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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA “ANÁLISIS DE GENES ASOCIADOS A CALIDAD DE LA CARNE Y SU EFECTO EN CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS DE GANADO CHAROLAIS” TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA PRESENTA: Q.B.P. CARMEN YAZMÍN MUÑOZ MEJÍA DIRECTOR: DR. GASPAR MANUEL PARRA BRACAMONTE DIRECTORA: DRA. ANA MARÍA SIFUENTES RINCÓN Reynosa, Tamaulipas, México Diciembre, 2009 DEDICATORIA Dedicó este trabajo y doy gracias a Dios que me permitió una vez más cumplir una meta en mi vida y esperando alcanzar muchas más. A mis padres y amigos, Tere y Sergio, por su amor incondicional, consejos y apoyo en todos los momentos de mi vida. A mis hermanos Vicky, Chuy y Luis por su apoyo, cariño y por compartir cada momento de lucha constante hasta cumplir cada uno de nuestros sueños. A mi tía luz por su cariño y motivación en cada momento… gracias tía! A un hombre especial, César, gracias por tu apoyo. A mis amigos por su amistad y consejos Edna, Mariana, Yolanda, Agustín, Carlos, Katia, María, Juan Zamora, lili, Beto, Indira, Sr. Víctor Rodríguez. Gracias! A mis primos (Jennifer Rojas) y tíos por su motivación y aliento, gracias siempre! A todas las personas que con sus múltiples formas de ser, conociendo sus errores, resaltando siempre sus virtudes, me han enseñado que el humano es un instrumento que experimenta diversas promesas y desventuras de la vida, haciéndolo elegir lo que desee en cualquier circunstancia de la vida, lo que lo hace ser como és. Por ese simple hecho, tiene el lujo de elegir lo que más le conviene sin tabús y reservas. ¡Gracias! a esas personas que permiten que las cosas triviales se transformen en hechos reales, siendo irreverentes con la ignorancia, que al final de cuentas se convierte en la verdad que ¡nos hace libres! “A todos, ¡gracias! por darme la oportunidad de disfrutar su presencia mediante un abrazo, una palmada en la espalda, una muestra de cariño, por sentirme orgullosa de ser parte de sus vidas!” AGRADECIMIENTOS Agradezco sinceramente a mis asesores y guías, el Dr. Manuel Parra y la Dra. Ana Ma. Sifuentes, por su paciencia, apoyo, consejos y darme la oportunidad de ampliar mis horizontes en el campo de la ciencia, cambiando ese concepto trivial de la sabiduría universal. ¡Muchas gracias! A las personas que conforman mi comité y que con su ayuda, consejos y amistad hicieron posible este trabajo, el Dr. Juan Manuel González, Dr. Juan Carlos Martínez, M. en C. Cristian Lizarazo. A mis compañeros y familia del laboratorio de Biotecnología Animal: Doc Manuel, Doc Ana, Xochitl, Williams, Soján, Brenda, Juan Zamora, Diana, Rey David, Perla, Víctor, Luis y Breidy por todos los momentos que pasamos. Les deseo ¡un gran éxito en todo lo que emprendan! A cada uno de mis compañeros de generación y a todo el personal que hace del CBG un centro de aprendizaje y motivación. Al Dr. José Luis Hernández, Isabel Sánchez, Di Carlo Quiroz, Ing. Roberto Blanco, Ing. Jesús García, por su amistad y los momentos gratos que me hicieron pasar durante mi estancia en el laboratorio de Biotecnología experimental. A cada una de las personas Angélica, Israel, Israelito, Carlitos, Sra. Carmen, Sr. Jesús, Sra. Margarita Pérez, que me apoyaron con sus atenciones, alojamiento y cariño durante mi estancia en esta Ciudad de Reynosa, Tamaulipas. A las instituciones que me brindaron apoyo desde el inicio de mi maestría hasta el término de ésta: Club Rotario de Reynosa, Tamaulipas, CONACYT, SIP-IPN, UAT y GRUPO FINANCIERO SANTANDER. “Cada uno me mostró lo que significa esforzarse en adquirir conceptos y enseñanzas que conforme pasa el tiempo cada vez son más difíciles y abstractos de entender”. ¡GRACIAS! i INDICE Contenido Página ABREVIATURAS…………………………………………………………………. iv RELACIÓN DE CUADROS……………………………………………………… vi RELACIÓN DE FIGURAS………………………………………………………. viii RESUMEN………………………………………………………………………….. x ABSTRACT………………………………………………………………………... xii I. INTRODUCCIÓN……………………………………………………………... 1 2. ANTECEDENTES……………………………………………………………… 3 2.1. La ganadería bovina………………………………………………………….. 3 2.2. La ganadería bovina productora de carne en México……………………… 4 2.3. La problemática de la ganadería bovina en México………………………... 5 2.4. Mejoramiento genético……………………………………………………….. 6 2.5. El mejoramiento genético en el ganado bovino para carne………………... 8 2.6. El mejoramiento genético asistido por marcadores genéticos………………. 10 2.7. Aplicación de los marcadores en la ganadería de México………………….. 12 2.8. Marcadores moleculares……………………………………………………... 12 2.9. Tipos de marcadores………………………………………………………….. 13 2.10. Marcadores asociados a la calidad de la carne……………………………. 13 2.11. Tiroglobulina (TG) …………………………………………………………. 14 2.12. Calpaína 1 (CAPN1) ………………………………………………………... 15 2.13. Miostatina (MSTN) …………………………………………………………. 17 2.14. Detección de polimorfismos de un solo nucleótido………………………... 20 2.14.1. Discriminación alélica…………………………………………………….. 20 2.14.2. La técnica de PCR-RFLP………………………………………………... 21 3. JUSTIFICACIÓN……………………………………………………………… 23 4. OBJETIVO GENERAL………………………………………………………... 24 4.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS………………………………………………... 24 5. HIPÓTESIS……………………………………………………………………... 24 6. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………… 25 6.1. Origen del material biológico y pruebas de comportamiento……………... 25 ii 6.2. Genotipificación de los cuatro marcadores asociados a características de calidad……………………………………………………………………………… 31 6.2.1. Aislamiento del ADN……………………………………………………….. 31 6.2.2. Análisis de los marcadores 316 y 4751 de CAPN1………………………... 32 6.2.3. Análisis del marcador TG5 por PCR-RFLP……………………………… 36 6.2.4. Detección de la variante Q204X del gen MSTN por discriminación alélica………………………………………………………………………………. 37 6.3. Análisis estadísticos…………………………………………………………... 38 6.3.1. Cálculo de frecuencias……………………………………………………… 38 6.3.2. Equilibrio de Hardy-Weinberg……………………………………………. 38 6.3.3. Análisis de asociación………………………………………………………. 38 7. RESULTADOS…………………………………………………………………. 40 7.1. Genotipificación con cuatro marcadores asociados a características de calidad de la carne………………………………………………………………… 40 7.1.2. Detección de los polimorfismos de los marcadores 316 y 4751 de CAPN1 por PCR-ACRS……………………………………………………………………. 40 7.1.2.1 Análisis de frecuencias alélicas y genotípicas de los marcadores del gen CAPN1……………………………………………………………………………… 41 7.2. Optimización e identificación del marcador TG5 por PCR-RFLP………... 41 7.2.1. Frecuencias alélicas y genotípicas de TG5………………………………… 43 7.3. Detección de la Q204X del gen de la Miostatina por discriminación alélica………………………………………………………………………………. 43 7.3.1. Análisis de frecuencias genotípicas y alélicas de Q204X…………………. 44 7.4. Análisis de asociación entre TG5, CAPN1 y Q204X con las características fenotípicas estudiadas……………………………………………………………... 45 8. DISCUSIÓN…………………………………………………………………….. 48 8.1. Análisis de frecuencias……………………………………………………….. 49 8.1.1. Frecuencias genotípicas y alélicas del gen TG5…………………………... 49 8.1.2. Frecuencias en marcadores 316 y 4751 del gen CAPN1………………….. 50 8.1.3. Frecuencias genotípicas y alélicas de Q204X……………………………... 52 8.2. Análisis de asociación entre TG5, CAPN1 y Q204X con las características iii fenotípicas estudiadas……………………………………………………………... 55 8.2.1. Efecto del gen TG5………………………………………………………….. 55 8.2.2. Efecto de los marcadores de CAPN1………………………………………. 56 8.2.3. Asociación de Q204X sobre ACEA………………………………………... 58 9. CONCLUSIONES……………………………………………………………… 60 10. RECOMENDACIONES……………………………………………………… 61 11. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………… 62 12. GLOSARIO……………………………………………………………………. 73 APÉNDICES………………………………………………………………………. 78 iv ABREVIATURAS A Adenina ACRS Creación de sitiosde restricción artificial ADN Ácido Desoxirribonucleico BLUP Mejor predictor lineal insesgado BTA Autosoma de Bos taurus °C Grados Centígrados C Citosina CAPN Calpaína cm Centímetros DE Desviación Estándar DEP Diferencia Esperada de la Progenie dNTPs Desoxirribonucleósidos Trifosfato EDTA Ácido etilendiamino-tetracético g Gravedades G Guanina GDF-8 Factor 8 de diferenciación del crecimiento HaeIII Haemophilus aegyptius III IA Inseminación Artificial IGF-I Factor de Crecimiento tipo Insulina I kDa Kilodaltones Kg Kilogramos MAM Manejo asistido por marcadores MboI Moraxella bovis I MgCl2 Cloruro de Magnesio min Minutos ml Mililitros mM Milimolar MspI Moraxella especies I MSTN Miostatina NaCl Cloruro de Sodio ng Nanogramos NH4Cl Cloruro de amonio NaHCO3 Bicarbonato de sodio nM Nanomolar Nm Nanómetros PA Producto Amplificado pb Pares de bases PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa pulg2 Pulgadas cuadradas PSA Persulfato de Amonio p/v Peso/volumen Q-PCR Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa QTL Loci de rasgos cuantitativos QTN Nucleótidos de rasgos cuantitativos v RFLP Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción rpm Revoluciones por minuto s Segundos SAM Selección asistida por marcadores SAS Software de análisis estadístico SDS Lauril Sulfato de Sodio SNP Polimorfismos de un solo nucleótido T Timina TBE Buffer Tris-Borato-EDTA TEMED Tetrametiletilenediamina TG5 Tiroglobulina 5 TGF-B Factor de crecimiento transformante de la superfamilia Beta U Unidades UV Luz Ultravioleta V Voltios μl Microlitros vi RELACIÓN DE CUADROS Cuadro Página Cuadro 2.1. Efecto de polimorfismos de un solo nucleótido en el gen TG5 sobre características de calidad de la carne bovina………………………….. 15 Cuadro 2.2. Efecto de polimorfismos de un solo nucleótido en el gen CAPN1 sobre características de calidad de la carne bovina…………………………... 16 Cuadro 2.3. Efecto de polimorfismos de un solo nucleótido en el gen MSTN sobre características relacionadas con la calidad de la carne……………….. 19 Cuadro 6.1. Escala de clasificación del grado de rendimiento ó producción de carne bovina…………………………..……………………………………... 28 Cuadro 6.2. Criterios de calificación y relación entre marmoleo y porcentaje de grasa intramuscular…………………………..………………... 28 Cuadro 6.3. Clasificación de la circunferencia escrotal (cm) para sementales bovinos…………………………..…………………………………. 29 Cuadro 6.4. Clasificación según la motilidad espermática individual en semen de bovinos…………………………..…………………………………… 29 Cuadro 6.5. Medias ± desviaciones estándar generales de las características fenotípicas de conformación, producción, ultrasonografía y reproducción de los animales Charolais estudiados…………………………………………. 30 Cuadro 6.6. Secuencias de los iniciadores a utilizar para la detección de los alelos del marcador 316…………………………..……………………………. 33 Cuadro 6.7. Secuencias de los iniciadores a utilizar para la detección de los alelos del marcador 4751…………………………..…………………………... 33 Cuadro 6.8. Condiciones de PCR para el polimorfismo 316 de CAPN1……. 34 Cuadro 6.9. Condiciones de PCR para el polimorfismo 4751 de CAPN1…... 34 Cuadro 6.10. Programa de amplificación TD55 por PCR de los fragmentos de los genes TG5 y CAPN1 (316 Y 4751) …………………………..…………. 35 Cuadro 6.11. Condiciones de la reacción de digestión para el polimorfismo 316 de CAPN1…………………………..………………………………………. 35 Cuadro 6.12. Condiciones de la reacción de digestión para el polimorfismo 4751 de CAPN1…………………………..……………………………………... 35 vii Cuadro 6.13. Secuencias de los iniciadores a utilizar para la detección de los alelos de TG5…………………………..……………………………………. 36 Cuadro 6.14. Condiciones de PCR para el polimorfismo de TG5…………... 36 Cuadro 6.15. Condiciones de la reacción de digestión para el polimorfismo de TG5…………………………..…………………………..…………………... 36 Cuadro 6.16. Secuencias de los iniciadores a utilizar para la detección de los alelos de Q204X…………………………..………………………………… 37 Cuadro 6.17. Secuencias de las sondas a utilizar para la detección de los alelos de Q204X…………………………..…………………………………….. 37 Cuadro 7.1. Frecuencias genotípicas y alélicas de los genes TG5, CAPN1 y Q204X…………………………..………………………………………………... 45 Cuadro A1. Volúmenes de soluciones y de tamaño de muestras utilizadas del Estuche de extracción de ADN genómico Promega Wizard ®…………... 78 Cuadro A2. Preparación de TBE 10 X…………………………..…………….. 78 Cuadro A3. Preparación de EDTA 0.5 M pH 8.0…………………………….. 78 Cuadro A4. Preparación de Agarosa al 1.5 %………………………………... 79 Cuadro A5. Preparación de Acrilamida………………………………………. 79 Cuadro A6. Preparación de PSA al 10 %……………………………………... 79 Cuadro C1. Análisis de características asociadas a las variantes TG5, CAPN1 (316, 4751) y Q204X…………………………..………………………. 81 Cuadro C2. Medias de cuadrados mínimos de las características de AOC, GR, GD, GC, GIM, ACEA y MI asociadas a los genotipos de los genes TG5, CAPN1 (316,4751) y MSTN (Q204X) ………………………………….. 82 viii RELACIÓN DE FIGURAS Figuras Página Figura 2.1. Principales países productores de carne bovina en el mundo, durante el 2008. (FAS/USDA, 2009) …………………………………………… 3 Figura 2.2. Principales estados productores de carne bovina en México (SIAP, 2007) …………………………..…………………………..……………... 5 Figura 2.3. Estructura piramidal de una raza o población bovina destinada a mejoramiento genético…………………………..…………………………….. 7 Figura 2.4. Ubicación genómica de los marcadores 316 y 4751 en el gen CAPN1…………………………..…………………………..……………………. 17 Figura 2.5. Posición de los SNPs de algunas variantes alélicas en el gen de MSTN causantes de la doble musculatura en diferentes razas bovinas cárnicas…………………………..…………………………..………………….... 18 Figura 2.6. Esquematización de la ubicación de un SNP en una secuencia de ADN…………………………..…………………………………………………... 20 Figura 2.7. Proceso de discriminación alélica (adaptado de Livak et al., 1999) …………………………..………………………………………………….. 21 Figura 2.8. Proceso de digestión enzimática por RFLP……………………….. 22 Figura 6.1. Posiciones de medición de las características de ultrasonografía en tiempo real (BIF, 2002) …………………………..………………………….. 28 Figura 6.2. Estrategia de los ACRS para la identificación de SNPs………….. 33 Figura 7.1. Fotografía del gel de agarosa Nusieve al 4.5% con los fragmentos digeridos del marcador 316 con HaeIII………………………………………… 40 Figura 7.2. Representación de la imagen del gel de agarosa Nusieve al 4% de los fragmentos digeridos de 4751 con MspI…………………………………….. 41 Figura 7.3. Fotografía con los fragmentos amplificados de TG5……………... 42 Figura 7.4. Imagen de los fragmentos digeridos de TG5 con la enzima de restricción MboI…………………………..……………………………………… 42 Figura 7.5. Curva de fluorescencia para la identificación de Q204X por discriminación alélica…………………………..………………………………... 44 ix Figura 7.6. Análisis de comparación de medias de cuadrados mínimos de los genotipos de TG5 sobre GR……………………………………………………... 46 Figura 7.7. Análisis de comparación de medias de cuadrados mínimos de los genotipos de Q204X sobre ACEA………………………………………………. 47 x “Análisis de genes asociados a calidad de la carne y sus efectos en características fenotípicas de ganado Charolais”. Resumen La ganadería es una pieza fundamental en el aumento productivo nacional, ya que entre los productos y subproductos derivados de esta actividad se encuentra uno de los alimentos básicos del país, la carne bovina. La calidad de la carne es un atributo importante perseguido por el consumidor y está representada entre otras por sus cualidades organolépticas como la suavidad y el marmoleo. Estas dos características son de naturaleza poligénica y por ende existe gran dificultad para identificar suvariabilidad genética en bovinos. Sin embargo, a la fecha existen genes asociados a estas características de calidad. En el gen tiroglobulina se ha reportado un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) denominado TG5, el cual se ha asociado al marmoleo e involucrado en el porcentaje de grasa intramuscular. Los marcadores 316 y 4751 del gen de CAPN1, se han relacionado con un efecto sobre la variación en la suavidad de la carne en diferentes poblaciones bovinas. Otro de los genes asociados al crecimiento y calidad de la carne es el gen de Miostatina (MSTN), causante de la doble musculatura en algunas razas bovinas. La raza Charolais posee una variante casi exclusiva de este gen (Q204X) que justifica ampliamente su necesidad de caracterización. El objetivo del presente trabajo fue determinar las frecuencias y efectos fenotípicos de variantes alélicas de genes asociados a calidad de carne en toretes de la raza Charolais. El SNP del marcador TG5 se detectó mediante PCR-RFLP, mientras que para la identificación de los polimorfismos de los marcadores 316 y 4751 (CAPN1), se diseñaron oligonucleótidos para crear sitios de restricción artificial y diferenciar de esta forma las variantes favorables y desfavorables (PCR-ACRS). La detección de la variante Q204X, se realizó por medio de discriminación alélica. Para el estudio de asociación fueron consideradas características de conformación, crecimiento, ultrasonografía y reproducción. Las frecuencias de los marcadores TG5 y 4751 mostraron estar en equilibrio genético, a excepción del marcador 316 y Q204X. Los análisis de asociación en TG5, mostró un efecto significativo sobre el GR, relacionado con el contenido de carne magra (P=0.0643). Para los marcadores del CAPN1, sólo se encontró asociación significativa para xi 4751 sobre AOC y GIM, (P=0.0347, P=0.0920; respectivamente). La variante Q204X sólo mostró efecto sobre ACEA (P=0.0358). La utilización de estos marcadores podría utilizarse como una herramienta adicional para la selección de características de producción y reproducción del ganado bovino. Palabras clave: SNP, Charolais, TG5, CAPN1, Q204X, PCR-RFLP. xii “Beef quality associated genetic markers analysis and their effect on some phenotypic traits of Charolais cattle”. Abstract The beef cattle systems are a fundamental piece for the national productive income increasing. The later related to the generation of products and by-products derived of one of the most important industry outcome, the beef. The beef quality is an important attribute for consumer’s satisfaction to diverse sensory properties such as tenderness and marbling. In cattle, these characteristics are polygenic nature and theirs genetic variability identification difficulty. A single nucleotide polymorphism (SNP) in the 5´ leader sequence of the Thyroglobulin gene (TG5) has been associated with marbling and intramuscular fat percentage. Markers 316 and 4751 CAPN1, have related with variation in beef tenderness of different cattle populations. The Myostatin gen (MSTN), related to double muscling has been associated with growth and beef quality too. The Charolais breed possesses an almost exclusive variant of this gene (Q204X) that justifies widely its need of characterization. The objective of this work was to determine the frequency and effect phenotype of allelic variants of genes associated with quality of meat in young bulls Charolais. The SNP of the marker TG5, CAPN1 were detected by means of PCR-RFLP; whereas for the identification of the polymorphisms of the markers 316 and 4751 (CAPN1), were designed primers by sites of artificial restriction, changing one of the sequences to differentiate between the favorable and unfavorable variants (PCR-ACRS).The detection of the variant Q204X was realized by discrimination allelic. For this study of association were considered conformation, growth, ultrasound and reproduction characteristics. The frequencies of TG5 and 4751 markers showed to be in genetic equilibrium, except for 316 marker and Q204X. The association analysis of TG5, shown has a significant association on yield grade (YG) related to the lean beef content (P=0.0643). For the markers of the CAPN1, only one significantly association (P<0.05) was found for 4751 on ribeye area (AOC), and the intramuscular fat (GIM), (P=0.0347, P=0.0920; respectively). The variant Q204X showed an effect on the scrotal circumference (ACEA) (P=0.0358). These markers might be in xiii usefulness additional tool for the selection of production and reproduction characteristics of cattle. Keywords: SNPs, Charolais, TG5, CAPN1, Q204X, PCR-RFLP Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 1 1. INTRODUCCIÓN La ganadería es una de las actividades socioeconómicas más importantes en México porque ocupa 110 millones de hectáreas en más del 50% del territorio nacional, y es una fuente importante de alimento, materias prima, divisas y empleos (Gallardo, 2004). Entre los sectores productivos pecuarios, se encuentra la producción de carne bovina, que genera entre 2.2 millones de toneladas y exporta en promedio 1.5 millones de cabezas de becerros en pie. Mientras, que el consumo de carne oscila cerca de los 2.5 millones de toneladas (FAS/USDA, 2009). Sin embargo, la ganadería no se ha desarrollado de manera adecuada debido a problemas, como la falta de financiamiento, lo cual no permite al sector contar con infraestructura para la aplicación de tecnologías para el mejoramiento productivo de sus animales. Por otro lado, las condiciones agroecológicas en donde se desarrolla el ganado son deficientes, y los problemas derivados de condiciones climatológicas anuales como la sequía, aún condicionan la disponibilidad del alimento para los animales que preponderantemente se encuentran en sistemas extensivos (Canizal y Rivera, 2007). Existen varias opciones que se han planteado para impulsar el desarrollo de la ganadería y así permitir el incremento del rendimiento y la eficiencia en su producción; entre ellas están: fomentar una alimentación adecuada en los animales, promover el comercio de sus subproductos, la medicina preventiva y el mejoramiento genético (Canizal, et al., 2007). Éste último comprende un conjunto de estrategias encaminadas a incrementar el desempeño animal en cuanto a sus características deseables mediante la selección de los mejores animales de la población y así poderlos reproducir de manera intensiva. Recientemente, el uso de la genética molecular como herramienta dentro de los programas de mejoramiento genético permite la identificación de variaciones específicas en el ADN que podrían estar asociadas a características de interés productivo y de calidad, esta estrategia es conocida como selección y manejo asistido por marcadores (Van der Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 2 Werf y Mingón, 2000). Su aplicación depende de los objetivos de selección y se espera un mayor impacto en aquellas características que son difíciles y/o costosas de cuantificar. Entre estas se encuentran las características de calidad de la carne como la suavidad y el marmoleo, las cuales están controladas por varios genes (Dekkers, 2004). Entre los genes asociados a estas características se encuentran la Tiroglobulina (TG) y µ-calpaína (CAPN1) (Casas, 2006; Barendse et al., 2004); en estos genes se han identificado marcadores moleculares que actualmente se encuentran disponibles comercialmente y para los cuales se continúa validando su efecto en diferentes poblaciones de bovino (Van Eenennaam et al, 2007). Otro de los genes que también se ha relacionado con características de calidad de la carne, es el gen de Miostatina (MSTN) quees causante de la doble musculatura en diversas razas bovinas (Bellinge et al., 2005; Casas et al., 2004) y ha mostrado favorecer la producción muscular en los animales portadores de la variante. Hasta el momento en México, no se han realizado estudios encaminados a evaluar el grado de asociación de los marcadores antes descritos a la calidad de carne, por lo que es necesario iniciar este tipo de estudios a fin de validar su aplicación en las poblaciones mexicanas. Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 3 2. ANTECEDENTES 2.1. La ganadería bovina La ganadería bovina destinada a la producción de carne es una actividad de notable importancia socioeconómica en el mundo, ya que es una fuente de alimento que genera incentivos económicos como divisas y empleos. Actualmente, los principales países productores de carne bovina son Estados Unidos (21% de la producción mundial), Brasil, China, y la India (Figura 2.1). México ocupa el séptimo lugar en esta actividad con un 3.8% (FAS/USDA, 2009). En el contexto mundial dos componentes importantes en la comercialización de productos cárnicos son las importaciones y exportaciones, que son indicadores de autosuficiencia. En este sentido, los países con mayor producción son por ende los principales exportadores. En contraste, algunos países no logran cubrir las demandas de consumo de sus poblaciones, lo que induce a la mayor importación de productos y subproductos cárnicos. México por ejemplo, muestra una tendencia de crecimiento en importaciones de carne bovina en un 34.9% anual, ubicándolo en el contexto mundial como uno de los principales países importadores (FAS/USDA, 2009). Figura 2.1. Principales países productores de carne bovina en el mundo, durante el 2008 (FAS/USDA, 2009). La distribución porcentual de los principales productores de carne bovina muestra que Estados Unidos y Brasil participan con la mayor producción a nivel mundial con respecto a México (7º lugar) y al resto del mundo. Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 4 2.2. La ganadería bovina productora de carne en México En México, la ganadería bovina para carne es una de las principales actividades productivas diseminadas en el área rural; ésta comprende el 53.7% de los 200 millones de hectáreas del territorio nacional (Osuna, 2002). Los principales estados productores de carne bovina son Veracruz, con un promedio de 440 mil toneladas al año, es decir 14.2% de la producción nacional; Jalisco, con 11.3% (0.35 millones de toneladas al año); y Chiapas, con 0.19 millones de toneladas ocupando el tercer lugar a nivel nacional con 6.3%; estos estados en participación conjunta con Baja California, Sinaloa y Sonora, representan el 45.4% de la productividad nacional (Figura 2.2). La ganadería bovina productora de carne, se desarrolla en diferentes zonas agroecológicas que determinan sus principales productos y su comercialización. Básicamente, los sistemas de producción intensiva o extensivamente de las principales razas bovinas cárnicas, se dirigen hacia el engorde de ganado, y por otro lado a la venta de animales jóvenes en pié, cuyo destino final en gran proporción es la exportación (FAS/USDA, 2001; Canizal y Rivera, 2007). La exportación de animales en pié, es una actividad que incrementa el rubro económico de la ganadería bovina y que oscila en 1.5 millones de cabezas al año. Desde los 70´s, la exportación ha sido una de las principales actividades de la región norte del país, ya que el ganado producido era utilizado para exportarlo a los EUA y Canadá. Sin embargo, con el tiempo, la exportación se ha reducido de un 60% en los 90´s, hasta un 25% en la actualidad (FAS/USDA, 2009). Por otra parte, el ganado de engorde es destinado al sacrificio para su venta y comercialización de carne en canal y de subproductos a la industria cárnica para contribuir en la balanza comercial del país (DGEAPEAS, 2009). Por otro lado, las importaciones de la ganadería bovina nacional se han movilizado por la introducción de material genético del extranjero como la compra de ganado en pie, Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 5 semen, entre otros, que contribuyen a los procesos de mejora en la productividad y calidad del ganado para engorda (Gallardo y Villamar, 2004). Figura 2.2. Principales estados productores de carne bovina en México (SIAP, 2007). La mayor proporción del territorio nacional dedicada a la producción de carne es por parte de los estados de Veracruz y Jalisco; en menor proporción los estados de Chiapas, Baja California, Sinaloa, Sonora y el resto del país. 2.3. La problemática de la ganadería bovina en México Existen diferentes factores que han influido de manera considerable en el desarrollo de la ganadería bovina en el país y que se han convertido en desafíos a lograr, como la mejora en la producción de las empresas pecuarias públicas y privadas para incrementar el comercio internacional mediante la elaboración de productos pecuarios de calidad (Lastra, 1997). Los principales problemas que evitan el progreso de la actividad ganadera bovina es la falta de financiamiento al campo con el fin de invertir en infraestructura y tecnologías reproductivas para la mejora genética del ganado, la disminución de la rentabilidad de las empresas, la baja demanda en el mercado, la sanidad animal, entre otras, que disminuyen el volumen de producción de la ganadería nacional y por ende decrece el desplazamiento del mercado y otras actividades de inversión (Osuna, 2002). Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 6 Además, las diversas condiciones climatológicas y geográficas en el país, y la incertidumbre en la disponibilidad de precipitaciones pluviales y agua en almacenamiento afectan a la ganadería limitando la vegetación y el forraje, fuentes de alimento principal del ganado (Canizal y Rivera et al., 2007), así como otras áreas dependientes de esta actividad como la agricultura (Osuna, 2002). Por otra parte, existe una latente necesidad por implementar estrategias de mejoramiento de la eficiencia y productividad de los hatos ganaderos, destacando la habilidad de los mejores ejemplares bovinos para mantener la producción bajo las condiciones predominantes en las diferentes regiones agroecológicas del país. Reiteradamente se ha sugerido que, en función de lo anterior, es necesario implementar programas y estrategias de mejoramiento que brinden oportunidades para el desarrollo ganadero, en concordancia con la cadena de comercialización, demanda de productos y competencia internacional (Lastra, 1997). 2.4. Mejoramiento genético Uno de los objetivos de los criadores de ganado bovino, es fomentar el desempeño en sus animales en cuanto a producción, rendimiento y eficiencia para obtener productos alimenticios en cantidad y de alta calidad (Warwick y Legates, 1980), para lo cual es necesario el establecimiento de programas de mejoramiento genético. El mejoramiento genético se puede realizar en tres formas: por selección entre razas, selección inter-razas y cruzamientos. Sin embargo, para determinar la estrategia de mejoramiento a utilizar, se debe tener en cuenta que característica del animal se requiere mantener en la población (Simm, 1998). Para que se pueda controlar la forma de realizar el mejoramiento genético y difundirlo entre las razas, es necesario conocer la estructura genética de una raza, la cual se puede ilustrar de manera piramidal (Figura 2.3). La parte superior de la pirámide Análisis de genes asociados a calidad de la carney su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 7 corresponde al nivel núcleo o élite, integrado por animales de raza pura poseedores de las mejores características fenotípicas y patrón racial, el siguiente escalón es el sector multiplicador que corresponde a los que adquieren sementales o semen bovino proveniente del sector núcleo. Finalmente, el sector comercial adquiere animales machos, o sementales del grupo multiplicador (Ochoa, 1997). Con la Inseminación artificial (IA), se ha podido remover el sector multiplicador de la pirámide, ya que esta tecnología ha permitido que en el sistema comercial se obtenga mayor acceso de animales desde el nivel núcleo (Simm, 1998). Actualmente, se han establecido consensos con la participación de criadores de ganado de registro e instituciones gubernamentales en pro del mejoramiento genético. En ellas se apoya con programas de mejora productiva que se basan en evaluaciones genéticas para generar diferencias esperadas en la progenie (DEP) que sean empleadas como herramienta en la selección (Mendoza, 1997; Martínez, 1999; Lastra et al., 2001b). Figura 2.3. Estructura piramidal de una raza o población bovina destinada a mejoramiento genético. La pirámide esquematiza los tres estratos en los que se divide una población ó raza encaminada al mejoramiento genético. La diseminación genética inicia en la parte superior con elite Núcleo, enseguida el nivel multiplicador, y finalmente el nivel comercial. Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 8 2.5. El mejoramiento genético en el ganado bovino para carne La piedra angular del mejoramiento genético animal es la selección, la cual le permite mantener solo a los animales que posean la mejor combinación de genes, y con esto aumentar las frecuencias de los alelos deseados a sus descendientes (Warwick y Legates, 1980). Bajo los supuestos del modelo infinitesimal, la efectividad de la selección depende además de la intensidad de la selección, la heredabilidad de las características a mejorar y de la magnitud de la varianza genética poblacional, lo que permitirá elegir a los mejores animales para que funcionen como progenitores. Conforme a lo anterior, el cambio que se espera depende de la fracción heredable de la superioridad de esos padres sobre el promedio de la población a la que pertenecen. No obstante, la magnitud de la heredabilidad de un carácter condiciona el mejoramiento y su efectividad (Warwick y Legates, 1980, Dekkers y Hospital, 2002). La selección en el ganado bovino para carne se puede auxiliar de diferentes estrategias: Selección por pedigrí. El pedigrí de un animal es un registro de los animales que están emparentados con él y se utiliza cuando se carece de información sobre el mérito real del animal (ganancia en peso a partir de la alimentación, eficiencia en la alimentación, etc). Esta selección solamente toma en cuenta el criterio de ascendencia y conformación fenotípica de los animales con respecto a sus progenitores y que muchas veces no está correlacionada con la habilidad o desempeño productivo real de los mismos. (Warwick y Legates, 1980). Selección por prueba de progenie. Con esta prueba se puede evaluar el genotipo de un animal con base en el comportamiento de sus descendientes. De la misma manera que el pedigrí, la prueba de progenie también se basa en la heredabilidad; y cuando ésta es baja, se requiere de más individuos para que la prueba sea más precisa, y su mayor limitación es el tiempo gastado para obtener la información. Para que una prueba de progenie sea efectiva, debe obtenerse la mayor población y tener un procedimiento para asignar con precisión la información de la prueba (Warwick y Legates, 1980). Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 9 Selección por prueba de comportamiento. Estas pruebas se basan en mediciones precisas de comportamiento de los animales seleccionados. El comportamiento de un animal es el resultado de la herencia individual y del efecto del ambiente desde el momento de la fecundación hasta que se realiza las mediciones. En los programas de las pruebas de comportamiento se incluyen una proporción de la población tan grande como sea posible para poder seleccionar un grupo de animales y así identificar a los mejores animales para la prueba (Warwick y Legates, 1980). Evaluaciones genéticas. Las evaluaciones genéticas son estimaciones ó cálculos donde los datos reproductivos, morfológicos, genealogías, influencias ambientales, así como la variabilidad genética; se plasman en modelos estadísticos para estimar el valor genético de los animales y así poder seleccionar a los mejores que tengan los genes que se espera que se transmitan a su descendencia (Díaz, 1994). El valor genético en una población comúnmente estimado como Valor Genético Esperado ó Diferencia esperada en la Progenie (DEP), es una herramienta producto de las evaluaciones genéticas, que permite estimar genéticamente la superioridad e inferioridad productiva que un animal transmite en promedio a su descendencia. Para obtener este valor se integra la información de pedigrí y de los sistemas de control y registro de la producción (Mendoza, 1997, Dekkers y Hospital, 2002). Las DEPs se pueden calcular mediante métodos estadísticos basados en los modelos mixtos como el BLUP (mejor predicción lineal insesgado). Este método, permite remover los efectos ambientales del valor genético y obtener una estimación más exacta. No obstante, para obtener el valor de las DEPs, se necesita tener registros productivos de los animales individualmente para inferir y comparar el desempeño productivo futuro de su descendencia (Simm, 1998; AMCGSBR, 2007). Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 10 2.6. El mejoramiento genético asistido por marcadores genéticos La implementación de metodologías moleculares ha permitido establecer un vínculo entre la variación genética y el fenotipo de los bovinos productores de carne. Esta variabilidad genética puede ser debida a cambios ocurridos en la secuencia del ADN del animal que pueden ser generadores de polimorfismos en regiones específicas del genoma entre individuos (polimorfismos de un solo nucleótido); (Goddard, 2009). Las características cuantitativas son aquellas que son influenciadas por varios genes, llamadas en consecuencia características poligénicas y QTLs (loci de rasgos cuantitativos), localizados en regiones cromosomales se ha logrado entender la estructura génica que afecta la variabilidad de características cuantitativas complejas como el crecimiento u otras características de importancia económica (Dekkers y Hospital, 2002; Van Eenennaam, 2006; Casas, 2006; Sellner et al., 2007; Guimarães et al., 2007; Allan y Smith, 2008). En todas las características de producción, la variación fenotípica resulta del efecto de la variación genética y su interacción con el ambiente. Sin embargo, la arquitectura genética de estas características no es transparente y es muy difícil conocer el número y localización de genes que condicionan la variabilidad genética observable para cada característica. A pesar de ello, el conocimiento en la ubicación y el efecto de algunos QTLs, incrementa el entendimiento de la arquitectura genética de las características poligénicas (Dekkers y Hospital, 2002; Guimarães et al., 2007; Allan y Smith, 2008); más aún, la disponibilidad de marcadores de mayor disponibilidad en el genoma (SNPs) y de mayor especificidad al corroborar su asociación como mutaciones causales (QTNs: nucleótidos de rasgos cuantitativos), ha fomentado la generación de estrategiasde mejoramiento genético que los incluyan de manera puntual. Uno de los enfoques propuestos inicialmente para integrar el uso de los marcadores moleculares, comprende la implementación de la información molecular en los programas de evaluación genética y estimación de valores genéticos para fomentar la exactitud de estas predicciones (Fernando, 2003; Dekkers, 2004) bajo los supuestos básicos del modelo infinitesimal y del desequilibrio de ligamiento de los marcadores incluidos en las Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 11 ecuaciones; este enfoque fue llamado Selección asistida por Marcadores (SAM). Sin embargo; inicialmente la poca disponibilidad de QTLs de demostrada asociación con las características de interés y la naturaleza poligénica de las características evaluadas, en conjunto con la heterogeneidad de las poblaciones animales condicionaron su limitación para ser implementados efectivamente (Dekkers, 2004). Recientemente, la disponibilidad de microarreglos de SNPs que permiten la implementación de un gran número de marcadores en la generación de los llamados valores genómicos (Goddard, 2009) ha permitido la visualización de un futuro más prometedor para la SAM. Por otro lado, el conocido Manejo asistido por Marcadores (MAM) funciona para determinar el potencial genético de los animales individualmente, lo que significa que todos los animales deben ser genotipificados, con la finalidad de identificar la predisposición del grupo de animales evaluados y proveerles un manejo favorable que asegure la expresión de su potencial (Allan y Smith, 2008). Actualmente, son conocidos numerosos marcadores genéticos que significativamente han demostrado su efecto favorable sobre diferentes características y en diferentes grupos raciales y genéticos de ganado bovino. Algunos de ellos son, los marcadores en el gen de la Calpaína (Page et al., 2004; Casas et al., 2005; Van Eenennaam et al., 2007a), los del gen de la Tiroglobulina (Barendse et al., 2004; Wood et al., 2006), IGF-I (Davis and Simmen, 1997; Ge et al., 2001) entre otros. Entre los llamados marcadores “validados”, están los marcadores 316 y 4751 del gen de calpaína 1, y los del gen de la Tiroglobulina que se encuentran disponibles comercialmente y que se continúan corroborando su efecto sobre la suavidad y el marmoleo, respectivamente (Van Eenennaam et al., 2007a). Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 12 2.7. Aplicación de los marcadores en la ganadería de México Se han estimado las frecuencias genotípicas y alélicas para algunos de los marcadores validados como Calpaína (316 y 4751) y el de la Tiroglobulina, en diferentes grupos de animales de México. Sin embargo, las implicaciones de su prevalencia han sido discutidas parcialmente (Parra-Bracamonte et al., 2007; Sifuentes et al., 2007; Valerio et al., 2007; Bonilla, 2008; Parra-Bracamonte et al., 2009; De la Rosa-Reyna et al., en prensa), y puesto que no existe evidencia extensiva sobre su efecto significativo en las diferentes poblaciones ganaderas nacionales manejadas en diferentes contextos productivos, no se conoce cuál sería la magnitud del cambio genético promovido por la segregación de las variantes favorables para ciertas características de interés. Actualmente, el principal criterio de la selección en México, está basado en características de crecimiento; que con el conocimiento de la información genómica en mutaciones en genes de interés económico, es fundamental para entender por una parte, las interacciones genéticas que fundamentan la “arquitectura genética” de los animales (Dekkers y Hospital, 2002) y por otra, para coadyuvar el manejo de la selección hacia un criterio más amplio que involucre aspectos de calidad y eficiencia de producción de la carne, que eventualmente el mercado comercial demandará. 2.8. Marcadores moleculares Los marcadores moleculares son etiquetas a lo largo de los cromosomas que pueden ser utilizados para identificar una región ó locus que se encuentra asociado a una característica de interés (Casas, 2002). Los marcadores pueden ser utilizados para diagnosticar características que son afectadas por un solo gen como las de apariencia, los defectos y/o desórdenes genéticos. Sin embargo, también pueden identificar características cuantitativas fáciles de medir como peso al nacimiento, peso al destete, entre otros; características difíciles de registrar Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 13 como la calidad de la carne, características no registradas como la resistencia a enfermedades (Dekkers, 2004). 2.9. Tipos de marcadores Los marcadores moleculares pueden dividirse en tres tipos principales: Los marcadores de tipo I ó marcadores directos. Estos marcadores son genes que codifican para proteínas asociadas a rasgos productivos ó asociados a funciones fisiológicas que puedan causar una variación fenotípica debido a un polimorfismo en su secuencia, como por ejemplo el gen de la Miostatina (O´Brien et al., 1999). Los marcadores de tipo II. También llamados indirectos porque ofrecen información indirecta del efecto del gen. Este tipo de marcadores son utilizados en diversidad genética de razas, evaluaciones de pedigrí, mapeo de genes, así como búsqueda de genes de importancia productiva, entre otras más aplicaciones como forenses y de población. Entre los ejemplos clasificados de este tipo de marcadores se encuentran: los microsatélites (O´Brien et al., 1999; Van der Werf y Kinghorn, 2000). Los marcadores de tipo III ó SNPs. Los SNPs ó polimorfismos de un solo nucleótido son cambios ó mutaciones que ocurren en un solo nucleótido tanto en regiones codificantes, y no codificantes (O´Brien et al., 1999; Dekkers y Hospital, 2002). En el genoma bovino, las proporciones de SNPs encontradas entre la regiones intergénicas, intronicas y exónicas son de 63.74, 34.9 y 1.35%, respectivamente (Science, 2009). Este tipo de marcadores pueden utilizarse en la identificación de vías metabólicas y/o en la expresión de características asociadas a la producción. 2.10. Marcadores asociados a la calidad de la carne El concepto de calidad de un producto alimenticio difiere entre países y abarca todos los aspectos sanitarios, sensoriales, nutricionales, de inocuidad, entre otros criterios según la preferencia del consumidor (Hocquette y Gigli, 2005). Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 14 Existen diversos factores y parámetros como el área del ojo de la chuleta, el espesor de la grasa dorsal, el marmoleo, la suavidad y la jugosidad que influyen sobre la calidad en la carne y están directamente asociados a su comercialización. Sin embargo, estas características son difíciles de medir, por lo que se pueden utilizar técnicas de ultrasonido para su medición y evitar el sacrificio del animal (Brannen, 2008). Se han identificado SNPs en genes de poblaciones bovinas que tienen un efecto sobre rasgos de calidad en la carne (Cuadros 2.1, 2.2 y 2.3), como el gen de la Tiroglobulina, relacionado con el marmoleo y el gen de Calpaína 1, con la suavidad. El gen de Miostatina, causante de la doble musculatura en diversas razas bovinas también, se ha relacionado con parámetros de calidad como la suavidad, el incremento del ojo de la chuleta y porcentaje de grasa intramuscular (Grobet et al. 1997, 1998; Kambadur et al. 1997; Casas et al., 2004; Bellinge et al., 2005). 2.11. Tiroglobulina (TG) La Tiroglobulina (TG) es una glicoproteína hormonal producto de la síntesis de las células foliculares de la tiroides. La TG es almacenadadentro del tejido de la glándula tiroidea y es secretada para activar las formas T3 (Triyodotironina) y T4 (tiroxina) involucradas en la regulación del metabolismo de lípidos y la deposición de grasa (Engelking, 2000; Qian-Fu et al., 2008). El gen de la TG se localiza en el brazo largo del cromosoma 14 del bovino (14q). Uno de los polimorfismos reportados dentro del gen se localiza en la región 5´ no traducible en la posición TG-537, el cual está involucrado en la regulación del gen y se le ha relacionado con el grado de marmoleo en la carne (Barendse et al., 2001, 2004). El marmoleo tiene un efecto de sabor y de lubricación durante la masticación obteniéndose una sensación de jugosidad al gusto del consumidor (Thompson, 2004). Actualmente, varias compañías ofrecen marcadores relacionados a la calidad (Van Eenennaam, et al., 2004), entre los cuales se encuentra la prueba GeneSTAR Quality Grade marker panel, que incluye al marcador TG5, y un SNP anónimo, esta prueba evalúa el marmoleo. Si un animal carece del alelo favorable se califica como estrella 0, si tiene Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 15 una copia obtendrá 1 estrella, y con 2 copias del alelo favorable se clasifica con 2 estrellas (Paschal, S/A; Hansen, 2004). Se han reportado estudios de validación realizados para corroborar el efecto de este marcador sobre el marmoleo; sin embargo, no ha habido resultados significativos sobre esta característica (Van Eenennaam et al., 2007a); (Cuadro 2.1). Lo que resulta que en estos estudios de validación depende de que característica en especifico se esté evaluando en un determinado tamaño de la población, las fases de ligamiento que ocurran entre la característica y el marcador, las interacciones genotipo-ambiente y los efectos epistáticos que pudieran estar ocurriendo (Van Eenennaam et al., 2007a). Cuadro 2.1. Efecto de polimorfismos de un solo nucleótido en el gen TG5 sobre características de calidad de la carne bovina. Genotipo Característica Raza o grupo genético Referencia 2/2 2/3 3/3 - + ++ Marmoleo Angus Barendse et al., 2004 - + ++ Marmoleo Shorthorn Barendse et al., 2004 - + ++ Marmoleo Cruzas Bosindicus y Bos taurus Barendse et al., 2004 - + ++ Marmoleo Cruzas Wagyu y poblaciones Britanicas/Europeas Wood et al., 2006 - + ++ Marmoleo Cruzas Bos taurus ( Charolais x Angus) Van Eenennaam et al., 2007a - - + Marmoleo Cruzas Bos indicus (Brahman) Van Eenennaam et al., 2007a - ++ +++ Marmoleo Wagyu Van Eenennaam et al., 2007a + = Efecto del marcador sobre marmoleo. 2= Alelo normal. 3= Alelo mutado favorable al marmoleo de la carne. 2.12. Calpaína 1 (CAPN1) Se han identificado molecularmente factores biológicos que influyen en la suavidad de la carne como el sistema de las calpaínas (CAPN1), estas son enzimas proteolíticas que degradan proteínas del músculo (actina y miosina) en la maduración postmortem, contribuyendo al ablandamiento de la carne (Koohmaraie, 1988). Las isoformas de la calpaína CAPN1 (µ-CAPN) y CAPN2 (m-CAPN) son proteasas calcio-dependientes (Koohmaraie et al., 1995; Oddy et al., 2001). Estas enzimas están involucradas en la degradación de las proteínas miofibrilares asociado a un efecto de suavidad (Page et al., 2002). Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 16 La CAPN1 y la CAPN2, están compuestas por dos subunidades con pesos moleculares de 28 y 80 kDa. Aunque ambas calpaínas tienen pequeñas subunidades idénticas, son genéticamente diferentes entre las subunidades grandes. A pesar de sus diferencias, una característica importante de ambas calpaínas es su habilidad de auto lisis en presencia de calcio (Hocquette y Gigli, 2005). El gen de la CAPN1 se localiza en el cromosoma 29 (BTA 29) y dentro del gen se han descrito diferentes SNPs que, entre los cuales están el marcador 316 y 4751, ambos marcadores están fuertemente asociados a la suavidad de la carne (Cuadro 2.2). El marcador 316 está ubicado en el exón 9 en la posición 5709, y corresponde a una transversión G/C que produce un cambio de Glicina por Alanina. La presencia de Alanina en la estructura de CAPN1 está asociada con mayor suavidad (Herrmann, 2006, Van Eenennaam et al., 2007a). Cuadro 2.2. Efecto de polimorfismos de un solo nucleótido en el gen CAPN1 sobre características de calidad de la carne bovina. Genotipo/Marcador Característica* Raza o grupo genético Referencia CAPN 1 (316) G/G G/C C/C - + ++ Suavidad Simmental Page et al., 2004 - + ++ Suavidad Angus, Hereford y MARCIII (Ciclo VII) Page et al., 2004 - - N/P Suavidad Brahman Casas et al., 2005 - + ++ Suavidad Brangus, Beefmaster, Bonsmara y Romosinuano, Hereford y Angus x Angus (MARCIII); (Ciclo VIII) White et al., 2005 - + ++ Suavidad Charolais x Angus Van Eenennaam et al., 2007a - + ++ Suavidad Brangus, Red Angus, Brahman, Hereford Van Eenennaam et al., 2007a CAPN 1 (4751) C/C C/T T/T ++ + - Suavidad Angus, Hereford y MARCIII (Ciclo 7) White et al., 2005 ++ + - Brangus, Beefmaster, Bonsmara y Romosinuano, Hereford y Angus x Angus (MARCIII); (Ciclo 8) White et al., 2005 N/P + - Suavidad Brahman White et al., 2005 ++ + - Suavidad Brangus y Angus rojo Van Eenennaam et al., 2007a ++ + - Suavidad Charolais x Angus Van Eenennaam et al., 2007a += Efecto sobre la suavidad de la carne. NP= Genotipo ausente. G= Guanina, C= Citosina, T= Timina. *Suavidad cuantificada por medio de la Fuerza de Corte de Warner Bratzler (FCWB). Por otro lado, el SNP 4751, localizado entre el intrón 17 y el exón 18 de la µ- calpaína se ubica en la posición 6545, y se debe a una transición de C/T (White et al., Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 17 2005). Este SNP también se ha relacionado con la suavidad de la carne en poblaciones bovinas (Casas et al., 2005; Van Eenennaam et al., 2007a) (Figura 2.4). _ Figura 2.4. Ubicación genómica de los marcadores 316 y 4751 en el gen CAPN1. El gen de CAPN1 se encuentra en el cromosoma 29 y tiene una longitud de 30 kb, la cual contiene 22 exones. El marcador 316 se localiza en el exón 9, mientras que el marcador 4751 se ubica en el intrón 17. Ambos marcadores se han relacionado con el incremento de la suavidad en la carne bovina. 2.13. Miostatina (MSTN) Otro de los genes relacionado con la calidad de la carne, es el que codifica para Miostatina (MSTN) ó factor 8 de diferenciación del crecimiento (GDF-8), la cual es una proteína que circula en la sangre y es producida en células del músculo que actúa inhibiendo el desarrollo de las células musculares (regulador negativo) del crecimiento de la masa muscular (McPherron-Lee, 1997). Este gen es el responsable de la doble musculatura en diversas especies entre ellas el bovino. Entre las razas bovinas que se han reportado con el gen que predispone a la doble musculatura se encuentran: Piedmontes, Belga Azul, Limousin, Charolais, Maine Anjou, Asturiana de los valles, entre otras (Switonski et al., 2002; Esmailizadeh et al., 2008). El gen de GDF-8 se encuentra en el cromosoma 2 del bovino y es un factor de crecimiento transformante de la superfamilia Beta (TGF-B); (Bellinge et al., 2004). Se han reportado varias mutaciones en regiones codificantes y no codificantes del gen de MSTN que son las causantes de la hipertrofia muscular (hm) en algunas razas bovinas. Las Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 18 mutaciones reportadas incluyen desde codones de terminación prematura, mutaciones en marcos de lectura y mutaciones puntuales en residuos de aminoácidos altamenteconservados (Grobet et al. 1997, 1998; Kambadur et al. 1997; McPherron y Lee 1997; Cappucio et al. 1998; Marchitelli et al. 2003); y que en conjunto estas mutaciones causan el fenotipo de doble musculatura (Figura 2.5). Figura 2.5. Posición de los SNPs de algunas variantes alélicas en el gen de MSTN causantes de la doble musculatura en diferentes razas bovinas cárnicas. El gen muestra tres regiones exónicas con diferentes mutaciones (color verde: silenciosas; color azul: pérdida del sentido pero no disruptiva; color rojo: disruptiva), encontradas en diferentes razas bovinas como Limousin (F94L), Charolais (Q204X), Piedmontes (C313Y). De las nueve mutaciones reportadas en las regiones codificantes del gen de MSTN, 3 mutaciones se ubican en los exones 1 y 2; mientras que las 6 mutaciones restantes son localizadas en los exones 2 y 3 (Dunner, et al., 2003). En la raza Piedmontes, en la cual se ha estudiado de manera amplia, se ha reportado un SNP en la posición 938 debido a una substitución de una Guanina (G) por una Adenina (A), que causa un cambio ó sustitución de un aminoácido de cisteína (C) por una tirosina (Y) en la región aminoacidica 313 (Grobet et al., 1997). En animales heterocigotos se ha reportado que manifiestan un incremento en peso al nacimiento, al destete y al año, así como mayor suavidad en la carne (Casas et al.1999); (Cuadro 2.3). Otro SNP reportado en razas Limousin es el localizado en la región 433 debido a una sustitución de una Citosina (C) por una Adenina, la cual causa la sustitución aminoácidica (región 94) de una Leucina por una Fenilalanina. La mutación F94L se ha relacionado con Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 19 aumento de músculo y menor deposición de grasa (Esmailizadeh et al., 2008); (Cuadro 2.3). Una mutación en el gen de la Miostatina que se ha relacionado con características fenotípicas de doble musculatura en ganado Charolais, es la Q204X, esta, es debida a una transición C/T en la posición 610 del exón II del gen; la cual causa la formación de un codón de terminación prematura en la posición aminoacídica 204 (Grobet et al., 1997). Esta variante alélica se ha reportado que en animales portadores del alelo, se ha relacionado con el aumento muscular, canales de carne más magra, disminución de tejido conectivo y mayor suavidad en la carne (Bellinge et al., 2005; Casas et al., 2004; Sifuentes et al., 2007 y 2009); (Cuadro 2.3). Cuadro 2.3. Efecto de polimorfismos de un solo nucleótido en el gen MSTN sobre características relacionadas con la calidad de la carne. Genotipo Característica Raza o grupo genético Referencia -/- C313Y/- C313Y/C313Y ‐ ++ + Incremento en peso al nacimiento, destete y al año. Piedmontes Casas et al., 1999 ‐ ++ + Mayor suavidad en la carne. Piedmontes Casas et al., 1999 -/- F94L/- F94L/F94L ‐ + ++ Incremento en ganancia de peso Limousin Esmailizadeh et al., 2008 -/- Q204X/- Q204X/Q204X - + ++ Aumento muscular Charolais Phocas, 2009 - - + Peso al nacimiento y al destete Charolais Phocas, 2009 += Mayor efecto sobre la característica. C313Y, F94L, Q204X= variantes alélicas del gen de miostatina (MSTN). Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 20 2.14. Detección de polimorfismos de un solo nucleótido Los SNPs, son una clase de marcadores moleculares que se caracterizan por cambios que se presentan en un nucleótido que cambian la secuencia de ADN mediante eventos de substitución, inserción y/ó deleción (Figura 2.6). Estos SNPs se encuentran en regiones codificantes y no codificantes en el genoma (DeYoung y Honeycutt, 2005). Figura 2.6. Esquematización de la ubicación de un SNP en una secuencia de ADN. Los SNPs son cambios en una sola base (A, T, C ó G) de una secuencia original de ADN transformándola en una secuencia mutada. Estos cambios pueden o no cambiar la secuencia de aminoácidos que producen. Existen varias técnicas moleculares utilizadas en la identificación de SNPs, entre las cuales se puede mencionar las siguientes: 2.14. 1. Discriminación alélica Es un proceso basado en un ensayo fluorogénico de nucleasa 5´, el cual permite identificar el SNP utilizando dos sondas marcadas con fluoróforos diferentes; por ejemplo una sonda marcada con el fluoroforo VIC que identifica al alelo 1 ó el alelo sin la mutación. La otra sonda marcada con FAM, identifica al alelo 2 ó el alelo mutado. Ambas Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 21 señales de las sondas (VIC y FAM) indican la presencia de los dos alelos, es decir los genotipos heterocigotos para la característica (Livak et al., 1999); (Figura 2.7). Aunque es una técnica relativamente simple, rápida y reproducible, no obstante, es necesario contar con un equipo de PCR en tiempo real (Sifuentes et al., 2006). Figura 2.7. Proceso de discriminación alélica (adaptado de Livak et al., 1999). Este proceso permite identificar SNPs mediante la utilización de sondas alelo-específicas (FAM y VIC) marcadas con fluoróforos diferentes (reportero y quencher ó inhibidor). La actividad exonucleasa 5´ de la Taq-ADN polimerasa degrada las sondas que hibridan con la secuencia complementaria liberando al fluoróforo correspondiente (reportero) emitiendo una luz fluorescente. 2.14. 2. La técnica de PCR-RFLP Los Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción asociada a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR-RFLP), permite generar fragmentos de ADN de una región específica, la cual es reconocida por enzimas de restricción que se unen y digieren el ADN, cortándolo en los sitios donde se encuentra la secuencia específica de nucleótidos reconocidos por las endonucleasas. Las enzimas de restricción utilizadas reconocen 4 (principalmente) ó 6 pb de longitud (Botsein et al, 1980); (Figura 2.8). Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 22 La PCR-RFLP es una herramienta versátil, rápida y de bajo costo en la detección de SNPs de genes asociados a características de producción, así como para evaluar variación genética entre y dentro de poblaciones (DeYoung y Honeycutt, 2005; Sifuentes et al., 2006). Sin embargo, esta técnica tiene una limitante que en ciertas ocasiones no existen sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción, lo que impide la detección del SNP, por lo que es necesario utilizar otros métodos como la creación de sitios de restricción durante la amplificación (ACRS), para detectar el polimorfismo (Eiken et al., 1991; Nafa et al., 1996). Figura 2.8. Proceso de digestión enzimática por RFLP. La digestión de un fragmento amplificado de una secuencia de ADN, se realiza con una enzima de restricción que reconoce la secuencia específica (CCATG▼G), cortándola en diferentes fragmentos. Al existir un cambio nucleotídico en la secuencia (CCATGT), la enzima no reconoce el sitio y no corta el fragmento de ADN. _ Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 23 3. JUSTIFICACIÓN La ganadería productora de carne tiene una gran importancia para el país y se desarrolla en más del 50% del territorio nacional. En México existen cerca de un millón de unidades de producción, que generan el 26% del valor económico pecuario (alrededor de 600 millones de dólares) además, de sostener más de 250 mil empleos remunerados (CNG, 2007). Sin embargo, a pesar de su importancia, esta ganadería productora de carne aún exhibeciertas limitantes que restringen su autosuficiencia. Los grandes volúmenes de importación de productos y subproductos cárnicos, aunado a la dependencia de material genético, apoyan la necesidad de generar estrategias de mejora que involucren criterios genéticos. El mejoramiento genético, como alternativa para obtener animales con mayor rendimiento de producción, ha sido propuesto como una medida que contribuya a incrementar la productividad y la eficiencia en los hatos ganaderos nacionales. Actualmente, la genética molecular ha probado ser auxiliar en el mejoramiento genético, mediante la implementación de técnicas moleculares de diagnóstico que permitan la identificación temprana de individuos portadores de las variantes alélicas favorables para características de importancia económica y productiva. A la fecha los marcadores TG5, 316, 4751 (CAPN1) y Q204X, han sido evaluados en diferentes poblaciones de bovinos, los resultados de su asociación a características de calidad de la carne los hacen candidatos ideales para su evaluación en hatos de México, y determinar su aplicabilidad en las estrategias de mejoramiento en las razas explotadas en el país. Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 24 4. OBJETIVO GENERAL Determinar la frecuencia y efecto fenotípico de variantes alélicas de genes asociados a calidad de carne en bovinos de la raza Charolais. 4.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1) Implementar la técnica PCR-RFLP como alternativa para la identificación de variantes SNPs de marcadores asociados a calidad de la carne. 2) Estimar las frecuencias genotípicas y alélicas de TG5 del gen de Tiroglobulina. 3) Estimar las frecuencias genotípicas y alélicas de los marcadores 316 y 4751 del gen de Calpaína 1 (CAPN1). 4) Estimar las frecuencias genotípicas y alélicas de la variante Q204X en animales de raza Charolais. 5) Estimar el efecto de los genotipos de TG5, 316, 4751 y Q204X, sobre algunas características fenotípicas en animales de la raza Charolais. 5. HIPÓTESIS Las variantes alélicas de los genes asociados a calidad de carne se encuentran en equilibrio genético y tienen un efecto significativo sobre algunas características fenotípicas en ganado Charolais. Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 25 6. MATERIALES Y MÉTODOS El presente estudio se dividió metodológicamente en tres etapas: 1) Origen del material biológico, y pruebas de comportamiento, 2) Optimización y genotipificación de las poblaciones con cuatro marcadores moleculares asociados a características de calidad y, 3) Análisis de asociación. 6.1 Origen del material biológico y pruebas de comportamiento Se realizaron dos muestreos, en los Centros de prueba de comportamiento productivo “El Perú” y “El Patrocipes”, localizados en Hermosillo, Sonora, en donde se recolectaron las muestras de sangre de 80 toretes de raza Charolais candidatos a sementales, de un año de edad en promedio. Los animales fueron sometidos a pruebas de comportamiento en dos períodos (verano de 2008 e invierno de 2009). Los animales se sometieron al mismo sistema de alimentación, con dietas isoprotéicas e isocalóricas, en confinamiento, e incluyeron un período de adaptación de siete días. En estas pruebas se midieron cuatro tipos de características fenotípicas: a) Conformación, b) Crecimiento, c) Ultrasonografía en tiempo real y, d) Reproducción. a) Características fenotípicas de conformación Las características de conformación evaluadas corresponden a: 1) Talla (cm). Tamaño de la masa ósea del animal (BIF, 2002). 2) Altura a la cruz (ACR, cm). Se midieron desde el piso hasta el área de la cruz. 3) Altura de la cadera (AC, cm). Estimado desde el piso hasta el área de la cadera. 4) Perímetro torácico (PT, cm). Es evaluado por detrás de la región dorsal ó lomo del animal (Martínez et al., 1998). Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 26 b) Características de crecimiento 1) Peso al nacimiento (PN, kg). Indicador de evaluación en los animales que infiere sobre el desarrollo en el periodo prenatal (Martínez et al., 1998). Este parámetro es afectado por factores ambientales como el año y época de nacimiento, edad de la vaca, sexo del becerro, manejo, y diferencias entre las razas. 2) Peso al destete ajustado a los 205 días (PADES, kg). El peso al destete es un valor que se asocia a alta producción de leche, mayor tamaño corporal en edad adulta, mayor tasa de crecimiento en la progenie. Al igual que peso al nacimiento, este parámetro está influenciado por factores como el año, época de nacimiento, edad de la vaca, número de parto, edad al destete y la raza, entre otros (Silva, 2009). 3) Ganancia total de peso (GAN, kg). Es la ganancia de peso adquirido en un tiempo determinado. 4) Ganancia diaria de peso (GDP, kg). En la producción de carne, las características que influyen en la rentabilidad son la eficiencia reproductiva y la capacidad de crecimiento de los terneros (Silva, 2009). El crecimiento en un animal está dado por el incremento del peso del animal en diferentes fases de su vida. Por lo que el crecimiento predestete es uno de los caracteres más importantes en la selección de bovinos para carne. Los factores que influyen sobre el peso al destete y la ganancia media diaria son: el sexo, el semental, la época y el año de nacimiento (Segura, 2003). c) Mediciones de ultrasonografía en tiempo real La evaluación de características que determinan la calidad de la canal y que sólo pueden ser evaluadas después del sacrificio del animal se pueden alternativamente cuantificar por medio de ultrasonografía. Esta técnica consiste en la transmisión de ondas sonoras a través de los tejidos por medio de un transductor hacia un centro de compilación de los datos (computadora), mediante la cual se analiza la información y produce una Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 27 imagen de la composición del tejido en medición, que fue observado a través de una pantalla (López y Rubio, 1997). Para la medición de estas características fue empleado un equipo Aloka SSD-500 V, con un transductor de 17 cm Aloka 5040, y el software Centralized Ultrasound Processing Lab (TM) Tower Cup box para la interpretación de las imágenes. Las propiedades evaluadas por ultrasonido en este estudio fueron las siguientes: 1) Área del ojo de la chuleta (Área del músculo Longissimus dorsi, AOC, pulg2) El área del músculo longissimus dorsi se realizó en un corte en el espacio entre la 12ª y 13ª costilla con la sonda en posición perpendicular a la espina dorsal (BIF, 2002); (Figura 6.1). 2) Grado de rendimiento (GR). Este parámetro expresa el grado de rendimiento ó producción de carne magra en la canal y utiliza una escala de números de 1 a 5 (BIF, 2002, FAS/USDA, 2001); (Cuadro 6.1). El grado de rendimiento de la canal es determinado por la cantidad de carne producida de la combinación de cortes de la canal, (principalmente de pierna, lomo, costillar y de la paleta). Entre los factores que determinan el GR están: el espesor de grasa sobre el área del ojo de la chuleta, porcentaje de la grasa del riñón, pélvica y corazón; y el peso de la canal (FAS/USDA, 2001). 3) Grasa dorsal (GD, mm). La grasa dorsal se mide desde la 12ª-13ª costilla, tomando como referencia un punto a las tres cuartas partes de la media final del músculo longissimus dorsi y perpendicular a la superficie de la canal (BIF, 2002); (Figura 6.1). 4) Grasa a la cadera (GC, mm.). La grasa a la cadera se evalúa de entre las costillas 12ª-13ª como se muestra en el número 3 dela Figura 6.1. Este valor puede ser utilizado para estimar la grasa externa en animales con carne más magra (BIF, 2002); 5) Porcentaje de grasa intramuscular (GIM, %). Este parámetro se refiere a la cantidad de grasa intramuscular infiltrada, que se encuentra entre el veteado ó Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 28 marmoleo de la carne (Delfa et al., S/A). En el Cuadro 6.2, se muestra la relación entre el grado de marmoleo y los porcentajes de grasa intramuscular (BIF, 2002); (Figura 6.1). Cuadro 6.1. Escala de clasificación del grado de Rendimiento ó producción de carne bovina. Grado de Rendimiento Grado de cortes de carne ajustados (% CTBRC) 1 >52.3 2 50.0 a 52.3 3 47.7 a 50.0 4 45.4 a 47.7 5 < 45.4 CTBRC = Closely trimmed, boneless retail cuts (por sus siglas en ingles). Figura 6.1. Posiciones de medición de las características de ultrasonografía en tiempo real (BIF, 2002). La figura representa el bovino con las diferentes posiciones en las que se realiza la medición de características de ultrasonografía. En las posiciones longitudinales 1 y 3 se miden las características de GIM y GC, respectivamente. Las características de AOC y GD se miden de manera transversal (posición 2), tomando como referencia la posición 1. Cuadro 6.2. Criterios de calificación y relación entre marmoleo y porcentaje de grasa intramuscular. Grado de Marmoleo Porcentaje de grasa Intramuscular (%) Ligeramente abundante 10.13 Moderado 7.25 Modesto 6.72 Poco 5.04 Ligero 3.83 Trazas (huellas) 2.76 Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 29 d) Características de reproducción 1) Circunferencia escrotal ajustada (ACEA, cm). La circunferencia escrotal es un indicador de fertilidad de los machos (90%) y la alta heredabilidad de este carácter permite que haya una buena respuesta selectiva (Arias et al., 2004). Este parámetro se estimó mediante palpaciones del escroto y su contenido, para después estimarlo según a una clasificación de buena, regular y mala. La clasificación se basa en el tamaño global esperado, tomando en cuenta la edad del toro (Sorensen, 1982), (Cuadro 6.3). Cuadro 6.3. Clasificación de la circunferencia escrotal (cm) para sementales bovinos. Edad (meses) Clasificación 12 a 14 15 a 20 21 a 30 Más de 30 Calificación Buena >35 >37 >39 >40 40 Regular 30-35 31-37 32-39 33-40 24 Mala <30 <31 <32 <33 10 2) Motilidad espermática individual (MI, %). Este parámetro se expresa como el porcentaje de células móviles progresivamente hacia una dirección y es indicador de la capacidad reproductiva (Cuadro 6.4), es evaluado en fresco por medio de un microscopio (Sorensen, 1982). Cuadro 6.4. Clasificación según la motilidad espermática individual en semen de bovinos. Clasificación Motilidad individual Calificación Muy buena Lineal rápido 20 Buena Lineal moderadamente rápido 12 Regular Lineal lento a errático 10 Pobre Muy lento, a menudo errático 3 Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 30 En el Cuadro 6.5 se muestran las medias generales y las desviaciones estándar (DE) de cada una de las características evaluadas de conformación (Talla, ACR, AC, PT), producción (PN, PADES, GAN, GDP), ultrasonografía (AOC, GR, GD, GC, GIM) y reproducción (ACEA, MI) de los animales de raza Charolais estudiados. Cuadro 6.5. Medias ± desviaciones estándar (DE) generales de las características fenotípicas de conformación, producción, ultrasonografía y reproducción de los animales Charolais estudiados. Características Media ± DE De conformación: Talla (cm) ACR (cm) AC (cm) PT (cm) 4.79 ± 1.08 115.51 ± 5.07 125.92 ± 4.64 177.36 ± 8.12 De producción: PN (kg) PADES (kg) GAN (kg) GDP (kg) 37.9 ± 5.93 232.19 ± 32.46 141 ± 46.25 1.3 ± 0.31 De ultrasonografía: AOC (pulg2) GR (%) GD (mm) GC (mm) GIM (%) 10.65 ± 1.94 2.4 ± 0.15 0.34 ± 0.06 0.21 ± 0.04 2.61 ± 0.64 Reproductivas: ACEA (cm) MI (%) 30.92 ± 3.86 70.88 ± 11.48 ACR= Altura a la cruz, AC= altura a la cadera, PT= perímetro torácico, PN= peso al nacimiento, PADES= peso al destete, GAN= ganancia total, GDP= ganancia diaria de peso, AOC= área del ojo de la chuleta, GR= grado de rendimiento, GD= grasa dorsal, GC= grasa a la cadera, GIM= grasa intramuscular, ACEA= circunferencia escrotal, MI= motilidad espermática individual. Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 31 6.2. Genotipificación de los cuatro marcadores asociados a características de calidad 6.2.1 Aislamiento del ADN La extracción del ADN genómico se realizó siguiendo el protocolo estandarizado de un estuche comercial de purificación Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, Inc.); (Apéndice A y cuadro A1). En un tubo eppendorf de 1.5 ml se colocaron 300 µl de sangre completa, añadiendo 900 µl de solución de lisis I (155Nm de Cloruro de amonio (NH4Cl); 0.5 mM de EDTA, pH 7.4; 10 mM; bicarbonato de sodio, NaHCO3). Los hematíes se lisaron mediante movimientos suaves de inversión, incubando las mezclas durante 15 min en hielo y posteriormente se centrifugaron a 2000 rpm por 5 min. El sobrenadante se desechó y se agregó 900 µl de solución de lisis I, se incubó por 5 min en hielo y centrifugar a 2000 rpm por 5 min. Este paso se repitió hasta obtener una pastilla blanca formada por los leucocitos. A continuación, se agregaron 300 µl de solución de lisis nuclear, mezclando por inversión hasta disolver la pastilla, agitando por vórtex por 20 s. Posterior a esto, se añadió un volumen de 100 µl de la solución de precipitación de proteínas y se agitó al vortex por 20 s. Después, se transfirió el sobrenadante a un tubo eppendorf limpio con un volumen de 300 µl de Isopropanol, se mezcló y centrifugó descartando el sobrenadante para adicionar un volumen de 300 µl de etanol al 70% y se centrifugó a 13,000 a 16,000 x g por 20 s. El sobrenadante de etanol fue eliminado por aspiración y se dejo secar la pastilla en el sevag por 25 min. Finalmente, el ADN se rehidrató con un volumen de 50 µl de agua mili Q estéril. Las muestras fueron almacenadas en criocajas a 4°C para utilizarlas como banco de ADN genómico. Posterior a la extracción, se efectuó la cuantificación del ADN genómico para determinar su calidad. La cuantificación se efectuó a partir de 5µl del ADN de cada una de las muestras y mezclando con 5 µl del buffer de carga que contiene el fluoroforo sybr gold 1X (SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain, Eugene, OR, USA;). Enseguida se transfirió todo el volumen de la mezcla a los carriles de un gel de agarosa al 1.5% p/v para su corrimiento y visualización. Se utilizó un marcador de peso molecular (λ ADN, de 50 ng/µl), como referencia para la cuantificación de las muestras por medio del equipo de fotodocumentador de luz UV (Electrophoresis Documentation and Analysis System 120 Análisis de genes asociados a calidad de la carne y su efecto en características fenotípicas de ganado Charolais. 32 Kodak Digital Science), utilizando el programa Gel-Imagen de Kodak Digital Science 3.02. Los valores de concentración se capturaron en una base de datos y fueron ajustados a 50 ng/µl. 6.2.2. Análisis de los marcadores 316 y 4751 de CAPN1 Para la determinación de las frecuencias de los marcadores 316 y 4751 de CAPN1 se diseñaron dos ensayos del tipo PCR-ACRS. El ACRS es un método que permite mutar la secuencia de uno de los oligonucleótidos para crear los sitios de restricción que permitan junto con los cambios del sitio polimórfico identificar las variantes
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