ALBERTO-GUZMAN-ALONSO

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
 
 
 
 
 
 
 
CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN 
BIOTECNOLOGÍA APLICADA-TLAXCALA 
 
 
 
 
 
POSGRADO DE TECNOLOGÍA AVANZADA 
 
 
 
PURIFICACION DE UN HERBICIDA DE Streptomyces sp cepa 1M5a 
 
 
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE 
 
MAESTRIA EN TECNOLOGÍA AVANZADA 
 
 
 
PRESENTA 
 
BIOL. ALBERTO GUZMÁN ALONSO 
 
 
DIRECTOR DE TESIS: SERGIO RÚBEN TREJO ESTRADA 
 
 
TEPETITLA DE LARDIZABAL, TLAXCALA 
 2 
 
 
 
 3 
 
 4 
INDICE DE CONTENIDO 
 
 Contenido Página 
 
GLOSARIO 8 
RESÚMEN 9 
ABSTRACT 10 
1. INTRODUCCIÓN 11 
2. MARCO TEÓRICO 13 
 2.1 Definición de herbicidas 13 
 2.2 Criterios de elección en los herbicidas 13 
 2.3. Modo de acción de los herbicidas 14 
 2.4. Factores que afectan la actividad de los herbicidas 14 
 2.5. Clasificación de los herbicidas 15 
 2.5.1 Aplicación de herbicidas de acuerdo a su selectividad 15 
 2.5.2 Modos de aplicación de herbicidas 15 
 2.5.3 Tipos de aplicación 16 
 2.5.4 Etapa de aplicación 16 
 2.6 Herbicidas químicos 16 
 2.7 Actinomicetos 17 
 2.8 Hábitat de Actinomicetos 18 
 2.9 El género Streptomyces 18 
 2.10 Morfología y fisiología 19 
 2.11 Importancia médica 19 
 2.12 Metabolitos secundarios 19 
 2.13 Fases del crecimiento microbiano 20 
 
3. ANTECEDENTES 21 
3.1Herbicidas de origen microbiano 21 
3.2 Estructuras químicas mayormente reportadas para los metabolitos 
secundarios en Actinomicetos 23 
3.3 Purificación de herbicidas en Streptomyces 24 
 
 5 
4. JUSTIFICACIÓN 26 
 
5. OBJETIVO GENERAL 27 
 
6. OBJETIVOS PARTICULARES 27 
 
7. METODOLOGÍA 28 
 7.1 Cultivo de Streptomyces sp 1M5a 28 
 7.1.1 Preparación de una suspensión de esporas 28 
 7.1.2 Conteo de esporas viables de la suspensión a partir de cultivos 
 en placa 28 
 7.2 Medio de cultivo liquido para fermentación sumergida 28 
 7.3 Producción de herbicidas por fermentación 29 
 7.3.1 Inoculación del medio con la suspensión de esporas 29 
 7.4 Extracción de herbicidas 29 
 7.4.1 Extracción líquido-líquido de metabolitos a partir de 
 cultivos de 1M5a 29 
 7.5Bioensayo de actividad herbicida 30 
 7.6 Purificación de compuestos herbicidas 30 
 7.6.1Cromatografía de capa fina y Bioautografía 30 
 7.6.2 Separación en fase sólida 31 
 7.7 Análisis en HPLC 31 
8. ESQUEMA DE TRABAJO 32 
9. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 33 
9.1Bioensayo de actividad herbicida de 1M5a en placas con 
 medio YCED 33 
9.2 Cultivo sumergido de 1M5a 33 
9.3 Extracción de compuestos herbicidas a partir de 
cultivos líquidos de 1M5a 34 
99..44 CCrroommaattooggrraaffííaa ddee ccaappaa ffiinnaa 3344 
9.5 Separación por fase sólida con Sep-Pak Vac 3 cc (silica), fase normal 38 
9.6 Separación de fase sólida con Sep-Pak Vac 6 cc (silica), 
fase normal 41 
 6 
9.7 Análisis de fracciones herbicidas por HPLC 42 
10. CONCLUSIÓN 44 
11. ANEXO 46 
12. BIBLIOGRAFÍA 47 
 
 
 
 
INDICE TABLAS 
 
Tabla 1. Clasificación de herbicidas por tipo de aplicación (Yufera, 1980) 13 
 
Tabla 2. Factores de corrimiento (Rf) de bandas separadas por 
cromatografía de capa fina (cloroformo-metanol), a partir de 
extractos activos de cultivos de Streptomyces sp 1M5a 35 
 
Tabla 3. Factores de corrimiento (Rf) de bandas separadas 
por cromatografía de capa fina (hexano-Isopropanol), a 
partir de extractos activos de cultivos de Streptomyces sp 1M5a 39 
 
Tabla 4. Sistema de solventes utilizados en la separación del 
compuesto herbicida por la técnica de separación en fase 
sólida. Se utilizaron cartuchos Sep-Pak de silica de fase normal 42 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 7 
INDÍCE DE FIGURAS. 
 
Figura 1. Actividad herbicida de la cepa 1M5a de Streptomyces sp contra 
semillas de jitomate. En 1a se presenta la inhibición de la germinación 
de semillas en comparación con 1b, un control no inoculado 33 
 
FFiigguurraa 22 CCrroommaattooggrraammaass ddee ccaappaa ffiinnaa de extractos activos, obtenidos de 
cultivos de Streptomyces sp 1M5a, con dos sistemas de solventes de 
cloroformo y metanol 33 
 
FFiigguurraa 33.. CCrroommaattooggrraammaass ddee ccaappaa ffiinnaa de extractos activos, obtenidos 
de cultivos de Streptomyces sp 1M5a, con dos sistemas de solventes 
de hexano-isopropanol 36 
 
FFiigguurraa 44 BBiiooaauuttooggrraaffiiaa ppaarraa llooccaalliizzaacciióónn ddee llaa bbaannddaa hheerrbbiicciiddaa eenn 
ccrroommaattooggrraammaass ddee eexxttrraaccttooss aaccttiivvooss ddee ccuullttiivvooss ddee 11MM55aa ddeessaarrrroollllaaddooss 
 ccoonn HHeexxaannoo--IIssoopprrooppaannooll 8800::2200 3399 
 
Figura 5 Bioensayo de fracciones obtenidas por separacion de fase 
 sólida de extractos de 1M5a con actividad herbicida. Sistemas de 
solventes Cloroformo-Metanol con Sep-Pak 3 cc 40 
 
Figura 6. Bioensayo de fracciones obtenidas por separacion de fase 
sólida de extractos de 1M5a con actividad herbicida. Sistemas de 
solventes Hexano-Isopropanol con Sep-Pak 3 cc 42 
 
FFiigguurraa 77.. Bioensayo de fracciones obtenidas por separacion de fase 
sólida de extractos de 1M5a con actividad herbicida. Sistemas de 
solventes Hexano-Isopropanol con Sep-Pak 6 cc 48 
 
Figura 8. Cromatograma de HPLC de fracciones semipurificadas del 
herbicida de la cepa 1M5a. El pico más prominente tiene un tiempo de 
retención de 3.090 min 49 
 8 
GLOSARIO 
 
Actinomicetos. Bacterias filamentosas que habitan principalmente en el suelo. 
 
Composta. Producto final de la degradación de materia orgánica obtenida por el proceso 
de composteo. 
 
Fitoreguladores. Compuestos que regulan positivamente o negativamente el crecimiento 
vegetal. 
 
Herbicidas. Compuestos sintéticos o naturales que matan a las plantas o que inhiben su 
desarrollo. 
 
Metabolitos secundarios. Compuestos producidos por microorganismos, estos 
compuestos no les son indispensables para vivir, pero puede beneficiarlos dándoles ciertas 
ventajas sobre otros microorganismos de su hábitat. 
 
Solventes miscibles en agua. Solventes con alta polaridad que son afines al agua y se 
homogenizan en ella. 
 
Solventes no miscibles en agua. Solventes con poca polaridad que no son afines al agua 
y no se homogenizan en ella. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 9 
RESUMEN 
En un trabajo previo sobre aislamiento de cepas de actinomicetos con actividad 
fitoreguladora, se identificó una cepa de Streptomyces (1M5a), que presentó un efecto 
herbicida contra semillas de jitomate (Spezzia-Mazzocco y col, 2002; Cercado-Jaramillo y 
col, 2004. La cepa 1M5a demostró la producción de compuestos difusibles asociados al 
metabolismo secundario. 
En el presente estudio se definió un medio de cultivo útil para el cultivo de 1M5a y la 
producción de metabolitos herbicidas. Utilizando un medio complejo, SB, se detectó la 
mayor producción de herbicidas en el 5º día de fermentación a nivel de matraz agitado. 
Se mejoraron los métodos de extracción para la recuperación de herbicidas a partir 
del sobrenadante de fermentación. Los extractos de mayor actividad se detectaron con 
solventes no polares, señaladamente hexano y tolueno. 
La mayor contribución del trabajo consiste en el desarrollo de un método de 
extracción más eficiente, que es posible por la utilización de mezclas de hexano-isopropanol 
y cloroformo metanol. 
A partir de liofilizados de sobrenadantes de fermentación, y mediante la separación 
por cromatografía de capa fina, bioautografía, protocolos de extracción en fase sólida, se 
generaron preparaciones purificadas con gran actividad herbicida, particularmente activas 
en la inhibición de germinación de semillas de jitomate (utilizado como sistema modelo de 
dicotiledóneas). Las preparaciones se analizaron por HPLC acoplada a detección por 
arreglo de diodos. Un solo pico activo, a los 3 min, fue eluído en una columna de silica 
normal con hexanoal 100% en la fase móvil. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 10 
ABSTRACT 
In a previous work on isolation of actinomycete strains with plant growth regulation 
activity against tomato seeds (1M5a) was identified, along with a potent herbicide against 
tomato seeds (Spezzia-Mazzocco y col, 2002; Cercado-Jaramillo y col, 2004). It was 
demonstrated that the strain 1M5a produced diffusible compounds associated to secondary 
metabolism in the producing strain. 
In the present study, a culture medium formulation was defined, which allowed for the 
production of herbicide metabolites. By the use of a complex medium (SB), the highest 
herbicide production was detected at day 5 of fermentation in shaken flask. 
In the course of this study, extraction methods were improved, for the recovery of 
herbicidal compounds from the fermentation supernatants. The extracts with the highest 
activity were detected when non-polar solvents were used, specifically hexane and toluene. 
 The most important contribution of the study is the development of an extraction 
method with higher efficiency, made possible by the use of solutions made of either hexane-
isopropanol, or chloroform-methanol. 
Starting from lyophilized preparations of fermentation supernatants, and by the use of 
thin layer chromatography, bioautography and solid phase extraction protocols, highly 
purified preparations with herbicidal activity were particularly active in the inhibition of 
germination of tomato seeds (as a model system for dicotyledonous plants). Purified 
preparations were analyzed by HPLC coupled to diode array detection. A single active peak, 
was eluted at minute 3 in a normal phase column with pure hexane as the mobile phase. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 11 
1. INTRODUCCIÓN 
El desarrollo de malezas junto con los cultivos agrícolas origina diversos problemas, 
como la disminución de la producción, dificultades de laboreo y recolección, y la necesidad 
de mano de obra o de plaguicidas para su eliminación. Los microorganismos y los 
productos microbianos han demostrado un gran potencial como agentes en el control de 
malezas. 
El interés creciente por el establecimiento de métodos alternativos de control de 
malezas ha sido respaldado por la necesidad de contar con herbicidas menos persistentes, 
más selectivos y de mayor seguridad ambiental (Plimmer, 1978). 
La importancia de realizar estudios sobre microorganismos productores de 
metabolitos con actividad herbicida, radica en que la utilización de estos productos 100% 
naturales no tiene repercusión ecológica negativa, cuando se comparan con las que tienen 
productos químicos sintéticos, que en su mayoría afectan el medio ambiente (Plimmer, 
1978). 
Microorganismos tales como los Actinomicetos, han sido ampliamente estudiados 
por su capacidad para producir metabolitos con actividad biológica. Entre ellos, los más 
importantes son antibióticos. El 70 % de los antibióticos conocidos son producidos por 
Estreptomicetos, un grupo bacteriano que pertenece a los Actinomicetos. El resto lo 
producen hongos y otras bacterias. 
Se reconoce una gran cantidad de cepas de Estreptomicetos productores de 
herbicidas. Los herbicidas microbianos en estado puro se han utilizado para aplicaciones en 
cultivos de importancia agrícola. En su hábitat natural, en el suelo, los Estreptomicetos 
descomponen la materia orgánica y producen otros compuestos con actividad biológica 
(Champness, 1994). 
En un estudio anterior, se aisló la cepa Streptomyces sp 1M5a. Dicha cepa fue 
aislada de composta por un grupo de trabajo del Instituto Politécnico Nacional. 1M5a 
demostró una gran capacidad para la producción de metabolitos con actividad herbicida 
que en forma difusible afectaba la germinación de semillas jitomate y de gramíneas 
(Spezzia-Mazzoco y col 2002; Cercado-Jaramillo y col 2004). Sin embargo, el compuesto o 
los compuestos con actividad herbicida no se han purificado, no se conoce su identidad ni 
se ha definido una estructura. 
 12 
El presente estudio, esta orientado al establecimiento de un método reproducible 
para la purificación del principal compuesto herbicida producido por la cepa 1M5a de 
Streptomyces sp. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 13 
2. MARCO TEÓRICO 
Herbicidas 
2.1 Definición de herbicidas 
Son productos principalmente químicos que puestos en contacto con las plantas, 
producen la muerte o alteraciones que evitan su crecimiento normal y producen 
deformaciones y al final la muerte. 
La lucha contra las plantas indeseables, se inició desde que el hombre aprendió a 
distinguir las especies que son útiles de las que no lo son, y vio la necesidad de eliminar a 
estas últimas para favorecer a las de su interés. Para el control de malezas se han utilizado 
durante siglos procedimientos mecánicos manuales (azadón, hoz, arado, etc.), fuego, 
anegamiento, sofocación y rotación de cultivos (Plimmer, 1978). 
Hacia 1940 sólo se usaban algunos herbicidas inorgánicos de contacto, aceites y 
esterilizantes del suelo para limpiar terrenos de hierbas de un modo general. Los productos 
más frecuentemente utilizados eran el clorato sódico, el arseniato sódico y el bórax. El 
hecho más decisivo en el desarrollo industrial de los herbicidas químicos en los últimos 
años, ha sido el descubrimiento del ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) y sus propiedades 
bioquímicamente selectivas (Yufera, 1980). 
Recientemente se han descubierto pesticidas naturales de fuentes microbianas que 
tienen muchas ventajas sobre los pesticidas químicos, especialmente la baja toxicidad al 
medio ambiente. El desarrollo más significativo para productos herbicidas naturales ocurrió 
en 1971 cuando Bayer y colaboradores descubrieron que Streptomyces higroscopicus 
producía un metabolito secundario: fosfinotricilalanil-alanina, compuesto con una actividad 
herbicida post-emergente, bajos rangos de aplicación y baja toxicidad (Stonard y Miller, 
1993) 
Las pérdidas que causan las malezas a los cultivos en México son difíciles de 
estimar, debido a la falta de estadísticas. Sin embargo, se considera que las malezas están 
dentro de los primeros cuatro factores que reducen el rendimiento agrícola. Observándose 
en algunas regiones pérdidas del cultivo hasta del 50%. Existen grandes extensiones de 
cultivos de temporal donde el combate de malezas deja mucho que desear y donde se 
observan pérdidas de más del 50% por competencia de las malezas (Cotero, 1997). Por lo 
que resulta necesaria la búsqueda de métodos más eficientes, selectivos y menos dañinos 
al medio ambiente para su control. 
 
 14 
2.2. Criterios de elección en los herbicidas 
El principal criterio en la selección de herbicidas consiste en identificar la 
composición del producto comercial. El producto fitotóxico que posee características 
herbicidas en una preparación comercial se denomina ingrediente activo. Al ingrediente 
activo se le añaden diferentes compuestos que se denominan coadyuvantes, que 
constituyen los principales agentes humectantes, adherentes, antiespumantes y 
tensoactivos. La mezcla convenientemente preparada, de ingrediente activo y coadyuvante, 
es lo que se denomina producto comercial, y es el tipo de formulación que existe en el 
mercado de agroquímicos. Los productos comerciales típicamente se comercializan en 
forma concentrada para que en el momento de su aplicación se diluyan en agua, con el 
objeto de ser convenientemente distribuidos sobre la superficie a tratar (Massante, 1997). 
 
 2.3. Modo de acción de los herbicidas 
Los herbicidas pueden actuar por varias vías en las plantas objetivo. Una vía de 
actuación es radicular, y la otra es típicamente foliar o de tejido aéreo. Los herbicidas que 
se absorben por vía foliar deben, para ser efectivos, atravesar la cutícula o entrar por los 
estomas. Aquellos productosque penetran por las raíces, lo hacen disueltos conjuntamente 
con sustancias nutritivas del suelo. Una vez que ha penetrado en el interior de la planta, 
puede ejercer su acción alrededor de su zona de penetración o moverse sistémicamente, a 
lo largo de la planta si su mecanismo de acción es por translocación radicular. En este caso 
el herbicida produce su acción tóxica en donde se almacena, a lo largo del trayecto por la 
planta (Yufera, 1980). 
 
2.4. Factores que afectan la actividad de los herbicidas 
La efectividad de las formulaciones de herbicidas puede variar de acuerdo a un gran 
número de factores. Factores importantes que afectan la actividad herbicida son: su 
facilidad de absorción (solubilidad del herbicida); la naturaleza del suelo y su composición; 
la estructura química del herbicida: la acidez del suelo; la humedad del suelo; la 
volatilización de los productos activos; la velocidad de degradación de los productos activos; 
la disponibilidad de herbicidas en el suelo; los efectos de temperatura radiación solar 
precipitación, vientos y otros. 
La demanda actual de productos agrícolas, en gran abundancia, en gran diversidad, 
de alta calidad y de precio razonable, impide en la práctica lo que se ha denominado 
 15 
agricultura sostenible. Dicho término hace referencia a las labores agrícolas encaminadas a 
la obtención de manera rentable de productos agroalimentarios, sin agotar las reservas 
naturales, y la generación de un impacto adverso sobre el medio ambiente. La 
modernización de la agricultura y el espectacular aumento de las producciones agrícolas 
han ido inevitablemente acompañados de un incremento de la mecanización, del consumo 
de agua, y de la utilización masiva, de vías indiscriminada, de plaguicidas y fertilizantes, 
con el consiguiente riesgo del equilibrio del ecosistema, incluida la salud humana (Yufera y 
Alambra, 1987). 
 
2.5. Clasificación de los herbicidas 
 Para fines prácticos, los herbicidas se clasifican por las condiciones de aplicación. 
En la Tabla 1 se presenta una clasificación general de los herbicidas (Yufera, 1981). 
 
Tabla 1. Clasificación de herbicidas por tipo de aplicación 
(Yufera, 1980). 
I. Selectividad -Tratamientos totales 
 - Tratamientos selectivos 
II. Por la superficie tratada - Aplicaciones totales y en banda 
 - Aplicaciones dirigidas 
III. Modos de aplicación - Por vía foliar 
 - De contacto 
 -Sistémicos 
 -A través del suelo o residuales 
IV. Época de la aplicación - Presiembra 
 - Preemergencia 
 - Postemergencia 
 
2.5.1). Aplicación de herbicidas de acuerdo a su selectividad 
 Existen diferentes tipos de herbicida de acuerdo a su selectividad. Los herbicidas de 
selectividad total (sin selectividad), son aquellos que destruyen toda la vegetación sobre la 
que se aplican. En algunos casos dichos herbicidas pueden ser selectivos si se aplican en 
dosis menores. 
 16 
 Otros herbicidas claramente selectivos, destruyen malezas presentes en los cultivos 
sin afectar a las plantas cultivadas (Yufera, 1980). 
 
2.5.2) Modos de aplicación de herbicidas. 
 Diferentes tipos de herbicidas se utilizan para aplicaciones que varían dependiendo 
de la superficie de suelo cubierta. 
Aplicaciones totales de herbicida. En este modo, el herbicida se aplica 
uniformemente sobre la superficie a tratar. Cuando el tratamiento es demasiado caro para 
realizar aplicaciones totales y las plantas cultivadas se disponen en líneas suficientemente 
distanciadas, el herbicida puede aplicarse solo sobre las bandas en las cuales solo se 
siembra el cultivo. 
Aplicaciones dirigidas. En otras ocasiones, cuando las plantas cultivadas tienen un 
porte suficientemente elevado y están dispuestas en líneas espaciadas, es posible aplicar 
polvos a malezas o al suelo de modo que no alcance la acción herbicida a las plantas de 
cultivo de interés (Yufera, 1980). 
 
2.5.3). Tipos de aplicación. 
 Existen dos tipos fundamentales de aplicación de herbicidas, la vía foliar y el 
tratamiento en suelo. 
Vía foliar. Los herbicidas que se absorben por vía foliar deben atravesar la cutícula 
o entrar por los estomas. Pueden ser, según su modo de acción herbicidas de contacto, o 
herbicidas de translocación o sistémicos. Los primeros afectan solamente a las partes de 
la planta con las cuales entran en contacto; los segundos ejercen su acción en lugares 
críticos de la planta, más o menos distantes de la zona de aplicación. 
Tratamientos en suelo. Los herbicidas pueden actuar por contacto con las raíces y 
por translocación a tejidos vegetales una vez que se absorben por el sistema radicular. 
Dado que el producto permanece en el suelo durante mucho tiempo, el herbicida tiene un 
efecto residual sobre las malezas que germinan en dicho periodo (Yufera, 1980). 
 
2.5.4) Etapa de aplicación. 
 Los herbicida pueden aplicarse en diferentes etapas del ciclo agrícola antes o 
durante el ciclo de producción. 
 17 
 Presiembra o preplantación. Son herbicidas que se aplican después de la 
preparación del suelo, pero antes de la siembra o plantación. Los herbicidas utilizados 
pueden ser de contacto o sistémicos. 
Preemergencia. Son los productos que se aplican después de la siembra de la planta 
cultivada, pero antes de la germinación. 
 Postemergencia. Son los herbicidas que se aplican después de la germinación del 
cultivo. Típicamente son compuestos selectivos que actúan de forma específica contra el 
desarrollo de malezas, y que dependen del desarrollo relativo de las malezas y del cultivo 
de interés (Yufera, 1980). 
 
2.6. Herbicidas químicos 
En el pasado los herbicidas eran compuestos a base de zinc, cobre, arsénico, 
mercurio y otros metales. El ácido sulfúrico, el arsenito de sodio, el clorato de sodio, el 
pentaborato de sodio, el metaborato de sodio y el tiocianato de sodio han sido utilizados 
como herbicidas. Estos compuestos son muy tóxicos y dejan residuos metálicos en el 
ambiente, por fortuna su uso ya no es tan común, aunque cabe la posibilidad de seguirlos 
usando en caso de que se produzca una resistencia a los herbicidas orgánicos (Yufera, 
1980). 
 
Otra forma de clasificación frecuente de los herbicidas se basa en su estructura química. 
Los herbicidas, químicamente se pueden clasificar como: (Yufera, 1980). 
 
 
- Fenoxiácidos y derivados 
- Carbamatos 
- Ácidos alifáticos clorados (o sus sales) 
- Ácidos aromáticos halogenados 
- Ureas sustituidas 
- Cloroacetamidas sustituidas 
- Anilidas sustituidas 
- Triazinas herbicidas 
- Diazinas 
- Otros compuestos 
 18 
2.7. Actinomicetos 
Los microorganismos de mayor importancia en la industria farmacéutica y agrícola 
pertenecen al grupo actinomicetos. La importancia de dichos organismos radica en la 
capacidad que tienen para sintetizar metabolitos secundarios con actividad antifungica, 
antiparasitaria, antibiótica, antitumoral y herbicida. En el sector farmacéutico y agroquímico 
existe un gran desarrollo de nuevos productos a partir de este grupo microbiano. Mucho de 
ellos alcanzan aplicación comercial. (Redeubach, 1996) 
Los actinomicetos y microorganismos relacionados probablemente representan el 
grupo de bacterias más grande y diverso. Este grupo esta conformado por microorganismos 
Gram positivos, unicelulares, en forma de bacilos y microorganismos filamentosos. Los 
actinomicetos comprenden al grupo Corineforme y al orden de los Actinomicetales 
(Lechevalier y Lechevalier, 1981). 
 El orden de los Actinomicetales comprende 63 géneros. La mayoría de ellos 
desarrollan un micelio filamentoso. Esta última estructura puede permanecer unida a la 
superficie del sustrato, al cual se le denomina “micelio vegetativo” o bien desarrollarse hacia 
la parte externa en cuyo caso se denomina “micelio aéreo”. Los filamentos individuales o 
hifas del micelio sesubdividen en unidades producto de un crecimiento de la pared celular 
hacia el interior de la hifa en intervalos regulares a lo largo de la estructura. A este proceso 
se le denomina septación y cada una de las septas resultantes tiene una molécula de DNA. 
Una característica particular de los actinomicetales es que la reproducción lleva a la 
formación de esporas que son producidas en hifas especializadas, muchas de las cuales se 
desarrollan sobre el filamento aéreo. De manera general, estas estructuras carecen de 
movilidad aunque algunos géneros producen esporas flageladas (Hirsh, 1985). 
La mayoría de los microorganismos agrupados dentro de los actinomicetales son 
aerobios (actinomicetos oxidativos), aunque algunos de ellos son anaerobios facultativos u 
obligados (actinomicetos fermentativos). (Lechevalier y Lechevalier, 1981) 
 
2.8. Hábitat de Actinomicetos 
Los actinomicetales se encuentran distribuidos en diferentes hábitats, sin embargo 
su reservorio natural es el suelo, en donde su función ecológica principal es la 
descomposición de la materia orgánica. Los actinomicetales comprenden aproximadamente 
el 20-60 % de la población microbiana del suelo. El olor característico a tierra húmeda se 
debe a su actividad metabólica y a la producción de pigmentos, terpenoides (geosminas) y 
 19 
enzimas extracelulares que son capaces de degradar materia orgánica de origen vegetal y 
animal. Algunas otras especies son patógenas de humanos, animales o plantas o son 
fijadores de nitrógeno. (Kieser, 2000) 
Además de la función ecológica de los actinomicetos, estos microorganismos son de 
suma importancia debido a que han demostrado ser la fuente más importante de 
metabolitos secundarios bioactivos de valor industrial y comercial (Madigan y col., 1999). 
 
2.9. El género Streptomyces. 
Los estreptomicetos esta representados por el género Streptomyces, que agrupa un 
gran número de especies y variedades. Los estreptomicetos son los actinomicetos más 
abundantes en la naturaleza, con más de 140 especies. Los filamentos de Streptomyces 
suelen tener un diámetro de 0.5 – 1.0 m, son de longitud indefinida y a menudo carecen de 
paredes celulares transversales en la fase vegetativa. El crecimiento se produce en los 
extremos del filamento y suele ir acompañado de ramificación, por lo que la fase vegetativa 
consiste en una matriz entretejida apretada y compleja, que forma una colonia compacta y 
enroscada. La colonia llega a formar unos filamentos aéreos característico (Madigan y col, 
1999; Locci, 1981). 
 
2.10. Morfología y fisiología 
 La identificación de una especie de Streptomyces emplea criterios morfológicos. Las 
cadenas de esporas pueden ser rectas o enruladas o espiraladas. Otras características 
importantes incluyen: La superficie de la espora (lisa, rugosa, espinosa), la fragmentación o 
esporulación de los filamentos profundos y los pigmentos asociados con las esporas 
(azules, grises, verdes, rojos, violetas, blancos o amarillos), los filamentos profundos o los 
filamentos difusibles. (Jawetz y col., 1987) 
 
2.11. Importancia médica 
La mayor importancia médica de los estreptomicetos es la producción de 
antibióticos. En conjunto, los estreptomicetos son responsables de un 75 % de los 
antibióticos conocidos, los restantes derivan de hongos y de otras bacterias (Joklik y 
col.,1996). 
 
 20 
2.12. Metabolitos secundarios 
Es difícil definir con precisión el concepto de metabolito secundario. Sin embargo 
pueden mencionarse algunas características inherentes a sustancias referidas como tales. 
Metabolismo secundario es un tipo de metabolismo de biosíntesis desarrollado por 
bacterias, algas, corales, esponjas, plantas y animales inferiores, muy poco frecuente 
producido por animales superiores, el metabolismo secundario es más común en 
organismos que carecen de un sistema inmune. Muchos metabolitos secundarios tienen 
actividad fisiológica. Por ejemplo vancomicina es utilizada clínicamente (Barna y William, 
1984), la penicilina (Mandell y Sande, 1984) y grupo de antibióticos que inhiben síntesis de 
la pared celular de bacterias Gram+ son metabolitos secundarios. Otros antibióticos como 
mytomycin C, actinomycin D, calichemycin, entre otros inhiben la trascripción del DNA en 
la replicación (William y col, 1989; Maplestone, 1992). 
Los metabolitos secundarios son moléculas sintetizadas por determinados 
microorganismos, típicamente en una fase tardía de su ciclo de crecimiento in vitro. 
Los metabolitos secundarios no son indispensables para el microorganismo que los 
produce. En estado natural, sus funciones se han asignado a la supervivencia de la 
especie, pero cuando los microorganismos que los producen se desarrollan en cultivo puro 
los metabolitos secundarios no desempeñan esa misión. 
Generalmente se producen como mezclas de productos relacionados químicamente 
entre sí. Por ejemplo, una única cepa correspondiente a una especie del genero 
Streptomyces, puede producir hasta 32 antraciclinas diferentes. Cada uno de estos 
productos es producido por un grupo muy reducido de organismos. La producción puede 
perderse fácilmente por mutación espontánea, por lo que son muy importantes las técnicas 
de conservación de estos microorganismos (Madigan y col.,1999). 
 
2.13. Fases del crecimiento microbiano. 
Para fines de estudio las fases de crecimiento se dividen en trofofase, una fase de 
crecimiento logarítmico, e idiofase, la fase estacionaria. En la trofofase no se producen 
normalmente los metabolitos secundarios. pero en la idiofase si. Aunque es una 
simplificación pensar sólo en dos fases, esta simplificación permite comprender de mejor 
forma la biosíntesis de metabolitos secundarios en fermentaciones industriales. Si se 
requiere de la producción de un metabolitos secundarios, deben garantizarse las 
 21 
condiciones apropiadas para un buen crecimiento, y una excelente producción del 
metabolito secundario (Karp,1988) . 
Los factores que ponen en marcha la producción de metabolitos secundarios al final 
de la trofofase no se conocen del todo; Se sabe que este mecanismo se dispara 
normalmente cuando algún nutriente del medio se ha agotado. En algunas ocasiones el 
nutriente responsable es una fuente de carbono, en otras el nitrógeno o el fósforo. La 
explicación puede ser que al faltar nutrientes se alteren los metabolitos primarios y se 
originen inductores de enzimas encargados de la síntesis de los metabolitos secundarios. 
Otra explicación es que la falta de una fuente de carbono cesa un tipo de represión por 
catabólico lo que permite la síntesis de enzimas útiles en la biosíntesis de metabolitos 
secundarios (Madigan y col., 1999). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 22 
3. ANTECEDENTES 
 
3.1. Herbicidas de origen microbiano 
Muchos microorganismos y productos microbianos han demostrado un gran 
potencial como agentes de control de malezas. El creciente interés por métodos alternativos 
de control de malezas ha sido respaldado por la necesidad de contar con herbicidas menos 
recalcitrantes, y de mayor selectividad. 
El estudio de fermentaciones microbianas orientado a la búsqueda de nuevos 
antibióticos con aplicación farmacéutica y agroquímica ha sido de gran interés (Stonard y 
Miller, 1993). 
Dentro de los herbicidas microbianos más potentes y de mayor utilización es 
Bialaphos, un compuesto producido por Streptomyces viridochromogenes. 
El bialaphos es el primer compuesto producido por vía fermentativa con fines 
comerciales. En Japón es comercializado bajo la marca de “Herbiace”. Es un herbicida de 
amplio espectro. Inhibe a la glutamin-sintetasa, enzima que interviene en la fotosíntesis 
(Hoagland, 1990). 
Estudios realizados con Streptomyces que producen metabolitos con actividad 
herbicida están ejemplificados en el trabajo realizado por Isaac y col. en 1990. En dicho 
estudio se reportael aislamiento de alfa-metilen-beta-alanina, un metabolito microbiano con 
actividad herbicida producido por Streptomyces sp A 12701, aun cuando dicho compuesto 
había sido reportado anteriormente en esponjas marinas: Fasciospongia cavernosa y 
Spongia cf. zimocca (Isaac y col, 1991). La actividad herbicida del caldo resultante fue 
probada con el método de difusión en agar, usando Arabidopsis thaliana como organismo 
de prueba (Isaac y col, 1990). 
Una cantidad considerable de los descubrimientos recientes sobre Streptomyces 
productores de metabolitos secundarios con actividad herbicida se ha llevado a cabo en 
países orientales, específicamente en Japón. Tal es el caso de Rotihibin A, compuesto 
aislado de Streptomyces sp. Cepa 3CO2. Este metabolito inhibe el crecimiento de los 
germinados de lechuga en dosis que van de 1 a 2 ppm, pero no es letal si no hasta 150 
ppm (Fukughi y col., 1991). 
Otros compuestos con actividad herbicida Kaimonolide A y Kaimonolide B, son 
metabolitos producidos por Streptomyces cepa No. 4155. Dicho compuesto fue aislado de 
una muestra de suelo de Kagoshima, Japón. Los compuestos referidos inhiben la 
 23 
elongación de raíces hasta en 50 % a concentraciones de 10 ppm, y causan necrosis a 
concentraciones de 100 ppm (Hirota y col, 1990). 
Otro compuesto la hidantocidina tiene potente actividad herbicida no selectiva, lo 
que incluye plantas anuales y perennes sean monocotiledóneas o dicotiledóneas. La 
hidantocidina actúa como herbicida de contacto, es principalmente permeable en las raíces. 
El compuesto fue descubierto por Nakajima y col. en 1991, en un cultivo de Streptomyces 
hygroscopicus SANK 63584, la potencia de hidantocidina parcialmente purificada fue 
probada en cultivos agrícolas y en particularmente en un ensayo de germinación con 
semillas de col china. (Nakajima y col, 1991). 
Durante el desarrollo de la fermentación de caldos de cultivo para encontrar 
actividad herbicida, reportada por Miller y col (1991), se descubrió un poliquetido llamado 
herboxidieno, producido a partir de un actinomiceto identificado como Streptomyces 
chromofuscus A7847 que posee actividad contra varias especies de malezas, que es 
comparable con la de herbicidas comerciales. La actividad herbicida de herboxidieno fue 
probada en niveles comerciales con plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas. El 
herbicida fue particular utilizado en malezas propias de cultivos de trigo (Miller y col, 1991). 
En el desarrollo de sustancias herbicidas a partir de antimetabolitos producidos por 
microorganismos Yoshida y col. en 1994 aislaron un metabolito de Streptomyces sp. OH-
5093 que inhibe el crecimiento de rábano y sorgo. El compuesto 4- clorotreonina fue 
producido por Streptomyces sp. OH-5093 en fermentación sumergida (Yoshida y col, 1994). 
En el mismo estudio, fue aislada la 4-clorotreonina, un metabolito producido por 
Streptomyces sp. OH-5093 que inhibe el crecimiento de plantas de rábano y sorgo, y cuya 
actividad herbicida se compara con la de Bialaphos. Asimismo, la 4-clorotreonina es activa 
contra levaduras, y en particular contra las pertenecientes al género Cándida. Este 
compuesto se conocía como constituyente de las syringostatinas y la siringomicina. Es un 
intermediario en la producción de antibióticos beta-lactámicos (Yoshida y col, 1994). 
En 1999 Maier y colaboradores demostraron la presencia de compuestos con 
actividad herbicida en cultivos de la cepas de Streptomyces viridochromogenes tü 6105. El 
ácido (2E, 4Z) decadienoico y ácido (2E, 4Z, 7Z) decatrienoico son los metabolitos que 
muestran la actividad herbicida. Dicha actividad fue detectada y cuantificada utilizando 
como indicadores plántulas de las especies de Lemna minor y Lepidium sativum. La 
actividad herbicida de los componentes aislados fue comparada con ácidos grasos 
similares y con otros compuestos derivados. (Maier y col, 1999). 
 24 
Spezzia-Mazzoco y colaboradores, probaron dos medios de cultivo líquido (SB y 
PDA), utilizados en la fermentación sumergida de Streptomyces sp cepa 1M5a en dichos 
medio fue posible la producción de compuestos herbicidas no identificados, con actividad de 
inhibición de germinación en semilla de jitomate. Los compuestos fueron extraíbles de un 
liofilizado de cultivos de la cepa mediante el uso de diferentes solventes orgánicos. 
(Spezzia-Mazzoco y col, 2002) 
 
3.2. Estructuras químicas mayormente reportadas para los metabolitos secundarios 
en Actinomicetos 
Las estructuras químicas mayormente reportadas para los metabolitos secundarios 
con actividad herbicida, producidos por actinomicetos son las de los nucleósidos. Son 
ejemplos de estos la hidantocidina o 2-alfa-hidantocidina (Cseke y col, 1996), la 
coaristeromicina y la aristeromicina, dos compuestos que son estructuralmente muy 
similares, y la 5’-deoxitoyocamicina y la coformicina (Isaac y col, 1991). Todos estos 
compuestos fueron extraíbles para su purificación por el uso de metanol, excepción hecha 
de la 5’-deoxitoyocamicina que se extrajo con acetato de etilo. 
 Además de los nucleósidos reportados en la literatura técnica, otros compuestos 
naturales aislados como metabolitos secundarios de cepas de actinomicetos han sido 
reportados como herbicidas. Ejemplos de dichos compuestos: el ácido carboxílico-4–
Isoxazol que es extraíble con acetona (Kobinata y col, 1990), la pironetina (Kobajashi y col, 
1995), el Rothibin A (Fukuchi y col, 1991), la 4-clorotreonina (Yoshida y col, 1994), el alfa-
metilen-beta-alanina (Isaac y col, 1991), el herboxidieno (Maier y col, 1999) y el (2E,4Z)- 
ácido decadienoico y (2E,4Z, 7Z)- ácido decatrienoico, todos extraídos con metanol. (Miller 
y col, 1992). 
Otro ejemplo de microorganismos que se han utilizado como fuentes de producción 
de antibióticos con actividad fitorreguladora es el desarrollado por Igarashi y col, 1997, los 
autores describen a Resormycina como un nuevo antibiótico tripéptidico, producido por 
Streptomyces platensis MJ953-SF5. El compuesto referido mostró una gran actividad 
herbicida contra malezas, así como cierta actividad fungicida contra hongos patógenos 
seleccionados (Igarashi y col, 997). 
En el desarrollo de metabolitos secundarios microbianos para la regulación del 
crecimiento de plantas, Kobayashi y colaboradores, (1993), descubrieron en Japón un 
nuevo compuesto, obtenido a partir de cultivos de Streptomyces sp. NK 10958. El 
 25 
compuesto denominado Pironetina, es un nuevo regulador de crecimiento en plantas 
(Kobayashi y col, 1995). 
 
3.3. Purificación de herbicidas en Streptomyces 
Fukuchi y colaboradores (1992) describieron el descubrimiento de la Rotibina, un 
fitoregulador producido por una cepa de Streptomyces sp. Los autores encontraron que la 
cepa 3CO2 inhibe el crecimiento de plántulas de lechuga. La estructura del componente 
activo fue determinada por RMN (resonancia magnética nuclear), datos de espectrometría 
de masas, y análisis de aminoácidos. El compuesto denominado Rotibina fue producido por 
la cepa 3CO2 en un cultivo en medio Bennet por 6 días a 26.5° C. El medio de fermentación 
se filtró y posteriormente se hizo pasar por una columna de adsorbió en una columna de 
XAD-7. La columna se lavó y se agregó metanol al 50 %. En la fracción activa el metanol 
se evaporó y el residuo se ajustó a pH 3 con ácido acético. La muestra se pasó por una 
nueva columna de SP-Sephadex, y se eluyó con un buffer de acetato de amonio 0.05 M. 
Las fracciones activas se liofilizaron y se aplicaron a una columna de HPLC de fase-
reversa. Por este último paso se obtuvo la Rotibina A como compuesto puro (Fukuchi y col, 
1991). 
Hidantocidina fue purificada a partir de un cultivo de 300 litros, de la cepa 
productora. El cultivo fue filtrado con zeolita 545 y lavado con agua. Posteriormente, 30 
litros de la fracción de lavado, fueron pasados en una columna Diaion HP-20. Las 
fracciones eluidasse recuperan y se pasan a su vez por una columna carbón activado. La 
columna carbón activado se lava con agua y el principio activo se eluye con una solución de 
30 % de agua-metanol. La fracción activa evaporada a vacío y un volumen de la fracción 
activa se pasa después por una columna Diaion CHP-20, que se lava con agua 
desionizada. La fracción activa se concentró en vacio, se liofilizó, se resuspendió en 
acetonitrilo. Después de varios pasos de cromatografía con intercambio iónico la fracción 
activa se liofilizó y se obtuvieron 480 mg. de hydantocidina (Nakiyama, 1991). 
En otro estudio Isaac y colaboradores, (1991), purificó nucleósidos a partir de un 
pellet celular derivado de la fermentación de 500 ml de Thermoactinomyces sp A6019. 
Dichas células fueron secadas y trituradas con metanol. El material bioactivo soluble en 
metanol fue purificado por cromatografía de fase reversa C18, con un gradiente de agua-
metanol, a partir del cual se obtuvo 1 mg. de material bioactivo. Análisis de espectros de 
 26 
absorción en UV, ¹H NMR y HPLC-MS mostraron que los compuestos activos eran 
nucleósidos, (Isaac y col, 1991). 
Otros métodos de purificación se han utilizado para aislar metabolitos secundarios 
con actividad herbicida mezclando estrategia de procesamiento de materiales y de 
separación cromatografica. Es por tanto posible purificar el principal compuesto herbicida de 
la cepa 1M5a utilizando técnicas reportadas en la literatura científica. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 27 
4. JUSTIFICACIÓN 
La presencia de plagas agrícolas disminuye de gran manera la calidad y el 
rendimiento de los cultivos, razón por lo cual el uso de los plaguicidas se ha impuesto como 
una de las operaciones más necesarias para conseguir cosechas estables, y de alto 
rendimiento, que contribuyan a la estabilidad del precio de los alimentos. La producción de 
plaguicidas ha evolucionado desde compuestos basados en metales pesados de muy alta 
toxicidad, a compuestos sintéticos de menor toxicidad, pero acumulables a través de la 
cadena alimenticia, hasta nuestros días en la que se busca la generación de plaguicidas 
naturales. Dentro de los plaguicidas los herbicidas constituyen los agroquímicos de mayor 
importancia por volumen y por valor. 
 Se reconoce que una gran cantidad de cepas de estreptomicetos como bacterias 
gram positivas, producen compuestos herbicidas, los cuales en estado puro se han utilizado 
para el control de malezas de importancia agrícola. 
La utilización de herbicidas naturales de origen microbianos, tales como el producido 
por la cepa Streptomyces sp 1M5a constituyen un gran interés para la agricultura moderna. 
El uso del microorganismo como agente de control biológico de sus productos de 
biosíntesis permite inhibir la germinación de plantas dicotiledoneas, y puede constituir a 
través de su purificación e identificación un producto de alto valor comercial, y permitir la 
sustitución de productos sintéticos reduciendo así el impacto ambiental de la utilización de 
agroquímicos. 
No existe un método para la purificación de los compuestos herbicidas producidos 
por Streptomyces sp 1M5a. Es indispensable por tanto establecer un método reproducible 
para la purificación de herbicidas producidos por la cepa, con el objetivo de caracterizarlos y 
mejorar la producción y estabilización de los compuestos en escala laboratorio, como piloto 
industrial. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 28 
5. OBJETIVO GENERAL 
 
Desarrollar métodos de purificación de compuestos con actividad herbicida 
producidos por la cepa de Streptomyces sp. 1M5a 
 
 
 
 
 
6. OBJETIVOS PARTICULARES 
 
 Establecer métodos de producción de herbicidas por la cepa Streptomyces sp 1M5a 
a través de fermentación sumergida a nivel de matraz agitado. 
 Establecer métodos de extracción de los compuestos herbicidas de producidos 
Streptomyces sp 1M5a. 
 Establecer métodos de separación de los compuestos herbicidas por el uso de 
métodos cromatograficos. 
 Establecer métodos de purificación de los compuestos herbicidas utilizando técnicas 
de HPLC. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 29 
7. METODOLOGÍA 
7.1. Cultivo de Streptomyces sp 1M5a. 
7.1.1. Preparación de una suspensión de esporas a partir de cultivos en placa 
Se inocularon 45 placas con la cepa 1M5a, por sembrado masivo en el medio IF 
se incubaron durante 5 días a una temperatura de 45º C. Cinco mililitros de una solución 
esterilizada de glicerol al 20 % se agregaron a cada una de las placas petri con un cultivo 
esporulado de 1M5a. Las esporas se recuperaron por suspensión en la solución de glicerol, 
con ayuda de puntas de plástico estériles y una micropipeta. 
La suspensión de esporas se depositó en un frasco de vidrio estéril, y se distribuyó 
en microtubos de plástico que se conservaron en congelación a -70° C. 
 
7.1.2. Conteo de esporas viables de la suspensión. 
La cuantificación de esporas viables de la suspensión se realizó a través del conteo 
en placa. Para dicho fin se efectuaron diluciones de la siguiente forma: 
Se colocaron 10 tubos eppendorf a cada uno de los cuales se les agregaron 900 µl de 
agua. Se colocaron entonces 100 µl de la suspensión de esporas en el primer tubo, se 
homogeneizó en vortex. A partir del primer tubo se tomaron 100 µl que se mezclaron en el 
tubo número 2. La operación se repitió para la generación de diluciones sucesivas 1 en 10 
v/v. Las diluciones se realizaron hasta la dilución 10-10. A partir de las diluciones 10-5, 10 –7 y 
10-10 se sembraron 100 µl en placas de agar para el conteo de unidades formadoras de 
colonia para cada dilución. Los 100 µl se colocaron en el centro de la placa y se 
distribuyeron con asa de vidrio por toda la superficie de agar. Las placas se incubaron 
durante tres días a 45º C y se realizó el conteo de Unidades Formadoras de Colonias 
(UFC). 
 
7.2. Medio de cultivo liquido para fermentación sumergida 
Para los experimentos de fermentación con 1M5a se utilizó un medio de cultivo 
líquido llamado SB por sus siglas en inglés (Sporulation broth) (Trejo-Estrada et al, 1998). 
La composición del medio SB es: 10 g de almidón o glucosa (Hycel de México); 5 g de 
bactotriptosa (Reactivo de Baker); 2 g de extracto de carne (Bioxon); 2 g de extracto de 
levadura (Bioxon); 0.01de FeSO4 7H2O (INDEQ) y 1000 ml de agua (H2O). 
 
7.3 Producción de herbicidas por fermentación 
 30 
7.3.1 Inoculación del medio con la suspensión de esporas 
El medio líquido SB (180 ml) se colocó en matraces Erlenmeyer de 1000 ml de 
capacidad. Una vez preparados, los matraces se inocularon con la suspensión de esporas 
para alcanzar una concentración de 1 x 10-5 UFC/ml. Los matraces inoculados se incubaron 
durante 5 días a temperatura de 30° C en un agitador orbital, (SEVE) a 180 RPM. 
Después de 5 días se registró visualmente el tipo de crecimiento de la cepa dentro 
de los matraces, se recuperó el caldo de fermentación del cultivo de 1M5a, y se centrifugó a 
11000 RPM durante 15 minutos a una temperatura de 4° C. 
A partir del centrifugado se separaron dos fracciones, el sobrenadante de 
fermentación y el paquete de células. Ambas fracciones se colocaron por separado en 
frascos de vidrio, y se mantuvieron en congelación a –20° C, antes de procesarse. 
El sobrenadante de fermentación se liofilizó, utilizando un vaso de liofilización de 
900 ml, y un equipo de liofilización (LABCONCO, modelo 77500-00). 
 
7.4. Extracción de herbicidas 
7.4.1 Extracción líquido-líquido de metabolitos a partir de cultivos de 1M5a 
El liofilizado del sobrenadante de 150 ml de medio de fermentación se solubilizó en 
20 ml de agua estéril. La solución concentrada se extrajo con hexano, utilizando 2 
volúmenes de solvente por 1 volumen de solución acuosa. Se utilizaron 20 ml del 
concentrado del sobrenadante resuspendido y 40 ml deldisolvente correspondiente. La 
extracción se llevó a cabo por homogeneización en un equipo de agitación vortex. 
Con el objeto de separar la fase orgánica de forma más fácil, la mezcla de extracción 
se centrifugó por 15 min a 11000 rpm (X g) en una centrífuga marca Eppendorf, modelo 
5804R. Una vez centrifugada la mezcla, se extrajo la fase orgánica de cada tubo y se 
colocó en nuevos tubos. El extracto en hexano se secó en una centrífuga de vacío (marca 
Eppendorf modelo vacufugue) a una temperatura de 45º C. La oleoresina resultante se 
utilizó para procesamiento posterior. 
 
7.5. Bioensayo de actividad herbicida 
El bioensayo de actividad herbicida se basó en la evaluación de extractos crudos o 
fracciones de separación cromatográfica sobre la germinación de semillas en un medio de 
agar. 
 31 
Para demostrar el efecto herbicida de productos de extracción o de fracciones 
parcialmente purificadas, se prepararon placas petri de medio YCED. En dichas placas se 
colocaron microdiscos de papel filtro de fibra de vidrio (Whatman GF/B), embebidos con 100 
µl de los extractos o soluciones de prueba. 
 Alrededor de los microdiscos se colocaron semillas de jitomate (certificadas, de un 
proveedor local), previamente desinfectadas. La desinfección de las semillas se realizó 
mediante lavados con hipoclorito al 6 % durante 5 minutos, seguidos de dos lavados de un 
minuto con agua estéril, en continua agitación por vortex. 
Las placas petri con las semillas y las soluciones de prueba se colocaron en una 
cámara de crecimiento vegetal a 25° C y luz blanca, con un fotoperíodo de 14 horas de luz y 
10 de oscuridad. 
 
7.6. Purificación de compuestos herbicidas 
7.6.1 Cromatografía de capa fina y Bioautografía 
 La separación inicial de compuestos se realizó por cromatografía de capa fina 
(CCF), utilizando placas de vidrio con silica (marca Whatman de 5 x 10 cm), a las cuales se 
les adicionó una muestra de oleoresina. 
La separación de los compuestos se realizó con un sistema de solventes de 
cloroformo-metanol (1:1), cloroformo-metanol (8:2), hexano-isopropanol (1:1) y hexano-
isopropanol (8:2). 
La separación de compuestos se verificó por la aparición de manchas fluorescentes 
bajo iluminación con UV. 
En sistemas seleccionados de cromatografía, los cromatogramas desarrollados se 
acoplaron a un bioensayo, en una modificación de la técnica denominada bioautografía, 
reportada clásicamente para antibióticos. 
Las placas de vidrio de silica, después de que los cromatogramas eran 
desarrollados, se secaron en una campana de flujo laminar, se colocaron en una placa de 
petri y se vertió medio de agar YCED a 45-48° C. Una vez solidificado el medio, se 
colocaron las semillas de jitomate, alrededor de las bandas desarrolladas en el 
cromatograma, con el objetivo de localizar aquellas bandas con actividad herbicida, y 
distinguirlas de las no activas. Las placas se incubaron en cámara de crecimiento vegetal 
bajo las mismas condiciones del bioensayo descrito con anterioridad. 
 
 32 
7.6.2 Separación en fase sólida 
A través de métodos definidos en CCF, se evaluaron sistemas de separación en 
fase sólida. 
Para la separación de fase sólida se utilizaron cartuchos Sep-PAC Vac 3 cc y Vac 6 
cc de silica, de fase normal. Los cartuchos de silica empacada se acondicionaron con 3 
volúmenes de cloroformo, y posteriormente se colocó la muestra de oleoresina dentro del 
cartucho. Se pasaron por la columna 3 volúmenes del sistema de solvente a probar 
(cloroformo-metanol y hexano-isopropanol 95:5, 90:10, 80:20, 60:40, 30:70, y 0:100). Para 
eluir la muestra se colectaron fracciones cada 2 ml. de cada fracción se evaporó el solvente 
en una centrifuga de vacío a 45° C. Las fracciones fueron posteriormente evaluadas en el 
sistema descrito de bioensayo. Se examinó para cada fracción, su capacidad para inhibir 
germinación de semillas de jitomate. Sólo las fracciones que inhibían parcial o totalmente la 
germinación, fueron analizadas en HPLC. 
 
7.7 Análisis en HPLC 
Las fracciones activas, detectadas por separación con el mejor sistema de solvente, 
fueron analizadas mediante la técnica de cromatografía liquida de alta resolución o HPLC. 
El análisis cromatográfico se efectuó mediante el uso de una columna de fase normal de 
silica (Zorbax SB- 4,6 x 12,5 mm y 5 µm), y con una fase móvil de 100% de hexano a un 
flujo de 500 μl/min. Los picos de cromatografía se detectaron por un detector de arreglo de 
diodos ajustado a una longitud de onda de 280 nm. Las fracciones para análisis se 
disolvieron en 100 % de hexano y se inyectaron 2 µl. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 33 
Conteo de colonias 
Fermentación liquida en medio SB, 
28°C, 200 RPM, 5 días 
Liofilizar el 
sobrenadante 
8. ESQUEMA DE TRABAJO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Propagación de 1M5a en medio IF, durante 
5 días a 45º C. 
Centrifugar y recuperar 
sobrenadante 
Extracciones con hexano-agua 
(2:1) 
Recuperar esporas con glicerol al 
 20 % 
Separación fase 
solida 
Cromatografía de 
capa fina 
 
HPLC 
 34 
9. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
9.1. Bioensayo de actividad herbicida 1M5a en placas con medio YCED 
Con el fin de confirmar el efecto herbicida de la cepa 1M5a, se realizó un 
bioensayo directo. La cepa 1M5a se inoculó por estriado en medio YCED, se incubó a 30° 
C durante cinco días, para garantizar la producción de metabolitos herbicidas (Spezzia-
Mazzocco, 2002), y posteriormente se colocaron semillas de jitomate previamente 
desinfectadas. Las placas se colocaron en una cámara de crecimiento vegetal de 
temperatura y fotoperíodo controlados. Diez días después se pudo evaluar la inhibición de 
la germinación de las semillas. En la figura 1 se presentan los resultados de inhibición de 
germinación por cultivo directo de 1M5a. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
9.2. Cultivo sumergido de 1M5a 
La cepa de Streptomyces sp fue exitosamente cultivada en medios de agar para la 
producción de esporas. Las esporas se conservaron adecuadamente, con la misma 
cuenta viable por al menos 18 meses, y los stocks de esporas pudieron ser utilizados 
como inóculos de fermentaciones sumergidas en el nivel de matraz. 
En el cultivo en matraz agitado, con una concentración inicial de 1x105 UFC/ml, se 
desarrollan pellets durante las primeras 48 horas, que devienen en un crecimiento 
plenamente filamentoso, confluente, de alta viscosidad. A partir de las 72 horas comienza 
la producción de un pigmento amarillo claro. 
Figura 1 Actividad herbicida de la cepa 1M5a de Streptomyces sp contra 
semillas de jitomate. En 1a se presenta la inhibición de la germinación de 
semillas en comparación con 1b, un control no inoculado. 
1 a 
Cepa 1M5a Control 
1 b 
 35 
La producción de los herbicidas se confirmó como óptima al quinto día de cultivo, 
tal y como lo reportó por Cercado-Jaramillo (2004). 
 
9.3. Extracción de compuestos herbicidas a partir de cultivos líquidos de 1M5a 
Hasta ahora la mayoría de los metabolitos herbicidas aislados a partir de cultivos 
de actinomicetos son compuestos polares y extraíbles con solventes miscibles en agua. 
En contraste, de los extractos obtenidos de cultivos de 1M5a, no presentaron efecto 
herbicida los correspondientes a extracciones con solventes polares (metanol, acetona, 
alcohol etílico o propanol). Sin embargo, todas las extracciones realizadas con los 
solventes no miscibles en agua (hexano, cloroformo, butanol, tolueno y acetato de etilo) 
mostraron alguna actividad inhibidora, resultando especialmente activas las extracciones 
realizadas con hexano y tolueno, tal y como lo reportaron Spezzia-Mazzoco y col. (2002). 
La selección de solventes para cromatografía de capa fina se basó en solventes 
no polares, que sin duda resultaron más adecuados para la mejor separación 
cromatográfica de los metabolitos producidospor fermentación sumergida de la cepa 
1M5a, a partir de su cultivo en medio SB. 
 
99..44.. CCrroommaattooggrraaffííaa ddee ccaappaa ffiinnaa 
 Extractos activos de cultivos de la cepa 1M5a, se separaron utilizando la técnica 
de cromatografía de capa fina. Los sistemas de solventes evaluados para dicho fin fueron 
cloroformo-metanol (1:1), y cloroformo-metanol (8:2). En los cromatogramas resultantes 
se observaron dos bandas visibles bajo luz UV. Los resultados se presentan en la Tabla 
2 y en la Figura 2. 
 
 
 
 
 
 
 
 36 
Tabla 2. Factores de corrimiento (Rf) de bandas separadas por cromatografía de 
capa fina (cloroformo-metanol), a partir de extractos activos de cultivos de 
Streptomyces sp 1M5a. 
BANDA RECORRIDO 
(mm) 
RECORRIDO 
(mm) 
Rf (1:1cloroformo-
metanol) 
Rf (8:2 
cloroformo-
metanol) 
1 6.0 6.5 0.800 0.866 
2 7.0 7.2 0.933 0.960 
 
 
Cloroformo-metanol (1:1) Cloroformo-metanol (8:2) 
FFiigguurraa 22 CCrroommaattooggrraammaass ddee ccaappaa ffiinnaa de extractos activos, obtenidos de cultivos de 
Streptomyces sp 1M5a, con dos sistemas de solventes de cloroformo y metanol. 
 
Con el primer sistema de solventes (cloroformo-metanol 1:1), se observaron dos 
bandas muy cercanas entre si, con tiempos de retención de 0.800 y 0.933. Con el 
segundo sistema (cloroformo-metanol 8:2) se registraron también dos bandas, con 
tiempos de retención 0.866 y 0.960. 
 37 
Se probó también otro grupo de sistemas de solventes, compuestos de soluciones 
de hexano-isopropanol. Los resultados para dicho sistema se presentan en la Tabla 3 y 
en la Figura 3. 
Con hexano-isopropanol 1:1 se obtuvieron cuatro bandas de mejor resolución 
cuando se comparan con las obtenidas con sistemas de solventes basados en cloroformo 
y metanol. Dichas bandas tuvieron tiempos de retención de 0.600 min, 0.733 min, 0.800 
min. y 0.906 min. Con hexano-isopropanol 8:2 se obtuvieron también cuatro bandas con 
tiempos de retención de 0.360 min, 0.466 min, 0.600 min. y 0.706 min. Es este último 
sistema de solventes el que se consideró mejor para la separación de compuestos a partir 
de extractos activos de cultivos de 1M5a. Debe destacarse que con este sistema, la 
primera banda no se eluye con el frente del solvente como es el caso cuando se utiliza 
hexano-isopropanol 1:1 
 
Tabla 3. Factores de corrimiento (Rf) de bandas separadas por cromatografía de 
capa fina (hexano-Isopropanol), a partir de extractos activos de cultivos de 
Streptomyces sp 1M5a. 
BANDA 
RECORRIDO 
(mm) 
RECORRIDO 
(mm) 
Rf (hexano-
isopropanol 1:1) 
Rf (hexano-
isopropanol 8:2) 
11 44..55 22..77 00..660000 00..336600 
22 55..55 33..55 00..773333 00..446666 
33 66..00 44..55 00..880000 00..660000 
44 66..88 55..33 00..990066 00..770066 
 
 38 
 
 hexano-isopropanol (1:1) hexano-isopropanol (8:2) 
FFiigguurraa 33.. CCrroommaattooggrraammaass ddee ccaappaa ffiinnaa de extractos activos, obtenidos de cultivos 
de Streptomyces sp 1M5a, con dos sistemas de solventes de hexano-isopropanol. 
 
 Posteriormente, se eligió la cromatografía de capa fina realizada con hexano-
isopropanol (80:20) para realizar una prueba de bioautografia. Después de desarrollada 
una cromatografía CCF, la placa de vidrio se colocó en una placa petri de vidrio a la cual 
se le adicionó medio YCED con agar. Sobre el medio solidificado se colocaron semillas 
de jitomate, se dejaron germinar durante 10 días, en cámara de crecimiento vegetal, y se 
evaluó la germinación para localizar la banda o bandas de mayor actividad inhibitoria de 
germinación. Los resultados de la prueba de bioautografía se presentan en la Figura 4. 
 Los resultados de la Figura 4 demuestran que la zona de inhibición de germinación 
de semillas de jitomate corresponde a la banda con Rf = 0.706. En la figura 4 se presenta 
un cromatograma revelado por incidencia de luz UV, en el que se señala la zona 
correspondiente a la actividad herbicida. 
 
 39 
 hexano-isopropanol 80:20 
 
FFiigguurraa 44 BBiiooaauuttooggrraaffiiaa ppaarraa llooccaalliizzaacciióónn ddee llaa bbaannddaa hheerrbbiicciiddaa eenn ccrroommaattooggrraammaass ddee 
eexxttrraaccttooss aaccttiivvooss ddee ccuullttiivvooss ddee 11MM55aa ddeessaarrrroollllaaddooss ccoonn HHeexxaannoo--IIssoopprrooppaannooll 8800::2200.. 
 
9.5. Separación por fase sólida con Sep-Pak Vac 3 cc (silica), fase normal 
 El siguiente paso en la estrategia de purificación del herbicida de 1M5a consistió 
en la aplicación de los sistemas de solventes utilizados en CCF, para conseguir una 
preparación semipurificada mediante el uso de la técnica de separación en fase sólida. 
Con la misma fase estacionaria que en CCF (silica normal), pero en este caso con 
minicolumnas superempacadas tipo cartuchos Sep-Pak Vac 3 cc (silica), de fase normal, 
se desarrolló un fraccionamiento cromatográfico. Cada fracción se evaluó en un 
bioensayo de germinación de semillas de jitomate. Los sistemas de solventes probados 
fueron cloroformo-metanol y hexano-isopropanol en diferentes concentraciones. Los 
resultados se presentan en la Tabla 4. 
 
Semillas no germinadas Semillas no germinadas 
 40 
 
La separación comenzó por la colocación de la oleorresina en la minicolumna. La 
oleoresina, provenía de un cultivo de la cepa 1M5a en 150 ml de medio SB, y disuelta en 
150 µl de hexano. Los solventes, en las combinaciones de menor polaridad se pasaron 
primero. Las fracciones eluidas fueron probadas en un bioensayo de actividad herbicida 
colocando una muestra de cada fracción en los disco de papel de fibra de vidrio. 
Posteriormente, y mediante bioensayo, se observó el efecto de la actividad herbicida. 
Como ejemplo, en la Figura 5 se presenta la actividad herbicida de las fracciones 4 
y 5 de la separación en fase sólida con el sistema cloroformo-metanol 80:20, así como la 
de la fracción 2 y 4 proveniente de la separación con cloroformo-metanol 30:70. Ambas 
muestras demostraron inhibición de la germinación a los 10 días de haber sido colocadas 
las semillas de jitomate. 
 
Tabla 4. Sistema de solventes utilizados en la separación del compuesto 
herbicida por la técnica de separación en fase sólida. Se utilizaron cartuchos 
Sep-Pak de silica de fase normal 
CLOROFORMO-METANOL HEXANO-ISOPROPANOL 
95:5 95:5 
90:10 90:10 
80:20 80:20 
60:40 60:40 
30:70 30:70 
0:100 0:100 
 41 
 
Cloroformo-metanol 80:20, vista por 
detrás de la placa 
Cloroformo-metanol 30:70, vista por detrás 
de la placa 
Figura 5 Bioensayo de fracciones obtenidas por separacion de fase sólida de 
extractos de 1M5a con actividad herbicida. Sistemas de solventes Cloroformo-
Metanol con Sep-Pak 3 cc. 
 
Otras pruebas, como la anterior, pero con sistemas de hexano-isopropanol 
tuvieron también fracciones de gran actividad herbicida. Las fracciones donde se observó 
el mayor efecto herbicida fueron: las 3 y 5 con hexano-isopropanol 60:40; las fracciones 3 
30:70 C-M 
95:5 C-
M 
90:10 C-M 80:20 C-M 
60:40 C-M 0:100 C-M 
 42 
y 4 de hexano-isopropanol 90:10; y la fracción 2 y 4 de hexano-isopropanol 80:20. Los 
resultados se presentan en la Figura 6. 
De forma interesante, la fracción 5 eluida con un sistema de hexano-isopropanol 
80:20 demostró tener el efecto contrario, es decir, potenció la germinación, y durante la 
evaluación de plántulas las raíces demostraron un mayor crecimiento, en comparación 
con las otras fracciones. Dicho efecto se debe probablemente a la presencia de un 
promotor de crecimiento vegetal. 
 
 
 Hexano-isopropanol 60:40 Hexano-isopropanol 90:10 Hexano-isopropanol 80:20 
90:10 H-I 80:20 H-I 95:5 H-I 
30:70 H-I 0:100 H-I 60.40 H-
I 
Fracción con 
actividad promotora 
 43 
placas vista por la parte de atrás donde se observan las raíces 
Figura 6. Bioensayo de fraccionesobtenidas por separacion de fase sólida de 
extractos de 1M5a con actividad herbicida. Sistemas de solventes Hexano-
Isopropanol con Sep-Pak 3 cc. 
 
9.6. Separación de fase sólida con Sep-Pak Vac 6 cc (silica), fase normal 
Con el fin de poder obtener una fracción de mayor volumen para los bioensayos y así 
poder evidenciar mejor el efecto herbicida, se realizaron pruebas con cartuchos Sep-Pak 
Vac de mayor tamaño, de 6 cc (silica), de fase normal, a los cuales se les colocó la 
muestra de oleoresina (disuelta en 150 µl de hexano), pero esta vez proveniente de un 
cultivo de la cepa 1M5a de 500 ml de medio. 
A partir de la fracción de hexano-isopropanol 0:100 se obtuvo una buena respuesta 
herbicida en 1 y 2. En la fracción 1 y 2 de 30:70 hexano-isopropanol se obtuvieron 
fracciones con una buena actividad herbicida, pero menos evidente que las fracciones 
correspondientes a 100 % isopropanol. Las fracciones 1 y 2 eluídas con 100 % de 
isopropanol fueron las de mayor actividad, y constituyen las fracciones que se analizaron 
posteriormente en HPLC analítico. Los resultados del bioensayo de dichas fracciones se 
presentan en la Figura 7. En esa figura queda de manifiesto que la germinación de 
semillas de jitomate en las fracciones activas es 0 %, contra > 85 % de germinación en el 
control de solvente. 
 
 
 
 
 
 
 44 
 Hexano-isopropanol 0:100 Control 
 Hexano-isopropanol 30:70 
FFiigguurraa 77.. Bioensayo de fracciones obtenidas por separacion de fase sólida de 
extractos de 1M5a con actividad herbicida. Sistemas de solventes Hexano-
Isopropanol con Sep-Pak 6 cc. 
 
9.7 Análisis de fracciones herbicidas por HPLC 
La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) se utilizó para el análisis de las 
fracciones activas, derivadas de la separación en fase sólida con minicolumnas 
empacadas de 6 cc. Las pruebas de HPLC se desarrollaron con una columna de silica de 
fase normal, una fase móvil de 100 % hexano, un flujo de 0.5 ml/min, y un detector DAD 
ajustado a 280 nm. La inyección de muestra fue de 2 µl. 
Con la técnica de HPLC se realizaron análisis de las fracciones 1 y 2, que fueron 
eluidas con 100 % isopropanol durante la separación en fase sólida. En los 
cromatogramas de HPLC de ambas fracciones se obtuvieron los mismos picos, con un 
tiempo de retención de 3.090 min. El pico recuperado de HPLC, con inyecciones de 
mayor volumen registró actividad herbicida. Los resultados se presentan en la Figura 8. 
 45 
 
 
 
 
 
El herbicida de la cepa 1M5a podría ser igual de potente que uno de los herbicidas 
microbianos de mayor potencia, y mayormente utilizados en agricultura, tal como 
Bialaphos, un compuesto producido por Streptomyces viridochromogenes. (Hoagland 
R.E., 1990). Observaciones de manejo del herbicida de 1M5a muestran la gran 
Figura 8. Cromatograma de HPLC de fracciones semipurificadas del 
herbicida de la cepa 1M5a. El pico más prominente tiene un tiempo de 
retención de 3.090 min. 
 46 
estabilidad del compuesto a cambios del medio ambiente debidos a la temperatura, la luz 
y el tiempo de almacenamiento. 
También hay reportes como el Pironetin que es un regulador de crecimiento 
aislado de Streptomyces sp. NK 10958 que inhibe el crecimiento de plantas de arroz 
(Kobayashi, 1994). 
A través de los procedimientos asociados a la purificación y análisis 
cromatográfico y biológico del herbicida de 1M5a, podrán desarrollarse en el futuro 
pruebas como espectrofotometría de masas y resonancia magnética nuclear, que 
permitirán establecer si dicho compuesto es un compuesto nuevo, o si se trata de un 
compuesto conocido, reportado ya para Streptomyces sp. 
Resulta indispensable, aún si es un compuesto conocido, el conocimiento sobre el 
producto producido por 1M5a, una cepa que funciona por sí sola como bioherbicida, y que 
produce compuestos con dicha actividad en suelos y sustratos naturales. En un contexto 
biotecnológico, es de gran importancia conocer el compuesto producido por 1M5a, para 
rastrear su producción en sistemas agrícolas y en el desarrollo de procesos de producción 
masiva del bioherbicida. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 47 
10. CONCLUSIONES 
 
1. Se confirmó el efecto herbicida de la cepa Streptomyces sp 1M5a en bioensayos 
en placas de agar. 
2. Se produjeron, de manera reproducible, cultivos sumergidos de Streptomyces sp 
1M5a, en escala de matraz agitado, con actividad herbicida en el sobrenadante. 
3. Se obtuvieron consistentemente extractos activos derivados de cultivos 
sumergidos con Streptomyces sp 1M5a. 
4. Se lograron separar compuestos a través de métodos cromatográficos 
desarrollados ad hoc, con técnicas tales como cromatografía de capa fina, 
separación en fase sólida y HPLC. 
5. Se obtuvo un método rápido y preciso de análisis del herbicida por HPLC. 
6. Se confirmó la pureza de una preparación purificada del herbicida, a través de 
análisis por HPLC. 
7. El método de purificación del herbicida es escalable para la obtención de material 
suficiente para examen espectroscópico y elemental, que posibilite la identificación 
del compuesto. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 48 
11. ANEXO 
Medios utilizados para el cultivo de la cepa de Streptomyces 1M5a 
 
YCED (agar extracto de levadura hidrolizado de caseína dextrosa) 
 18 g/l agar bacteriológico (Bioxon) 
 2 g/l fosfato dibásico de potasio (Química Meyer) 
 0.3 g/l dextrosa (Hysel de México) 
 0.3 g/l extracto de levadura (Bioxon) 
 0.3 g/l hidrolizado de caseína (Sigma) 
 pH 7.2 
 
Medio PDA se utilizo como medio liquido de fermentación 
 
PDA (agar papa dextrosa) 
 100 g de extracto de papa. 
 10 g de almidón soluble (Sigma) 
 1 g de nitrato de potasio (KNO3) (Reactivo Baker) 
 0.2 g de fosfato de potasio dibásico (K2HPO4 ) (Reactivo Baker) 
 1 lt de agua 
 
Medio utilizado para la fermentación de la cepa 1M5a 
SB (Sporulation broth) (Trejo-Estrada et al, 1998) 
Los componentes del medio: 
 10 g de almidón o glucosa (Hycel de México) 
 5 g de bactotriptosa (Reactivo de Baker) 
 2 g de extracto de carne (Bioxon) 
 2 g de extracto de levadura (Bioxon) 
 0.01de FeSO4 .7H2O (INDEQ) 
 1000 ml, de agua (H2O) 
 
 
 
 49 
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