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DISEÑO DE MICROARREGLOS PARA LA DETECCIÓN DE HAPLOGRUPOS HUMANOS EN RESTOS OSEOS 
ANTIGUOS DE POBLACIONES AMERINDIAS 
 
Juan-José Alcalá-Huerta1,2, María de Lourdes Muñoz Moreno*2 
1.-Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología, Instituto Politécnico Nacional (IPN). 
2.-Departamento de Genética y Biología Molecular, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), Instituto Politécnico 
Nacional. Av. Instituto Politécnico Nacional 2508, San Pedro Zacatenco, Gustavo A. Madero, México D. F. 07360, Tel. 57473335, Fax. 57473392. 
 
Palabras clave: microarreglos, antropología molecular, haplogrupos, SNP, ADNmt, mitocondrial. 
 
Introducción. Un microarreglo, según el diseño, permite obtener 
información sobre el comportamiento transcripcional de miles de 
genes simultáneamente y/o la composición genómica de los 
organismos en estudio en un área de superficie reducida. Su 
sensibilidad, especificidad y capacidad de discriminación entre las 
moléculas involucradas (3) permitió diseñar un microarreglo para la 
identificación de los principales haplogrupos mitocondriales de 
nativos americanos. La baja reproducibilidad en cualquier proceso 
eleva los costos y dificulta la interpretación de los resultados. Por ello 
para evitar las variaciones que se presentan normalmente durante la 
deposición de las muestras en los microarreglos se probaron 
diferentes soluciones con sustancias detergentes y/o 
desnaturalizantes para la deposición de material genético. 
 
Metodología. El material óseo fue sometido a limpieza por abrasión 
mecánica y radiación UV para eliminación de restos orgánicos y 
material genético exógeno. La muestras corresponden a: Entierro B, 
Cueva del Tecolote (Huapacalco, Hidalgo; m1); Peñon III, (Ciudad de 
México; m2). La extracción de ADN total antiguo y moderno se realizó 
por los método de fenol-cloroformo, alcohol isoamílico y de Chelex 
respectivamente descritos previamente (1). Los individuos control en 
estudio presentaron alguno de los 4 haplogrupos de interés. Las 
regiones para cada haplogrupo en ADN antiguo como moderno se 
amplificaron de acuerdo a previos reportes (2), para después 
depositarlos en la laminilla del microarreglo usando diferentes 
soluciones: CHAPS 1.6 mM, CHAPS 16 mM, DMSO, formamida, 
DMSO/ formamida, DMSO/CHAPS 1.6 mM, DMSO/CHAPS 16 mM, 
formamida/CHAPS 16 mM. Para las pruebas de hibridación se 
utilizaron sondas previamente diseñadas específicas para determinar 
los haplogrupos mitocondriales humanos A, C y D. 
 
Resultados y discusión. Los estudios en ADN antiguo se confrontan 
con problemas de degradación, contaminación y baja concentración 
disponible. Se pudo extraer y amplificar ADN antiguo de muestras 
óseas de alrededor de 12500 años de antigüedad. Para la deposición 
se eligieron las soluciones que mostraron una señal homogénea en 
su forma, intensidad y reproducibilidad. La formamida permitió mayor 
reproducibilidad y homogeneidad en la señal en comparación con el 
DMSO. El CHAPS como detergente no incremento de manera 
apreciable la fluorescencia inespecífica. Se descartaron 
contribuciones debidas al robot en las diferencias morfológicas al 
comparar resultados entre laminillas duplicadas. Las soluciones con 
detergentes como aditivo produjeron la mayor homogeneidad en la 
morfología de los depósitos. La reproducibilidad se mejoró con la 
combinación de detergentes y solventes como CHAPS y DMSO 
(Figura 1). Los mejores resultados se presentaron con las soluciones 
de DMSO/ formamida y DMSO/CHAPS 1.6 mM, prefiriendo la última 
por las propiedades teratogénicas de la formamida. 
 
 
 
 
 
Figura 1. Ejemplo de la señal generada para la deposición de 
muestras con diferentes soluciones. Izquierda, DMSO/Chaps 1.6 mM; 
centro, control negativo; derecha, DMSO 100%. 
 
Finalmente se realizaron pruebas de hibridación con ADN mkoderno 
y antiguo, logrando obtener el haplogrupo en ADN de orígen 
contemporáneo, de individuos control, y antiguo (Figura 2) obteniendo 
la identificación del haplogrupo C.. 
F4 
 
Figura 2. Resultados de la hibridación con las sondas. Lectura 
realizada para la sonda marcada con HEX (532 nm,550LP). Muestras 
E3, E4, F1, F2: ADN moderno; muestra F4: ADN antiguo. 
 
Conclusiones y perspectivas. La solución óptima para la deposición 
de ADN antiguo fue DMSO/CHAPS 1.6 mM. El microarreglo diseñado 
es capaz de determinar los haplogrupos mitocondriales A, C y D. Las 
perspectivas son validar el microarreglo para comprobar la veracidad 
de los resultados y diseñar un microarreglo capaz de identificar todos 
los polimorfismos mitocondriales utilizados para análisis filogenéticos 
en poblaciones nativas americanas. 
 
Agradecimientos. Dra. Ma. De Lourdes Muñoz M. °, Dr. Álvaro Díaz 
B. °, Lic. Miguel Moreno G. °, Dra. Guadalupe Ramírez S., M. en C. 
Mauro López A. °, Dr. Víctor Altuzar °°, Lic. Ma. Concepción Morales 
°, Lic. Diana Bustos R.° ° CINVESTAV-IPN, °° Universidad 
Veracruzana. 
 
Referencias. 
1. Muñoz M.L., Moreno-Galeana, M., Díaz-Badillo A., Loza- 
Martínez, I., Macías-Juárez, V.M., Márquez-Morfín, L., Jiménez- 
López, J.C. y Martínez-Meza, A. En Aluja Pilar, Malgosa 
Asunción, y Nogués Ramón (Coord.), Antropología y 
Biodiversidad. Volumen 2, Barcelona España 2003. Ediciones 
Bellaterra pp.170-182. 
2. Torroni, A.; Schurr, T.; Yang, C., Szathmary, E.; Williams, R.; 
Schanfield, M.; Troup, G.; Knowler, W., Lawrence, D.; Weiss, K. 
y Wallace, D. 1992. Genet. 130: 153-162. 
3. Urakawa, H.; Noble P.A.; El-Fantroussi, S.; Kelly, J.J. y Stahli, 
D.A. 2002.. Appl. Environ. Microbiol. 68: 235-244. 
 
CONTENIDO 
 
JUAN JOSÉ ALCALÁ HUERTA 
 
 
 
 
 
 
 
 
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA 
 
 
 
 
 
 
 
DISEÑO DE MICROARREGLOS PARA LA DETECCIÓN DE 
HAPLOGRUPOS HUMANOS EN RESTOS OSEOS ANTIGUOS 
DE POBLACIONES NATIVAS AMERICANAS 
 
 
 
 
INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA 
 
MODALIDAD DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN. 
 
 
 
 
 
 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
INGENIERO BIOTECNÓLOGO. 
 
 
 
 
 
PRESENTA: 
 
 
 
DIRECTOR DE PROYECTO: Dra. María de Lourdes Muñoz Moreno (CINVESTAV-IPN). 
ASESOR INTERNO: Dra. María Guadalupe Ramírez Sotelo (UPIBI-IPN). 
EVALUADOR: M. en C. Patricia Vázquez Lozano (UPIBI-IPN). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
México, DF., Mayo del 2008 
CONTENIDO 
 
 
Pág. 
 
RESUMEN 1 
 
I. INTRODUCCIÓN 2 
 
1.1 MICROARREGLOS 2 
 
1.1.1 ELABORACIÓN DE MICROARREGLOS 2 
 
1.1.1.1 Sondas 3 
 
1.1.1.2 Fabricación de Microarreglos 3 
 
1.1.1.2.1 Microarreglos por síntesis in situ 3 
 
1.1.1.2.2 Microarreglos por deposición 3 
 
1.1.1.3 Soporte 4 
 
1.1.1.4 Recubrimiento del soporte 4 
 
1.1.1.5 Impresión 4 
 
1.1.1.6 Deposición 4 
 
1.1.1.7 Robot 4 
 
1.1.1.7 Aplicadores 5 
 
1.1.1.8 Fijación 5 
 
1.1.2 HIBRIDACIÓN 5 
 
1.1.3 LAVADO 5 
 
1.1.4 LECTURA 5 
 
1.2 ADN ANTIGUO 6 
 
1.2.1 ADN MITOCONDRIAL 9 
 
1.2.2 RECOMBINACIÓN 10 
 
1.2.3 POLIMORFISMOS 10 
 
1.2.4 HAPLOGRUPOS 10 
 
1.2.5 CONTAMINACIÓN 10 
 
1.2.6 INHIBIDORES 11 
 
II. JUSTIFICACIÓN 12 
 
III. OBJETIVOS 14 
 
IV. METODOLOGÍA 15 
 
4.1 OBTENCIÓN DE ADN 15 
 
4.2 AMPLIFICACIÓN DE ADN 15 
 
4.3 ELECTROFORESIS 16 
 
4.4 DETERMINACIÓN DE HAPLOGRUPOS 16 
 
4.5 INICIADORES DE LA PCR 16 
4.6 DEPOSICIÓN DEL ADN 16 
 
4.7 INMOVILIZACIÓN 17 
 
4.8 DESNATURALIZACIÓN 17 
 
4.9 HIBRIDACIÓN 17 
 
4.10 LAVADO 17 
 
4.11 ADQUISICIÓN DE LA IMAGEN 18 
 
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 20 
 
5.1 ADN ANTIGUO 21 
 
5.2 SOLUCIONES PARA IMPRESIÓN 26 
 
5.3 SONDAS 30 
 
5.4 PURIFICACIÓN DEL ADN 38 
 
5.5 PROCESO DE FABRICACIÓN DEL MICROARREGLO 39 
 
5.6 HIBRIDACIÓN 40 
 
VI. CONCLUSIONES 45 
 
VII. PERSPECTIVAS 46 
 
ANEXOS 
ÍNDICE DE TABLAS 
 
 
 
Tabla Página 
 
 
Tabla 1 Distribución general de las muestras en la laminilla para 28 
prueba con las diferentes soluciones para la inmovilización 
del ADN. 
 
 
Tabla2 Temperaturas de fusión teóricas para cada una de las 35 
 
sondas. 
 
 
Tabla 3 Marcas fluorescentes evaluadas para el marcaje de 36 
 
oligonucleótidos 
 
 
Tabla 4 Equipo disponible para evidenciar la hibridación. 37 
 
 
Tabla 5 Características de los fluoróforos destinados al marcaje de 37 
 
las sondas. 
 
 
Tabla 6 Fluoróforos compatibles con los láseres disponibles. 38 
 
 
Tabla 7 Longitud, secuencia y marcaje de las sondas para 38 
determinar los polimorfismos de un sólo nucleótido 
característico de cada haplogrupo. 
ÍNDICE DE FIGURAS 
 
 
 
Figura Página 
 
 
 
Figura 1 Mapa del ADN mitocondrial humano. 11 
 
Figura 2 Procedimiento experimental. 19 
 
Figura 3 Amplificados de ADNmt. 22 
 
Figura 4 Amplificados de ADNmt. 22 
 
Figura 5 Optimización de la amplificación de ADN moderno. 24 
 
Figura 6 Extracción de ADN antiguo. 24 
 
Figura 7 Visualización de la calidad del ADN a partir de las 25 
extracciones. Presencia de contaminantes. 
Figura 8 Electroforesis. Presencia de contaminantes en el ADN 25 
antiguo. 
Figura 9 Vista general de la impresión de ADN para la 26 
 
optimización de la inmovilización. 
 
Figura 10 Distribución del Microarreglo de la Figura 9. 27 
 
Figura 11 Acercamiento del Microarreglo elaborado para la 29 
optimización de la inmovilización. 
Figura 12 Acercamiento del Microarreglo elaborado para la 30 
optimización de la inmovilización 
Figura 13 Elección de fluoróforos. Acoplamiento de los picos de 35 
absorción. 
Figura 14 Distribución de las muestras anterior a la deposición para 41 
 
el Microarreglo destinado a la hibridación con las sondas. 
 
Figura 15 Microarreglo A33. Vista general. 42 
 
Figura 16 Microarreglo A33. Acercamiento. 42 
 
Figura 17 Microarreglo B35. Vista general. 44 
 
Figura 18 Microarerglo B35. Acercamiento. 44 
RESUMEN 
 
 
 
En este trabajo se aplica la tecnología de Microarreglos a estudios de polimorfismos en el ADN 
mitocondrial humano con aplicaciones en la antropología, arqueología, medicina forense y medicina 
genética. Como en medicina forense y genética de poblaciones para estudios de medicina preventiva, 
en lo que refiere a antropología de la salud; estudios migracionales, por medio de análisis filogenéticos, 
y estudios de evolución. 
Se presenta el diseño de Microarreglos para la detección de los haplogrupos mitocondriales 
humanos A, C y D en el ADN de origen actual y de restos antiguos, permitiendo, dada la gran cantidad 
de información que es posible obtener, facilitar la detección de estos marcadores biológicos para un 
análisis verás, rápido y a costo menor a los métodos empleados actualmente, favoreciendo el análisis de 
pequeñas cantidades de ADN. Con ello estos marcadores se pueden analizar en forma masiva y con 
una gran sensibilidad. 
La tecnología de Microarreglos se aplica sobrellevando las dificultades que confieren el trabajo 
con ADN antiguo (Pääbo S. y col., 1989) en particular el estudio de haplogrupos mitocondriales en 
poblaciones prehispánicas. 
El presente proyecto tiene como propósito contribuir con la tecnología de Microarreglos al área 
de la antropología, particularmente en lo que se refiere a la detección de haplogrupos mitocondriales 
utilizados en análisis forenses, filogenéticos, movimientos migracionales y estudios de evolución. 
Se presenta un estudio de los procedimientos para la extracción y amplificación por PCR de ADN 
antiguo y sus diferencias de este con el ADN moderno; el diseño de Microarreglos de ADN para la 
detección de los haplogrupos mitocondriales A, C y D utilizados en estudios filogenéticos de poblaciones 
nativas americanas; la variación y repetibilidad de la morfología e intensidad de la señal generada en los 
depósitos del Microarreglo con respecto a las sustancias para la deposición utilizadas en la 
inmovilización de ADN antiguo y moderno; el diseño de sondas para la detección de polimorfismos de un 
solo nucleótido correspondientes a los haplogrupos mitocondriales A, C y D; la metodología de elección 
de los fluorófos adecuados para el marcaje de las sondas; las condiciones de hibridación para las 
sondas diseñadas. 
I. INTRODUCCIÓN 
 
 
 
1.1 MICROARREGLOS 
 
 
 
1.1.1 ELABORACIÓN DE MICROARREGLOS 
 
Este capítulo comprende los antecedentes y conceptos necesarios para introducirse a la 
tecnología de Microarreglos. 
Un Microarreglo de ADN consiste en una superficie sólida en la que han sido inmovilizadas 
ordenadamente moléculas de ADN por unión química en áreas definidas y localizables. Su 
funcionamiento se basa en la propiedad de las bases nitrogenadas de hibridar sólo cuando son 
complementarias. Se detecta la hibridación por medio de un lector óptico, el cual recibe una señal 
generada por un marcador adherido a una de las cadenas que participan en la conformación de la 
molécula de ADN. 
Esta tecnología tiene antecedentes desde finales de los setentas del siglo XX, en las bibliotecas 
de ADN recombinante hechas en bacterias o levaduras y almacenadas en placas tipo ELISA. Las clonas 
que conformaban una biblioteca se analizaban para identificar segmentos traslapados y generar así los 
mapas físicos de segmentos genómicos o incluso de genomas bacterianos completos. Kafatos y col. 
(1979) introdujeron la idea original de analizar múltiples secuencias simultáneamente, aplicándolas 
sobre papel filtro, técnica conocida actualmente como dot blot. Hoheisel y col. (1994) propusieron la 
idea de usar las bibliotecas de ADN recombinante arregladas sobre papel filtro a una elevada densidad 
como herramientas para identificar secuencias relacionadas. Una importante innovación introducida por 
estos autores fue reemplazar el procedimiento manual de picar e imprimir clonas sobre el papel filtro, por 
un procedimiento robotizado. La automatización incrementó la velocidad del análisis, eliminó errores 
humanos, permitió analizar una muestra determinada a una mayor densidad (se pudieron imprimir miles 
de clonas) y mejoró la calidad de las placas de papel así preparadas. 
Si bien el papel filtro presentaba algunas ventajas como el permitir cargar grandes cantidades de 
ADN en una pequeña área, proporcionar una gran superficie de unión y permitir cargar la muestra en 
grandes volúmenes de líquido, presentaba también algunas desventajas, por ejemplo, los límites y la 
forma de los depósitos no eran definidos y la cantidad de ADN cargado era difícil de controlar, 
adicionalmente, no era posible reducir el tamaño de los depósitos más allá de cierto límite, esto sumado 
al hecho de que el papel se expande cuando se humedece y se deforma cuando se seca. El tener una 
cantidad conocida de ADN, así como depósitos con tamaño y forma definidos, es crucial para el análisis 
automatizado de las señales de hibridación. Con la tecnología actual, cuando se colocan sobre un 
soporte sólido, las moléculas de ADN forman una monocapa que satura la superficie, esto permite que 
la cantidad de muestra unida al soporte sea consistente entre diferentes regiones del Microarreglo. 
Actualmente esta tecnología se esta aplicado entre otros al análisis de la expresión génica, 
detección de mutaciones y polimorfismos, secuenciación, seguimiento de terapia, medicina preventiva, 
búsqueda y toxicología de fármacos, y diagnóstico molecular. 
 
 
1.1.1.1 Sondas 
 
Existen diferentes formas de nombrar al ADN en el arreglo y al ADN en solución al momento de 
la hibridación. En este trabajo se referirá al oligonucleótido marcado como “reportero” (comúnmente 
denominado sonda) y al ADN inmovilizado en el arreglo como “extracto de hibridación” de acuerdo a la 
MGED. 
 
 
1.1.1.2 Fabricación de Microarreglos. 
 
Actualmente existen dos principales vías para la fabricación de Microarreglos: por deposición 
automatizada y por síntesis in situ. 
 
 
1.1.1.2.1 Microarreglos por síntesis in situ. 
 
En este tipo de arreglos los oligonucleótidos son sintetizadosbase por base en la superficie del 
arreglo; por la exposición subsecuente de la superficie con diferentes máscaras. Esto se lleva acabo por 
medio de reacciones covalentes entre el grupo OH 5´ del azúcar del último nucleótido y el grupo fosfato 
del siguiente nucleótido. Cada nucleótido agregado al oligómero posee un grupo protector en la posición 
5´ para prevenir la adición de más de una base durante cada paso de síntesis. Posteriormente el grupo 
protector es convertido en un grupo hidroxilo con ayuda de un ácido o por medio de un rayo de luz antes 
del siguiente paso de síntesis. 
Los métodos de desprotección de los nucleótidos definen a tres principales tecnologías para la 
elaboración de arreglos in situ: 
1) Fotodesprotección utilizando máscaras: la base de los Microarreglos de Affymetrix. 
 
2) Fotodesprotección sin la utilización de mascaras: método utilizado por Nimblegen y Febit. 
 
3) Desprotección química con síntesis vía inkjet: método utilizado por Rosetta, Agilent y Oxford 
 
Gene Technology. 
 
 
 
1.1.1.2.2 Microarreglos por deposición. 
 
Es la tecnología por la cual fueron elaborados los primeros Microarreglos. Se realiza el arreglo 
utilizando un brazo robótico con movimiento en los ejes X, Y y Z para la deposición de las muestras, la 
cual se realiza en tres pasos: 
a) Elaboración de las sondas. 
 
b) Deposición del ADN objetivo en la superficie sólida destinada para el arreglo con un 
robot. 
c) Hibridación de la sonda y el ADN arreglado ordenadamente en la superficie sólida. 
 
1.1.1.3 Soporte 
 
Las superficies sobre las que se pueden imprimir los Microarreglos de ADN son dos, las 
membranas de materiales como la nitrocelulosa o el nylon y las laminillas de vidrio o polipropileno, 
semejantes a las que se utilizan para microscopía. Estas últimas son los de mayor uso, ya que permiten 
tener un mejor control sobre el diámetro de las aplicaciones y la distancia entre ellas. Los soportes 
sólidos ofrecen estabilidad dimensional y rigidez. 
 
 
1.1.1.4 Recubrimiento del soporte. 
 
Las laminillas utilizadas como soporte se pueden conseguir con diferentes recubrimientos como: 
 
poli-L-lisina, aminas y aldehídos, las cuales permiten la unión química del ADN con la superficie. 
 
 
 
1.1.1.5 Impresión. 
 
La unión del oligonucleótido o cadena de ADN puede ser por medio de enlaces covalentes y 
enlaces no covalentes. 
Con la unión covalente, el ADN es adicionado a un grupo amino alifático primario sobre la 
superficie sólida. El oligonucleótido adicionado al grupo amino normalmente se une por el lado 5´ tanto 
en oligonucleótidos como en ADN de doble cadena. 
En la unión no covalente, el enlace es del tipo de atracciones electrostáticas entre el esqueleto 
de fosfato del ADN y el grupo NH2 perteneciente a la superficie sólida. La interacción toma lugar en 
varios puntos de la cadena de ADN. La unión no covalente es preferida en las arreglos de ADNc (Stekel, 
2003), y oligonucleótidos, que comúnmente son muy pequeños como para que la fuerza electrostática 
sea suficiente para mantenerlos adheridos a la superficie se prefiere la unión covalente. 
 
 
1.1.1.6 Deposición. 
 
Las muestras de ADN son organizadas en bandejas con micropozos. Un robot que es capaz de 
acceder sucesivamente a cada uno de los pozos toma muestra por medio de una serie de agujas 
(aplicadores) organizadas en red. Las agujas son utilizadas para la transferencia del líquido de los 
micropozos a la superficie sólida utilizada para el arreglo. 
Durante la deposición se deben controlar la humedad y la temperatura. 
 
 
 
1.1.1.7 Robot. 
 
Se trata de un brazo robótico con movimiento en los ejes X, Y y Z, siendo su característica más 
importante el poderse desplazar en cualquiera de estas direcciones con una resolución de una décima 
de milímetro. Existen dos tipos de estos robots: los primeros y más sencillos en los que una superficie 
conteniendo las laminillas sobre las que se va a imprimir, se desplaza en los ejes (X, Y) y la cabeza con 
los aplicadores sube y baja en el eje Z depositando la muestra sobre la laminilla. En el otro tipo de robots 
las laminillas permanecen estáticas y un brazo mecánico se desplaza en los tres ejes aplicando las 
muestras. Los robots impresores de contacto cuentan con una cabeza en la que se pueden colocar de 1 
a 48 aplicadores. 
 
 
1.1.1.8 Aplicadores. 
 
Los aplicadores, son pequeñas agujas con una ranura en la punta similar a la punta de una 
pluma fuente y al igual que en ésta, la muestra se toma y se deposita por capilaridad. Los aplicadores 
más comunes tienen una capacidad de 0.25 μl y pueden hacer al menos 100 aplicaciones, es decir 
0.0025 μl por aplicación. También existen aplicadores con capacidad de hasta 300 aplicaciones y 
aplicadores sólidos, es decir sin ranura, y que pueden hacer hasta 10 aplicaciones (Ramírez y col., 
2003). 
 
 
 
1.1.1.9 Fijación. 
 
Una vez impresas las laminillas, el ADN debe ser fijado a la superficie. Esto se puede lograr 
horneando los Microarreglos a 80°C por cuatro horas o con un entrecruzador de luz ultravioleta. 
 
 
1.1.2 HIBRIDACIÓN 
 
El procedimiento consiste en aplicar la solución de hibridación con las sondas sobre la laminilla y 
cubrirla con un cubreobjetos para permitir que la solución cubra todo el Microarreglo de igual forma que 
se hace una preparación para microscopía. La reacción es capilar, por lo tanto requiere de muy poco 
volumen. Sin embargo es importante señalar que se debe tener cuidado con la evaporación. Para evitar 
que esto suceda, los microrreglos se colocan en cámaras húmedas diseñadas para éstos propósitos. 
 
 
1.1.3 LAVADO 
 
Al igual que la hibridación, el lavado de un Microarreglo utiliza reglas similares de temperatura y 
astringencia que se siguen en los experimentos tipo Southern o Northern, con una pequeña diferencia 
que es, el secado de las laminillas. Para secar las laminillas es recomendable utilizar la centrifugación ya 
que cualquier residuo de sales por evaporación puede afectar la lectura. 
 
 
1.1.4 LECTURA 
 
Los lectores utilizan un láser para excitar las moléculas fluorescentes unidas ADN, para obtener 
la imagen de cada una de las muestras contenidas en el Microarreglo. Este procedimiento se hace para 
cada uno de los fluoróforos existentes en el Microarreglo obteniéndose una imagen para cada fluoróforo. 
Para la obtención de estas imágenes se debe ajustar la intensidad del láser y la sensibilidad de la 
cámara o de los fotomultiplicadores, de tal forma que todas las imágenes den valores semejantes de 
fluorescencia total. Una vez obtenidas estas imágenes, pueden ser combinadas para obtener un aspecto 
visual del Microarreglo. 
 
 
1.2 ADN ANTIGUO 
 
Los primeros estudios en los que se determinaron variaciones genéticas entre los grupos 
humanos se encaminaron a la detección de los grupos sanguíneos ABO y la presencia de variantes 
alélicas que determinan el tipo de sangre. La importancia de estas investigaciones se acentuó aun más 
cuando Fisher (1918) mostró que podía trazarse la historia evolutiva, a través de estudios realizados, 
atendiendo a la expresión genotípica de diversos cromosomas presente en poblaciones, donde dicha 
expresión se perpetúa a través de mecanismos hereditarios. 
Cuando se compara la secuencia de aminoácidos de la albúmina o el citocromo c en diversos 
animales, se puede observar que entre más cercanas sean dos especies, más parecidos son sus 
proteínas (Wilson, A., y col., 1987). Se pueden obtener medidas cuantitativas del parecido de unas 
especies con otras de acuerdo con las alteraciones que sufren sus proteínas en regiones o residuos 
específicos. Este tipo de estudios permitió el establecimiento de un conocimiento medio de las bases 
moleculares del proceso evolutivo. Al igual que en el caso de estos relojes proteicos, las diferencias 
comparativas en las secuencias de nucleótidos se convierten en distancias genéticas yestablecen 
relaciones entre especies emparentadas. 
Los trabajos de Hutchinson y col. (1974), Potter y col. (1975) y Upholt y Dawid (1977) pusieron 
de manifiesto la utilidad del ADNmt para estudios de genética de poblaciones. 
Conjuntamente con los análisis del ADN mitocondrial (ADNmt), se han utilizado marcadores del 
cromosoma Y que han probado tener un inestimable valor en la generación de modelos utilizados para 
delinear cómo fue la evolución humana (Cavalli-Sforza y Feldman, 2003). A partir de este tipo de 
estudios se puede incrementar el conocimiento acerca del pasado, presente e incluso futuro evolutivo 
del ser humano. 
El ADNmt se ha convertido en una herramienta privilegiada en estudios evolutivos, como la 
reconstrucción de los orígenes del hombre, la historia de las poblaciones, el análisis de migraciones 
humanas y los estudios filogenéticos de poblaciones extintas en restos de ADN antiguo, entre otros 
(Stoneking, 1993). 
Los polimorfismos del ADN mitocondrial son herramientas en el estudio comparativo de 
poblaciones modernas y antiguas. Entre los más usados están los haplogrupos mitocondriales basados 
en la presencia o ausencia de sitios de restricción (RFLP, polimorfismo de longitud de fragmentos de 
restricción) específicos y un sistema de inserción/deleción (Sandoval J. y col., 2004). 
Los análisis filogenéticos de estos polimorfismos específicos para cada etnia definen grupos de 
ADNmt denominados haplogrupos o linajes. En la genética los haplogrupos están determinados por las 
variaciones encontradas en el ADNmt. Los estudios que analizan el ADNmt por variación de sitios de 
restricción han permitido establecer que las poblaciones humanas nativas están definidas por uno o más 
linajes específicos de cada continente. La incidencia de estas mutaciones específicas en la secuencia 
del ADNmt humanos de cada continente y su especificidad en cada grupo humano, los hace marcadores 
genéticos importantes para inferir el origen étnico y geográfico de la especie humana (Johnson y col., 
1983; Reed y Takezaki, 1995). 
 
En la mayoría de los ADNmt de poblaciones nativas americanas tanto contemporáneas como 
antiguas prevalecen cuatro linajes de ADNmt descritos como haplogrupos fundadores: A, B, C, D 
(Wallace y col., 1985; Torroni y col., 1992, 1993, 1994; Horai y col., 1993), siendo que la frecuencia de 
cada uno varía en las diferentes poblaciones. Estos haplogrupos trazan la ascendencia y descendencia 
matrilineal de la especie humana. 
En ocasiones, la identificación de cadáveres mediante las técnicas clásicas de la medicina 
forense (huellas dactilares, fórmula dentaria, medidas antropológicas, etc.) no permite definir con 
precisión la identidad del sujeto en cuestión y es necesario recurrir a técnicas de análisis de ADN. 
Existen dos factores como son el tiempo transcurrido y las condiciones medioambientales que ocasionan 
la degradación del material genético. Esta circunstancia hace que al quedar afectado el ADN, su análisis 
mediante marcadores genéticos nucleares sea en ocasiones inviable, tal es así que para la medicina 
forense se dispone del ADNmt dadas ciertas características que le confieren ventaja con respecto al 
ADN nuclear al paso del tiempo. En lo que respecta a restos humanos de conflictos bélicos, es posible 
vislumbrar la posible identidad de estos a través del uso de los haplogrupos mitocondriales de los 
individuos en cuestión, de tal modo que se de su posible procedencia geográfica. 
La determinación de haplogrupos en poblaciones humanas tanto antiguas como modernas es 
una herramienta que permite aproximarse a la historia de la humanidad. 
Dentro del campo de la antropología, los estudios de parentesco y movimientos poblacionales se 
han visto extraordinariamente enriquecidos por los avances de la biología molecular. Por medio de la 
identificación del posible origen genético de poblaciones prehispánicas presentes en entes de carácter 
arqueológico se facilita el estudio de la sociedad mexicana, principalmente respecto a su origen, tópicos 
socioeconómicos y rituales. Igualmente en este punto se toman como ventajas las características del 
ADNmt en lo que respecta del ADN nuclear. 
El estudio científico de las poblaciones del pasado permite el abordaje de cuestiones de alto 
interés para reconstruir los caminos evolutivos y adaptativos de nuestra especie (Buikstra y Ubelaker, 
1994). Los análisis de ADN antiguo junto con otras herramientas permiten establecer estimaciones de 
las relaciones genéticas existentes entre poblaciones del pasado. Los resultados de estos análisis 
toman importancia desde el punto de vista de la historia evolutiva de la población, buscando estimar la 
importancia relativa de fenómenos como la deriva génica, la selección, el flujo génico y la influencia de la 
separación geográfica y otros mecanismos de aislamiento. Además los análisis del ADN antiguo pueden 
aportar información sobre aspectos arqueológicos e históricos, en donde se dilucida acerca de la 
asociación de los cambios biológicos con los cambios culturales. De tal modo que contribuye a conocer 
los límites geográficos o temporales de la población, los patrones de residencia post-marital, grupos de 
parentesco, agrupamientos sociales o eventos de contacto entre dos grupos biológicamente bien 
diferenciados. 
El ADN antiguo presenta un conjunto de características que lo diferencian del ADN extraído de 
muestras actuales como lo son la escasez, fragmentación y modificaciones moleculares. 
La extracción de ADN procedente de algunos animales extintos supuso el comienzo de las 
investigaciones en ADN antiguo (Higuchi y col., 1984). Esta línea de investigación utiliza las técnicas de 
la biología molecular por lo que experimentó, a finales de los años 80, un gran desarrollo gracias a la 
invención de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). La década siguiente sufrió un relativo 
estancamiento, debido, sobre todo, a una serie de limitaciones técnicas en el campo del ADN antiguo. 
Sin embargo, se han alcanzado avances de extrema importancia, sobre todo relacionados con la 
recuperación de ADN, análisis de calidad y cantidad, así como con la mejora en el procesamiento de los 
datos genéticos obtenidos. Como resultado de esta combinación de factores, el estudio del ADN antiguo 
es un campo preparado para empezar a ofrecer grandes resultados científicos, inimaginables hace tan 
solo unos años. 
Una prueba de estos avances lo constituye el estudio del material genético procedente de 
Neandertales. Mientras que la recuperación de las primeras secuencias de ADN mitocondrial de 
Neandertales, de menos de 400 pares de bases, supusieron un hito científico en los años 1997 y 2000 
(Krings M y col., 1997; Ovchinnikov IV y col., 2000), se ha logrado recuperar ADN nuclear de un millón 
de pares de bases de longitud de Neandertal (Green, 2006). A pesar de los avances recientes, su 
aplicación ha sido muy limitada, por lo que su potencial sigue siendo aún muy grande. 
La recuperación de material genético de restos antiguos combina la fascinación del estudio del 
pasado con la potencialidad para establecer genealogías. Al mismo tiempo, presenta numerosas 
dificultades técnicas debido a la degradación del material genético y contaminantes presentes en la 
muestra a analizar, lo que lo convierte en un campo de estudio con problemas a resolver. 
Es en este punto donde se aborda el presente trabajo, donde se aplica la tecnología de 
 
Microarreglos, sobrellevando las dificultades que confieren el trabajo con ADN antiguo (Pääbo S. y col., 
 
1989) en particular el estudio de haplogrupos mitocondriales en poblaciones prehispánicas. 
1.2.1 ADN MITOCONDRIAL 
 
El ADNmt posee características que le hacen ideal para estudios de restos antiguos: 
 
 
¾ Es una molécula circular cerrada de doble cadena (Figura 1), rasgo que le confiere mayor 
estabilidad frente a fenómenos degradativosrespecto al genoma nuclear. 
¾ Consta de 16,569 pares de bases (pb) en la cual su secuencia se conoce en toda su longitud 
 
(Anderson S. y col., 1981; Andrews y col., 1999). La numeración del genoma, establecida por 
Anderson en 1981, comienza arbitrariamente cerca del punto medio de la región control, de 
forma que esta región se extiende desde la posición 16,024 a la 16,569, continuando 
después de la posición 1 hasta la posición 576. 
¾ Presenta alrededor de 3000 a 5000 copias por célula (Shuster y col. 1998) facilitando su 
 
análisis. 
¾ El ADNmt codifica para 13 polipéptidos del complejo respiratorio mitocondrial y para los 
genes correspondientes al ARN ribosomal (ARNr) y ARN de transferencia (ARNt) de la 
síntesis de proteínas mitocondriales (Shoffner y Wallace 1990). Estas regiones codificantes 
se alteran con una tasa de 2 a 4% por millon de años (Cann y col. 1987; Stoneking y col. 
1990), mientras que la secuencia no codificante, conocida como región control o región D- 
loop (displacement-loop), se altera alrededor de un 8% por millón de años (Greenberg y col. 
1983; Horai and Hayasaka 1990; Vigiliant y col. 1989). La tasa de mutación es la frecuencia 
con que ocurren cambios en la secuencia nucleotídica del ADN. De esta forma, conociendo 
cada cuánto tiempo se produce una alteración, y cuántas diferencias hay entre dos individuos 
que se quieran comparar, se pueden determinar hace cuánto tiempo tuvieron un antepasado 
en común. Lo mismo sucede en el caso de realizar comparaciones entre poblaciones. 
¾ Es heredado por vía materna (Case y Wallace 1981; Giles y col. 1980) y no se recombina a 
 
partir de la fecundación (Schurr y col. 1990), por lo tanto los cambios son desarrollados por 
una acumulación de mutaciones a través de la línea materna (Jonson y col. 1983). A 
diferencia del ADN nuclear que se hereda de ambos progenitores, el ADN de la mitocondria 
se hereda como un bloque de madre a sus descendientes. De este modo únicamente los 
descendientes del sexo femenino podrán transmitir su herencia mitocondrial. Esta 
circunstancia se debe a que las mitocondrias contenidas en los espermatozoides no 
intervienen directamente en el proceso de fecundación. 
¾ Adicionalmente su secuencia tiene una tasa de mutación con una frecuencia 10 veces más 
 
rápida que el ADN nuclear (Brown y col. 1979, 1982; Miyata y col. 1982; Neckelmann y col. 
 
1987; Wallace y col. 1987), permitiendo hacer distinciones entre poblaciones muy 
relacionadas. 
1.2.2 RECOMBINACIÓN 
 
La recombinación es el proceso por el cual dos cromosomas homólogos pueden intercambiar 
material genético (González A., 2006). Este proceso, de suma importancia en la generación de la 
variabilidad y de nuevas recombinaciones genéticas en la descendencia puede ser problemático al 
realizar la búsqueda del origen en la secuencia de una porción del material genético. Si no ha habido 
recombinación y la herencia es uniparental, como es el caso de ADN mitocondrial, como ya se recalcó, 
se puede reconstruir la genealogía por la línea materna de un individuo y de una especie. De tal modo 
con todo lo antes mencionado el único sistema por el cual se puede introducir variaciones serán, por lo 
tanto, las mutaciones. 
 
 
1.2.3 POLIMORFISMOS 
 
Las variaciones en la secuencia del ADNmt pueden ser analizadas haciendo uso de los 
polimorfismos. Los polimorfismos del ADN mitocondrial son herramientas en el estudio comparativo de 
poblaciones modernas y antiguas. Entre los más usados están los haplogrupos mitocondriales basados 
en RFLP y un sistema de inserción/deleción. El estudio de los RFLPs radica en el corte con 
endonucleasas de restricción de los productos amplificados por PCR. Si dos amplicones presentan una 
variación de la secuencia nucleotídica, en los sitios de reconocimientos de las enzimas de restricción, 
generarán distintos patrones de fragmentos. 
 
 
1.2.4 HAPLOGRUPOS 
 
Los estudios de ADNmt de poblaciones nativas americanas han definido cuatro haplogrupos 
principales. Estos cuatro haplogrupos pueden ser perfectamente distinguidos con análisis de RFLPs por 
la ganancia o pérdida de uno o más sitios de restricción o por la presencia o ausencia de una deleción 
de 9 pb de la región intergénica COOO-tARNlys (Schurr, 1990). En la Figura 1 se muestra la 
localización en el genoma mitocondrial humano de los polimorfismos característicos de los cuatro 
principales haplogrupos en poblaciones nativas de América. 
 
 
1.2.5 CONTAMINACIÓN 
 
La contaminación con ADN de origen diferente a la muestra, aunado a las características del 
ADN antiguo, produce la amplificación preferente del primero de los dos tipos durante el proceso de 
PCR, incrementando los problemas dada la elevada sensibilidad de dicha técnica. La contaminación de 
la muestra puede producirse en el momento de la deposición en el lugar de entierro; antes, durante y 
después del aislamiento de su material genético en el laboratorio. La contaminación con ADN de la 
misma especie a las muestras a analizar puede resultar problemática debido al objetivo del estudio 
realizado en el presente proyecto. El ADN contaminante puede introducirse directamente en la muestra 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
mientras esta es manipulada por arqueólogos, personal de museo o por los propios investigadores; por 
ejemplo a través de la descamación de la piel o de los aerosoles de la respiración. Otros vehículos de 
contaminación pueden ser el material y reactivos empleados para su análisis genético. En el laboratorio, 
durante las fases de extracción y amplificación, puede darse también contaminación por otras fuentes 
mucho más difíciles de detectar y erradicar: el ADN extraído con anterioridad y las amplificaciones de 
anteriores experimentos. Estos contaminantes pueden flotar en forma de aerosoles en el ambiente, o 
quedar adheridos tras una amplificación y/o extracción a las superficies o al material de trabajo no 
desechable. Este tipo de contaminación se conoce comúnmente con el nombre de contaminación de 
arrastre. 
 
 
1.2.6 INHIBIDORES 
 
Adicionalmente, la mayor parte de los extractos de ADN antiguo, pueden contener otras 
moléculas que inhiben la reacción de PCR y que han pasado a ser conocidas bajo el nombre de 
inhibidores. Esta denominación agrupa un conjunto de moléculas de naturaleza diversa, que no son la 
misma en todos los extractos, todo depende del origen y modo de preservación de la muestra. Dichos 
inhibidores pueden tratarse de compuestos del suelo: ácidos húmicos y/o fúlvicos, residuos de porfirinas 
y/o productos de su degradación y taninos; de subproductos de degradación orgánica: productos de 
Maillard, productos de degradación del ADN entre otros (Pääbo y col., 1989). 
. 
 
 
 
663 
Ganancia de un sitio de 
restricción para la enzima Hae 
III en la posición 663 
corresponde al haplogrupo A 
 
 
 
 
Pérdida de un sitio para la 
enzima Alu I en la posición 5176 
conferirá el haplogrupo D 
 
13259 
 
 
 
5176 
Ganancia de un sitio de 
restricción para la enzima 
Hinc II en la posición 13259 
será para el haplogrupo C 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Mapa del ADN mitocondrial humano. Localización de los polimorfismos que determinan los 
cuatro principales haplogrupos de poblaciones nativas americanas (tomado de López, 2007). 
 
 
II. JUSTIFICACIÓN 
 
 
 
Contribuir al esclarecimiento de los flujos migratorios, origen, asentamiento y estructura genética 
de poblaciones antiguas. Lo que habrá de apoyar el trabajo antropológico y arqueológico referente a 
grupos humanos. 
La ventaja de utilizar el ADNmt surge cuando se tienen muestras comprometidas de las que 
apenas se suele tener restos óseos o pelo, en cantidades mínimas. Esta tecnología no sólo se podría 
utilizar con muestras óseas sino inclusive con otro tipo de tejidos. 
Se puede estudiar de manera directa la composición genética de las poblacionesdel pasado, 
compararlas con las del presente, e inferir los procesos evolutivos que han tenido lugar a lo largo de la 
historia. 
El diseño de Microarreglos para la determinación de haplogrupos humanos no únicamente se 
puede aplicar en poblaciones antiguas sino incluso en poblaciones contemporáneas, en especial en 
investigaciones forenses cuando el material biológico se asocia a un presunto criminal. La genética 
forense es una especialidad de las ciencias forenses que se ocupa del estudio de los caracteres 
hereditarios y el análisis del polimorfismo o variabilidad genética humana aplicada a problemas de orden 
legal. 
 
Tradicionalmente la reconstrucción de nuestro pasado ha sido una tarea desarrollada por 
antropólogos, historiadores, arqueólogos y paleontólogos, mientras que la evidencia indirecta de las 
poblaciones humanas modernas la ofrecen los lingüistas y más recientemente los biólogos moleculares. 
La reconstrucción del pasado de una población permite un mayor sentido de pertenencia, y así, 
reafirmar su identidad. Los valores que han unido a los mexicanos a lo largo de siglos se vuelven 
presente vivo a través de la investigación, la recuperación y el cuidado de ese universo patrimonial; 
proyectan el futuro del país con solidez, afirmando la viabilidad de la nación. 
El análisis por medio de Microarreglos de poblaciones en específico podría ayudar en la 
predicción de la asociación de los haplogrupos mitocondriales con enfermedades determinadas. 
Una peculiaridad del ADN mitocondrial es que procede en su totalidad de la madre, mientras que 
el ADN cromosómico procede de los dos progenitores en partes equivalentes. Esto es importante para 
los estudiosos de la antropología humana, pero también para los genetistas humanos, puesto que un 
buen número de enfermedades genéticas son causadas por mutaciones que afectan a este pequeño 
número de genes mitocondriales. La investigación de los polimorfismos mitocondriales podría dar alguna 
relación posible entre poblaciones determinadas y enfermedades de origen mitocondrial. 
La vanguardia, eficacia y competitividad requieren de un costo; costo que sería mayor si se 
carece de tecnología que facilite los procesos de investigación. 
Por otra parte la utilización de Microarreglos en lugar o al mismo tiempo que los métodos 
comunes (secuenciación y reacciones de restricción) para la determinación de haplogrupos conlleva 
muchas ventajas sobre ellos, entre las que se encuentran: la posibilidad de analizar un número de 
mucho mayor de secuencias a la vez y de manera simultánea, disminución de errores de manipulación 
durante el ensayo, debido a la automatización del proceso, generación de resultados en menor tiempo, 
por lo mismo del manejo de varias muestras y diferentes ensayos para cada muestra en una sola 
laminilla, y lo mas importante de esto, evitar a futuro en la medida de lo posible el uso de PCR, 
eliminando los problemas que se presentan con los llamados inhibidores de las polimerasas utilizadas; y 
los requerimientos mínimos de ADN (picomoles), considerando la cantidad de muestra disponible para 
tomar de los restos antiguos con carácter de patrimonio cultural, así como las mínimas cantidades de 
ADN presentes en la propia muestra debido a su degradación al paso del tiempo y condiciones de 
conservación. 
III. OBJETIVOS 
 
 
 
OBJETIVOS GENERALES: 
 
o Diseño de Microarreglos para la detección de haplogrupos del ADN mitocondrial humano 
en restos óseos antiguos de poblaciones amerindias. 
 
 
OBJETIVOS PARTICULARES: 
 
 
 
o Obtención de ADN de restos óseos prehispánicos. 
 
o Obtención de los fragmentos de ADN correspondientes a cada haplogrupo. 
 
o Amplificación de regiones conteniendo el sitio de restricción para cada haplogrupo. 
 
o Diseño de las sondas especificas para la detección de haplogrupos. 
 
o Prueba de diferentes soluciones para fijado en la laminilla de Microarreglos. 
 
o Búsqueda de las condiciones óptimas de hibridación. 
 
o Pruebas preliminares de los Microarreglos diseñados en ADN moderno y ADN antiguo. 
Fase del ciclo Temperatura Tiempo 
Desnaturalización Inicial 94 °C 5´ 
Desnaturalización 94 °C 55´´ 
Alineamiento 4 °C *** 
Elongación 72°C 50´´ 
Elongación Final 72°C 5´ 
Almacenamiento 4 °C ∞ 
 
IV. METODOLOGÍA 
 
En este capítulo se describe cada punto del procedimiento experimental llevado acabo, y que se 
resume en la Figura 2. 
 
 
4.1 Obtención de ADN. 
 
Para la obtención del ADN de los restos óseos antiguos primeramente se procedió a la limpieza 
por abrasión mecánica con la finalidad de remover las partículas presentes en la parte externa de la 
muestra. La muestra posteriormente es sometida a -70 °C por lo menos una hora y molienda en mortero 
hasta obtener un polvo fino. 
La cantidad de muestra disponible para su estudio fue la que determinó la cantidad utilizada para 
la extracción del ADN antiguo. 
Para la extracción del ADN antiguo se utilizaron 3 vías: fenol-cloroformo, Chelex y sílica (Vigilant 
 
L y col. 1989; Muñoz y col.; González A 2006; Merriwether D y col., 2005). 
 
Para la obtención del ADN moderno se realizó la búsqueda de individuos en los que se 
encontrara la secuencia deseada correspondiente a los haplogrupos deseados. Las muestras de las que 
se extrajo el ADN fueron de células epiteliales bucales, sangre y/o cabello de acuerdo a la disposición de 
los individuos. La extracción del ADN moderno se realizó mediante Chelex 
 
 
4.2 Amplificación de ADN. 
 
Se pretende la obtención de los fragmentos que contienen las regiones para cada haplogrupo a 
partir de ADN moderno con la finalidad de tener controles positivos para la laminilla de Microarreglos. 
El ciclo de PCR se presenta a continuación: 
 
 
HAPLOGRUPO A 
HAPLOGRUPO C 
HAPLOGRUPO D 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Número de ciclos utilizados: 40 Ciclos 
***Temperaturas de Alineamiento 
HAPLOGRUPO A 59 °C 
HAPLOGRUPO C 59 °C 
HAPLOGRUPO D 59 °C 
 
 
 
 
 
4.3 Electroforesis. 
 
Para evidenciar la amplificación se realiza una electroforesis en agarosa al 2% y 4 μl de bromuro 
de etidio por cada 100ml de azarosa utilizando un voltaje de 60 V. 
 
 
4.4 Determinación de haplogrupos. 
 
Una vez amplificados los fragmentos tanto de ADN moderno o antiguo se procede a realizar 
pruebas de determinación de haplogrupos mediante la secuenciación de los amplificados con la finalidad 
de corroborar los resultados en la determinación de haplogrupos que se obtengan mediante los 
Microarreglos para validar el proyecto en un futuro. Posteriormente los resultados obtenidos mediante 
los Microarreglos se validarán mediante PCR tiempo real. 
 
 
4.5 Iniciadores de la PCR. 
 
Los iniciadores a utilizar para la amplificación en la PCR de las regiones que definen los 
haplogrupos son: 
ƒ Iniciadores para amplificar la región que define el haplogrupo A. 
 
L590 5-TGA,AAA,TGT,TTA,GAC,GGG,CTC,ACA-3 
 
H760 5-TAG,AGG,GTG,AAC,TCA,CTG,G-3 
ƒ Iniciadores para amplificar la región que define el haplogrupo C. 
L13209 5-CGC,CCT,TAC,ACA,AAA,TGA,C-3 
H13420 5-GGG,AGG,TTG,AAG,TGA,GAG,G-3 
ƒ Iniciadores para amplificar la región que define el haplogrupo D. 
L5110 5-TAA,CTA,CTA,CCG,CAT,TCC,TA-3 
H5250 5-AAA,GCC,GGT,TAG,CGG,GGG,CA-3 
 
 
 
5.1 Impresión de la laminilla. 
 
Se emplearon placas de vidrio recubiertas químicamente con aminosilano para unir 
covalentemente las moléculas de ADN. 
5.1 Inmovilización 
 
a) Se rehidrató la superficie impresa con vaporizaciones por 3 segundos. 
 
b) E sometió a calentamiento directo de la laminilla por el lado no impreso en una 
plancha a 85°C por 10 segundos. 
c) Se expuso el lado impreso en un entrecruzador de rayos UV a 260 mJ. 
 
 
 
5.1 Desnaturalización 
 
Este paso es requerido dado que el arreglo de ADN es de cadenas dobles. 
 
a) Inmersión del arreglo en dodecil sulfato de sodio (SDS) por 30 segundos, seguido 
de unbaño en agua por 3 minutos y otro en etanol por 2 minutos. 
b) Secado del arreglo con aire libre de aceite para eliminar los residuos de agua en la 
superficie de la laminilla. 
 
 
5.1 Hibridación. 
 
Preparación de solución de hibridación: 35 a 50% de formamida. 5X SSC, 0.1% SDS, 0.1 
mg/mgL de bloqueador de fondo (esperma de salmón). Determinar el área de la laminilla que 
será expuesta a la solución de hibridación y calcular el volumen a utilizar (alrededor de 2.5 a 3 
microlitros por centímetro cuadrado). Disolución del ADN reportero en la solución de hibridación. 
Bloqueo de la superficie no utilizada del Microarreglo (con una solución compuesta por SDS 1%, 
5x SSC, 0.1 mg/mL BSA) previo a la aplicación de la solución de hibridación. 
 
Lavado de la laminilla con agua libre de nucleasas, seguido de un lavado con etanol. Secado de 
la laminilla con aire libre de aceites y polvo. 
Aplicar cuidadosamente la solución de hibridación con el ADN reportero en la superficie del 
arreglo. Incubar el arreglo en una cámara de hibridación a la temperatura elegida. 
 
 
5.1 Lavado. 
 
a) Sacar el arreglo de la cámara de hibridación. 
 
b) Sumergirlo en una solución de SSC 2X y 0.1% de SDS. Permitir que el 
cubreobjetos se separe suavemente. 
c) Realizar los siguientes lavados, en el orden descrito: 
 
i. Solución SSC 2X por 5 minutos a 42°C con agitación ligera. 
ii. Solución SSC 0.2 X a 25°C por un minuto. 
iii. Solución SSC 0.05 X a 25°C por 5 segundos. 
d) Secado del arreglo con aire libre de aceite. 
e) Guardar el arreglo protegiendo la superficie de la luz, polvo y abrasión hasta que 
se realice la lectura. 
5.1 Adquisición de la imagen. 
 
La adquisición de la imagen se llevó a cabo por un lector óptico utilizando la longitud de 
onda apropiada de acuerdo a cada fluoróforo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1 1 
 
 
 
 
 
 
, 
 
1 
 
 
, 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
, 
 
 
 
'-.. 
........ 
 
Figura 2. Procedimiento experimental. 
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
 
 
Los estudios en ADN antiguo se confrontan con problemas de degradación, contaminación y baja 
concentración disponible. Se pudo extraer y amplificar ADN antiguo después de repetidos ensayos de 
dos muestras óseas de alrededor de 12500 años de antigüedad (Fig. 6). Para la deposición en el se 
utilizaron diferentes soluciones con la finalidad de obtener una señal homogénea en su forma, intensidad 
y reproducibilidad. La formamida permitió mayor reproducibilidad y homogeneidad en la señal en 
comparación con el DMSO. El CHAPS como detergente no incremento de manera apreciable la 
fluorescencia inespecífica. Se descartaron contribuciones debidas al robot en las diferencias 
morfológicas al comparar resultados entre laminillas duplicadas. Las soluciones con detergentes como 
aditivo produjeron la mayor homogeneidad en la morfología de los depósitos. La reproducibilidad se 
mejoró con la combinación de detergentes y solventes como formamida y DMSO. Los mejores 
resultados se presentaron con las soluciones de DMSO/ formamida y DMSO/CHAPS 1.6 mM. Se prefirió 
el uso de CHAPS 1.6 mM como agente detergente debido a las propiedades teratogénicas de la 
formamida. Se piensa que los resultados obtenidos son debidos a que el CHAPS por no poseer carga 
formal (a pH de 1 a 13), estabiliza el ambiente altamente cargado por la contribución de cargas 
negativas del esqueleto de ADN y las cargas positivas de la superficie de la laminilla. 
Se obtuvieron amplificados para los haplogrupos A, C y D de fuentes contemporáneas. En la 
Figura 3 se muestran particularmente los amplificados que contienen la región correspondiente al 
polimorfismo característico del haplogrupo A, en donde se realizaron amplificaciones de la misma 
muestra con diferentes diluciones de ADN. El producto de PCR posiblemente presentó estas diferencias 
al manejar diferentes concentraciones ADN debido a que en el caso de existir una gran cantidad de ADN 
en la reacción de amplificación se presenta un impedimento estérico que no permite una adecuada 
polimerización por parte de la enzima utilizada (PFU; proveniente de Pyrococcus furiosus.), y en caso de 
haber una cantidad mínima de ADN no es suficiente el amplificado de las pocas moléculas para 
visualizarlas en el gel a simple vista. De tal modo que se buscó una dilución adecuada del ADN a utilizar 
en la amplificación, de acuerdo a la fuente que se tratase. Finalmente se obtuvo como resultado que 
para las muestras de cabello no era necesario realizar diluciones y para extracciones a partir de células 
epiteliales una dilución 1:10 era suficiente posiblemente por las diferencias en cantidad del ADN 
presente en las fuentes. 
En la parte de la amplificación de ADN antiguo no se realizó esta optimización dado que es 
imposible tener muestras con características homogéneas. 
5.1 ADN ANTIGUO 
 
Las muestras óseas antiguas que fueron sometidas a estudio fueron: 
 
 
„ M6) CUEVA DEL TECOLOTE, HUAPALCALCO, HIDALGO. ENTIERRO “B”. EPOCA 
PRECERÁMICA* 
„ M7) PEÑON III. EPOCA PRECERÁMICA* 
„ MA) ENTIERRO 2E_TC_35. TEHUACAN, PUEBLA, 
„ MB) ENTIERRO 1, PEÑON DEL MARQUEZ, SANTA MARTA ACATITLA. IZTAPALAPA 
(DISTRITO FEDERAL), 650 A 750 AÑOS DE ANTIGÜEDAD 
„ MC) ENTIERRO 2, PEÑON DEL MARQUEZ, SANTA MARTA ACATITLA. IZTAPALAPA 
 
(DISTRITO FEDERAL), 650 A 750 AÑOS DE ANTIGÜEDAD 
„ M4D) ENTIERRO 3, PEÑON DEL MARQUEZ, SANTA MARTA ACATITLA. IZTAPALAPA 
(DISTRITO FEDERAL), 650 A 750 AÑOS DE ANTIGÜEDAD 
„ MVB) PREDIO 89, POZO 3, ENTIERRO 1(2). LA PEÑA, PROYECTO VALLE DE BRAVO 
„ MMA) MONTE ALBAN 
„ CT7) MONTE ALBAN 
„ CT8) MONTE ALBAN 
 
 
 
*Las muestras precerámicas corresponden a promedio de entre 5000 y 12500 años de 
antigüedad. 
Cabe recalcar que dado que el ADN antiguo presenta tanto degradación de la molécula como 
alteración de las bases y la presencia de los ya mencionados contaminantes el proceso de amplificación 
conllevas dificultades que no se presentan para el ADN moderno. 
En la Figura 6 se muestran las extracciones de restos óseos antiguos y en las Figuras 7 y 8 
donde se observan los llamados contaminantes, presentes en toda muestra de carácter antiguo. 
 
 
Carril Muestra 
1 MA (Chelex) 
2 MB (Chelex) 
3 MC (Chelex) 
4 MD (Chelex) 
5 MA (Dilución 1:10) 
6 MB (Dilución 1:10) 
7 MC (Dilución 1:10) 
8 MA (Isot) 
9 MB (Isot) 
10 MC (Isot) 
11 Control (+) 
12 (-) 
13 Contemporáneo 
 
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 
 
Figura 3. Amplificado de ADN a partir de restos óseos antiguos utilizando iniciadores de 
PCR para el haplogrupo A. Extracción utilizando diferentes metodologías. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
400 pb 
300 pb 
 
 
 
 
 
Figura 4. Amplificación de muestras contemporáneas y de restos antiguos. Uso de 
iniciadores de PCR para haplogrupo C. 1)Marcador de peso molecular 2)Muestra de 
ADN contemporáneo 3)Muestra de restos antiguos M7, extracción por fenol 
cloroformo 4)Muestra de ADN contemporáneo 5)Muestra de ADN contemporáneo. 
En los ensayos de extracción y amplificación de ADN antiguo se utilizaron diferentes métodos de 
extracción. Los resultados de amplificación difieren entre las muestras, lo que resulta en pensar que es 
necesario ensayar todos los métodos que sea posible hasta lograr obtener un amplificado de la muestra 
de interés. 
Este hecho se pudo deber a la diferente naturaleza y características particulares de cada 
muestra. Es decir, que los contaminantes presentes en cada una de las muestras difiere entre sí. Estos 
contaminantes son inhibidores de la PCR como ya se mencionó. En cuanto a la procedencia u origen de 
dichos inhibidores, se ha propuesto con anterioridad (Pavo S., 1989) que puede tratarse de compuestos 
del suelo (ácidos húmicos y/o fúlvicos, residuos de porfirinas y/o productos de su degradación y taninos 
entre otros) y/o de subproductos de degradaciónorgánica (productos de Maillard, productos de 
degradación del propio ADN, etc.). Adicionalmente se debe considerar que el ADN obtenido puede diferir 
cualitativamente, obteniéndose la gran mayoría, sino es que la totalidad del ADN, alterado 
molecularmente, lo que puede llegar e evitar el correcto trabajo de la polimerasa durante la PCR, en 
fragmentos muy pequeños y a concentraciones muy escasas, lo que afecta la visualización posterior a la 
electroforesis. 
Posteriormente se procedió a purificar los amplificados de ADN antiguo después de pasar por 
una electroforesis en gel de agarosa, utilizando columnas de matriz de sílica (QIAquick Gel Extraction 
Kit, Qiagen, Santa Clara, CA, U.S.A.) a la cual se une el ADN, en presencia de altas concentraciones de 
tiocianato de guanidinio como sal caotrópica, la cual también ayuda a disolver la agarosa. 
 
 
1 2 3 4 5 6 7 
 
 
 
 
 
 
 
 
400 pb 
300 pb 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Visualización de la electroforesis de amplificados de ADN moderno de 
células de epitelio bucal utilizado diferentes diluciones en la PCR. La amplificación 
fue para la región correspondiente al haplogrupo A. 1)marcador de peso molecular 
2)control negativo 3) dilución 1:100 4) 1:50 5)1:40 6)1:1 7)1:10. 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 6. Extracción de ADN antiguo de restos óseos. La figura muestra las 
diferentes fases que se forman en al extracción con el método fenol- 
cloroformo y con ello la separación de una gran cantidad de contaminantes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
ADN total 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 7. Prueba para observación de la presencia de ADN en la 
extracción de restos antiguos. ADN total (flechas negras). También 
se observan los contaminantes (flecha azul). Fotografía tomada con 
luz ultravioleta. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa para ADN antiguo. Se muestra 
la presencia de contaminantes en el extracto de ADN (manchas oscuras). 
Fotografía tomada con luz blanca. 
 
 
Posterior a la amplificación tanto del ADN moderno como del ADN antiguo se procedió a realizar 
el Microarreglo. 
 
 
 
5.2 SOLUCIONES PARA IMPRESIÓN 
 
 
 
La deposición o impresión del ADN a la laminilla se realizo utilizando diferentes soluciones de 
impresión (Figura 4): DMSO, formamida, CHAPS 1.6 mM, CHAPS 16 mM, DMSO/formamida, 
DMSO/CHAPS 1.6 mM, DMSO/CHAPS 16 mM y formamida/CHAPS 16 mM. 
 
 
 
DEPOSITO DE MUESTRA. 
LAMINILLA DE CORNING 
(12479471). MARCADO CON 
SYBRGREEN (DILUCION 1: 2000). 
 
 
 
 
•DMSO 
 
•FORMAMIDA 
 
•CHAPS 1.6 mM 
 
•CHAPS 16 mM 
 
•DMSO + FORMAMIDA 
 
•DMSO + CHAPS 1.6 mM 
 
•DMSO + CHAPS 16 mM 
 
•FORMAMIDA + CHAPS 16 mM 
 
 
DEPOSITO DE MUESTRA . LAMINILLA 
DE SCHOTT (SIN CODIGO DE BARRAS). 
MARCADO CON SYBRGREEN 
(DILUCION 1: 2000). 
 
Figura 9. Visualización de las laminillas impresas para la determinación de la solución 
óptima para la deposición del ADN. Arreglos idénticos se realizaron en laminillas 
comerciales de diferentes compañías. Los resultados fueron similares. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1 2 3 4 
 
 
 
 
A 
B 
C 
D 
E 
F 
G 
H 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 10. Distribución del Microarreglo elaborado para la 
prueba y optimización de las soluciones utilizadas durante la 
inmovilización del ADN. 
Tabla 1. Distribución general de las muestras en la laminilla para prueba con las diferentes 
 
soluciones para la inmovilización del ADN. 
 
 ADN 
MODERNO 
ADN 
MODERNO 
ADN 
ANTIGUO. 
Muestra 6. 
ADN 
ANTIGUO. 
Muestra 7. 
DMSO A1 A2 A3 A4 
FORMAMIDA B1 B2 B3 B4 
CHAPS 1.6 mM C1 C2 C3 C4 
CHAPS 16 mM D1 D2 D3 D4 
DMSO + 
FORMAMIDA 
 
E1 
 
E2 
 
E3 
 
E4 
DMSO + 
CHAPS 1.6 mM 
 
F1 
 
F2 
 
F3 
 
F4 
DMSO + 
CHAPS 16 mM 
 
G1 
 
G2 
 
G3 
 
G4 
FORMAMIDA + 
CHAPS 16 mM 
 
H1 
 
H2 
 
H3 
 
H4 
 
 
La inmovilización del ADN en la laminilla se evidenció por medio de SYBR Green I en dilución 
 
1:2000. El colorante SYBR Green I se une al surco menor del ADN bicatenario, pero no al ADN 
monocatenario, y dado que el ADN impreso en la laminilla hasta este momento es de doble cadena, las 
características de este colorante son ideales. A consecuencia de esta unión la fluorescencia es muy alta 
comparada con otros agentes utilizados para el mismo propósito, como el bromuro de etidio, siendo 
menos tóxico, mas específico y sensible (entre 10 y 25 veces) que este último (Haugland, 2002). La 
excitación de este fluoróforo se encuentra aproximadamente a 488nm y 254nm; y la emisión aproximada 
a 560 nm. En la impresión de la laminilla se realizó un pegado tanto de ADN moderno como de ADN 
antiguo (Tabla 1 y Figura 4), encontrando diferente comportamiento tanto en la intensidad y como en la 
definición de los depósitos al observar la impresión. La diferencia en la intensidad como en la 
consistencia morfológica se puede explicar por impedimentos estéricos de los contaminantes con la 
intercalación del SYBR Green I en la doble cadena de ADN, 
En lo que respecta a las soluciones de impresión utilizadas se encontraron dos situaciones 
óptimas para la impresión de ADN antiguo (Figura 6): 
• CHAPS 1.6 mM + formamida 
 
• CHAPS 1.6 mM + DMSO 
 
El detergente zwitteriónico CHAPS 16mM y el mismo con una concentración de 1.6mM en 
combinación con DMSO reducen la variación de los resultados de pegado del ADN de doble cadena, por 
el incremento de homogeneidad y reproducibilidad de la morfología de los depósitos. Estos resultados 
se evaluaron en tres diferentes laminillas: 
• Laminilla de CORNING (Código de barras: 12479471). Marcado con SYBR Green 
 
(Dilución 1: 2000). 
• Laminilla de SCHOTT (Sin código de barras).Marcado con SYBR Green (1: 2000). 
• Laminilla fabricada en CICATA-IPN (Sin código de barras). marcado con SYBR Green 
 
(1:2000) 
 
Los resultados se debieron posiblemente a que mientras el CHAPS no posee una carga formal, 
puede presentar interacciones electrostáticas acompañadas de un momento dipolar, a la par de que 
permite reducir la tensión superficial. De este modo logra estabilizar el medio fuertemente cargado del 
ADN depositado (la carga negativa proporcionada por el esqueleto de azúcar-fosfato del ADN 
acompañado de una carga positiva perteneciente a la superficie de la laminilla durante el proceso de 
secado) permiten la formación de depósitos con mayor homogeneidad, incrementando la 
reproducibilidad de los resultados. 
 
1 2 3 
 
 
 
Figura 11. Acercamiento de la Figura 4 para la señal generada en la deposición de 
muestras con diferentes soluciones; se muestra mayor homogeneidad en la 
morfología de las deposiciones y mayor intensidad de la señal en el grupo 1, donde 
se utilizó una mezcla 50/50 de DMSO y CHAPS 1.6 mM. Para la evidenciación del 
ADN se utilizó SYBRGreen I. 1)DMSO/CHAPS 1.6 mM, 2) control negativo, 3) 
DMSO 100%. 
 
 
F1 F2 F3 
 
 
 
 
 
 
 
A 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
B 
 
 
 
 
 
Figura 12. Acercamiento de uno de los Microarreglos. F1) ADN moderno, F2) 
Control negativo, F3) ADN antiguo; A) CHAPS 1.6 mM/ DMSO; B) DMSO 100% 
 
 
 
5.3 SONDAS 
 
La sondas para la determinación de los haplogrupos se diseñaron a partir de la secuencia del 
ADNmt humano de referencia (Human Mitochondrial DNA Revised Cambridge Reference Sequence) 
registrada en el Gene Bank del NCBI como REFSEQ AC_000021.2 gi:115315570 y HUMMTCG 
J01415.2 gi:113200490 y las especificaciones moleculares correspondientes de cada haplogrupo. 
 
 
Se consideró el amplificado teórico para cada haplogrupo teniendo en cuenta los iniciadores de PCR 
 
utilizados. 
 
 
 
Para el haplogrupo A la PCR el amplificado teórico resultó en la siguiente secuencia: 
 
611 GAAAATGTTT AGACGGGCTC ACATCACCCC ATAAACAAAT AGGTTTGGTC 
 
661 CTAGCCTTTC TATTAGCTCT TAGTAAGATT ACACATGCAA GCATCCCCGT 
 
711 TCCAGTGAGT TCACCCTCTA 
Para el haplogrupo C: 
 
5101 TAACTACTAC CGCATTCCTA CTACTCAACT TAAACTCCAGCACCACGACC 
 
5161 CTACTACTAT CTCGCACCTG AAACAAGCTA ACATGACTAA CACCCTTAAT 
 
5221 TCCATCCACC CTCCTCTCCC TAGGAGGCCT GCCCCCGCTA ACCGGCTTTT 
 
 
 
Para el haplogrupo D: 
 
5101 TAACTACTAC CGCATTCCTA CTACTCAACT TAAACTCCAG CACCACGACC 
 
5151 CTACTACTAT CTCGCACCTG AAACAAGCTA ACATGACTAA CACCCTTAAT 
 
5201 TCCATCCACC CTCCTCTCCC TAGGAGGCCT GCCCCCGCTA ACCGGCTTTT 
 
 
 
Como resultado de la labor de diseño de las sondas para la determinación de los haplogrupos se 
obtuvo lo que se lee a continuación. 
 
 
El haplogrupo A está definido por medio de RFLPs mediante la ganancia del sitio de corte en la 
posición 663 por la enzima Hae III (Torroni y col., 1992),, y de acuerdo al mecanismo de la enzima se 
presenta una transición de A por G en el sitio 663. 
El haplogrupo C está definido por medio de RFLPs mediante la ganancia de un sitio de 
restricción por la enzima Alu I en el nucleótido 13262 y la pérdida de un sitio de restricción por la enzima 
Hinc II en el nucleótido 13259 (Torroni y col., 1992), y de acuerdo al mecanismo de la enzima se 
presenta una transición de A por G en el sitio 13263. 
El haplogrupo D está definido por medio de RFLPs mediante la pérdida del sitio de corte en la 
posición 5178 por la enzima Alu I, y de acuerdo al mecanismo de la enzima se presenta una 
transversión de C por A en el sitio 5178. 
 
 
Considerando la región en que se encuentra cada una de las mutaciones se consideró la longitud 
de la sonda y la posición de la mutación con la finalidad de obtener una alta especificidad y temperatura 
de fusión similar entre todas las sondas considerando que la temperatura óptima tiene que ser lo 
suficientemente baja para permitir la hibridación específica entre la sonda y su secuencia 
complementaria, y lo suficientemente alta, como para impedir hibridaciones no específicas. 
Muchas fórmulas útiles y prácticas se han desarrollado para calcular la Tm para experimentos de 
PCR, Southerns, Northerns, y para hibridaciones in situ. La ecuación mas simple para calcular la Tm la 
proporcionada por Wallace y col. (1979) en donde A, G, C, y T corresponden al número de cada 
nucleótido presentes. Esta ecuación se desarrolló para oligonucleótidos de 14 a 20 bases: 
 
 
Tm=4(G+C)+2(A+T) (1) 
En el diseño de cada una de las sondas la Tm teórica se igualó con la finalidad de realizar los 
ensayos de hibridación a la misma temperatura de incubación durante la etapa misma de hibridación. La 
Tm teórica influyó en la longitud seleccionada del oligonucleótido, debido a que la ecuación utilizada 
para su cálculo considera la cantidad y proporción de 
Se optimizó la posición del nucleótido en que se presentaba la mutación de las sondas ya que en 
investigaciones anteriores (Suzuki S., 2007) se ha mostrado que la mayor capacidad de discriminación 
la presentan sondas en donde la mutación está ubicada en el centro de la secuencia. 
De acuerdo a Zhen (1994) la longitud de la secuencia es el factor que más influye en la 
estabilidad de la doble cadena. En general, las secuencias cortas poseen mayor capacidad de 
discriminación cuando se presentan bases no complementarias, pero con el costo de una menor 
estabilidad de la doble cadena, lo que probablemente causaría resultados negativos falsos. En cambio 
en l caso de secuencias largas la estabilidad de la cadena doble es alta y la capacidad de discriminación 
es baja lo que posiblemente ocasionaría resultados positivos falsos. Otro factor que podría influir en la 
elección e la longitud del oligonucleótido es la formación de estructuras secundarias (Saiki, 1989) 
formadas en la propia cadena sencilla. Si la estabilidad termodinámica de las estructuras secundarias es 
mayor que la estabilidad de la doble cadena formada entre la sonda y el ADN inmovilizado es poco 
factible que la sonda tenga acceso al sitio para el que esta diseñada a hibridar. Esto último se puede 
evitar aumentando la longitud de las sondas para tener la posibilidad de aumentar al temperatura 
durante la hibridación. 
 
 
El contenido de GC también tiene fuerte influencia sobre la estabilidad de la doble cadena. En el 
presente trabajo para las sondas diseñadas se procuró un contenido del 50 al 60% de GC. 
 
 
Sonda del haplogrupo A: 
 
 
 
Con 15 nucleótidos de longitud 
 
TGGTCCTGGCCTTTC Tm= 48 
TTGGTCCTGGCCTTT Tm= 46 
TTTGGTCCTGGCCTT Tm= 46 
GTTTGGTCCTGGCCT Tm= 48 
GGTTTGGTCCTGGCC Tm= 50 
AGGTTTGGTCCTGGC Tm= 48 
TAGGTTTGGTCCTGG Tm= 46 
ATAGGTTTGGTCCTG Tm= 44 
TGGTCCTGGCCTTTC Tm= 48 
GGTCCTGGCCTTTCT Tm= 48 
GTCCTGGCCTTTCTA Tm= 46 
TCCTGGCCTTTCTAT Tm= 44 
CCTGGCCTTTCTATT Tm= 44 
CTGGCCTTTCTATTA Tm= 42 
TGGCCTTTCTATTAG Tm= 42 
GGCCTTTCTATTAGC Tm= 44 
 
Con 17 nucleótidos de longitud 
 
TTGGTCCTGGCCTTTCT Tm= 52 
TGGTCCTGGCCTTTCTA Tm= 52 
TTTGGTCCTGGCCTTTC Tm= 52 
GGTCCTGGCCTTTCTAT Tm= 52 
GTTTGGTCCTGGCCTTT Tm= 52 
GTCCTGGCCTTTCTATT Tm= 50 
GGTTTGGTCCTGGCCTT Tm= 54 
TCCTGGCCTTTCTATTA Tm= 48 
AGGTTTGGTCCTGGCCT Tm= 54 
CCTGGCCTTTCTATTAG Tm= 50 
TAGGTTTGGTCCTGGCC Tm= 54 
CTGGCCTTTCTATTAGC Tm= 50 
ATAGGTTTGGTCCTGGC Tm= 52 
TGGCCTTTCTATTAGCT Tm= 48 
AATAGGTTTGGTCCTGG Tm= 50 
TGGCCTTTCTATTAGCT Tm= 48 
AATAGGTTTGGTCCTGG Tm= 50 
 
 
Para el haplogrupo C: 
 
 
 
Con 15 nucleótidos de longitud 
 
CAAGTCAGCTAGGAC 
 
 
 
 
 
Tm=46 
 AAGTCAGCTAGGACT 
AGTCAGCTAGGACTC 
GTCAGCTAGGACTCA 
TCAGCTAGGACTCAT 
AGCTAGGACTCATAA 
GCTAGGACTCATAAT 
CAAGTCAGCTAGGAC 
TCAAGTCAGCTAGGA 
TTCAAGTCAGCTAGG 
CTTCAAGTCAGCTAG 
ACTTCAAGTCAGCTA 
CACTTCAAGTCAGCT 
CCACTTCAAGTCAGC 
TCCACTTCAAGTCAG 
Tm=44 
Tm=46 
Tm=46 
Tm=44 
Tm=42 
Tm=42 
Tm=46 
Tm=44 
Tm=44 
Tm=44 
Tm=42 
Tm=44 
Tm=46 
Tm=44 
 
 
Con 16 nucleótidos de longitud 
 
 
TCAAGTCAGCTAGGAC 
CAAGTCAGCTAGGACT 
AAGTCAGCTAGGACTC 
AGTCAGCTAGGACTCA 
GTCAGCTAGGACTCAT 
 
Tm=48 
Tm=48 
Tm=48 
Tm=48 
Tm=48 
CAGCTAGGACTCATAA Tm=46 
AGCTAGGACTCATAAT Tm=44 
CAAGTCAGCTAGGACT Tm=48 
TCAAGTCAGCTAGGAC Tm=48 
TTCAAGTCAGCTAGGA Tm=46 
CTTCAAGTCAGCTAGG Tm=48 
ACTTCAAGTCAGCTAG Tm=46 
CACTTCAAGTCAGCTA Tm=46 
CCACTTCAAGTCAGCT Tm=48 
TCCACTTCAAGTCAGC Tm=48 
 
 
Para el haplogrupo D 
 
 
 
Con 17 nucleótidos de longitud 
 
GAAACAAGATAACATGA 
 
 
 
 
 
Tm=44 
 AAACAAGATAACATGAC 
AACAAGATAACATGACT 
ACAAGATAACATGACTA 
CAAGATAACATGACTAA 
AAGATAACATGACTAAC 
AGATAACATGACTAACA 
GATAACATGACTAACAT 
GAAACAAGATAACATGA 
TGAAACAAGATAACATG 
CTGAAACAAGATAACAT 
CCTGAAACAAGATAACA 
ACCTGAAACAAGATAAC 
CACCTGAAACAAGATAA 
GCACCTGAAACAAGATA 
CGCACCTGAAACAAGAT 
Tm=44 
Tm=46 
Tm=44 
Tm=44 
Tm=44 
Tm=44 
Tm=44 
Tm=44 
Tm=44 
Tm=44 
Tm=46 
Tm=46 
Tm=46 
Tm=48 
Tm=50 
 
 
Con 18 nucleótidos de longitud 
 
 
TGAAACAAGATAACATGA 
GAAACAAGATAACATGAC 
AAACAAGATAACATGACT 
AACAAGATAACATGACTA 
ACAAGATAACATGACTAA 
CAAGATAACATGACTAAC 
AAGATAACATGACTAACA 
AGATAACATGACTAACAT 
GAAACAAGATAACATGAC 
TGAAACAAGATAACATGA 
CTGAAACAAGATAACATG 
CCTGAAACAAGATAACAT 
ACCTGAAACAAGATAACA 
CACCTGAAACAAGATAAC 
GCACCTGAAACAAGATAA 
CGCACCTGAAACAAGATA 
 
Tm=46 
Tm=48 
Tm=48 
Tm=46 
Tm=46 
Tm=48 
Tm=46 
Tm=46 
Tm=48 
Tm=46 
Tm=48 
Tm=48 
Tm=48 
Tm=50 
Tm=50 
Tm=52 
 
 
 
 
 
F
lu
o
rescen
cia
 
A
b
so
rb
a
n
ci
a
 
 
 
tabla: 
Las temperaturas de fusión teóricas obtenidas para cada sonda se observan en la siguiente 
 
 
 
Tabla 2. Temperaturas de fusión teóricas para cada una de las sondas. 
 
SONDA Temperatura de fusión 
 
teórica (Tm) 
Haplogrupo A 5´ TGG-TCC-TGG-CCT-TTC 3' 48 °C 
Haplogrupo C 5´ TCA-AGT-CAG-CTA-GGA-C 3' 48°C 
Haplogrupo D 5´ TGA-AAC-AAG-ATA-ACA-TGA-C 3´ 50°C 
 
 
Posteriormente se eligieron las moléculas fluorescentes más adecuadas al equipo disponible en 
el centro de trabajo para el marcaje de las sondas, con la finalidad de evidenciar la hibridación de las 
sondas con el ADN inmovilizado en las laminillas. Se consideraron los espectros de absorción y emisión 
de diferentes moléculas fluorescentes disponibles comercialmente para marcaje de oligonucleótidos 
considerando las especificaciones del equipo disponible, filtros y láseres (Tabla 4), para evidenciar la 
hibridación. En este puntose buscó que los picos máximos de absorción coincidieran con los láseres y 
los picos máximos de excitación coincidieran con los filtros, como se observa para el caso del Texas 
Red en la Figura13. Asimismo se consideraron los espectros de absorción y emisión para poder 
distinguir entre cada una de las sondas, que se marcaron con diferentes moléculas. 
 
 
 
 
 
 
Incidencia del 
láser de 594 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Longitud de onda (nm) 
 
Figura 13. Acoplamiento del pico de absorción de la molécula 
fluorescente Texas Red con uno de los láseres disponibles 
 
 
Tabla 3. Marcas fluorescentes más comunes disponibles comercialmente 
para oligonucleótidos. * Grupos de moléculas fluorescentes, marcas registradas 
de Molecular Probes. 
 
 
Molécula 
Absorción 
máxima (nm) 
Emisión 
máxima (nm) 
 
 
 
 
 
5’ Conjugados de 
forforoamidita 
Fluoresceina 492 520 
6-FAM 494 525 
TET 521 536 
HEX 535 556 
Cy3 552 570 
Cy5 643 667 
Cy5.5 675 694 
 
 
 
5’ o 3’ Conjugados 
NHS-éster 
TAMRA 565 580 
ROX 585 605 
JOE 520 548 
Cy3 552 570 
Cy5 643 667 
 
 
 
 
3’ Conjugados CPG 
6-FAM 494 525 
TAMRA 565 580 
Dabcyl Opacador de fluorescencia 
Black HoleTM-1 
Black HoleTM-2 
 
Opacador de fluorescencia 
 
 
 
 
(5' o 3') 
Texas Red® 583 603 
*Alexa Dyes - - 
Oregon GreenTM 492 517 
*Bodipy Dyes® - - 
QSYTM-7 Opacador De fluorescencia 
 
 
 
 
Una vez considerada la compatibilidad entre los picos máximos de absorción y emisión de las moléculas 
fluorescentes disponibles se mejoró la elección considerando el coeficiente de extinción molar y 
rendimiento cuántico de las moléculas fluorescentes, así como el precio y capacidad de la empresa 
proveedor para un pronto abastecimiento. El coeficiente de extinción molar (E) y el rendimiento cuántico 
(QY) fueron considerados con detalle (Tabla 5) con la finalidad de elegir aquellos fluoróforos con 
posibilidad de presentar mayor intensidad en la señal generada al realizar la lectura del Microarreglo. 
Estos dos últimos factores considerados al ser multiplicados dan una idea de la intensidad de señal que 
generan al hacer incidir la misma cantidad de energía sobre diferentes fluoróforos. 
 
 
Tabla 4. Equipo disponible para 
 
Evidenciar la hibridación. 
 
FILTROS LÁSER 
505 LP 488nm 
512 BP 532nm 
550 LP 594nm 
560 BP 633nm 
605 LP 
615 BP 
675 BP 
 
 
Tabla 5. Características de los fluoróforos elegidos en primer instancia para 
el marcaje de las sondas. 
Dye Emission max - E QY (QY*E) 
 (nm) 
6-FAM 520 0.9 67500 
Fluorescein-dT 522 0.9 67500 
TET 541 0.9 77400 
HEX 553 0.7 67200 
TAMRA 580 0.7 62300 
Cy3 563 0.1 13600 
Cy3.5 604 0.35 40600 
Cy5 662 0.2 50000 
Cy5.5 707 
Texas Red 603 0.9 100800 
Yakima Yellow 549 0.96 80448 
Redmond Red 595 0.84 62160 
De este análisis resultaron como los mejores para los propósitos del trabajo los siguientes 
 
fluoróforos: 
 
Tabla 6. Fluoróforos compatibles 
con los láseres disponibles 
 
Fluoróforo 
Láser 
adecuado 
 
6 FAM 488 
HEX 532 
Texas Red 594 
 
 
Las sondas resultantes considerando los factores mencionados anteriormente (Para el 
oligonucleótido: longitud, posición de la mutación, temperatura de alineamiento, secuencia. Para el 
fluoróforo: compatibilidad de los picos de absorción y emisión con los láseres y filtros respectivamente, 
rendimiento cuántico, coeficiente de extinción molar, disponibilidad y precio) se muestran en la Tabla 6. 
 
Tabla 7. Longitud, secuencia y marcaje de las sondas para determinar los 
polimorfismos de un sólo nucleótido característico de cada haplogrupo. 
 
SONDAS 
Clave Marcaje 5' Secuencia Número de 
nucleótidos 
HAPLOA 6FAM 5´ TGG-TCC-TGG-CCT-TTC 3' 15 
HAPLOC HEX 5´ TCA-AGT-CAG-CTA-GGA-C 3' 16 
HAPLOD Texas Red 5´ TGA-AAC-AAG-ATA-ACA-TGA-C 3´ 19 
 
 
5.4 PURIFICACIÓN DEL ADN 
 
 
 
Se purificó el amplificado ADN obtenido por medio de columnas columnas de matriz de sílica 
(QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Santa Clara, CA, U.S.A.) sin embargo se observó un decremento 
drástico en la concentración del ADN al observarlo por electroforesis en gel de agarosa al 1.5% (no se 
muestra imagen), por lo que se procedió a purificar los amplificados por precipitación con etanol. Este 
hecho pudo ser causado por la saturación de la columna debido a los altas concentraciones de ADN 
(moderno) amplificado para realizar repetidos ensayos, lo que impide recuperar todo el ADN e implica 
utilizar varias columnas para recuperarlo. 
5.5 PROCESO DE FABRICACIÓN DEL MICROARREGLO 
 
Del proceso de diseño del Microarreglo resultó un protocolo para la inmovilización de 
amplificados de ADN, el cual permitió obtener una adecuada reproducibilidad de los resultados. Este 
protocolo se presenta a continuación: 
 
 
IMPRESIÓN 
 
Una vez amplificado y purificado el ADN de fuentes contemporáneas como antiguas (de las que 
fue posible) se procedió a la deposición de este utilizando la solución previamente definida como óptima 
para este paso durante el trabajo (DMSO/CHAPS 1.6 mM). 
 
 
INMOVILIZACIÓN DE ADN 
 
Para la inmovilización de ADN se utilizó un primer paso de calentamiento directo en 
pancha caliente de la laminilla por el lado no impreso y un segundo paso con luz UV hasta 260 
mJ por el lado impreso. 
 
 
PREHIBRIDACIÓN 
 
El objetivo del paso de prehibridación es el obtener la mayor especificidad posible durante 
la hibridación, al tiempo de minimizar la fluorescencia de fondo, la cual afecta negativamente los 
resultados. 
La cubierta de aminosilano de la lámina que se eligió para la inmovilización permite la 
unión del ADN con un alta eficiencia. Sin embargo previo a la hibridación los grupos amino que 
quedaron libres de ADN se bloquearon con la finalidad de evitar señales inespecíficas debidas a 
la posible unión de las sondas con estos. Diferentes investigadores (Erie Scientific Company, 
2003) utilizan bloqueos químicos con anhídrido succínico (Núm. CAS 108-30-5) sin embargo se 
implementó una solución fácil de elaborar y no tóxica (5X SSC, 0.1% SDS y 1% BSA), 
incubando a 42°C durante de 45 min a 60 min, lo que resultó efectivo, pues se eliminaron las 
uniones inespecíficas en el área donde no se inmovilizó ADN intencionalmente. 
La prehibridación tiene como ventaja adicional la remoción de ADN que no se unió a la 
superficie de la lámina, lo cual puede interferir en el proceso de hibridación al impedir el 
adecuado acercamiento de la sonda al ADN inmovilizado, lo cual se apoya de acuerdo a previos 
estudios realizados por Flikka K. (2004) en los que inclusive la longitud de los amplificados 
inmovilizados influyen en la eficiencia de hibridación. 
Posterior a la incubación dentro del mismo paso de prehibridación se transfirieron las 
laminillas a una solución de 0,1X SSC, incubando a temperatura ambiente (25°C) durante 5 min. 
Este paso se realizó por segunda vez. 
Se sumergieron las laminillas en agua desionizada por 30 segundos. Y finalmente se 
secaron por centrifugación a 1200 rpm por 1.5 min. 
 
 
DESNATURALIZACIÓN 
 
Este paso se utilizó para separar la doble cadena de los amplificados de PCR y permitir 
consecuentemente la hibridación. El proceso de calentamiento utilizado durante la 
inmovilñización tiene efecto sobre la apertura de la doble cadena, sin embargo para mejores 
resultados y una mayor cantidad de hebras sencillas se implemento este paso, que consistió en 
el calentamiento de la laminilla en agua hirviendo durante 1 minuto. En este punto además se 
evitan los entrecruzamientos entre las cadenas inmovilizadas. Posteriormente se sumergió la 
laminilla en etanol enfriado en hielo al 95% por un minuto y se secó la laminilla con aire seco 
limpio. 
 
 
5.6 HIBRIDACIÓN 
 
Se realizaron los ensayos de hibridación utilizando una solución de 1.5 pmol/microlitro de la 
sonda; se necesitaron 20 microlitros de la solución para cubrir la superficie impresa. Se