Alvarado-Palacios-Quetzaliztli

Vista previa del material en texto

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL 
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA 
DE BIOTECNOLOGIA 
 
 
 
Producción de vitamina B12 por fermentación líquida y 
su cuantificación por Electroforesis Capilar. 
 
 
Informe técnico de la opción curricular en la modalidad de: 
 
 
Proyecto de Investigación 
 
 
Para obtener el título de Ingeniero Farmacéutico. 
Presenta 
 
Alvarado Palacios Quetzaliztli Gloria 
 
 
 
Director de Proyecto: 
M. en C. Yolanda de las Mercedes Gómez y Gómez 
 
 
 
México, D.F. Mayo 2009. 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
“Mas ahora ya no se puede mirar la luz esplendente en los cielos, luego que pasa el 
viento y los limpia, viniendo de la parte del norte la dorada claridad” Job 21, 22 
 
 A Dios 
Le agradezco infinitamente por permitirme llegar hasta este nivel, por ser mi 
inspiración y mi motivo a vivir; por ser mi esperanza y fuerza a cada paso que doy. 
 
A mi Papito 
Por ser la persona que me enseñó las bases de la vida y a tener siempre la frente en 
alto a pesar de las circunstancias, aprendo a cada día de Ti que lo más importante 
es mantener el carácter para defender mis ideales y principalmente a “esforzarse y 
ser valiente” 
 
A mi mamá 
Por tus oraciones que a diario haces por mí, tu comprensión, ayuda y sabiduría que 
has compartido conmigo, porque siempre has estado a mi lado y tu bendición de 
siempre “que el Señor haga resplandecer su rostro sobre Ti” 
 
A mi hermano 
Por ser el mejor del mundo, nunca te cambiaría por nada en la vida, un gran ejemplo 
de perseverancia, paciencia, dedicación y entrega para alcanzar los objetivos que 
me propongo y tú, mi competencia que hace más interesante el porvenir 
 
A mi hermana 
Por ser la niña más Linda, que contigo a mi lado he vencido muchos problemas y 
siempre hemos salido adelante, tú mi apoyo incondicional que a pesar de las 
adversidades tú y yo juntas triunfaremos. 
 
A mis abuelos pero principalmente a mi abuelita Aida V.L. 
Que siempre has estado conmigo en los momentos buenos, pero también en los 
más difíciles de mi vida, mi cariño por ti jamás cambiará. 
 
“Los ambiciosos buscaban transmutar los metales en oro, pero ¿qué querían 
transmutar los más ambiciosos? Se hablaba de la búsqueda de la piedra filosofal, 
pero la piedra que rechazaron los edificadores, ha venido a ser cabeza del ángulo”. 
Y piedra es: 
 
nun beth aleph = piedra 
50 + 2 + 1 = 53 
 
nun beth = ben beth aleph = aba 
¿Qué otras palabras suman 53?... 
 
 
 
"Yo quiero conocer los pensamientos de Dios, el resto son detalles." 
Einstein 
 
 
A la profesora y M. en C. Yolanda Gómez y Gómez 
Por ser la persona que contribuyó plenamente para la realización de este 
trabajo y que ha iniciado mi formación como investigadora y que gracias a 
ella; a sus consejos, paciencia, observaciones, asesorías y esfuerzo fuí 
aprendiendo grandes cosas a lo largo de este proyecto. 
 
 
Al profesor y M. en C. Carlos Orozco Álvarez 
Por aceptar ser evaluador de este trabajo, que ha destinado de su tiempo y 
por su valiosa ayuda en cuanto a sus observaciones, críticas y asesorías 
que han logrado grandes mejoras. 
 
 
Al profesor el I.Q. Luis Francisco Esquivel Ruiz 
Por ser la persona que ha contribuido con sus correcciones, y 
observaciones desde un enfoque Químico y lo cual se ha visto reflejado en 
este trabajo. 
 
 
También quiero agradecer a mis amigos que siempre estuvieron conmigo 
apoyándome algunos cerca y otros más, aun estando lejos de mí 
físicamente, pero sé que su apoyo siempre estuvo conmigo “Jazmín, Citlalli, 
Ami, Lulú, Adrian, Felipe, Axa, Lazcano, Denis, Tania, Arturo, Luis, Nidia, 
David.” 
 
 
Y por último, pero no por esto ser las menos importantes, agradezco su 
ayuda a Vero y a Elsa por todo el tiempo que dedicaron para hacer posible 
este proyecto. 
 
 
 
 
 
 “Y como el vacío está contenido en el Universo, 
Así también los pensamientos quedarán fusionados en uno mismo 
Cuando por fin se logre alcanzar la perfección”. 
Quetzaliztli 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PRODUCCIÓN DE 
VITAMINA B12 POR 
FERMENTACIÓN 
LÍQUIDA Y SU 
CUANTIFICACIÓN POR 
ELECTROFORESIS 
CAPILAR 
 
PRODUCIDA POR: 
 
 Propionibacterium freudenreichii shermanii 
 
 
 
 
 
 
 
 
ÍNDICE 
 
 
INTRODUCCIÓN....................................................................................................11 
 
1.1 Vitamina B12...................................................................................................11 
 
1.2 Pruebas de identidad de la cianocobalamina ...........................................13 
 
1.3 Síntesis de cianocobalamina.......................................................................16 
 
1.4 Importancia de la vitamina B12...................................................................17 
 
1.5 Inductor..........................................................................................................18 
 
1.6 Electroforesis capilar...................................................................................20 
 
 1.6.1. Fundamento...........................................................................................20 
 
 1.6.2. Ventajas de la electroforesis capilar....................................................25 
 
1.7 Metabolitos....................................................................................................26 
 
 1.7.1. Metabolitos primarios............................................................................26 
 
 1.7.2. Metabolitos secundarios.......................................................................26 
 1.8 Fermentación......................................................................................26 
 
 1.8.1. Fermentación líquida...................................................................26 
 
 1.8.2. Fases de una fermentación.........................................................28 
 
 1.8.2.1. Fase Lag..............................................................................28 
 
 1.8.2.2. Fase temporal de aceleración............................................28 
 
 1.8.2.3. Fase de crecimiento exponencial......................................28 
 
 1.8.2.4. Fase estacionario................................................................28 
 
 1.8.2.5. Fase de muerte....................................................................28 
 
 1.8.3. Utilidades y ventajas de una fermentación...............................28 
 
 1.8.4. Desventajas de una fermentación..............................................29 
 
 1.9. Producción de vitamina B12 a partir de Propionibacterium freuden 
 reichii ...........................................................................................................29 
 
2. OBJETIVOS..............................................................................................................31 
 2.1. Objetivo general...................................................................................31 
 
 2.2. Objetivos particulares.........................................................................31 
 
 3. JUSTIFICACIÓN.........................................................................................31 
 
 4. DESARROLLO EXPERIMENTAL................................................................32 
 
 4.1. Material y métodos.............................................................................32 
 
 4.2. Metodología.........................................................................................324.3. Características de la cepa..................................................................34 
 
 4.4. Preparación de una solución isotónica al 0.9% de NaCl................36 
 
 4.5. Preparación de la solución de NaOH al 1M......................................36 
 
 4.6. Preparación del inóculo.....................................................................36 
 
 4.7. Preparación de la solución de KCN al 1M........................................36 
 
 4.8. Preparación del reactivo DNS............................................................37 
 
 4.9. Curva tipo para cuantificar azúcares residuales por la técnica de 
 Ac 3,5 DNS..................................................................................................37 
 
 4.10. Cuantificación de azúcares residuales..........................................37 
 
 4.11. Reacción de KCN a cada muestra………………….........................38 
 
 4.12. Determinación de biomasa y la [x]=[g/l].........................................38 
 
 4.13. Curva tipo de vitamina B12...............................................................38 
 
 4.14. Preparación de muestras en los viales...........................................39 
 
 5. EQUIPO DE ELECTROFORESIS CAPILAR..............................................39 
 
 6. RESULTADOS Y ANÁLISIS…...................................................................42 
 
 6.1 Fermentación ......................................................................................42 
 
 6.1.1. Determinación de Biomasa.........................................................42 
 
 6.1.2. Determinación de pH....................................................................44 
 
 6.1.3. Determinación de azúcares reductores......................................45 
 
 6.1.4. Cuantificación de la producción de vitamina B12 por 
 electroforesis capilar....................................................................47 
 
 6.1.4.1. Determinación presencia de vitamina B12 por 
 electroforesis capilar..........................................................49 
 
 6.2 Fermentación .......................................................................................52 
 
 6.2.1. Determinación de biomasa..........................................................52 
 
 6.2.2. Determinación de pH....................................................................53 
 
 6.2.3. Determinación de azúcares reductores......................................54 
 
 6.2.4. Cuantificación de la producción de vitamina B12 por 
 electroforesis capilar...................................................................56 
 
 6.3. Fermentación .....................................................................................58 
 
 6.3.1. Determinación de biomasa.........................................................58 
 
 6.3.2. Determinación de pH...................................................................59 
 
 6.3.3. Determinación de azúcares reductores.....................................60 
 
 6.3.4. Fermentación por triplicado……………...………………………..62 
 
 7. DISCUSIÓN DE RESULTADOS …………..………………….………………64 
 
 8. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS.........................................................66 
 
 9. REFERENCIAS............................................................................................67 
 
 10. SECCIÓN DE ANEXOS.............................................................................70 
 
 ANEXO 1...................................................................................................70 
 
 ANEXO 2...................................................................................................73 
 
 ANEXO 3...................................................................................................74 
 
 ANEXO 4..................................................................................................75 
 
 ANEXO 5..................................................................................................76 
 
 ANEXO 6..................................................................................................77 
 
 ANEXO 7..................................................................................................78 
 
 ANEXO 8..................................................................................................79 
 
 ANEXO 9..................................................................................................79 
 
 ANEXO 10................................................................................................80 
 
 ANEXO 11................................................................................................82 
 
 ANEXO 12................................................................................................83 
 
 ANEXO 13................................................................................................84 
 
 ANEXO 14................................................................................................85 
 
 ANEXO 15................................................................................................85 
 
 ANEXO 16................................................................................................86 
 
 GLOSARIO………………….……………..…………………………………...86 
 
 11. PRODUCTOS …………………………..……….………………………..……87 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PRODUCCIÓN DE VITAMINA B12 POR FERMENTACIÓN LÍQUIDA Y SU CUANTIFICACION 
POR ELECTROFORESIS CAPILAR 
Alvarado-Palacios, Quetzaliztli; Medina-Rosas, Axayacatl ;Gómez-Gómez, Yolanda, Bautista- Ramírez, Esther; 
Salazar-Arredondo, Elsa 
Departamento de Bioprocesos (Laboratorio de Farmacología) de la Unidad Interdisciplinaria de Biotecnología del 
Instituto Politécnico Nacional, Teléfono 57-29-60-00 Ext. 56390. Correo electrónico ygomezipn@hotmail.com. 
 
Área temática: Biotecnología Farmacéutica 
Palabras clave: Vitamina B12, Electroforesis capilar, Propionibacterium freudenreichii. 
 
Introducción. Dentro del enfoque farmacéutico de la biotecnología 
se busca la producción de productos biológicos de interés con la 
participación de un organismo vivo; algunos de dichos productos, 
tienen intereses de tipo médico y clínico, tales como la producción 
de la vitamina B12; puesto que es de gran importancia en procesos 
biológicos dentro del cuerpo humano, por su participación dentro 
de diversas reacciones metabólicas. El interés de una producción a 
gran escala de dicho compuesto, radica en la prevención y 
combate de enfermedades tales como la anemia perniciosa. 
Objetivo. Producción de vitamina B12 por Propionibacterium 
freudenreichii shermanii en fermentación líquida y su cuantificación 
por Electroforesis Capilar. 
Metodología. Para la biosíntesis de cianocobalamina, con 
Propionibacterium freudenreichii shermanii CDBB: 581 adquirida 
en el cepario del CINVESTAV- IPN, se utilizó Medio formulado con 
glucosa, betaína, fosfato y sulfato de amonio, sulfato de magnesio 
y zinc, cloruro de cobalto, sulfato ferroso y manganoso, glicina, 
extractode levadura, hidrolizado de caseína, ácido pantoténico y 
láctico; ajustado a pH de 6.5 y esterilizado a 15 lbs. Durante 15 
min. Se incubo a 28°C durante 72 horas sin agitación (fase 
anaerobia) y 72 horas con agitación (fase aerobia). Cada 24 horas 
se tomaron muestras, las cuales fueron filtradas. En cada muestra 
se determino pH, biomasa por peso seco, azúcares por DNS y la 
concentración de B12. La determinación de vitamina B12 se realizó 
en un equipo de Electroforesis capilar Beckmam P/ACE MDQ, con 
un detector de arreglo de diodos (PDA), utilizando un capilar de 
sílica fundida de 50 cm de longitud y un diámetro interior de 75 
micras. Las muestras se inyectaron a 0.5 psi por 10 s, el voltaje de 
separación fue de 28 Kv y se detectó a 214 nm de longitud de 
onda. El buffer de corrida utilizado fue de boratos 30 mM con un 
pH de 10. 
 
 
Resultados y discusión. El tiempo de detección de 
cianocobalamina fue a los 5 minutos y la producción en el medio 
utilizado es de 20.5 g/ml. Los límites de detección en nuestro 
equipo fue de 3.12 g /mL, el coeficiente de correlación de 0.998. 
 
 
Ilustración 1 Lectura de estándar de vitamina B12 por método de 
electroforesis capilar. 
 
Ilustración 2 Medio de producción con vitamina B12. 
Conclusiones y perspectivas. La cianocobalamina se logro 
producir por biosíntesis a partir de Propionibacterium freudenreichii 
shermanii; e igualmente se logro su determinación directamente 
del medio de producción a partir de la aplicación de la técnica de 
electroforesis capilar, con un tiempo corto de detección; y esto no 
solamente debido al corto periodo de corrimiento para la detección 
de la curva representativa de la cianocobalamina, sino también por 
la manifestación de características peculiares como indicadores de 
la presencia del metabolito; tales como el vire en el color del medio 
o el cambio del pH. La metodología realizada constituye un 
procedimiento alternativo de la producción y determinación del 
metabolito buscado; por tanto las bases de una nueva técnica que 
posteriormente podría llegar a convertirse en un proceso industrial 
a mayor escala y con resultados satisfactorios. 
Referencias. 
1. P. Kiatpapan · Y. Murooka Construction of an expression vector 
for Propionibacterium and its use in production of 5-aminolevulinic 
acid by Propionibacterium freudenreichii. Appl Microbiol Biotechnol 
(2001) 56:144–149 DOI 10.1007/s002530100603 Published online: 
18 May 2001. 
2. Quesada-Chanto, A.C. Schmid-Meyer, A.G. Schroeder, M.F. 
Carvalho-Jonas, I. Blanco and R. Jonas*. Effect of oxygen supply 
on biomass, organic acids and vitamin B12 production by 
Propionibacterium shermanii World Journal of Microbiology & 
Biotechnology 14, 843±846
Ilustración 3. Equipo de Electroforesis capilar 
Beckmam P/ACE MDQ 
mailto:ygomezipn@hotmail.com
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página 11 
1. INTRODUCCIÓN 
1.1. VITAMINA B12 
 
Las vitaminas hidrosolubles no pueden ser almacenadas por el cuerpo, pero la 
vitamina B12 es especial, porque el cuerpo la puede almacenar por años en el 
hígado. Debido a esto, una deficiencia de vitamina B12 es muy rara. La vitamina 
B12, al igual que las otras vitaminas del complejo B, es importante para el 
metabolismo, ayuda a la formación de glóbulos rojos en la sangre y al 
mantenimiento del sistema nervioso central ( Goldman L, 2004). 
La cianocobalamina o vitamina B12 es un complejo hexacoordinado de cobalto. 
Cuatro posiciones de coordinación están ocupadas por un macro ciclo de corrina. 
Una de las posiciones axiales se completa con un grupo cianuro (CN-). Una 
cadena lateral del anillo de corrina compuesta por una amida, un grupo fosfato, 
una ribosa y un nucleótido completa la coordinación a través del resto 5,6-
dimetilbenzimidazol en su extremo(fig. 1), es una vitamina hidrosoluble (Raux E, 
2002) 
La vitamina B12 se absorbe por dos mecanismos, en primer lugar, lo hace por un 
mecanismo de difusión pasiva, que le permite ser absorbida por la mucosa del 
intestino, mediante este mecanismo pasivo sólo se absorbe el 1% de la vitamina 
B12 presente. El mecanismo activo es más importante, ya que en este caso la 
vitamina debe combinarse con el factor intrínseco, que es una glucoproteína 
secretada por células de la pared y del fondo del estómago. Una molécula de 
factor intrínseco fija dos moléculas de vitamina B12, formando un complejo que la 
protege de la degradación por las enzimas intestinales (Roth, J. R., Wersig C., 
Shemin, D, Cobalamin, 1996). 
Este complejo finalmente se fija sobre receptores específicos situados en la 
porción terminal del íleon. La fijación del complejo factor intrínseco- vitamina B12 
necesita un pH > 5,6 y la presencia de iones Ca++ o Mg++. La vitamina B12 es 
liberada de este complejo, la vitamina B12 presente en la célula intestinal penetra 
en el enterocito por medio de una difusión activa, abandonando así al factor 
intrínseco, que queda retenido en la luz intestinal (Skoog W, 1990). 
Luego de su penetración intracelular, aparece en los microsomas y en las 
mitocondrias donde sufre una transformación, por lo menos parcialmente, en 
coenzima B12. La fijación del complejo factor intrínseco- vitamina B12 es rápida; sin 
embargo, la absorción de la vitamina es lenta. De este modo, transcurren varias 
horas hasta registrarse su aparición en la vena porta, siempre unida a las 
proteínas transportadoras, las transcobalaminas, se han determinado tres de éstas 
 
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/002257.htm
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/002311.htm
http://es.wikipedia.org/wiki/Complejo_met%C3%A1lico
http://es.wikipedia.org/wiki/Cobalto
http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Corrina&action=edit&redlink=1
http://es.wikipedia.org/wiki/Cianuro
http://es.wikipedia.org/wiki/Amida
http://es.wikipedia.org/wiki/Fosfato
http://es.wikipedia.org/wiki/Ribosa
http://es.wikipedia.org/wiki/Nucle%C3%B3tido
http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Dimetilbenzimidazol&action=edit&redlink=1
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 12 
- 
 
las Transcobalaminas I, II y III, la vitamina B12 fijada a la transcobalamina 
abandona rápidamente el plasma y se distribuye con preferencia en las células 
del parénquima hepático. En el adulto, hasta el 90% de las reservas de 
vitamina B12 se encuentran en el hígado. La bilis es la principal vía de excreción 
de la vitamina B12 (Buchanan, 2007). 
Las 2/3 partes de la vitamina B12 se excretan por vía biliar y se reabsorben 
luego por la mucosa íleal, formándose de este modo un ciclo enterohepático. El 
resto es eliminado por las materias fecales, pudiendo aumentar la cantidad de 
vitamina B12 en las mismas por la descamación de las células epiteliales del 
tubo digestivo y también por la síntesis efectuada por las bacterias presentes 
en el colon. En condiciones normales, la excreción de vitamina B12 en la orina 
aumenta cuando se administra cobalamina exógena. Eliminación biliar; de ésta 
se recupera el 65-75% al entrar en la circulación enterohepática (Ellenbogen L, 
1984). 
El mecanismo de acción de ésta vitamina permite absorber una cantidad de 
vitamina B12 mayor que la requerida. El excedente se almacena sobre todo en 
el hígado. La importancia de los depósitos corporales se pone en evidencia por 
el hecho de que la anemia megaloblástica aparece recién después de 2-4 años 
de la ingestión de una dieta carente de vitamina B12 ó una gastrectomía total. 
Funciones nutricionales:La vitamina B12 se halla relacionada con el 
metabolismo del ácido fólico y con reacciones de isomerización vinculadas con 
el metabolismo de los lípidos y de las proteínas. 
La metil-cobalamina actúa como cofactor en la transferencia del grupo metilo 
del N5-metil-Tetrahidrofolato (N5-metil-THF) para transformar homocisteína en 
metionina y dejar libre al ácido tetrahidrofólico (ATHF) que se incorpora así a su 
ciclo metabólico. Por éste motivo, los trastornos hematológicos observados en 
la deficiencia de cualquiera de éstas vitaminas son idénticos, porque en ambos 
casos se produce un defecto en la producción de ATHF, necesario para la 
formación de las purinas y pirimidinas del DNA (Buchner E, 2007). 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 13 
- 
 
Fig. 1 Estructura de cianocobalamina 
La fig. 1 representa a la cianocobalamina siendo esta un compuesto 
nitrogenado sumamente complejo, integrado por dos fracciones principales: el 
núcleo corrínico (que incluye cobalto) y el nucleótido adherido (Roman D, 
2002). 
1.2. PRUEBAS DE IDENTIDAD DE LA CIANOCOBALAMINA 
Vitamina B12 
C63H88CoN14O14P 
Co -[ -(5, 6 – dimetilbencinidazolil)] – Co - cianocobamida 
Contiene no menos del 96.0 por ciento y no más del 100 por ciento de 
cianocobalamina, calculado con referencia a la sustancia seca. 
Sustancia de referencia. Cianocobalamina. Antes de su uso secarla sobre gel 
de sílice durante 4 horas. 
Descripción. Cristales rojo oscuros o polvo amorfo cristalino rojo. La forma 
anhidra es higroscópica y cuando se expone al aire puede absorber alrededor 
del 12 por ciento de agua. 
Solubilidad. Soluble en etanol: poco soluble en agua; insoluble en acetona, 
cloroformo y éter (USP, 2007). 
 
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 14 
- 
Ensayos de identidad. 
El espectro de absorción en la región ultravioleta de la solución empleada para 
medir la absorbancia en la valoración exhibe máximos a 278 nm + 1 nm, 361 
nm + 1 nm y a 550 nm + 2 nm 
En una cápsula de porcelana fundir 1.0 mg de la muestra de cianocobalamina 
con 50 mg de pirosulfato de potasio; enfriar disgregar la masa con un agitador 
de vidrio agregar 3.0 ml de agua y disolver con ebullición. Agregar una gota de 
fenolftaleína y gota de solución de NaOH (1:10), hasta color rosa. Agregar 500 
mg de acetato de sodio, 0.5 ml de solución 1N de ácido acético y 0.5 ml de 
solución (1:500) preparada con el reactivo sal nitroso R ( 1 – Nitroso – 2 – 
naftol – 3,6 – disulfonato disódico) : aparece un color naranja – rojo. Agregar 
0.5 ml de ácido clorhídrico y hervir durante 1 minuto, persiste el color rojo 
(USP, 2007). 
En un matraz de destilación de 50 ml conectado a un condensador corto 
enfriado por agua, disolver 5.0 mg de la muestra con 5.0 ml de agua, agregar 
2.5 ml de ácido hipofosforoso, calentar suavemente durante 10 minutos, 
enseguida destilar 1 ml recibiéndolo en un tubo de ensayo, que contiene 1 ml 
de solución (1:50) de hidróxido de sodio. Al tubo de ensayo agregar 4 gotas de 
solución saturada fría de sulfato férrico amónico, agitar suavemente, enseguida 
agregar 30 mg de fluoruro de sodio y llevar el contenido a ebullición (USP, 
2007). 
Agregar gota a gota solución 5 N de ácido sulfúrico hasta que la solución quede 
clara, agregar 3 o 5 gotas más de ácido: después de pocos minutos se produce 
un color azul o azul verdoso. 
Conservación. En recipientes cerrados y protegidos de la luz, a una 
temperatura entre 2 ºC y 30 ºC. 
Absorción de vitamina B12 en el organismo 
 
La vitamina B12 sintetizada por microorganismos ingresa con la comida y para 
absorberse necesita mecanismos especiales de transporte. En el estómago la 
Vitamina B12 está unida a una proteína X de la dieta que el jugo gástrico separa 
y se une a otra proteína R de la saliva. En el duodeno la tripsina digiere la 
proteína R y la Vitamina B12 se enlaza al factor intrínseco FI producido por las 
células parietales del estómago. En el íleon hay receptores específicos para el 
complejo Vit B12-FI el cual es englobado dentro de las células por endocitosis. 
Luego pasa a la sangre y se une a un transportador que la lleva a los sitios 
donde ejerce sus funciones. Cuando hay daño de la mucosa gástrica o 
gastrectomía ocurre anemia megaloblástica por falta de Vitamina B12. 
 
 
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 15 
- 
Representando el aparato digestivo (fig 2), el complejo vitamina B12 y factor 
intrínseco (FI) se forma en el estómago y pasa por la parte superior del 
intestino delgado en dirección del íleon, donde se une a las células epiteliales 
propias de esta zona del intestino y de ese modo facilita la transferencia de 
vitamina B12 hacia el epitelio del íleon. Para ello se requieren asimismo calcio y 
un pH mayor de 6 (Boonkerd, 1994). 
 
 
 
Fig. 2 Aparato Digestivo 
 
 
 
 
 
 
http://www.monografias.com/trabajos15/direccion/direccion.shtml
http://www.monografias.com/trabajos15/proteinas/proteinas.shtml
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 16 
- 
 
 
1.3. SÍNTESIS DE CIANOCOBALAMINA 
En la biosíntesis de la vitamina B12 incluye la síntesis de metionina y acetato, 
como también de los folatos poliglutamatos y en la regeneración del ácido fólico 
durante la formación de los eritrocitos. La vitamina B-12 es la única que 
contiene cobalto, un oligoelemento. Es esencial para el funcionamiento de 
todas las células del cuerpo, especialmente aquellas de la médula ósea, vías 
gastrointestinales y sistema nervioso. 
 
Fig. 3 Síntesis de cianocobalamina 
 
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 17 
- 
 
 
Correspondiente a la fig 3. El esquema propuesto de la trayectoria de la 
vitamina B 12, biosintetizada en Propionibacterium freudenreichii shermanii, con 
los productos del gen indicado, las líneas punteadas describen las trayectorias 
de multipasos, un intermediario es llamado precorrina o precorrina de cobalto, 
si esta procede de la formación del anillo de corrina presentado en un ácido 
cobírico. El número después de la corina de cobalto, da el número de grupos 
metil que han sido introducidos desde 5- Adenosil L- metionina para formar la 
sustancia durante los pasos dirigidos de uroporpirógeno III. Los genes 
interrelacionados de este estudio están indicados por letras negritas (Crane M, 
1994). 
1.4. IMPORTANCIA DE LA VITAMINA B12 
La vitamina B12 es necesaria para el metabolismo normal del tejido nervioso, 
además de estar involucrada en el metabolismo de proteínas, grasas ycarbohidratos. 
Interviene en la síntesis de ADN, ARN y proteínas 
Interviene en la formación de glóbulos rojos. 
Mantiene la vaina de mielina de las células nerviosas 
Participa en la síntesis de neurotransmisores 
Es necesaria en la transformación de los ácidos grasos en energía 
Ayuda a mantener la reserva energética de los músculos 
Interviene en el buen funcionamiento del sistema inmune 
Necesaria para el metabolismo del ácido fólico (Ellenbogen, 1984). 
Causas de la deficiencia: 
Por una inadecuada ingestión, absorción y utilización: 
- Inadecuada absorción: existe cuando la dieta es deficiente en alimentos 
de origen animal, ya que la vitamina B12 no se encuentra en vegetales. 
- Inadecuada absorción: por ausencia de factor intrínseco (anemia 
perniciosa) 
Ingestas recomendadas: La ingesta recomendada de vitamina B12 es de 1-3 
µg/día. Las deficiencias de vitamina B12 ocurren cuando el cuerpo es incapaz 
de utilizarla apropiadamente. Esta incapacidad para absorber esta vitamina 
desde el tracto intestinal puede ser causada por la anemia perniciosa. 
http://www.zonadiet.com/nutricion/acgraso.htm
http://www.zonadiet.com/alimentacion/calorias.htm
http://www.zonadiet.com/nutricion/folico.htm
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/spanish/ency/article/000569.htm
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 18 
- 
Debido a que la vitamina B12 proviene principalmente de los productos 
animales, las personas que siguen dietas vegetarianas estrictas y que no 
consumen huevos o productos lácteos pueden requerir suplementos de esta 
vitamina. (Las fuentes no animales de esta vitamina existen, pero son 
altamente variables en su contenido de B12, por lo que son consideradas 
fuentes no confiables de dicha vitamina). Las personas que se han sometido a 
una cirugía en partes específicas del intestino delgado o del estómago también 
son propensas a presentar una deficiencia si no toman suplementos de esta 
vitamina( Florent J, 1979). 
Los bajos niveles de vitamina B12 pueden causar anemia, entumecimiento u 
hormigueo en brazos y piernas, debilidad y pérdida del equilibrio (Eschenmoser 
A, 1994). 
Algunos medicamentos que contienen vitamina B12: Genérico; Vitamina B12 o 
cobalaminas (hidroxocobalamina, cianocobalamina). Comercial; Dalamon, 
Vitafardi-C-B12, Neurodavur, Neurodavur Plus, Reticulogen fortificado, Optovite 
B12 1000 gammas, Nervobion, Hidroxil. El objetivo es que la vitamina B12 se 
usa en el tratamiento de estados carenciales, anemia perniciosa y anemia 
megaloblástica aunque también se ha utilizado en el tratamiento de diversas 
neuropatías, en esclerosis múltiple y neuralgia del trigémino, diversos 
trastornos psiquiátricos, crecimiento o nutrición inadecuados. Si se ha 
constatado cierta eficacia de un régimen de sostén de vitamina B12 para el 
tratamiento de la aciduría metilmalónica en niños (Woodward R, 1993). 
1.5. INDUCTOR 
Los inductores pueden provocar un aumento en el metabolismo de varias 
sustancias y a su vez una reacción catabólica puede ser inducida por más de 
una sustancia inductora (Herbert V 1988). 
 
Fig. 4 Metabolismo de la vitamina B12. 
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 19 
- 
La 5-desoxiadenosilcobalamina actúa como coenzima activo catalizando la 
reacción en la que el enzima metilmalonil CoA mutasa realiza un 
reordenamiento químico, la conversión de L-metilmalonil CoA en succinil CoA. 
La ausencia de 5-desoxiadenosilcobalamina (figura 4) causa la interrupción de 
esta reacción bioquímica y consecuentemente de toda la vía, de forma que el 
L-metilmalonil CoA, al no poder ser transformado en succinil CoA, se estanca y 
acumula en forma de metilmalonato. 
En la síntesis del aminoácido metionina a partir de la homocisteína, no sólo 
requiere metilcobalamina, sino también folatos como coenzima 
(metiltetrahidrofolato) y la segunda reacción es un paso en el catabolismo del 
propionato, la conversión del metilmalonil CoA a succinil Coa (Yongsmith B, 
1998). 
 
Fig.5 Ruta metabólica vitamina B12 dependiente 
 
Su génesis, a partir de la metionina, sigue una vía de desmetilación. Y su 
metabolismo desemboca en la síntesis de cisteína (vía de transulfuración, vit.B6 
dependiente), o de metionina (2 vías de remetilación, una vitamina B12 - folato 
dependiente y otra betaína dependiente). 
 
 
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 20 
- 
Metilación de la homocisteína a metionina 
Esta reacción es catalizada por la enzima N5 metiltetrahidrofolato-homocisteína 
metil transferasa que se halla íntimamente relacionada con el metabolismo del 
ácido fólico y por lo tanto, con el transporte de unidades de carbono, pues está 
acoplada a la transformación de N5 metiltetrahidrofolato, forma circulante del 
ácido fólico, en tetrahidrofolato. La forma activa de la vitamina B12 en esta 
reacción es la metilcobalamina y su déficit condiciona una disminución del 
tetrahidrofolato o de cualquiera de sus formas activas intracelulares, pero es 
especial del N5N10 metilentetrahidrofolato, cofactor fundamental en la síntesis 
de DNA (Eklund H, 1994). 
Luego, el déficit de cobalaminas producirá una acumulación del folato en forma 
de N5 metiltetrahidrofolato que al quedar atrapado no podrá ser reutilizado. 
Asimismo, la acumulación de homocisteína sería la causa de su eliminación 
urinaria. 
1.6. ELECTROFORESIS CAPILAR 
La electroforesis es un método analítico de laboratorio en el que se utiliza una 
corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoléculas según su 
tamaño y carga eléctrica a través de una matriz. 
1.6.1. FUNDAMENTO 
Cuando una mezcla de moléculas ionizadas y con carga neta son colocadas 
en un campo eléctrico, estas experimentan una fuerza de atracción hacia el 
polo que posee carga opuesta, dejando transcurrir cierto tiempo las moléculas 
cargadas positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y 
aquellas cargadas positivamente se desplazaran hacia el ánodo (el polo 
positivo). 
 
Fig 6. Separación de partículas según su carga y tamaño 
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 21 
- 
 
El movimiento de las moléculas está gobernado también por dos fuerzas 
adicionales; inicialmente la fricción con el solvente dificultará este movimiento 
originando una fuerza que se opone , por otro lado las moléculas tienen que 
moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen 
energía cinética propia denominado difusión. La energía cinética de las 
moléculas aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor 
difusión (Takashi, 2004). 
 
Fig. 7 Electroforesis Capilar 
En la fig. 7 se esquematiza el interior del capilar de sílice en donde la pared de 
este mismo tendrá únicamente cargas negativas lo cual ayudará a que exista 
un buen flujo electro osmótico, partiendo del polo con carga positiva (ánodo) 
para llegar hasta el polo con carga negativa (cátodo), el orden de separaciónde las partículas de la muestra, en el equipo de electroforesis capilar es como 
sigue: primeramente saldrán las partículas de tamaño pequeño y que tengan 
carga positiva, después las partículas de mayor tamaño y con carga positiva, 
seguirán las partículas neutras, posteriormente las de carga negativa y con 
mayor tamaño y por último aquellas que tengan carga negativa y de tamaño 
pequeño (fig. 6). 
 
Fig.8 Instrumentación del Equipo de Electroforesis capilar 
 
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 22 
- 
 
La fig 8 representa el equipo de electroforesis capilar, se observa una fuente 
emisora de corriente eléctrica, teniendo así un flujo electro osmótico partiendo 
desde el ánodo para llegar al cátodo, en este momento es donde se lleva a 
cabo la separación y clasificación de las partículas presentes en la muestra, 
también posee una fuente emisora de luz (es aquí donde se lee la muestra a 
cierta longitud de onda), también cuenta con un receptor que es donde se va 
registrando de forma grafica los resultados, para después procesarlos. 
Al aplicar una diferencia de potencial entre los extremos de un capilar que 
contiene un líquido, se constata que el líquido se mueve a este movimiento se 
le denomina flujo electroosmótico (FE). La velocidad del flujo es proporcional al 
potencial aplicado y a la viscosidad del tampón y depende de la carga en la 
superficie del capilar. 
La causa de la aparición del flujo electroosmótico es la formación de la doble 
capa eléctrica. Básicamente es una separación de la carga iónica, una 
segregación de capas de iones que se acumulan en la interfase formada entre 
la superficie del capilar y la disolución. Los capilares usados en electroforesis 
capilar suelen ser de sílice fundida (Emaldi P, 1995). 
 
A pH por encima de 3, la pared interna del capilar de sílice presenta carga 
negativa debido a la desprotonación de los grupos silanol (Si-OH) de la 
superficie. Los cationes de la disolución formarán cerca de la superficie del 
capilar una primera capa interna, fija, en la que los cationes, inmóviles, están 
unidos fuertemente a la superficie del capilar. Una segunda capa, denominada 
capa móvil o difusa, formada también por cationes aunque unidos de manera 
más débil a la superficie del capilar, migrará hacia el cátodo (electrodo 
negativo) en presencia de un campo eléctrico. El resto de la disolución, 
mediante capilaridad, migrará a la misma velocidad y en la misma dirección, lo 
que producirá un perfil de flujo plano, a diferencia de la cromatografía, que 
produce perfiles de flujo laminar (fig 9). 
 
EC HPLC 
Fig 9. Comparación de perfil de flujo laminar 
 
La segregación de las capas de iones produce un potencial en la superficie que 
disminuye cuando aumenta la distancia desde la superficie. Este potencial ψ es 
grande en la capa fija, y su valor va disminuyendo conforme se adentra en la 
capa difusa. El punto clave es que donde termina la capa fija aún existe un 
cierto potencial, llamado potencial zeta ζ, que permitirá el movimiento del fluido. 
La velocidad del flujo electroosmótico es proporcional a la diferencia de 
potencial e inversamente proporcional a la viscosidad del tampón. 
La velocidad del FE va a variar en función de los cambios que se produzcan en 
el tampón; por ejemplo, una variación del pH del tampón origina un cambio en 
la ionización del capilar y un aumento de la concentración del tampón da lugar 
a una disminución del flujo electroosmótico. 
 
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 23 
- 
En general, cualquier alteración en la disolución que modifique la carga en la 
superficie del capilar, modifique la viscosidad del tampón o requiera un cambio 
en el potencial, altera la velocidad del FE. 
Como se ha comentado, el flujo electroosmótico da lugar a un perfil de flujo 
plano, lo que reduce significativamente el ensanchamiento de banda y por 
tanto, mejora la resolución. Además, la gran ventaja que presenta el FE es que 
la separación electroforética y la detección pueden realizarse a la vez para 
cationes y aniones. Sin el FE, o sólo aniones, o sólo cationes migrarían hacia el 
detector. El ión de carga opuesta migraría retrocediendo al final de la inyección, 
y los compuestos neutros se quedarían al final y se dispersarían por difusión. 
Con el FE todas las especies pasan por el detector. 
Finalmente, la velocidad de un ión en la electroforesis capilar vendrá 
determinada por su velocidad electroforética y por su velocidad de flujo 
electroosmótico ( Weston A, 1997). 
La ventaja de esta técnica es que el capilar de sílica fundida que generalmente 
se cubre con una capa de polimina para darle mayor rigidez y resistencia, tiene 
una ventaja a través de ella que permite el pasaje de la luz UV. Con esta 
técnica descrita es posible separar cationes, aniones, proteínas, péptidos, 
aminoácidos, ácidos núcleicos, iones inorgánicos, bases orgánicas, ácidos 
orgánicos, macromoléculas y sustancias no cargadas en forma simultánea 
(Rivera A, 2002). 
La velocidad de desplazamiento de las partículas cargadas, por unidad de 
intensidad del campo, es variable y depende de su carga y de la resistencia 
que le opone el disolvente. 
 
Es medida en cm s-1, y se rige por la siguiente ecuación: 
v = μe E … (1) 
 
siendo μe la movilidad electroforética del ión, medida en cm2V
-1
s
-1
, y E la 
intensidad del campo eléctrico medida en V cm-1. 
La movilidad electroforética de un ión es directamente proporcional a la fuerza 
eléctrica del ión e inversamente proporcional a los factores de retardo por 
rozamiento. 
La fuerza de retardo por rozamiento se determina en un ión a partir de su 
tamaño y de la viscosidad del medio en el que migra. La resistencia del medio 
al paso del ión también influirá en su movilidad electroforética, siendo ésta 
menor cuanto mayor sea la viscosidad del medio. 
Para hacer una separación efectiva es necesario mantener constantes las 
cargas de cada especie de iones, de manera que la relación carga-tamaño (y 
por tanto la velocidad de migración) permanezcan en el intervalo más estrecho 
posible. Asegurar que la carga se mantiene igual sobre cualquier ácido o base 
quiere decir que las separaciones electroforéticas requieren disoluciones 
tampón( Mc Clean S, 1999). 
 
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 24 
- 
 
Fig 10. Esquema de la separación de los componentes de una solución en EC 
La electroforesis se usa para separar los componentes de una solución coloidal 
y por lo tanto se pueda cuantificar, por ejemplo las vitaminas, para ello se arma 
un dispositivo donde, en la parte inferior del tubo, se ubica la solución coloidal 
constituida por una mezcla de sustancias coloidales que se cubre con una 
solución "buffer". Al cerrarse el circuito, las partículas coloidales se van 
desplazando en las ramas del tubo, dejando entre ellas y el "buffer" y entre los 
distintos coloides que la constituyen, una superficie de separación 
perfectamente nítida. Si la mezcla contiene, por ejemplo, dos o más vitaminas 
diferentes y como cada una de ellas tienen su propia velocidad de 
desplazamiento, se forman distintos frentes de avance,uno por cada vitamina. 
En la figura se ha esquematizado la técnica seguida para separar 
electroforéticamente dos vitaminas; en A se observa el tubo con las dos 
vitaminas mezcladas y el frente 1 que las separa de la solución "buffer". En B 
ya iniciado el experimento, se han formado dos niveles de avance, el 2, que 
pertenece a los dos coloides, y el 3 a uno solo de ellos; y en C se ha 
representado el valor del índice de refracción de la solución a lo largo del eje de 
la cubeta; ε0 corresponde al de la solución "buffer", ε1 al de la zona en que sólo 
existe un solo coloide, y ε2 al que contiene los dos. Por último, en D se resume 
la variación del índice de refracción a lo largo de la cubeta. A cada frente de 
separación le corresponde un determinado índice de refracción, representado 
por una punta o la curva ( Emaldi P, 1995). 
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 25 
- 
Una de las ventajas de la electroforesis capilar es que las especies separadas 
pueden detectarse directamente al aplicar el método. Se obtiene una gráfica de 
la respuesta en función del tiempo, llamada electroferograma (fig 11), en la que 
cada pico representa una especie química separada. 
 
Fig 11. Representación de un electroferograma 
 
En la electroforesis capilar la separación entre los picos resulta de las 
diferencias en las movilidades electroforéticas de las especies, y por tanto será 
la anchura de la banda la que determine la mayor o menor resolución del 
método. El flujo electroosmótico, es el responsable de la disminución de 
anchura de las bandas. 
1.6.2. VENTAJAS DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR EN 
COMPARACIÓN CON EL EQUIPO DE HPLC 
- Los cambios de Temperatura son pequeños por la disipación del 
calor en el capilar. 
- Hay mayor reproducibilidad. 
- Uso de voltajes altos, mayores a 30 Kilo Volts. 
- Menor tiempo de análisis. 
- Resolución entre los picos. 
- Mínimo gasto de disolventes, aditivos y reactivos. 
- Bajos costos y menor daño al ambiente. 
- Los capilares son baratos. 
- Uso de gran variedad de detectores. 
- Análisis de 100 muestras a la vez. 
 
 
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 26 
- 
1.7. METABOLITOS 
1.7.1. METABOLITO PRIMARIO 
Los metabolitos primarios son moléculas de bajo peso molecular que 
intervienen tanto en productos finales como intermediarios en las distintas rutas 
metabólicas. 
Las características de los metabolitos primarios: 
- Son necesarios para el crecimiento del microorganismo que los produce. 
- Se producen como productos únicos. 
- Estos productos son sintetizados por todos los microorganismos es decir 
son universales. 
- La producción no puede perderse fácilmente por mutación espontánea 
(Kun Y, 2006). 
1.7.2. METABOLITO SECUNDARIO 
Los metabolitos secundarios son, en principio, no esenciales para la vida pero 
contribuyen definitivamente a la adaptación de las especies y su supervivencia. 
Son más característicos para un grupo biológico particular, tal como una familia 
o un género. 
Las características de los metabolitos secundarios: 
- Son específicos de un grupo de organismos 
- No esenciales para el crecimiento 
- Dependiente de las condiciones de crecimiento 
- Puede obtenerse una sobreproducción espectacular (Goldman, 2004). 
1.8. FERMENTACIÓN 
La fermentación es un proceso en el que en ausencia de un aceptor externo de 
electrones, muchos organismos pueden oxidar algunos compuestos orgánicos 
con liberación de energía. Bajo esas condiciones sólo se produce la oxidación 
parcial del compuesto orgánico (de los átomos de carbono), y únicamente es 
liberada una pequeña parte de la energía, permaneciendo el resto en los 
productos resultantes. Esas oxidaciones parciales implican la misma sustancia 
como dador y aceptor de electrones a la vez (Beltran G, 2002). 
1.8.1. FERMENTACIÓN LÍQUIDA 
 
Se puede definir a la fermentación líquida (FL) o sumergida (abreviada en 
inglés como SmF) como un cultivo de células microbianas dispersas en forma 
homogénea en un recipiente agitado que puede o no ser aireado por medios 
mecánicos. La forma de fermentación liquida más utilizada en los laboratorios 
de investigación es el matraz agitado. El desarrollo de esta técnica ha sido 
importante porque ha permitido el cultivo de organismos aeróbicos en 
condiciones homogéneas con una densidad moderada de la biomasa y ha 
simplificado el estudio de la fisiología de los organismos. 
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 27 
- 
A su vez, el cultivo de suspensiones de células en fermentadores agitados ha 
evolucionado a gran escala, pues no es raro ver fermentadores con volúmenes 
superiores a 10 mil litros, en los cuales se producen todo tipo compuestos 
derivados del metabolismo microbiano. En estos sistemas, la agitación 
mecánica permite aumentar la transferencia del gas a la biomasa de tres 
formas básicas: 
I) Dispersa el gas en burbujas más pequeñas incrementando el área de 
interface gas-líquido. 
2) Incrementa el tiempo de contacto de líquido con las burbujas de gas. 
3) Disminuye el grueso de la capa estacionaria del líquido al aumentar la 
turbulencia del cultivo. Además, la agitación mezcla el cultivo manteniéndolo 
homogéneo. 
 
Esto es particularmente importante para la dispersión de la biomasa y la 
transferencia de calor. Los productos metabólicos y el calor se dispersan 
fácilmente, por lo que, no son un factor limitante para el crecimiento del 
microorganismo. La barrera principal de transferencia del oxígeno en la FL, es 
su baja solubilidad en el agua y, al hacerse mayor la capa de agua que debe 
cruzar, aumenta la dificultad para que llegue a la célula. 
Gran parte del gasto energético que debe realizarse en la FL está relacionado 
con la necesidad de satisfacer la demanda de oxígeno en el crecimiento de los 
microorganismos (Shigeru F, 1988). 
 
En la mayoría de los procesos para producción de vitamina B12 usan glucosa 
como fuente de carbono. Se conocen varias cepas productoras tales como: 
Bacillus megaterium (0.45mg/L de vitamina B12); Butyribacterium rettgeri (5 
mg/L de vitamina B12); Steptomyces olivaceus (3.3 mg/L de vitamina B12). 
 
 
Los mayores rendimientos se han obtenido con Propionibacterium 
freudenreichii (19 mg/L de vitamina B12), Propionibacterium shermanii (23 mg/L 
de vitamina B12) y Pseudomonas desnitrificans (60 mg/L de vitamina B12 ). 
Proceso con Propionibacterium: Propionibacterium freudenreichii y 
Propionibacterium shermanii, son utilizados en procesos de dos etapas con 
adición de cobalto (10 – 100 mg/L de vitamina B12). Como fuente de carbono la 
glucosa y fuente de nitrógeno se usa extracto de levadura. En una fase 
anaerobia preliminar (2–4 días) se produce 5’-deoxiadenosilcobinamida, en una 
segunda fase aeróbica (3- 4 días) se produce 5’deoxiadenosilcobalamina 
(coenzima B12). Ambas etapas pueden ser operadas en cascada en un proceso 
continuo. Durante el proceso de recuperación se rompen las células esto indica 
que la vitamina B12 es intracelular por lo que se aplica un tratamiento térmico, 
para poder liberar dicha vitamina (10-30 minutos a 80°C – 120°C, con un pH 
6.5 – 8.5). Después se convierten a una forma más estable, cianocobalamina. 
Posteriormente serealizan etapas de purificación para obtener un producto con 
95 a 98% de pureza (Meera, 2003). 
 
 
 
 
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 28 
- 
1.8.2. FASES DE UNA FERMENTACIÓN 
1.8.2.1. FASE LAG 
Fase de inactividad de duración variable ya que depende del número de células 
así como de las características metabólicas de las mismas. Grandes fases lag 
indican la presencia de sustancias tóxicas, muerte de células o inactividad de 
éstas. 
1.8.2.2. FASE TEMPORAL DE ACELERACIÓN 
No ha sido definida matemáticamente pero en ellas las proporciones de las 
células hijas tienden a alcanzar el 50% de la población total. 
1.8.2.3. FASE DE CRECIMIENTO EXPONENCIAL 
Allí crecen los microorganismos rápidamente y el crecimiento de la población 
depende del sustrato inicialmente colocado. 
1.8.2.4. FASE ESTACIONARIA 
Aquí ya se ha alcanzado el máximo valor de producción, en esta fase algunas 
células se dividen y otras mueren donde las células vivas utilizan los 
compuestos provenientes de las muertas como nutriente, manteniendo la 
población constante durante la fase. 
1.8.2.5. FASE DE MUERTE 
Dado que la población celular presente no se mantiene por sí misma comienza 
a morir. Tiene un comportamiento exponencial (Harden A, 1911). 
1.8.3. UTILIDADES Y VENTAJAS DE LA FERMENTACIÓN 
- La síntesis microbial puede ser el único medio práctico de obtener 
compuestos complejos. 
- Se puede realizar en un solo paso un cambio molecular el cual podría 
conseguirse por una larga síntesis química. 
- Las materias primas usadas en los procesos fermentativos son más 
baratas. 
- Las enzimas del microorganismo pueden evitar condiciones drásticas, 
algunas veces costosas requeridas en un producto químico. 
- En la síntesis microbial se pueden evitar compuestos indeseados debido 
a que las enzimas son catalizadores muy específicos. 
- Los medios de cultivo son simples, generalmente subproductos 
agrícolas que presentan un alto contenido de los nutrientes necesarios. 
- La concentración natural del sustrato permite utilizar reactores más 
pequeños en comparación con los utilizados en otro tipo de 
fermentación. Tienen mayor productividad volumétrica. 
- La aireación forzada es facilitada por la porosidad del soporte, lo que 
permite una alta transferencia de oxígeno al microorganismo. 
http://www.monografias.com/trabajos6/prod/prod.shtml
http://www.monografias.com/trabajos14/falta-oxigeno/falta-oxigeno.shtml
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 29 
- 
- Los procesos se consideran generalmente como tecnologías limpias 
(Zang S, 1993). 
1.8.4. DESVENTAJAS DE LA FERMENTACIÓN 
- Su aplicación se limita a microorganismos que crecen en bajos 
contenidos de humedad. 
- La extracción del calor metabólico puede ser un problema, sobre todo 
cuando se trabaja a gran escala y no se controla el proceso. 
- El tiempo de fermentación es mayor debido a que generalmente se 
utilizan microorganismos que presentan bajas velocidades específicas 
de crecimiento (Howard A, 2003) 
1.9. PRODUCCIÓN DE VITAMINA B12 A PARTIR DE 
PROPIONIBACTERIUM FREUDENREICHII 
 
La síntesis de la vitamina B12 requiere más de 70 pasos, la producción de esta 
vitamina se ha logrado por fermentación de microorganismos con 
modificaciones breves adicionales. En un esfuerzo por incrementar la 
productividad de la B12, anteriormente se intento expresar 10 genes que 
pertenecen a la familia de genes hem, cob y cbi que estén involucrados en la 
síntesis de la vitamina B12 con Propionibacterium freudenreichii, la cual se 
conoce produce la vitamina B12 . En un clon recombinante que refugia el vector 
que contiene coba, cbil F, o cbiEGH, se obtuvó un incremento en la vitamina 
B12 de 1.7, 1.9 y 1.5 mg/L, más alto respectivamente que aquellos sin el 
organismo con gérmenes clonados en la expresión del vector pPk705. 
 
Los genes cobS, cobU causan un ligero incremento en la producción de la 
vitamina B12. Lograron expresiones multigen en Propionibacterium 
freudenreichii en un gen recombinante de Propionibacterium freudenreichii 
de exógenos, esferoides hemA y endógenos hemB y coba, la producción fue 
de alrededor de 1.7 mg/L de vitamina B12, 2.2 mg/ L más alto que la producida 
por Propionibacterium freudenreichii Ppk705. 
 
El termino vitamina B12 es extensamente usado para describir compuestos del 
grupo de cobalamin. Formas naturales de este compuesto son 
adenosilcobalamin, vitamina B12 por definición es un compuesto cobalamin 
estable el cual es producido industrialmente pero en forma natural 
(Shakulashvili N, 2000) . La vitamina B12 es una importante vitamina para tratar 
una anemia y neuritis y es también importante como un suplemento de dieta 
para animales incluyendo humanos. Por tanto la vitamina B12 ha sido producida 
intracelularmente en una escala industrial usando procesos en lotes de 
alimentos de una fermentación microbial (Takashi M, 2004) varios 
microorganismos incluyendo aquellos que generan Bacilos, Methanobacterium 
han sido usados para producir vitamina B12 a escala industrial, algunas 
especies de Propionibacterium han sido conocidos como GRAS 
(generalmente conocidos como seguros) con un estatus que no producen 
exotoxinas ni endotoxinas (Vazquez H, 2007). 
 
 
http://www.monografias.com/trabajos15/transf-calor/transf-calor.shtml
http://www.monografias.com/trabajos6/dige/dige.shtml#evo
http://www.monografias.com/trabajos901/evolucion-historica-concepciones-tiempo/evolucion-historica-concepciones-tiempo.shtml
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 30 
- 
 
En la producción de la vitamina B12 muchos procesos de fermentación 
rutinarios se enfocan en un crecimiento bacterial para altas densidades de 
células (Villaplana G, 1975). 
Las composiciones de nutrientes del medio de cultivo tal como el acido amonio 
o composición mineral incluyendo iones de cobalto afectan la producción de B12 
 
En general, un alto campo del estudio de vitamina B12 ha sido lograda por tratar 
los microorganismos con agentes tales como UV ultravioleta o agentes 
químicos y seleccionando cadenas con ventajas practicas tales como 
productividad y estabilidad genética que son las principales razones de 
crecimiento y resistencia a altas concentraciones de intermediarios presentes 
en el medio (Zang S, 1993) . Pero ha habido un incremento mayor en los 
precursores o metabolitos intermediarios de vitamina B12 en las células se 
espera para resultar en la sobreproducción de B12 usando recombinación 
genética DNA. Sin embargo ha habido pocos reportes en la improvisación 
producción de B12 mediante ingeniería genética. 
 
Avances en biología molecular y bioquímica relacionan a la biosíntesis de B12 
que ha conducido el aislamiento de varias encimas responsables para la 
síntesis de B12. La mayoría de los pasos en la biosíntesis de B12 han sido 
caracterizadas en Pseudomonas denitrificantes, Salmonella typhimurium Y 
Propionibacterium freudenreichii. Los genes que están involucrados en la 
biosíntesis de B12 o sus precursores han sido aislados de la Rhodobacter 
cuyos genes están involucrados en la biosíntesis de B12 , han sido aislados y la 
mayoría de las funciones de los polipéptidos codificado por los genes han sidoidentificados. La biosíntesis de uroporphyrinogeno III, un precursor de B12 
involucra un camino de multipasos de acido δ-aminolevulinic (ALA) vía 
porphobilinogen (PBG). La síntesis de vitamina es producido por riboflavin en 5 
pasos de reacción, uno de los cuales parece requerir de oxigeno. 
 
Se desarrolló un sistema de vector host por propionibacteria con un vector 
lanzadera, , Ppk705, para transferir genes entre cadenas de escherichia coli y 
propionibacterium y se usó un vector Ppk705 para construir una expresión 
vector y excitosamente expresada en los genes por ALA (hemA) de 
Rhodobacter esferoides y colesterol oxidase (cho A) de Streptomyces sp con 
promotores endogenous seleccionados. Estos sucesos resultaron en la 
sobreproducción de ALA y choA. Más aun obtenemos regiones promotoras de 
Propionibacterium freudenreichii usando choA como un gen reportado alineado 
de secuencias DNA de promotores activos y propone una secuencia 
consensada en Propionibacterium freudenreichii. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 31 
- 
2. OBJETIVOS 
2.1. OBJETIVO GENERAL: 
Cuantificación por electroforesis capilar de la cianocobalamina producida por 
Propionibacterium freudenreichii shermanii. 
2.2. OBJETIVOS PARTICULARES: 
 
- Producción de vitamina B12 con Propionibacterium freudenreichii 
shermanii en fermentación líquida. 
 
- Identificación y cuantificación de vitamina B12 por electroforesis capilar. 
 
- Capacitación para el manejo del equipo de electroforesis capilar. 
 
3. JUSTIFICACIÓN 
 
La aplicación de la técnica de electroforesis capilar para la cuantificación de 
vitamina B12, ha mostrado una gran ventaja con respecto a otras técnicas 
usadas debido a que se puede cuantificar durante el proceso de fermentación. 
Se usó Propionibacterium freudenreichii shermanii, por ser una cepa 
modificada para la producción de vitamina B12. En este trabajo de 
experimentación se investigará bajo las condiciones establecidas la producción 
de vitamina B12. 
El control de calidad en la industria farmacéutica es especialmente riguroso 
porque el producto final está destinado a consumo humano. El elevado poder 
de resolución de EC la hace una técnica adecuada para este tipo de ensayos 
donde es habitual la separación de compuestos debido a su carga, 
principalmente para la determinación de impurezas relacionadas con el 
principio activo (impurezas de síntesis o productos de degradación). 
La electroforesis capilar (EC) es una técnica de separación basada en la 
migración diferencial de una mezcla de analitos bajo la acción del campo 
eléctrico. La EC ha sufrido un gran desarrollo a nivel de investigación en la 
última década pero su implantación a nivel industrial ha sido reducida. La gran 
variedad de productos y los numerosos controles que implica el control de 
calidad en la industria ha conducido al desarrollo de técnicas rápidas y con una 
amplia gama de aplicaciones como la EC. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 32 
- 
 
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL 
4.1. MATERIAL Y MÉTODOS 
Se necesitará: 
 
Cepa 
Se utilizó la cepa Propionibacterium freudenreichii subespecie shermanii 
CDBB-B-581, perteneciente a la Colección Nacional de Cepas Microbianas y 
Cultivos Celulares del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del 
Instituto Politécnico Nacional, de México. Esta se conservó en medio MRS con 
agar a 20 0C. Este medio M.R.S. fué desarrollado por Man, Rogosa y Sharpe 
para proveer un medio que pudiera evidenciar un buen crecimiento de 
lactobacilos y otras bacterias ácido lácticas, debido a esto la abreviatura MRS. 
 
Medios de cultivo 
El medio de producción fué formulado con glucosa 100g/L, fosfato de amonio 
2g/L, sulfato de amonio 0.25g/L, sulfato de magnesio 0.2g/L, sulfato de zinc 
0.02g/L, cloruro de cobalto 0.5g/L, sulfato ferroso 0.5g/L, sulfato manganoso 
0.5g/L , glicina 0.05g/L , extracto de levadura 2.0, ácido láctico 1mL/L, 
hidrolizado de caseína 2.0g/L, ácido pantoténico 0.1g/L, 5-6 dimetilbenzimidazol 
0.05g/L y betaína 3g/L, ajustando el pH a 7.2 todos los medios se esterilizaron 
a 15 Ibs durante 15 min. 
 
Inóculo 
Se preparan en medio MRS líquido se inocula con la cepa en estudio y se 
incuba a 28 0C con agitación 115 rpm por 48 horas (inóculo 0.551 leído 540nm) 
 
Fermentación líquida 
Se trabajó a escala de laboratorio en matraces de 250 ml con 50 ml de medio 
de producción por triplicado por cada día durante 9 días que duró la 
fermentación. Se incubó a 28 0C durante 72 horas sin agitación (fase 
anaerobia), al término de este tiempo se agregó cloruro de cobalto 0.5g/L, 5-6 
dimetilbenzimidazol 0.05g/L y betaína 3g/L y se incubó a 28 0C durante72 horas 
con agitación (fase aerobia). Cada 24 horas se tomaron tres matraces para 
determinarles pH, la biomasa por peso seco, el consumo de azúcares por el 
método de DNS y la concentración de B12 (por duplicado para cada 
determinación). 
Para liberar la vitamina de las células se hace un calentamiento (10 minutos a 
100 0C, pH 6.5) y se le agrega KNC 1N donde se convierte en la forma más 
estable (cianocobalamina). 
 
 4.2 METODOLOGÍA 
 
Para la producción se utilizó Medio MRS ajustado a pH de 6.5 y esterilizado a 
15 Ibs/15 min. Se incubó a 28 °C durante 72 horas sin agitación (fase 
anaerobia) y 72 horas con agitación (fase aerobia). Cada 24 horas se tomaron 
muestras para determinarles pH, biomasa por peso seco, azúcares por DNS y 
la concentración de B12. 
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 33 
- 
 
 
Se coloca el papel filtro a peso constante, esto se logrará poniendo dichos 
papeles en un horno a 50 º C (anexo 2) y después de 24 horas, registrar su 
peso, volver a meter en el horno y después de 24 horas registrar su peso, 
hacer esto hasta que el peso de cada papel sea constante es decir que ya no 
haya variación en su peso, después colocarlos en un desecador, para evitar 
que absorban humedad del medio ambiente, pesarlos y registrar su peso en la 
bitácora. 
 
Una vez ya preparado este medio se resiembra la cepa, es decir se toma una 
asada de Propionibacterium freudenreichii shermanii y se resiembra en un tubo 
que contiene el medio de conservación, de esta forma se resiembra en 
5 tubos, el tiempo que tarda en crecer la cepa es de 72 horas. 
Es necesario que para cada vez que se monte una nueva fermentación, se 
realiza la resiembra de la cepa ya que necesitamos que las bacterias sean 
jóvenes para tener un buen resultado. 
Primeramente pesar los componentes que se utilizarán para la preparación del 
medio 53 MRS, pesar los reactivos para la preparación del inductor, pesar el 
NaOH y preparar la solución de NaOH al 1M, pesar NaCl y hacer la solución 
salina al 0.9 %. Una vez preparado el medio ajustar a un pH de 7.2, logrando 
este ajuste con una solución de NaOH al 1M. 
Después repartir en 30 matraces el medio ya que se hizo por triplicado, es decir 
cada matraz tendrá 50 mL de medio MRS, y proceder a esterilizar, se esteriliza 
a 15 libras o 121 º C por 15 minutos; se esteriliza el medio, el inductor, la 
solución salina al 0.9 %, y la solución de NaOH al 1M. 
Cuando ya está esterilizado, sacar los matracesdel autoclave y esperar a 
enfriar a temperatura ambiente. 
 
Para inocular se toman los matraces que contienen el medio a temperatura 
ambiente y entonces se toma 1 mL del inóculo, y se agrega 1 mL a cada 
matraz y se homogeniza, luego se procede a dejarlos en la incubadora a 28 ºC 
por 72 horas (anexo 12). 
 
Una vez transcurridas las 72 horas se sacan los matraces, se toma el primer 
matraz es decir el tiempo cero y se mide su pH, después ajustar el pH entre 6.5 
y 7 con una solución de NaOH al 1M. Después se mide el volumen que se 
gasto de NaOH para hacer el ajuste y se agrega. 
Luego en condiciones estériles, se agrega el volumen de NaOH al 1M que se 
gastó en el tiempo cero para el ajuste de pH a cada matraz, a esta muestra 
(tiempo cero) se filtra; del filtrado se separan 12 mL para hacer la prueba de 
azúcares reductores, el resto del filtrado se le hace la reacción de KCN (anexo 
1), y el papel filtro se lleva a secar en un horno (anexo 2), para llevarlo a peso 
constante y se pueda procesar resultados para hacer cálculos y realizar 
determinación de biomasa (anexo 1). 
En seguida se toma el inductor que ha sido preparado (anexo 1), y se agrega 
1 mL a cada matraz. 
 
 
 
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 34 
- 
Una vez que los matraces tienen el inductor se seleccionan 2 matraces para 
que sean muestras blanco por lo tanto se tendrá: 
1 matraz blanco a una temperatura de 28 º C 
1 matraz blanco en refrigeración 5 º C 
 
- El blanco que está a 28 ºC contiene inductores. 
- El blanco que está a 5 ºC no tiene inductores. 
Colocar todos los matraces a incubación sus condiciones son 28 ºC a 115 rpm 
por 24 horas, excepto el que está en refrigeración. 
Después de haber transcurrido las 24 horas, se saca el matraz del tiempo 1, y 
se mide su pH después ajustar a 6.5 con la solución de NaOH al 1 M, y 
registrar el volumen gastado para dicho ajuste. 
Enseguida sacar todos los matraces de la incubadora y en condiciones 
estériles poner el mismo volumen de NaOH al 1 M (estéril), gastado para el 
ajuste a cada matraz. 
Llevar todos los matraces a incubación bajo las mismas condiciones excepto el 
tiempo 1, a este matraz filtrar y al filtrado sacar una muestra de 12 mL para 
hacer la prueba de azúcares reductores y al resto del filtrado realizar la 
reacción de KCN para la estabilización de la molécula de vitamina B12. 
La siguiente muestra se toma al pasar 24 horas, y así sucesivamente hasta 
encontrar la muestra en la que suba su pH aproximadamente en pH =6.5 por lo 
regular cuando ocurre esto es a las 72 horas, se espera que a las 144 horas , 
exista un vire rojo en el caldo de fermentación de ser así, a partir de esta 
muestra es donde se espera que haya producción de vitamina B12, si se tiene 
un pH arriba de 6.5, se sabe que hay presencia de vitamina B12, entonces se 
procede a filtrar las muestras restantes, y el filtrado se lleva a refrigeración. 
A cada muestra realizar determinación de biomasa (anexo 1), de esta forma se 
procesaran todas las muestras, obteniendo una muestra cada 24 horas, las 
muestras totales son 9, es decir 216 horas empleadas para realizar la 
fermentación. 
 
4.3 CARACTERÍSTICAS DE LA CEPA 
 
Morfología Colonial 
Gram positivo, bacilos. 
Morfología de la cepa: 
Características: 
Tamaño: 1mm 
Color: Amarillo 
Forma: Circular 
Elevación: Convexa 
Superficie: Lisa 
Aspecto: Húmedo 
Borde: Entero 
Consistencia: Suave 
Luz reflejada: Brillante 
Luz transmitida: Translúcida 
Difusión de pigmento: No presenta 
 
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 35 
- 
 
 
 
Tabla 1. Medio 53 MRS conservación de la cepa. 
 
Reactivos Peso (g/l) 
Glucosa 20 
Digerido tríptico, peptona de Caseína 10 
Extracto de levadura 5 
Extracto de carne 10 
Tween 80 1 
K2HPO4 2 
Acetato de Sodio 5 
Citrato de Amonio 2 
Mg SO4 7 H2O 0.2 
MnSO4 H2O 0.05 
H2O Destilada 1000 mL 
pH 6.2 – 6.5 
2% Agar 2 
Esterilizar a 15 lb/ 15min 
 
Colocar en tubos, esterilizar y colocar en pico de flauta, se resiembra la cepa 
dejar 48 horas e incubar a 28 °C 
 
Tabla 2. Preparación del medio de producción 
 
Reactivos Medio 
(g/l) 
1°etapa medio 
(g/l) 
Glucosa 50 - 
Sacarosa - - 
Betaína - 1.5 
Fosfato de Amonio 1.0 - 
Sulfato de Amonio 0.125 - 
Sulfato de Magnesio 0.1 - 
Sulfato de Zinc 0.01 - 
5-6 Dimetilbenzimidazol - 0.0025 
Clorato de Cobalto - 0.25 
Fe Sulfato (Ferroso) 0.25 - 
Mn Sulfato (Manganoso) 0.25 - 
Glicina 0.0025 - 
Extracto de levadura 1.0 - 
Hidrolisado de Caseína Heptona 1.0 - 
Acido Pantoténico 0.05 0.05 
Acido Láctico 0.05 mL - 
Agua 500 mL - 
pH 7.2 - 
 
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 36 
- 
 
Tabla 3. Inductor 
 
Inductor Reactivos Peso en (g) 
1° Etapa 5-6 Dimetilbenzimidazol 0.025 
Betaína 3 
Cloruro de Cobalto 0.5 
Acido Pantoténico 0.10 
 
Esto es para preparar 20 matraces de 50 ml cada uno. 
 
4.4. PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN ISOTÓNICA AL 0.9 % DE NaCl 
 
Se pesa 0.27 g de NaCl y en un matraz de 250 mL disolver y homogenizar en 
30 mL de agua destilada, poner tapón y esterilizar a 15 lb/ 15 min (anexo 9). 
 
 
4.5. PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE NaOH AL 1M 
 
Pesar 4 gramos de NaOH y en un matraz de 250 mL disolver en 100 mL de 
agua destilada y homogenizar, colocar tapón y esterilizar a 15 lb/ 15 minutos 
(anexo 9). También preparar otra solución de NaOH al 1 M pero ésta no se 
esteriliza. 
 
4.6. PREPARACIÓN DEL INÓCULO. 
 
Se prepara el inóculo al 0.5 de absorbancia se toma la solución isotónica 
preparada al 0.9 % de NaCl (anexo 1). Se toman 2 tubos que contienen la 
cepa, vaciarles la solución isotónica y agitar. 
Ahora la solución isotónica ya tendrá la bacteria Propionibacterium 
freudenreichii shermanii, después colocarla en una celda para poder leer su 
absorbancia debe estar a una absorbancia de 0.5 y una longitud de onda de 
540 nm. De no ser así, tomar otro tubo que contiene la cepa y con esa misma 
solución isotónica, vaciar y agitar en el tubo, ahora ya estará más concentrada, 
proceder a leer en el espectrofotómetro hasta alcanzar la absorbancia 
determinada, una vez que ya se haya alcanzado esta absorbancia podremos 
inocular. 
 
4.7 PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE KCN AL 1M 
 
Se pesan 3.256 gramos de KCN y se afora en un matraz volumétrico a 50 mL 
con agua destilada y homogenizar, para el manejo de este reactivo como 
medida de seguridad es necesario usar guantes ya que es un material tóxico 
para la piel, así como mascarilla para evitar inhalar gases tóxicos, el lugar de 
trabajo será en la campana de extracción (anexo 10). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 I N S T I T U T O P O L I T É C N I C O N A C I O N A L 
 
U P I B I 
P R O D U C C I O N D E V I T A M I N A B 1 2 P O R F E R M E N T A C I O N L I Q U I D A Y S U C U A N T I F I C A C I O N P O R E C 
 
 Página - 37 
- 
 
4.8 PREPARACIÓN DEL REACTIVO DNS 
 
Para preparar 100 gramos de reactivo DNS, se pesan 30 gramos de tartrato de 
sodio y 30 gramos de potasio tomar un poco de agua destilada y disolverlos. 
Pesar 1.6 gramos de NaOH y disolver, a la vez homogenizar después pesar 
1 gramo de DNS y también disolverlo en agua, aforar