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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA “VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALITICO PARA NIMESULIDA POR ESPECTROFOTOMETRIA U.V” INFORME TÉCNICO DE LA OPCION CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE: ESTANCIA INDUSTRIAL QUE PARA OBTENER EL TITULO DE INGENIERO FARMACEUTICO PRESENTA: ALONSO CHÁVEZ GUADALUPE ASESORES: EXTERNO: QFB BEATRIZ GONZÁLEZ SÁNCHEZ INTERNO: QFB MA. ESTHER BAUTIZTA R México, D.F. a 19 mayo de 2008. INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 1 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA INDICE I. HISTORIA DE LA EMPRESA …………………………………….2 2. SIMBOLOS Y ABREVIATURAS …………………………………….7 3. INTRODUCCION …………………………………….8 3.1 Ficha técnica de Nimesulida …………………………………….8 3.2 Validación de Métodos Analíticos ……………………………………10 3.3 Clasificación de Métodos Analíticos ……………………………………11 3.4 Parámetros a Evaluar ……………………………………12 3.5 Informe del proceso de Validación ……………………………………17 4. JUSTIFICACION ……………………………………18 5. OBJETIVOS ……………………………………19 6. METODOLOGIA ……………………………………20 6.1 Método Potenciométrico ……………………………………20 6.2 Método Espectrofotometrico ……………………………………22 7. RESULTADOS ……………………………………26 7.1 Método Potenciométrico ……………………………………26 7.2 Método Espectrofotometrico ……………………………………36 8. COMPARACION DE METODOS ……………………………………50 9. ANALISIS DE RESULTADOS ……………………………………53 10. CONCLUSIONES ……………………………………54 11. BIBLIOGRAFIA ……………………………………55 12. ANEXOS ……………………………………56 1 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 2 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA I. HISTORIA DE LA EMPRESA. El 7 de enero de 1953 nace Mavi Farmacéutica en la ciudad de México, con el objeto de fabricar medicamentos de uso humano, de calidad reconocida y a precio accesible para la mayoría, buscando la formación integral y el bienestar de sus empleados. Es fundada por la familia Alonso Vilatela, es una empresa mexicana financiada en su totalidad por capital nacional. Después de 8 exitoso años, en 1961 los socios fundan una segunda empresa llamada Laboratorios Euromex, con el objetivo de proveer un mayor numero de especialidades farmacéuticas. En le año de 1980, se forma un grupo industrial Farmex como empresa controladora de laboratorios Euromex y Mavi Farmacéutica. Ese mismo año se adquiere la empresa Corporación Farmacéutica. De esta manera, Grupo Industrial Farmex se convierte en un conglomerado fuerte y solidó. Buscando una mayor integración, en 1984 crea Química Fina Farmex, empresa productora de principios activos farmacéuticos. Estas materias primas se comercializan tanto en el mercado nacional como internacional. Atendiendo los siguientes sectores. * Línea comercial (Mavi farmacéutica, laboratorio Euromex) * Sector Salud (Mavi farmacéutica, laboratorio Euromex) * Línea fármaco química (química fina Farmex) 2 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 3 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA I:I LOCALIZACIÓN DE LA PLANTA: Dirección: Calle Triangulo esquina con Osa Menor, Colonia Prado Churubusco, S/N, CP 04370, Delegación Coyoacán. 3 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 4 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA I.2 MISION: Desarrollar, producir y comercializar medicamentos para atender la salud humana, de calidad reconocida y a precio accesible, impulsando la formación integral y el bienestar de sus empleados y generando una retribución justa para los accionistas que asegure la permanencia y Crecimiento de la organización. I.3 POLITICA DE CALIDAD: En nuestra organización la calidad se demuestra: * Desarrollando y produciendo medicamentos conforme a lo que dispone la Ley General de Salud. * Desempeñando actividades dando cumplimiento a La NOM 059 y la ISO 9001:2000 * Esforzándose continuamente en mejora de procesos, y el ambiente de trabajo, la comunicación con clientes, proveedores y empleados. * Verificando la satisfacción de nuestros clientes, la capacidad de proveedores y eficacia de los procesos. 4 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 5 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA I.4 LINEA DE PRODUCTOS GENERALES DE LA EMPRESA: 1. ANALGESICOS 2. ANTIBIOTICOS 3. ANTIMICROBIANOS LINEA DE PRODUCTOS ESPECIFICOS DE LA EMPRESA. NOMBRE COMERCIAL SUSTANCIA ACTIVA PRESENTACIÓN ACITAB Acido acetil salicílico Caja c/20 tabletas AMIKAVI Amikacina Caja c/ 1 ampolleta ARTROBEN CREMA Bencidamina Caja c/1 tubo de 60 g ARTROBEN SPRAY Bencidamina Caja c/frasco de 30 mL AXTIN Fluoxetina Caja c/14 cápsulas BACTOKINA Lincomicina Caja c/ 6 ampolletas BIOTAxIL Amoxicilina Caja c/ frasco 75 mL CATONA Captopril Caja c/30 tabletas DALATINA Clindamicina Caja c/1 tubo de 30 g DISTENTAL Bromuro de pinaverio Caja c/14 tabletas EUFLUXIN Ciprofloxacino Caja c/12 comprimidos EURIFAM Rifampicina Caja c/16 cápsulas EUROLOL Metoprolol Caja c/20 tabletas FENAGEL Diclofenaco dietil amonio Caja c/1 tubo 60g FLUOSEP Ofloxacino Caja c/10 grageas FLUXIBIT Loratadina/ambroxol Caja c/1 frasco de 120 mL INFLANOX Naproxeno Caja c/12 tabletas ITAMOL Subsalicilato de bismuto Caja c/24 tabletas masticables LESACLOR SUSPENSION Aciclovir Caja c/ 1 frasco 125 mL LESIDEN Nimesulida Caja c/ 1 frasco 60 mL MACROFURIN Nitrofurantoína Caja c/40 cápsulas MAVICAM Meloxicam Caja c/ 14 tabletas MAVIDOL Ketorolaco Caja c/10 tabletas 5 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 6 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 6 ORTOCOL FORTE DICLOFENACO/COMPLEJOB CAJA C/30 GRAGEAS SINFRAC Alendronato sódico Caja c/30 tabletas TAXENAN Naproxeno/Paracetamol Caja c/10 tabletas UREZOL Fenazopiridina Caja c/20 tabletas VIKROL Claritromicina Caja c/10 tabletas XINAMIN Complejo B Caja c/30 tabletas GÉNERICOS INTERCAMBIABLES SUSTANCIA ACTIVA PRESENTACION CINARIZINA Caja c/60 tabletas CLARITROMICINA Caja c/10 tabletas CLINDAMICINA Caja c/ 16 capsulas DICLOFENACO Caja c/ 2 ampolletas DIFENHIDRAMINA Caja c/ 1 frasco FLUCONAZOL Caja c/ frasco HIDRALAZINA Caja c/5 ampolletas KETAMINA Caja c/ 1 frasco KETOROLACO Caja c/ 3 ampolletas LORATADINA Caja c/ 1 frasco MICONAZOL Caja c/ 1 tubo ONDANSETRON Caja c/ 3 ampolletas TERBUTALNA Caja c/ 3 ampolletas ENALAPRIL Caja c/10 tabletas FENAZOPIRIDINA Caja c/ 20 tabletas FENOBARBITAL Caja c/1 frasco PEROXIDO DE BENZOILO Caja c/ 1 frasco RIFAMPICINA Caja c/ 1 frasco SULFATO FERROSO Caja c/ 1 frasco INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 7 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 2. SIMBOLOS Y ABREVIATURAS: Cuando se haga referencia a los siguientes símbolos o abreviaturas se entera: S ó σ Desviación estándar S2 Varianza S12 Varianza del método 1 S22 Varianza del método 2 F0.025,n2-1,n1-1 Valor de la distribución F de fisher asociado a una confianza del 2.5% y agrados de libertad establecidos. F0.975,n2-1,n1-1 Valor de la distribución F de fisher asociado a una confianza del 97.5% y agrados de libertad establecidos. SB2 Varianza del método 2 SA2 Varianza del método 1 b Pendiente r2 Coeficiente de determinación CV Coeficiente de variación LD Limite de detección LC Limite de cuantificación x Media aritmética de x y Media aritméticade y n Numero de mediciones o recobros o blancos o muestras o determinaciones. SRf Sustancia de referencia σ22/σ12 Razón de varianzas poblacionales 7 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 8 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 3 INTRODUCCION: 3.1 FICHA TECNICA DE NIMESULIDA Nimesulida es una molécula derivada de la sulfonanilida con acción antiinflamatoria, antipirética y analgésica que pertenece al grupo de los antiinflamatorios no esteroideos. ESTRUCTURA Nimesulida difiere de otros AINES por poseer una sulfonanilida, como su grupo acídico funcional, que le dota de un perfil farmacológico único. Nimesulida inhibe la prostaglandina sintetasa, también conocida como ciclooxigenasa, que modifica los límites de producción de prostaglandina. Su potencia inhibitoria de la ciclooxigenasa se considera intermedia cuando se compara con otros AINES. Se ha demostrado recientemente que la ciclooxigenasa existe en dos formas isomorfas en el organismo, denominadas COX-1 y COX-2. La COX-1 es una enzima constitutiva que produce prostaglandinas que son esenciales para el mantenimiento de la homeostasis vascular y las funciones gástricas y renales normales. La COX-2 es una enzima inducible que es responsable de la liberación de prostaglandinas durante la inflamación. Según esto, parece positivo que la actividad antiinflamatoria positiva de los AINES se puede atribuir a su capacidad para inhibir la COX-2, mientras que las reacciones adversas asociadas se deben a su capacidad para inhibir la COX-1. Nimesulida posee un efecto "scavenger" que interfiere con la producción de radicales libres por los leucocitos sin inhibir la quimiotaxis y la fagocitosis. Los productos de los radicales libres directa e indirectamente lesionan los tejidos del huésped y contribuyen al mantenimiento del proceso inflamatorio. Nimesulida protege la lesión tisular que ocurre durante la inflamación y "cortacircuita" el proceso inflamatorio. De esta manera, ejerce un potente efecto antiinflamatorio in vivo. 8 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 9 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA Propiedades farmacocinéticas Nimesulida es bien absorbido por vía oral y alcanza la concentración plasmática máxima en 1-3 horas; tiene una semivida de 2-3 horas y una duración de acción de 6-8 h; por vía rectal el pico plasmático se alcanza en aproximadamente 4 h con un tiempo de eliminación de alrededor de 5 horas. La administración diaria de 1 comprimido, cada 12 horas, con 100 mg de Nimesulida, que es la dosis usual en las patologías con un componente inflamatorio, logra el estado de equilibrio en 24-36 horas. La administración reiterada no da lugar a fenómenos de acumulación. Nimesulida se une ampliamente (99%) a las proteínas plasmáticas y posee un volumen de distribución aparente estimado de 0,19 a 0,35 l/kg tras la administración oral. Nimesulida se metaboliza en gran medida (1 a 3 % de la dosis se excreta invariable en la orina) en varios metabolitos que se excretan principalmente en la orina (aprox. 70%) o en heces (aprox. 20%). El fármaco es casi completamente biotransformado en 4-hidroxi- nimesulida en ambas formas libre y conjugada, metabolito que parece contribuir a la actividad antiinflamatoria del compuesto. Nimesulida se excreta principalmente por vía urinaria (80%) y en menor cuantía por heces (20%). Indicaciones Terapéuticas Tratamiento sintomático de la artropatía degenerativa (artrosis). Tratamiento de procesos inflamatorios y dolorosos agudos de diversas etiologías tales como postoperatorio y traumatismos musculoesqueléticos. Dismenorrea primaria y como antipirético. 9 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 10 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 3.2 VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALITICOS: En la industria farmacéutica siempre actúa buscando la calidad de los medicamentos y de los procesos de fabricación, por lo que es plenamente importante garantizar que el medicamento es seguro, eficaz y eso se garantiza mediante la validación. Es por eso que los métodos analíticos deben cumplir con las exigencias de: La Dirección general de medicamentos insumos y drogas (Digemid) Reglamento de Insumos para la Salud, publicado en el diario Oficial el 4 de Febrero de 1988 referente a los establecimientos que destinen la fabricación de insumos (medicamentos, fármacos, materias primas y aditivos). La Norma Oficial Mexicana NOM-059-SSA-1993 Buenas Prácticas de Manufactura de productos farmacéuticos, que establece los siguientes puntos: 1. NUMERAL DE LA NORMA (5.6.3): Que se lleven acabo estudios de validación de los procesos de fabricación y de los sistemas involucrados. 2. NUMERAL DE LA NORMA (9.11.3): Los Métodos Analíticos deben ser validados, de acuerdo con lo establecido en el apartado 9.12 “Control de Laboratorio Analítico” 3. NUMERAL DE LA NORMA (9.12.3): Se debe contar con métodos de análisis validados para producto a granel, terminado y materia prima en caso de no aparecer en cualquier farmacopea internacional ni en la FEUM. Norma Oficial Mexicana NOM-164-SSA1-1998 Buenas Prácticas de Fabricación para Fármacos que establece: 1. NUMERAL DE LA NORMA (16.1): Los controles de laboratorio e inspecciones deben apoyarse en normas, PNO´s o manuales que contengan las especificaciones para garantizar la confiabilidad de sus resultados. 2. NUMERAL DE LA NORMA (16.1.5): Validación de Métodos Analíticos utilizados por la empresa, NO farmacopeicos o farmacopeicos que tengan desviaciones frente a la farmacopea de referencia. 10 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 11 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA Buenas Prácticas de Laboratorio. Un laboratorio de análisis debe tener como principal propósito la producción de datos analíticos de alta calidad por medio de uso d mediciones analiticas que sean precisas, confiables y adecuadas para tal fin. Esto puede alcanzarse si se cuenta con un sistema planificado y documentado de la calidad de las actividades, para esto el laboratorio necesitara operar bajo un sistema de garantía de calidad que incluya una extensa documentación de sus actividades. La validación de un método analítico, garantiza la calidad del medicamento, así mismo es necesaria por que: 1. proporciona alto grado de confianza, seguridad den método y calidad en los resultados. 2. permite el conocimiento profundo del método, si como las características. 3. este conocimiento y seguridad ayuda a la disminución de fallas y repeticiones, por que lleva al ahorro de costos asociados y a cumplir con los tiempos previstos de análisis. 3.3 CLASIFICACION DE MÉTODOS ANALITICOS: 1.- En función de su estado Regulatorio: * Métodos farmacopeicos. * Métodos No farmacopeicos. 2.- En función de su aplicación: * Métodos para producto a granel. * Métodos para producto terminado. * Métodos para Materia Prima. * Métodos indicadores de Estabilidad. 3.- En función de la Naturaleza de la respuesta analítica: 11 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 12 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA * Métodos físico-químicos. * Métodos Biológicos. 4.- En función de propósito analítico: * Métodos para cuantificar el analito. * Métodos para establecer la presencia del analito a un límite. * Métodos para identificar el analito. 5.- En función de la naturaleza del sistema de medición: * Métodos en los cuales el instrumento de medición de la respuesta analítica, permite medir el ruido (cromatogramas, espectrofotómetro). *Métodos en los cuales el instrumento de medición de la respuesta analítica, no permite medir el ruido (potenciómetros, buretas, etc.). 3.4 LAS CARACTERÍSTICAS DEL DESEMPEÑO DEL MÉTODO SE EXPRESA EN FUNCIÓN DE LOS SIGUIENTES PARÁMETROS: Selectividad Capacidad de un método analítico para determinar únicamente los componentes que se pretenden medir. Sensibilidad Es la pendiente de la recta de calibración que se obtiene cuando el resultado (o señal) de la medida o una función de la misma se representa frente a la cantidad o concentración del analito. Linealidad del sistema: Criterios de aceptación: El valor del coeficiente de determinación “r2” deberá ser ≥ 0.98 12 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 13 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA El intervalo de confianza para la pendiente debe incluir la unidad El coeficiente de variación CV deberá ser: ≤ 3% Si es químico o espectrofotométrico. ≤ 2% Si es volumétrico o cromatografico. ≤ 5% Si es microbiológico El porcentaje de recobro deberá ser: 98-102% Si el método es cromatografico, volumétrico. 97-103% Si el método es químico o espectrofotométrico. 95-105% Si el método es microbiológico. Linealidad del método analítico: Es su capacidad para demostrar que los resultados de la prueba son directamente proporcionales a ala concentración del analito dentro de un rango dado. Se clasifica en dos: 1. Cuando se conocen los componentes de la muestra y es posible preparar un placebo analítico. 2. No se conocen los componentes de la muestra. Criterios de aceptación: El valor del coeficiente de determinación “r2” deberá ser ≥ 0.98 El intervalo de confianza para la pendiente debe incluir la unidad El coeficiente de variación CV deberá ser: ≤ 3% Si es químico o espectrofotométrico. ≤ 2% Si es volumétrico o cromatografico. ≤ 5% Si es microbiológico El porcentaje de recobro deberá ser: 98-102% Si el método es cromatografico, volumétrico. 97-103% Si el método es químico o espectrofotométrico. 13 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 14 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 95-105% Si el método es microbiológico. Linealidad en el intervalo de aplicación La pendiente de la recta de calibración debe ser constante en todo el intervalo de aplicación del procedimiento de medida. El límite inferior de dicho intervalo vendrá determinado por el valor obtenido para el límite de cuantificación del método. El límite superior del intervalo estará condicionado, en general, por la pérdida de linealidad en la curva de calibración. Exactitud: Es la proximidad entre los resultados obtenidos por este método y el valor real. La exactitud del método analítico se debe establecerse a lo largo de todo un rango. Criterios de aceptación: El intervalo de confianza para la diferencia de las dos medias poblacionales del porcentaje de recobro, debe incluir el valor de cero. Cualquier otro criterio debe ser justificado. Rango: Es el intervalo entre los niveles superior e inferior, en el que se ha demostrado un nivel adecuado de precisión, exactitud y linealidad del método tal cual esta escrito. Repetibilidad: a. Cualitativamente Es el grado de concordancia entre resultados sucesivos obtenidos con el mismo método sobre una materia idéntica sometida al ensayo, en las mismas condiciones (siempre el mismo operador, igual aparato, igual laboratorio y en pequeños intervalos de tiempo). b. Cuantitativamente 14 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 15 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA Es el valor por debajo del cual está situado, con una probabilidad especificada, el valor absoluto de la diferencia entre dos resultados individuales obtenidos en las condiciones anteriormente expuestas. En ausencia de otra indicación se entenderá que la probabilidad es del 95%. Criterios de aceptación: El intervalo d confianza para la razón de varianzas, deberá incluir el valor de 1. Cualquier otro criterio debe ser justificado. Reproducibilidad: a. Cualitativamente Es el grado de concordancia entre dos resultados individuales obtenidos con el mismo método sobre una materia idéntica sometida al ensayo, pero en condiciones diferentes (operadores distintos, aparatos diferentes, distintos laboratorios y/o épocas diferentes). b. Cuantitativamente Es el valor por debajo del cual está situado, con una probabilidad especificada, el valor absoluto de la diferencia entre dos resultados individuales obtenidos en las condiciones anteriormente expuestas. En ausencia de otra indicación se entenderá que la probabilidad es del 95%. Límite de detección: Es la menor cantidad de analito que puede ser detectada y diferenciada de un blanco, pero no necesariamente cuantificada con un nivel aceptable de exactitud y precisión. Criterios de aceptación: El LD debe ser menor a la especificación. El valor del coeficiente de determinación “r2” deberá ser ≥ 0.98 15 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 16 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA El intervalo de confianza para la pendiente no debe incluir el cero. Límite de cuantificación: Es la cantidad o concentración mínima que puede determinarse con un nivel aceptable de exactitud y precisión. Criterios de aceptación: El LC debe ser menor a la especificación. El valor del coeficiente de determinación “r2” deberá ser ≥ 0.98 El intervalo de confianza para la pendiente no debe incluir el cero Incertidumbre de la medida: Estimación que caracteriza el intervalo de valores en el que se sitúa generalmente, con una alta probabilidad, el valor verdadero de la magnitud medida. La incertidumbre de la medida incluye, en general, varios componentes. Algunos pueden estimarse a partir de la distribución estadística de los resultados de una serie de mediciones y pueden caracterizarse por la desviación típica muestral. La estimación de otros componentes solamente puede basarse en la experiencia o en otras informaciones. Incertidumbre global: Es una cantidad utilizada para caracterizar, como un todo, la incertidumbre del resultado dado por un equipo o un procedimiento de medida. Precisión: Es el grado de concordancia entre los resultados obtenidos aplicando el método repetidas veces, bajo condiciones determinadas. La precisión sólo depende de la distribución de errores aleatorios. Criterios de aceptación: El intervalo de confianza para la pendiente debe incluir el valor de 1. 16 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 17 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 3.5 INFORME DEL PROCESO DE VALIDACIÓN El protocolo de validación deberá incluir al menos la siguiente información: a. Titulo b. Propósito u objetivo. c. Responsabilidades d. Plan de prueba e. Criterios de aceptación El informe de validación deberá incluir al menos la siguiente información: a. Descripción completa de la muestra, especificando. o Tiempo y condiciones de muestreo. o Cantidad mínima necesaria. o Instrumental y recipientes adecuados para la toma y conservación de las muestras. o Aditivos cuando sean necesarios. o Precauciones a tomar una vez recogida la muestra (por ejemplo: tiempo y temperatura de conservación). b. Descripción completa del método analítico. c. Concentraciones ensayadas. d. Valores obtenidos en los ensayos realizados. e. Valores calculados para la precisión, r2 y CV para cada concentración. f. Justificación técnica de la omisión de algún ensayo. 17 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALpág 18 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 4.JUSTIFICACIÓN: Hoy en día la competencia cada vez es más fuerte en la Industria Farmacéutica. Es por eso que el contar con métodos validados para el análisis de materia prima, producto a granel y terminado confiere alto grado de confiabilidad en la elaboración de un producto, proporcionando así la calidad del producto para quien lo consuma, garantizando el fin para el cual fue creado. La validación de un procedimiento de medida, certifica mediante estudios de laboratorio, que las características de dicho procedimiento cumplen las especificaciones relativas al uso previsto de los resultados analíticos. La validación permite el conocimiento de las características de funcionamiento del método y proporciona un alto grado de confianza en el mismo y en los resultados obtenidos al aplicarlo mediante evidencia documentada y aprobada por el sistema de calidad de la empresa. La validación de un Método Analítico constituye un instrumento importante para garantizar la calidad de un medicamento, puesto que confiere la fiabilidad a los resultados obtenidos en el análisis, asegurando así que cumplan con los parámetros de calidad establecidos. 18 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 19 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 5. OBJETIVOS: OBJETIVO GENERAL: Validar el método analítico para la valoración de Nimesulida materia prima: * Por UV * Por titulación potenciométrica. Realizar la comparación de métodos mediante la validación para demostrar que se pueden utilizar indistintamente y que se puede reemplazar el método espectrofotométrico por el potenciométrico. OBJETIVOS ESPECIFICOS: Comprobar mediante los resultados obtenidos de la validación, que el método espectrofotométrico se puede reemplazar como método rutinario de control de calidad. Demostrar la aplicabilidad del método a las instalaciones y equipo con el que se cuenta en la empresa. Comprobar que se cumplen con las especificaciones para dicho método. Demostrar que el método por UV sea reproducible, lineal, exacto. 19 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 20 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 6 METODOLOGIA: 6.1 TITULACIÓN POTENCIOMETRICA a) Método de análisis de la valoración: Pesar con exactitud aproximadamente 240 mg de la muestra, transferir a un matraz erlenmeyer de 250 y disolver en 30 ml. de Acetona RA y 20 ml de Agua purificada. Titular con solución 0.1 M de hidróxido de sodio. Determinar en punto de equivalencia potencio métricamente. Cada mililitro de solución de 0.1M de hidróxido de sodio equivale a 30.83 mg de Nimesulida. REACTIVOS: Agua purificada. Acetona RA Nimesulida MP lote: NM/3330107 Hidróxido de sodio 0.1 M SV Ácido clorhídrico 0.1M SV EQUIPO Y MATERIAL: Parrilla de agitación Thermolyne Bureta Kimax de 50 ml. Balanza analítica Sartorius BP 2215 Matraz erlenmeyer Kimax de 250 ml. Pinzas para bureta. Pipetas de 20,10 ml. Agitador magnético Espátula de acero inoxidable. Soporte universal. Perilla de succión. Potenciómetro Sicnno. 20 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 21 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA b) Ensayos de validación: 1.- LINEALIDAD DEL SISTEMA DE MEDICION: Construir una curva de calibración a los niveles 40, 60, 80, 90, 100,110 %, por medio de pesadas independientes, transferir a un matraz erlenmeyer y adicionar 30 ml. de Acetona RA y 20 ml de Agua purificada. Titular con solución 0.1 M de hidróxido de sodio. Determinar en punto de equivalencia potenciométricamente. NIVEL% CANTIDAD ADICIONADA (mg) NO. DE REPLICAS 40 96 3 60 144 3 80 192 3 90 216 3 100 240 6 120 288 3 Criterios de aceptación: se determinaran evaluando los resultados obtenidos por regresión lineal. Calcular la pendiente El intercepto en “y” deberá ser cercano a 0 El valor del coeficiente de correlación “r” deberá ser 0.99 o mayor El intervalo de confianza para la pendiente no debe incluir el cero El coeficiente de variación CV deberá ser menor al 1.5% 2.- PRECISION DEL SISTEMA: Tomar los resultados obtenidos en el nivel al 100% y calcular los valores de ҳ, SD, y el CV. El criterio de aceptación es: CV ≤ 1.5% 3.- LINEALIDAD DEL METODO: No aplica debido a que es materia prima y se toma la linealidad del sistema. Calcular la pendiente Calcular la ordenada al origen El valor del coeficiente de determinación “r2” deberá ser 0.98 o mayor 21 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 22 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA El intervalo de confianza para la pendiente debe incluir la unidad El coeficiente de variación CV deberá ser ≤ 2% 4.- EXACTITUD Y REPETIBILIDAD AL 100%: No aplica debido a que es materia prima y se toma el la linealidad del sistema al nivel 100%. Determinar el CV total El criterio de aceptación es para el porcentaje de recobro: 98 al 102% 5.- REPRODUCIBILIDAD DEL METODO: Realizar el análisis como se indica en la parte a) de este protocolo. Con 2 analistas, en dos días diferentes, por triplicado. Calcular el CV y realizar el análisis de varianza. El criterio de aceptación para el porcentaje de recobro es: ≤ 2% . 6.2 ESPECTROFOTOMETRÍA U.V REACTIVOS: Nimesulida SRef. Lote No: 117H1019 Nimesulida Lote No: NM/3330107 (materia prima) Agua Purificada Hidróxido de sodio SV EQUIPO, INSTRUMENTOS Y MATERIAL: Espectrofotómetro Hawlett Packard Perilla de succión Espátula de acero inoxidable Balanza analítica (Sartorius) Matraces aforados de 50, 100 y 200 mL Pipeta volumétrica de 2, 3, 4, 5, 6 y 7mL 22 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 23 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA a) Método de análisis de la valoración: Preparación de la referencia: Transferir alrededor de 50 mg Nimesulida SRef a un matraz volumétrico de 100 mL. disolver y aforar con hidróxido de sodio 0.1 N, transferir una alícuota de 2 mL. de solución a un matraz volumétrico de 100 mL, diluir a volumen con agua y mezclar. Preparación de la muestra: Seguir el tratamiento de la preparación de la referencia pero con la muestra. Procedimiento: Determinar las absorbancias de ambas preparaciones en celdas de 1cm, a la longitud de onda máxima de absorbancia, utilizando como blanco de ajuste Hidróxido de sodio 0.1 N. Calcular el porcentaje de Nimesulida en la muestra por medio de la siguiente fórmula: (Am/Aref)(Cref/Cm)100 Donde: Am/Aref = Las absorbancias de la preparación de la muestra y la preparación de la referencia, respectivamente. Cref/Cm = Las concentraciones en miligramos por mililitro de la preparación de la referencia y de la preparación de la muestra, respectivamente. b) Ensayos de validación: 1. LINEALIDAD DEL SISTEMA DE MEDICIÓN: Construir una curva de calibración de la respuesta del equipo contra la cantidad adicionada de principio activo, a los niveles 40, 60, 80, 100,120 y 140 %, partiendo de una solución patrón (Stock). Tomar el volumen de alícuota de acuerdo con la siguiente tabla y llevar aforo a 50 mL con agua. 23 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 24 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIANIVEL % VOL. ALICUOTA mL No. REPLICAS 40 2 3 60 3 3 80 4 3 100 5 6 120 6 3 140 7 3 Leer todas las muestras a 392 nm en celdas de 1.0 cm. Registrar los resultados y calcular los valores de m, b, mr, br, r y r2. El valor del coeficiente de determinación “r2” deberá ser de 0.98 o mayor. El coeficiente de variación CV deberá ser menor al 1.5% 2.-PRECISIÓN DEL SISTEMA: Tomar los resultados obtenidos con el nivel al 100 % de la linealidad del sistema y calcular los valores de x , y el C.V. El criterio de aceptación es: CV ≤ 1.5% 3. LINEALIDAD DEL MÉTODO: Construir una curva de calibración a los niveles 40, 60, 80, 100, 120, 140 mezclar y llevar al aforo con Hidróxido de sodio 0.1 N. Transferir una alícuota de 2 mL de la solución a un matraz volumétrico de 100 mL, diluir a volumen con agua y mezclar. Analizar por sextuplicado y en días diferentes, al azar, incluyendo en cada día la preparación de reactivos y soluciones de referencia. NIVEL % CANTIDAD (mg) No. REPLICAS 40 20 6 60 30 6 80 40 6 100 50 6 120 60 6 24 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 25 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 140 70 6 Calcular: Calcular el porcentaje de recobro. El valor del coeficiente de determinación “r2” deberá ser 0.98 o mayor El coeficiente de variación CV deberá ser ≤ 3% 4.-EXACTITUD Y REPETIBILIDAD: Emplear los resultados obtenidos en la linealidad del método, en nivel 100% y determinar el coeficiente de variación del % recuperado. El criterio de aceptación para el porcentaje de recobro es: 97-103%. 5. REPRODUCIBILIDAD DEL MÉTODO: Realizar el análisis como se indica en la parte A) de este protocolo, con 2 analistas, en dos días diferentes, Calcular los % recuperados, C.V. y realizar el análisis de varianza con el porcentaje recuperado. El criterio de aceptación para el porcentaje de recobro es: ≤ 3%. 6. LIMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN: Con lo s resultados obtenidos en la curva de calibración de la linealidad del sistema calcular el valor de la pendiente (b1), el coeficiente de determinación (r2) y la desviación estándar de la regresión (Sx/y) y con ellos obtener el limite de detección y cuantificación. 25 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 26 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 7 RESULTADOS: 7.1 MÉTODO POR TITULACIÓN POTENCIOMETRICA LINEALIDAD DEL SISTEMA Para determinar el volumen real de titulación se realizo el método de la segunda derivada, por el que se determino el volumen real ocupado por cada muestra y en cada nivel. Este volumen es necesario para el calculo del porcentaje recuperado en cada muestra ya que cada 1 mL de NaOH es equivalente a 30.83 mg de Nimesulida. Ejemplo de cálculo (M5 del nivel al 100%): obtención de 2da derivada, hoja de calculo exel. MUESTRA 5 NIVEL 100 % 2 DA DERIVADA V(mL) volts ∆E ∆V Vr ∆E/∆V ∆(∆E/∆Vra) ∆Vda Vda ∆2E/∆V2) 0 109 -33 0.2 0.1 -165 100 0.2 0.2 500 0.2 76 -13 0.2 0.3 -65 -5 0.2 0.4 -25 0.4 63 -14 0.2 0.5 -70 25 0.2 0.6 125 0.6 49 -9 0.2 0.7 -45 0 0.2 0.8 0 0.8 40 -9 0.2 0.9 -45 -20 0.2 1 -100 1 31 -13 0.2 1.1 -65 35 0.2 1.2 175 1.2 18 -6 0.2 1.3 -30 10 0.2 1.4 50 1.4 12 -4 0.2 1.5 -20 0 0.2 1.6 0 1.6 8 -4 0.2 1.7 -20 0 0.2 1.8 0 1.8 4 -4 0.2 1.9 -20 5 0.2 2 25 2 0 -3 0.2 2.1 -15 -5 0.2 2.2 -25 2.2 -3 -4 0.2 2.3 -20 5 0.2 2.4 25 2.4 -7 -3 0.2 2.5 -15 -5 0.2 2.6 -25 2.6 -10 -4 0.2 2.7 -20 0 0.2 2.8 0 2.8 -14 -4 0.2 2.9 -20 5 0.2 3 25 3 -18 -3 0.2 3.1 -15 0 0.2 3.2 0 3.2 -21 -3 0.2 3.3 -15 0 0.2 3.4 0 3.4 -24 -3 0.2 3.5 -15 5 0.2 3.6 25 3.6 -27 -2 0.2 3.7 -10 0 0.2 3.8 0 3.8 -29 -2 0.2 3.9 -10 -5 0.2 4 -25 4 -31 -3 0.2 4.1 -15 0 0.2 4.2 0 4.2 -34 -3 0.2 4.3 -15 -5 0.2 4.4 -25 4.4 -37 -4 0.2 4.5 -20 0 0.2 4.6 0 4.6 -41 -4 0.2 4.7 -20 10 0.2 4.8 50 4.8 -45 -2 0.2 4.9 -10 5 0.2 5 25 5 -47 -1 0.2 5.1 -5 -5 0.2 5.2 -25 5.2 -48 -2 0.2 5.3 -10 -5 0.2 5.4 -25 26 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 27 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 5.4 -50 -3 0.2 5.5 -15 15 0.2 5.6 75 5.6 -53 0 0.2 5.7 0 -30 0.2 5.8 -150 5.8 -53 -6 0.2 5.9 -30 15 0.2 6 75 6 -59 -3 0.2 6.1 -15 0 0.2 6.2 0 6.2 -62 -3 0.2 6.3 -15 -10 0.2 6.4 -50 6.4 -65 -5 0.2 6.5 -25 0 0.2 6.6 0 6.6 -70 -5 0.2 6.7 -25 0 0.2 6.8 0 6.8 -75 -5 0.2 6.9 -25 -5 0.2 7 -25 7 -80 -6 0.2 7.1 -30 0 0.2 7.2 0 7.2 -86 -6 0.2 7.3 -30 -5 0.2 7.4 -25 7.4 -92 -7 0.2 7.5 -35 -15 0.2 7.6 -75 7.6 -99 -10 0.2 7.7 -50 -75 0.2 7.8 -375 7.8 -109 -25 0.2 7.9 -125 -520 0.2 8 -2600 8 -134 -129 0.2 8.1 -645 540 0.2 8.2 2700 8.2 -263 -21 0.2 8.3 -105 55 0.2 8.4 275 8.4 -284 -10 0.2 8.5 -50 10 0.2 8.6 50 8.6 -294 -8 0.2 8.7 -40 5 0.2 8.8 25 8.8 -302 -7 0.2 8.9 -35 10 0.2 9 50 9 -309 -5 0.2 9.1 -25 -35 0.2 9.2 -175 9.2 -314 -12 0.2 9.3 -60 -20 0.2 9.4 -100 9.4 -326 -16 0.2 9.5 -80 35 0.2 9.6 175 9.6 -342 -9 0.2 9.7 -45 -15 0.2 9.8 -75 9.8 -351 -12 0.2 9.9 -60 10 -363 MUESTRAS DEL NIVEL 40% 2da DERIVADA M1,M2,M3 NIVEL 40% DETERMINACION DEL PUNTO DE EQUIVALENCIA METODO POTENCIOMETRICO -5000 -4000 -3000 -2000 -1000 0 1000 2000 3000 4000 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 Vr ∆2 E/ ∆V 2) Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 3.3 Grafica 1. Muestra1,2,3-40% determinación del punto de equivalencia para Nimesulida, método potenciométrico 27 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 28 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA MUESTRAS DEL NIVEL 60% 2da DERIVADA M1,M2,M3 NIVEL 60% DETERMINACION DEL PUNTO DE EQUIVALENCIA METODO POTENCIOMETRICO -3000 -2000 -1000 0 1000 2000 3000 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 Vr ∆2 E/ ∆V 2) Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 4.9 Grafica 2. Muestra 1,2,3-60% determinación del punto de equivalencia para Nimesulida, método potenciométrico MUESTRAS DEL NIVEL 80% 2da DERIVADA M1,M2,M3 NIVEL 80% DETERMINACION DEL PUNTO DE EQUIVALENCIA METODO POTENCIOMETRICO -2500 -2000 -1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 2000 0 1 2 3 4 5 6 7 Vr ∆2 E/ ∆V 2) 8 Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 6.6 6.7 Grafica 3. Muestra 1,2,3-80% determinación del punto de equivalencia para Nimesulida, método potenciométrico MUESTRAS DEL NIVEL 90% 28 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 29 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA MUESTRAS DEL NIVEL 100% 2da DERIVADA M2 100% DETERMINACIÓN DEL PUNTO DE EQUIVALENCIA MÉTODO POTENCIOMETRICO -2500 -2000 -1500 -1000 -500 0 500 1000 1500 2000 2500 0 2 4 6 8 10 Vr ∆2 E/ ∆V 2) 12 8.3 Grafica 4. Muestra 2-100% determinación del punto de equivalencia para Nimesulida, método potenciométrico MUESTRAS DEL NIVEL 120% 2da DERIVADA M1 120% DETERMINACIÓN DEL PUNTO DE EQUIVALENCIA MÉTODO POTENCIOMETRICO -1000 -500 0 500 1000 1500 0 2 4 6 8 10 12 Vr ∆2 E/ ∆V 2) 14 9.7 Grafica 5. Muestra 1-120% determinación del punto de equivalencia para Nimesulida, método potenciométric 29 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 30 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA LINEALIDAD DEL SISTEMA Linealidad del sistema de medición para Nimesulida. NIVEL (%) mg Adicionados Replica número RESPUESTA volumen Media SD CV ( %) 40 96.0000 1 2 3 3.30000 3.30000 3.30000 3.300 0.0 0.0 60 144.0000 1 2 3 4.90000 4.90000 4.90000 4.900 0.0 0.0 80 192.0000 1 2 3 6.60000 6.70000 6.60000 6.6330.0577 0.87 90 216.0000 1 2 3 7.30000 7.40000 7.30000 7.333 0.05774 0.79 100 240.0000 1 2 3 4 5 6 8.30000 8.30000 8.10000 8.30000 8.10000 8.30000 8.233 0.10328 1.25 120 288.0000 1 2 3 9.70000 9.70000 9.70000 9.700 0.0 0.0 Tabla 1 Linealidad del sistema de medición para Nimesulida, método potenciométrico 30 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 31 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA GRAFICA: LINEALIDAD DEL SISTEMA LIN EA LID AD DE L S IST EM A P AR A N IME SU LID A M ET OD O PO TE NC IOM ET RIC O y = 0.0 33 6x + 0 .1 R2 = 0 .99 92 024681012 0 50 10 0 15 0 20 0 25 0 30 0 35 0 mg Ad icio na do s Volumen (mL) Grafica 6 Linealidad del sistema de medición para Nimesulida, método potenciométrico. b= 0.1 m= 0.0336 r=0.9996 br= 0.011 mr=0.9850 r2= 0.9992 Cumple con los criterios de aceptación: SI 31 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 32 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA PRECISIÓN DEL SISTEMA AL 100% Precisión del sistema para Nimesulida # RE RESPUESTA (VOLUMEN) PLICA 1 2 3 4 5 6 8.30000 8.40000 8.10000 8.30000 8.10000 8.30000 Tabla 2. Precisión de stema para Nimesulid o potenciométrico. x= 8.250 σ= 0.12274 C.V.= 1.48 Cumple con los criterios de aceptación: SI XACTITUD AL NIVEL100% xactitud del método para Nimesulida NO. REPLICA % RECU RADO X DESVIACION C.V. l si a, métod E E PE 1 2 3 4 5 6 101.72 100 35 3. 4 1. 5 101.46 99.22 101.67 99.22 1 01.72 .8 0 2 Tabla 3. Exact método para Nimesulida, método potenciométrico % de Recobro= 98-102% = 100.835% C.V.= 1.25 Cumple con los criterios de aceptación: SI itud del x 32 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 33 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA LINEALIDAD DEL MÉTODO Linealidad del método para Nimesulida. Nivel Replica mg (x) adicionados mg (y) rec s uperado (%) número % rec. Media Media CV X Y Y 40 96.000 97.06 101.10 96.03 97.06 0.003 1 2 3 96.100 96.000 97.06 97.06 101.00 101.10 60 144.200 144.11 99.94 144.23 144.08 0.041 1 2 3 144.200 144.300 144.11 144.01 99.94 99.80 80 192.400 194.11 100.89 192.63 199.09 0.870 1 2 3 192.500 192.500 197.05 194.12 102.1 100.84 90 216.400 214.71 99.22 216.17 215.68 0.78 1 2 3 216.300 215.800 217.69 214.70 100.62 99.49 100 240.000 244.13 101.72 240.18 242.16 1.257 1 2 3 4 5 6 240.600 240.100 240.100 240.100 240.000 244.11 238.23 244.11 238.23 244.13 101.46 99.22 101.67 99.22 101.72 120 288.000 285.29 99.06 288.20 285.29 0.001 1 2 3 288.200 288.400 285.29 285.29 98.99 98.92 Tabla 4 Linealidad del o todo potenciométrico. métod para Nimesulida, mé 33 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 34 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA GRAFICA: LINEALIDAD DEL METODO Gráfica 7 Linealidad del método para Nimesulida, método potenciométrico b= 2.764 m= 0 876 r=0.9997 r2= 0.9993 Cumple con los criterios de aceptación: SI LIN EA LID AD DE L M ET OD O P AR A N IME SU LID A M ET OD O PO TE NC IOM ET RIC O y = 0 .98 76x + 2 .76 43 R2 = 0 .99 93 050100150200250300350 0 50 100 150 200 250 300 350 mg Ad icio nad os mgRecuperados .9 34 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 35 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA REPRODUCIBILIDAD DEL METODO Analista Resultados en % Día 1 2 1 99.22 101.631 101.631 101.588 101.715 99.26 101.631 99.26 2 101.588 101.631 101.67 101.631 Tabla 5. Reproducibilidad del método p Nimesulida, método potenciométrico X= 101.04 σ= 1.08 C.V.= 1.07 Cumple con los criterios de aceptación: SI TABLA DE ANALISIS DE VARIANZA Fuente variación Gra ara dos de de Libertad Suma de Cuadrados Cuadrado F calc da F tablas medio u al de Analista 1 0.38 0.38 0.78 18.51 Día 2 0.97 0.49 0.34 4.46 Error 8 11.5 1.44 Total 11 12.85 Tab nálisis varian a Nimesulida, métod potenciométrico Cumple con los criterios de aceptación: SI la 6 A de za par o 35 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 36 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 7.2 MÉTODO POR ESPECTROFOTOMETRIA UV. INEALIDAD DEL SISTEMA L Espectro1. Linealidad del sistema de medición para Nimesulida, método espectrofométrico 36 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 37 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA LINEALIDAD DEL SISTEMA Linealidad del sistema de medición para Nimesulida. NIVEL Concentración Replica RESPUESTA Media SD CV ( %) (%) [ mg / mL ] Abs 40 4.0000 0.18601 0.189 0.00258 1.37 1 2 3 0.19112 0.18922 60 6.0000 0.28308 0.284 0.00078 0.28 1 2 3 0.28459 0.28419 80 8.0000 0.37360 0.376 0.00372 0.99 1 2 3 0.37342 0.37996 100 10.0000 0.46727 0.469 0.00231 0.49 1 2 3 4 5 6 0.46785 0.47077 0.46696 0.47156 0.47209 120 12.0000 0.56365 0.561 0.00250 0.45 1 2 3 0.55866 0.56084 140 14.0000 0.65360 0.655 0.00161 0.25 1 2 3 0.65500 0.65682 Tabla 6 Linealidad del sistema de para Nimesulida, método medición espectrofotométrico. 37 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 38 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA GRAFICA: LINEALIDAD DEL SISTEMA b= 0.004 m= 0.0465 r=1.00 Cumple con los criterios de aceptación: SI ES PE CT RO FO TO ME TR IA U V y = 0 .0 46 5x + 0 .0 04 R2 = 1 00.10.20.30.40.50.60.7 0 2 4 6 8 10 12 14 16 ug /m L Abs LIN EA LID AD D EL SI ST EM A PA RA N IM ES UL ID A Grafica 8. Linealidad del sistema de medición para Nimesulida, método espectrofométrico br= 0.0089 mr=0.9915 r2=1.00 38 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 39 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA PRECISIÓN DEL SISTEMA AL 100% Precisión del sistema para Nimesulida # RE RESPUESTA (ABS) PLICA 1 2 3 4 5 6 0.46727 0.46785 0.47077 0.46696 0.47156 0.47209 Tabla 6. Presición de stema para Nimesulid o potenciométrico. x= 0.469 σ= 0.00231 C.V.= 0.49 Cumple con los criterios de aceptación: SIXACTITUD AL NIVEL100% xactitud del método para Nimesulida NO. REPLICA % RECU RADO X DESVIACION C.V. l si a, métod E E PE 1 2 3 4 5 6 100.55 99.94 100.90 101.06 99.08 100.52 100 34 0.728846 0.728846 . Tabla 7. Exact método para Nimesulida, método potenciométrico % de Recobro= 97-103% x= 100.34% C.V.= 0.73 Cumple con los criterios de aceptación: Si itud del 39 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 40 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA LINEALIDAD DEL MÉTODO Espectro 2. Linealidad del método para Nimesulida, método espectrofométrico muestras de los niveles 120, 140y 40 % 40 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 41 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA LINEALIDAD DEL MÉTODO Espectro 3. Linealidad del método para Nimesulida, método espectrofométrico muestras de los niveles 100, 80y 60 % 41 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 42 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA LINEALIDAD DEL MÉTODO Linealidad del método para Nimesulida. Nivel Replica m adicionados g (X) Mg (Y) % Medi rec. a Media CV rec osuperad(%) número X Y Y 40 102.15 20.16 20.18 1.50 1 2 3 4 5 6 20.300 20.200 20.100 20.100 20.100 20.000 20.74 19.85 20.19 20.14 20.15 19.98 98.29 100.46 100.18 100.24 99.91 60 28.70 30.65 0.52 1 2 3 4 5 6 30.500 30.500 30.400 30.400 30.400 30.000 30.76 30.78 30.68 30.68 30.66 30.34 100.84 100.92 100.92 100.91 100.85 101.14 80 40.08 39.92 0.90 1 2 3 4 5 6 40.400 40.000 40.100 40.000 40.000 40.000 40.54 39.60 40.12 39.62 39.88 39.75 100.35 98.99 100.05 99.06 99.71 99.37 100 100.55 1 2 3 4 5 6 50.100 50.000 50.300 50.300 50.000 50.000 50.38 49.97 50.75 50.83 49.54 50.26 99.94 100.90 101.06 99.08 100.52 50.12 50.29 0.97 120 60.03 59.08 0.30 1 2 3 4 5 6 60.000 60.000 60.000 60.200 60.000 60.000 58.91 58.87 59.27 59.21 59.00 59.24 98.19 98.11 98.78 98.36 98.34 98.73 140 102.15 70.08 70.23 1.19 1 2 3 4 5 6 70.000 70.100 70.100 70.100 70.100 70.100 71.51 68.90 70.42 70.23 70.27 70.04 98.292 100.46 100.18 100.24 99.91 Tabla 7 Linealidad del método p mesulida, método espectrofotométrico. ara Ni 42 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 43 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA GRAFICA: LINEALIDAD DEL METODO Gráfica 9. Linealidad del método para Nimesulida, método espectrofométrico b= 0.2656 m= 0.9923 r=0.9997 r2= 0.9995 Cumple con los criterios de aceptación: SI LIN EA LID AD DE L M ÉT OD O P AR A N IME SU LID A M ÉT OD O ES PE CT RO FO TO ME TR ICO y = 0.9 923 x + 0.2 656 R2 = 0 .99 95 01020304050607080 0 20 40 60 8 mg Ad icio nad os 0 mgRecuperados 43 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 44 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA REPRODUCIBILIDAD DEL METODO Analista Resultados en % Día 1 2 1 100.13 101.19 99.868 99.828 99.491 101.29 99.373 99.75 2 99.54 99.431 99.96 100.0 Tabla 8. Reproducibilidad del método para Nimesulida, método X= 99.99 σ= 0 3 C.V.= 0.63 Cumple con los criterios de aceptación: SI TABLA DE ANALISIS DE VARIANZA Fuente variación Grado espectrofotométrico .6 Suma de Cuadrado s Cuadrados medio de de Libertad F calc da F tablas u al de Analista 1 0.38 0.38 1.69 18.51 Día 2 0.97 0.49 2.26 4.46 Error 8 11.5 1.44 Total 11 12.85 Tabla lisis d rianza imesuli , método pectrofot étrico Cumple con los criterios de aceptación: SI 9 Aná e va para N da es om 44 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 45 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA REPRODUCIBILIDAD DEL METODO nalista 1: Día 1 A Espectro 4. Reproducibilidad del método para Nimesulida, método espectrofométrico 45 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 46 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA REPRODUCIBILIDAD DEL METODO nalista 2: Día 1 A Espectro 5. Reproducibilidad del método para Nimesulida, método espectrofométrico 46 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 47 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA REPRODUCIBILIDAD DEL METODO nalista 1: Día 2 A Espectro 6. Reproducibilidad del método para Nimesulida, método espectrofométrico 47 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 48 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA REPRODUCIBILIDAD DEL METODO nalista 2: Día 2 A Espectro 7. Reproducibilidad del método para Nimesulida, método espectrofométrico 48 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 49 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA ESTÁNDAR UTILIZADO EN LA REPRODUCIBILIDAD DEL METODO-DIA 1 ESTÁNDAR UTILIZADO EN LA REPRODUCIBILIDAD DEL METODO-DIA 2 49 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 50 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 8. COMPARACION DE LOS METODOS REPETITIBILIDAD EN EXACTITUD: METODO A (UV) METODO B (POTENCIOMETRICO) 1 100.55 101.72 2 99.94 101.46 3 100.90 99.22 4 101.06 101.67 5 99.08 99.22 6 100.52 101.72 ∑y 602.05 605.01 ∑y2 0541 60413.3565 61014. n 6 6 S2 0.53121 1.57415 S12 menor S22 mayor F0.025,n2-1,n1-1 0.14 F0.975,n2-1,n1-1 7.15 T a 9. Compar métodos, repetitibilidad en exactitud valo de confianza ≤ σ22/σ12≤ 21.1875 Los parámet de desempe s métodos son igua lo que se puede usar indistintame Ya que el in e confianza incluye Los cálculos fectuaron de exo 1 abl ación de Inter 0.4148 ros ño de lo les por nte. tervalo d el 1. se e acuerdo al an 50 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 51 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA REPETITIBILIDAD EN LINEALIDAD DEL METODO A (UV) METODO B (POTENCIOMETRICO) METODO Cantidad adicionad mg mg a Cantidad recuperada % de recobro % de recobro Cantidad adicionada Cantidad recup mg erada mg 20.3 20.74 102.15 101.1 96.0 97.06 20.2 19.85 96.1 97.06 98.29 101.0 20.1 20.19 96.0 97.06 100.46 101.1 20.1 20.14 144.2 144.1 100.18 99.94 20.1 20.15 100.24 99.94 144.2 144.1 20.0 19.98 99.91 99.8 144.3 144.01 30.5 30.76 100.84 100.89 192.4 194.11 30.5 30.78 100.92 102.1 192.5 197.05 30.4 30.68 100.92 100.84 19.5 194.12 30.4 30.68 100.91 99.22 216.4 214.71 30.4 30.66 100.85 100.62 216.3 217.64 30.0 30.34 101.14 99.49 215.8 214.7 40.4 40.54 100.35 101.72 240.0244.12 40.0 39.6 98.99 101.46 240.6 244.12 40.1 40.12 100.05 99.22 240.1 238.23 40.0 39.62 99.06 101.67 240.1 244.12 40.0 39.88 99.71 99.22 240.1 238.23 40.0 39.75 99.37 101.72 24.0 244.13 50.1 50.38 100.55 99.06 288.0 285.29 50.0 49.97 99.94 98.99 288.2 285.29 50.3 100.9 98 9 50.75 .92 288.4 285.2 50.3 50.83 101.06 50.0 49.54 99.08 50.0 5 100.52 0.26 60.0 58.91 98.19 60.0 58.87 98.11 60.0 59.27 98.78 60.2 59.21 98.36 60.0 59.0 98.34 60.0 59.24 98.73 70.0 71.51 102.15 70.1 68.9 98.029 70.1 70.42 100.46 70.1 70.23 100.18 70.1 70.27 100.24 70.1 70.04 99.91 ∑y 3 598.1032 2108.02 ∑y2 359 53 668.61 21 2 1629.75 n 36 22 S2 1 .203381 45 9.1043801 F0.02 1-1 5,n2-1,n 0.32 F0.97 1-1 5,n2-1,n 3.36 Tabla 10. Compara e método titibilid inealidad del método ción d s, repe ad en l 51 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 52 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA Intervalo de confianza no incluy idad, por que cumple con las especificaciones puede hacer uso indistinto de los méto s. 122. ≤ σ22/σ12≤ 1.8806 Los cálculos se efe n de ac l anexo 2 PRECISIÓN DEL MÉTODO ETODO A METODO B e la un lo y se do 0838 128 ctuaro uerdo a M DIA A A1 A2 1 A2 DIA 1 100.13 99.868 99.828 101.19 101.29 99.22 101.631 101.588 101.631 101.715 99.26 99.491 1 99.373 99.75 101.631 2 99.54 99.431 99.96 100.0 2 101.588 101.631 99.26 101.67 101.631 ∑y 1199.851 ∑y 1212.456 ∑y2 6.978 119974.5958 ∑y2 12251 n 1 12 2 n SA2 0.399448 SB2 1.1680627 F0.025,11,11 0.29 F0.975,11,11 3.47 Tabla 11. Comparación de métodos, repetitibilidad en precisión del método tervalo de confianza 0.8480 σ22/σ12 .146944 Como intervalo ianza l 1, los parámetros de desempeño por lo tanto los m se pue indistintamente. Los cálculos se efectuar anexo 3 In 15 ≤ ≤ 10 el de conf incluye e son iguales étodos den usar on de acuerdo al 52 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 53 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 9. ANALISIS DE RESULTADOS: Linealidad del sist MET .5 % y al compararlos con los criterios de a tación, este parámetro cumple con las especificaciones ya que la concentración es directamente proporcional a la unidad de respuesta del sistema de odo espectrofotometrico umple con los criterios establecidos. ema: ODO POTENCIOMETRICO: De acuerdo a los resultados obtenidos, r2= 0.9992 , CV≤ 1 cep medición, de igual manera el Mét c Linealidad del método: Se realizo un grafico de mg adicionados VS mg recuperados, al cual se determinó el le con los criterios ya que el valor de 2= 0.9993, CV≤ 1.5 % este parámetro asegura la proporcionalidad directa sobre el tervalo de trabajo. Para el caso del Método espectrofotometrico cumple con el riterio de aceptación. coeficiente de correlación, este coeficiente cump r in c Precisión del sistema al 100% rico como el espectrofotométrico, son precisos ya que mbos cumplen con los criterios de aceptación ya que ninguno sobrepasa el 1.5 % con Tanto el método potenciomét a respecto al CV. Exactitud y Repetitibilidad: METODO POTENCIOMETRICO: Es exacto ya que la media del porcentaje de recobro tiene un valor de 100.84% y el rango para el criterio de aceptación es de 98-102%, también cumple con CV≤ 1.5 % METODO ESPECTROFOTOMETRICO: Este método tiene un rango mas amplio de 97-103% el valor de la media cae dentro del rango al tener un para el porcentaje de recobro, valor de 100.34% y no sobrepasar el límite del CV≤2%. Reproducibilidad: Ambos métodos son reproducibles ya que al realizar el análisis de varianza resulta que los diferentes analistas no interfieren con la reproducibilidad del método. 53 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 54 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA Comparación de métodos: Al realizar el análisis de varianza para determinar si los parámetros de desempeño son iguales, resulta que cumple con los criterios establecidos para dichos parámetros, por lo tanto los métodos se pueden usar indistintamente, ya que esta arámetros reales y documentados. 4. Reproducible usar indistintamente, ya que se cumple con los por el método potenciométrico. El método se puede usar como método rutinario de control, ya que las étodo espectrofotométrico ya que este facilita el análisis acortando el tiempo y cantidad de muestra. en la industria farmacéutica se requiere de análisis rápidos pero sempeño y el método espectrofotométrico ecesidades para la empresa. justificada su comparación con p 10. CONCLUSIONES: Mediante los resultados obtenidos durante el proceso de validación se puede afirmar que se cumplen con las especificaciones señaladas de cada parámetro por que el método es: 1. Lineal 2. Preciso 3. Exacto Los métodos se pueden parámetros necesarios para el uso indistinto de ellos. El método espectrofotométrico mediante la validación y comparación cumple con las especificaciones señaladas, el cual se desea remplazar instalaciones y equipos son adecuados para la reproducibilidad de este. Se prefiere el uso del M Como se sabe de calidad aceptada para su de satisface esas n 54 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 55 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 11. BIBLIOGRAFIA: éxico (2000). 2. Ley General de Salud (1997). xicana NOM-059-SSAA-1993, Buenas Practicas de Fabricación para establecimientos de la industria químico farmacéutica dedicados a la 5. Guía de Validación de Métodos Analíticos, 1ª Edición de Mayo2002. Iberoamericana. 3ª Ed. México (1991). 8. European Pharmacopoeia, 5th Edición, Vol. II, pp. 2101-2102 1. Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, 7ª Ed. M 3. Reglamento de Insumos para la Salud. 4. Norma Oficial Me fabricación de medicamentos. 6. British Pharmacopoeia. Monograph Development: Methods of Analysis. Version en CD-ROM, 1998. 7. Diseño y Análisis de experimentos, Montgomery D.C. Grupo editorial 55 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 56 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 12. ANEXOS Modelos de cálculo. ANEXO 1 56 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 57 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 57 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 58 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA ANEXO 2 58 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 59 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 59 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 60 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 60 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 61 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA ANEXO 3 61 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 62 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 62 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALpág 63 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA TABLAS 63 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 64 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 64 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 65 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 65 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 66 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 66 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 67 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 67 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL pág 68 UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA 68 caratula TRABAJOESTANCIA
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