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Proyecto Terminal III GRUPO 8BV1 INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE: PROYECTO DE INVESTIGACIÓN INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE Taq DNA POLIMERASA RECOMBINANTE UTILIZANDO Escherichia coli QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERA BIOTECNÓLOGA PRESENTA: ALLISON PÉREZ VELÁZQUEZ México, D. F. 19 Mayo de 2008 Director: Dr. Claudio Garibay Orijel Evaluadoras: Dra. Ma. Carmen Oliver Salvador M. en C. Paola B. Zárate Segura DEDICATORIA A Dios por la fe y esperanza que me infunde. A mi mamá, papá, hermanos y abuelitos, ya que han sido mi apoyo y me han brindado su amor y, sobre todo, comprensión a lo largo de mi formación, tanto académica como la persona que ahora soy. A mis amigos entrañables Sonia, Merari, Alma, Ulises, Carlos, Gheorghe, Hugo, Cristian, Ricardo, Rodrigo, por siempre escuchar y tolerarme, por esos consejos y por hacerme pasar ratos inolvidables. CONTENIDO Resumen Marco teórico Antecedentes Justificación Objetivos Metodología Resultados y discusión Conclusiones Recomendaciones para trabajo futuro Agradecimientos Referencias 1 2 5 7 7 8 12 22 22 22 23 RESUMEN La enzima Taq DNA polimerasa es muy importante, ya que se utiliza en una de las herramientas más elementales para el desarrollo de la Biología Molecular como lo es la PCR. En este trabajo se describe la metodología que se llevó a cabo para producir y purificar dicha enzima; se transformó E. coli BL21 con CaCl2 para la inserción del plásmido de expresión. La producción de la enzima se realizó en caldo super-ampicilina, induciendo la expresión de los genes con IPTG. Las bacterias se lisaron y la enzima se recuperó, así se pudo visualizar en un gel de acrilamida SDS. Se establecieron las condiciones de almacenamiento, y una vez obtenida la enzima, se realizaron reacciones de PCR para medir la actividad cada mes. De la transformación surgieron diferentes cepas, se realizaron cinéticas y se empezó a trabajar con la que presentó mayor generación de biomasa en menor tiempo (ARC4). Para el experimento de producción de enzima, se creció la cepa en caldo super-ampicilina, se utilizaron dos matraces, uno con IPTG y el otro sin inductor. Se extrajo proteína, se corrió un gel de acrilamida y no se detectó la producción de enzima, puesto que se observaron las mismas bandas en las 2 muestras. Por esto, se decidió utilizar una cepa diferente (ARC2). Igual que con la cepa anterior, se realizó la producción de la enzima, siempre con un control negativo sin IPTG. Se extrajeron las proteínas y en un gel de acrilamida SDS se detectó una banda correspondiente a un peso molecular aproximado de 80 kDa en la muestra problema, no así en el control negativo. Posteriormente se realizaron más ensayos de inducción, comparando con controles de la cepa sin transformar y la cepa transformada, así se pudo comprobar que se estaba extrayendo una enzima no presente en la cepa silvestre. Después se realizaron las pruebas de PCR, las cuales arrojaron resultados positivos, puesto que se tuvo amplificado con la enzima Taq DNA Polimerasa extraída en el laboratorio. 1 MARCO TEÓRICO Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) La PCR es una tecnología que involucra la síntesis enzimática in vitro de millones de copias de un segmento específico de DNA. La reacción se basa en la hibridación y extensión de un par de oligonucleótidos, sintetizados artificialmente, utilizados como iniciadores o cebadores que delimitan una secuencia de DNA de doble cadena que se desea amplificar. Un ciclo de PCR comprende tres etapas: 1) desnaturalización de la doble cadena, 2) unión de una secuencia de DNA (iniciador) a la hebra simple y 3) replicación del DNA a partir del iniciador (Mullis, 1987). Figura 1. Pasos de un ciclo de PCR. Se lleva a cabo en un termociclador, un instrumento que automáticamente controla y alterna las temperaturas durante periodos programados de tiempo para el número apropiado de ciclos de PCR (generalmente entre 30 y 40 ciclos). Paso 1. Desnaturalización a 94-95 °C. A esta temperatura se separa la doble cadena de DNA en dos filamentos, esto se conoce como desnaturalización. Puesto que los enlaces de hidrógeno que unen las bases de uno a otro son débiles, se rompen a altas temperaturas, mientras que los enlaces entre fosfatos y desoxirribosa, que son enlaces covalentes más fuertes, permanecen intactos. 2 Paso 2. Alineación – unión de los iniciadores. El objetivo no es replicar la hebra entera de DNA sino replicar la secuencia de interés. Los iniciadores marcan el inicio y el final de la secuencia a amplificar, éstos son sintéticos y cortos, constan de una hebra única de DNA y normalmente presentan una longitud de 20-30 bases. La temperatura de alineación generalmente ocurre entre 40°C y 65°C, dependiendo de la longitud, de la secuencia de bases y de la especificidad de los iniciadores, que en las condiciones de reacción específicas disparan la síntesis. Paso 3. Extensión. Una vez que los iniciadores se han unido a las secuencias complementarias de DNA, la temperatura se eleva aproximadamente a 72°C y la enzima polimerasa replica las cadenas de DNA. Comienza el proceso de síntesis en la región marcada por el iniciador y sintetiza una nueva cadena de DNA, idéntica a la original. La extensión comienza siempre en el extremo 3' del iniciador creando una doble cadena a partir de cada una de las hebras individuales. La Taq DNA polimerasa sintetiza exclusivamente en la dirección 5’ a 3’. Este ciclo es repetido por algunas decenas de veces y, como el producto de cada polimerización sirve como molde para el siguiente, en teoría, cada ciclo duplica la cantidad del producto del anterior (figura 2). El resultado de la reacción es un fragmento de DNA de doble cadena, cuyos extremos corresponden a los extremos 5´ de los iniciadores y su tamaño a la distancia entre los mismos. Después de apenas 20 ciclos se logra más de un millón de veces la cantidad inicial de la secuencia de interés. Esta escala de amplificación permite, por lo tanto, iniciar el proceso con cantidades mínimas de DNA y terminar la reacción con grandes cantidades de una secuencia de interés. 3 Figura 2. Ciclos en una amplificación por PCR (Alberts et. al, 2003). Dos enzimas que son muy cotizadas son la Taq DNA polimerasa, proveniente de la bacteria termofílica Thermus aquaticus y la Vent DNA Polimerasa de la bacteria Thermococcus litoralis. Sus temperaturas óptimas de catálisis oscilan alrededor de los 72ºC y 75 °C, respectivamente, a estas temperaturas incorporan aproximadamente 100 nucleótidos por segundo; son muy estables a altas temperaturas, incluso por encima de 92ºC. La Taq DNA Polimerasa, procedente de Thermus aquaticus, es la más utilizada, es una enzima que consta de una sola cadena polipeptídica con un peso molecular de aproximadamente 65 - 95 kDa (figura 3), la variabilidad del peso molecular depende de la estructura formada durante la síntesis de la proteína. Su fidelidad de replicación depende de la concentración del ión Mg+2 y de los dNTPs, ya que a menor concentración de estos componentes se minimizan los errores. Comete un error cada 1,25x105 bases (Rodríguez-Sánchez y Barrera-Saldaña, 2004). Fragmento de DNA cromosomal PRIMER CICLO SEGUNDO CICLO TERCER CICLO DNA separado de la hebra y alineado con el cebadorSíntesis de DNA DNA separado de la hebra y alineado con el cebador Síntesis de DNA DNA separado de la hebra y alineado con el cebador Síntesis de DNA 4 Figura 3. Taq DNA polimerasa (people.cryst.bbk.ac.uk) La Vent DNA Polimerasa y la Pfu (Pyrococcus furiosus), aunque son de las mejores enzimas, ya que tienen actividad correctora de errores (cometen 12 veces menos errores que la Taq), son muy caras. La polimerasa Tth (Thermus thermophilus) no distingue entre moldes de DNA o de RNA, con lo que se utiliza como transcriptasa inversa para, por ejemplo, obtener el cDNA a partir de un mRNA. ANTECEDENTES En 1993 Kary Mullis ganó el premio Nobel de Química por la invención de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR). La PCR permite crear millones de copias de DNA in vitro a partir de una molécula de DNA (Rodríguez- Sánchez y Barrera-Saldaña, 2004). El impacto de la PCR fue enorme en el avance de la biotecnología así como en otras áreas que afectan la vida cotidiana, puesto que permitió el desarrollo de las pruebas para detectar el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), así como diagnósticos para enfermedades hereditarias, diagnósticos prenatales, estudios de evolución molecular, determinar el sexo en embriones humanos, para clonar genes, para mutagénesis in vitro y para mapeo y secuenciación de genomas, identificación de plantas y animales transgénicos, entre otras aplicaciones, 5 constituyéndose así en una herramienta poderosa para la Ingeniería genética (Gómez y Echenique, 2004). La premiación con el Nobel honró el trabajo de Mullis, investigador de la compañía Cetus Corporation de California, y permitió divulgar a nivel mundial su descubrimiento. Inmediatamente después Cetus Corporation vendió la patente a la compañía farmacéutica Hoffman-La Roche (a la división Roche Molecular Systems). Lo curioso es que este descubrimiento se gestó 25 años atrás en una investigación prácticamente desconocida. En 1976, Thomas Brock y Hudson Freeze, obtuvieron la enzima DNA Polimerasa a partir de la bacteria Thermus aquaticus, originaria de las aguas hirvientes de los géiseres del Parque Nacional Yellowstone en E.U.A. Esta bacteria tolera temperaturas hasta de 80 °C, esta propiedad permite desnaturalizar al DNA de interés para ser polimerizado sin destruir la enzima, y así se puede multiplicar rápidamente el número de copias de ese fragmento. Actualmente hay más ejemplos de microorganismos termorresistentes, como el Sulfolobus acidocaldarius, que además, soporta valores de pH de 1, o el Pyrococcus furiosus, que vive a 105 ºC, y el Pyrolobus fumarii, que crece a 113 ºC pero no a menos de los 90 ºC. Debido a lo anteriormente mencionado, la Taq Polimerasa, que es el elemento fundamental que sustenta la metodología de la PCR, ha cobrado gran importancia, por eso constantemente se crean metodologías para la obtención y purificación de esta enzima. Además de que con ayuda de técnicas de recombinación genética es posible obtener y clonar, a partir de Thermus aquaticus, el gen de esta enzima y expresarlo en otro organismo procarionte como E. coli. Tal es el caso de la Universidad Autónoma de Nuevo León, que a partir del 2002 produce y utiliza su propia Taq polimerasa (Tamez-Guerra et. al., 2002). También se ha observado que el costo de los reactivos para la obtención de la enzima en un laboratorio, es más barato comparado con una enzima comercial (Leelayuwat et. al., 1997). 6 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=PubMed&Cmd=Search&Term=%22Leelayuwat%20C%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlus http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=PubMed&Cmd=Search&Term=%22Leelayuwat%20C%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlus http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=PubMed&Cmd=Search&Term=%22Leelayuwat%20C%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlus JUSTIFICACIÓN • La Taq DNA Polimerasa es una enzima cara e importante para la realización de investigaciones genéticas y biotecnológicas. • México no cuenta con laboratorios que produzcan y purifiquen Taq DNA Polimerasa en grandes cantidades. • La UPIBI realiza una cantidad importante de investigaciones que utilizan esta enzima. • En muchas ocasiones las compañías distribuidoras llegan a tardar más de 2 meses para proveer dicho insumo. • Por lo anterior, el presente proyecto pretende satisfacer las necesidades de la enzima Taq DNA Polimerasa de la UPIBI. OBJETIVOS General - Producir y purificar Taq DNA Polimerasa recombinante utilizando E. coli. Específicos - Transformar E. coli con un plásmido de expresión que contenga el gen para la Taq DNA Polimerasa. - Producir Taq DNA Polimerasa a nivel laboratorio. - Estandarizar la técnica de obtención de Taq DNA Polimerasa. - Comprobar actividad enzimática. 7 METODOLOGÍA Obtención de cepa E. coli BL21 y plásmido pET con gen de Taq DNA Polimerasa. Fueron donados por el Dr. Agustín Badillo Corona. Universidad de Cambridge, UK. Transformación de E. coli BL21 con plásmido de expresión. A partir de un cultivo en placa LB de la cepa a transformar, se inoculó con dos colonias 50 mL de caldo LB y se incubó a 37 ºC en agitación hasta una densidad óptica a 590 nm (DO590) aproximada de 0.375. A continuación se centrifugaron las células a 6000 rpm durante 4 minutos, el sobrenadante se eliminó y las células se resuspendieron en 5 mL de CaCl2 0.1 M frío (4 ºC). Posteriormente se realizó una nueva centrifugación a 6000 rpm durante 4 minutos a 4 ºC, se eliminó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 1 mL de CaCl2 (0.1 M). Las células competentes obtenidas por este proceso, se mantuvieron en hielo un mínimo de 30 minutos antes de su transformación. Para proceder a la transformación, se mezclaron 200 μL de células con 10-20 ng (1-2 μL) del plásmido a introducir y se mantuvo la mezcla en hielo durante 10 minutos. Transcurrido ese tiempo, se sometieron las células a un choque térmico a 42 ºC durante 1 minuto y a continuación se colocaron nuevamente en hielo durante 2 minutos. Se añadieron 800 μL de medio LB y se incubaron durante 1 hora a 37 ºC, 250 rpm, para permitir la expresión de los genes. Por último, se sembraron las células en placas de agar LB-ampicilina y se incubaron durante 16 horas a 37 ºC. La concentración de ampicilina en el medio fue de 100 µg/mL. Extracción de DNA plasmídico. Se inocularon 50 mL de medio LB-Amp con una colonia de la bacteria transformada. El cultivo se incubó a 37 °C a 180 rpm durante toda la noche. El cultivo se transfirió a un tubo de 15 mL y se recuperaron las bacterias por centrifugación a 4000 rpm durante 10 min a 4 °C. Se secó el pellet y se resuspendió con 200 μL de solución de lisis I (Glucosa 50 mM, Tris-Cl 25 mM, EDTA 10 mM), se agitó en vortex constantemente y se transfirió a un tubo de 1.5 mL. Se agregaron 400 μL de la solución de lisis II (NaOH 0.2 N, SDS 8 1%) a cada suspensión. Se mezcló el contenido del tubo rápidamente invirtiendo el tubo 5 veces. Se agregaron 300 μL de solución de lisis III (acetato de potasio 5 M, ácido acético 3 M) y se mezcló invirtiendo el tubo varias veces. Se incubó a 4 °C durante 5 min. El lisado se centrifugó a máxima velocidad por 5 min. a 4 °C. Se transfirieron 600 μL del sobrenadante a un nuevo tubo. Se agregó un volumen de fenol-cloroformo. Se agitó con vortex y se centrifugó a máxima velocidad por 2 min. a 4 °C. La fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo. Los ácidos nucléicos se precipitaron por la adición de 600 μL de isopropanol, la solución se agitó en un vortex y se dejó a temperatura ambiente durante 2 min. Se centrifugóa máxima velocidad por 5 min. a temperatura ambiente. El sobrenadante se removió y se dejó secar el pellet. Se agregó 1 mL de etanol al 70 % y el DNA se recuperó por centrifugación a máxima velocidad a temperatura ambiente. Se retiró el sobrenadante y se dejó secar el pellet. Se le agregaron 100 μL de TE (pH 8.0) que contiene 20 μg/mL de RNAsa libre de DNAsa. Se agitó en vortex y se almacenó a - 20 °C. Diseño de iniciadores. Se diseñaron 4 pares de iniciadores que se alinean en diferentes regiones del gen de la Taq DNA Polimerasa, éstos se diseñaron en el programa MacVector® (Cía. MacVector Incorporated, versión 9.5.2, 2007), las secuencias se muestran en la tabla 1. Tabla 1. Iniciadores seleccionados para gen Taq DNA Polimerasa. NOMBRE FRAGMENTO SECUENCIAS INICIADORES TAMAÑO DEL FRAGMENTO (pb) F1 GCTTCCTCGCCGTCTTCTCC GATGCTGCCCCTCTTTGAGC 600 F2 GAACTCGTGGAGGAGGCTGC GCGGAAAAGGAGGGCTACG 450 F3 CCTCCCGCACGCTCTTCAC GCAGCCTCCTCCACGAGTTC 1400 F4 CCTCCGCCCTCTCTTTTGG CAGCCTCCTCCACGAGTTCG 1500 9 Producción de la Taq DNA Polimerasa en caldo super-ampicilina. Se inoculó caldo super-ampicilina con 5 mL de cultivo previamente crecido de E. coli recombinante. Se dejó crecer hasta alcanzar una densidad óptica (a 600 nm) de 0.3 a 0.6. La expresión del plásmido se indujo con IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranosido) por no más de 16 hrs. La concentración de IPTG en el caldo fue de 0.5mM. Purificación de Taq DNA Polimerasa. Se centrifugó el medio de cultivo durante 10 min a 4000 rpm y posteriormente se resuspendieron las células en 5 mL de Solución A (Tris-Cl 50 mM pH 7.9, EDTA 1mM pH 7.9 y Glucosa 50 mM) y se le añadió lisozima, la cual debía quedar a una concentración final de 4 mg/mL. Se dejó reposar 15 min a temperatura ambiente. Después se adicionó 5 mL de Solución B (Tris-Cl 10 mM pH 7.9, EDTA 1mM pH 7.9, KCl 50 mM, Igepal 0.5%, Tween 20 0.5%) y se incubó por 1 hora a 75 °C agitando cada 5 min. A continuación se centrifugó a 18000 rpm durante 60 min a 4 °C. La extracción de la Taq DNA Polimerasa se determinó por electroforesis en gel de acrilamida- bisacrilamida SDS. Preparación de gel de acrilamida-bisacrilamida SDS (SDS-PAGE). Primero se prepara el gel separador (tabla 2). Tabla 2. Preparación del gel separador a diferentes concentraciones. Componente 20 % 15 % 12 % 10 % 7.5 % 5 % Agua desionizada (L) 367 1167 1683 2000 2367 2783 Tris 2M pH 8.8 (L) 1250 1250 1250 1250 1250 1250 SDS (L) 50 50 50 50 50 50 Arcrilamida/bisacrilamida (L) 3333 2500 2000 1667 1250 833 Se prepara el molde para el gel. Se hace una marca a 1 - 1,5 cm debajo del nivel del peine de muestras. Se etira el peine. Se inicia la polimerización agregando 4 μL de 10 TEMED y 40 μL de persulfato de amonio a la mezcla. Se mezcla e inmediatamente se vierte la solución en los vidrios (molde), hasta la marca hecha anteriormente, sin atrapar burbujas. Mientras solidifica se mezclan los componentes del gel concentrador (tabla 3). Tabla 3. Preparación del gel concentrador. Componente 20 % Agua desionizada (L) 1800 Tris 2M pH 6.8 (L) 756 SDS (L) 39.6 Arcrilamida/bisacrilamida (L) 396 TEMED (L) 4 PSA (L) 18 Una vez agregados los catalizadores se mezclan y se vierten inmediatamente en el molde, nivelando ahora el peine a su posición horizontal, sin atrapar burbujas. Se deja polimerizar. Se quita el peine deslizándolo suavemente, se lavan los pozos llenándolos con agua y aspirando luego con una jeringa. Esto elimina residuos de componentes no polimerizados. Medición de la actividad de la Taq purificada. Se amplificó un segmento de DNA utilizando la Taq DNA Polimerasa ya purificada, variando el número de ciclos y los segmentos de DNA, que provenían de diferentes especies. Para comprobar si las condiciones de almacenamiento fueron las óptimas, se midió la actividad cada mes. 11 RESULTADOS Y DISCUSIÓN Se transformó E. coli BL21 con el plásmido pET que contiene el gen de Taq y se obtuvieron diferentes cepas, denominadas ARC. Se comenzó a trabajar con la cepa ARC4, ya que presentó mayor generación de biomasa en menor tiempo. Posteriormente se realizó una fermentación para producir Taq DNA Polimerasa en matraz, a la cual se le añadió IPTG como inductor. Se utilizó un control negativo, el cual fue la misma cepa en las mismas condiciones de cultivo, excepto IPTG. A continuación, se realizó un experimento de extracción de proteínas y se realizó una electroforesis en gel de acrilamida-bisacrilamida SDS para visualizarlas (figura 4). Figura 4. Gel acrilamida-bisacrilamida SDS al 10%, 90 volts, 60 min. MPM, marcador de peso molecular SDS7B2 (26.6-180 kDa); CN1, control negativo, 6 μL de muestra; Taq1, muestra que contiene a Taq DNA Polimerasa, 6 μL de muestra; CN2, 8 μL de muestra; Taq2, 8 μL de muestra. CN1 Taq1 CN2 Taq2 MPM 180 kDa 90 36.5 12 Se puede observar que las proteínas extraídas tanto de la muestra como del control negativo (CN) presentan el mismo perfil, por lo que es probable que la producción de la proteína recombinante fuera del mismo orden. Este resultado se repitió en múltiples experimentos, por lo que se decidió comprobar la presencia del gen en el plásmido. Para este fin se diseñaron 4 pares de iniciadores, utilizando el programa MacVector® y se extrajo plásmido. Posteriormente, con el plásmido extraído y los iniciadores diseñados, se realizó una PCR (30 ciclos, T alineación 56 °C) y las muestras se corrieron en un gel de agarosa al 1% (figura 5). Figura 5. Gel de agarosa 1%, SybrGreen Invitrogen, 100 volts, 40 min. MPM, marcador de peso molecular 100 pb; F1, 600 pb; F2, 450 pb; F4, 1500 pb; F1’, F2’ y F4’ son las muestras diluidas. Con estos resultados se sugiere que el gen de la Taq DNA Polimerasa estaba presente en el plásmido pero no se expresaba. MPM F1 F2 F4 F1’ F2’ F4’ 600 450 600 450 1500 1500 100 600 1500 2072 pb 13 La expresión de proteínas se puede ver inhibida por la concentración de IPTG en el medio, por ello se realizaron diversos ensayos de inducción a diferentes concentraciones de IPTG, a 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1 mM, comparando con un control negativo (CN, sin IPTG). Se extrajeron las proteínas y se corrieron electroforéticamente en un gel SDS-PAGE (figura 6). Figura 6. Gel acrilamida-bisacrilamida SDS al 7.5%, 90 volts, 60 min. MPM, marcador de peso molecular SDS7B2 (26.6-180 kDa); concentraciones finales en el medio de cultivo, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1 mM; CN, control negativo, sin IPTG. Como se observa en la figura 6, las proteínas extraídas de las muestras a las que se les agregó inductor y del CN son las mismas, por lo tanto el gen sigue sin expresarse. Esto se puede deber a que el IPTG no sirve, por ello, se realizó un ensayo de inducción con una marca distinta de IPTG. La concentración en el medio de cultivo fue de 0.5 mM. Se extrajo proteína y se corrió electroforéticamente en un gel SDS-PAGE (figura 7). 180 kDa 90 36.5 MPM 0.2 0.4 0.6 0. 8 1 CN MPM 14 Figura 7. Gel acrilamida-bisacrilamida SDS al 7.5%, 90 volts, 60 min. MPM, marcador de peso molecular SDS7B2 (26.6-180 kDa); Taq, muestra con IPTG; CN, control negativo, sin IPTG. En la figura 7 se puede observar el mismo perfil tanto para las proteínas que se extrajeron de la muestra inducida como de las del CN, así se sugirió que el IPTG no era la causa por la cual el gen no se estaba expresando, y por esta razón se decidió cambiar de cepa. Se comenzó a trabajar con la cepa ARC2. Igualmenteque en los experimentos anteriores, una muestra se indujo con IPTG y la otra fue el CN, se extrajo proteína y se corrió electroforéticamente un gel SDS-PAGE (figura 8). 180 kDa 90 36.5 MPM Taq CN Taq CN 15 Figura 8. Gel acrilamida-bisacrilamida SDS al 7.5%, 90 volts, 60 min. MPM, marcador de peso molecular SDS7B2 (26.6-180 kDa); Taq, muestra con IPTG; CN, control negativo, sin IPTG. En el gel se observa la banda de aproximadamente 80 kDa, que pertenece a la Taq DNA Polimerasa, esto quiere decir que se hubo expresado el gen y que probablemente la cepa anterior sufrió una mutación que le impidió la correcta expresión de los genes. Posteriormente se realizó otro ensayo de inducción para la producción de Taq DNA Polimerasa y se realizaron los siguientes controles (figura 9): 1) Cepa sin transformar (BL21) s/IPTG, s/Amp. 2) BL21 c/IPTG, s/Amp. 3) BL21 s/IPTG, c/Amp. 4) BL21 c/IPTG, c/Amp. 5) Cepa transformada (ARC2) s/IPTG, c/Amp. 6) ARC2 c/IPTG, c/Amp. Todo se realizó bajo las mismas condiciones. 180 kDa 90 36.5 MPM Taq CN 16 Figura 9. Controles para la producción de Taq DNA Polimerasa. Se puede observar que en el control 3 y 4 no hubo crecimiento, esto se esperaba, puesto la cepa sin transformar se puso en presencia de ampicilina, así nos muestra que la cepa no contiene plásmido que le confiera resistencia al antibiótico. En los demás matraces se esperaba crecimiento, así que de estos se extrajo proteína y se corrió electroforéticamente un gel SDS-PAGE (figura 10). 17 Figura 10. Gel acrilamida-bisacrilamida SDS al 7.5%, 90 volts, 60 min. MPM, marcador de peso molecular SDS7B2 (26.6-180 kDa); 1, BL21 s/IPTG, s/Amp; 2, BL21 c/IPTG, s/Amp; 5, ARC2 s/IPTG, c/Amp; 6, ARC2 c/IPTG, c/Amp. Así, con los controles de la cepa sin transformar (BL21), con y sin IPTG y sin ampicilina (figura 10, carriles 1 y 2) se comprueba que el IPTG no tiene efecto sobre la producción de las proteínas sintetizadas por la cepa BL21. En los controles de la cepa sin transformar, con y sin IPTG y con ampicilina, como ya se mencionó, no se esperaba crecimiento, puesto que no cuentan con un plásmido que les confiera resistencia al antibiótico. En la muestra del control de la cepa transformada sin IPTG y con ampicilina (figura 10, carril 5) no se observa alguna banda que corresponda a la Taq Polimerasa, en cambio en la muestra de ARC2 con IPTG y con ampicilina (figura 10, carril 6) se puede observar una banda que corresponde a la Taq DNA Polimerasa, ya que tiene un peso aproximado de 80 kDa. Con esto se asegura que la enzima recombinante es únicamente producida por la cepa transformada y en presencia de IPTG, además de corroborar que en la cepa sin transformar no existe ningún plásmido. 180 kDa 90 36.5 MPM 1 2 5 6 MPM 18 Posteriormente se realizó PCR con la enzima producida en el laboratorio y se corrió un gel de agarosa (figura 11). Figura 11. Gel de agarosa 1%, SybrGreen Invitrogen, 100 volts, 40 min. 1, MPM 100 pb; 2, dilución 1:10; 3, dilución 1:100; 4, dilución 1:1000; 5, dilución 1:10000; 6, dilución 1:100000; 7, directa del extracto; 8, s/DNA; 9, s/nucleótidos; 10, s/DNA y s/nucleótidos; 11, s/iniciadores; 12, control positivo Taq comercial; 13, control negativo Taq comercial; 14, MPM 100 pb. En el gel que se muestra en la figura 11; se hicieron diluciones del extracto, con esto se realizó la PCR y no se muestra amplificado (carriles 2 al 6). En cambio con la muestra directamente del extracto se observa amplificado (carril 7). Se metieron controles sin DNA, sin nucleótidos y sin iniciadores. El control sin DNA muestra amplificado, esto sugiere que el extracto tiene contaminación de DNA, aunque el control negativo con la Taq comercial muestra también un amplificado, así que algún reactivo se ha contaminado por el mal manejo. 2072 pb 1500 600 100 19 Posteriormente se realizó otro experimento, en el cual se quería comprobar si había pérdida de la enzima durante la extracción, así que de cada paso de la extracción se tomó una muestra y se realizó PCR. También para corroborar si había o no contaminación de DNA (figura 12). Figura 12. Gel de agarosa 1%, SybrGreen Invitrogen, 100 volts, 40 min. 1, MPM 100 pb; 2-7, primer paso de la extracción; 8-13, soluciones de lisis; 14-16, penúltimo paso de la extracción; 17-19, penúltimo paso s/DNA; 20-22, extracto; 23-25, extracto s/DNA; 26, vacío; C+, con Taq comercial; C-, con Taq comercial s/DNA; C+, Taq extracto de un mes anterior; C-, Taq extracto de un mes anterior s/DNA. De la figura 12; en los carriles 2 al 7, que pertenecen al sobrenadante de la primera centrifugación, se observa que no hay pérdida de la enzima y se confirma que no es extracelular, ya que no hay ningún amplificado. Los carriles 8 al 13 pertenecen a la muestra tomada durante el segundo paso de la extracción, cuando las células se resuspenden con las soluciones de lisis A y B, se observa que tampoco existe pérdida de la enzima durante ese paso, puesto que no se observa ningún amplificado. Los carriles 14 al 16 pertenecen al penúltimo paso de la extracción, después de haber calentado las muestras, y se observa un amplificado. Puesto que el último paso es una centrifugación, para eliminar del extracto las moléculas más grandes, se puede decir que en el anterior paso no se pierde la enzima. Los carriles 17 al 19 son de la muestra del penúltimo paso pero sin DNA, con esto se comprueba que no hay contaminación 2072 pb 1500 600 100 20 con DNA. Del 20 al 22 son del extracto final, y del 23 al 25 también son del extracto final pero sin DNA, aunque se observan pequeñas bandas no se puede decir que hay contaminación en el extracto, puesto que en los controles también se observa amplificado. Los primeros controles se realizaron con Taq comercial; el control positivo (C+) con DNA y el negativo (C-) sin DNA, en el negativo se observa un amplificado, lo que muestra que algún reactivo está contaminado con DNA. Los segundos controles se realizaron con Taq producida un mes anterior, el control negativo (C-) muestra un amplificado, lo que comprueba que se ha contaminado con DNA. Así también se comprueba la actividad, puesto que después de estar un mes en congelación sigue amplificando. 21 CONCLUSIONES Se logró la producción de Taq DNA Polimerasa a nivel laboratorio. Los resultados de la PCR muestran que no se tienen pérdidas de la enzima durante la extracción. La enzima presenta buena actividad después de estar un mes en congelación (- 28 °C), ya que se muestra amplificado. RECOMENDACIONES PARA TRABAJO FUTURO Comprobar si existe contaminación de DNA en el extracto, mediante reacciones de PCR, con reactivos nos contaminados. Establecer las condiciones óptimas de producción a nivel piloto. AGRADECIMIENTOS A Rodrigo Corona Guzmán, M. en C. Paola Zárate Segura, Biol. Verónica Pacheco, Raúl Iván López Gómez, Erick Miguel Ramos Martínez, José Alberto Kakauma González y a todos aquellos que hicieron posible la realización de este trabajo. 22 REFERENCIAS 1. Alberts, B.; Johnson A.; Lewis, J.; Raff, M.; Roberts, K.; Walter, P. 2003. Molecular Biology of the cell. 4a Edición. Garland Science. E.U.A. 588-601. 2. Dorado, G. Amplificación de DNA mediante PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa). España, 2006. 3. Gómez, M.; Echenique, V. 2004. Biotecnología y MejoramientoVegetal. Primera edición. Ediciones INTA. Argentina. 4. Gómez, J.; Bermúdez, L.; Tamez, R.; Adame, J. 2002. Producción y purificación de la Taq DNA polimerasa a partir de E. coli recombinante. Ciencia UANL. Vol. V (Número 3). 316-321. 5. Leelayuwat, C.; Srisuk, T.; Paechaiyaphum, R.; Limpaiboon, T.; Romphruk, A. 1997. Production and evaluation of Taq DNA polymerase. Jornal of the Medical Association of Thailand. Vol. 80 (Suppl). 129-136. 6. Mullis, Kary B. Process for amplifying nucleic acid sequences. Patent number: 4683202. Filing date: Oct 25, 1985. Issue date: Jul 28, 1987. Assignee: Cetus Corporation. 7. Novagen. 1999. pET System Manual. Novagen. Estados Unidos y Canadá. 8. Rodríguez, I.; Barrera, H. 2004. La reacción de la cadena de polimerasa a dos décadas de su invención. Ciencia UANL. Vol. VII (Número 003). 323-335. 9. Sambrook, J.; Russell, D. 2001. Molecular cloning, a laboratory manual. 3ra. Edición. Vol. 2. CSHL PRESS. 15-22. 10. www.biblioweb.sindominio.net 11. www.golemp.blogspot.com/2006/09/ 12. www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez 13. www.rochediagnostics.es/productos_servicios/02020601 14. www.scielo.org.ar/pdf/medba/v65n5/v65n5a14 15. www.wipo.int/pctdb/en 23 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=PubMed&Cmd=Search&Term=%22Leelayuwat%20C%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlus http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=PubMed&Cmd=Search&Term=%22Srisuk%20T%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlus http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=PubMed&Cmd=Search&Term=%22Paechaiyaphum%20R%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlus http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=PubMed&Cmd=Search&Term=%22Limpaiboon%20T%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlus http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=PubMed&Cmd=Search&Term=%22Romphruk%20A%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlus http://www.blogs.20minutos.es/retiario/post http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez http://www.rochediagnostics.es/productos_servicios/02020601 http://www.scielo.org.ar/pdf/medba/v65n5/v65n5a14 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Pasos de un ciclo de PCR Figura 2. Ciclos en una amplificación por PCR (Alberts et. al, 2003). Figura 3. Taq DNA polimerasa (people.cryst.bbk.ac.uk). Figura 4. Gel acrilamida-bisacrilamida SDS al 10%, 90 volts, 60 min. MPM, marcador de peso molecular SDS7B2 (26.6-180 kDa); CN1, control negativo, 6 μL de muestra; Taq1, muestra que contiene a Taq DNA Polimerasa, 6 μL de muestra; CN2, 8 μL de muestra; Taq2, 8 μL de muestra. Figura 5. Gel de agarosa 1%, SybrGreen Invitrogen, 100 volts, 40 min. MPM, marcador de peso molecular 100 pb; F1, 600 pb; F2, 450 pb; F4, 1500 pb; F1’, F2’ y F4’ son las muestras diluidas. Figura 6. Gel acrilamida-bisacrilamida SDS al 7.5%, 90 volts, 60 min. MPM, marcador de peso molecular SDS7B2 (26.6-180 kDa); concentraciones finales en el medio de cultivo, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1 mM; CN, control negativo, sin IPTG. Figura 7. Gel acrilamida-bisacrilamida SDS al 7.5%, 90 volts, 60 min. MPM, marcador de peso molecular SDS7B2 (26.6-180 kDa); Taq, muestra con IPTG; CN, control negativo, sin IPTG. Figura 8. Gel acrilamida-bisacrilamida SDS al 7.5%, 90 volts, 60 min. MPM, marcador de peso molecular SDS7B2 (26.6-180 kDa); Taq, muestra con IPTG; CN, control negativo, sin IPTG. Figura 9. Controles para la producción de Taq DNA Polimerasa. Figura 10. Gel acrilamida-bisacrilamida SDS al 7.5%, 90 volts, 60 min. MPM, marcador de peso molecular SDS7B2 (26.6-180 kDa); 1, BL21 s/IPTG, s/Amp; 2, BL21 c/IPTG, s/Amp; 5, ARC2 s/IPTG, c/Amp; 6, ARC2 c/IPTG, c/Amp. Figura 11. Gel de agarosa 1%, SybrGreen Invitrogen, 100 volts, 40 2 4 5 12 13 14 15 16 17 18 19 min. 1, MPM 100 pb; 2, dilución 1:10; 3, dilución 1:100; 4, dilución 1:1000; 5, dilución 1:10000; 6, dilución 1:100000; 7, directa del extracto; 8, s/DNA; 9, s/nucleótidos; 10, s/DNA y s/nucleótidos; 11, s/iniciadores; 12, control positivo Taq comercial; 13, control negativo Taq comercial; 14, MPM 100 pb. Figura 12. Gel de agarosa 1%, SybrGreen Invitrogen, 100 volts, 40 min. 1, MPM 100 pb; 2-7, primer paso de la extracción; 8-13, soluciones de lisis; 14-16, penúltimo paso de la extracción; 17-19, penúltimo paso s/DNA; 20-22, extracto; 23-25, extracto s/DNA; 26, vacío; C+, con Taq comercial; C-, con Taq comercial s/DNA; C+, Taq extracto de un mes anterior; C-, Taq extracto de un mes anterior s/DNA. 20 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Iniciadores seleccionados para gen Taq DNA Polimerasa. Tabla 2. Preparación del gel separador a diferentes concentraciones. Tabla 3. Preparación del gel concentrador. 9 10 11
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