llego a casa. A mis abuelitos que aún están conmigo, a mis tíos y primos que siempre me han confiado mi, seguros de que cumpliría esta meta. A mis amigos por todos los momentos buenos y malos que compartimos a lo largo de la carrera, por aguantar mis locuras y apoyo incondicional. A la Doctora Karina Mendoza Ángeles, por su tiempo, paciencia, y sobretodo por disposición para auxiliarme en la realización de este proyecto, sin su ayuda esto no hubiera sido posible. Y por brindarme esta valiosa amistad. A los Doctores Jesús Hernández Falcón y Fidel Ramón por aceptarme en el laboratorio y apoyarme en mi proyecto. iii ÍNDICE 1. RESUMEN 1 2. INTRODUCCIÓN 2 2.1 Actividad eléctrica del cerebro 2 2.2. Vigilia y sueño 4 2.3. Actividad eléctrica en el cerebro del acocil 6 2.4. Sueño en el acocil 6 2.5. Análisis en tiempo-frecuencia 7 2.5.1. Transformada de Fourier en corto tiempo 7 2.5.2. Transformada Gabor 8 2.5.3. Transformada wavelet 8 2.6. Anatomía del sistema nervioso del acocil 9 3. JUSTIFICACIÓN 11 4. OBJETIVOS 12 5. MATERIAL Y MÉTODOS 13 5.1. Material biológico 13 5.2. Registros conductuales y electrofisiológicos 13 5.2.1. Preparación biológica 13 5.2.2. El electrodo 14 5.3. Mapeo cerebral 14 5.3.1. Preparación biológica 14 5.3.2. El electrodo 16 5.4. Manipulación de la actividad del complejo central: efectos de enfriamiento 16 5.4.1. Preparación biológica 17 5.4.2. El electrodo 17 5.5. Análisis de los registros de actividad eléctrica cerebral 17 6. RESULTADOS 19 6.1. Estudio de la anatomía del Sistema Nervioso Central del Acocil 19 6.2. Preparación deambulante 19 6.2.1. Análisis de los registros conductuales 19 6.2.2. Análisis de los registros eléctricos 20 6.1.2.2. Análisis tiempo-frecuencia 21 6.3. Mapeo cerebral 26 6.3.1. Registros 27 6.3.2. Transformada wavelet 28 6.4. Manipulación de la actividad del complejo central: efectos de enfriamiento 30 6.4.1. Registros 30 6.4.2. Transformada wavelet 31 7. DISCUSIÓN 33 7.1. Identificación de estados cerebrales 33 7.1.1. Análisis con transformada wavelet 33 7.2 Mapeo Cerebral 33 7.2.1. Preparación de acocil suspendido 33 7.2.2. Secuencia de sincronización del cerebro durante el sueño 34 7.3. Origen de las ondas lentas 34 iv 8. CONCLUSIONES 34 9. REFERENCIAS 36 ESTUDIO DEL SUEÑO EN EL ACOCIL: MAPEO DE LA ACTIVIDAD CEREBRAL DURANTE EL SUEÑO EN UNA PREPARACIÓN NO DEAMBULANTE Itzel Ávila Cabello, Jesús Hernández Falcón, Yolanda de las Mercedes Gómez y Gómez. Dr. Jesús Hernández Falcón; Depto. Fisiología, Facultad de Medicina; Tel.: 56-220765; e-mail: jesushf@servidor.unam.mx Palabras clave: sueño, invertebrado, mapeo cerebral. Introducción. El sueño es un estado durante el cual el cuerpo se encuentra inactivo, no así el cerebro, y se ha estudiado sobre todo en mamíferos y otros vertebrados. Diversos estudios muestran que en algunos invertebrados también está presente esta función, lo que implica que ella aparece muy pronto en el desarrollo evolutivo. El acocil es un invertebrado que duerme y en el que se han realizado diversos estudios sobre el sueño. Este animal es útil como modelo biológico, el cerebro es de fácil acceso y el número de neuronas es relativamente pequeño, lo que facilita realizar estudios electrofisiológicos (1). La actividad eléctrica del cerebro del acocil alerta consiste en multitud de espigas sobre una línea base plana. Durante el sueño, esta actividad es sustituida por ondas lentas y desaparición de las espigas (2). El propósito de este trabajo es obtener un mapa dinámico de las diferentes regiones del cerebro del acocil durante el sueño de ondas lentas, analizarlo mediante la transformada “wavelet”, que es el instrumento matemático ideal para este tipo de señales biológicas, y postular posibles vías de transmisión de las ondas lentas hacia las diferentes áreas del cerebro Metodología. Preparación biológica: Utilicé acociles machos adultos Procambarus clarkii en intermuda, de 8 a 10 cm de longitud del rostrum-telson. Un día antes del registro coloqué a los animales un corcho en el caparazón dorsolateral, que sirvió para sujetarlo a nivel de la superficie del agua en un soporte metálico. Luego, realicé una perforación en el caparazón dorsal para exponer el cerebro por completo. En estas condiciones coloqué un electrodo en un área cerebral seleccionada y obtuve el registro de la actividad eléctrica de la misma. Posteriormente moví el electrodo a otra posición y repetí el registro hasta cubrir al menos las tres áreas principales, protocerebro, complejo central del cerebro y deutocerebro (3). Registros eléctricos: Los electrodos fueron cánulas de acero inoxidable, en cuyo interior llevaban de 1 a 4 alambres de Pt-Ir, (75 µm de diámetro) recubiertos de teflón. La señal eléctrica se amplificó por técnicas convencionales y se filtró entre 3 Hz y 3 kHz. Mediante una tarjeta AD se almacenó en una computadora personal para su análisis posterior. Análisis de las señales: Para realizar el análisis de las señales eléctricas utilicé la Transformada Wavelet, mediante un algoritmo que explora frecuencias entre 5 y 1000 Hz (3). Resultados y discusión. Un acocil flotando a nivel de la superficie del agua, presenta dos estados, alerta y dormido. La actividad cerebral del acocil alerta está formada por múltiples espigas de amplitud variable, montadas sobre una línea basal plana. Cuando el animal duerme las espigas se reducen o desaparecen y aparecen ondas lentas de baja amplitud y con frecuencias de entre 20-35 Hz. (Figura 1). Estos resultados son similares a los observados en animales reambulantes (2), lo que implica que en mis condiciones experimentales el acocil duerme. Estudios previos han mostrado que la actividad eléctrica del cerebro del acocil no es estacionaria (3), y que la Transformada Wavelet es un método de análisis ideal para el tratamiento de dichas señales. Mediante esta técnica pude determinar, sin errores de apreciación, cuándo estaba dormido un acocil desde el punto de vista electrofisiológico. Por otro lado, el mapeo cerebral me permitió determinar la secuencia de propagación de las ondas lentas durante el sueño. La secuencia tentativa es: complejo central – deutocerebro – protocerebro. Figura 1. Posiciones del acocil y su actividad cerebral correspondiente. a) animal alerta; b) animal dormido. En el análisis con la TW encontré cambios en la actividad eléctrica en casi todas las regiones. En protocerebro la actividad es regular de potencias altas que disminuyen cuando el acocil duerme. En el cuerpo central la señal es regular en frecuencias bajas y alrededor de los 30-45 Hz; esta estructuraoscila constantemente y solo cuando el animal duerme es que estas ondas lentas se propagan en la secuencia enunciada líneas arriba. Como en el caso del animal deambulante, durante el sueño de ondas lentas hay caídas de potencia alrededor de los 30-45 Hz. Conclusiones y perspectivas. La transformada Wavelet es útil para el análisis de series de tiempo no estacionarias. El sueño de ondas lentas en el acocil se caracteriza por una reducción en la potencia en la banda de frecuencias entre 30 y 45 Hz, que se desplaza del complejo central hacia deutocerebro y luego a protocerebro. Encontramos variaciones en la actividad eléctrica cerebral del acocil aún cuando se encuentra en estado de sueño. El acocil duerme aún en la preparación donde se encuentra suspendido. Pareciera que el complejo central funciona como un oscilador que es independiente del estado cerebral del animal. Agradecimientos. A los Dr. Karina Mendoza Ángeles, Dr. Jesús Hernández Falcón y Dr. Fidel Ramón, por su apoyo para la realización de este proyecto. Referencias. 1. Hernández, O. H., Serrato, J., and Ramón, F. (1996) Chronic recording of electrical activity from the brain of unrestrained crayfish: The basal, unstimulated activity. Comp. Biochem. Physiol., 114A: 219-226. 2. Ramón, F., Hernández-Falcón, J., Nguyen, B., and Bullock, T. (2004) Slow wave sleep in crayfish. PNAS, 101: 11857- 11861. 1. Mendoza-Angeles, K. (2008) Identificación y Caracterización de estados cerebrales en el acocil. Tesis doctoral, Facultad de Medicina, UNAM. 1 mailto:jesushf@servidor.unam.mx 2. INTRODUCCIÓN 2.1 Actividad eléctrica del cerebro Desde hace muchos años la técnica más utilizada para registrar y estudiar la actividad eléctrica del cerebro de los vertebrados es mediante la electroencefalografía, término introducido por Hans Berger. Convencionalmente, la actividad eléctrica del cerebro es recogida por electrodos colocados en la superficie del cuero cabelludo o en el cerebro a diferentes profundidades. La actividad eléctrica depende de la profundidad a la que han sido colocados los electrodos y también de la región donde se localicen. La señal obtenida representa la suma espacial y temporal de diferencias de potencial debidas a corrientes sinápticas, principalmente de células piramidales, cuyas dendritas atraviesan todas las capas de la corteza y permiten el flujo de esas corrientes desde capas profundas de la corteza a capas más superficiales. Estas neuronas están orientadas en paralelo unas con otras facilitando la suma espacial. La corriente está limitada por la corteza, sin embargo una pequeña fracción penetra a través de las meninges y cráneo. Llegando a el cuero cabelludo, donde debido a la propia anatomía del cráneo se registran diferentes niveles de potencial, dependiendo del área en que se coloquen los electrodos (Fisch, 1991). El EEG de un humano, despierto o en descanso comúnmente está conformado por una actividad rítmica, debida a interacciones corticotalámicas. La actividad eléctrica del cerebro de vertebrados se puede analizar de diferentes maneras. La Transformada de Fourier (Ec. 2.1) fue introducida por Dietsch en 1932 como método de análisis de la señal de EEG, gracias a ella se clasificaron los diferentes ritmos que muestra la actividad cerebral. La transformada de Fourier está diseñada para analizar señales periódicas y estacionarias. Definida por la suma de señales exponenciales de frecuencia definida. dtetfF jwt− ∞ ∞− ∫= )()(ω Ec. 2.1 donde: es una función definida en tiempo )(tf )(ωF es una función definida en frecuencia , identidad de Euler )()cos( tjsente jwt ωω +=− El análisis con la Transformada de Fourier es muy tardado, por ello se desarrolló la Transformada Rápida de Fourier (TRF), que simplifica el análisis, ya que 2 elimina la información redundante y considera la suma de señales exponenciales finitas. Esto permitió construir espectrogramas confiables y de manera rápida (Figura 2.1). Figura 2.1. Análisis del EEG mediante TRF (Modificada de del Águila, 1994). Con los resultados obtenidos se le asignaron valores a la clasificación cualitativa que ya existía y de está manera se convirtió en una clasificación cuantitativa de las ondas del EEG (Figura 2.2). Figura 2.2. Ondas características del EEG (Modificada de del Águila, 1994). 3 4 En la señal registrada mediante electroencefalografía se estudian básicamente las ondas por segundo (frecuencia), la amplitud (diferencia de potencial) y la distribución topográfica dependiendo de las áreas cerebrales. 2.2 Vigilia y sueño El estado de vigilia en un individuo se caracteriza por que este se encuentra alerta, respondiendo a los estímulos externos del medio que le rodea e interactuando con el mismo. Desde el punto de vista conductual, en la mayor parte de los mamíferos el sueño se caracteriza por una postura más o menos estereotípica y por la pérdida de la respuesta a los estímulos externos. Desde el punto de vista funcional hay dos tipos de propiedades del sueño. Por un lado, hay una reducción de la mayor parte de las funciones autonómicas, frecuencias cardiaca y respiratoria, control de la temperatura corporal, etc. Por otro lado, destacan los cambios en la actividad cerebral. El sueño es un estado durante el cual el cuerpo se encuentra inactivo, no así el cerebro y se ha estudiado sobre todo en mamíferos y otros vertebrados (Rattenborg y Amianer, 2002). En el individuo despierto y alerta, el EEG presenta un patrón dominado por ondas rápidas y de bajo voltaje, denominado ritmo beta, cuya frecuencia está dentro de márgenes relativamente estrechos: 15-60 Hz. El cierre de los ojos y la ausencia de estímulos externos lleva a la sustitución del ritmo beta por una actividad de mayor voltaje y menor frecuencia, el ritmo alfa (8-13 Hz). Cuando el sujeto entra en fase de sueño, este tipo de actividad es sustituido por ondas de mayor voltaje y de frecuencia progresivamente menor, el sueño de ondas lentas, en el que predominan ondas del EEG entre 0.5 y 8 Hz y corresponden a los llamados ritmos theta (4-8 Hz) y delta (0.5- 2 Hz). Existen dos tipos de sueño, el sueño MOR (movimientos oculares rápidos) o paradójico, y el sueño no-MOR (no hay movimientos oculares rápidos) o de ondas lentas, este último consta de cuatro fases. La primera fase (1-7 minutos) es de sueño ligero, aún percibimos la mayoría de estímulos que suceden a nuestro alrededor (auditivos y táctiles). La actividad cerebral muestra ondas lentas de frecuencias bajas (3-7 Hz). En la fase II (10-25 minutos) la actividad cerebral es predominantemente ritmo theta y los complejos K (12-14 Hz). El sueño de fase III se caracteriza por la presencia de ondas delta de frecuencias muy bajas (0.5-2 Hz) y amplitud mayor a 75μV. En la última fase (20-40 minutos) la actividad cerebral es aún más lenta en la que predominan las ondas delta. En general, cada ciclo dura unos 90 minutos de los cuales el sueño MOR ocupa 5-10 minutos. En una noche los ciclos se presentan de 4 a 6 veces. El sueño MOR es considerado el restaurador físico asociado al dormir (Kandel, 2000). 5 Al sueño se le han atribuido funciones esenciales como las que de un papel restaurador, reforzador del aprendizaje, adaptación y consolidación de la memoria, entre otras. La función reparadora sugiere que el sueño es una forma básica de restaurar lo que el cuerpo o el cerebro han gastado durante el día, ya que existen cambios hormonales que lo sustentan (Aldrich, 1999; Muzur, 2005). Aún cuando no se conoce a ciencia a cierta el por qué dormimos, se ha comprobado que el sueño se presenta de manera cicardiana en los vertebrados estudiados. Dormir es vital para los animales y su privación prolongada en animales experimentales, da como resultado la muerte (Rechtschaffen y cols., 1989). Una característicacomún durante el sueño en los vertebrados es la aparición de ondas lentas, que indican la sincronización de grandes grupos neuronales, sin embargo, en la mayoría de los animales estudiados el sueño no es un estado cerebral uniforme y estático (Mendoza-Ángeles, 2008). Surge, sin embargo, la pregunta sobre si los invertebrados duermen (Aréchiga, 1995). Los estudios en los invertebrados son escasos y principalmente de tipo conductual con algunos abordajes electrofisiológicos (Campbell y Tobler, 1984; Tobler y Stalder, 1988), pues resulta difícil colocar electrodos en el cerebro, o su equivalente, de la mayoría de los invertebrados y permitir que el animal deambule. Sin embargo, en estudios que combinaron un abordaje conductual con algunas mediciones funcionales, se encontró que en el escorpión la frecuencia cardiaca se reduce durante los periodos de inmovilidad de tipo sueño (Tobler y Stalder, 1988), de manera similar a lo que ocurre durante el sueño en los vertebrados. Otros estudios conductuales mostraron que las abejas pasan por periodos de reposo de tipo sueño que se caracterizan por una postura estereotípica y durante la cual hay una aparente reducción del tono motor que mantiene erguidas las antenas (Kaiser, 1988). Trabajos recientes aportan más datos sobre la existencia de sueño en invertebrados. Así, la mosca de la fruta muestra todo un repertorio conductual que parece indicar que el animal pasa por periodos de sueño (Hendricks y cols., 2000; Shaw y Cols., 2000; Greenspan y cols., 2001). Estos periodos pueden coincidir con el ritmo circadiano de actividad locomotriz, pero se diferencian del puro reposo por la presencia de cambios en el umbral para estímulos sensoriales, una sensibilidad a fármacos que típicamente bloquean el sueño o lo inducen y la evidencia de mecanismos homeostáticos como el rebote después de la privación de sueño. En estos animales se han podido encontrar genes que se expresan durante el sueño de manera similar a como ocurre en la rata. Estos hallazgos indican que los invertebrados tienen periodos de sueño, lo que implica que se trata de una función que aparece muy pronto en el desarrollo evolutivo (Hendricks y cols., 2000; Shaw y cols., 2000; Greenspan y cols., 2001). 2.3 Actividad eléctrica en el cerebro del acocil En el acocil se ha logrado implantar electrodos, por periodos prolongados, que permiten registrar la actividad eléctrica de la superficie del cerebro aún cuando este se encuentra realizando actividades cotidianas (Hernández y Cols., 1996), como deambular por el acuario. La preparación del acocil deambulante (Hernández y Cols., 1996), ha permitido registrar patrones de actividad eléctrica asociados a estados de sueño, caracterizada por ondas lentas de bajo voltaje (Ramón y cols., 2004) y vigilia, en la que se muestra una señal de múltiples espigas de diferentes magnitudes montadas sobre una línea basal plana, respuestas a estímulos omitidos y emitidos (Hernández-Falcón y cols., 1999; Ramón y cols., 2002), inclusive a potenciales evocados tanto de tipo visual como de tipo olfatorio. El espectro de potencias de la actividad eléctrica del cerebro del acocil despierto muestra prevalencia de ondas de alta frecuencia (mayor a 100 Hz), pero cuando el animal está de lado las frecuencias dominantes se encuentran entre 10 y 20 Hz. 2.4 Sueño en el acocil El acocil presenta una conducta que por medio de la observación se le ha relacionado con el estado de sueño, en la que el acocil se encuentra inmóvil por periodos variables, caracterizándose por una posición estereotípica (de lado sobre la superficie del agua). Esta conducta muestra registros de la actividad eléctrica diferentes a cuando el animal esta alerta, se observa un incremento en el umbral a estímulos mecánicos y ausencia de la respuesta a potenciales evocados. Esta conducta ha sido definida como sueño, en la medida que cumple con los criterios convencionales. En condiciones de laboratorio, los acociles la adoptan con frecuencia y duración variables que no parecen depender dela hora del día (Figura 2.3, Ramón y cols., 2004). Figura 2.3. Periodos de sueño de un acocil (barras oscuras) durante un periodo de 6 días. 6 En el animal alerta (Figura 2.4a), es notable la presencia de espigas de amplitud variable sobre una línea basal plana. Sin embargo cuando el acocil duerme, el patrón de señal es sustituido por ondas lentas de amplitud baja (Figura 2.4b). Figura 2.4. Posiciones del acocil y su actividad cerebral correspondiente. a) animal alerta; b) animal dormido. Las ondas lentas en el acocil dormido no tienen una morfología constante e incluso el sueño no parece tener las mismas características en todos los casos, ya que en algunos momentos el animal presenta movimientos rítmicos de quelas y de patas ambulatorias. Las señales registradas del cerebro del acocil indican que las técnicas convencionales para el análisis de estas, como la Transformada de Fourier y la Transformada Rápida de Fourier no se pueden aplicar para su análisis, ya que su diseño matemático no nos permite obtener información cuando el espectro varia en tiempo, es decir cuando la señal es no estacionaria. 2.5. Análisis en tiempo-frecuencia Como mencioné, para el análisis de estas señales no es aplicable la TF, la cual esta enfocada a las señales estacionarias, es decir a aquellas señales que mantienen constantes sus parámetros estadísticos a lo largo del tiempo. Sin embargo contamos con alternativas que nos ayudan con el análisis de señales no estacionarias o cuasi-estacionarias, como lo son la Transforma de Fourier en corto tiempo (TFCT), la transformada Gabor y la transformada Wavelet (TW), entre otras (Goswami y Chan, 1999). 2.5.1. Transformada de Fourier en corto tiempo La transformada de Fourier en corto tiempo, definida por la ecuación 2.2, se basa en el hecho de que al tomar pequeños segmentos de una señal f(t) es posible asumir que dicho segmento es estacionario y por lo tanto, calcular su transformada de Fourier. 7 dtttfbfG b∫ ∞ ∞− = )()(:),( ,ξφ φξ Ec. 2.2 donde: es la ventana tiempo-espectral. tj b ebtt ξ ξ φφ )()(, −= La ecuación muestra que es necesario fijar un ancho en el tamaño de la ventana, lo cual no nos garantiza una buena resolución, el principio de incertidumbre nos dice que para obtener buena resolución en tiempo, es necesario elegir una ventana pequeña, mientras que para obtener buena resolución en frecuencia es necesario utilizar una ventana grande. 2.5.2. Transformada Gabor Introducida por el físico inglés de origen húngaro Dennis Gabor en la década de los cuarenta. Gabor apunta el hecho de que el mejor candidato a ser ventana es una función gaussiana, por el hecho de ser no nula y donde se alcanza la máxima concentración simultánea en tiempo y frecuencia, llevando al mínimo el principio de incertidumbre. La transformada Gabor se define: . dtebtgtfbfG tj∫ ∞ ∞− −−= ξαφ ξ )()(:),( Ec. 2.3 donde, αα πα 4 2 2 1 teg − = 2.5.3. Transformada Wavelet La Transformada Wavelet de una función f(t) es la descomposición de f(t) en un conjunto de funciones ψs,τ (t), que forman una base y son llamadas las “Wavelets” . La Transformada Wavelet se define como: Ec. 2.4 Las Wavelets son generadas a partir de la traslación y cambio de escala de una misma función wavelet ψ(t), llamada la “Wavelet madre”, y se define como: Ec. 2.5 8 donde: s es el factor de escala τ es el factor de traslación Las wavelets ψs,τ (t) generadas de la misma función wavelet madre ψ(t) tienen diferente escala s y ubicación τ, pero tienen todas la misma forma. Se utilizan siempre factores de escala s > 0. Las Wavelets son dilatadas cuando la escala s > 1, y son contraídas cuando s < 1. Así, cambiando el valor de s se cubren rangos diferentes de frecuencias. Valoresgrandes del parámetro s corresponden a frecuencias de menor rango, o una escala grande de ψs,τ (t). Valores pequeños de s corresponden a frecuencias de menor rango o una escala muy pequeña de ψs,τ (t). 2.6 Anatomía del sistema nervioso del acocil El sistema nervioso del acocil (Figura 2.5) muestra una estructura formada por 6 ganglios abdominales, 5 torácicos, 1 subesofágico y el cerebro, el cual esta formado por 2 ganglios circumorales, uno subesofágico y el otro supraesofágico. Figura 2.5. A) Vista dorsal del acocil. B) Sistema nerv oso del acocil. i Modificada de Cattaert y LeRay, 2001. El supraesofágico es en sí la unión de tres ganglios embrionarios: el más rostral es el protocerebro, le sigue el deutocerebro y el más caudal es el tritocerebro (Figura 2.6). 9 Figura 2.6. Vista dorsal del Cerebro del acocil. Modificada de Sandeman y cols., 1992. El protocerebro tiene dos lóbulos laterales, donde esta la médula terminal y el cuerpo elipsoidal) y una parte media. En el protocerebro podemos encontrar el ganglio óptico (lámina, médula interna y externa). La parte media del protocerebro lo forman el puente del protrocerebro y el cuerpo central. El deutocerebro contiene los lóbulos olfatorios, los neuropilos de la antena 1 (mecanoreceptores y neuronas motoras) y los lóbulos accesorios. Al proteocerebro y al deutocerebro llega información sensorial de todo tipo y, al parecer, también son centros de integración y procesamiento de la información. El tritocerebro contiene el neuropilo tegumentario y los neuropilos de la antena II (mecanoreceptores, propioceptores y neuronas motoras). El tritocerebro forma un par de conectivos que se extiende alrededor del esófago hacia el ganglio subesofágico, los cuales permiten la comunicación entre el cerebro y la cadena nerviosa toracoabdominal. Al tritocerebro también llegan algunos nervios antenulares así como ciertos nervios sensoriales de la región anterior y de la cabeza. El ganglio subesofágico controla los movimientos de la mandíbula, la maxila y los maxilípedos. El primer ganglio torácico maneja los quelíceros y los siguientes cuatro ganglios torácicos inervan los apéndices motores del cefalotórax. En los primero 5 ganglios abdominales se encuentra el control de los apéndices asociados a cada segmento de está región del cuerpo y también cada uno de los músculos abdominales. El sexto ganglio se encarga de los urópodos, del telson, de la musculatura anal y de la parte posterior del tubo digestivo (Sandeman, 1992; Delgado Morales, 2004). 10 11 3. JUSTIFICACIÓN Se han hecho numerosos estudios del sueño en mamíferos y vertebrados, pero en el caso de los invertebrados son muy escasos, esto debido a las características de los mismos; sin embargo la pregunta sobre si los invertebrados duermen pareciera estar respondida, hallazgos indican que los invertebrados tienen periodos de sueño, lo que implica que se trata de una función que aparece muy pronto en el desarrollo evolutivo. El acocil es un invertebrado que parece reunir todos los requerimientos para el estudio del sueño, particularmente de sus aspectos electrofisiológicos. La actividad eléctrica del cerebro del acocil es totalmente distinta a la registrada en el cerebro de cualquier vertebrado, por lo que para el análisis de estas señales es recomendable hacer un estudio, sobre qué tipo de análisis es más conveniente aplicar a las señales recogidas, dándonos gráficas con buena resolución, de tal manera que permitan observar cambios importantes en tiempo y frecuencia. Sin embargo aún falta por responder muchas preguntas acerca del seño en este invertebrado, como en qué parte del cerebro se originan las ondas lentas –patrón de la señal indicativa de que el animal está dormido- y de qué manera está involucrado el complejo central del cerebro en el sueño del acocil, cómo y cuáles son las vías de transmisión en algunas partes del cerebro del acocil, etc. El mapeo cerebral y el análisis de las señales con la transformada Wavelet son herramientas muy importantes que nos puede ayudar a responder muchas de nuestras preguntas. 12 4. OBJETIVOS • Hacer un mapa dinámico de las diferentes regiones del cerebro del acocil. • Registrar la actividad eléctrica durante el estado de sueño en diferentes áreas del cerebro del acocil. • Hacer registros de actividad eléctrica del acocil durante el estado de sueño en diferentes áreas del cerebro, lesionando de manera reversible el complejo central. • Analizar las señales obtenidas mediante la transformada Wavelet, creando un algoritmo que se ajuste al tipo de señal obtenida. • Hacer un estudio de correlación entre el estado y la posición del acocil con la actividad eléctrica registrada. 13 5. MATERIALES Y MÉTODOS 5.1. Material biológico Utilicé acociles machos adultos Procambarus clarkii en intermuda. Los animales midieron entre 8 y 10 cm de longitud del rostrum al telson, y los apéndices completos. 5.2. Registros conductuales y electrofisiológicos Para llevar a cabo los registros conductuales y electrofisiológicos simultáneamente y hacer una comparación de ambos registros; previamente implanté electrodos fijos en la superficie del cerebro, coloque a los amnimales en acaurios individuales y para determinar los cambios de posición de un acocil a lo largo del nictámero obtuve videos ininterrumpidos durante 24 horas, con una cámara sensible a luz infrarroja (CCD-TRV138, Sony), al mismo que obtenía su registro eléctrico. La señal recogida por los electrodos era enviada a amplificadores de AC (P511, Grass Instruments, Quincy, MA) con filtros pasabanda colocados a 3 Hz y a 3 kHz. Desplegué la señal en un osciloscopio (Gould, Mod. 1604) de rayos catódicos y en paralelo la envié a una tarjeta convertidora A/D (6024E, National Instruments), para muestrear usé una frecuencia de 2 KHz para su almacenamiento en una computadora y su análisis posterior. 5.2.1. Preparación biológica Inicialmente anestesiaba a los acociles por frío, por aproximadamente 30 min, posteriormente. Para tener acceso al cerebro, realizaba una perforación amplia en el caparazón dorsal, que abarcaba toda la región cefálica, después retraje las vísceras internas y las mantuve en esta posición mediante un sujetador de plástico, por último retiré la hemolinfa. Bajo el microscopio estereoscópico descendí un electrodo hacia la posición adecuada. Por último sellé la perforación, pegando parafilm (American Can Co., Greenwich, CT) al caparazón a modo de crear una capa protectora y la que recubrí posteriormente, con una capa de acrílico. Después de implantar los electrodos (Figura 5.1), regresaba a los animales a sus acuarios individuales donde permanecían aislados para su recuperación durante al menos 24 horas. Figura 5.1. Electrodo implantado en la superficie del cerebro del acocil. 5.2.2. Electrodo Usé un electrodo diseñado previamente en el laboratorio, consta de una cánula de acero inoxidable dentro de la cual inserté 1 alambre de platino-iridio (75 μm de diámetro) recubierto con teflón. La cánula está doblada en un extremo en un ángulo de 30-40 grados. Fijé el alambre con parafilm (American Can Co., Greenwich, CT) para evitar el movimiento dentro de la cánula (Figura 5.2). Figura 5.2. Diagrama del electrodo de un solo alambre. 5.3. Mapeo Cerebral Los resultados que encontré hicieron necesario un mapeo de las diferentes regiones del cerebro del acocil. Esto no es posible en el animal deambulante (porque la ventana del caparazón es relativamente pequeña y la cánula obstruye la visión de buena parte del cerebro), por lo que utilicé otra preparación para poder obtener registros de diferentes regiones de un animal inmóvil, además modifiquélas características del electrodo y de la preparación. 5.3.1. Preparación biológica La preparación que hemos ideado en el laboratorio consiste en un acocil que no puede deambular libremente por el acuario pero que puede mover cualquiera de sus apéndices (patas ambulatorias, quelas, antenas o anténulas) e incluso el abdomen o el telsón (Figura 5.3). 14 Anestesié por frío acociles intactos en los que previamente se fijé un corcho en el caparazón dorsal – en la cara lateral del mismo –, el cual sujeté a un estativo mediante una barra metálica. Esto me permitió mantener al animal sumergido en agua (para que pudiera respirar), móvil y tener acceso prácticamente libre al cerebro. Para tener este acceso se hace una perforación amplia en el caparazón dorsal, que abarque toda la región cefálica, se retraen las vísceras internas y se mantienen en posición mediante un sujetador de plástico. Bajo el microscopio estereoscópico descendí un electrodo múltiple hacia la posición adecuada y bañé la preparación con solución salina para acocil (Van Harreveld, 1936) e hice el registro, para posteriormente realizar el análisis. En estas condiciones pude colocar el electrodo en el área seleccionada, obtuve el registro y posteriormente moví el electrodo a otra posición y repetí el registro. Al concluir con el registro, cubrí el orificio con parafilm (American Can Co., Greenwich, CT) y regresé a cada acocil a un acuario individual, para su recuperación. Figura 5.3. Preparación del acocil suspendido, diseñada en el laboratorio. La posición de los electrodos en relación a las áreas cerebrales del acocil se muestra en la Figura 5.3. Los electrodos E1, E2, E3 y E4 se encontraban en el protocerebro; E1 y E3 sobre la región superior lateral (izquierda y derecha respectivamente), E2 en la región superior; que incluye el puente y el cúmulo celular 6 y, E4 en la región media del complejo central, por lo que la señal puede provenir del tracto olfatorio o del cuerpo central. Los electrodos E5 y E6 se encontraban en deutocerebro y, E7 y E8 en tritocerebro. 15 Figura 5.4. Ubicación de los electrodos de registro. Las combinaciones de electrodos de registro fueron: E1-E5, E3-E6, E2-E4, E1-E5-E7, E3-E6-E8 y E1-E4-E6 5.3.2. El electrodo Construí electrodos cuádruples. Para ello, usé una cánula de acero inoxidable dentro de la cual inserté de 4 alambres de platino-iridio (75μm de diámetro) recubiertos con teflón. La cánula estaba doblada en un extremo en un ángulo de 30-40 grados. Fijé los alambres con agar dejándolo enfriar por 24 horas para que endureciera y de está manera fijar los alambres. El diámetro de los electrodos me permitió colocarlos dentro de la cánula sobresaliendo aproximadamente 0.05 mm de ella, por lo que al implantarlos quedaban dentro del cerebro pasando la vaina de tejido conectivo (Figura 5.5). Figura 5.5. Diagrama del electrodo cuádruple. 5.4. Manipulación Para poder determinar si las ondas de sueño se originan y diseminan a partir del complejo central del cerebro fue necesario reducir la actividad de esta región. Ello lo conseguí mediante enfriamiento de la misma como relato a continuación. 16 5.4.1. Preparación biológica Después de anestesiar los animales con frío (30 minutos), hice una perforación en el caparazón, separé y retraje los músculos con un separador de plástico, para tener acceso al cerebro. Después fijé al acocil un soporte metálico por medio de un corcho pegado a la cara lateral del caparazón dorsal del acocil. A continuación, bajo control microscópico, coloqué el electrodo múltiple sobre el cerebro utilizando un micromanipulador, asegurándome de que las puntas penetrarán la vaina que cubre el cerebro y que la guarda formará un sello sobre la superficie del tejido, de tal manera que el registro proviniera ya no de la superficie del cerebro sino de la porción interna del mismo. Finalmente, bañé la preparación con solución salina de van Harreveld (NaCl 205mM, KCl 5.4mM, MgCl2 2.6mM, HEPES 5mM; van Harreveld, 1936) a temperatura ambiente (aproximadamente 21 ºC). Con está preparación pude obtener registros de varias zonas del cerebro, hice el registro control durante media hora y después procedí a enfriar una región cerebral. Para ello, tomé el electrodo que se encontraba en dicha región y en serie coloque una malla de cobre (buen conductor), la cual metí en agua-hielo (aproximadamente 4ºC), estos registros tuvieron una duración de 30 minutos. Al término de cada registro cerraba el orificio con parafilm (American Can Co., Greenwich, CT) y regresaba a cada acocil a un acuario independiente, para su recuperación. 5.4.2. El electrodo Para este tipo de preparación utilice el mismo electrodo diseñado para el mapeo cerebral (Figura 5.5). 5.5. Análisis de los registros de actividad eléctrica cerebral. Para el análisis en tiempo-frecuencia de las señales cerebrales, utilicé transformada wavelet (TW). Elegí segmentos de la señal recogida sin importar su grado de estacionariedad. Para el análisis con representación Wavelet utilicé un algoritmo diseñado en el laboratorio, que calcula la TW de una serie de tiempo f(n) con N=o,…N; donde N es el número de puntos en la serie de tiempo con un espaciamiento; este algoritmo se basa en: ∑ ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ −= N n a tbnnfabfW δψψ )()(:),( Ec. 5.1 17 usando una ventana Morlet definida por: ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛= −− a b-tos)( 2/)(, 2 cet ajbtabψ Ec. 5.2 Se seleccionó una Wavelet madre, para este caso la Morlet (Figura 5.5) debido a que es no-ortogonal (lo que permite observar cambios suaves y continuos en la potencia) y compleja (mejor adaptada para capturar cambios oscilatorios), además de presentar características similares a la señal de registro extracelular del cerebro del acocil (Mendoza-Ángeles, 2008). Figura 5.5. Función Morlet (Modificada de Goswami y Chan, 1999). 18 19 6. RESULTADOS 6.1. Estudio de la anatomía del Sistema Nervioso Central del Acocil Para estudiar los principales detalles anatómicos del cerebro del acocil trabajé con acociles adultos Procambarus clarkii, de aproximadamente 8-10 cm rostrum – telson, muertos recientemente y con preparaciones vivas anestesiadas, el método de anestesia consiste en colocar al acocil en un recipiente con hielo hecho escarcha y meterlo al refrigerador por al cabo de 30 minutos aproximadamente. Con el primer tipo de preparación pude extraer cerebros completos los que analicé bajo el microscopio estereoscópico comparándolos con trabajos ya publicados (Sandeman y cols., 1992). Sin embargo las preparaciones vivas me permitieron identificar las mismas regiones pero en los momentos que anteceden a la implantación del electrodo (Figura 2.6). 6.2. Preparación deambulante Antes de implantar los electrodos en una preparación no deambulante, fue necesario aprender a implantar exitosamente electrodos fijos en preparaciones deambulantes y tener un 60 % de sobrevivencia a de los animales después de la cirugía, para poder hacer análisis de registros conductuales y electrofisiológicos. 6.2.1. Análisis de los registros conductuales En condiciones de laboratorio es posible encontrar a un acocil en cualquiera de dos conductas. En la primera el animal se encuentra deambulando por el acuario por periodos variables (Figura 6.1A), responde a estímulos externos y explora el entorno. En la segunda, el acocil se pone de lado durante periodos variables (Figura 6.1B). Como este animal no flota, para ponerse de lado coloca las patas ambulatorias de un lado del cuerpo sobre la pared del acuario y se apoya en las patas contralaterales, las cuales se encuentran en el fondo del acuario. Las quelas quedan péndulas, las antenas se relajan y yacen fláccidas hacia el fondo del acuario y las anténulas se mantieneninmóviles y relajadas. (Figura 6.1B). La actividad locomotriz de un acocil muestra una fuerte relación con los ciclos de luz y oscuridad. En animales sincronizados a ciclos de 12 horas de luz por 12 horas de oscuridad, la actividad locomotriz incrementa significativamente en las transiciones luz-oscuridad y oscuridad-luz (Ramón y cols., 2004). Figura 6.1. Acociles inmóviles. A) Dos animales parados y B) Un acocil de lado. Como previamente fue reportado (Mendoza-Angeles y cols., 2007; Ramón y cols., 2005), la duración de estos periodos es muy variable (Figura 6.2). Para ilustrar los registros conductuales, elaboré una gráfica usando una técnica ya publicada (Mendoza-Angeles, 2008) la cual consiste en asignar un valor de 0 para la posición de parado y de 1 para la posición de lado, y correlacionarlas con la hora a la que inició y terminó cada una de ellas. Figura 6.2. Posición de un acocil durante el ciclo de 24 horas (La barra oscura indica las horas de oscuridad); modificada de Mendoza-Ángeles, 2008. 6.2.2. Análisis de los registros eléctricos Al hacer la comparación entre la conducta y la actividad cerebral del acocil encontré que cuando el acocil se encuentra en estado de alerta (parado) muestra una actividad eléctrica conformada por múltiples espigas montadas en una línea basal plana (Figura 6.3A). El tipo de actividad eléctrica es similar entre protocerebro y deutocerebro, no así en tritocerebro donde predominan ondas muy lentas que corresponden a la actividad respiratoria de los escafognatitos (Figura 6.3A, Ramón y cols, 2004). Al cambiar a la posición de lado (Figura 6.3B), la actividad registrada en protocerebro o en deutocerebro se modifica, reduciéndose la cantidad y amplitud de las espigas y apareciendo ondas lentas con frecuencias alrededor de 15 Hz. 20 Figura 6.3. Actividad eléctrica del cerebro del acocil A) Parado y B) De lado. P=Protocerebro, D=Deutocerebro y T=Tritocerebro. 6.2.2.1. Análisis tiempo-frecuencia En el laboratorio se hizo un estudio previo de parámetros estadísticos para acociles alerta y dormidos, con el fin de verificar si las señales registradas de la actividad eléctrica del acocil era de tipo estacionario o no y, de esta manera tomar la decisión de sobre con que transformada hacer el análisis dicha actividad, de tal manera que nos mostrarán la mayor cantidad de información sobre los estados cerebrales presentes en el acocil. Los estudios realizados con la media y la desviación estándar móviles (Figura 6.4), como se pude observar en las gráficas resultantes, indicaron que tanto para el acocil parado como de lado, la señal tiene variaciones con respecto al tiempo, pero con algunos segmentos en los que la señal se mantiene constante, que reciben el nombre de segmentos cuasi-estacionarios. Esto confirmó que las señales registradas de la actividad cerebral del acocil para ambos estados son no estacionarias. 21 Figura 6.4. Media y desviación estándar móviles de la actividad eléctrica del acocil parado (A) y de lado (B), de Mendoza-Ángeles, 2008. Transformada de Fourier en corto tiempo (TFCT). Sin embargo como ya explique antes la TFCT esta diseñada para análisis de señales no estacionarias por lo que la apliqué se le aplicó sólo a los segmentos cuasi-estacionarios y se obtuvieron los siguientes espectrogramas Figura 6.5. Figura 6.5. Espectrograma con TFCT de la actividad correspondiente al acocil parado (A) y de lado (B). Nótese que la potencia para todas las frecuencias disminuye cuando el acocil está de lado, tomada de Mendoza-Ángeles, 2008. 22 23 Se utilizaron diferentes longitudes de ventana (128, 256, 512 y 1024 muestras respectivamente) y se graficaron sus espectrogramas correspondientes. Se Trabajó con frecuencias de 0 a 60 Hz, el tiempo en segundo, mientras que la potencia la se graficó mediante un código de color de acuerdo al espectro natural de la luz visible. Podemos observar como es que la resolución varía con respecto al número de muestras que limitan la ventana (Figura 6.5). En los espectros se observan líneas horizontales y las líneas verticales, que indican componentes de frecuencia y tiempo respectivamente. De acuerdo con estas gráficas, la ventana que produce mejor resolución para las frecuencias de interés (0 a 60 Hz) es la de 256 muestras para el caso del acocil parado y de 512 muestras para el animal de lado. Al hacer una comparación entre el espectro del acocil parado con el del acocil de lado, se ve con claridad como es que para todas las ventanas, no importando el número de muestras, disminuye la potencia significativamente. Sin embargo en estas gráficas no es posible observar cambios de transición de un estado a otro, esto indica que la TFCT no nos ayuda a analizar los segmentos cuasi-estacionario de la señal adquirida. Y la resolución que nos brinda no es la mejor, ya que es necesario fijar un ancho de la ventana. Transformada Gabor. Por las características de esta transformada es posible hacer un mejor análisis, ya que como sabemos con ella tenemos una reducción al mínimo del principio de incertidumbre (Goswami y Chan, 1999). Para saber si me sirve el análisis de las señales con está transformada, se obtuvieron espectrogramas similares a los obtenidos con la TFCT, mediante un algoritmo de la misma diseñado en el laboratorio. En el espectrograma del acocil parado se observan potencias altas, principalmente en la banda de 0 a 10 Hz y algunas transiciones representadas por líneas verticales (Figura 6.6A) Figura 6.6. Espectrograma con transformada Gabor de la actividad correspondiente al acocil parado (A) y de lado (B). Nótese que la potencia para todas las frecuencias disminuye cuando el acocil está de lado. Es claro el decremento en la potencia a todas la frecuencias cuando el acocil cambia de estado alerta (Figura 6.6A) al de dormido (Figura 6.6B). Las gráficas qus se obtuvieron indican variaciones en la banda de 0-10 Hz, en las que la potencia ya no permanece constante, por lo que los eventos transitorios se localizan con mayor precisión. Este análisis resulto tener mejor resolución que el de la TFCT, pero sigue teniendo las mismas limitaciones que la anterior, ya que se requiere limitar el ancho de la ventana, con un cierto número de muestras. Nota: me permití tomar los resultados anteriores, obtenidos por Mendoza- Ángeles, 2008, con el fin de fundamentar el tratamiento de las señales que obtuve con la wavelet. Transformada Wavelet (TW). Puesto que los análisis anteriores demuestran que la actividad eléctrica del cerebro del acocil es de carácter no estacionario resulta necesario usar un análisis no lineal para obtener información sobre la dinámica de aparición de las ondas de sueño en este crustáceo. Como previamente lo relaté, las bases para este análisis fueron desarrolladas en el laboratorio y para mis experimentos modificamos algunos parámetros para poder estudiar segmentos de diferentes duraciones y con límites de frecuencias un poco mayores. 24 Del análisis con TW obtuve gráficas tridimensionales que incluyen tiempo, frecuencia (sólo la banda de 0-60 Hz) y potencia (codificada en color usando el espectro de la luz visible). La TW de la actividad eléctrica cerebral correspondiente al acocil parado, muestra la relación entre las frecuencias del registro eléctrico del cerebro (30-45Hz), su potencia y el tiempo durante el cual se realizó el registro (Figura 6.7). En protocerebro, se observa una actividad constante a lo largo del tiempo, las frecuencias dominantes están alrededor de los 30 y 8 45 Hz, y una más alrededor de los 25 Hz. También es posible observar cambios transitorios al inicio del segmento. Por otro lado en deutocerebro la actividad es más regular, alrededor de la banda de los 25 Hz (que nos muestra la gráfica de contorno) lapotencia es más alta comparada con del caso protocerebro. Figura 6.7. Gráficas tridimensionales y de contorno de la transformada wavelet, de la actividad eléctrica de protocerebro y deutocerebro correspondientes al acocil parado. Para la actividad cerebral que corresponde al acocil de lado, las gráficas de TW (Figura 6.8) muestran un descenso en la potencia que es claro para todas las frecuencias y para las dos regiones (protocerebro y deutocerebro). 25 Es posible observar que en el protocerebro se localizan grandes depresiones en la banda 30-45 Hz. Pero en deutocerebro también se observan dichos cambios, donde los valores de las potencias tienden a bajar más. Es posible observar estas depresiones en ambas regiones cada vez que el animal adopta la posición de lado. Figura 6.8. Gráficas tridimensionales y de contorno de la TW de la actividad eléctrica de protocerebro y deutocerebro, correspondientes al acocil de lado. Nótese la reducción en la potencia para todas las frecuencias en ambas regiones. Compárese con las figuras 7.9 y 7.10. Las gráficas anteriores me permiten decir que las ondas lentas o depresiones aparecen primero en deutocerebro y después se expande al protocerebro. 6.3. Mapeo cerebral Los resultados obtenidos recientemente demuestran que la actividad eléctrica producida por el sueño da inicio en deutocerebro y se transmite a protocerebro; por esta razón fue necesario hacer un mapeo de las diferentes regiones del cerebro para tener una idea de la dinámica del sueño desde el punto de vista electrofisiológico. Para este caso se diseñé un electrodo múltiple, que me permitiera registrar diferentes regiones cerebrales simultáneamente y recurrí nuevamente a la preparación del acocil 26 suspendido, ya que como mencione anteriormente, además permite la visualización total del cerebro. 6.3.1. Registros En el laboratorio fue desarrollada una preparación de acocil suspendido (Mendoza-Angeles, 2008) que permite tener fácil acceso al cerebro y modificar la posición de los electrodos. Se ha demostrado que un acocil suspendido es capaz de dormir y fue durante los periodos de sueño que pude cambiar la posición de los electrodos, registrar de diferentes regiones y enfriar algunas con el propósito de determinar los orígenes de las ondas lentas y la dinámica de su propagación. En la figura 6.9 muestro los registros eléctricos correspondientes a la actividad del cerebro en las regiones principales del cerebro del acocil cuando esta alerta; y la señal es muy parecida a la registrada en los animales deambulantes. El registro del protocerebro superior lateral (E1 y E2), está caracterizado por espigas sobrepuestas en una base plana y, el protocerebro medio superior se observan más espigas. El complejo central registra ondas de baja frecuencia con una gran cantidad de espigas de diferentes amplitudes. Esas ondas se presentan en deutocerebro aunque con espigas de tamaños regulares. Por último en tritocerebro hay pocas espigas sobre una onda de baja freceuncia (alrededor de los 3 Hz). Figura 6.9. Actividad eléctrica del cerebro del acocil alerta. Las posiciones de los electrodos son las mismas de la figura 5.3. 27 Por otra parte en el acocil "dormido" se modifica la actividad eléctrica de las regiones registradas, de tal manera que en el protocerebro superior, tanto lateral como medio, disminuye la amplitud de las espigas. En deutocerebro, además de una disminución similar, aparecen ondas de baja frecuencia. En el complejo central y en tritocerebro no hay cambios significativos (Figura 6.10). Figura 6.10. Actividad espontánea del cerebro del acocil dormido. Las posiciones de los electrodos son las indicadas en la figura 5.3. 6.3.2. Transformada wavelet El análisis con transformada wavelet de las señales obtenidas de la preparación no deambulante confirma resultados previamente obtenidos. 28 a) b) E1 E2 E4 E5 E7 a) b) E1 E2 E4 E5 E7 Figura 6.11. Graficas 3-D de la transformada Wavelet de la actividad eléctrica registrada en varias regiones del cerebro de acociles, a) alerta y b) dormido. Las posiciones de los electrodos son las indicadas en la figura 5.3. En el protocerebro superior lateral del animal alerta hay una actividad muy regular, con potencias altas que disminuyen cuando el acocil está dormido. En el protocerebro superior medio, la actividad es también muy regular, con potencias altas que no cambian cuando el acocil está dormido. En el cuerpo central la actividad de muy baja frecuencia es regular y alrededor de los 30-45 Hz se presentan las caídas en 29 potencia características del sueño, las que aparentemente están presentes en todo momento, aunque son más pronunciadas cuando el acocil está dormido. Cuando el acocil está alerta, la actividad eléctrica del deutocerebro es muy similar a la del protocerebro superior, pero cuando el acocil está dormido, aparecen depresiones alrededor de 30-45 Hz. Por último, en tritocerebro la potencia es muy alta para las frecuencias más bajas, alrededor de los 5 Hz, y permanece elevada cuando el acocil está dormido; el cambio más significativo en esta región es un aumento en la homogeneidad de la potencia de este intervalo de frecuencias (Figura 6.11). 6.4 Manipulación de la actividad del complejo central: efectos del enfriamiento. Los resultados anteriores me dicen que el complejo central es el que origina las ondas lentas y al parecer el que inicia con la sincronización de la actividad de las demás regiones del cerebro del acocil. Para demostrar esto modifique la preparación del acocil suspendido y ocupando el mismo electrodo múltiple, enfrié zonas especificas (Figura 6.12) y registré la actividad, después comparé registros control, con registros de las zonas enfriadas, analizando los resultados obtenidos. Figura 6.12. Posición de los electrodos, con un tache se encuentra marcada la zona enfriada 6.4.1. Registros Los registros muestran que dependiendo de la región enfriada hay cambios en las regiones adyacentes a esta. En el registro control, antes de enfriar alguna región (Figura 6.13A), observe que la señal de protocerebro y deutocerebro son similares, muestran numerosas espigas de amplitud variable y con algunas oscilaciones, mientras que en el complejo 30 central las espigas disminuyen, al igual que su frecuencia y amplitud, y se observa una señal oscilante. Figura 6.13. Registros eléctricos A) control, B) después de enfriar el complejo central. Las posiciones de los electrodos son las indicadas en la figura 6.12. Sin embargo, cuando se enfría el complejo central (Figura 6.12), se ve claramente que la señal de protocerebro se regulariza un poco, pero las espigas aumentan de amplitud, no así en deutocerebro, donde la señal disminuye en frecuencia, amplitud y número de espigas, haciéndose regular. Pero algo muy interesante sucede en el complejo central, las señal deja de oscilar y disminuyen las espigas (Figura 6.13B). 6.4.2. Análisis con la transformada Wavelet Al hacer una comparación de las wavelets de los registros control (Figura 6.14A) con las de los registros con enfriamiento (Figura 6.14B), me percaté de que la potencia de la señal de protocerebro aumentó, de forma ligera, para las frecuencias comprendidas entre 5 y 35 Hz. Hay que hacer notar que, para la frecuencia de 15 Hz, no hubo aumento, por el contrario, fue persistente una disminución en la potencia de esta frecuencia. En deutocerebro se observa que la señal conserva el mismo patrón antes y después del enfriamiento, pero con una disminución en la potencia de todas las frecuencias exploradas. 31 Figura 6.14. Gráficas 3-D de las Transformada Wavelet de las señales de varias regiones del cerebro,A) control y B) después de enfriar el complejo central. Las posiciones de los electrodos se muestran en la figura 6.12. En el complejo central, las oscilaciones desaparecen por completo y solamente son evidentes espigas de diferentes amplitudes. Es de suponer que estas espigas estuvieron presentes todo el tiempo y que se hicieron evidentes al momento de cancelar las ondas lentas. Resulta notable, sin embargo, que la amplitud de las espigas remanentes sea similar a lo observado en las otras regiones del cerebro del acocil. Se requieren más experimentos para explicar este resultado. 32 33 7. DISCUSIÓN 7.1. Identificación de estados cerebrales Fue posible distinguir dos estados cerebrales, el de vigilia caracterizado por una actividad cerebral formada por múltiples espigas de amplitud variable montadas sobre una línea basal plana (Hernández y cols., 1996), el animal deambula por el acuario, moviendo las antenas o realizando labores de limpieza; el estado de sueño se caracteriza por ondas lentas de baja frecuencia y amplitud, desaparición de espigas (Ramón y cols., 2004), y una posición típica, de lado a nivel de la superficie del agua. El análisis realizado me permitió caracterizar la actividad cerebral de las diferentes áreas estudiadas y evaluar los efectos que tiene la reducción de la actividad de regiones circunscritas, inducida por el frío, sobre el sueño de este invertebrado. 7.1.1. Análisis con transformada wavelet Como mencioné anteriormente, el estudio de la actividad eléctrica con los métodos estadísticos me avalan para decir que dicha señal es no estacionaria pero que segmentos son cuasi-estacionarios. Elegí la función Morlet como wavelet madre ya que se asemeja a la forma de señal de la actividad eléctrica cerebral del acocil. Las propiedades que muestra a la TW la hacen sensible a los cambios en frecuencia, tiempo y potencia, y esto lo podemos confirmar en las gráficas 3D, que me muestran cambios importantes en el patrón de la señal cuando el acocil esta alerta, donde vemos potencias altas a las frecuencias muestreadas y de cuando el acocil esta dormido, la gráfica es reemplazada por una en la que observamos huecos, que indican disminución en la potencia entre las frecuencias de 30 y 45 Hz, mientras que las ondas lentas se ven como ondas entre las frecuencias de 15 a 20 Hz reportadas (Ramón y cols., 2004) y, también se pueden observar con claridad las transiciones de un estado a otro con muy buena resolución. 7.2. Mapeo cerebral 7.2.1. Preparación de acocil suspendido La preparación del acocil suspendido (Mendoza-Ángeles y cols., 2008), diseñada en el laboratorio, me permitió hacer un estudio exhaustivo de la actividad eléctrica del cerebro del acocil, tanto en estado de vigilia como de sueño y tratar de para responder a las preguntas que me llevaron a hacer dicho estudio, respecto al origen de las ondas lentas, de que si los cambios en la actividad eléctrica ocurren en todo el cerebro del acocil o existe un sitio específico donde inicien y la secuencia de 34 propagación de la misma, de manera que pueda tener una idea de la dinámica del sueño desde el punto de vista electrofisiológico. En la preparación de acocil suspendido el animal se observan dos estados conductuales, y lo más importante es que ahora podemos decir que el acocil duerme y que los registros eléctricos son similares a los obtenidos en la preparación deambulante en ambos estados. La transformada wavelet de la actividad eléctrica del cerebro de acociles suspendidos en estado de vigilia es muy similar a la obtenida de animales deambulantes alertas, la única diferencia es que las espigas son de mayor amplitud y más numerosas en la preparación de acocil suspendido, esto puede deberse a que los electrodos atraviesan la vaina de tejido conectivo. Y en el estado de sueño son más notorias las potencias bajas y oscilaciones en el complejo central. 7.2.2. Secuencia de sincronización del cerebro durante el sueño La preparación de acocil suspendido me permitió además registrar simultáneamente tres o cuatro áreas del cerebro y por lo tanto establecer una secuencia aproximada en que ocurren los cambios cuando el acocil duerme: Las ondas lentas con frecuencias entre los 15 y 20 Hz y la depresión en potencia en las frecuencias de 30 a 45 Hz están presentes en el complejo central independientemente del estado cerebral del acocil, de esta área se “propagan” al deutocerebro y finalmente al protocerebro posterior medio. 7.3. Origen de las ondas lentas Conforme al lo observado en los experimentos anteriores, en el complejo central siempre presenta ondas lentas, que en el caso del estado de sueño son propagadas y sincronizadas a las demás regiones del cerebro del acocil. En el acocil no hay datos que indiquen el origen de las ondas lentas, pero las dendritas están en la vecindad de grandes cantidades de glía (Sandeman y cols., 1992) y podría especular que existen interacciones similares entre glía y neuronas a través de ondas de calcio que resulten en ondas lentas en la actividad eléctrica del cerebro del acocil (Mendoza-Ángeles, 2008). 7.4 Manipulación de la actividad del complejo central: efectos del enfriamiento. Los experimentos que realicé me permiten decir que el complejo central en el acocil es un oscilador, el cual sincroniza la actividad de las demás regiones del cerebro cuando este se encuentra en el estado de sueño. 35 Al enfriar esta región las ondas lentas desaparecen y por tanto en el resto del cerebro no se presentan, lo que pudiera decirnos que cuando no hay ondas lentas el acocil no duerme. Sin embargo no hay antecedentes que sustenten lo que obtuve en este parte del trabajo, por lo que sólo queda como una hipótesis. 36 8. CONCLUSIONES • La transformada Wavelet nos brinda información importante sobre la actividad eléctrica del cerebro del acocil, que con otros métodos de análisis como la TFCT y la transformada Gabor no nos permiten observar. • El sueño de ondas lentas en el acocil se caracteriza por una reducción en la potencia de la banda de frecuencias entre 30 y 45 Hz, desplazándose de deutocerebro a protocerebro. • El acocil suspendido es una preparación que permite hacer un mapeo de las regiones cerebrales, comprobándose que el animal duerme ya que presenta las mismas características que cuando colocamos electrodos fijos en el cerebro. • Pareciera que el complejo central funciona como un oscilador que es independiente del estado cerebral del animal. Cuando el acocil duerme este es el que origina las ondas lentas en las regiones adjuntas a este. • Cuando se enfría el complejo central este deja de oscilar, y por lo tanto no se presentan oscilaciones en las demás regiones del cerebro. 37 9. 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