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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS Departamento de Biotecnología “Extractos de plantas micropropagadas de Aristolochia elegans Mast. con actividad relajante en la contracción inducida por veneno de alacrán (Centruroides limpidus limpidus Karsch.) en íleon aislado de cobayo” T E S I S P R E S E N T A ALEJANDRO MORA IZQUIERDO DIRECTOR: Dr. ANTONIO JIMÉNEZ APARICIO Que para obtener el grado de M a e s t r o e n C i e n c i a s e n Desarrollo de Productos Bióticos Yautepec, Morelos Dic, 2004 EL TRABAJO EXPERIMENTAL DE ESTA TESIS SE REALIZÓ EN EL DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA DEL CEPROBI–IPN Y EN LOS LABORATORIOS DE BIOTECNOLOGÍA VEGETAL Y DE FARMACOLOGÍA DEL CENTRO DE INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA DEL SUR–IMSS. EL DR. ANTONIO JIMÉNEZ APARICIO FUE EL DIRECTOR DE ESTA TESIS Y SE CONTÓ CON LA VALIOSA ASESORÍA DE LA DRA. ELSA VENTURA ZAPATA Y LA DRA. LIDIA OSUNA TORRES; ADEMÁS DE LAS CONTRIBUCIONES DEL DR. ENRIQUE J. JIMÉNEZ FERRER, LA DRA. SILVIA EVANGELISTA LOZANO Y EL DR. ROBERTO MONTES BELMONT. RECONOCIMIENTOS AL CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA POR LA BECA RECIBIDA PARA LA REALIZACIÓN DE ESTUDIOS DE MAESTRÍA Y EL APOYO PARA LA REALIZACIÓN PARCIAL DE ESTE TRABAJO. AL PROGRAMA DE FORMACIÓN DE INVESTIGADORES DEL IPN POR EL APOYO RECIBIDO COMO BECARIO EN LOS PROYECTOS CGPI 20030340, 20030343 Y 20040547. A mis padres, su amor y respeto por la naturaleza ha sido un ejemplo que me ha impulsado a seguir esta disciplina del conocimiento. A mi familia, una de las razones mas importantes que me hacen continuar adelante. A mis profesores, compañeros y amigos de hoy y de siempre… CONTENIDO ÍNDICE DE CUADROS ÍNDICE DE FIGURAS LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS GLOSARIO RESUMEN ABSTRACT 1 INTRODUCCIÓN 2 ANTECEDENTES 2.1 PLANTAS MEDICINALES 2.2 IMPORTANCIA DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS 2.3 MICROPROPAGACIÓN 2.4 GÉNERO Aristolochia 2.5 Aristoloch a elegans i 2.6 ENVENENAMIENTO POR PICADURA DE ALACRÁN 2.7 PLANTAS USADAS EN EL TRATAMIENTO DE PICADURA DE ALACRÁN 2.8 GÉNERO Aristolochia EN EL TRATAMIENTO DE PICADURA ALACRÁN 2.9 EVALUACIÓN FARMACOLÓGICA 3 JUSTIFICACIÓN 4 OBJETIVOS 4.1 OBJETIVO GENERAL 4.2 OBJETIVOS PARTICULARES 5 MATERIALES Y MÉTODOS 5.1 MATERIALES 5.1.1 Material biológico 5.1.2 Reactivos y material de laboratorio 5.2 METODOLOGÍA EXPERIMENTAL pag. i ii iv vi 1 2 3 6 6 8 9 12 13 16 18 18 20 23 24 24 24 25 25 25 25 25 5.3 MICROPROPAGACIÓN Y CULTIVO 5.3.1 Condiciones generales de preparación de medio de cultivo 5.3.2 Desinfestación de semillas 5.3.3 Inducción de brotes 5.3.4 Multiplicación y elongación de brotes 5.3.5 Inducción de raíces 5.3.6 Aclimatización 5.3.7 Cultivo en invernadero y cosecha 5.4 EVALUACIÓN FARMACOLÓGICA 5.4.1 Obtención de extractos 5.4.2 Obtención de veneno 5.4.3 Animales de experimentación 5.4.4 Preparación de soluciones stock 5.4.5 Preparación del equipo y cámara de incubación 5.4.6 Contracción inducida por veneno de alacrán 5.4.7 Prueba de relajación 5.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICOS 6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.1 MICROPROPAGACIÓN 6.1.1 Desinfestación de semillas 6.1.2 Inducción de brotes 6.1.3 Multiplicación y elongación de brotes 6.1.4 Inducción de raíces 6.1.5 Aclimatización 6.1.6 Desarrollo en invernadero y cosecha 6.2 EVALUACIÓN FARMACOLÓGICA 6.2.1 Obtención de extractos 6.2.2 Cuantificación de la contracción inducida por el veneno 6.2.3 Prueba de relajación 7 CONCLUSIONES 8 PERSPECTIVAS 9 BIBLIOGRAFÍA 26 26 26 28 30 30 32 33 35 35 35 36 36 36 38 38 39 40 40 40 43 47 48 50 54 56 56 57 58 62 64 66 ÍNDICE DE CUADROS Cuadro 1. Compuestos químicos encontrados en A. elegans. Cuadro 2. Tratamientos para la desinfestación de semillas de A. elegans mediante la combinación de tres concentraciones de NaClO con tres tiempos de inmersión. Cuadro 3. Tratamientos con los fito-reguladores ANA y/o BAP para la inducción de brotación múltiple en dos tipos de explante (yemas apicales y yemas axilares). Cuadro 4. Tratamientos con los fito-reguladores AIB y ANA para la inducción de raíces en explantes de yemas axilares. Cuadro 5. Efecto de soluciones de NaClO a diferentes concentraciones y tiempos de inmersión, en la desinfestación de semillas. Cuadro 6. Efecto del uso de etanol al 70% con diferentes tiempos de inmersión combinado con el tratamiento E (NaClO 1.0 % / 10 min), en la desinfestación de semillas. Cuadro 7. Formación de brotes en yemas apicales y axilares por efecto de diferentes tratamientos con fito-reguladores. Cuadro 8. Formación de raíces en yemas axilares por efecto de diferentes tratamientos con los fito-reguladores AIB y ANA. Cuadro 9. Valores de velocidad específica de cambio de los cuatro parámetros de crecimiento de las plantas, evaluados durante la etapa de aclimatización. Cuadro 10. Valores de humedad relativa (HR) y potencial hídrico (Ψ) dentro del sistema hidropónico y la cámara de incubación, durante las primeras cinco semanas de aclimatización. Cuadro 11. Material vegetal cosechado de plantas cultivadas de A. elegans. Cuadro 12. Rendimientos de extracción de las plantas cultivadas de A. elegans. Cuadro 13. Efecto de los extractos de las partes aéreas y raíces de A. elegans sobre la relajación del íleon contraído por efecto del veneno de alacrán. pag. 15 27 29 31 40 41 43 49 51 53 55 56 59 i t ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Distribución en México de las especies de alacranes de mayor peligro para los humanos, todas pertenecientes al género Centruroides. Figura 2. Flor de Aris olochia elegans. Figura 3. Diagrama de flujo del desarrollo experimental. Figura 4. Diagrama de flujo de la desinfestación de semillas. Figura 5. Representación de los sitios de corte en las plántulas para obtener los explantes. Figura 6. Esquema en el que se muestran las diferentes fases de micropropagación de A. elegans. Figura 7. Equipo de prueba para el modelo de íleon aislado de cobayo. En (a), fotografía del equipo y principales componentes; y (b), esquema que representa la cámara de incubación. Figura 8. Ejemplo de los registros gráficos típicos proporcionados por el equipo y los componentes para obtener el porcentaje de relajación. Figura 9. Efecto de diferentes tratamientos en la desinfestación de semillas de A. elegans. En (a) se representan los valores obtenidos mediante tratamientos de NaClO y en (b) los valores de etanol 70 % en diferentes tiempos de inmersión combinado con el tratamiento E. En (a), los valores representan la media de tres unidades experimentales y en (b), de seis + error estándar. Figura 10. Fotografías que representan los brotes formados por efecto de BAP 10 µM (tratamiento 4) en yemas axilares (A) y yemas apicales (B). Figura 11. Efecto de los diferentes tratamientos de fito-reguladores, en la formación de brotes en yemas apicales y yemas axilares. Los valoresrepresentan la media de tres unidades experimentales + error estándar. Figura 12. Vistas diferentes de cuatro tratamientos de fito-reguladores para la inducción de brotes en yemas axilares. Figura 13. Efecto de diferentes tratamientos de fito-reguladores en la formación de raíces en yemas axilares. Los valores representan la media de tres unidades experimentales + error estándar. pag. 3 14 25 26 28 30 37 39 42 44 45 47 50 ii Figura 14. Cinética de desarrollo de las plantas durante la aclimatización. En (a), se representa la longitud de la raíz y de la parte aérea. En (b), el número de raíces secundarias y de nudos. Los valores representan la media de 72 plantas ± desviación estándar. Figura 15. Imagen de las plantas de A. elegans en el quinto mes de cultivo en el invernadero. Figura 16. Efecto de la concentración de veneno de alacrán sobre la contracción del íleon. En (a) la primera curva de la respuesta de contracción con concentraciones en intervalos logarítmicos y en (b), la segunda curva en el intervalo de concentración de 10-100 µg/ml. Los valores representan la media de tres determinaciones ± error estándar. Figura 17. Dos registros sobrepuestos de la prueba de relajación. En (A), la respuesta de contracción por aplicación del veneno (40 µg/ml) y en (B), la respuesta de relajación por la aplicación del veneno (40 µg/ml) + extracto metanólico de partes aéreas (200 µg/ml). Figura 18. Efecto de relajación del íleon (contraído por acción del veneno de alacrán), como resultado de la aplicación de los extractos en diferentes concentraciones. Los valores representan la media de seis determinaciones ± error estándar. La línea más gruesa corresponde con la curva del Extracto Hexánico de raíces de plantas silvestres reportado por Jiménez (2004) y en el reporte original los valores representan la media de cinco determinaciones. 51 55 57 58 60 iii LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS AIA ácido indolacético AIB ácido indolbutírico ANA ácido naftalenacético BAP 6-bencilaminopurina DL50 dosis letal media EE error estándar de la media EH extracto hexánico EM extracto metanólico ES peso del extracto seco EtOH etanol F(ab´)2 fragmentos de anticuerpos purificados que se obtienen del suero de caballos hiper- inmunizados con venenos. FCA fuerza de contracción A FCB fuerza de contracción B H humedad HR humedad relativa IBE índice de brotes por explante IRE índice de raíces por explante MI peso de la muestra inicial (antes del secado) MF peso de la muestra final (después del secado) MS medio de cultivo Murashige-Skoog MV material vegetal de inicio (en la extracción) iv NES número de explantes sembrados NaClO hipoclorito de sodio NSS número de semillas sembradas NSD número de semillas desinfestadas PA partes aéreas PLA2 fosfolipasa-A2 p/v peso a volumen RA raíces RE rendimiento de extracción RI valor de relajación del íleon SD semillas desinfestadas SE sistema entérico, que se refiere al sistema nervioso en el intestino t tiempo de un intervalo TBU número total de brotes por unidad experimental TRU número total de raíces por unidad experimental UE unidad experimental; es la entidad en la cual se aplicó un tratamiento VE velocidad específica VNI valor numérico inicial (del parámetro de crecimiento) VNF valor numérico final (del parámetro de crecimiento) Ψ potencial hídrico % porcentaje v GLOSARIO Aclimatización: es el fortalecimiento que desarrollan las plantas cultivadas in vit o para tolerar las condiciones ex vitro mediante un sistema artificial controlado por el hombre. r Agrolita: material volcánico utilizado en la preparación de sustratos de cultivo. Está compuesto de pequeñas piedras (1-4 mm de diámetro) muy ligeras y con excelentes propiedades de aireación y retención de humedad. Alacranismo: ocurrencia de picaduras de alacrán en personas y el problema de salud pública que implica. Anafilaxia: sensibilidad excesiva de algunas personas a la acción de ciertas sustancias presentes en los alimentos y/o medicamentos. Autacoide: sustancia formada por un grupo de células que a nivel local altera la función de otras. Bioprospección: la búsqueda de aplicaciones útiles de los organismos vivos o sus derivados. Desinfestación de semillas: eliminación de esporas y otros microorganismos que se encuentran en la superficie de las semillas. Edema: hinchazón blanda de una parte del cuerpo, que cede a la presión. Elongación: alargamiento. Emenagogo: remedio que provoca la regla o evacuación menstrual de las mujeres. Embriogénesis somática: proceso mediante el cual se obtienen embriones a partir de células somáticas (no sexuales) de cualquier tipo de tejido. Eritema: enrojecimiento persistente de la piel o las mucosas, generalizado o localizado, debido a vasodilatación y congestión capilar. Etnobotánica: rama de la botánica que estudia la interacción entre las plantas y los seres humanos en las sociedades antiguas y actuales. Explante: pequeño fragmento de una planta (hoja, tallo, raíz, yemas, anteras, etc.) para iniciar un cultivo in vitro. vi Extracto: producto sólido o espeso obtenido por evaporación del disolvente utilizado para extraer sustancias de algún material (vegetal o animal). Fito-reguladores: sustancias naturales (fito-hormonas) o artificiales que controlan el crecimiento y desarrollo de una planta. Herbolaria: práctica terapéutica en la que se utilizan plantas medicinales. Hidroponía: técnica de cultivo de plantas con la adición de soluciones nutritivas que no incluye el uso de tierra. Íleon: tercera porción del intestino delgado de los mamíferos que se encuentra entre el yeyuno y el ciego. Índice: expresión numérica de la relación entre dos cantidades. Inducción: provocar el estímulo para obtener una respuesta. Irradiancia: es el flujo de energía radiante recibido por unidad de superficie plana. Laparotomía: operación quirúrgica que consiste en abrir las paredes abdominales. Liofilizar: separar el agua de una sustancia, o de una disolución, mediante congelación y posterior sublimación a presión reducida del hielo formado. Macerar: mantener sumergido algún material sólido en un líquido a temperatura ambiente, con el fin de ablandarlo o de extraer de él las sustancias solubles. Medio: la suma de las influencias externas que modifican el crecimiento, la estructura y reproducción de los organismos en un lugar dado. Metabolitos secundarios: sustancias producidas por las plantas que tienen un papel muy importante en su adaptación al ambiente. Micropropagación: procedimiento que consiste en la multiplicación vegetativa in v o para regenerar nuevas plantas a partir de un explante. itr Neurotransmisor: sustancia liberada selectivamente de una terminal nerviosa por la acción de un potencial de acción, que transmite los impulsos nerviosos en la sinapsis. Nudo: La parte de un tallo donde una o más hojas están pegadas, donde se encuentra la yema axilar. vii Peat moss: materia orgánica seca proveniente de musgos que se utiliza en la preparación de sustratos para cultivo. Plántula: planta joven que resulta de la germinación de la semilla. Potencial hídrico: es el potencial químico del agua en un sistema o parte de un sistema, expresado en unidades de presión, comparado con el potencial químico del agua pura a la presión atmosférica y a las mismas temperaturas y altura, y con el potencial químico del agua de referencia fijado en cero. Solución Tyrode: solución isotónica. Sustentabilidad: es un proceso que hace referencia a una forma de desarrollo en la que se busca el bienestar humano sin dañar el equilibrio del ambiente y sus recursos naturales. Sustrato:material que sirve de soporte a una planta. Totipotencia: se refiere a que cada célula vegetal tiene la misma información genética que le permite desarrollar por sí misma un individuo idéntico a la planta de la cual se derivó. Vermiculita: material volcánico (silicato de aluminio) utilizado en la preparación de sustratos para cultivo, que tiene la característica de retener hasta cuatro veces su peso en agua. Yema: tallo embriónico protegido por hojas jóvenes y es el sitio de crecimiento ubicado en la punta de las ramas (yema apical) o en los nudos (yema axilar). viii RESUMEN Aristolochia elegans Mast. es una planta que crece de manera silvestre en México y que se utiliza en la medicina tradicional para aliviar los efectos de la picadura de alacrán. Como una alternativa biotecnológica de producción, en este trabajo se estableció la metodología para la micropropagación de A. elegans, que incluyó las siguientes etapas: desinfestación, inducción de brotes, enraizamiento y elongación; así como aclimatización a condiciones ex vitro (mediante un sistema hidropónico). Posteriormente, las plantas se cultivaron en invernadero y al término de cinco meses se cosecharon las partes aéreas y raíces. Una vez seco el material vegetal, se obtuvieron extractos con metanol y hexano. Finalmente, como un indicativo de la actividad farmacológica anti-veneno de alacrán, se aplicaron diferentes concentraciones de los extractos en un modelo biológico in vi ro; en el que se evaluó la respuesta de relajación en íleon aislado de cobayo previamente contraído por efecto del veneno de alacrán Centruroides limpidus limpidus. t r Los principales resultados fueron los siguientes: se obtuvieron plántulas asépticas por la germinación de semillas desinfestadas mediante un protocolo establecido en este trabajo, que incluyó lavados con detergente, etanol e hipoclorito de sodio. Las plántulas asépticas se utilizaron como fuente de explantes. El tratamiento con BAP 10 µM indujo la formación del mayor número de brotes por explante (3.1 en promedio); mientras que con AIB 1.5 µM se indujo la mayor formación del número de raíces por brote (12 en promedio). La aclimatización mediante el sistema hidropónico permitió obtener el 100 % de supervivencia de las plantas en condiciones ex vitro y las plantas en el invernadero alcanzaron una altura de 1.33 m después de cinco meses de cultivo. Se obtuvo mayor rendimiento en los extractos con metanol que con hexano. En la evaluación farmacológica in vitro, con la mayor concentración de los extractos aplicados (300 µg/ml), se alcanzaron valores en el intervalo de 42 al 73 % de relajación, semejantes a los reportados con extractos de raíces de plantas silvestres. Se concluye que con la metodología establecida para la propagación in vit o de A. elegans y su crecimiento en invernadero, se obtuvieron plantas que contienen los metabolitos secundarios con la capacidad de relajar en íleon aislado de cobayo, la contracción inducida por efecto del veneno de alacrán (C. limpidus limpidus), de manera semejante a la reportada para plantas silvestres. – 1 – ABSTRACT Aristolochia elegans Mast. is a plant that grows wild in Mexico and is used in folk medicine to alleviate the effects of scorpion sting. As a biotechnological alternative of production, in this work was established the methodology for the micropropagation of A elegans that included the following stages: disinfestation, shoot induction, rooting and elongation; as well as acclimatization to ex-vi ro conditions (using a hydroponic system). Further, the plants were cultivated in the greenhouse and at the end of five months the aerial parts and roots were harvested. Once the vegetal material was air dried, extracts were obtained with methanol and hexane. Finally, as an indicative of the pharmacological action as anti- scorpion venom, different concentrations of the extracts were applied in a in vit o biological model, that consisted in evaluating the response of relaxation in isolated guinea-pig ileum (contracted by the effect of scorpion venom Centruroides limpidus limpidus). . t r t - The main results were: aseptic plantlets were obtained by germination of disinfested seeds by means of the established protocol in this work that included washes with detergent, ethanol and sodium hypochlorite. The aseptic plantlets were used as a source of explants. The treatment with BAP 10 µM induced the formation of the highest number of shoots for explant (3.1 on the average); while the maximum number of roots by explant (12 on the average) was induced with IBA 1.5 µM. The acclimatization by means of the hydroponic system allowed obtaining 100% of survival of the plants in ex-vi ro conditions and the plants in the greenhouse reached a height of 1.33 m after five months of cultivation. The yield of the extracts with methanol was higher than the obtained with hexane. In the pharmacological in-vitro test, values in the range of 42 to 73 % of relaxation were reached with the highest concentration of the applied extracts (300 µg/ml), similar to those reported with root extracts of wild plants. It was concluded that with the methodology established for the in vitro propagation of A. elegans and growth in the greenhouse, were obtained plants that contain secondary metabolites with the ability to relax the isolated guinea-pig ileum, previously contracted by effect of the scorpion venom (C. limpidus limpidus), in a similar way to the one reported for wild plants. – 2 – 11 iinnttrroodduucccciióónn INTRODUCCIÓN INTRODUCCIÓN El alacranismo se considera un problema de salud pública en México donde ocho especies tóxicas para el ser humano se encuentran distribuidas a lo largo de su territorio y todas ellas pertenecen al género Centruroides (Figura 1). La especie Centruroides limpidus limpidus Karsch. es la segunda en orden de toxicidad y se localiza en la región que abarca todo el estado de Morelos y parte de Guerrero, México, Puebla y Michoacán (Dehesa y col., 1995). La presencia de C. limpidus limpidus se ve reflejada en los altos índices de morbilidad por picaduras de alacrán reportados para dichos estados, entre los que resalta Morelos donde se presenta la mayor tasa de incidencias a nivel nacional (Secretaría de Salud, 2004). C. suffusus suffusus C. sculpturatus y pallidiceps C. limpidus limpidus C. limpidus tecomanus C. infamatus infamatus C. elegans C. noxius Figura 1. Distribución en México de las especies de alacranes de mayor peligro para los humanos, todas pertenecientes al género Centruroides (Adaptado de Dehesa y co ., 1995). l r r t Durante muchos años la medicina tradicional mexicana ha usado plantas para el tratamiento de la picadura de alacrán, incluyendo especies pertenecientes al género A istolochia. La etimología griega del término A is olochia podría ser ‘aristokeia, que da a luz los mejores hijos’, lo que se relaciona con uno de sus principales usos que es el de favorecer el parto y contribuir a la expulsión de la placenta (Camacho, 1990). – 3 – INTRODUCCIÓN En náhuatl, estas plantas se conocen con el nombre de ‘ lacopatli, vara o junquillo medicinal’ (Rojas, 1998). Francisco Hernández (1959) hace referencia de varios tlacopatli y de sus aplicaciones como remedio en sus estudios realizados entre los años 1571-1576; pero es notorio que no mencionó la pretendida propiedad contra veneno, o como remedio al momento del parto; lo cual no se sabe si atribuirla a que los indígenas ocultaron esas propiedades, o que Hernández no consideró esas plantas como remedio efectivo para tales casos (Martínez, 1959). t . Aristolochia elegans Mast. es una especie originaria de Brasil. En México se conoce comúnmente como ‘guaco’, ‘pato’ o ‘tlacopatli’, donde crece de manera silvestre en varios estadosde la república. A. elegans podría ser la especie vegetal más usada en el estado de Morelos para el tratamiento de picaduras de alacrán (Monroy y Castillo, 2000; Jiménez, 2004). Se ha demostrado mediante pruebas de laboratorio que las raíces de plantas silvestres de A elegans tienen la capacidad de antagonizar algunos efectos causados por el veneno de alacrán (Jiménez, 2004); esta propiedad resulta interesante para el desarrollo de nuevos productos que permitan ofrecer una alternativa de solución a este problema de salud como un tratamiento efectivo, económico, fácil de obtener, almacenar y administrar. Nuestro país es reconocido como uno de los de mayor riqueza vegetal en el mundo, pues se estima que existen más de 30 mil especies de plantas en su territorio. De esta diversidad vegetal, se han registrado alrededor de 4 mil especies con atributos medicinales; lo que ha llevado a México a ser clasificado en el 2° lugar a nivel mundial en cuanto a riqueza de plantas medicinales (Conabio, 1998). Por otro lado, se estima que el 80% de la población mexicana usa plantas medicinales y la frecuencia de su uso puede ser cotidiana o esporádica, dependiendo de la región y del nivel socioeconómico de la población (Taddei y col., 1999; Castellanos, 2002). En las zonas rurales se utilizan frecuentemente plantas como A. elegans para el tratamiento de los efectos del envenenamiento por picadura de alacrán, debido a que los alacranes viven en las cercanías de las viviendas y la atención médica es escasa. Sin embargo, es preocupante saber que más del 90 % de las plantas medicinales que se utilizan en México son de origen silvestre y que no existen programas agro-biológicos para hacer un uso racional y sustentable de este recurso vegetal; por lo que su colecta – 4 – INTRODUCCIÓN indiscriminada ha contribuido a la reducción de las poblaciones en su hábitat natural. Particularmente, plantas como A. elegans son más susceptibles a la desaparición debido a que de ella se aprovecha principalmente la raíz. Por otro lado, se sabe que el uso de plantas medicinales de origen silvestre no siempre garantiza la efectividad terapéutica (Castellanos, 2002), debido a la variabilidad en sus componentes químicos; lo que se atribuye a diferentes factores inherentes a la planta, ambientales o de manejo al ser colectadas en campo (Wheeler y col., 1992; Veerporte y Beck, 1998; Raskin y col., 2002). El panorama que se presenta parece contraponer los esfuerzos de conservación de nuestra riqueza biológica y el aprovechamiento de los conocimientos etnobotánicos heredados de nuestros antepasados; lo cual nos conduce al siguiente cuestionamiento: ¿Qué desarrollo tecnológico puede contribuir con la conservación de la forma tradicional de uso de este recurso vegetal, que a su vez también contribuya a evitar la desaparición de esta especie en estado silvestre? La micropropagación es una alternativa biotecnológica mediante la cual se puede obtener un suministro continuo y uniforme de plantas homogéneas, sanas, vigorosas y en menor tiempo al que requiere la planta para multiplicarse en condiciones naturales (Rout y col., 2000; Rates, 2001; Chawla, 2002); lo que además puede contribuir a la conservación de las poblaciones en su hábitat natural. De esta manera, mediante el cultivo en invernadero de plantas micropropagadas de A. elegans se puede disponer de un suministro de plantas homogéneas con la capacidad de presentar actividad farmacológica semejante a la que presentan individuos en estado silvestre, como se ha demostrado en especies de otros géneros. – 5 – 22 aanntteecceeddeenntteess ANTECEDENTES 2.1 PLANTAS MEDICINALES México es reconocido como uno de los países con mayor riqueza vegetal en el mundo, ya que se estima que existen más de 30 mil especies de plantas en su territorio. Esta diversidad vegetal se ha originado gracias a su ubicación geográfica con una amplia gama de climas y suelos. Otra característica importante de nuestro país es su gran diversidad cultural, que combinada con la riqueza biológica, favorecieron el valioso conocimiento etnobotánico de las plantas; lo que ha llevado a México a ser clasificado en el 2° lugar a nivel mundial en cuanto a riqueza de plantas medicinales con alrededor de 4 mil especies registradas (Conabio, 1998). La medicina tradicional en nuestro país es una importante manifestación cultural, y se estima que 80 millones de personas (80 % de la población) utilizan plantas medicinales; de las cuales 20 millones recurren exclusivamente a la medicina tradicional y el resto combinan su uso con la medicina institucional (Estrada y Morales, 2002). A pesar de que la investigación sobre el uso de plantas medicinales ha tenido una amplia trayectoria a lo largo de la historia de México, el rescate y validación de estos conocimientos son recientes; esta situación ha retrasado la incorporación de sus productos como medicamentos en la medicina moderna de nuestro país (Rivera, 1999; Estrada y Morales, 2002). En la actualidad se ha incrementado el interés a usar terapias alternativas, especialmente aquellas derivadas de plantas (Conabio, 1998; Rates, 2001); lo cual se puede atribuir a diferentes factores como: ▫ La ineficiencia de la medicina institucional en muchos casos. ▫ La dificultad para personas de bajos recursos de tener acceso a los tratamientos farmacológicos convencionales. ▫ provoca ▫ ión primaria de la salud con costos accesibles a la mayor parte de la población. El abuso y/o uso incorrecto de medicamentos de origen sintético que efectos colaterales o secundarios en las personas que los consumen. ▫ La tendencia a creer que todos los productos naturales son inocuos. La herbolaria se puede utilizar para la atenc – 6 – ANTECEDENTES Desafortunadamente, la sobreexplotación de las plantas medicinales está conduciendo a la desaparición de las especies de su hábitat natural; ya que más del 90 % de las plantas edicinales que se usan en México son de origen silvestre, y no existe una regulación den alimentar de ellas, lo cual indica una xicidad inusual y una estrecha relación evolutiva entre la planta y el insecto (Rojas, 2000; os de bioprospección, pero al mismo tiempo buscar los mecanismos para no obreexplotar los recursos biológicos en los diferentes ecosistemas (Massieu y Chapela, ralmente, como en el conocimiento de las condiciones de su cultivo, lo que ervirá para contribuir con la conservación de las poblaciones silvestres (Pelt, 1992; Bye y ol., 1995). m legal para su uso personal. Pero quizá la mayor amenaza a la conservación de las plantas medicinales es la alteración de su hábitat natural (Craker, 1999); por lo que también es importante considerar el papel que tienen algunas especies dentro de los ecosistemas que forman parte. El ejemplo más ilustrativo se tiene en la India, donde Aristolochia indica es una especie medicinal que ha sido declarada en peligro de extinción, lo cual ha colocado a la mariposa Tros aristolochae (‘cola de golondrina’) también en riesgo, ya que ésta deposita sus huevecillos sobre la planta; la cual no solo sirve como fuente de alimento para sus orugas, sino que éstas aprovechan las sustancias químicas para utilizarlas como defensa contra sus depredadores. De hecho, la mayoría de las orugas de la tribu Troidini se alimentan exclusivamente del follaje de plantas de la familia Aristolochiaceae; y aparentemente pocos insectos además de la tribu Troidini se pue to Sime y Feeny, 2000; Mebs y Schneider, 2002). En este sentido, es importante buscar el aprovechamiento de la biodiversidad a través de proyect s 2002). La necesidad de conservar plantas medicinales para los usos tradicionales, modernos y futuros, requiere de muchos esfuerzos tanto en el hábitat donde las plantas medicinales crecen natu s c – 7 –ANTECEDENTES 2.2 IMPORTANCIA DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS De manera general, las plantas producen una gran variedad de compuestos químicos involucrados en sus interacciones ecológicas llamados ‘metabolitos secundarios’ (Veerporte y Beck, 1998). Las funciones del metabolismo secundario se pueden referir como mediadoras de la interacción de las plantas con el medio donde se desarrollan como: interacciones planta-insecto, planta-microorganismo y planta-planta; estas interacciones pueden desempeñar funciones de defensa (contra animales herbívoros, microbios patógenos y virus), funciones de señal (atracción de animales polinizadores o ispersores de semillas), y/o alelopáticos (fenómenos de competencia entre especies stos bioactivos ha sido poco estudiada o se desconoce (Craker, 1999); sin como: ▫ ntrar diferencias entre plantas de diferentes ▫ Tejidos, órganos y estados de desarrollo. En la mayoría de las plantas la síntesis y acumulación de metabolitos secundarios esta regulada en espacio y mente varía en los diferentes tejidos y órganos de la planta y en algunos casos, se ha observado que existe ▫ tivos, que se convierten a compuestos d vegetales por espacio, luz y nutrientes), (Wink, 1999; Wink, 2003). Aunque los metabolitos secundarios son muy comunes en el reino vegetal, esto no significa que todas las plantas pueden producir cualquier metabolito. Para la mayoría de las especies medicinales la relación entre los factores ambientales y la producción de compue embargo, se ha observado que en general su contenido es variable y depende de factores Ecotipos o razas. Se pueden enco poblaciones de una especie, e incluso diferentes genotipos entre individuos de la misma población. (Wink, 1999). tiempo; esto es, el perfil de los compuestos normal una variación estacional e incluso diurna. Estado de salud. Una planta herida o infectada puede contener compuestos que no están presentes normalmente en plantas intactas y sanas; esto puede ser por la presencia de precursores inac activos por mecanismos de respuesta al estímulo; o bien, porque los compuestos son sintetizados en el momento que se requieren para la defensa (Veerporte y Beck, 1998; Wink, 2003). – 8 – ANTECEDENTES ▫ a los diferentes cambios del medio (temperatura, precipitación pluvial, luz, altitud, tipo de suelo, etc.) con variaciones durante su ciclo de n la industria farmacéutica (Bye y col., 1992). Cabe señalar que las ondiciones de cosecha y procesamiento de las plantas también pueden influir en el encionó anteriormente, diferentes factores pueden afectar su omposición química. Para asegurar esa composición y por lo tanto la eficacia de las lantas medicinales se requiere de cultivos uniformes en condiciones estandarizadas otipotencia’ de las células vegetales, que significa que cada una de ellas tiene la misma Medio. Es la suma de las influencias externas que modifican el crecimiento, la estructura y reproducción de los organismos en un lugar dado. Las plantas son susceptibles desarrollo, lo que incluye la producción de metabolitos secundarios (Estrada y col., 1992). Una cantidad importante de metabolitos secundarios como alcaloides, terpenoides, flavonoides, entre otros, han sido aprovechados por el hombre de diversas maneras: por ejemplo, para la producción de colorantes, insecticidas, saborizantes, fragancias y estimulantes (Wink, 1999; Veerporte y Memelink, 2002). Adicionalmente, sus propiedades farmacológicas son la base del uso de las plantas en la medicina tradicional, así como de su explotación e c contenido de metabolitos secundarios del producto destinado para ser explotado comercialmente. Las plantas pueden ser la fuente renovable más abundante y de menor costo para la obtención de metabolitos secundarios complejos con propiedades farmacológicas; sin embargo, como se m c p (Raskin y col., 2002). 2.3 MICROPROPAGACIÓN Micropropagación, propagación por cultivo de tejidos y propagación in vitro son sinónimos de un procedimiento que consiste en la multiplicación vegetativa in vitro para regenerar nuevas plantas a partir de un ‘explante’ que es un pequeño fragmento de cualquier parte de la planta (hoja, tallo, raíz, yemas, anteras, etc.). Este procedimiento se basa en la ‘t – 9 – ANTECEDENTES información genética que le permite desarrollar por sí misma un individuo completo idéntico a la planta de la cual se derivó (Lozoya, 1985; Robert y col., 1993; Chawla, 2002). La micropropagación puede llevarse a cabo por diferentes procedimientos; sin embargo, como el principal objetivo de la micropropagación es multiplicar con eficacia una planta produciendo individuos idénticos a la planta madre, los procesos más comúnmente empleados son: a) la embriogénesis directa a partir de algún explante y, b) el cultivo de yemas que es el método más comúnmente utilizado. En ambos casos se obtienen rocesos eficientes de multiplicación y con estabilidad genética ya que se evitan las a micropropagación difiere de otros métodos convencionales de propagación en que las condicio ép micropropagación ase 0 Inducción. El explante es cortado de la planta, desinfestado y sembrado ase 1 Multiplicación. Los brotes inducidos en la fase anterior son cortados y Fase 3 as plantas requieren ser aclimatizadas, mediante una reducción gradual de la humedad para de microorganismos (Robert y col., 1993). p diversas fases que se tienen con los tejidos desdiferenciados conocidos como callos (Robert y col., 1993). L nes as ticas de cultivo son esenciales para tener éxito. El proceso de se puede dividir en cuatro fases: F en un medio de cultivo. En este medio se induce la formación de brotes adventicios o de la embriogénesis. F resembrados para incrementar el número de individuos. Este proceso puede repetirse varias veces. Fase 2 Enraizamiento. El total de brotes obtenidos de la fase anterior son tratados para inducir la formación de raíces y formar plantas completas. Transplante. Las plantas salen del ambiente in vitro para iniciar su desarrollo en condiciones externas. En esta fase, l que las plantas no mueran por pérdida excesiva de agua o por el ataque – 10 – ANTECEDENTES Son var importante ▫ El origen del explante (raíz, tallo, hojas, etc.) y la edad fisiológica de la fuente ▫ lativa a la concentración de auxinas induce la formación de brotes y por el contrario, alta concentración de auxinas relativa a la concentración de citocininas induce la formación de callos y en algunos casos ▫ Factores físicos tales como: el pH del medio de cultivo; la iluminación, tanto la aria; ya que el proceso está estrechamente ligado a la producción de plantas libres e patógenos. Incluso se pueden establecer procesos de micropropagación para obtener e una sola lanta madre en cuestión de meses. Sin embargo, es muy importante tomar en cuenta la fraestructura del sistema que es su principal desventaja, ya que se requiere personal de energía y equipo de laboratorio (Lozoya, 1985). ios los factores que determinan la inducción de brotes y raíces; algunos de los más s son: del explante, ya que los tejidos jóvenes tienen mayor capacidad de diferenciación que los viejos. La combinación de fito-reguladores para estimular una característica particular del crecimiento y desarrollo a partir de los explantes. Las auxinas y las citocininas son las más comúnmente empleadas. En general, una alta concentración de citocininas re de raíces (Robert y col., 1993). duración diurna (fotoperíodo) como la calidad (longitud de onda e intensidad) y la temperatura que dependerá de la especie (Lozoya, 1985; Rout y col., 2000). La utilidad de la micropropagación con fines comerciales se basa en la uniformidad genética del material, evitándose las variaciones genotípicas propias de poblaciones generadas porsemilla sexual en muchas especies. Otras ventajas de la técnica son la disponibilidad de la planta todo el año, y la obtención de material de alta calidad fitosanit d plantas libres de virus (Lozoya, 1985; Robert y col., 1993; Villarreal, 1993; Rout y col., 2000). En teoría, es posible producir cientos de miles de individuos clonales a partir d p in capacitado, gran suministro – 11 – ANTECEDENTES 2 4 ias de ellas son endémicas; debido a la semejanza de su orfología a muchas de ellas se les conoce comúnmente como ‘guaco’, ‘pato’ o ‘tlacopatli’ lacrán e inductor de contracciones uterinas (El-Tahir, 1991); ntiasmático, contra mordedura de serpiente, infecciones generales, inducción de aborto 9), contra veneno de serpientes eyes, 1995; Otero y col., 2000), tratamiento contra el SIDA (Achenbach y col., 2002), y ca por su uso medicinal y como plantas de ornato. Al respecto, ólo tres estudios con plantas del mismo género se encontraron disponibles en la bibliogra a) n . GÉNERO Aristolochia Aristolochia es el género más grande de la familia Aristolochiaceae con aproximadamente 550 especies distribuidas en gran parte del mundo. En México existen cerca de 65 especies de Aristolochia y var m (Martínez, 1959; Kelly, 2000). A las especies de este género, se les atribuyen diversas propiedades terapéuticas, entre las que se pueden mencionar: purgante, antihelmíntico, antipirético, emenagogo, antídoto contra veneno de a a (Lemos y col., 1993). Recientemente se han reportado varios estudios de la actividad biológica de plantas pertenecientes a este género como: citotóxico (Mongelli y col., 2000), antimicrobiano y citotóxico (Murillo y col., 2001), antiespasmódico (Haruna y Choudhury, 1997), antiinflamatorio (Hutt y Houghton, 1998), antifúngico (Gadhi y col., 2001), antibacteriano (Shafi y col., 2002), insecticida (Broussalis y col., 199 (R contra veneno de alacrán (Rojas, 2002; Jiménez, 2004). Existen escasos reportes de micropropagación de las especies de éste género, a pesar de su importancia económi s fía consultada: En A. indica, mediante el uso de ácido naftalenacético (ANA) 0.5 µM + 6- bencilaminopurina (BAP) 13.3 µM en el medio MS, se obtuvieron de 2 a 3 brotes por explante en 4 subcultivos de 28 días. Se indujo la formación de raíces con ácido indolbutírico (AIB) 2.46 µM en el medio, con lo que se logró un 85 % brotes enraizados. Después de su aclimatización en un medio líquido co – 12 – ANTECEDENTES vermiculita como soporte, las plantas se transfirieron a tierra y se cultivaron en b) nudos a partir de uno. La inducción de raíces se logró con la adición de AIB 2.5 c) edio de 4.2 brotes por explante mediante el uso de BAP 2.0 µM en el medio MS. La inducción de raíces se logró con la adición al medio de ácido indolacético AIA 5.0 µM, logrando un 24 o raizados (Svensson, 2000). ia de Brasil, la cual se ncuentra distribuida en el continente americano desde Florida (en E.U.) hasta Argentina de diámetro de color verde-limón cuando inmadura, parda cuando madura. emillas numerosas, planas, ovaladas, de 3-6.5 mm de largo, 2-5 mm de ancho, 0.5 mm de grueso, la testa delgada, aceitosa, brillante, lisa, el endospermo abundante, el embrión pequeño. invernadero, donde se logró el 90 % de supervivencia (Manjula y col., 1997). En A. fimbriata, mediante el uso de BAP 5.0 µM en el medio MS, se logró el crecimiento de un solo brote (3.79 cm de largo), con el que se obtuvieron 8 µM al medio (MS al 50 %), con lo que se lograron poco mas de 10 raíces por brote; mientras que ANA solo indujo la formación de callos (Bravo y col., 1999). En A. manchuriensis, se reportó un prom % de br tes en 2.5 Aristolochia elegans Aristolochia elegans Mast., sin. A. littoralis, es una especie originar e (Ortega y Ortega, 1997); aunque también se reporta su cultivo como planta ornamental en algunos países como Egipto y Taiwán (El-Sebakhy y col., 1984). Ortega (1997), describe las plantas de esta especie con las siguientes características: Lianas perennes, de 1-5 m de largo, el tallo rugoso. Hojas acorazonadas-triangulares, de 3.5-12.5 cm de largo, 4.5-12 cm de ancho. Flores axilares, solitarias de 14.5-27 cm de largo, color verde-cremoso y púrpura (Figura 2). Cápsula cilíndrica, de 2.5-5 cm de largo, 0.7-2.5 cm S – 13 – ANTECEDENTES Figura 2. Flor de Aristolochia elegans En México se ha identificado la presencia de esta especie en estado silvestre principalmente, en zonas desde los 380 hasta los 700 m sobre el nivel del mar; dentro de vegetación de tipo bosque caducifolio, bosque de encino, selva mediana subperenifolia y selva baja caducifolia en los estados de Nuevo León, Tamaulipas, Estado de México, Morelos, Chiapas y Veracruz (Ortega y Ortega, 1997). Sus nombres comunes más conocidos son igualmente, guaco, pato y tlacopatli y su época de floración es de Marzo a Julio. Son amplios los estudios fitoquímicos que se han realizado en esta especie, de la que se han identificado hasta 142 compuestos (Cuadro 1), muchos de los cuales podrían estar relacionados con las diferentes propiedades terapéuticas que se le atribuyen. – 14 – ANTECEDENTES Cuadro 1. Compuestos quím cos encontrados en A. elegans. i PARTE DE LA PLANTA COMPUESTOS REFERENCIA hoja y raíz Bisbencilisoquinolinas: (-)-temuconina y (-)-(R,R)-7´- O-metilcuspidalina Alcaloide aporfínico: magnoflorina Alantoína El-Sebakhy, 1984 1989 hoja, raíz y tallo Se identificaron 58 compuestos volátiles: 4 monoterpenos (p.ej. α y β-pineno) 5 monoterpenos oxigenados (p.ej. 1,8 cineol, borneol y acetato de bornilo) 28 sesquiterpenos (p.ej. cariofileno) 18 sesquiterpenos oxigenados (p.ej. nerolidol) Vila y col., 1997 hoja, raíz y tallo Ácidos aristolóquicos (AA): AA I, AA D y aristolósido Dímero (diterpeno+AA): Aristolina Metilesteres de AA: metilester de AA Ia, AA IV, AA D, metil aristoloquiato Aporfinas: magnofolina, oxonuciforina, isomoschatolina, 4,5dioxodehidroasimilobina Isoquinolinas: aristoquinolina A, B, C, pericampilinona- A, coridaldina, talifolina, nortalifolina, N-metil- coridaldina Aristolactamas: Aristolactama E, A II, A IIIa, C N-β-D- glucósido, A IIIa -6-O-β-D-glucósido, 9- metoxiaristolactama, isoaristolactama Esteroides: β-sitosterol, β-sitosterilglucósido, felocriseina Sesquiterpenoides: Aristololido Diterpenoides: ent-kauran-16β,17-diol, ent-16β,17- epoxikauran, ent-kaur-15-en-17-ol, ent-15β,16-epoxikauran-17-ol Tetralonas: Aristelegona A, B, C, D Amidas: N-trans-feruloiltiramina, N-cis-feruloiltiramina, N-trans-cinamiltiramina, N-p-trans-cumariltiramina Lignanos: (-)-cubebina, α-metilcubebina, β- metilcubebina, (-)-hinokinina, (-)-5’’- metoxihinokinina, (-)-kobusina, (+)-medioresinol, aristelegina A, B, C Bifenil éteres: ácido 4-metoxi-3-4’-oxidibenzoico Aristogina A, B, C, D, E, F Bencenoides: metilparabeno, metilvainillato, p- hidroxibenzaldehido, vainillina, metil4-hidroxi- metoxicinamato, ácido cinámico, ω-hidroxipropioguayacona, ficusol Wu y col., 2000 2002 Shi y col., 2004 – 15 – ANTECEDENTES 2.6 ENVENENAMIENTO POR PICADURA DE ALACRÁN El veneno de los alacranes es producido por glándulas que se localizan en la cola. Al ocurrir el piquete, el veneno se inyecta subcutáneamente y posteriormente se distribuye a otras partes del cuerpo a través del sistema circulatorio (Hutt y Houghton, 1998). Se trata de una mezcla compleja de diferentes sustancias entre las que se encuentran proteínas, péptidos, aminoácidos libres y aminas activas entre otros (Osnaya y col., 2001; Rojas, 2002); sin embargo, los componentes responsables de la toxicidad del veneno son principalmente los péptidos. Los péptidos, también llamados neurotoxinas, están formados por 30-80 residuos de aminoácidos y tienen como blanco los canales iónicos de Na+, K+, Cl- yCa2+ en las membranas de células excitables (como las nerviosas y musculares); la acción de estas toxinas en los canales iónicos provoca muchos de los síntomas tóxicos del veneno. Particularmente la toxicidad del veneno de la especie Centruroides limpidus limpidus Kash, reside principalmente en péptidos de 60-70 residuos de aminoácidos; los cuales son altamente estables por su bajo peso molecular y por 4 puentes disulfuro que consolidan su estructura tridimensional. Estos péptidos afectan los canales iónicos de sodio (Na+) modificando sus mecanismos de apertura y cierre. Como resultado de esto, ocurre la alteración de la transmisión de impulsos nerviosos en los sitios presinápticos de los nervios colinérgicos y adrenérgicos, favoreciendo la liberación súbita y masiva de acetilcolina y catecolaminas respectivamente; lo que provoca a su vez alteraciones funcionales de diversos órganos y tejidos (Possani y col., 1999). Los efectos principales de la intoxicación se da en los sistemas cardiovascular y respiratorio pero también hay estimulación de las actividades del sistema nervioso simpático y parasimpático, lo que explica la mayoría de los síntomas clínicos del envenenamiento. El veneno contiene además hialuronidasa que aumenta la permeabilidad capilar para facilitar su absorción y 5-hidroxitriptamina (serotonina) de la que depende la producción de dolor y edema en el sitio de la picadura (Montoya, 1996; Possani y col., 1999; Osnaya y col., 2001). – 16 – ANTECEDENTES En condiciones de laboratorio, la toxicidad del veneno depende principalmente de la especie del alacrán; por ejemplo, C. limpidus limpidus presenta una dosis letal en ratones de 0.61 a 3.31 mg de veneno por kg de peso corporal (promedio 2 mg/kg), para reducir en un 50 % la población de animales de experimentación (parámetro conocido como DL50). Otras especies como C. noxius, muestra una DL50 de 0.26 mg/kg; en otras palabras, es casi 10 veces más letal (Dehesa y col., 1995). Sin embargo, también es muy importante considerar las características de los animales de experimentación (generalmente ratones) como la cepa, el sexo y la edad (Padilla y col., 2003). Diferentes factores pueden contribuir a la variación de los efectos del envenenamiento por la picadura de alacrán, como son: la especie del alacrán, la condición de la glándula venenosa al momento de la picadura, la ruta de inyección, el número de picaduras, la parte del cuerpo que sufrió la picadura, la cantidad de veneno inyectada, y la época del año; además de factores propios de la víctima como: la edad, peso, estado nutricional y estado de salud (Rangel y Gómez, 1997; Hutt y Houghton, 1998, Padilla y col., 2003). Generalmente la población más afectada son los menores de edad sin distinción por el género; las picaduras son más frecuentes en los miembros inferiores, ocurren principalmente durante la noche (lo que demuestra sus hábitos nocturnos ya que durante el día se esconden) y las picaduras son más frecuentes durante la temporada primavera- verano (Marzo a Julio), lo que coincide con la temporada de su reproducción (Montoya, 1996; Rangel y Gómez, 1997; Osnaya y col., 2001). Las manifestaciones leves son dolor, eritema e inquietud; además de entumecimiento y salivación excesiva, sensación de hormigueo nasal y palpitaciones. El cuadro severo se manifiesta con fiebre, distensión abdominal, movimientos oculares rápidos y visión borrosa; se acompañan de vómito, sudoración profusa, insuficiencia cardiaca, edema pulmonar y choque. Los cuadros severos también pueden acompañarse de convulsiones (Rangel y Gómez, 1997). El anti-veneno de alacrán usado en México contiene fragmentos de anticuerpos purificados [F(ab´)2]; este anti-veneno se obtiene a partir de suero de caballos hiper- inmunizados con los venenos de los alacranes más peligrosos. El producto al ser liofilizado, tiene la ventaja de que no requiere refrigeración y se puede mantener a temperatura ambiente por varios meses por debajo de los 37 °C. El anti-veneno de alacrán – 17 – ANTECEDENTES debe ser usado solo cuando se observen síntomas moderados o severos; y en general, dos ámpulas son suficientes para controlar incluso casos severos. No obstante, dado que el suero antialacrán proviene de anticuerpos de caballo, constituye a su vez un antígeno ajeno al huésped y se corre el riesgo de alguna reacción anafiláctica (Osnaya y col., 2001; Rojas, 2002). 2.7 PLANTAS USADAS EN EL TRATAMIENTO DE PICADURA DE ALACRÁN El uso de plantas para aliviar los efectos de picaduras de alacrán es común en las regiones donde existen alacranes, principalmente de países subdesarrollados. Hutt y Houghton (1998) reportaron un total de 141 especies de 53 familias de plantas de diferentes partes del mundo, a las que se les ha atribuido esta propiedad. La supuesta propiedad anti-veneno de alacrán de estas plantas puede estar relacionada con diferentes actividades, ya que los efectos terapéuticos de los productos naturales generalmente son el resultado de mas de un compuesto activo y el resultado final puede deberse a diferentes efectos (aditivos, complementarios, sinérgicos, antagónicos) de sus componentes. (Blumenthal, 2000; Stermitz y col., 2000; Raskin y col., 2002; Loew y Kaszkin, 2002). Sin embargo, son muy escasos los estudios para validar la efectividad de dichas propiedades, para identificar los compuestos activos y sus mecanismos de acción contra el efecto del veneno (Rojas, 2002; Jiménez 2004). El demostrar la efectividad de estas plantas contra picaduras de alacrán es una tarea para países como México que sufre de éste problema de salud y que tiene a su disposición recursos vegetales para explotarlos de una manera racional. 2.8 GÉNERO Aristolochia EN EL TRATAMIENTO DE PICADURA DE ALACRÁN Las plantas del género Aris olochia son ampliamente usadas en México para contrarrestar los efectos del envenenamiento por picadura de alacrán (y otros animales ponzoñosos). Lo anterior quedó establecido en los resultados de una encuesta realizada a nivel nacional para conocer las plantas medicinales mas frecuentemente utilizadas por los terapeutas t – 18 – ANTECEDENTES tradicionales, donde se mencionó el uso del ‘guaco’ para alivio de este padecimiento en 18 sitios (aproximadamente el 50 % del total) donde se aplicó la encuesta (Lozoya y col., 1987). Como ejemplo, se puede mencionar la receta del uso de tlacopatli que describe Rojas (1998): “… la raíz fresca o seca (10 g) se remoja en un cuarto de litro de alcohol durante 20 días, éste alcohol se unta en el piquete 2 o 3 veces”; aunque también otras recetas recomiendan ingerir la infusión o tintura como lo menciona Cabrera (1996): “Tlacopatle. Remedio: tomar uno o dos gramos de polvo de la raíz, o hacer una infusión con 20 grs. de la misma en un litro de agua y tomar una tac ta. También puede prepararse una tintura con 50 grs. de la raíz machacada en 200 grs. de alcohol de caña puro, que se dejan reposar durante una semana. Tomar una cucharadita cada hora, con un poco de agua”. i r t r r El veneno de alacrán al ser inyectado ejerce una fuerte respuesta de inflamación en la víctima; por lo tanto, no es de sorprender que ciertas plantas con propiedades anti- inflamatorias como las del género A is olochia sean recomendadas para aliviar la picadura (Hutt y Houghton, 1998). Es interesante que algunas plantas usadas para tratar el envenenamiento por mordeduras de serpientes sean también usadas para dar alivio contra picaduras de alacrán; dentro de este grupo se encuentran muchas especies del género A istolochia. El ácido aristolóquico, un componente común de éste género, se ha observado que interactúa con enzimas de venenos de serpientes como la fosfolipasa-A2 (PLA2), donde actúa como inhibidor no competitivo. PLA2 participa en la liberación de ácidos grasos de fosfolípidosde membrana de la posición sn-2 (especialmente araquidonato), necesarios para la biosíntesis de los eicosanoides; los cuales están implicados en la cascada de reacciones de enfermedades inflamatorias (Chandra y col., 2002). Puesto que las fosfolipasas tienen un papel importante en la respuesta de inflamación y dolor, la inhibición de su actividad podría aliviar de manera similar esos síntomas en el envenenamiento por picadura de alacrán (Hutt y Houghton, 1998; Rojas, 2002). En particular, con respecto al uso de A. elegans como anti-veneno de alacrán, Jiménez (2004) realizó una investigación con extractos de raíces de plantas silvestres en pruebas farmacológicas tanto in vivo como in vit o. Los resultados mostraron en general, que los – 19 – ANTECEDENTES extractos antagonizaron los efectos del veneno de Centruroides limpidus limpidus en los modelos experimentales estudiados. Al respecto, A. elegans podría ser la especie vegetal más frecuentemente usada para el tratamiento de picaduras de alacrán en el estado de Morelos (Monroy y Castillo, 2000; Jiménez, 2004); aunque otros autores han reportado su uso también contra picaduras de animales ponzoñosos (Avilés y Suárez, 1994) y como anticrotálico Rojas (2002). 2.9 EVALUACIÓN FARMACOLÓGICA Una prueba farmacológica se aplica en un sistema biológico para conocer el efecto que le provoca la interacción con una sustancia (extracto crudo, fracciones parcialmente purificadas o compuestos puros) y puede ser mediante algún modelo in vivo o in vit o. Las especies comúnmente utilizadas en animales intactos son los ratones, ratas y en algunos casos gatos y cobayos; en tanto que en las pruebas in vi ro normalmente se utilizan preparaciones aisladas de órganos o tejidos, y existen muchas modalidades dependiendo del sistema fisiológico que se desea probar. r t r El modelo del ‘íleon aislado de cobayo’ se fundamenta en la capacidad de contracción del íleon y es muy empleado para el estudio in vit o de los efectos de diferentes sustancias como antiespasmódicas y en el sistema nervioso parasimpático. Sus principales ventajas son: a) las contracciones son relativamente simples y rápidas de registrar, y b) se requieren pequeñas cantidades de los compuestos. Sin embargo, la complejidad de los posibles sitios y mecanismos de acción hace difícil la tarea de elucidar la manera exacta en la cual la sustancia produce o inhibe las contracciones en el órgano (Samuelsson, 1991; Williamson y col., 1998). El intestino delgado en los mamíferos está constituido de tres partes: duodeno, yeyuno e íleon; el íleon es la parte más larga y constituye aproximadamente el 55 % de la longitud total. La parte más externa del intestino se conoce como serosa. Bajo la serosa se encuentran dos capas de músculo liso: en la primera las células musculares están orientadas longitudinalmente, mientras que en la segunda están orientadas de forma circular. Posteriormente se encuentra la submucosa y la mucosa. – 20 – ANTECEDENTES Los intestinos contienen un sistema nervioso intrínseco: el sistema entérico (SE); pero además contienen fibras nerviosas de origen extrínseco. Las fibras nerviosas y los ganglios del SE están arregladas en varios plexos, que se encuentran en todas partes del tubo digestivo y se extienden desde la parte del músculo liso del estómago hasta la parte interna del esfínter anal. Los dos plexos dominantes son el plexo mientérico que se encuentra entre las capas longitudinales y circulares de músculo y el plexo submucoso que se encuentra dentro del tejido conectivo de la submucosa. Grupos de fibras nerviosas conectan los ganglios en los plexos y forman redes continuas. La principal característica del SE es la presencia de muchas diferentes substancias neurotransmisoras: acetilcolina, noradrenalina, 5-hidroxitriptamina, sustancia P, etc. (Samuelsson, 1991). Existen varias razones para considerar por separado el SE como una división específica del sistema nervioso autónomo además de las divisiones del simpático y parasimpático: ▫ El SE es relativamente independiente del control central. El daño al sistema en las rutas extrínsecas tiene poco efecto en las funciones digestivas. ▫ El número de neuronas en este sistema (107-108), es equivalente al número total de neuronas en la médula espinal. ▫ Existen al menos diez diferentes tipos de terminales nerviosas en el SE. ste cambio de estado uede ser registrado durante todo el tiempo en que dura la prueba. Las células musculares de un fragmento aislado del tejido están bajo la influencia de señales de este SE y su estado contráctil depende del balance de la información que lo controla (de estímulo o inhibición) transmitido mediante neurotransmisores, hormonas, autacoides y otras sustancias; y este balance puede ser alterado por diferentes compuestos. La adición de un compuesto bioactivo al baño en el cual está suspendido el fragmento aislado del íleon, puede causar un cambio en el estado contráctil de los músculos, provocando una contracción o relajación del tejido. E p – 21 – ANTECEDENTES Los cambios provocados por el o los compuestos bioactivos pueden ser el resultado de ferentes mecanismos: ▫ ón de neurotransmisores. ▫ La interferencia con segundos mensajeros, p.ej. adenosina monofosfato (AMP) influyen en los niveles de ▫ La acción directa sobre las células del músculo liso. ▫ Tratándose de extractos, los efectos pueden ser una combinación de diferentes mecanismos, ya que son mezclas generalmente de una gran cantidad de sustancias desconocidas. di La interferencia en la liberación o desactivaci ▫ La acción directa del compuesto en los receptores de los transmisores ó en los receptores para las hormonas o autacoides. o guanosina monofosfato (GMP) cíclicos, los cuales calcio que participan de manera muy importante en la contracción muscular. – 22 – 33 jjuussttiiffiiccaacciióónn JUSTIFICACIÓN La disminución de las poblaciones silvestres de Aristolochia elegans es una consecuencia de la colecta indiscriminada para uso medicinal. La micropropagación y cultivo en invernadero de ésta especie, es una alternativa biotecnológica para la obtención de plantas sanas y homogéneas; con lo que se puede disponer de material vegetal para futuras investigaciones de su aplicación en el tratamiento de la picadura de alacrán, lo que además puede contribuir a evitar la desaparición de las poblaciones en estado silvestre. En esta investigación se propone que mediante la micropropagación y cultivo de A. elegans se pueden obtener plantas con capacidad de antagonizar en íleon de cobayo, el efecto de contracción inducido por veneno de alacrán, semejante a la reportada de plantas silvestres; lo cual será un indicativo de su efectividad terapéutica como anti-veneno de alacrán. – 23 – 44 oobbjjeettiivvooss 4.1 Objetivo general • Determinar si los extractos de las plantas de Aris olochia elegans Mast. (obtenidas por micropropagación y crecidas en invernadero), tienen la capacidad de relajar el íleon de cobayo contraído por efecto del veneno de alacrán Centruroides limpidus limpidus Karsch, de manera semejante a la reportada para plantas silvestres. t r r 4.2 Objetivos particulares • Establecer las condiciones de desinfestación y germinación in vit o de semillas de A. elegans. • Establecer las condiciones de micropropagación de A. elegans a partir de yemas axilares y apicales. • Obtener plantas por cultivo in vit o y aclimatizarlas a condiciones ex vitro mediante un sistema hidropónico. • Obtener extractos metanólicos y hexánicos de las plantas cultivadas. • Evaluar el efecto relajante de los extractos en íleon aislado de cobayo, contraído por veneno de alacrán C. limpidus limpidus.– 24 – 55 mmaatteerriiaalleess yy mmééttooddooss MATERIALES Y MÉTODOS 5.1 MATERIALES 5.1.1 Material biológico Se utilizaron semillas de plantas de A. elegans cultivadas en la parcela experimental del Centro de Investigación Biomédica del Sur-IMSS en el Municipio de Xochitepec, Morelos. Estas plantas fueron identificadas previamente por personal del herbario del IMSSH y registradas con el número HPMIMSS13595. 5.1.2 Reactivos y material de laboratorio Todos los reactivos usados fueron grado analítico de las marcas Merck, Sigma, Baker y Mallinkrodt; el material de vidrio fue el común de laboratorio. 5.2 METODOLOGÍA EXPERIMENTAL. En la Figura 3 se muestra el diagrama de flujo de las etapas experimentales. Cabe mencionar que las etapas correspondientes a la micropropagación, aclimatización y cultivo en invernadero fueron realizadas en el Laboratorio de Cultivo de Células Vegetales y en el Invernadero del CeProBi en Yautepec, Morelos; mientras que la obtención de los extractos de las plantas micropropagadas y la prueba farmacológica se efectuaron en las instalaciones del CIBIS-IMSS en Xochitepec, Morelos. Colecta de semillas Plántulas asépticas Desinfestación Germinación Factorial (explantes y fito- reguladores) Aclimatización Enraizamiento Multiplicación Transferencia a invernadero Obtención de extractos Cosecha Prueba farmacológica en íleon de cobayo Figura 3. Diagrama de flujo del desarrollo experimental. – 25 – MATERIALES Y MÉTODOS 5.3 MICROPROPAGACIÓN Y CULTIVO 5.3.1 Condiciones generales de preparación de medio de cultivo El medio de cultivo basal empleado fue el MS (Murashige y Skoog, 1962). En la preparación del medio de cultivo, antes de la adición del agar, se ajustó el pH (Potenciómetro Jenco Electonics, LTD mod. 1671) a un valor de 5.8 (con HCl 0.1 N). Todos los componentes del medio fueron mezclados antes de la esterilización. La esterilización se llevó a cabo en autoclave (AESA, modelo C.V. 250) a una temperatura de 120 °C durante 20 min. En los diferentes experimentos cada unidad experimental (UE) consistió de un frasco de vidrio transparente tipo ‘gerber’ (6.0 cm de diámetro y 6.0 cm de altura con tapa de plástico) conteniendo el medio de cultivo (20 ml) y los explantes. Las condiciones generales en la cámara de incubación fueron: temperatura de 25±2 °C, 16 horas de fotoperíodo con una irradiancia de 310 µmol m-2 s-1 (luxómetro Mavolux digital B400, Bélgica) generados con lámparas de luz blanca fluorescente. 5.3.2 Desinfestación de semillas Con la finalidad de obtener plántulas asépticas, se buscaron las condiciones de desinfestación de semillas; para ello se siguió el proceso señalado en la Figura 4. b1) tratamientos con etanol al 70 % a) lavado de semillas con sol. detergente 1 % b) enjuague i desionizada; c) inmersión de las semillas a diferentes tratamientos con soluciones de Figura 4. D agrama de flujo de la desinfestación de semillas. En la primera etapa se aplicó el siguiente proceso: a) lavado con solución de detergente al 1% p/v en agua desionizada durante 30 min; b) tres enjuagues sucesivos con agua c) tratamientos con NaClO d) enjuague e) siembra b2) enjuague 1ª etapa 2ª etapa – 26 – MATERIALES Y MÉTODOS hipoclorito de sodio (NaClO) de acuerdo a lo que se describe en el Cuadro 2; d) enjuague y e) siembra en medio nutritivo. Cuadro 2. Tratamientos para la desinfestación de semillas de A. elegans mediante la TRATAMIENTO (% re) combinación de tres concentraciones de NaClO con tres tiempos de inmersión. NaClO Tiempo de inmersión cloro lib (min) A 10 10 10 B C D E F G H I 0.5 0.5 0.5 1.0 1.0 1.0 1.5 1.5 1.5 5 15 5 15 5 15 on base en los resultados de la primera etapa, se eligió un solo tratamiento de acuerdo n la desinfestación se trabajó con lotes de 25 semillas. La aplicación de las soluciones de dentro de ella. C con el porcentaje de desinfestación y de germinación obtenido. En la segunda etapa se modificó el proceso en el inciso (b) de la Figura 4, donde se aplicaron tratamientos con una mezcla de etanol al 70 % v/v en agua desionizada con tres tiempos de inmersión: 1, 3 y 5 min previos al tratamiento en NaClO. El proceso finalizó con el enjuague y la siembra de las semillas en el medio de cultivo. E lavado, desinfestante y enjuague se hicieron en una proporción de 1 ml de solución por semilla tratada. La solución de detergente y de NaClO se prepararon a partir de los productos comerciales Roma® y Cloralex® respectivamente; éste último con un contenido de cloro libre de 6 %. Las semillas en contacto con las soluciones de etanol se agitaron manualmente, mientras que con las soluciones de NaClO se utilizó un agitador magnético. Los lavados con detergente, etanol y los enjuagues respectivos se realizaron fuera de la campana; mientras que la inmersión en NaClO y la siembra de las semillas se realizaron – 27 – MATERIALES Y MÉTODOS En la siembra se utilizó el medio MS al 50 % de concentración de nutrientes, sacarosa al 1.5 % (p/v) y agar al 0.4 % (p/v). Se colocaron cinco semillas (NSS = número de semillas % SD = NSD x 100 NSS (1) na vez que comenzó la germinación (emergencia de la radícula), se incubaron las plántulas en una irradiancia de 310 µmol m s y 16 horas de fotoperíodo. manas de edad. Los explantes se obtuvieron por cortes de s plántulas en segmentos de 0.5 cm de longitud que contenían la yema apical y Figura 5. Representación de los sitios de corte en las plántulas para obtener los explantes. sembradas) sobre el medio de cultivo en cada unidad experimental (UE). Cada tratamiento se aplicó en tres UE en la primera etapa y en seis en la segunda. Las cuales se mantuvieron dentro de la cámara de incubación durante dos semanas en oscuridad; al término de este tiempo se realizó la evaluación del número de semillas desinfestadas (NSD). Se consideraron como desinfestadas a aquellas semillas en las que no se observó crecimiento de microorganismos a su alrededor. El porcentaje de semillas desinfestadas (% SD) se obtuvo mediante la siguiente ecuación: ÷ U -2 -1 5.3.3 Inducción de brotes Se utilizaron plántulas de 8 se la segmentos de tallo de 1 cm con un solo nudo que incluía la yema axilar (Figura 5). yema axilar yema apical – 28 – MATERIALES Y MÉTODOS Se pla ción últiple, donde se evaluaron las variab EXPLANTE (yemas apicales y yemas ión se realizó al cumplirse la sexta semana de incubación; para lo cual se contó l número total de brotes en cada unidad experimental (TBU). El índice de brotes por Cuadro 3. Tratamientos con los fito-reguladores ANA y/o BAP para la inducción de brotación múltiple en dos tipos de explante (yemas apicales y yemas axilares). nteó un diseño experimental bifactorial para obtener la respuesta de brota les: TIPO DEm axilares) y TRATAMIENTOS CON LOS FITO-REGULADORES ANA y BAP; éstos se adicionaron al medio de cultivo en las concentraciones como se indica en el Cuadro 3, donde se incluyó también un control sin fito-reguladores. Se utilizó el medio MS al 100 % de concentración de nutrientes, sacarosa al 3.0 % (p/v) y agar al 0.8 % (p/v). En cada UE se sembraron tres explantes (NES = número de explantes sembrados) y cada tratamiento se realizó por triplicado. La evaluac e explante (IBE) se obtuvo mediante la siguiente ecuación: IBE = TBU ÷ NES (2) ANA BAP TRATAMIENTO Concentración (µM) 1 0.0 5.0 2 3 4 5 6 7 8 0.0 0.0 2.5 0.0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.0 10.0 0.0 2.5 5.0 10.0 as diferentes fases que se siguieron para la micropropagación de A. elegans, se presentan en la Figura 6. L re – 29 – MATERIALES Y MÉTODOS Multiplicación Inducción de brotesExplantes asépticos Aclimatización Elongación y enraizamiento Transferencia al sustrato Figura 6. Esquema en el que se muestran las diferentes fases de .3.4 Multiplicación y elongación de brotes a multiplicación se realizó con diez explantes colocados en medio de cultivo con el .3.5 Inducción de raíces imultáneamente a la elongación de brotes y con base en los trabajos reportados sobre micropropagación de A. elegans. 5 L tratamiento que presentó el mayor rendimiento, incubados durante 4 semanas y al término de éste período, se separaron los brotes mayores a 0.5 cm para subcultivarse. La etapa de multiplicación concluyó al terminar el segundo período de cultivo y todos los brotes resultantes se sembraron en medio de cultivo sin fito-reguladores para su elongación; en el que permanecieron durante 3 semanas. 5 S inducción de raíces en otras especies de Aristolochia, se desarrolló un diseño experimental para definir las condiciones de inducción de raíces en brotes de A. elegans. Para ello se – 30 – MATERIALES Y MÉTODOS utilizaron plántulas asépticas de 6 semanas de edad, de las que se cortaron las yemas axilares, que se sembraron en el medio de cultivo MS al 100 % de concentración de nutrientes, sacarosa al 3.0 %, agar al 0.8 % y los fito-reguladores: ácido indolbutírico (AIB) y ANA en diferentes concentraciones de acuerdo con el Cuadro 4. Cuadro 4. Tratamientos con los fito-reguladores AIB y ANA para la inducción de AIB ANA raíces en explantes de yemas axilares. TRATAMIENTO Concentració ) n (µM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0.0 0.0 0.5 1.5 2.5 5.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.5 1.5 2.5 5.0 ada UE consistió en la siembra de 2 explantes (NES = número de explantes sembrados) IRE = TRU ÷ NES (3) l término de la prueba de inducción de raíces, los brotes elongados se transfirieron al C y cada tratamiento se realizó con cuatro UE. La evaluación se hizo al cumplirse la sexta semana de incubación y para ello se contó el número total de raíces en cada unidad experimental (TRU). El índice de raíces por explante (IRE) se obtuvo mediante la siguiente ecuación: A medio de cultivo adicionado con el tratamiento que indujo el mayor número de raíces. – 31 – MATERIALES Y MÉTODOS 5.3.6 Aclimatización as plantas enraizadas se aclimatizaron mediante el método desarrollado por Ventura a aclimatización se hizo al exponer gradualmente las plantas a las condiciones ex vitro, urante el proceso de apertura de la cubierta de plástico, se tomaron lecturas de humedad ÷ HR) (4) Donde T se debe expresar en ° K (Salisbury y Cleon, 1994). L (1998; 2001). Éste consistió en un sistema hidropónico, conformado por un frasco de vidrio que contenía solución nutritiva de Hoagland (Hoagland y Arnon, 1950), el pH se ajustó a 5.5. Después el frasco se tapó con papel aluminio, al que se le hizo un corte en forma de ‘V’ de 1 cm por lado para insertar la raíz, de esta forma el sistema radical quedó inmerso en la solución. La parte aérea de las plantas se cubrió con una bolsa de plástico transparente de 10 x 20 cm (Figura 6). La bolsa quedó boca abajo y se sujetó con una liga cubriendo la planta; de esta forma se creó un ambiente semi-hermético en el sistema hidropónico. L para ello, se hicieron perforaciones circulares de 0.6 cm de diámetro en la bolsa (parte superior), con una perforadora manual (en cada perforación se obtienen dos orificios: uno de cada lado de la bolsa). La apertura gradual se realizó de la siguiente manera: en el transcurso de la primera semana las bolsas se mantuvieron intactas; al cumplirse la primera semana, se realizó una perforación y uno de los orificios se cubrió con cinta adhesiva para dejar sólo uno abierto; al cumplirse la segunda semana se abrió el orificio que estaba cubierto. Al término de la tercera semana se realizó la segunda perforación; al cumplirse la cuarta semana se realizó la tercera y cuarta perforación; finalmente en la quinta semana se abrió totalmente la bolsa mediante un corte con tijeras, de manera que las plantas quedaron expuestas a las condiciones de la cámara de cultivo: 16 h de fotoperíodo con irradiancia de 310 µmol m-2 s-1, temperatura de 25 ± 2°C y humedad de 45- 48 % HR (termo-higrómetro digital Cole Parmer modelo PT8708). D de la cámara de incubación y dentro del sistema hidropónico de diez plantas. Con estos valores se determinó el potencial hídrico (Ψ) atmosférico en la cámara y dentro del sistema hidropónico, mediante la siguiente ecuación: Ψ (MPa) = –1.06 T log (100 – 32 – MATERIALES Y MÉTODOS Cabe mencionar que al cumplirse el primer mes de aclimatización se cambió la solución on la finalidad de comparar los parámetros mencionados, se obtuvo la velocidad VE = (VNF (t2 – t1) (5) .3.7 Cultivo en invernadero y cosecha e utilizó un sustrato preparado en el invernadero con una mezcla de peat-moss, agrolita y as plantas del sistema hidropónico se transfirieron a vasos de unicel de 0.2 l de contenida en los frascos por solución recién preparada; en estas condiciones las plantas se mantuvieron hasta cumplirse el segundo mes. Durante la aclimatización (tiempo 0, 1 y 2 meses), se evaluaron los siguientes parámetros de crecimiento: 1) número de nudos, 2) número de raíces secundarias (las formadas en la interfase raíz-tallo), 3) longitud de la raíz y 4) longitud de la parte aérea (desde la interfase raíz-tallo hasta la yema apical). C específica (VE) de cambio de cada uno, mediante los valores numéricos de los parámetros evaluados al final de cada tiempo (VNF) y los del inicio (VNI) en los intervalos de tiempo: 0-1 mes (t1 y t2) y de 1-2 meses (t1 y t2), de acuerdo con la siguiente ecuación: – VNI) ÷ 5 S vermiculita en una relación 3:1:1 respectivamente. El pH se ajustó dentro del intervalo de 6.0-6.5, mediante el uso de óxido de calcio (CaO), el cual se agregó en polvo sobre la mezcla seca. La medición de pH se realizó de la siguiente manera: se pesaron 5 g de la mezcla seca y se agregaron 50 ml de agua desionizada; se filtró sucesivamente con gasa y papel filtro de poro grande; finalmente se midió el pH del filtrado. Una vez ajustado el pH, el sustrato se esterilizó en autoclave durante 1 h a 120 °C. L capacidad que contenían el sustrato estéril. Una vez plantadas, se agregaron en cada vaso 50 ml de la misma solución nutritiva utilizada en el sistema hidropónico. Debido a la heterogeneidad de la altura de las plantas y para facilitar su manejo, se realizó una poda en todas ellas, dejándolas con una altura de 0.1 m. Las plantas contenidas en los vasos de unicel se mantuvieron durante 3 semanas dentro del laboratorio; posteriormente, se transfirieron a macetas de 2 l de capacidad cuyo volumen fue cubierto con el sustrato antes descrito. – 33 – MATERIALES Y MÉTODOS En estas macetas, al inicio y al cumplimiento de cada mes se agregaron 100 ml de la solución nutritiva de Hoagland; además de los riegos con agua de la llave una vez por semana. En cada maceta se colocó un tutor de madera (1.20 m aprox.) que sirvió como guía a la planta. Las macetas se colocaron dentro del invernadero sobre una mesa (2.50 x 1.20 m) que tenía una altura de 0.70 m del piso. Adicionalmente, se colocó una red (tela de malla de apertura muy fina) para cubrir el espacio sobre la mesa (1.5 m de altura) donde se desarrollaron las plantas; esto sirvió de barrera física para evitar la invasión de insectos. En estas condiciones de cultivo las plantas se mantuvieron durante 5 meses. Durante el período de cultivo en el invernadero, se obtuvieron lecturas de temperatura, humedad e irradiancia. En la cosecha, se cortó la parte aérea y la raíz de cada planta a partir de la interfase tallo– raíz. Las raíces se separaron manualmente del sustrato y tanto las raíces como
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