Descarga la aplicación para disfrutar aún más
Vista previa del material en texto
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN CIENCIA APLICADA Y TECNOLOGÍA AVANZADA UNIDAD QUERÉTARO POSGRADO EN TECNOLOGÍA AVANZADA REACTIVIDAD DE BASES INUSUALES DEL ADN CON AMINAS TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE: MAESTRÍA EN TECNOLOGÍA AVANZADA PRESENTA I. Q. en A. Alfredo Castanedo Varela Directores de Tesis Dr. Reynaldo Pless Elling Dra. Eva González Jasso Santiago de Querétaro, Qro. Junio del 2015 ii iii iv AGRADECIMIENTOS A mis padres Alfredo Castanedo Escobedo y Sara Varela Parga que me dieron el ser. Al Dr. Reynaldo C. Pless Elling por la dirección de mi tesis, por compartir un poco de esa amplia cultura que lo caracteriza y por su gran apoyo. A la Dra. Eva González Jasso por el apoyo brindado sobre todo en la etapa final. Al Dr. Pedro Alberto Vázquez Landaverde y a la Dra. Ma. Alejandra Rojas Molina por el tiempo que dedicaron a la revisión de mi trabajo. A Julio C.González Olvera por su apoyo técnico y por su consentimiento en reproducir en ésta tesis algunos datos de su trabajo: "Estudio de la degradación de las bases heterocíclicas del ADN en soluciones acuosas de aminas", tesis de maestría publicada en 2011, en CICATA-IPN Querétaro. Al Instituto Politécnico Nacional (I.P.N.) y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por las becas y apoyos otorgados. v ÍNDICE GENERAL ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................ vii ÍNDICE DE TABLAS ............................................................................................... xi LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS ............................................................ xii RESUMEN .............................................................................................................. 1 SUMMARY .............................................................................................................. 2 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 3 2. FUNDAMENTOS TEÓRICOS .......................................................................... 4 2.1. ESTRUCTURA DE ÁCIDOS NUCLEICOS ............................................... 4 2.2. ABSORCIÓN UV....................................................................................... 8 2.3. BASES INUSUALES ................................................................................. 9 2.3.1. 2-Aminopurina ..................................................................................... 9 2.3.2. Uracilo ................................................................................................. 9 2.3.3. 5-bromouracilo ................................................................................... 10 2.3.4. 5-metilcitosina .................................................................................... 10 2.3.5. N6-metiladenina ................................................................................. 11 2.3.6. N4-etilcitosina ..................................................................................... 12 2.3.7. Hipoxantina ........................................................................................ 13 3. ANTECEDENTES .......................................................................................... 13 4. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................ 20 5. HIPÓTESIS .................................................................................................... 20 6. OBJETIVOS ................................................................................................... 20 6.1. Objetivo General: .................................................................................... 20 6.1.1. Objetivos Específicos: ....................................................................... 20 7. MATERIALES Y MÉTODOS .......................................................................... 21 8. RESULTADOS ............................................................................................... 22 vi 8.1. 2´-desoxinucleósidos con bases inusuales ............................................. 22 8.1.1. 5-metil-2´-desoxicitidina ..................................................................... 24 8.1.2. 2´-desoxiinosina ................................................................................. 31 8.1.3. N6-metil-2´-desoxiadenosina .............................................................. 34 8.1.4. 5-Bromo-2´-desoxiuridina .................................................................. 37 8.1.5. 2-Aminopurina 2´-desoxirribósido ...................................................... 39 8.1.6. N4-etil-2´-desoxicitidina ..................................................................... 41 8.2. Resultados Cinéticos .............................................................................. 43 8.3. Oligonucleótidos...................................................................................... 45 8.3.1. 5´-TTTT(AP)TTT-3´ ........................................................................... 45 8.3.2. 5´-TTTTTATTTT-3´ ............................................................................ 47 8.3.3. 5´-TTTATT-3´, y tablas comparativas ................................................ 49 8.3.4. 5´-TAGGTGTACT-3´ ......................................................................... 51 9. CONCLUSIONES .......................................................................................... 55 10. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................ 56 11. APÉNDICE .................................................................................................. 63 vii ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Componentes de los ácidos nucleicos ..................................................... 5 Figura 2. Formas syn y anti de dos desoxinucleósidos ........................................... 7 Figura 3. Tripletes de bases con apareamiento tipo Hoogsteen en las purinas ...... 7 Figura 4. Reacción de 2´-desoxiadenosina con formamida .................................. 16 Figura 5. Reacción de 2´-desoxiguanosina con formamida .................................. 17 Figura 6. Reacción de 2´-desoxicitidina con formamida ........................................ 17 Figura 7. Perfil cromatográfico de a) metanol y b) acetonitrilo, utilizando CH3CN/MeOH (85:15 v/v) como eluente. .............................................................. 23 Figura 8. Perfil cromatográfico de 5-metil-2´-dCyd, utilizando CH3CN/MeOH (85:15 v/v) como eluente. ................................................................................................. 24 Figura 9. Perfil cromatográfico de a) timidina, y b) timina utilizando CH3CN/MeOH (85:15 v/v) como eluente. ...................................................................................... 25 Figura 10. Espectros UV de a) 5-metil-2´-dCyd; b) compuesto problema tr = 3.261; c) timina; d) timidina .............................................................................................. 25 Figura 11. Espectro de timina a pH 7 y pH 13 ...................................................... 26 Figura 12. Espectro de 2´-dThd a pH 7 y pH 13 .................................................... 26 Figura 13. Espectro UV del compuesto problema a pH 7 (azul) y pH 14 (rojo) .... 27 Figura 14. Cromatografía en capa fina de a) 2´-dThd; b) timina; c) compuesto problema. Placa RP-18 de Macherey-Nagel utilizando agua como eluyente ........ 27 Figura 15. Perfil cromatográfico de 5-metil-2´-dCyd utilizando CH3CN/MeOH(85:15 v/v) como eluente ....................................................................................... 28 Figura 16. Espectro UV del compuesto con tr = 6.54 min de la reacción de 5-metil- 2´-dCyd con pirrolidina .......................................................................................... 28 Figura 17. Cromatograma a 12 horas de reacción de 2´-desoxirribosa con pirrolidina a 110°C ................................................................................................. 29 Figura 18. Espectro del compuesto con un tr = 6.8 min de la reacción de 2´- desoxirribosa con pirrolidina a 110°C .................................................................... 29 Figura 19. Cinética de la descomposición de la 5-metil-2´-dCyd con pirrolidina a 500 mM a 110°C ................................................................................................... 29 viii Figura 20. Cinética de la aparición de los productos de la pirrolidinólisis de 5-metil- 2´-dCyd con tiempos de retención de 3.26 y 9.23 minutos ................................... 30 Figura 21. Perfil cromatográfico de 5-metil-2´-dCyd con amoniaco 0.5 M utilizando CH3CN/MeOH (85:15 v/v) como eluente ............................................................... 30 Figura 22. Perfil cromatográfico de 5-metil-2´-dCyd con NH3 utilizando CH3CN/MeOH (85:15 v/v) como eluente ............................................................... 31 Figura 23. Perfil cromatográfico de 2´-dIno con pirrolidina, utilizando CH3CN/MeOH (85:15 v/v) como eluyente ..................................................................................... 31 Figura 24 Perfil cromatográfico de hipoxantina, utilizando CH3CN/MeOH (85:15 v/v) como eluyente ................................................................................................ 32 Figura 25. Espectros UV de a) 2´-dIno; b) compuesto con tr = 3.726, c) compuesto con tr = 8.474 min y d) hipoxantina ........................................................................ 32 Figura 26. Cinética de la descomposición de 2´-dIno con pirrolidina a 500 mM a 110°C .................................................................................................................... 33 Figura 27. Cinética de la aparición de los productos de la pirrolidinólisis de 2´-dIno con tiempos de retención de 3.7 y 8.4 minuto ....................................................... 33 Figura 28. Perfil cromatográfico de N6-metil-2´-dAdo, utilizando CH3CN/MeOH (85:15 v/v) como eluente ....................................................................................... 34 Figura 29. Espectros UV: a) N6-metil-2´-dAdo; b) compuesto con tr = 4.313 min, c) N6-metiladenina, d) compuesto con tr = 7.412 min ................................................ 34 Figura 30. Espectros del compuesto con tr = 4.313 en la reacción de N 6-metil-2´- dAdo a pH=1 (azul) y pH=13 (rojo) ........................................................................ 35 Figura 31. Curva cinética de N6-metil- 2´-dAdo con pirrolidina 0.5 M .................... 35 Figura 32. Perfil cromatográfico de N6-metil-2´-dAdo con NH3, utilizando CH3CN/MeOH (85:15 v/v) como eluente. .............................................................. 36 Figura 33. Espectro UV del compuesto con tr = 4.1 min de la reacción de N 6-metil- 2´-dAdo con NH3 ................................................................................................... 36 Figura 34. Curva cinética de N6-metil- 2´-dAdo con amoniaco 0.5 M ................... 37 Figura 35. Perfil cromatográfico de 5-Br-2´-dUrd con pirrolidina, utilizando CH3CN/MeOH (85:15 v/v) como eluente ............................................................... 37 Figura 36. Perfil cromatográfico de 5-Br-2´-dUrd con amoniaco, utilizando CH3CN/MeOH (85:15 v/v) como eluente ............................................................... 38 ix Figura 37. Espectros de: a) 5-Br-2´-dUrd; b) compuesto con un tr = 5.71 min (reacción con pirrolidina); c) compuesto con un tr = 7.129 min (reacción con pirrolidina); d) compuesto con un tr = 4.801 min (reacción con amoniaco)........... 38 Figura 38. Curva cinética de 5-Br-2´-dUrd con pirrolidina 0.5 M ........................... 39 Figura 39. Curva cinética de 5-Br-2´-dUrd con amoniaco 0.5 M ........................... 39 Figura 40. Perfil cromatográfico de 2-aminopurina desoxirribósido con pirrolidina 0.5 M utilizando CH3CN/MeOH (85:15 v/v) como eluente .................................... 40 Figura 41. Espectros UV de a) 2-Aminopurina desoxirribósido y b) compuesto con tr = 3.910 min, c) 2-Aminopurina ........................................................................... 40 Figura 42. Perfil cromatográfico (260 nm) de N4-etil-2´-dCyd con pirrolidina 0.5 M utilizando CH3CN/MeOH (85:15 v/v) como eluente .............................................. 41 Figura 43. Perfil cromatográfico (260 nm) de 2´-dCyd con pirrolidina 0.5 M utilizando CH3CN/MeOH (85:15 v/v) como eluente .............................................. 41 Figura 44. Espectros de a) N4-etil-2´-dCyd; b) compuesto con tr =3.3 min; c) compuesto con un tr =3.8 min; d) compuesto con un tr =4.77 min e) compuesto con un tr =6.47; min f) compuesto con un tr =8.77 min ................................................. 42 Figura 45. Perfil cromatográfico (240 nm) de N4-etil-2´-dCyd con pirrolidina 0.5 M utilizando CH3CN/MeOH (85:15 v/v) como eluente .............................................. 42 Figura 46. Perfil cromatográfico de d-T4(AP)T3 con pirrolidina a 110°C ................ 45 Figura 47. Espectros UV de a) d-T4(AP)T3; b) compuesto con tr = 21.142; min c) compuesto con un tr = 15.641 min d) compuesto con un tr = 1.241 min ................ 46 Figura 48. Cromatogramas de pirrolidina a 110°C ................................................ 46 Figura 49. Aparición de los productos de la reacción entre d-T4(AP)T3 y pirrolidina a 110°C ................................................................................................................. 47 Figura 50. Perfil cromatográfico de dT5AT4 con pirrolidina a 110°C ...................... 48 Figura 51. Espectros de a) dT5AT4; b) compuesto con tr = 24.750 min; c) compuesto con tr = 20.101 min ............................................................................. 48 Figura 52. Zoom del perfil cromatográfico de dT5AT4 con pirrolidina a 110°C ...... 49 Figura 53. Perfil cromatográfico de d-T3AT2 con pirrolidina a 110°C ..................... 49 Figura 54. Perfil cromatográfico de d- TAGGTGTACT con pirrolidina a 110°C ..... 52 Figura 55. Mapeo de 5´-TAGGTGTACT a 2 horas de reacción con pirrolidina ..... 54 x Figura 56. Curvas de degradación de octámeros modelo con pirrolidina a 110°C. a) d-T4(AP)T3; b) d-T4CT3; c) T4GT3; d) T4AT3....................................................... 63 Figura 57. Curva de degradación de a) d-T3AT2 y b) d-T5AT4 con pirrolidina a 110°C .................................................................................................................... 64 Figura 58. Mapeo de 5´-TAGGTGTACT a 4 horas de reacción ........................... 68 Figura 59. Mapeo de 5´-TAGGTGTACT a 6 horas de reacción ............................ 69 xi ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Reacciones con pirrolidina 0.5M, a 110°C reportadas por González Olvera en 2011 ................................................................................................................. 43 Tabla 2. Reproducción de resultados .................................................................... 43 Tabla 3. Datos obtenidos en el presente trabajo con nucleósidos conteniendo bases inusuales ..................................................................................................... 43 Tabla 4. Reacciones con pirrolidina de 2´-dAdo y secuencias modelo ................. 50 Tabla 5. Reaccionesde octámeros modelo con pirrolidina a 110°C ..................... 50 Tabla 6. Tiempos de retención en minutos, de los fragmentos generados durante la pirrolidinólisis de oligómeros modelo ................................................................. 51 Tabla 7. Comparación de tiempos de retención en octámeros ............................. 51 Tabla 8. Características espectrales de los supuestos productos de la aminólisis de la secuencia 5´-TAGGTGTACT-3´ que arroja el software "UV spectrum of DNA calculator" de IDT (Integrated DNA Technologies). ............................................... 64 Tabla 9. Tiempos de retención, áreas, longitud de onda máxima y mínima, de los espectros correspondientes a los picos cromatográficos obtenidos de la degradación de la secuencia 5´-TAGGTGTACT-3´ (S.D = Desviación estándar; c.v. = coeficiente de variación). ............................................................................. 65 xii LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS Abreviatura Descripción ADN Ácido desoxirribonucléico ARN Ácido ribonucléico 2´-dAdo 2´-desoxiadenosina A Unidad de 2´-desoxiadenilato en el ADN 2´-dCyd 2´-desoxicitidina C Unidad de 2´-desoxicitidilato en el ADN 2´-dGuo 2´-desoxiguanosina G Unidad de 2´-desoxiguanilato en el ADN 2´-dThd 2´-desoxitimidina T Unidad de 2´-desoxitimidilato en el ADN 2´-dUrd 2´-desoxiuridina 5-Br-2´-dUrd 5-Bromo-2´-desoxiuridina 2´-dIno 2´-desoxi-inosina CH3CN Acetonitrilo MeOH Metanol NaCl Cloruro de sodio Na2HPO4.H2O Fosfato de sodio monobásico monohidratado HPLC Cromatografía de líquidos de alta eficiencia UV Ultravioleta M Molar xiii Símbolo Descripción °C Grado centígrado h Hora min Minuto pH Potencial del ion hidronio mL Mililitros μL Microlitros pKb Logaritmo a base 10 del valor numérico de 1/Kb ε Coeficiente de extinción nm Nanómetros tr Tiempo de retención 1 RESUMEN El ácido desoxirribonucléico (ADN) es la macromolécula que contiene la información genética de los seres vivos. Está compuesta por unidades llamadas nucleótidos, cuya composición consta de tres elementos: un azúcar desoxirribosa, un grupo fosfato y una base característica la cual puede ser adenina, guanina, citosina ó timina. Ciertos ácidos nucleicos también pueden contener bases inusuales presentes en casos específicos, tanto de forma natural como en fragmentos sintéticos. Se presenta un estudio comparativo de aminólisis a altas temperaturas de diversos 2´-desoxinucleósidos representativos de bases raras que pueden encontrarse en oligodesoxirribonucleótidos sintéticos, como una contribución para utilizar esta metodología para la determinación confirmatoria de la secuencia de nucleótidos en tales oligómeros, tal metodología no se ha reportado aún. Se determinaron los parámetros cinéticos obteniendo la caracterización de 2´-desoxirribonucleósidos que contenían las bases canónicas así como algunas bases inusuales en solución acuosa de pirrolidina 0.5 M a 110°C, por diferentes tiempos de reacción así como en solución acuosa de amoniaco a 0.5 M a la misma temperatura. La razón entre las tasas de velocidad entre 2-aminopurina y la base inmediata en reactividad (adenina) fue de 7.6 y entre 5-Br-uracilo y adenina de 10.9. En el caso de amoniaco, la razón entre 5- Bromo-uracilo y Adenina fue de 10.4. Así mismo se analizaron oligómeros modelo para comparar la sensibilidad de las bases en un hexámero, un decámero en octámeros y una secuencia con bases canónicas usando pirrolidina a alta temperatura. Las técnicas empleadas para este propósito fueron cromatografía de líquidos de alta eficiencia y espectroscopía de luz UV. En secuencias modelo donde una base en particular está rodeada de timinas, fue posible identificar los fragmentos obtenidos de la reacción en cromatogramas. Las tasas relativas de reacción de diferentes bases en estos compuestos fueron: AP > A > G ≥ C. Se observó que fragmentos con la misma secuencia y con un solo grupo fosfato terminal, pero que difieren en la posición de éste grupo (5´o 3´), se retienen con un minuto de diferencia en la columna cromatográfica empleada para este tipo de análisis sin haber traslape de las especies, donde el compuesto con fosfato terminal en 3´ se retiene con más fuerza. En el análisis de una secuencia compuesta por bases canónicas, se pudo identificar los fragmentos desprendidos de reacción en un análisis basado en tiempos de retención, comportamiento cinético y espectro UV; sin embargo, a tiempos de reacción mayores a 2 horas no hubo diferenciación de intensidad entre cortes en A, G y C. Los fosfatos terminales de las especies estudiadas, se retienen con mayor fuerza que los fosfatos intermedios en la columna de intercambio iónico empleada, ocasionando que ciertos fragmentos derivados de la reacción se retengan más que otros a pesar de tener menor número de cargas negativas en su estructura. En conclusión, se obtuvo información valiosa acerca de algunas bases inusuales que pueden ser estudiadas en un ambiente oligonucleotídico utilizando pirrolidina o amoniaco como reactivo, y se desarrolló un procedimiento de identificación de fragmentos por HPLC, que debe ser complementado con otra técnica analítica como la espectrometría de masas. 2 SUMMARY Deoxyribonucleic acid (DNA) is the macromolecule that contains the genetic information of living beings. It is composed of units called nucleotides, which composition consist of three elements: a deoxyribose sugar, a phosphate group and a characteristic base, which can be adenine, guanine, citosine or thymine. Certain nucleic acids may also contain rare bases present in specific cases, in natural or in synthetic fragments. The present work is a comparative study of various representative 2'-deoxynucleosides with rare bases in aqueous amine solutions at high temperature, which can be found in synthetic oligodeoxyribonucleotides, as a contribution to the use of this methodology for the confirmatory identification of the nucleotide sequence in such oligomers. The kinetic parameters were determined by obtaining the characterization of 2´- deoxyribonucleosides containing the standard bases and unusual bases in aqueous solution of 0.5 M pyrrolidine and 0.5 M aqueous ammonia solution at 110°C for different reaction times. The rate ratio between 2-aminopurine and adenine it was 7.6, and between 5-Br-uracil and adenine it was 10.9. In the case of ammonia, the rate ratio between 5-bromo-uracil and adenine it was 10.4. Likewise, model oligomers were analyzed to compare the sensitivity of the bases in a hexamer, a decamer, in octamers and in a sequence with standard bases, using pyrrolidine at high temperature. The techniques employed for this purpose were high performance liquid cromatography and UV spectroscopy. In model sequences where a particular base is surrounded by thymines, it was possible to identify the fragments obtained from reaction in chromatograms. The relative rates of reaction of these compunds in different bases were AP > A > G ≥ C. It was observed that fragments with the same sequence and with one terminal phosphate group, but differing in position of this group (5´ or 3´) are retained with a minute difference in the cromatographic column used, without overlap of species, where the compound containing the 3´-terminal phosphate was retained more strongly. In the analysis of a sequence composed of canonical bases, we could identify the fragments detached from the reaction based on retention times, UV spectra and kinetic behavior; however, for reaction times grater than 2 hours, there was no difference in intensity between A, G and C cuts. The terminal phosphates of the species studied, are retained more strongly than the intermediate phosphates in the column used, causing more retention in certain fragments derived from the reaction, despite having fewer negative charges in structure. In thechromatograms the null reactivity of T positions was noted, so it would be necessary in future work, to complement the analysis with mass spectrometry. 3 1. INTRODUCCIÓN Los ácidos nucléicos son macromoléculas de suma importancia biológica ya que tienen un papel central tanto en la conservación como en la transmisión y expresión de la información genética y son de dos tipos: ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN). Ambos son polímeros cuyas sub-unidades monoméricas están compuestas de la siguiente forma: en el caso del ADN, un azúcar 2´-desoxirribosa unido a un grupo fosfato en el carbono 5 y a una base característica unida al carbono 1, la cual puede ser Adenina (A), Timina (T), Guanina (G) o Citosina (C); en el ARN, la estructura es similar sólo que el azúcar es la ribosa y la base timina se sustituye por uracilo; dichas subunidades se unen por medio de grupos fosfato enlazados a las posiciones 3 y 5 del azúcar. Normalmente, la información genética está codificada en un ADN de doble cadena (como excepción algunos virus utilizan ARN) y cada organismo lleva en cada una de sus células al menos una copia de dicha información. Una fracción del ADN de un organismo es capaz de transcribirse para permitir la expresión de la información que contiene y dirigir la síntesis de moléculas de ARN y proteínas. En el momento en que se reconoció la importancia de los ácidos nucleicos surgió el interés en desarrollar técnicas para su secuenciación, es decir, el conocimiento de la sucesión exacta de las bases que los componen. Los primeros en reportar metodologías prácticas para secuenciar el ADN, fueron los grupos de Maxam y Gilbert (1977) y de Sanger y col. (1977), en donde el primero usó cuatro reacciones químicas diferenciales para romper las bases del ADN con una selectividad que depende del reactivo utilizado y el otro se basó en el análisis de los productos de una polimerización selectivamente interrumpida. Esta última metodología se ha estado desarrollando durante las últimas décadas; sirve para determinar secuencias extensas de ADN e incluso genomas completos, sin embargo no es útil para secuenciar fragmentos muy cortos como son los oligonucleótidos, los cuales tienen suma importancia hoy en día pues son aplicables en diversos campos, por ejemplo en la síntesis de genes, PCR, secuenciación, sondas moleculares, mutagénesis dirigida, oligonucleótidos antisentido, entre otros. Para secuenciar tales oligonucleótidos se deben usar los métodos de cercenamiento químico. Un método por cercenamiento simple descrito en 1985 por Ambrose y Pless es la digestión del ADN en solución acuosa de aminas a temperaturas elevadas, en donde el ADN sufre una fragmentación en todas sus posiciones, analizándose luego los fragmentos en un gel electroforético. En un trabajo realizado en 2011 por González Olvera, se reportó la aminólisis de nucleósidos canónicos y oligonucleótidos modelo sumamente cortos, determinando las tasas comparativas de degradación para estos casos así como los respectivos productos de reacción. En ese trabajo, se obtuvo una idea más clara de cómo es que ocurre el ataque químico inicial por parte de la amina a la base del ADN. Sin embargo, aparte de las bases canónicas expuestas anteriormente, se tiene la existencia de otras bases presentes en el ADN tanto de forma natural como en oligómeros sintéticos como pueden ser: la 5-metilcitosina, base característica de eucariotas presente de 3% a 5% con respecto a citosina (Mathews, & col., 2002), N6-metiladenina y N4- metilcitosina, las cuales son bases metiladas características de procariotas; la 4 hipoxantina la cual se ha utilizado en técnicas para secuenciación (Di Mauro & col., 1994); el 5-bromouracilo, análogo de la timina responsable de mutagénesis (Mathews & col. 2002); la 2-aminopurina, análogo de la adenina, igualmente responsable de mutagénesis, y uracilo; por lo que sería de interés tener un método confirmatorio para secuenciar oligonucleótidos que contengan este tipo de bases, analizando cinéticamente tanto nucleósidos como oligómeros cortos modelo, comparando la aminólisis con la formamidólisis, técnica de secuenciación alternativa propuesta por un grupo de científicos italianos (Negri & col. 1991; Ferraboli & col., 1993; Negri & col., 1994). El siguiente trabajo aborda el estudio de reacciones de nucleósidos conteniendo algunas bases infrecuentes presentes en el ADN, así como de oligonucleótidos modelo, utilizando algunos compuestos que han mostrado ser representativos en la secuenciación química en trabajos anteriores, para generar una metodología simple sobre un principio ya demostrado, para la confirmación de bases heterocíclicas inusuales en cortos fragmentos sintéticos. 2. FUNDAMENTOS TEÓRICOS 2.1. ESTRUCTURA DE ÁCIDOS NUCLEICOS Los ácidos nucleicos son polímeros lineales, cuya unidad repetitiva se denomina nucleótido. Cada nucleótido consta de tres componentes, a saber: un grupo fosfato, un azúcar de cinco carbonos y una base nitrogenada heterocíclica. En el ADN el azúcar es la 2'-desoxirribosa y en el ARN la ribosa. En cuanto a las bases, se encuentra que están presentes dos tipos de ellas, las purinas y las pirimidinas. El ADN tiene las purinas adenina (A) y guanina (G) y las pirimidinas citosina (C) y timina (T). El ARN contiene las mismas bases con excepción de la timina, en vez de ello contiene la base pirimídinica uracilo (U). Las purinas se unen al carbono 1 del azúcar, el cual se encuentra en conformación β, a través del nitrógeno en la posición 9 de la base (ver Figura 1), mientras que las pirimidinas lo hacen a través del nitrógeno en la posición 1. Los nucleótidos se unen mediante enlaces fosfodiéster entre dos residuos de azúcar, de manera que un grupo fosfato se encuentra unido al grupo hidroxilo 5´ de una unidad y al hidroxilo 3´ de la unidad siguiente. Esta unión lineal entre monómeros representa la estructura primaria de los ácidos nucleicos. La información genética se almacena en la estructura primaria del ADN, de manera que un gen es una secuencia concreta de unidades nucleotídicas que codifica información mediante un lenguaje de cuatro letras (Mathews, & col., 2002), donde cada letra (A, C, T y G) representa a una de las bases heterocíclicas. Dichas bases tienen la capacidad de formar puentes de hidrógeno entre ellas, lo cual es de suma importancia tanto para la cuestión estructural como para la función biológica. Normalmente una purina se aparea con una pirimidina, de manera que una adenina se une mediante dos puentes de hidrógeno a la timina en el caso del ADN y al uracilo en el caso del ARN. La citosina en cambio se une a la guanina mediante tres puentes de hidrógeno. 5 N N N N H N N N N NH 2 H N N N N O NH 2 H H Purina N N N N O NH 2 H N N O O H H N N O O H H Adenina Guanina 1 2 34 5 67 8 9 Citosina Timina UraciloPirimidina 1 2 3 4 5 6 Bases Heterocíclicas OH OHOH O OH OH OH O OH Azúcares 1´ 2´ 3´ 4´ 5´ 1´ 2´ 3´ 4´5´ OH O - 3 OPO N N O NH 2 OH O - 3 OPO N N N N NH 2 2´-desoxicitidina 5´-fosfato 2´-Desoxirribonucleótidos 2´-desoxiadenosina 5´-fosfato Figura 1. Componentes de los ácidos nucleicos β-D-ribosa β-D-2´-desoxirribosa 6 El hecho de que cada uno de los pares de bases (A:T o G:C) está conformado por una base grande (púrica) y una base pequeña (pirimídica), y que los puentes de hidrógeno están ubicados en posiciones equivalentes de estas bases, hace que los dos pares de bases sean sumamente similares en su geometría general, a tal punto que las distancias entre los átomos C-1´ de las bases apareadas en ácidos nucleicos es exactamente la misma para los dos tipos de pares de base, a saber 10.85 Å (Arnott & col., 1968). En el caso del ADN, el apareamiento de bases permite la unión entre dos cadenas o hebras de ácidos nucleicos, las cuales están alineadasen direcciones opuestas (si dos bases adyacentes están unidas en la dirección 3´→ 5´, sus bases complementarias están unidas en la dirección 5´→ 3´). Estas hebras forman una doble hélice cuyo exterior está constituido por las cadenas de azúcar-fosfato en contacto con el medio acuoso y el interior lo forman los pares de bases, que se apilan unos sobre otros en la región del eje de la hélice (Mathews & col., 2002). El apilamiento entre bases provoca interacciones de van der Waals entre ellas, contribuyendo a la estabilidad de la doble hélice. El entrelazado entre las hebras genera dos surcos helicoidales en la estructura, conocidos como surcos "mayor" y "menor". De acuerdo a las condiciones del medio y a la secuencia de bases específicas, la doble hélice puede adquirir conformaciones geométricas diferentes. La conformación de ADN encontrada en las células o en condiciones de humedad elevada, se denomina forma "B" o canónica (Geng & Qu, 2010), y presenta las siguientes características: por cada vuelta helicoidal hay 10 residuos, la distancia paralela al eje, que va desde el nivel de un residuo hasta el siguiente (elevación) es 0.34 nm, la rotación por residuo es de 36° y la hélice gira hacia a la derecha. La conformación geométrica juega un rol funcional importante en cuanto a la expresión genética. Las fibras de ADN en condiciones de humedad baja forman una conformación denominada "A". Esta conformación puede presentarse también cuando proteínas específicas estabilizan al ADN de algunas bacterias al haber exposición a radiación UV, ya que la conformación A es menos susceptible a daños (Sink, 2005); en moléculas híbridas de ADN-ARN y en moléculas de ARN de doble cadena (Mathews & col., 2002). El ADN-A tiene 11 residuos por vuelta helicoidal, la elevación es de 0.25 nm, la rotación es de 33° y el giro es también hacia la derecha (Sink, 2005). Experimentalmente se ha observado otra forma del ADN la cual gira hacia la izquierda, denominada forma "Z", y se observa en secuencias de purinas y pirimidinas alternadas, ante todo d(GC)n (Devlin, 2006). Una peculiaridad estructural de la forma Z es la orientación de las purinas. En los polinucleótidos hay dos orientaciones estables de las bases con respecto al anillo de azúcar, denominadas "sin" y "anti". En las formas A y B del ADN las bases siempre están en posición anti (Figura 2), sin embargo en la forma Z, las purinas están en configuración "sin" (Mathews & 2002). La elevación es de 0.37 nm, hay 12 residuos por vuelta y el giro es de -60° por dímero. El rol biológico de estructuras que no pertenecen al B-ADN es un área activa de estudio. Las consecuencias genéticas en humanos de estas estructuras comprenden alrededor de 20 enfermedades neurológicas, 50 desórdenes genéticos y enfermedades psiquiátricas (Geng & Qu, 2010). 7 OH O N N N N NH 2 OH OH O OH N N NH 2 N N OH O N N O NH 2 OH OH O OH N N NH 2 O anti- 2´-desoxiadenosina 2´-desoxiadenosinasyn- anti- 2´-desoxicitidina 2´-desoxicitidinasyn- Figura 2. Formas syn y anti de dos desoxinucleósidos Diversos estudios revelan una forma de ADN con una triple hélice intramolecular in vitro (Wells & col., 1988), (Lyamichev & col., 1989), compuesta por fragmentos de homopirimidina y homopurina, estabilizada por puentes de hidrógeno y conformada por los siguientes tripletes de bases: CGC+ y TAT (Figura 3). Las purinas en este tipo de tripletes tienen un apareamiento tipo Hoogsteen, donde las posiciones 6 y 7 de la purina forman puentes de hidrógeno con otra base. A esta forma de ADN se le denomina "H" y la energía libre para la estabilización de ésta sigue una relación lineal con el pH (Lyamichev & col., 1989). N N O CH 3O R HHN N N N N H H N NO O CH 3 R H H H R H N N O NH H RN N N N O N N NO N R H H H HH H R H H H C + A T T C G Figura 3. Tripletes de bases con apareamiento tipo Hoogsteen en las purinas 8 La forma H estabilizada por las triadas de bases antes expuestas, se conoce como canónica, sin embargo pueden existir otro tipo de triadas que pueden darse en oligonucleótidos de manera menos favorable (Mirkin & Frank-Kamenetskii, 1994). En presencia de iones divalentes, se ha visto que el duplex de ADN tipo d(G)n•d(C)n y el oligonucleótido d(AG)m forman triple hélices estabilizadas por triadas de pirimidina•purina•purina (Malkov & col., 1993). A este tipo de conformación se le conoce como forma H´ o H*, y es más versátil que la forma H en cuanto a los requerimientos de la secuencia para su formación (Mirkin & Frank- Kamenetskii, 1994). 2.2. ABSORCIÓN UV Entre 1948 y 1950, Cavalieri y col. estudiaron los espectros de absorción de purinas, pirimidinas y triazolopirimidinas, correlacionando los espectros obtenidos para verificar cuáles eran los grupos cromóforos principales. Ellos observaron que en la serie de pirimidinas, normalmente se presentaba una sola banda, excepto cuando hay un grupo amino en la posición 2, lo cual genera una banda secundaria. El grupo cromóforo simple -CH=N- en la posición 3,4 se asoció a la banda que aparece normalmente, explicando que la interacción de este grupo con el doble enlace en la posición 5,6 ocurre, sin embargo es mínima ya que el nitrógeno en la posición 1 atrae a estos electrones π, decrementando de este modo su tendencia a entrar a un sistema de resonancia. Cuando un grupo amino está presente en la posición 2, la situación se ve alterada. Esta forma tiende a decrementar el efecto inductivo del nitrógeno-1 sobre los electrones π en la posición 5,6. Estos electrones π tienen entonces una mayor tendencia a interactuar con el grupo cromóforo en 3,4 y la resonancia de -CH=CH-CH=N- hace una mayor contribución al actual estado de la molécula. En el caso de las purinas la presencia de un grupo amino o un grupo carboxilo en la posición 2, coincide igualmente con la aparición de una segunda banda en el ultravioleta lejano. Adenina, hipoxantina y xantina (a pH 6) exhiben sólo una banda. Se observó que las pirimidinas parentales también exhiben solo una banda. Guanina, isoguanina y 2,6-diaminopurina exhiben 2 máximos. Se realizaron diversos experimentos y se concluyó que no es necesario tener el anillo de pirimidina intacto en las purinas para que ocurra absorción UV y que el grupo cromóforo en la posición 2,3, es de importancia secundaria en las pruebas espectroscópicas, siendo el cromóforo mayor el grupo -CH=CH-CH=N- o -CH=CH-CH=O en la región 4,5,6. De acuerdo a los resultados en esos trabajos, parece haber una relación entre la intensidad de absorción y la simetría de la moléculas de manera que al alterar el núcleo de una pirimidina, la asimetría va acompañada de un aumento en la intensidad de absorción. Las bandas de las pirimidinas di-sustituidas en las posiciones 2 y 4 son menores que las correspondientes a compuestos di-sustituidos en las posiciones 4 y 6 pero mayores a las pirimidinas monosustituidas. Las pirimidinas tri-sustituidas tienen coeficientes molares de extinción mayores que los derivados di- y mono- sustituidos. 9 2.3. BASES INUSUALES 2.3.1. 2-Aminopurina La 2-aminopurina (2AP) es una base heterocíclica que se incorpora enzimáticamente al ADN en lugar de la adenina, pero cuando el molde que contiene 2AP se replica, el análogo puede formar un par de bases con la citosina, cambiando en la replicación un par A-T por uno G-C, generando mutaciones del tipo transición (Mathews & col., 2002). Es una base fluorescente con un máximo de excitación alrededor de 305 nm. Se utiliza como análogo en oligomeros para estudiar por métodos espectrofotométricos, cambios estructurales tanto en ADN como en ARN (Hardman & Thomson 2006). Cuando la 2AP se introduce en un ácido nucleico, causa pequeñas perturbaciones en la estructura, y la fluorescencia de la 2AP es reprimida si la hebra en la que se encuentra la base se une complementariamente a otra formando una doblehélice (Hardman & Thomson, 2006). Se ha usado como sonda espectroscópica para estudiar cambios de eversión de bases nucleotídicas por las metiltransferasas, como una metodología alternativa a la cristalografía de rayos X; dado que los máximos de emisión y de excitación de la 2AP están bien separados de los máximos de triptófano y de la tirosina, es útil para el estudio de interacciones proteína-ADN (Holz & col., 1998). 2.3.2. Uracilo El uracilo como se mencionó anteriormente es una base característica del ARN, sin embargo puede estar presente en el ADN en pequeñas cantidades como resultado de la desaminación espontánea de la citosina (50-600 eventos en el genoma humano por día), pero se presenta también por exposición a radiación gamma, o por una mala incorporación de la desoxiuridina monofosfato (dUMP) durante el proceso de replicación (Kavli & col. 2007). El uracilo en el ADN se incrementa por la deficiencia de folato o por drogas que interfieren con el metabolismo de las pirimidinas. La lesión es reparada por el mecanismo de reparación de bases iniciado por una uracil-ADN glicosilasa (Andersen & col., 2005). En humanos hay cuatro enzimas conocidas que tienen actividad uracil-ADN glicosilasa: las enzimas UNG2 (uracil-ADN N-glicosilasa), SMUG1 (uracil-ADN glicosilasa monofuncional selectiva de una hebra), TDG (timina-ADN glicosilasa) y MBD4 (proteína de dominio de unión de metilo) (Krokan & col., 2008). El mal apareamiento U:G en el ADN no bloquea la replicación pero es 100% mutagénico. Cuando se da un apareamiento del tipo U:A en ADN, por sí mismo no es mutagénico, sin embargo, los sitios abásicos resultado de la remoción del uracilo son mutagénicos y citotóxicos en células eucariotas, ya que inhiben el enlazamiento específico de factores de transcripción (Rogstad, & col., 2002). La desaminación de la citosina a uracilo en cDNA puede ser un importante mecanismo de defensa contra infección retroviral (Kavli & col. 2007). 10 2.3.3. 5-bromouracilo La 5-bromo-2´-desoxiuridina, contiene la base 5-bromouracilo que fue diseñada inicialmente alrededor de 1950 como un análogo de la timina, para perturbar la síntesis de ADN en células cancerígenas (Masterson & O’Dea, 2007). Posteriormente se encontró que las células con este análogo eran más sensibles a la radiación UV y a los rayos X (Djordjevic & Szybalski, 1960). Cuando se expusieron ratas neonatas a ciertas dosis del análogo, se encontró un desarrollo temprano de tumores, pérdida de dientes, inhibición de la queratinización del cabello, pérdida de pelo y aberraciones cromosomales (Anisimov, 1995). La combinación de la suministración del análogo con incidencia de rayos X incrementó significativamente el número de tumores malignos en ese mismo tipo de ratas, comparados con grupos control que sólo recibieron radiación o el análogo (Anisimov & Osipova, 1993). También se ha observado que al exponer a ratas en estado embrionario a la 5-bromo-2´-desoxiuridina, el espesor de la corteza cerebral se ve disminuido, las células corticales comienzan a morir, y cuando son adultas llevan un comportamiento fenotípico de hiper-locomoción (Kuwagata & col. 2011); detectando en los roedores de diez semanas de edad, un incremento significativo de serotonina y ácido homovanílico en el hipocampo y un decremento significativo de dopamina y ácido dihidrofenilacético en el hipotálamo. El análogo de timina también se ha usado para otro tipo de estudios, como en la investigación de proteínas entrecruzadas con ADN o ARN usando espectrometría de masas (Kramer & col., 2011). En este tipo de investigaciones se hace uso de luz UV para entrecruzar proteínas con ácidos nucleicos, formando enlaces covalentes a partir de reacciones basadas en radicales. Con la introducción de ciertos grupos fotorreactivos como el 5-bromo-uracilo, se logran mayores rendimientos de entrecruzamiento y máximos de absorción a longitudes de onda más grandes en este tipo de estudios (Meisenheimer & Koch, 1997). 2.3.4. 5-metilcitosina La 5-metilcitosina es una base característica de eucariotas y no es detectable en algunos organismos como Drosophila y Saccharomyces cerevisiae (Martienssen & Richards, 1995). La metilación está asociada a cambios epigenéticos, generando patrones heredables en la expresión genética y en los cambios subsecuentes fenotípicos que ocurren sin alteraciones en la secuencia subyacente o fundamental (Villeneuve & col., 2011). Los genomas eucariotas se metilan en regiones específicas y de manera no uniforme por medio de las ADN metil- transferasas, y estos cambios son esenciales para el desarrollo correcto de los mamíferos. Una característica de la metilación es que es tejido específica y puede variar con la edad. Antes se pensaba que la metilación estaba confinada únicamente a los sitios simétricos CpG en animales y CpG + CpNpG en plantas; sin embargo se ha encontrado metilación en residuos de citosina afuera de los sitios canónicos simétricos tanto en mamíferos, como en hongos y plantas (Martienssen & Richards, 1995). Muchos genes donde ocurre metilación, son factores de crecimiento o reguladores de la expresión genética que controlan el 11 crecimiento; desórdenes en estos genes caracterizan obesidad como una de las características clínicas (Herrera & col., 2011). La hipermetilación del promotor CpG generalmente resulta en la represión de la transcripción genética promoviendo la desacetilación de histonas (Villeneuve & col., 2011). El silenciamiento epigenético, como resultado del incremento de la metilación del ADN ha sido asociada a disfunciones y desarrollo de diabetes en animales modelo (Park & col., 2008). También hay un interés creciente en el rol de la metilación del ADN en la enfermedad crónica del riñón. En esta enfermedad se ha notado un incremento en los niveles de homocisteína en sangre, la cual afecta las reacciones de transferencia de metilo inhibiendo las ADN-metiltransferasas (Ekström & Stenvinkel, 2009). Posibles disturbios en la metilación pueden surgir durante el desarrollo fetal, debido a la falta de disponibilidad de donadores de metilo dietarios. Interacciones potenciales entre el ambiente y los mecanismos epigenéticos median la expresión de genes asociados con el incremento en el índice de masa corporal y adiposidad (Herrera & col., 2011). Se ha establecido que una dieta restringida en proteína, altera persistentemente la metilación de citosinas específicas en un promotor hepático, por lo que cambios en la metilación debido a nutrición prenatal, puede persistir en adultos (Lillycrop & col., 2008). Actualmente existe también la búsqueda de biomarcadores epigenéticos para predecir problemas de salud futuros, entender los factores ambientales relacionados con enfermedades que pudieran modular la expresión genética, y estudiar estrategias nuevas basadas en agentes nutricionales o farmacológicos que pudieran modificar marcas epigenéticas (Milagro & col., 2012). 2.3.5. N6-metiladenina La N6-metil-adenina es una base característica de procariotas, archaea y protistas (Wion & Casadesús, 2006) y está involucrada en diversos mecanismos biológicos de regulación. La metilación en el grupo amino de la adenina disminuye la estabilidad termodinámica del ADN, donde primordialmente la base se encuentra en conformación cis (el grupo metilo se encuentra del lado del Nitrógeno 1 de la base) formando puentes de hidrógeno en la conformación Hoogsteen con la timina (von Hippel & Engel, 1978). La curvatura de la molécula del ADN se incrementa, afectando las interacciones específicas de secuencia entre proteínas y ADN (Diekmann, 1987). Esto es importante, ya que cuando existe invasión viral en bacterias, la metilación está involucrada en sistemas de defensa, donde la interacción del ADN con enzimas específicas es crucial. Estos sistemas llevan a cabo dos actividades, modifican residuos de adenina o citosina por medio de una metiltransferasa ensitios específicos del ADN bacteriano, protegiéndolo del ataque de endonucleasas y escinden ADN no metilado proveniente de algún fago (proceso de restricción). Se ha documentado que el patrón de metilación del ADN, es parte integral de la identidad de cada cepa bacteriana, por lo que una función de los sistemas de modificación y restricción, es el mantenimiento de la identidad de las especies (Jeltsch, 2003). Existen dos ADN-metiltransferasas muy bien estudiadas sin una afinidad aparente con procesos de restricción. Estas enzimas son Dam de Escherichia coli y CcrM de Calobacter crescentus y ambas catalizan 12 la transferencia de un grupo metilo de S-adenosilmetionina a adenina (Reisenauer & col. 1999). CcrM metila secuencias GANTC (donde N es cualquier base canónica), es esencial para la viabilidad de la bacteria y una expresión inadecuada durante el ciclo celular resulta en morfología anormal e interrupción del control de la replicación (Reisenauer, Kahng, Collum, & Shapiro, 1999). La metilasa Dam metila secuencias GATC. Existen 11 regiones en el origen de replicación del cromosoma de E. coli (oriC) que contienen esta secuencia, y la replicación comienza cuando una proteína denominada DnaA se une en ese sitio y separa las dos hebras de la hélice de ADN; la unión de la proteína sólo es posible si los sitios GATC de oriC están metilados (Boye & col., 2000). La metilación también juega un papel en la regulación del gen dnaA, donde uno de los promotores para ese gen se encuentra activo sólo si existe metilación en él (Braun & Wright, 1986). Se ha documentado en experimentos con cepas bacterianas mutantes, las cuales utilizaban la metilasa dam de manera esencial y no esencial para su viabilidad, que la metilación en la posición N6 de la adenina en ciertos genes, tiene importancia en la atenuación de la virulencia en algunos patógenos, como Salmonella enterica, Haemophilus influenzae y Yersinia pseudotuberculosis (Heusipp & col., 2007). En Escherichia coli uropatogénica, la metilación está involucrada en una variación de fase, es decir, una variación reversible en el nivel de expresión genética para producir proteínas específicas (Woude & Bäumler, 2004), que en este caso, son antígenos de superficie que le permiten a la bacteria adherirse al tracto urinario para evitar el ataque de respuesta del sistema inmune (Wion & Casadesús, 2006). La expresión de genes que permite producir dichos antígenos está regulada por una proteína de respuesta a Leucina, y algunos de los sitios de unión de esa proteína contienen sitios GATC los cuales se metilan diferencialmente para regular la transcripción (Heusipp & col., 2007) y permitir a la bacteria la adhesión mencionada. 2.3.6. N4-etilcitosina La N4-etilcitosina es una base que se ha utilizado en experimentos de hibridación para reducir la estabilidad del ADN rico en GC, ya que este tipo de ADN tiende a formar estructuras de horquilla. La formación específica de híbridos, entre un oligonucleótido y una secuencia de ADN es la base para muchos análisis de ácidos nucleicos, y el éxito en este tipo de técnicas implica una discriminación de híbridos perfectos de aquellos que contienen errores. La N4-etilcitosina, tiene una alta especificidad para formar un par de bases con la guanina, y este par de bases tienen a su vez una estabilidad muy similar al par de bases Adenina-Timina, (Nguyen & col., 1997). Se ha demostrado que la N4-etilcitosina es aceptada por la ADN polimerasa (polimerasa Taq y fragmento de Klenow), la cual coloca nuevas bases a una cadena de ADN en crecimiento, así como que la estabilidad térmica de híbridos de doble cadena que contienen el análogo, es independiente del contenido de bases presentes, aunque varía con la secuencia de nucleótidos, como ocurre con los híbridos naturales o sin análogos (Nguyen & col., 1998). El uso del análogo en híbridos de ácidos nucléicos, junto con algún solvente 13 caotrópico como el cloruro de tetrametilamonio, permite un ajuste fino de la temperatura de fusión (Tm) para sistemas isoestables (Nguyen & col., 1999). 2.3.7. Hipoxantina La hipoxantina es la base constitutiva del nucleósido inosina. La inosina monofosfato es el primer nucleótido que se forma en la cadena de síntesis de purinas en el organismo (principalmente en el hígado) y puede ser convertida tanto a adenosina monofosfato como a guanosina monofosfato. En el proceso de catabolismo, la hipoxantina también es uno de los productos de degradación del ATP, y se oxida por medio de la xantina oxidasa para formar xantina y ácido úrico. Se sabe que se acumula cuando existe deterioro en carne de animales o pescado, así como en distintos órganos como el corazón, el riñón y músculo esquelético en caso de deceso, por lo que el nivel de concentración de hipoxantina es usado tanto en la industria alimenticia como índice para evaluar la frescura de carne y pescado (Lawal & Adeloju, 2012), como en la ciencia forense para determinar la hora de muerte dentro de un cierto intervalo de tiempo (Lendoiro & col., 2012). Los niveles de hipoxantina e inosina en el plasma sanguíneo, se incrementan cuando existe un estrés oxidativo en el tejido cardíaco (como en el caso de isquemia o infarto al miocardio), por lo que existen métodos cromatográficos para determinar su concentración en el fluido corporal mencionado, como un indicador de isquemia cardíaca aguda (Farthing & col., 2007). La hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa, es una enzima responsable de reciclar purinas, ya que convierte las bases hipoxantina y guanina a nucleótidos de purina utilizables (IMP y GMP) (Ceballos-Picot et al., 2009). Cuando existen mutaciones en el gen que codifica para dicha enzima (HPRT1), se da lugar a la denominada enfermedad de Lesch- Nyhan, donde se presentan anormalidades neurológicas y de comportamiento tales como: contracciones involuntarias de los músculos, hiperuricemia (alta concentración sérica de ácido úrico) y automutilación (Guibinga & col., 2010). La hipoxantina se ha utilizado en metodologías de secuenciación química de ADN (Saladino & col., 1996), su uso con este fin se describe en la siguiente sección. 3. ANTECEDENTES En 1977 Maxam y Gilbert propusieron un método de secuenciación donde el ADN se escinde utilizando cuatro reacciones químicas diferenciales (una para cada base), separando por electroforesis en un gel de poliacrilamida los fragmentos marcados radioactivamente en un extremo de la cadena. La presencia o ausencia de una banda en un determinado carril del gel permite identificar la presencia de una base en una posición dada de la secuencia. Las reacciones específicas son las siguientes (Maxam & Gilbert, 1980): a) se hace reaccionar el fragmento de ADN con dimetil-sulfato 50 mM a 20°C por 10 minutos, ocasionando la metilación de una proporción de las purinas (A y G), alterando la estabilidad electrónica de 14 dichas bases, se precipita el ADN con etanol y se hace una segunda reacción con piperidina 1 M a 90°C por 30 minutos, rompiendo el enlace entre la base guanina metilada y el azúcar desoxirribosa, b) se realiza un tratamiento ácido, protonando los anillos púricos (A y G), lo que causa el desprendimiento de una proporción de estas bases del ADN; c) se utiliza hidrazina la cual puede romper los anillos de pirimidina (C y T), desplazando los fragmentos generados del azúcar con una segunda reacción con piperidina; d) se utiliza hidrazina con NaCl a 1.5 M donde únicamente la citosina reacciona apreciablemente. La piperidina a altas temperaturas utilizada como segundo paso en cada uno de estos tratamientos, da lugar a dos eliminaciones β en el azúcar, separando completamente el residuo generado de los fosfatos 3´ y 5´ de los fragmentos remanentes de ADN. Sanger y col. (1977) propusieron una metodología alternativa de secuenciación al mismo tiempo que el grupo de Maxam y Gilbert (1977); dicha técnica se basó en la reacción llevadaa cabo por la ADN polimerasa, en donde en presencia de los cuatro desoxirribonucleótidos y un oligonucleótido como cebador se realiza una copia complementaria del fragmento de ADN de interés. En este caso se realizan cuatro reacciones por separado en presencia de concentraciones equivalentes de dATP, dCTP, dGTP y dTTP junto con un décimo de equivalente de un didesoxinucleótido (ddATP, ddCTP, ddGTP ó ddTTP). Cuando la polimerasa inserta ocasionalmente un didesoxinucleótido la elongación de la cadena o copia llevada a cabo se detiene, generándose de esta manera fragmentos de diversos tamaños que identifican a una determinada base; dichos fragmentos se separan en un gel electroforético y la secuencia del ADN de interés se determina basado en el patrón de las bandas electroforéticas en el gel. Ambrose y Pless (1985) desarrollaron un método de secuenciación química para polidesoxirribonucleótidos marcados en el extremo 5´, donde el ADN se sometía a una reacción con piperidina a 90°C. Los fragmentos obtenidos de la ruptura solvolítica se separaban en un solo carril electroforético y el criterio interpretativo de las bandas se basó en la intensidad de éstas y en la separación relativa entre bandas sucesivas. La técnica evitaba el uso de sustancias tóxicas como hidrazina, utilizada en el proceso de Maxam y Gilbert (1977), permitía también un requerimiento de muestra más reducido, aunque el proceso era más dependiente de la adecuada resolución de bandas y la ausencia de impurezas. La intensidad de las bandas para las bases fue como sigue: A > G ≈ C > T. Un incremento en concentración de NaCl en la solución de amina resultó en una reducción en la escisión de G; esto se interpretó de la siguiente forma: a mayor fuerza iónica, hay un incremento en la ionización de guaninas por lo que resultarían más resistentes a un ataque nucleofílico. Posteriormente se estudiaron las condiciones que permitieran aplicar dicho método en oligodesoxirribonucleótidos (Ambrose & col. 1986), aplicando un tratamiento ácido ligero para lograr una depurinización parcial seguido de un extenso tratamiento con piperidina caliente. Los resultados de la intensidad de bandas fue el siguiente: G>A>C>T. Ambrose y col. (1988) mejoraron las condiciones para obtener patrones más claros y extendieron el análisis a fragmentos marcados radioactivamente en el extremo 3´. Temperaturas de 110°C daban tiempos de reacción más cortos y 15 patrones de radioactividad fácilmente interpretables. Se observó también una menor tasa de escisión en metil-citosinas comparadas con citosinas (Ambrose & Pless, 1987; Ambrose & col., 1988), análoga a la muy reducida tasa de hidrazinólisis de metil-citosinas comparadas con citosinas observada en el procedimiento de Maxam y Gilbert (1980); se sugirió un ataque inicial tipo Michael en el carbono-6 del resto de pirimidina para producir un ion enolato, el cual sería desestabilizado por metilación en C-5. Rosenthal y col. (1990) utilizaron ADN marcado en su terminal 5´ con fluoresceína unida mediante enlace amidopropil o tiopropiléter, desarrollando una secuenciación química con un método para cuatro carriles electroforéticos y otro para un solo carril. En el primero se desarrollaron cuatro reacciones químicas utilizando dimetilsulfato, ácido fórmico, permanganato de potasio e hidrocloruro de hidroxilamina. En el método de un carril se usó dimetilsulfato seguido de piperidina en presencia de cloruro de sodio. La intensidad de las bases individuales en este método siguieron el orden G > A > C > T. La fluoresceína resultó ser un marcador estable en las reacciones de degradación, permitiendo un adecuado patrón de secuenciación sin uso de radioactividad por lo que los autores promovían el potencial de la técnica para su automatización. En 1991 Testoff y Pless secuenciaron ADN utilizando soluciones acuosas de diferentes aminas. Se observó un aumento de reactividad de guaninas al utilizar aminas menos básicas, entendiendo esto sobre la base de que a menor basicidad la proporción de guaninas desprotonizadas es menor, y por lo tanto, hay más guaninas vulnerables al ataque nucleofílico, independiente de la concentración de sal utilizada en solución. Ferraboli y col. (1993) presentaron evidencia de que la degradación de ADN es posible, mediante calentamiento en solución acuosa de formamida, lográndose una secuenciación en un solo carril electroforético. La intensidad de bandas se presenta a continuación: G ≥ A > C > T. La relación entre las tasas de escisión de las bases guanina y adenina fue G/A = 1.5 ± 0.05 y entre timina y citosina fue en el intervalo T/C = [0.7-0.5]. La reacción daba resultados repetibles y no era muy sensible a cambios de pH. Negri y col. (1994) hacen la observación de que la secuenciación descrita en el trabajo anterior no es posible con fragmentos marcados en la terminal 5´, ya que el uso de formamida sola produce perfiles de secuenciación sucios. Esto dio a entender que con esta reacción el corte del enlace fosfodiéster en 3´ se daba de manera satisfactoria, pero que el siguiente corte del lado 5´ de la unidad de desoxirribosa resultaba menos eficiente en este medio de relativamente baja basicidad. Se estableció un protocolo usando formamida seguido de tratamiento con piperidina, permitiendo la secuenciación de fragmentos marcados en 5´ usando un marcaje radioactivo o fluorescente. La intensidad de las bandas producidas fue: G > A > C > T. Di Mauro y col. (1994) propusieron solucionar el problema de la pequeña diferencia entre las tasas de escisión en G y A, sustituyendo la base inosina por guanina durante la amplificación del fragmento de ADN a analizar. Reportaron que de los enlaces fosfodiéster los del lado 5´ de las inosinas eran escindidos con 16 mayor eficiencia que el 5´ de las guaninas para lograr una diferencia cinética más informativa (I/A = 3.3 ± 0.38). En 1966, Jones y col. estudiaron la acción de degradación alcalina sobre purinas y sus derivados, ya que en esa época se desarrollaron algunos métodos para determinar la distribución de nucleótidos en ácidos desoxirribonucleicos que involucraban el álcali como agente reactivo; los autores identificaron los productos de la hidrólisis cromatográficamente y espectrofotométricamente, utilizando soluciones estándar de compuestos conocidos y comparando los espectros a pH 1 y pH 13. Sin embargo no se tenían reportes de mecanismos de reacción de estos compuestos con formamida. Saladino y col. (1996) estudiaron las rutas de degradación de 2´-desoxiadenosina y 2´-desoxiguanosina con dicho compuesto. Las técnicas empleadas para la separación e identificación de compuestos fueron: Cromatografía en Capa Fina, Cromatografía de gases acoplada a Espectrometría de Masas, Resonancia Magnética Nuclear y Microanálisis Elemental. Los resultados obtenidos sugirieron que la formamida reacciona con el carbono 8 del anillo de purina, resultando en el caso de la 2´-desoxiadenosina en varios intermediarios dando al final formamido-4-[N-(2´-desoxi-β-D- ribofuranosil)]pirimidina, que en condiciones vigorosas se transformaba en 4,6- diamino-5-formamidopirimidina (Figura 4). N NH NH 2 N N OH O OH HCONH 2 N NH NH 2 N N OH O OH H H O N H H N NH NH 2 N N OH O OH H H H O N H N NH NH 2 N NH OH O OH H H O N OH H H N NH NH 2 N NH OH O OH H H O NH 2 CHO O H H N NH NH 2 N NH 2 H H O 110°C - + -Calor Figura 4. Reacción de 2´-desoxiadenosina con formamida 17 En el caso de la 2´-desoxiguanosina, los compuestos resultantes fueron 2,6- diamino-4-oxo-5-formamido-6-[N-(2´-desoxi-β-D-ribofuranosil)]pirimidina y 2,6- diamino-4-oxo-5-formamidopirimidina (Figura 5). . N NNH 2 O N N OH O OH H HCONH 2 N NNH 2 O N NH OH O OH H O H H N NNH 2 O N NH 2 H O H H 90°C + Figura 5. Reacción de 2´-desoxiguanosina con formamida Se propuso la hipótesis de que modificacionesestructurales que redujeran el carácter electrofílico en la posición C(8) del anillo de purina, reducirían la reactividad de dicho análogo con un nucleófilo débil como la formamida. Para probar esto se insertaron análogos del tipo 7-desaza nucleósidos púricos (adenosina, guanosina e inosina) a polinucleótidos y se desarrolló una secuenciación. Los resultados mostraron que con la modificación se redujo la susceptibilidad al ataque por la formamida, al grado de que el análogo desaza de la inosina fue prácticamente inerte (I > G > desazaG > desazaI). Saladino y col. (1997) llevaron a cabo el estudio de la degradación de 2´- desoxicitidina con formamida (Figura 6), con el fin de entender mejor la reacción y determinar si era posible añadir algún nucleósido análogo para una mejor discriminación entre residuos C y T. Se determinó que la formamida reacciona por adición nucleofílica al carbono 6 de la 2´-desoxicitidina, dando como productos finales urea y 2´-desoxi-β-D-ribofuranosil-urea. OH O OH N N O NH 2 NH 2 CHO OH O OH N N O NH 2 N H O H NH 2 CHO OH O OH N N O NHCHO N H O H NH 2 O NH 2 OH O OH N H NH 2 O 110 °C + Figura 6. Reacción de 2´-desoxicitidina con formamida 18 Se reportó también que la timidina no reaccionaba en formamida a altas temperaturas, incluso en un tiempo prolongado de reacción. Con estos datos se planteó la siguiente hipótesis: modificaciones estructurales que mejoraran o redujeran el carácter electrofílico del carbono en posición 6 del anillo de citosina, podrían cambiar drásticamente su reactividad con un nucléofilo débil como la formamida. Se analizó entonces la sensibilidad de reacción de la formamida con 5- bromo-2´-desoxicitidina y 5-metil-2´desoxicitidina incorporados a polinucleótidos (intercalados con dCTP). Para la secuenciación se usó formamida seguido de piperidina o N-metil-formamida (Negri & col., 1996). La presencia del grupo metilo como sustituyente, causó un retardo en la migración de los productos que lo contenían en el gel de poliacrilamida, ocasionando una mayor distancia entre el corte 5-metil-C y la banda inmediata superior comparado con un carril control. El grupo metilo ocasionó un decremento en la susceptibilidad al ataque de la formamida en un factor de dos. El grupo 5-bromo aumentó a poco más del doble la susceptibilidad al ataque. En los trabajos donde se aplica la formamidólisis, se tiene duda de la pureza de los reactivos, ya que se utilizó formamida de diferentes fuentes y además es sabido que a altas temperaturas la formamida se hidroliza a formiato de amonio, por lo que no queda claro si la escisión la desarrolla el formiato o la formamida, además de que se reportó que la reactividad disminuye con el uso de formamida cuidadosamente desionizada (Negri & col., 1991). Arredondo Vázquez y col. (2007) hacen una comparación secuenciando oligodesoxirribonucleótidos radiomarcados en 5´ con 12 aminas diferentes, con análisis en un solo carril electroforético. Diferentes aminas daban una intensidad de señales global diferente: amoniaco, etilamina, etilendiamina, dietilamina, piperidina y quinuclidina, todos a una concentración de 0.5 M, dieron patrones radioactivos de la misma intensidad, comparable a la intensidad de la señal obtenida con NaOH al 0.01 M en solución acuosa (Arredondo Vázquez y col., 2007). En cambio algunas aminas como la morfolina, la trietilamina y DABCO daban señales más débiles en el carril electroforético. Para todas las condiciones la vulnerabilidad relativa de los sitios adenina, citosina y timina fue la siguiente: A > C > T. La reactividad de G decaía dependiendo de las condiciones precisas empleadas y está correlacionada con la basicidad de la amina y con la concentración de sal añadida durante la aminólisis. Una mayor concentración de sal disminuye la reactividad de G como observaron Ambrose y Pless en 1984. Los autores explican que en un contexto oligonucleotídico, el efecto puede deberse a que a mayor fuerza iónica de la solución, el pKa de los residuos de guanina disminuye, incrementándose la proporción de guaninas desprotonizadas, que serían menos reactivas. González Olvera (2011) reportó diferentes tasas de reacción de 2´- desoxinucleósidos con pirrolidina en donde se observó la siguiente secuencia de reactividades: A>C>G>>T, la cual está correlacionada con lo antes observado por Ambrose y Pless (1984) y Testoff y Pless (1991) en el contexto polinucleotídico. También se observó una mayor reactividad del grupo guanina con el uso de amoniaco, lo cual coincide también con lo observado en trabajos anteriores. En este trabajo se planteó la posibilidad de que el ataque solvolítico en posiciones C 19 en un ambiente oligonucleotídico, resulte inicialmente en una hidrólisis formando una unidad de desoxiuridilato sin cercenamiento inmediato en la cadena; esto por el hecho de que la 2´-dCyd resultó ligeramente más vulnerable que la 2´-dAdo, pero en cercenamiento en oligodesoxirribonucleótidos los cortes en posiciones A y C se relacionaban aproximadamente en 3:1 (Arredondo Vázquez, 2007). Se analizó también la aminólisis de oligómeros cortos modelo del tipo d-TAT y d-TGT. Dado que las bases T son resistentes a la aminólisis (Ambrose & Pless, 1984) estos trímeros son modelos idóneos para estudiar de manera simple la reactividad de las bases A y G en un entorno oligonucleotídico. Se observó una diferencia en la tasa de reactividad con el grupo G, en donde el oligómero era alrededor de 50 veces más reactivo que el 2´-desoxinucleósido, por lo que llevar este tipo de estudio a oligómeros más extensos, ayudaría a comparar la sensibilidad de las bases con el cambio en el tamaño de la cadena. Se quiso conocer en este trabajo la vulnerabilidad solvolítica de unidades de desoxiinosinato en aminólisis, ya que se tenía duda si en la reacción por ejemplo con pirrolidina, se iba a dar el mismo efecto que el reportado por Di Mauro y col. (1994) en formamidólisis, manifestándose una reactividad superior a la de las demás unidades nucleotídicas, dado que en las condiciones básicas que imperan en esa situación el grupo hipoxantina en el nucleósido se encontrará predominantemente en forma desionizada, lo que disminuiría su reactividad, de manera similar como ocurre con la 2’-desoxiguanosina. En vista de los resultados reportados para ADN por Pless y Bessman (1983), se esperaba que la reactividad del grupo 2-aminopurínico en un oligonucleótido fuera muy elevada, lo que se corroboró en este estudio. Para una posición de N6-metiladenina en ADN se observó de manera cualitativa, que fue significativamente menos sensible a la aminólisis que las posiciones A normales (Ambrose & Pless, 1985), por lo que en este trabajo se anticipaba ver una tasa menor en pirrolidinólisis de la N6-metil-2’-desoxiadenosina, comparado con la 2’-desoxiadenosina, y por consideraciones de efectos inductivos dentro del heterociclo también se esperaba una menor reactividad, en pirrolidinólisis, de la N4-metil-2’-desoxicitidina comparado a la 2’-desoxiciticina, situación que no ocurrió como se verá más adelante. 20 4. JUSTIFICACIÓN Una metodología de simple cercenamiento químico, basada en el principio ya demostrado de aminólisis o amonólisis, permitirá confirmar de manera económica la posición de bases heterocíclicas inusuales en oligodesoxirribonucleótidos sintéticos preparados para diversas aplicaciones especiales. Tal metodología aún no se ha reportado. 5. HIPÓTESIS Utilizando aminólisis o amonólisis a temperaturas elevadas, las bases heterocíclicas inusuales ostentarán reactividades diferenciales que permitirán usar estos métodos para localizar estas bases, de manera confirmatoria, en oligodesoxirribonucleótidos. 6. OBJETIVOS 6.1. OBJETIVO GENERAL: Determinar la cinética del cercenamiento solvolítico de oligonucleótidos, en dependencia del reactivosolvolítico, del tipo de base involucrado y de su posición dentro del oligómero. 6.1.1. Objetivos Específicos: a) Comparar la reactividad aminolítica o amonolítica de algunos desoxinucleósidos con varias bases heterocíclicas inusuales. b) Comparar la reactividad aminolítica de bases canónicas en dependencia de su posición en el oligonucleótido. c) Comparar los fragmentos oligoméricos obtenidos en aminólisis de oligonucleótidos. 21 7. MATERIALES Y MÉTODOS Los nucleósidos 2’-desoxiuridina, 5-bromo-2´-desoxiuridina, 5-metil-2’- desoxicitidina, N6-metil-2’-desoxiadenosina, 2’-desoxiinosina, 2’-desoxiadenosina, 2’-desoxiguanosina y 2’-desoxicitidina se obtuvieron de Sigma. El 2’-β-D-desoxirribósido de la 2-aminopurina se obtuvo de TriLink Biotechnologies. Agua, metanol y acetonitrilo grado HPLC se obtuvieron de J.T.Baker. El amoniaco utilizado fue de J.T.Baker sin purificación especial. La pirrolidina se obtuvo de Aldrich, y no se llevó a cabo una purificación adicional. Las solvólisis en solución acuosa de amina a altas temperaturas se realizaron en ampolletas de borosilicato de 1 mL marca Wheaton. Los análisis de HPLC se hicieron en un equipo Agilent 1200. En el caso de los aminolisatos, el análisis se realizó con una columna Zorbax XDB-CN, de 4.6 mm x 150 mm, con elución isocrática con acetonitrilo/metanol (85:15, v/v) (González-Olvera, 2011). Los oligodesoxirribonucleótidos requeridos se obtuvieron de Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa, E.U.A., y de Glen Research, y se utilizaron sin purificación especial. Se evaluaron por cromatografía en la columna Zorbax OLIGO (6.2 x 8 mm) con elución por un gradiente lineal de cloruro de sodio en agua-acetonitrilo (80:20, v/v) ajustado a pH 5 con amortiguador de fosfato. El Buffer A consistió en 0.02 M de Na2HPO4 .H2O, pH 5.0, en agua-acetonitrilo (80:20, v/v) y el buffer B, fue igual que el anterior a una concentración 1 M de NaCl. El gradiente se construyó partiendo de 0 a 80% de solución B en 40 minutos con un flujo de 1 mL por minuto a 25°C. Experimentos realizados: 1) Estudio de las reacciones de los nucleósidos 2’-desoxiuridina, 5-bromo-2´- desoxiuridina, 5-metil-2’-desoxicitidina, N4-etil-2’-desoxicitidina, N6-metil-2’- desoxiadenosina y 2’-desoxi-inosina a 5 mM en nucleósido, en solución acuosa de pirrolidina a 0.5 M, a 110°C, inicialmente por tiempos de reacción de 1, 3, 6, 12, 24, 48 y 72 horas, analizando las mezclas resultantes por HPLC con seguimiento de absorbancia en UV. 2) Estudio de la reacción con pirrolidina a 110°C de los siguientes oligodesoxirribonucleótidos: d-T4GT3, d-T4CT3, d-T4(2-AP)T3, d-T4AT3, d- T3AT2 y d-T5AT4, con análisis de las mezclas de reacción por cromatografía en la columna OLIGO. La ligera asimetría de las secuencias permitió distinguir el desprendimiento de los fragmentos del lado 3’ y del lado 5’ de la base vulnerable. Estos experimentos permitieron comparar la sensibilidad de las bases G, C, 2-aminopurina y A en posición aproximadamente central en octanucleótidos, y comparar la sensibilidad de la base adenina en posición aproximadamente central en un hexámero, un octámero y un decámero. 22 3) Estudio de la reacción con pirrolidina a 110°C del oligonucleótido d- TAGGTGTACT, analizando la mezcla de reacción con la columna OLIGO con las condiciones antes expuestas. 4) Los nucleósidos 2’-desoxiuridina, 5-bromo-2´-desoxiuridina, 2’-desoxi- inosina y 5-metil-2’-desoxicitidina se examinaron con condiciones semejantes a las descritas con pirrolidina en solución acuosa de amoniaco a 0.5 M. 8. RESULTADOS 8.1. 2´-DESOXINUCLEÓSIDOS CON BASES INUSUALES Se desarrolló la reacción de pirrolidina con 5-metil-2´-desoxicitidina, N6-metil-2´- desoxiadenosina, 2´-desoxi-inosina, 5-bromo-2´-desoxiuridina y 2-aminopurina desoxirribósido de la siguiente forma: se mezclaron 1.5 mL de solución acuosa de nucleósido al 10 mM con 1.5 mL de solución acuosa de pirrolidina o amoniaco al 1 M. Posteriormente, alícuotas de 160 µL de esta solución fueron depositadas en ampolletas de borosilicato de 1 mL, las cuales fueron tapadas con Parafilm y congeladas a -20°C por una noche. Las ampolletas fueron selladas utilizando un mechero y se colocaron en el horno de secado a 110°C, por tiempos de reacción en un rango entre 0 y 96 horas dependiendo del nucleósido involucrado en la reacción. Después la ampolleta correspondiente se quitó del horno, se dejó enfriar a temperatura ambiente, y se agitó para garantizar la homogeneidad de su contenido. Se fracturó el cuello de la ampolleta y se mantuvo destapado hasta que la solución se secara por completo. Se añadieron 40 μL de agua grado HPLC y se repitió el secado de la mezcla, buscando una evaporación total de la pirrolidina. Luego, el residuo se disolvió con 80 μL de agua, grado HPLC y de esta mezcla se tomaron 20 μL que se diluyeron con 380 μL de CH3CN/MeOH (85:15 v/v). Las mezclas se analizaron en HPLC, inyectando alícuotas de 20 μL, bajo un flujo de 0.5 mL/min con las condiciones expuestas anteriormente. De esta manera, el volumen de muestra inyectado en cada corrida cromatográfica contenía el material correspondiente a 10 nmol del nucleósido inicial. También se analizaron en solución acuosa de amoniaco a 0.5 M, siguiendo el procedimiento citado anteriormente, los siguientes nucleósidos: 2'-desoxiuridina, 5-bromo-2´- desoxiuridina, 2´-desoxi-inosina, 5-metil-2´-desoxicitidina, N4-etil-citosina y N6- metil-2´-desoxiadenosina. Se registraron los espectros de absorción de los diferentes productos mencionados en eluyente de CH3CN/MeOH (85:15 v/v). Se usó el detector de fotodiodos manejando valores de λ entre 220 nm y 300 nm en la región UV para detectar compuestos de degradación que pudieran absorber en ese rango de longitud de onda. Se corrieron los componentes en los cuales estaba disuelto el nucleósido (Acetonitrilo y Metanol) por separado en el equipo y se obtuvieron los cromatogramas correspondientes. El metanol y el acetonitrilo prácticamente no absorben a las longitudes de onda estudiadas, las señales de absorción obtenidas por ejemplo a λ= 280 nm (Figura 7) se deben al cambio abrupto en el índice de 23 refracción que se presenta cuando pasa el volumen de carga por el detector, ya que los gradientes de índice de refracción que se presentan de manera transversal al rayo de luz lo desvían, aumentando o reduciendo la intensidad incidente sobre el detector. Figura 7. Perfil cromatográfico de a) metanol y b) acetonitrilo, utilizando CH3CN/MeOH (85:15 v/v) como eluente. Esto es más marcado en el caso del metanol, donde el haz de luz incidente en el detector disminuye (lo que representaría una absorción) seguido de un paso mayor de luz en una fracción pequeña de tiempo. El hecho de que los efectos son mayores en el caso del metanol, comparado con el caso del acetonitrilo, es lógico, porque el solvente de elución (CH3CN/MeOH, 85:15, v/v) se asemeja menos en su índice de refracción al metanol que al acetonitrilo. Estas señales indican que el tiempo muerto en estos cromatogramas es de aproximadamente 3.260 minutos y que dichas señales no interfieren de manera importante, con la señal de algún compuesto que no sea retenido en la columna. A280 tiempo de elución (min) A280 a) b) 24 8.1.1. 5-metil-2´-desoxicitidina A continuación se presentan las señales a diferentes tiempos de reacción del nucleósido 5´-metil-2´-desoxicitidina utilizando pirrolidina como reactivo, donde se observa que el material inicial no es completamente puro ya que contiene un compuesto que de hecho, también es generado, en mayor medida, durante la aminólisis. Este compuesto no se retiene en la columna dado que se encuentra con un tr = 3.26 minutos (ver Figura 8). Al obtener el espectro de absorción, de este compuesto, se observa un máximo de absorción con una λ ≈ 266 nm. Se planteó la posibilidad de que el compuesto generado en
Compartir