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INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE: PROYECTO DE INVESTIGACIÓN INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA TÍTULO DEL TRABAJO: “ SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN POR RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN) DE HETEROCÍCLOS DE SELENIO Y TELURIO DE CINCO MIEMBROS EMPLEADOS COMO ANTIOXIDANTES” QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE: INGENIERO FARMACÉUTICO PRESENTA: ALCÁNTAR FERNÁNDEZ IVÁN DIRECTOR INTERNO: DR. EFREN V. GARCÍA BÁEZ MÉXICO, D.F. 8 DE JUNIO DE 2009 EVALUADORES: M. en C. BENITO RIZO ZÚÑIGA M. en C. MARTÍN F. GARCÍA MENDOZA AGRADECIEMIENTOS. A DIOS Por guiar mis pasos por el camino de la verdad y por poner a mi lado a los ángeles que tengo por padres, pues me han ayudado a realizar mis sueños y a alcanzar mis metas. A MIS PADRES Cuando se trata de agradecer el amor y todo lo que me han brindado, no existe una sola palabra que pueda expresar el infinito agradecimiento que tengo hacia ustedes por todo lo hermoso que me han dado. AL Dr. EFREN V. GARCÍA BAEZ Le agradezco el haberme brindado la oportunidad de colaborar con él y de conocerlo un poco más, espero no haberlo defraudado. A MIS HERMANOS Por el apoyo que mutuamente nos hemos brindado, aunque ha habido problemas, siempre los hemos superado juntos, por esto y más muchas gracias, por que se que contare con su apoyo incondicionalmente. A MIS MAESTROS Por ayudarme a expresar lo que llevo dentro, enseñarme que nuestros sueños no tienen límites, a ser libre y a volar con la imaginación sabiendo que hay muchas cosas por descubrir, pero sobre todo por explicarme que para tener la cabeza en el cielo, hay que tener primero los pies en la tierra. A MI ABUELA Adoro tu valor y tu esfuerzo, todos esos momentos que hemos vivido juntos quedaran plasmados en mi memoria, este trabajo solo es un pequeño homenaje a todos los esfuerzos y sacrificios que has realizado por mi y mi familia. A MIS TIOS Por el cariño y apoyo que me han brindado sin esperar nada a cambio. Con este trabajo les digo cuanto los quiero y les agradezco por estar en mi camino y por el apoyo que le han brindado a mi familia. A MIS AMIGOS Agradezco el apoyo que me han brindado cuando he estado mal, que no importando donde estén hacen lo imposible por llegar a mi. "No hay casualidad, si no destino... por alguna razón será que tenían que escuchar mis locuras...” (IAF) DEDICATORIA A Mis Padres: Hoy he encontrado una oportunidad para llegar a ustedes y demostrarles que su esfuerzo ha valido la pena… Aprovecho la ocasión para agradecerles el que hayan estado conmigo desde el comienzo de mi vida encaminando mis primeros pasos y siendo testigos de mis mejores años, siendo espectadores de mis alegrías y fracasos, de mis risas y mis llantos y de la culminación de las metas que me he trazado. En ocasiones me han visto esforzarme y en muchas otras flaquear dejándome llevar por tantas cosas que me ofrece el mundo y otras que me exige la sociedad. Sin embargo, han estado ahí en mis momentos de luz y oscuridad, cuando me he sentido cansado y cuando no he sabido dar respuesta a lo que me dan. Quisiera que no solo me enseñaran y me llenaran de contenidos, los cuales sé que son necesarios para mi vida; desearía más conocer lo que su corazón muchas veces esconde por temor a mostrar su humanidad, lo que hay en ustedes, lo que piensan, lo que sienten, tantas cosas que estoy seguro me enseñarían mucho más. Tengo tantas cosas que agradecerles que el hecho de intentar plasmarlas en un papel sea casi imposible. Sólo por haberme dado esta vida que hoy en día puedo disfrutar con tanta alegría, se los debo todo. Con esta carta pretendo dar a conocer al mundo que son los mejores padres que existen, pues han estado a mi lado apoyándome en todo momento, enseñándome y corrigiéndome para ir por el buen camino, siempre intentando hacer de mí una persona excelente… Sé, que lo hacen porque me quieren, y solo quieren lo mejor para mí, por eso, les debo además de un gracias enorme, un lo siento infinito. Lo siento por todas las cosas que hago mal, por todos los disgustos, los caprichos, los derroches, los enfados… Todas esas cosas que hacen que no sea lo que esperan de mí, y que tal vez no hagan que se enfaden, sino que se decepcionen por pensar que yo podría actuar de una forma mejor. Muchísimas gracias por ser como son; yo, pase lo que pase, los voy a querer y estaré agradecido toda mi vida. Gracias a ustedes he logrado llegar hasta aquí y convertirme en lo que soy. Ha sido un privilegio ser su hijo... lo único que me resta decir es que son los mejores padres.... No se si este es el fin o el principio pero… ahora voy con más fuerza a comerme el mundo!!! SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN POR RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN) DE HETEROCICLOS DE SELENIO Y TELURO DE CINCO MIEMBROS EMPLEADOS COMO ANTIOXIDANTES Alcántar Fernández Iván, García Báez Efrén Venancio * Departamento de Química-Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología del Instituto Politécnico Nacional. Av. Acueducto s/n Barrio La Laguna Ticoman, Delegación GAM. México DF. CP. 07350. Tel. 57296000 ext. 56324, e-mail: vgarcia@upibi.ipn.mx. Palabras clave: Selenio, Teluro, Antioxidantes, Radicales libres. Introducción. Los radicales libres son átomos de oxígeno con siete electrones y uno desapareado, el cual toman de la membrana celular produciendo así otro radical libre dando lugar a una reacción en cadena. Éstos recorren el organismo quitando electrones de las moléculas estables, con el fin de alcanzar su estabilidad electroquímica, destruyendo así las células. Esta reacción en cadena se combate con la acción de los antioxidantes, los cuales son capaces de retardar o prevenir la oxidación de otras moléculas, inhibiendo reacciones de oxidación oxidándose ellos mismos. Se emplean para evitar daños como el envejecimiento de la piel, problemas cardiovasculares y del sistema nervioso, disminuyendo el impulso nervioso, al igual que los reflejos, la memoria y el aprendizaje, disminuye la irrigación sanguínea a nivel del sistema nervioso y se puede padecer demencia senil (1). Metodología. Se empleó el procedimiento divulgado por Lesser y Weiss (2) para la obtención del ebselen (Figura 1). Se colocó en reflujo durante 2h al calcógeno e NaH, empleando como catalizador DMF. Para la formación de la sal de benceno diazonio, se preparó una solución del ácido antranilico sustituido en K2CO3 y agua; una de NaNO2 en agua y una de HCl en agua, estas se mantuvieron a 268.15ºK en baño de hielo. Se vertió la solución del NaNO2 en la del ácido antranilico y posteriormente la del HCl muy lentamente. Transcurrido el tiempo del reflujo se vertió en la solución anterior y se filtró al vacío, conservando el sólido, el líquido obtenido fue transferido a un embudo de separación y se le añadió CH2Cl2 para la separación de fases. La fase orgánica se pasó a un matraz balón y se le agregó SOCl2, fue llevado a reflujo durante 3h con DMF como catalizador. Por otra parte se añadió gota a gota el acetonitrilo anhidro al aminoácido en agitación durante 1.5h para su disolución. Transcurrido el tiempo del reflujo del SOCl2 se añadió el aminoácido y fue agitado durante 1.5h a temperatura ambiente. La solución anterior fue evaporada hasta la obtención de un sólido. E N O H3C R E=Se, Te R=aminoacido Figura 1. Esquema del benzisoselenazol-3(2H)-uno (ebselen) Resultados y Discusión. Los compuestos sintetizados fueron caracterizados por resonancia magnética nuclear de 1H y 13C. En los espectros obtenidos podemos observar que las síntesis fueron logradas con éxito. La formación de los compuestos debe de realizarse en una atmosfera reductora con hidrógeno, por quelos compuestos se oxidan con rapidez y por tal motivo, la adicción de las soluciones fue realizada por cánula. Figura 2. Espectro experimental de RMN de 1H. En la figura 2, se muestra el espectro de RMN de 1H (en DMSOd6) y se observan las señales que indican los hidrógenos presentes del compuesto sintetizado, lo cual nos indica que la síntesis se realizó de manera adecuada. Conclusiones y perspectivas. Los espectros de resonancia magnética nuclear de 1H y 13C indican que las síntesis que se llevaron a cabo se realizaron de la mejor manera posible, obteniendo gran pureza y una reacción casi completa, esto al observar que las demás señales que aparecen son solo del catalizador empleado, DMF en este caso. Se lograron sintetizar y caracterizar los intermediarios para la obtención del ebselen y los compuestos finales. Comprobamos que por el método de Lesser y Weiss se pueden obtener diversos heterociclos de cinco miembros de selenio y teluro, los cuales demuestran tener diferente actividad farmacológica. Agradecimientos. Al director del proyecto el Dr. Efrén Venancio García Báez, por la oportunidad y el apoyo brindados, al laboratorio de Investigación de Química de la Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología y a la Secretaria de Investigación y Posgrado del IPN por apoyo al proyecto 20090059 Referencias: (1). Parnham, M.J., Graf, E. (1987). Seleno-organic compounds and the therapy of hydroperoxide-linked pathological conditions. Biochem Pharmacol. Vol. 36 3095-3102. (2). Matill H.A. (1947). Antioxidants. Annu Rev Biochem. Vol. 16: 177–192. (3). Valko M., Leibfritz D., Moncol J., Mazur M., Telser J. (2007). Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol. Vol. 39(1). 44-84. 1 2 3 4 7 8 5 Se N O C H CO2H NH2 CH3 1 2 3 4 5 6 8 7 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología i CONTENIDO INDICE DE FIGURAS iii 1. ANTECEDENTES 1 1.1 Selenio 1 1.2 Teluro 2 1.3 Antioxidantes 3 1.3.1 Clasificación 4 1.3.2 Mecanismos antioxidantes 5 1.3.2.1 Glutatión 5 1.3.2.2 Sistemas de enzimas 6 1.3.2.3 Superóxido dismutasa 7 1.3.2.4 Catalasas 7 1.3.2.5 Peroxirredoxinas 7 1.3.2.6 Tiorredoxina 7 1.4 Radicales libres 8 1.4.1 Clasificación 8 1.4.2 Daños por radicales libres 9 1.5 Estrés oxidativo 10 1.6 Usos del ebselen y sus derivados 11 1.6.1 Antioxidantes y agentes antiinflamatorios 11 1.6.2 Inhibidores enzimáticos 12 1.6.3 Agentes antiinfecciosos 12 1.6.4 Inductores e inmunomoduladores de la citoquina 13 1.6.5 Agentes antitumorales 14 2. JUSTIFICACIÓN 15 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología ii 3. OBJETIVOS 16 4. MATERIALES 17 5. DESARROLLO EXPERIMENTAL 18 5.1 Síntesis del ebselen empleando el ácido 2-amino-3-metil benzoico y Se 18 5.2 Síntesis del ebseeln empleando el ácido 2-amino-3-metil benzoico y Te 19 5.3 Síntesis del ebselen empleando el ácido 2-amino-5-metil benzoico y Se 20 5.4 Síntesis del ebselen empleando el ácido 2-amino-6-metil benzoico y Se 21 6. RESULTADOS 22 7. DISCUSIÓN 31 8. CONCLUSIONES 32 9. BIBLIOGRAFÍA 33 10. ABREVIATURAS 35 ANEXO I. Esquemas de Reacción 37 ANEXO II. Cronograma de Actividades 41 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología iii ÍNDICE DE FIGURAS Figura1. Mecanismo del radical libre en la peroxidación de lípidos. Figura 2. Ruta enzimática para la detoxificación de especies reactivas del oxígeno. Figura 3. Dos mitocondrias. Izq. joven y saludable. Dcha. envejecida por acción de los radicales libres. Figura 4. Las especies reactivas del oxígeno y su sistema de detoxificación. SOD: superóxido dismutasa, GSH-peroxidasa: glutatión peroxidasa. Si este sistema es desbordado, surge una situación de estrés oxidativo. Figura 5. Estructura tridimensional del ebselen. Figura 6. Modificación del ebselen, 7-nitro-2-phenylbenzo [d][1,2]selenazol-3(2H)-one. Figura 7. Compuestos análogos del ebselen Figura 8. Ejemplos de agentes antiinfecciosos Figura 9. Agente antiinfeccioso. Figura 10. Agentes inductores de la citoquina Figura 11. Ejemplos de agentes antitumorales. Figura 12. Esquema del ebselen Figura 13. Espectro experimental de RMN de 13C en CDCl3 del intermediario III-A. Figura 14. Espectro comparativo teórico de RMN de 13C, del intermediario III-A. 6 6 9 10 11 11 12 13 13 14 14 15 22 22 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología iv Figura 15. Espectro experimental de RMN de 1H en CDCl3 del intermediario III-A. Figura 16. Espectro comparativo teórico de RMN de 1H, del intermediario III-A. Figura 17. Espectro experimental de RMN de 13C en CDCl3 del intermediario VI-A. Figura 18. Espectro comparativo teórico de RMN de 13C, del intermediario VI-A. Figura 19. Espectro experimental de RMN de 1H en CDCl3 del intermediario VI-A. Figura 20. Espectro comparativo teórico de RMN de 1H, del intermediario VI-A. Figura 21. Espectro experimental de RMN de 1H en CDCl3 del intermediario III-B. Figura 22. Espectro comparativo teórico de RMN de 1H, del intermediario III-B. Figura 23. Espectro experimental de RMN de 13C en CDCl3 del intermediario VI-C. Figura 24. Espectro comparativo teórico de RMN de 13C, del intermediario VI-C. Figura 25. Espectro experimental de RMN de 13C en CDCl3 del intermediario V-C. Figura 26. Espectro comparativo teórico de RMN de 13C, del intermediario V-C. 23 23 24 24 25 25 26 26 27 27 28 28 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología v Figura 27. Espectro experimental de RMN de 13C en DMSOd6, del compuesto final (ebselen) VI-B. Figura 28. Espectro comparativo teórico de RMN de 13C, del compuesto final (ebselen) VI-B. Figura 29. Espectro experimental de RMN de 1H en DMSOd6 del compuesto final (ebselen) VI-B. Figura 30. Espectro comparativo teórico de RMN de 1H, del compuesto final (ebselen) VI-B. 29 29 30 30 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 1 - 1. ANTECEDENTES. 1.1 Selenio El selenio es un micromineral antioxidante, componente de la enzima antioxidante glutatión peroxidasa, que previene las reacciones excesivas de oxidación, y su acción se relaciona con la actividad de la Vitamina E, disminuyendo el proceso de envejecimiento celular neutralizando los radicales libres. Se encuentra en el pan, los cereales, el pescado, las carnes y los huevos. Estimula el sistema inmunológico e interviene en el funcionamiento de la glándula tiroides. Está presente en el aminoácido seleno-cisteina. Es insoluble en agua y alcohol, ligeramente soluble en disulfuro de carbono y soluble en éter. Exhibe el efecto fotoeléctrico, convirtiendo la luz en electricidad, su conductividad eléctrica aumenta al exponerlo a la luz. Se encuentra a menudo en suplementos multivitamínicos y minerales, y su cantidad mínima viene expresada en µg/día. El Comité de Nutrición y Alimentos del Instituto de Medicina (Food and Nutricional Board of theInstitute of Medicine1) recomienda los siguientes consumos de selenio en la dieta: • 0 – 6 meses: 15 µg/día • 7 – 12 meses: 20 µg/día • 1 – 8 años: 30 µg/día • 9 – 13 años: 40 µg/día • 14 años en adelante: 55 µg/día 1 Institute of Medicine, Food and Nutrition Board. Dietary Reference Intakes: Vitamin C, Vitamin E, Selenium, and Carotenoids. National Academy Press, Washington, DC, 2000. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 2 - Efectos secundarios: - Enfermedad de Keshan (anomalía del músculo cardíaco) - Enfermedad de Kashin-Beck (articular y ósea) - Cretinismo endémico mixedematoso (retardo mental) - Selenosis (exceso de selenio en la sangre, produciendo pérdida de cabello, nauseas, irritabilidad, fatiga y daño nervioso) 1.2 Telurio El teluro es un elemento de color blanco plateado que cristaliza en forma hexagonal. Descubierto en 1789 por el químico australiano F. J. Muller von Reichenstein y nombrado en 1798 por el químico australiano M. H. Klaproth2. Actúa como fungicida en tratamientos relacionados con la dermatitis. Los compuestos del telurio son teratógenos, pueden ser absorbidos por el cuerpo por medio de la inhalación o por contacto directo. La evaporación a 20ºC es insignificante; sin embargo cuando se dispersa se puede alcanzar rápidamente una concentración dañina de partículas suspendidas en el aire, con el cual forman mezclas explosivas. Reacciona bruscamente con halógenos provocando riesgo de incendio. Efectos secundarios: - Nauseas - Olor a ajo - Boca seca - Somnolencia - Estreñimiento - Gusto metálico - Efectos en el hígado y el SNC - Dolor de cabeza y abdominales - Irritación en los ojos y tracto respiratorio 2 http://www.lenntech.com/espanol/tabla-peiodica/Te.htm INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 3 - 1.3 Antioxidantes Un antioxidante es una sustancia capaz de neutralizar la acción oxidante de los radicales libres, liberando electrones en nuestra sangre que son captados por los radicales libres convirtiéndose en moléculas inestables. La oxidación es una reacción química de transferencia de electrones de una sustancia a un agente oxidante. Las reacciones de oxidación pueden producir radicales libres que comienzan reacciones en cadena que dañan las células. Los antioxidantes terminan estas reacciones quitando intermedios del radical libre e inhiben otras reacciones de oxidación oxidándose ellos mismos. Debido a esto es que los antioxidantes son a menudo agentes reductores tales como tioles o polifenoles. La cantidad de protección proporcionada por cualquier antioxidante depende de su concentración, de su reactividad hacia la especie reactiva del oxígeno y del estado de los antioxidantes con los cuales interactúa. Aunque las reacciones de oxidación son cruciales para la vida, también pueden ser perjudiciales; por lo tanto las plantas y los animales mantienen complejos sistemas de múltiples tipos de antioxidantes, tales como glutatión, vitamina C, vitamina E y enzimas (catalasa, superóxido dismutasa y peroxidasas). Los niveles bajos de antioxidantes o la inhibición de las enzimas antioxidantes causan estrés oxidativo y pueden dañar o matar las células comenzando reacciones químicas en cadena tales como la peroxidación de lípidos u oxidando el ADN o proteínas. Los daños al ADN pueden causar mutaciones mientras que los daños a las proteínas causan la inhibición de enzimas, la desnaturalización y la degradación de proteínas. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 4 - Tabla 1. Especies reactivas del oxígeno. Oxidante Descripción •O2 -, Anión superóxido Formado por la cadena de transporte de electrones. Es poco reactivo, pero puede liberar Fe2+ de proteínas ferrosulfuradas y de la ferritina. H2O2, peróxido de hidrógeno Formado por la dismutación de •O2 - o por reducción directa de O2. Soluble en lípidos. •OH, radical hidroxilo Formado por la reacción de Fenton3 y la descomposición de peroxinitrito. Extremadamente reactivo. ROOH, hidroperóxido orgánico Formado por reacciones de radicales con componentes celulares como lípidos y nucleobases. RO•, alcoxi- y ROO•, peroxi- Producido en presencia de oxígeno por adición de radicales a dobles enlaces o eliminación de hidrógeno. HOCl, ácido hipocloroso Formado a partir de H2O2 por la mieloperoxidasa. Soluble en lípidos y altamente reactivo. Oxida constituyentes de proteínas (grupos tiol, grupos amino y metionina). OONO-, peroxinitrito Formado en una rápida reacción entre •O2 - y NO•. Liposoluble y similar en reactividad al ácido hipocloroso. 1.3.1 Clasificación 4 Se pueden clasificar de acuerdo a su función: - Hidrofílicos.- reaccionan con los oxidantes en el citoplasma celular y el plasma sanguíneo. - Hidrofóbicos.- protegen las membranas de la célula contra la peroxidación de lípidos. Para la neutralización: - Endógenos.- enzimas (proteínas) con capacidad antioxidante que no se consumen al reaccionar con los radicales libres y son dependientes de sus cofactores (cobre, hierro, zinc, magnesio y selenio). 3 H.J.H. Fenton en 1894, es la que se produce al catalizar el peróxido de hidrógeno con hierro, dando como resultado la generación de radicales altamente reactivos del oxhidrilo (-OH). 4 Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin M, Mazur M, Telser J (2007). "Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease". Int J Biochem Cell Biol 39 (1): 44–84. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 5 - - Exógenos.- provienen de la dieta, y a diferencia de las enzimas se consumen al reaccionar con los radicales libres, y deben ser reemplazados. Según la zona donde actúan: - Ejercen su acción a nivel de la membrana lipídica: - Vitamina E - Carotenos - Polifenoles y flavonoides - Actúan en medio acuoso: - Ácido ascórbico (Vitamina C) - Relacionados con metales pesados: - Ferritina - Transferrina - Lactoferrina - Ceruloplasmina 1.3.2 Mecanismos antioxidantes 1.3.2.1 Glutatión Es un péptido5 que contiene cisteína. Tiene características antioxidantes ya que el grupo tiol en su porción de cisteína es un agente reductor y puede ser oxidado y reducido de forma reversible. El glutatión es mantenido en forma reducida por la enzima glutatión reductasa y alternadamente reduce otros metabolitos y sistemas de enzimas así como reacciona directamente con los oxidantes. El sistema incluye glutatión, glutatión reductasa, glutatión peroxidasa y glutatión S- transferasa. La glutatión peroxidasa es una enzima que contiene cuatro cofactores de selenio que catalizan la ruptura del peróxido de hidrógeno y de hidroperóxidos orgánicos. 5 Compuesto formado por dos o más aminoácidos INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 6 - R H + OH H2O R R OO R H + R OOH O2 Propagación Lípido insaturado Lípido radical Lípido peroxil radicalLípido peróxido Iniciación Figura 1. Mecanismo del radical libre en la peroxidación de lípidos6. 1.3.2.2 Sistemas de enzimas Las células son protegidas por una red de enzimas antioxidantes. El superóxido liberado por procesos tales como la fosforilación oxidativa, primero se convierte en peróxido de hidrógeno e inmediatamente se reduce para dar agua. Esta ruta de detoxificación es el resultado de múltiples enzimas con la superóxido dismutasacatalizando el primer paso y luego las catalasas y varias peroxidasas que eliminan el peróxido de hidrógeno. O2 O2 H2O2 H2O Oxígeno Superóxido Peróxido de hidrógeno Agua Superóxido dismutasa Peroxidasas Catalasas Figura 2. Ruta enzimática para la detoxificación de especies reactivas del oxígeno7. 6 http://es.wikipedia.org/wiki/Imagen:Lipid_peroxidation-es.svg INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 7 - 1.3.2.3 Superóxido dismutasa Las superóxido dismutasa (SODs) son enzimas que catalizan la transferencia del anión de superóxido en peróxido de oxígeno y de hidrógeno. Contienen iones metálicos como cofactores que, dependiendo de la isoenzima, pueden ser cobre, zinc, manganeso o hierro. 1.3.2.4 Catalasas Enzimas que catalizan la conversión del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno usando hierro o manganeso como cofactor. Se localiza en los peroxisomas, su cofactor es oxidado por una molécula de peróxido de hidrógeno y después regenerado transfiriendo el oxígeno enlazado a una segunda molécula de sustrato. 1.3.2.5 Peroxirredoxinas Son peroxidasas que catalizan la reducción de peróxido de hidrógeno, hidroperóxido orgánico y peroxinitrito. Se dividen en tres clases: las típicas 2-cisteín peroxirredoxinas; las atípicas 2-cisteín peroxirredoxinas; y las 1-cisteín peroxirredoxinas. Estas enzimas comparten el mismo mecanismo catalítico básico, en el cual una cisteína redox activa en el sitio activo es oxidada a un ácido sulfénico por el sustrato del peróxido. 1.3.2.6 Tiorredoxina Contiene la proteína tiorredoxina de 12-kDa y su tiorredoxina reductasa compañera. El sitio activo de la tiorredoxina consiste en dos cisteínas, como parte de un motivo estructural CXXC altamente conservado que puede ciclar entre una forma activa del ditiol reducida y la forma oxidada del disulfuro. 7 http://es.wikipedia.org/wiki/Imagen:AntioxidantLpathway-es.svg INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 8 - En su estado activo, actúa como un agente de reducción eficiente removiendo especies reactivas del oxígeno y manteniendo otras proteínas en su estado reducido. Después de ser oxidado, la tiorredoxina activa es regenerada por la acción de la tiorredoxina reductasa, usando NADPH como donante de electrones. 1.4 Radicales libres Los radicales libres son átomos o grupos de átomos que tienen un electrón (e-) desapareado con capacidad de aparearse, por lo que son muy reactivos. Generalmente son átomos de oxigeno (O2) con 7 electrones, los cuales, al faltarles un electrón, buscan completar su octeto, tomándolo prestado de la membrana celular, produciendo así otro radical libre dando lugar a una reacción en cadena. Esta reacción en cadena se combate con la acción de los antioxidantes, los cuales neutralizan los átomos de oxigeno. Los radicales libres recorren el organismo intentando robar un electrón de las moléculas estables, con el fin de alcanzar su estabilidad electroquímica, una vez conseguido, la molécula estable que se lo cede se convierte a su vez en un radical libre, por quedar con un electrón desapareado, iniciándose así una verdadera reacción en cadena que destruye las células. La vida biológica media del radical libre es de microsegundos; pero tiene la capacidad de reaccionar con todo lo que esté a su alrededor provocando un gran daño a las moléculas y a las membranas celulares. 1.4.1 Clasificación Existen dos tipos: Internos: • Ejercicio muy intenso, • Estrés, • Propios del metabolismo. Externos: • Mala dieta ó alimentación • Consumo de tabaco • Consumo de alcohol • Medicamentos • Contaminación • Exceso de exposición solar INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 9 - 1.4.2 Daños por radicales libres Envejecimiento: las membranas de las células epiteliales se modifican, y así se ve dificultada la nutrición de la piel, también se ven dañadas las células de colágeno y elastina, perdiendo firmeza y elasticidad. Problemas en el sistema cardiovascular: aparición de arterioesclerosis8 por el endurecimiento de las paredes arteriales. Afecta a la pared endotelial, no pudiendo realizar sus funciones correctamente. Problemas en el sistema nervioso: el impulso nervioso se ve disminuido, al igual que los reflejos, la memoria y el aprendizaje, si disminuye la irrigación sanguínea a nivel del sistema nervioso se puede llegar a padecer demencia senil. Figura 3. Dos mitocondrias. Izq. joven y saludable. Dcha. envejecida por acción de los radicales libres9. 8 Endurecimiento y pérdida de elasticidad de la pared arterial. 9 Parnham, M.J., Graf, E. Seleno-organic compounds and the therapy of hydroperoxide-linked pathological conditions. Biochem Pharmacol 36 3095-3102 (1987) INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 10 - 1.5 Estrés oxidativo Es causado por un desequilibrio entre la producción de oxígeno reactivo y la capacidad de un sistema biológico de detoxificar rápidamente los reactivos intermedios o reparar el daño resultante. Existe un entorno reductor dentro de las células, preservado por las enzimas que mantienen el estado reducido a través de un constante aporte de energía metabólica. Desbalances en este estado normal redox pueden causar efectos tóxicos a través de la producción de peróxidos y radicales libres que dañan a todos los componentes de la célula, incluyendo las proteínas, los lípidos y el ADN. El estrés oxidativo está involucrado en muchas enfermedades, como la aterosclerosis, Parkinson, Alzheimer y también puede ser importante en el envejecimiento. Las especies reactivas de oxígeno pueden resultar beneficiosas ya que son utilizadas por el sistema inmunitario como un medio para atacar y matar a los patógenos. ONOO O2 NO SOD H2O2 O2 Catalasa H2O + ½O2 + H2O 2H2O + GSSG GSH-peroxidasa + GSH OH Fe2+, Cu+ RH R + H2O O2 ROO vitamina E ROOH GSH-peroxidasa +GSH ROH + H2O + GSSG Reacción de detoxif icación de ROS Reacción de desintoxicación de ROS Figura 4. Las especies reactivas del oxígeno y su sistema de detoxificación. SOD: superóxido dismutasa, GSH-peroxidasa: glutatión peroxidasa. Si este sistema es desbordado, surge una situación de estrés oxidativo10. 10 http://es.wikipedia.org/wiki/Imagen:Systeme_detox_ROS.GIF INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 11 - 1.6 Usos del ebselen y sus derivados El ebselen es un imitador de la enzima glutatión peroxidasa, inhibe la ciclooxigenasa y lipooxigenasas a concentraciones micromolares. Figura 5. Estructura tridimensional del ebselen. Existen tres métodos para la síntesis del ebselen, los cuales son: - o-litiación del benzanilido, inserción del selenio, y ciclización oxidativa. - síntesis de radical libre alcanzada por la ciclización t-butílica. - procedimiento divulgado por Lesser y Weiss11. 1.6.1 Antioxidantes y agentes antiinflamatorios El ebselen es un compuesto antiinflamatorio que ha experimentado ensayos clínicos de la fase III como agente neuroprotector y pronto podrá convertirse en el primer terapéutico sintético del organoselenio lanzado en el mercado. Actúa como imitador del glutatión peroxidasa (GPx) reduciendo los hidroperóxidos al agua o al alcohol correspondiente. La actividad se puede alterar modificando su estructura, por ejemplo, la substitucióndel átomo de hidrógeno con un nitro ocupando la posición orto al selenio (114, Figura 6) aumenta la actividad de GPx de ebselen. Figura 6. Modificación del ebselen, 7-nitro-2-phenylbenzo[d][1,2]selenazol-3(2H)-one12. 11 Matill HA (1947). Antioxidants. Annu Rev Biochem 16: 177–192. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 12 - 1.6.2 Inhibidores enzimáticos Los inhibidores enzimáticos inhiben una variedad de enzimas tales como el óxido nítrico sintasa, deshidrogenasa del monofosfato de la inosina (IMDPH), lipooxigenasas (LOX), fosforilasa de la uridina (UrdPase), cinasa de la tirosina (TK), glutatión-S-transferasa (GST), reductasa del NADPH-citocromo y papaína. Los compuestos relacionados del organoselenio, entre ellos el análogo carboxilado (127, Figura 7), se ha divulgado para ser inhibidor endotelial. Además, se estudia algún otro benzisoselenazol-3(2H)-uno (128-135, Figura 7) evaluando sus características inhibitorias en anillos aórticos de conejo. Los derivados de selenourea, entre ellos el 2- aminoselenazoline (136, Figura 7) inhibidores potentes del oxido nítrico sintasa (iNOS). Figura 7. Compuestos análogos del ebselen13. 1.6.3 Agentes antiinfecciosos El selenio forma parte de algunos antivirales, generalmente bajo la forma de inhibidores de la ligasa del nucleósido (150, Figura 8). El 7-azabenzisoselenasol-3(2H)-uno (151, Figura 8) (substituido en la posición 2 con los grupos fenilos o alquílicos) y los metiodides (152, Figura 8), les fueron encontradas propiedades inhibidoras del virus herpes simples 12 Matill HA (1947). Antioxidants. Annu Rev Biochem 16: 177–192. 13 Matill HA (1947). Antioxidants. Annu Rev Biochem 16: 177–192. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 13 - tipo 1 (HSV-1) y del virus de la encefalomiocarditis (EMCV), teniendo una actividad inhibitoria más potente que ebselen. Figura 8. Ejemplos de agentes antiinfecciosos. Las actividades antibacterianas de ebselen y otros benzisoselenazo-3(2H)-uno contra bacterias gram positivas y gram negativas, deben su acción a la reactividad con los grupos de azufre esenciales. El ebselen así como el análogo p-cloro (154, Figura 9) exhibió actividad inhibitoria contra el crecimiento de hongo Saccharomyces cerevisiae. Figura 9. Agente antiinfeccioso. 1.6.4 Inductores e inmunomoduladores de Citoquina Algunas citoquinas como las interleuquinas (ILs), los interferones (IFNs) y necrosis de tumor (TNFs) son los estimulantes que desempeñan un papel importante en el sistema inmunológico. El ebselen y otros benzisoselenazoles-3(2H)-uno (155 y 156, Figura 10) inducen las citoquinas IL-2, IL-6, TNF-α e IFN-γ en los leucocitos de la sangre. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 14 - Figura 10. Agentes inductores de la citoquina14. 1.6.5 Agentes antitumorales No hay compuestos sintéticos del organoselenio en uso clínico como agentes anticancerígenos. La aplicabilidad para el control de los tumores se ha demostrado únicamente en sistemas con una estructura química conformada por anillos de cinco miembros. La búsqueda para los agentes antitumorales nuevos dio lugar al desarrollo de dos nuevos compuestos inesperados (143 y 144, Figura 11), probados contra crecimiento de tumor en ratón modelo. Ambos inhibieron el crecimiento de la leucemia del ratón P388 en la dosis 100µg/ratón/día sin la exhibición de ninguna toxicidad. Los 2,4-disustituidos de los selenazoles (145 y 146, Figura 11), fueron evaluados in vitro, determinando su capacidad antitumoral de inhibir la proliferación de las células L1210, portadoras de la leucemia. Figura 11. Ejemplos de agentes antitumorales. 14 Matill HA (1947). Antioxidants. Annu Rev Biochem 16: 177–192. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 15 - 2. JUSTIFICACIÓN. Se pretende el desarrollo y obtención de compuestos análogos al ebselen, cuyo potencial antioxidante sea superior al este. El hecho de llevar a cabo la síntesis del ebselen (benzisoselenazol-3(2H)-uno, figura 12) nos permite obtener moléculas bioactivas con actividad antioxidante. Las características de dicho compuesto, dependerán de la sustitución del radical R, proporcionándonos compuestos con diversas características, como pueden ser: � Inductores e inmunomoduladores de la citoquina. � Antioxidantes � Antiinflamatorios � Inhibidores enzimáticos � Agentes antitumorales � Agentes antiinfeciosos Figura 12. Esquema del ebselen INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 16 - 3. OBJETIVOS. General: � Sintetizar heterociclos de selenio y telurio con actividad antioxidante. Específicos: � Caracterización de los compuestos heterocíclicos por RMN de 1H y 13C. � Realizar la síntesis del ebselen basados en la metodología divulgada por Lesser y Weiss. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 17 - 4. MATERIALES. � S molecular � Se molecular � Te molecular � Ácido 2-amino-3metil benzoico � Acido 2-amino-5metil benzoico � Ácido 2-amino-6metil benzoico � L-Glutamina � NaH � DMF � K2CO3 � NaNO2 � HCl � H2O destilada � CH2Cl2 � Acetonitrilo � SOCl2 � P2O5 � CDCl3 � DMSOd6 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 18 - 5. DESARROLLO EXPERIMENTAL. 5.1. Síntesis del ebselen empleando el ácido 2-amin o-3-metil benzoico y Se 1. Colocar en un matraz balón 0.2g de Se y 0.12g de NaH, adicionar 15ml de DMF y reflujar 2 horas a una temperatura de 70°C. 2. Preparar las siguientes soluciones y enfriarlas a -5ºC en baño de hielo: Solución 1: 0.2g de ácido 2-amino-3-metil benzoico, en 0.08g de K2CO3 en 4ml de H2O Solución 2: 0.08g de NaNO2 en 0.6ml de H2O Solución 3: 2ml de HCl en 12.5 ml de H2O 3. Verter la solución 2 sobre la solución 1 y agitar, posteriormente a la solución anterior verter lentamente la solución 3 manteniendo una temperatura de -5°C. 4. Transcurrido el tiempo del reflujo (paso 1) enfriar y verter la solución del paso 3. 5. Filtrar al vacío. El sólido obtenido transferirlo a un vial para su posterior análisis y el líquido obtenido transferirlo a un embudo de separación y añadir CH2Cl2 para separar las fases. 6. Colocar la fase orgánica en un matraz balón, agregarle 6 ml de SOCl2 y reflujar durante 3 horas teniendo cuidado de no inhalar los vapores que desprende. 7. Transcurrido el tiempo del reflujo (paso 6) añadir la amina disuelta en acetonitrilo y agitar, mantener a temperatura ambiente durante 1.5 horas. 8. Evaporar la solución anterior hasta la obtención de un sólido en el matraz y transferir a un vial los residuos sólidos de la evaporación. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 19 - 5.2. Síntesis del ebselen empleando el ácido 2-amin o-3-metil benzoico y Te 1. Colocar en un matraz balón 0.2g de Te y 0.12g de NaH, adicionar 15ml de DMF y reflujar 2 horas a una temperatura de 70°C. 2. Preparar las siguientes soluciones y enfriarlas a -5ºC en baño de hielo: Solución 1: 0.2g de ácido 2-amino-3-metil benzoico, en 0.08g de K2CO3 en 4ml de H2OSolución 2: 0.08g de NaNO2 en 0.6ml de H2O Solución 3: 2ml de HCl en 12.5 ml de H2O 3. Verter la solución 2 sobre la solución 1 y agitar, posteriormente a la solución anterior verter lentamente la solución 3 manteniendo una temperatura de -5°C. 4. Transcurrido el tiempo del reflujo (paso 1) enfriar y verter la solución del paso 3. 5. Filtrar al vacío. El sólido obtenido transferirlo a un vial para su posterior análisis y el líquido obtenido transferirlo a un embudo de separación y añadir CH2Cl2 para separar las fases. 6. Colocar la fase orgánica en un matraz balón, agregarle 6 ml de SOCl2 y reflujar durante 3 horas teniendo cuidado de no inhalar los vapores que desprende. 7. Transcurrido el tiempo del reflujo (paso 6) añadir la amina disuelta en acetonitrilo y agitar a temperatura ambiente durante 1.5 horas. 8. Evaporar la solución anterior hasta la obtención de un sólido en el matraz y transferir a un vial los residuos sólidos de la evaporación. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 20 - 5.3. Síntesis del ebselen empleando el ácido 2-amin o-5-metil benzoico y Se 1. Colocar en un matraz balón 0.2g de Se y 0.12g de NaH, adicionar 15ml de DMF y reflujar 2 horas a una temperatura de 70°C. 2. Preparar las siguientes soluciones y enfriarlas a -5ºC en baño de hielo: Solución 1: 0.2g de ácido 2-amino-5-metil benzoico, en 0.08g de K2CO3 en 4ml de H2O Solución 2: 0.08g de NaNO2 en 0.6ml de H2O Solución 3: 2ml de HCl en 12.5 ml de H2O 3. Verter la solución 2 sobre la solución 1 y agitar, posteriormente a la solución anterior verter lentamente la solución 3 manteniendo una temperatura de -5°C. 4. Transcurrido el tiempo del reflujo (paso 1) enfriar y verter la solución del paso 3. 5. Filtrar al vacío. El sólido obtenido transferirlo a un vial para su posterior análisis y el líquido obtenido transferirlo a un embudo de separación y añadir CH2Cl2 para separar las fases. 6. Colocar la fase orgánica en un matraz balón, agregarle 6 ml de SOCl2 y reflujar durante 3 horas teniendo cuidado de no inhalar los vapores que desprende. 7. Transcurrido el tiempo del reflujo (paso 6) añadir la amina disuelta en acetonitrilo y agitar a temperatura ambiente durante 1.5 horas. 8. Evaporar la solución anterior hasta la obtención de un sólido en el matraz y transferir a un vial los residuos sólidos de la evaporación. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 21 - 5.4. Síntesis del ebselen empleando el ácido 2-amin o-6-metil benzoico y Se 1. Colocar en un matraz balón 0.2g de Se y 0.12g de NaH, adicionar 15ml de DMF y reflujar 2 horas a una temperatura de 70°C. 2. Preparar las siguientes soluciones y enfriarlas a -5ºC en baño de hielo: Solución 1: 0.2g de ácido 2-amino-6-metil benzoico, en 0.08g de K2CO3 en 4ml de H2O Solución 2: 0.08g de NaNO2 en 0.6ml de H2O Solución 3: 2ml de HCl en 12.5 ml de H2O 3. Verter la solución 2 sobre la solución 1 y agitar, posteriormente a la solución anterior verter lentamente la solución 3 manteniendo una temperatura de -5°C. 4. Transcurrido el tiempo del reflujo (paso 1) enfriar y verter la solución del paso 3. 5. Filtrar al vacío. El sólido obtenido transferirlo a un vial para su posterior análisis y el líquido obtenido transferirlo a un embudo de separación y añadir CH2Cl2 para separar las fases. 6. Colocar la fase orgánica en un matraz balón, agregarle 6 ml de SOCl2 y reflujar durante 3 horas teniendo cuidado de no inhalar los vapores que desprende. 7. Transcurrido el tiempo del reflujo (paso 6) añadir la amina disuelta en acetonitrilo y agitar a temperatura ambiente durante 1.5 horas. 8. Evaporar la solución anterior hasta la obtención de un sólido en el matraz y transferir a un vial los residuos sólidos de la evaporación. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 22 - 6. RESULTADOS - Espectro experimental de RMN de 13C del intermediario III-A. Figura 13. Espectro experimental de RMN de 13C en CDCl3 del intermediario III-A. - Espectro teórico de RMN de 13C del intermediario III-A. 20406080100120140160180 PPM Figura 14. Espectro comparativo teórico de RMN de 13C, del intermediario III-A. 8 2 6 5 1 4 3 7 8 2 6 5 1 4 3 7 5 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 23 - - Espectro experimental de RMN de 1H del intermediario III-A. Figura 15. Espectro experimental de RMN de 1H en CDCl3 del intermediario III-A. - Espectro teórico de RMN de 1H del intermediario III-A. 246810 PPM Figura 16. Espectro comparativo teórico de RMN de 1H, del intermediario III-A. 5 4 2 3 1 1 3 2 4 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 24 - - Espectro experimental de RMN de 13C del intermediario VI-A. Figura 17. Espectro experimental de RMN de 13C en CDCl3 del intermediario VI-A. - Espectro teórico de RMN de 13C del intermediario VI-A. 20406080100120140160 PPM Figura 18. Espectro comparativo teórico de RMN de 13C, del intermediario VI-A. 8 6 4 5 2 1 3 7 8 6 7 3 1 5 4 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 25 - - Espectro experimental de RMN de 1H del compuesto VI-A. Figura 19. Espectro experimental de RMN de 1H en CDCl3 del intermediario VI-A. - Espectro teórico de RMN de 1H del intermediario VI-A. 246810 PPM Figura 20. Espectro comparativo teórico de RMN de 1H, del intermediario VI-A. 5 3 4 2 1 1 2 4 3 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 26 - - Espectro experimental de RMN de 1H del intermediario III-B. Figura 21. Espectro experimental de RMN de 1H en CDCl3, del intermediario III-B. - Espectro teórico de RMN de 1H del intermediario III-B. 246810 PPM Figura 22. Espectro comparativo teórico de RMN de 1H, del intermediario III-B. 5 4 2 3 1 1 3 2 4 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 27 - - Espectro experimental de RMN de 13C del intermediario VI-C. Figura 23. Espectro experimental de RMN de 13C en CDCl3 del intermediario VI-C. - Espectro teórico de RMN de 13C del intermediario VI-C. 20406080100120140160 PPM Figura 24. Espectro comparativo teórico de RMN de 13C, del intermediario VI-C. 8 6 4 2 1 5 3 7 7 8 6 4 2 1 5 3 5 4 3 2 1 6 7 8 S S OH O O OH CH3 CH3 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 28 - - Espectro experimental de RMN de 13C del intermediario V-C. Figura 25. Espectro experimental de RMN de 13C en CDCl3 del intermediario V-C. - Espectro teórico de RMN de 13C del intermediario V-C. 20406080100120140160 PPM Figura 26. Espectro comparativo teórico de RMN de 13C, del intermediario V-C. 8 5 4 2 6 1 7 3 8 5 4 6 2 3 1 7 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 29 - - Espectro experimental de RMN de 13C del ebselen VI-B. Figura 27. Espectro experimental de RMN de 13C en DMSOd6, del compuesto final (ebselen) VI-B. - Espectro teórico de RMN de 13C del ebselen VI-B. 20406080100120140160180 PPM Figura 28. Espectro comparativo teórico de RMN de 13C, del compuesto final (ebselen) VI-B. 10 8 6 1 2 4 5 3 9 12 11 7 7 11 12 9 810 6 2 1 4 5 3 13 13 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 30 - - Espectro experimental de RMN de 1H del ebselen VI-B. Figura 29. Espectro experimental de RMN de 1H en DMSOd6 del compuesto final (ebselen) VI-B. - Espectro teórico de RMN de 1H del ebselen VI-B. 246810 PPM Figura 30. Espectro comparativo teórico de RMN de 1H, del compuesto final (ebselen) VI-B. 9 2 4 3 7 5 7 1 6 7 8 6 1 5 2 4 3 8 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 31 - 7. DISCUSIÓN Los compuestos sintetizados se caracterizaron por medio de resonancia magnética nuclear (RMN) de Hidrógeno 1 (1H) y Carbono 13 (13C). Observándose en los espectros obtenidos que las síntesis fueron logradas con éxito. La formación de los compuestos se realizaba en una atmósfera reductora con hidrógeno, evitando de este modo la oxidación de cada uno de los intermediarios para la obtención del ebselen. Del mismo modo, la adicción de los reactivos en algunos pasos de la síntesis, por ejemplo, la adición de la sal de diazonio al reflujo del Se e NaH, se realizó por cánula, para evitar que los compuestos se oxidaran. Los compuestos fueron lavados con solventes orgánicos, como por ejemplo el CH2Cl2, CDCl3, DMSOd6, para separar las fases, obteniendo así una fase orgánica con la que se continuaría la síntesis, y desechando la fase inorgánica. Los solventes utilizados en el proyecto fueron destilados para aumentar su pureza, el material de vidrio empleado fue perfectamente lavado y enjuagado con acetona, posteriormente fue introducido a la estufa para evitar que el material contuviera residuos de cualquier sustancia que pudiera provocar una alteración en los resultados. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 32 - 8. CONCLUSIONES � Los espectros de resonancia magnética de 1H y 13C indican que las síntesis que se llevaron a cabo se realizaron de manera satisfactoria, obteniendo gran pureza, al observar que las demás señales que aparecen en dichos espectro solo son de los solvente empleados. � Se lograron sintetizar y caracterizar los intermediarios para la obtención del ebselen y los compuestos finales. � La síntesis de heterociclos de selenio, teluro y azufre se realizó con éxito, esto se comprueba en los espectros de resonancia magnética de 1H y 13C de los intermediarios y del compuesto final. � Se comprobó que por el método de Lesser y Weiss se pueden obtener heterociclos de 5 miembros de selenio y teluro de forma rápida y sencilla, en comparación teórica con los demás métodos. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 33 - 9. BIBLIOGRAFÍA. � Aldrich, (1994-1995). “Catálogo Manual de Productos Químicos Finos”. Editorial Sigma-Aldrich Química, S.A. de C.V. México. � Emsley Jonh (2001). “Las piezas de construcción de la Naturaleza: Guía de los Elementos de la A a la Z. Nature’s Buildiing Blocks. � Et. Al. (2000). “Food and Nutrition Board. Dietary Reference Intakes: Vitamin C, Vitamin E, Selenium, and Carotenoids”. Institute of Medicine. Editorial National Academy Press. Washington, DC. � Finkel T., Holbrook N.J. (2000). "Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing". Nature Vol. 408 Tomo 6809. pp. 239-47. � Goldhaber S.B. (2003), “Trace element risk assessment: essentiality vs. Toxicity”. Regulatory Toxicology and Pharmacology. Vol. 38. pp. 232-42. � Matill H.A. (1947). “Antioxidants”. Annu Rev Biochem Vol. 16. pp. 177–192. � Meister A. (1988). "Glutathione metabolism and its selective modification". J Biol Chem Vol. 263 Tomo 33. pp. 17205–17208. � Parnham M.J., Graf E. (1987), “Seleno-organic compounds and the therapy of hydroperoxide-linked pathological conditions”. 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V-C: ácido antranílico substituído en la posición 5 y azufre. VI-A: ácido antranílico substituído en la posición 6 y selenio. VI-B: ácido antranílico substituído en la posición 6 y telurio. VI-C: ácido antranílico substituído en la posición 6 y azufre. CDCl3: cloroformo deuterado, Aldrich CH2Cl2: dicloro metano, Aldrich DMF: dimetilformamida, Aldrich DMSOd6: (CH3SOCH3) dimetil sulfóxido deuterado, Aldrich Ebselen: benzisoselenazol-3(2H)-uno HCl: ácido clorhídrico, Aldrich H2O destilada: agua destilada K2CO3: carbonato de potasio, Aldrich NaH: hidruro de sodio, Aldrich INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 36 - NaNO2: nitrito de sodio, Aldrich P2O5: pentóxido de fósforo, Aldrich S: azufre, Aldrich Se: selenio molecular, Aldrich SOCl2: cloruro de tionilo, Aldrich Te: telurio molecular, Aldrich INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 37 - ANEXO I ESQUEMA DE REACCIÓN. � Síntesis del ebselen empleando el ácido 2-amino-3-m etil benzoico. a. Obtención del compuesto A1. b. Obtención de la sal de diazonio B1. c. Formación del ácido C1. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 38 - d. Halogenación D1. e. Reacción con la amina E1. Cl O Se Cl CH3 2 + H2N O H2N O HO 2 2 + 4HCl CH3 Se N O H2N HO O O � Síntesis del ebselen empleando el ácido 2-amino-5-m etil benzoico. a. Obtención del compuesto A2. b. Obtención de la sal de diazonio B2. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 39 - c. Formación del ácido C2. d. Halogenación D2. e. Reacción con la amina E2. Cl O Se Cl 2 + H2N O H2N O HO 2 2 + 4HCl H3C Se N O H2N HO O O H3C � Síntesis delebselen empleando el ácido 2-amino-6-m etil benzoico. a. Obtención del compuesto A3. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 40 - b. Obtención de la sal de diazonio B3. c. Formación del ácido C3. d. Halogenación D3. e. Reacción con la amina E3. Cl O Se Cl 2 + H2N O H2N O HO 2 2 + 4HCl CH3 Se N O H2N HO O O CH3 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología - 41 - ANEXO II CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES 2008 2009 Actividad Jun Jul Ago Sep Oct Nov Dic Ene Feb Revisión bibliográfica x x x x X x x x x Acondicionamiento del equipo x Obtención del 1er intermediario de Se y Te x Caracterización de los intermediarios por RMN x Obtención del 2do intermediario X Caracterización del 2do intermediario por RMN x Obtención del ebselen x Caracterización del ebselen por RMN x Determinación de la capacidad antioxidante del ebselen x Con la preparación que he obtenido a lo largo de mi carrera profesional y que hoy finaliza, el día de mañana les recompensaré el esfuerzo, el amor y el sacrificio que me han brindado, y cuando su cabello blanco aparezca en sus cabecitas señal de los años dorados, seguiré a su lado para seguirlos amando y venerando por siempre, gracias por tanto y tanto amor…
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