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Proyecto Terminal III 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
GRUPO 8BV1 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE: 
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN 
 
 
 
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA 
 
PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DE Taq DNA POLIMERASA 
RECOMBINANTE UTILIZANDO 
Escherichia coli 
 
 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
INGENIERA BIOTECNÓLOGA 
PRESENTA: 
ALLISON PÉREZ VELÁZQUEZ 
México, D. F. 19 Mayo de 2008 
Director: 
Dr. Claudio Garibay Orijel 
Evaluadoras: 
 Dra. Ma. Carmen Oliver Salvador 
 M. en C. Paola B. Zárate Segura 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
DEDICATORIA 
 
 
A Dios por la fe y esperanza que me infunde. 
 
 
 
 
A mi mamá, papá, hermanos y abuelitos, ya que han sido mi apoyo y me han 
brindado su amor y, sobre todo, comprensión a lo largo de mi formación, tanto 
académica como la persona que ahora soy. 
 
 
 
 
A mis amigos entrañables Sonia, Merari, Alma, Ulises, Carlos, Gheorghe, Hugo, 
Cristian, Ricardo, Rodrigo, por siempre escuchar y tolerarme, por esos consejos 
y por hacerme pasar ratos inolvidables. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CONTENIDO 
 
 
 
Resumen 
 
Marco teórico 
 
Antecedentes 
 
Justificación 
 
Objetivos 
 
Metodología 
 
Resultados y discusión 
 
Conclusiones 
 
Recomendaciones para trabajo futuro 
 
Agradecimientos 
 
Referencias 
1 
 
2 
 
5 
 
7 
 
7 
 
8 
 
12 
 
22 
 
22 
 
22 
 
23 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMEN 
 
La enzima Taq DNA polimerasa es muy importante, ya que se utiliza en una de las 
herramientas más elementales para el desarrollo de la Biología Molecular como lo es la 
PCR. En este trabajo se describe la metodología que se llevó a cabo para producir y 
purificar dicha enzima; se transformó E. coli BL21 con CaCl2 para la inserción del 
plásmido de expresión. La producción de la enzima se realizó en caldo super-ampicilina, 
induciendo la expresión de los genes con IPTG. Las bacterias se lisaron y la enzima se 
recuperó, así se pudo visualizar en un gel de acrilamida SDS. Se establecieron las 
condiciones de almacenamiento, y una vez obtenida la enzima, se realizaron reacciones 
de PCR para medir la actividad cada mes. De la transformación surgieron diferentes 
cepas, se realizaron cinéticas y se empezó a trabajar con la que presentó mayor 
generación de biomasa en menor tiempo (ARC4). Para el experimento de producción de 
enzima, se creció la cepa en caldo super-ampicilina, se utilizaron dos matraces, uno con 
IPTG y el otro sin inductor. Se extrajo proteína, se corrió un gel de acrilamida y no se 
detectó la producción de enzima, puesto que se observaron las mismas bandas en las 2 
muestras. Por esto, se decidió utilizar una cepa diferente (ARC2). Igual que con la cepa 
anterior, se realizó la producción de la enzima, siempre con un control negativo sin 
IPTG. Se extrajeron las proteínas y en un gel de acrilamida SDS se detectó una banda 
correspondiente a un peso molecular aproximado de 80 kDa en la muestra problema, no 
así en el control negativo. Posteriormente se realizaron más ensayos de inducción, 
comparando con controles de la cepa sin transformar y la cepa transformada, así se 
pudo comprobar que se estaba extrayendo una enzima no presente en la cepa silvestre. 
Después se realizaron las pruebas de PCR, las cuales arrojaron resultados positivos, 
puesto que se tuvo amplificado con la enzima Taq DNA Polimerasa extraída en el 
laboratorio. 
 
 
 
 
 
 
1 
 
MARCO TEÓRICO 
 
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 
 
La PCR es una tecnología que involucra la síntesis enzimática in vitro de millones de 
copias de un segmento específico de DNA. La reacción se basa en la hibridación y 
extensión de un par de oligonucleótidos, sintetizados artificialmente, utilizados como 
iniciadores o cebadores que delimitan una secuencia de DNA de doble cadena que se 
desea amplificar. Un ciclo de PCR comprende tres etapas: 1) desnaturalización de la 
doble cadena, 2) unión de una secuencia de DNA (iniciador) a la hebra simple y 3) 
replicación del DNA a partir del iniciador (Mullis, 1987). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Pasos de un ciclo de PCR. 
 
Se lleva a cabo en un termociclador, un instrumento que automáticamente controla y 
alterna las temperaturas durante periodos programados de tiempo para el número 
apropiado de ciclos de PCR (generalmente entre 30 y 40 ciclos). 
 
Paso 1. Desnaturalización a 94-95 °C. 
A esta temperatura se separa la doble cadena de DNA en dos filamentos, esto se 
conoce como desnaturalización. Puesto que los enlaces de hidrógeno que unen las 
bases de uno a otro son débiles, se rompen a altas temperaturas, mientras que los 
enlaces entre fosfatos y desoxirribosa, que son enlaces covalentes más fuertes, 
permanecen intactos. 
 
2 
 
Paso 2. Alineación – unión de los iniciadores. 
El objetivo no es replicar la hebra entera de DNA sino replicar la secuencia de interés. 
Los iniciadores marcan el inicio y el final de la secuencia a amplificar, éstos son 
sintéticos y cortos, constan de una hebra única de DNA y normalmente presentan una 
longitud de 20-30 bases. La temperatura de alineación generalmente ocurre entre 40°C 
y 65°C, dependiendo de la longitud, de la secuencia de bases y de la especificidad de 
los iniciadores, que en las condiciones de reacción específicas disparan la síntesis. 
 
Paso 3. Extensión. 
Una vez que los iniciadores se han unido a las secuencias complementarias de DNA, la 
temperatura se eleva aproximadamente a 72°C y la enzima polimerasa replica las 
cadenas de DNA. Comienza el proceso de síntesis en la región marcada por el iniciador 
y sintetiza una nueva cadena de DNA, idéntica a la original. La extensión comienza 
siempre en el extremo 3' del iniciador creando una doble cadena a partir de cada una de 
las hebras individuales. La Taq DNA polimerasa sintetiza exclusivamente en la dirección 
5’ a 3’. 
 
Este ciclo es repetido por algunas decenas de veces y, como el producto de cada 
polimerización sirve como molde para el siguiente, en teoría, cada ciclo duplica la 
cantidad del producto del anterior (figura 2). El resultado de la reacción es un fragmento 
de DNA de doble cadena, cuyos extremos corresponden a los extremos 5´ de los 
iniciadores y su tamaño a la distancia entre los mismos. Después de apenas 20 ciclos 
se logra más de un millón de veces la cantidad inicial de la secuencia de interés. Esta 
escala de amplificación permite, por lo tanto, iniciar el proceso con cantidades mínimas 
de DNA y terminar la reacción con grandes cantidades de una secuencia de interés. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
 
Figura 2. Ciclos en una amplificación por PCR (Alberts et. al, 2003). 
 
Dos enzimas que son muy cotizadas son la Taq DNA polimerasa, proveniente de la 
bacteria termofílica Thermus aquaticus y la Vent DNA Polimerasa de la bacteria 
Thermococcus litoralis. Sus temperaturas óptimas de catálisis oscilan alrededor de los 
72ºC y 75 °C, respectivamente, a estas temperaturas incorporan aproximadamente 100 
nucleótidos por segundo; son muy estables a altas temperaturas, incluso por encima de 
92ºC. La Taq DNA Polimerasa, procedente de Thermus aquaticus, es la más utilizada, 
es una enzima que consta de una sola cadena polipeptídica con un peso molecular de 
aproximadamente 65 - 95 kDa (figura 3), la variabilidad del peso molecular depende de 
la estructura formada durante la síntesis de la proteína. Su fidelidad de replicación 
depende de la concentración del ión Mg+2 y de los dNTPs, ya que a menor 
concentración de estos componentes se minimizan los errores. Comete un error cada 
1,25x105 bases (Rodríguez-Sánchez y Barrera-Saldaña, 2004). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fragmento 
de DNA 
cromosomal 
PRIMER CICLO SEGUNDO CICLO TERCER CICLO 
DNA separado de la 
hebra y alineado con 
el cebadorSíntesis 
de DNA 
DNA separado de la 
hebra y alineado con 
el cebador 
 
Síntesis 
de DNA 
 
DNA separado de la 
hebra y alineado con 
el cebador 
 
Síntesis 
de DNA 
 
4 
 
 
Figura 3. Taq DNA polimerasa (people.cryst.bbk.ac.uk) 
 
La Vent DNA Polimerasa y la Pfu (Pyrococcus furiosus), aunque son de las mejores 
enzimas, ya que tienen actividad correctora de errores (cometen 12 veces menos 
errores que la Taq), son muy caras. La polimerasa Tth (Thermus thermophilus) no 
distingue entre moldes de DNA o de RNA, con lo que se utiliza como transcriptasa 
inversa para, por ejemplo, obtener el cDNA a partir de un mRNA. 
 
 
ANTECEDENTES 
 
En 1993 Kary Mullis ganó el premio Nobel de Química por la invención de la Reacción 
en Cadena de la Polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR). La PCR permite crear 
millones de copias de DNA in vitro a partir de una molécula de DNA (Rodríguez-
Sánchez y Barrera-Saldaña, 2004). El impacto de la PCR fue enorme en el avance de la 
biotecnología así como en otras áreas que afectan la vida cotidiana, puesto que permitió 
el desarrollo de las pruebas para detectar el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida 
(SIDA), así como diagnósticos para enfermedades hereditarias, diagnósticos prenatales, 
estudios de evolución molecular, determinar el sexo en embriones humanos, para 
clonar genes, para mutagénesis in vitro y para mapeo y secuenciación de genomas, 
identificación de plantas y animales transgénicos, entre otras aplicaciones, 
5 
 
constituyéndose así en una herramienta poderosa para la Ingeniería genética (Gómez y 
Echenique, 2004). 
La premiación con el Nobel honró el trabajo de Mullis, investigador de la compañía 
Cetus Corporation de California, y permitió divulgar a nivel mundial su descubrimiento. 
Inmediatamente después Cetus Corporation vendió la patente a la compañía 
farmacéutica Hoffman-La Roche (a la división Roche Molecular Systems). 
 
Lo curioso es que este descubrimiento se gestó 25 años atrás en una investigación 
prácticamente desconocida. En 1976, Thomas Brock y Hudson Freeze, obtuvieron la 
enzima DNA Polimerasa a partir de la bacteria Thermus aquaticus, originaria de las 
aguas hirvientes de los géiseres del Parque Nacional Yellowstone en E.U.A. Esta 
bacteria tolera temperaturas hasta de 80 °C, esta propiedad permite desnaturalizar al 
DNA de interés para ser polimerizado sin destruir la enzima, y así se puede multiplicar 
rápidamente el número de copias de ese fragmento. Actualmente hay más ejemplos de 
microorganismos termorresistentes, como el Sulfolobus acidocaldarius, que además, 
soporta valores de pH de 1, o el Pyrococcus furiosus, que vive a 105 ºC, y el Pyrolobus 
fumarii, que crece a 113 ºC pero no a menos de los 90 ºC. 
 
Debido a lo anteriormente mencionado, la Taq Polimerasa, que es el elemento 
fundamental que sustenta la metodología de la PCR, ha cobrado gran importancia, por 
eso constantemente se crean metodologías para la obtención y purificación de esta 
enzima. Además de que con ayuda de técnicas de recombinación genética es posible 
obtener y clonar, a partir de Thermus aquaticus, el gen de esta enzima y expresarlo en 
otro organismo procarionte como E. coli. 
 
Tal es el caso de la Universidad Autónoma de Nuevo León, que a partir del 2002 
produce y utiliza su propia Taq polimerasa (Tamez-Guerra et. al., 2002). 
 
También se ha observado que el costo de los reactivos para la obtención de la enzima 
en un laboratorio, es más barato comparado con una enzima comercial (Leelayuwat et. 
al., 1997). 
 
 
 
 
6 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=PubMed&Cmd=Search&Term=%22Leelayuwat%20C%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlus
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=PubMed&Cmd=Search&Term=%22Leelayuwat%20C%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlus
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=PubMed&Cmd=Search&Term=%22Leelayuwat%20C%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlus
 
 
 
JUSTIFICACIÓN 
 
• La Taq DNA Polimerasa es una enzima cara e importante para la realización de 
investigaciones genéticas y biotecnológicas. 
• México no cuenta con laboratorios que produzcan y purifiquen Taq DNA Polimerasa en 
grandes cantidades. 
• La UPIBI realiza una cantidad importante de investigaciones que utilizan esta enzima. 
• En muchas ocasiones las compañías distribuidoras llegan a tardar más de 2 meses 
para proveer dicho insumo. 
• Por lo anterior, el presente proyecto pretende satisfacer las necesidades de la enzima 
Taq DNA Polimerasa de la UPIBI. 
 
 
 
OBJETIVOS 
 
General 
- Producir y purificar Taq DNA Polimerasa recombinante utilizando E. coli. 
 
Específicos 
- Transformar E. coli con un plásmido de expresión que contenga el gen para la 
Taq DNA Polimerasa. 
- Producir Taq DNA Polimerasa a nivel laboratorio. 
- Estandarizar la técnica de obtención de Taq DNA Polimerasa. 
- Comprobar actividad enzimática. 
 
 
 
 
 
 
 
7 
 
METODOLOGÍA 
 
Obtención de cepa E. coli BL21 y plásmido pET con gen de Taq DNA 
Polimerasa. 
Fueron donados por el Dr. Agustín Badillo Corona. Universidad de Cambridge, UK. 
 
 
Transformación de E. coli BL21 con plásmido de expresión. 
A partir de un cultivo en placa LB de la cepa a transformar, se inoculó con dos colonias 
50 mL de caldo LB y se incubó a 37 ºC en agitación hasta una densidad óptica a 590 
nm (DO590) aproximada de 0.375. A continuación se centrifugaron las células a 6000 
rpm durante 4 minutos, el sobrenadante se eliminó y las células se resuspendieron en 5 
mL de CaCl2 0.1 M frío (4 ºC). Posteriormente se realizó una nueva centrifugación a 
6000 rpm durante 4 minutos a 4 ºC, se eliminó el sobrenadante y las células se 
resuspendieron en 1 mL de CaCl2 (0.1 M). Las células competentes obtenidas por este 
proceso, se mantuvieron en hielo un mínimo de 30 minutos antes de su transformación. 
Para proceder a la transformación, se mezclaron 200 μL de células con 10-20 ng (1-2 
μL) del plásmido a introducir y se mantuvo la mezcla en hielo durante 10 minutos. 
Transcurrido ese tiempo, se sometieron las células a un choque térmico a 42 ºC durante 
1 minuto y a continuación se colocaron nuevamente en hielo durante 2 minutos. Se 
añadieron 800 μL de medio LB y se incubaron durante 1 hora a 37 ºC, 250 rpm, para 
permitir la expresión de los genes. Por último, se sembraron las células en placas de 
agar LB-ampicilina y se incubaron durante 16 horas a 37 ºC. La concentración de 
ampicilina en el medio fue de 100 µg/mL. 
 
 
Extracción de DNA plasmídico. 
Se inocularon 50 mL de medio LB-Amp con una colonia de la bacteria transformada. El 
cultivo se incubó a 37 °C a 180 rpm durante toda la noche. El cultivo se transfirió a un 
tubo de 15 mL y se recuperaron las bacterias por centrifugación a 4000 rpm durante 10 
min a 4 °C. Se secó el pellet y se resuspendió con 200 μL de solución de lisis I (Glucosa 
50 mM, Tris-Cl 25 mM, EDTA 10 mM), se agitó en vortex constantemente y se transfirió 
a un tubo de 1.5 mL. Se agregaron 400 μL de la solución de lisis II (NaOH 0.2 N, SDS 
8 
 
1%) a cada suspensión. Se mezcló el contenido del tubo rápidamente invirtiendo el tubo 
5 veces. Se agregaron 300 μL de solución de lisis III (acetato de potasio 5 M, ácido 
acético 3 M) y se mezcló invirtiendo el tubo varias veces. Se incubó a 4 °C durante 5 
min. El lisado se centrifugó a máxima velocidad por 5 min. a 4 °C. Se transfirieron 600 
μL del sobrenadante a un nuevo tubo. Se agregó un volumen de fenol-cloroformo. Se 
agitó con vortex y se centrifugó a máxima velocidad por 2 min. a 4 °C. La fase acuosa 
se transfirió a un tubo nuevo. Los ácidos nucléicos se precipitaron por la adición de 600 
μL de isopropanol, la solución se agitó en un vortex y se dejó a temperatura ambiente 
durante 2 min. Se centrifugóa máxima velocidad por 5 min. a temperatura ambiente. El 
sobrenadante se removió y se dejó secar el pellet. Se agregó 1 mL de etanol al 70 % y 
el DNA se recuperó por centrifugación a máxima velocidad a temperatura ambiente. Se 
retiró el sobrenadante y se dejó secar el pellet. Se le agregaron 100 μL de TE (pH 8.0) 
que contiene 20 μg/mL de RNAsa libre de DNAsa. Se agitó en vortex y se almacenó a -
20 °C. 
 
 
Diseño de iniciadores. 
Se diseñaron 4 pares de iniciadores que se alinean en diferentes regiones del gen de la 
Taq DNA Polimerasa, éstos se diseñaron en el programa MacVector® (Cía. MacVector 
Incorporated, versión 9.5.2, 2007), las secuencias se muestran en la tabla 1. 
 
Tabla 1. Iniciadores seleccionados para gen Taq DNA Polimerasa. 
NOMBRE 
FRAGMENTO 
SECUENCIAS 
INICIADORES 
TAMAÑO DEL 
FRAGMENTO (pb) 
F1 
 
GCTTCCTCGCCGTCTTCTCC 
GATGCTGCCCCTCTTTGAGC 
600 
F2 
 
GAACTCGTGGAGGAGGCTGC 
GCGGAAAAGGAGGGCTACG 
450 
F3 
 
CCTCCCGCACGCTCTTCAC 
GCAGCCTCCTCCACGAGTTC 
1400 
F4 
 
CCTCCGCCCTCTCTTTTGG 
CAGCCTCCTCCACGAGTTCG 
1500 
 
 
9 
 
Producción de la Taq DNA Polimerasa en caldo super-ampicilina. 
Se inoculó caldo super-ampicilina con 5 mL de cultivo previamente crecido de E. coli 
recombinante. Se dejó crecer hasta alcanzar una densidad óptica (a 600 nm) de 0.3 a 
0.6. La expresión del plásmido se indujo con IPTG (isopropil-β-D-tiogalactopiranosido) 
por no más de 16 hrs. La concentración de IPTG en el caldo fue de 0.5mM. 
 
 
Purificación de Taq DNA Polimerasa. 
Se centrifugó el medio de cultivo durante 10 min a 4000 rpm y posteriormente se 
resuspendieron las células en 5 mL de Solución A (Tris-Cl 50 mM pH 7.9, EDTA 1mM 
pH 7.9 y Glucosa 50 mM) y se le añadió lisozima, la cual debía quedar a una 
concentración final de 4 mg/mL. Se dejó reposar 15 min a temperatura ambiente. 
Después se adicionó 5 mL de Solución B (Tris-Cl 10 mM pH 7.9, EDTA 1mM pH 7.9, 
KCl 50 mM, Igepal 0.5%, Tween 20 0.5%) y se incubó por 1 hora a 75 °C agitando cada 
5 min. A continuación se centrifugó a 18000 rpm durante 60 min a 4 °C. La extracción 
de la Taq DNA Polimerasa se determinó por electroforesis en gel de acrilamida-
bisacrilamida SDS. 
 
 
Preparación de gel de acrilamida-bisacrilamida SDS (SDS-PAGE). 
Primero se prepara el gel separador (tabla 2). 
 
Tabla 2. Preparación del gel separador a diferentes concentraciones. 
Componente 
20 % 
 
15 % 
 
12 % 
 
10 % 
 
7.5 % 
 
5 % 
Agua desionizada (L) 367 1167 1683 2000 2367 2783 
Tris 2M pH 8.8 (L) 1250 1250 1250 1250 1250 1250 
SDS (L) 50 50 50 50 50 50 
Arcrilamida/bisacrilamida (L) 3333 2500 2000 1667 1250 833 
 
 
Se prepara el molde para el gel. Se hace una marca a 1 - 1,5 cm debajo del nivel del 
peine de muestras. Se etira el peine. Se inicia la polimerización agregando 4 μL de 
10 
 
TEMED y 40 μL de persulfato de amonio a la mezcla. Se mezcla e inmediatamente se 
vierte la solución en los vidrios (molde), hasta la marca hecha anteriormente, sin atrapar 
burbujas. Mientras solidifica se mezclan los componentes del gel concentrador (tabla 3). 
 
Tabla 3. Preparación del gel concentrador. 
Componente 
20 % 
Agua desionizada (L) 1800 
Tris 2M pH 6.8 (L) 756 
SDS (L) 39.6 
Arcrilamida/bisacrilamida (L) 396 
TEMED (L) 4 
PSA (L) 18 
 
Una vez agregados los catalizadores se mezclan y se vierten inmediatamente en el 
molde, nivelando ahora el peine a su posición horizontal, sin atrapar burbujas. Se deja 
polimerizar. Se quita el peine deslizándolo suavemente, se lavan los pozos llenándolos 
con agua y aspirando luego con una jeringa. Esto elimina residuos de componentes no 
polimerizados. 
 
 
Medición de la actividad de la Taq purificada. 
Se amplificó un segmento de DNA utilizando la Taq DNA Polimerasa ya purificada, 
variando el número de ciclos y los segmentos de DNA, que provenían de diferentes 
especies. Para comprobar si las condiciones de almacenamiento fueron las óptimas, se 
midió la actividad cada mes. 
 
 
 
 
 
 
 
11 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
 
Se transformó E. coli BL21 con el plásmido pET que contiene el gen de Taq y se 
obtuvieron diferentes cepas, denominadas ARC. Se comenzó a trabajar con la cepa 
ARC4, ya que presentó mayor generación de biomasa en menor tiempo. Posteriormente 
se realizó una fermentación para producir Taq DNA Polimerasa en matraz, a la cual se 
le añadió IPTG como inductor. Se utilizó un control negativo, el cual fue la misma cepa 
en las mismas condiciones de cultivo, excepto IPTG. A continuación, se realizó un 
experimento de extracción de proteínas y se realizó una electroforesis en gel de 
acrilamida-bisacrilamida SDS para visualizarlas (figura 4). 
 
 
 
Figura 4. Gel acrilamida-bisacrilamida SDS al 10%, 90 volts, 60 min. MPM, marcador de 
peso molecular SDS7B2 (26.6-180 kDa); CN1, control negativo, 6 μL de muestra; Taq1, 
muestra que contiene a Taq DNA Polimerasa, 6 μL de muestra; CN2, 8 μL de muestra; 
Taq2, 8 μL de muestra. 
 
 CN1 Taq1 CN2 Taq2 MPM 
180 kDa 
90 
36.5 
12 
 
Se puede observar que las proteínas extraídas tanto de la muestra como del control 
negativo (CN) presentan el mismo perfil, por lo que es probable que la producción de la 
proteína recombinante fuera del mismo orden. Este resultado se repitió en múltiples 
experimentos, por lo que se decidió comprobar la presencia del gen en el plásmido. 
 
Para este fin se diseñaron 4 pares de iniciadores, utilizando el programa MacVector® y 
se extrajo plásmido. Posteriormente, con el plásmido extraído y los iniciadores 
diseñados, se realizó una PCR (30 ciclos, T alineación 56 °C) y las muestras se 
corrieron en un gel de agarosa al 1% (figura 5). 
 
 
 
Figura 5. Gel de agarosa 1%, SybrGreen Invitrogen, 100 volts, 40 min. MPM, marcador 
de peso molecular 100 pb; F1, 600 pb; F2, 450 pb; F4, 1500 pb; F1’, F2’ y F4’ son las 
muestras diluidas. 
 
Con estos resultados se sugiere que el gen de la Taq DNA Polimerasa estaba presente 
en el plásmido pero no se expresaba. 
 
 MPM F1 F2 F4 F1’ F2’ F4’ 
600 
450 
600 
450 
1500 1500 
100 
600 
1500 
2072 pb 
13 
 
La expresión de proteínas se puede ver inhibida por la concentración de IPTG en el 
medio, por ello se realizaron diversos ensayos de inducción a diferentes 
concentraciones de IPTG, a 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1 mM, comparando con un control 
negativo (CN, sin IPTG). Se extrajeron las proteínas y se corrieron electroforéticamente 
en un gel SDS-PAGE (figura 6). 
 
 
 
Figura 6. Gel acrilamida-bisacrilamida SDS al 7.5%, 90 volts, 60 min. MPM, marcador 
de peso molecular SDS7B2 (26.6-180 kDa); concentraciones finales en el medio de 
cultivo, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1 mM; CN, control negativo, sin IPTG. 
 
 
Como se observa en la figura 6, las proteínas extraídas de las muestras a las que se les 
agregó inductor y del CN son las mismas, por lo tanto el gen sigue sin expresarse. Esto 
se puede deber a que el IPTG no sirve, por ello, se realizó un ensayo de inducción con 
una marca distinta de IPTG. La concentración en el medio de cultivo fue de 0.5 mM. Se 
extrajo proteína y se corrió electroforéticamente en un gel SDS-PAGE (figura 7). 
 
 
 
 
 
180 kDa 
 
 
 
 
 
 
90 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
36.5 
MPM 0.2 0.4 0.6 0. 8 1 CN MPM 
14 
 
 
 
Figura 7. Gel acrilamida-bisacrilamida SDS al 7.5%, 90 volts, 60 min. MPM, marcador 
de peso molecular SDS7B2 (26.6-180 kDa); Taq, muestra con IPTG; CN, control 
negativo, sin IPTG. 
 
En la figura 7 se puede observar el mismo perfil tanto para las proteínas que se 
extrajeron de la muestra inducida como de las del CN, así se sugirió que el IPTG no era 
la causa por la cual el gen no se estaba expresando, y por esta razón se decidió 
cambiar de cepa. 
 
Se comenzó a trabajar con la cepa ARC2. Igualmenteque en los experimentos 
anteriores, una muestra se indujo con IPTG y la otra fue el CN, se extrajo proteína y se 
corrió electroforéticamente un gel SDS-PAGE (figura 8). 
 
 
 
 
 
 
 
180 kDa 
 
 
90 
 
 
 
 
 
 
 
36.5 
 MPM Taq CN Taq CN 
15 
 
 
 
Figura 8. Gel acrilamida-bisacrilamida SDS al 7.5%, 90 volts, 60 min. MPM, marcador 
de peso molecular SDS7B2 (26.6-180 kDa); Taq, muestra con IPTG; CN, control 
negativo, sin IPTG. 
 
En el gel se observa la banda de aproximadamente 80 kDa, que pertenece a la Taq 
DNA Polimerasa, esto quiere decir que se hubo expresado el gen y que probablemente 
la cepa anterior sufrió una mutación que le impidió la correcta expresión de los genes. 
 
Posteriormente se realizó otro ensayo de inducción para la producción de Taq DNA 
Polimerasa y se realizaron los siguientes controles (figura 9): 
1) Cepa sin transformar (BL21) s/IPTG, s/Amp. 
2) BL21 c/IPTG, s/Amp. 
3) BL21 s/IPTG, c/Amp. 
4) BL21 c/IPTG, c/Amp. 
5) Cepa transformada (ARC2) s/IPTG, c/Amp. 
6) ARC2 c/IPTG, c/Amp. 
 
Todo se realizó bajo las mismas condiciones. 
180 kDa 
 
 
 
 
 
 
 
 
 90 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 36.5 
 MPM Taq CN 
16 
 
 
 
Figura 9. Controles para la producción de Taq DNA Polimerasa. 
 
Se puede observar que en el control 3 y 4 no hubo crecimiento, esto se esperaba, 
puesto la cepa sin transformar se puso en presencia de ampicilina, así nos muestra que 
la cepa no contiene plásmido que le confiera resistencia al antibiótico. En los demás 
matraces se esperaba crecimiento, así que de estos se extrajo proteína y se corrió 
electroforéticamente un gel SDS-PAGE (figura 10). 
 
 
17 
 
 
Figura 10. Gel acrilamida-bisacrilamida SDS al 7.5%, 90 volts, 60 min. MPM, marcador 
de peso molecular SDS7B2 (26.6-180 kDa); 1, BL21 s/IPTG, s/Amp; 2, BL21 c/IPTG, 
s/Amp; 5, ARC2 s/IPTG, c/Amp; 6, ARC2 c/IPTG, c/Amp. 
 
Así, con los controles de la cepa sin transformar (BL21), con y sin IPTG y sin ampicilina 
(figura 10, carriles 1 y 2) se comprueba que el IPTG no tiene efecto sobre la producción 
de las proteínas sintetizadas por la cepa BL21. En los controles de la cepa sin 
transformar, con y sin IPTG y con ampicilina, como ya se mencionó, no se esperaba 
crecimiento, puesto que no cuentan con un plásmido que les confiera resistencia al 
antibiótico. En la muestra del control de la cepa transformada sin IPTG y con ampicilina 
(figura 10, carril 5) no se observa alguna banda que corresponda a la Taq Polimerasa, 
en cambio en la muestra de ARC2 con IPTG y con ampicilina (figura 10, carril 6) se 
puede observar una banda que corresponde a la Taq DNA Polimerasa, ya que tiene un 
peso aproximado de 80 kDa. 
 
Con esto se asegura que la enzima recombinante es únicamente producida por la cepa 
transformada y en presencia de IPTG, además de corroborar que en la cepa sin 
transformar no existe ningún plásmido. 
 
180 kDa 
 
 
 
 
 
90 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
36.5 
 MPM 1 2 5 6 MPM 
18 
 
Posteriormente se realizó PCR con la enzima producida en el laboratorio y se corrió un 
gel de agarosa (figura 11). 
 
 
Figura 11. Gel de agarosa 1%, SybrGreen Invitrogen, 100 volts, 40 min. 1, MPM 100 pb; 
2, dilución 1:10; 3, dilución 1:100; 4, dilución 1:1000; 5, dilución 1:10000; 6, dilución 
1:100000; 7, directa del extracto; 8, s/DNA; 9, s/nucleótidos; 10, s/DNA y s/nucleótidos; 
11, s/iniciadores; 12, control positivo Taq comercial; 13, control negativo Taq comercial; 
14, MPM 100 pb. 
 
En el gel que se muestra en la figura 11; se hicieron diluciones del extracto, con esto se 
realizó la PCR y no se muestra amplificado (carriles 2 al 6). En cambio con la muestra 
directamente del extracto se observa amplificado (carril 7). Se metieron controles sin 
DNA, sin nucleótidos y sin iniciadores. El control sin DNA muestra amplificado, esto 
sugiere que el extracto tiene contaminación de DNA, aunque el control negativo con la 
Taq comercial muestra también un amplificado, así que algún reactivo se ha 
contaminado por el mal manejo. 
 
 
2072 pb 
 
1500 
 
 
 
 
 
600 
 
 
 
100 
19 
 
Posteriormente se realizó otro experimento, en el cual se quería comprobar si había 
pérdida de la enzima durante la extracción, así que de cada paso de la extracción se 
tomó una muestra y se realizó PCR. También para corroborar si había o no 
contaminación de DNA (figura 12). 
 
 
Figura 12. Gel de agarosa 1%, SybrGreen Invitrogen, 100 volts, 40 min. 1, MPM 100 pb; 
2-7, primer paso de la extracción; 8-13, soluciones de lisis; 14-16, penúltimo paso de la 
extracción; 17-19, penúltimo paso s/DNA; 20-22, extracto; 23-25, extracto s/DNA; 26, 
vacío; C+, con Taq comercial; C-, con Taq comercial s/DNA; C+, Taq extracto de un 
mes anterior; C-, Taq extracto de un mes anterior s/DNA. 
 
 
De la figura 12; en los carriles 2 al 7, que pertenecen al sobrenadante de la primera 
centrifugación, se observa que no hay pérdida de la enzima y se confirma que no es 
extracelular, ya que no hay ningún amplificado. Los carriles 8 al 13 pertenecen a la 
muestra tomada durante el segundo paso de la extracción, cuando las células se 
resuspenden con las soluciones de lisis A y B, se observa que tampoco existe pérdida 
de la enzima durante ese paso, puesto que no se observa ningún amplificado. Los 
carriles 14 al 16 pertenecen al penúltimo paso de la extracción, después de haber 
calentado las muestras, y se observa un amplificado. Puesto que el último paso es una 
centrifugación, para eliminar del extracto las moléculas más grandes, se puede decir 
que en el anterior paso no se pierde la enzima. Los carriles 17 al 19 son de la muestra 
del penúltimo paso pero sin DNA, con esto se comprueba que no hay contaminación 
2072 pb 
 
 
 
1500 
 
 
 
 
 
600 
 
 
 
 
100 
20 
 
con DNA. Del 20 al 22 son del extracto final, y del 23 al 25 también son del extracto final 
pero sin DNA, aunque se observan pequeñas bandas no se puede decir que hay 
contaminación en el extracto, puesto que en los controles también se observa 
amplificado. Los primeros controles se realizaron con Taq comercial; el control positivo 
(C+) con DNA y el negativo (C-) sin DNA, en el negativo se observa un amplificado, lo 
que muestra que algún reactivo está contaminado con DNA. Los segundos controles se 
realizaron con Taq producida un mes anterior, el control negativo (C-) muestra un 
amplificado, lo que comprueba que se ha contaminado con DNA. Así también se 
comprueba la actividad, puesto que después de estar un mes en congelación sigue 
amplificando. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
21 
 
CONCLUSIONES 
 
 Se logró la producción de Taq DNA Polimerasa a nivel laboratorio. 
 
 Los resultados de la PCR muestran que no se tienen pérdidas de la enzima 
durante la extracción. 
 
 La enzima presenta buena actividad después de estar un mes en congelación (-
28 °C), ya que se muestra amplificado. 
 
 
 
RECOMENDACIONES PARA TRABAJO FUTURO 
 
 Comprobar si existe contaminación de DNA en el extracto, mediante reacciones 
de PCR, con reactivos nos contaminados. 
 Establecer las condiciones óptimas de producción a nivel piloto. 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
A Rodrigo Corona Guzmán, M. en C. Paola Zárate Segura, Biol. Verónica Pacheco, 
Raúl Iván López Gómez, Erick Miguel Ramos Martínez, José Alberto Kakauma 
González y a todos aquellos que hicieron posible la realización de este trabajo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
22 
 
 
 
REFERENCIAS 
 
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Primera edición. Ediciones INTA. Argentina. 
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(Número 3). 316-321. 
5. Leelayuwat, C.; Srisuk, T.; Paechaiyaphum, R.; Limpaiboon, T.; Romphruk, A. 
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7. Novagen. 1999. pET System Manual. Novagen. Estados Unidos y Canadá. 
8. Rodríguez, I.; Barrera, H. 2004. La reacción de la cadena de polimerasa a dos 
décadas de su invención. Ciencia UANL. Vol. VII (Número 003). 323-335. 
9. Sambrook, J.; Russell, D. 2001. Molecular cloning, a laboratory manual. 3ra. 
Edición. Vol. 2. CSHL PRESS. 15-22. 
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11. www.golemp.blogspot.com/2006/09/ 
12. www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez 
13. www.rochediagnostics.es/productos_servicios/02020601 
14. www.scielo.org.ar/pdf/medba/v65n5/v65n5a14 
15. www.wipo.int/pctdb/en 
 
 
 
 
 
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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=PubMed&Cmd=Search&Term=%22Paechaiyaphum%20R%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlus
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=PubMed&Cmd=Search&Term=%22Limpaiboon%20T%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVAbstractPlus
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http://www.blogs.20minutos.es/retiario/post
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez
http://www.rochediagnostics.es/productos_servicios/02020601
http://www.scielo.org.ar/pdf/medba/v65n5/v65n5a14
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
 
 
Figura 1. Pasos de un ciclo de PCR 
 
 
Figura 2. Ciclos en una amplificación por PCR (Alberts et. al, 2003). 
 
 
Figura 3. Taq DNA polimerasa (people.cryst.bbk.ac.uk). 
 
 
Figura 4. Gel acrilamida-bisacrilamida SDS al 10%, 90 volts, 60 
min. MPM, marcador de peso molecular SDS7B2 (26.6-180 kDa); 
CN1, control negativo, 6 μL de muestra; Taq1, muestra que 
contiene a Taq DNA Polimerasa, 6 μL de muestra; CN2, 8 μL de 
muestra; Taq2, 8 μL de muestra. 
 
 
Figura 5. Gel de agarosa 1%, SybrGreen Invitrogen, 100 volts, 40 
min. MPM, marcador de peso molecular 100 pb; F1, 600 pb; F2, 
450 pb; F4, 1500 pb; F1’, F2’ y F4’ son las muestras diluidas. 
 
 
Figura 6. Gel acrilamida-bisacrilamida SDS al 7.5%, 90 volts, 60 
min. MPM, marcador de peso molecular SDS7B2 (26.6-180 kDa); 
concentraciones finales en el medio de cultivo, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1 
mM; CN, control negativo, sin IPTG. 
 
 
Figura 7. Gel acrilamida-bisacrilamida SDS al 7.5%, 90 volts, 60 
min. MPM, marcador de peso molecular SDS7B2 (26.6-180 kDa); 
Taq, muestra con IPTG; CN, control negativo, sin IPTG. 
 
 
Figura 8. Gel acrilamida-bisacrilamida SDS al 7.5%, 90 volts, 60 
min. MPM, marcador de peso molecular SDS7B2 (26.6-180 kDa); 
Taq, muestra con IPTG; CN, control negativo, sin IPTG. 
 
 
Figura 9. Controles para la producción de Taq DNA Polimerasa. 
 
 
Figura 10. Gel acrilamida-bisacrilamida SDS al 7.5%, 90 volts, 60 
min. MPM, marcador de peso molecular SDS7B2 (26.6-180 kDa); 
1, BL21 s/IPTG, s/Amp; 2, BL21 c/IPTG, s/Amp; 5, ARC2 s/IPTG, 
c/Amp; 6, ARC2 c/IPTG, c/Amp. 
 
 
Figura 11. Gel de agarosa 1%, SybrGreen Invitrogen, 100 volts, 40 
2 
 
 
4 
 
 
5 
 
 
12 
 
 
 
 
 
 
13 
 
 
 
 
14 
 
 
 
 
 
15 
 
 
 
 
16 
 
 
 
 
17 
 
 
18 
 
 
 
 
 
19 
 
min. 1, MPM 100 pb; 2, dilución 1:10; 3, dilución 1:100; 4, dilución 
1:1000; 5, dilución 1:10000; 6, dilución 1:100000; 7, directa del 
extracto; 8, s/DNA; 9, s/nucleótidos; 10, s/DNA y s/nucleótidos; 11, 
s/iniciadores; 12, control positivo Taq comercial; 13, control 
negativo Taq comercial; 14, MPM 100 pb. 
 
 
Figura 12. Gel de agarosa 1%, SybrGreen Invitrogen, 100 volts, 40 
min. 1, MPM 100 pb; 2-7, primer paso de la extracción; 8-13, 
soluciones de lisis; 14-16, penúltimo paso de la extracción; 17-19, 
penúltimo paso s/DNA; 20-22, extracto; 23-25, extracto s/DNA; 26, 
vacío; C+, con Taq comercial; C-, con Taq comercial s/DNA; C+, 
Taq extracto de un mes anterior; C-, Taq extracto de un mes 
anterior s/DNA. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
20 
 
 
 
 
ÍNDICE DE TABLAS 
 
 
Tabla 1. Iniciadores seleccionados para gen Taq DNA Polimerasa. 
 
 
 
Tabla 2. Preparación del gel separador a diferentes 
concentraciones. 
 
 
 
Tabla 3. Preparación del gel concentrador. 
 
9 
 
 
 
 
10 
 
 
 
11

Otros materiales