ALVAREZ-SAüNCHEZ-OLIVIA

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA 
 
 
TÍTULO DEL TRABAJO 
DETERMINACIÓN DE ÁCIDO FÓLICO EN LECHE POR HPLC 
 
 
 
INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE: 
ESTANCIA INDUSTRIAL 
 
 
 
LICONSA GERENCIA METROPOLITANA SUR S.A. de C. V. 
 
 
 
PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
INGENIERO EN ALIMENTOS 
 
 
 
PRESENTA: 
ALVAREZ SÁNCHEZ OLIVIA 
 
 
ASESORES: 
DR. ENRIQUE DURÁN PÁRAMO (Interno) 
I. Q. ISAAC RODRÍGUEZ VICTORIA (Externo) 
 
 
EVALUADORES: 
M. EN C. PATRICIA VÁZQUEZ LOZANO 
M. EN C. SAMUEL SUAZO ABARCA 
 
 
 Liconsa S.A. de C. V 
 Gerencia Metropolitana Sur México D. F. Mayo del 2009 
 Departamento de Control de Calidad 
 
 
 
 - 2 - 
AGRADECIMIENTOS 
 
A MI MAMÁ 
 
 Gracias por acompañarme en las noches de 
desvelo, por estar conmigo en esos momentos de preocupación y 
angustia, por celebrar conmigo en los momentos de grandes logros 
y por acompañarme en los momentos de tristeza. Gracias mami 
lo logramos por fin nos graduamos. 
 
 
A MIS HERMANOS 
 
 Por su apoyo y comprensión a lo largo de mi 
formación como profesionista, por compartir conmigo la alegría 
de haber llegado al final de esta etapa tan importante de mi vida. 
 
 
A MIS CUÑADOS 
 
 Que fueron formando parte de mi familia 
proporcinando apoyo y confianza para poder realizar mis logros 
y metas a lo largo de mi vida muchas gracias. 
 
 
A MIS SOBRINITOS 
 
 Por estar siempre a mi lado y llenar de alegría 
aquellos momentos difíciles, los quiero mucho. 
 
 
A MI PAPÁ 
 
 Un gran hombre a quien quiero y recuerdo 
mucho. Que aunque no estés presente, siempre te tuve en mi mente 
que muchos de mis logros siempre pensé en ti, sé que estarías 
orgulloso de mí. 
 - 3 - 
CONTENIDO 
 
ÍNDICE DE TABLAS………………………………………………………………….6 
ÍNDICE DE FIGURAS………………………………………………………………...6 
ABREVIATURAS……………………………………………………………………...7 
RESUMEN…………………………………………………...…………………………8 
1. ANTECEDENTES HISTÓRICOS LICONSA GMS S.A. DE C.V ...…........…..9 
2. OBJETIVOS GENERALES DE LICONSA GMS S.A. DE C. V..……….....…14 
2.1 Ubicación de la planta………………………………………………………15 
2.2 Misión y visión……………………………………………………………..15 
3. DISTRIBUCIÓN DE PERSONAL DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL 
DE CALIDAD………………………………………………………………..……...16 
4. INTRODUCCIÓN…….............................................................................................17 
5. ÁCIDO FÓLICO…...................................................................................................17 
5.1. Comportamiento químico de los compuestos de folato....................……....18 
5.2. Análisis para la detección de folatos …...……….………..………………..19 
5.3. Características funcionales del acido fólico ……………………..………...21 
5.4. Acido fólico como precursor de la salud…….……………………………22 
5.5. Acido fólico en los alimentos……………………………………………...23 
5.6. Ingesta diaria recomendada de acido fólico en humanos........................….24 
6. JUSTIFICACIÓN………………………………………………………………….25 
7. OBJETIVOS GENERALES Y OBJETIVOS ESPECÍFICOS...….…………….27 
8. METODOLOGÍA………………….…………………………………...………….28 
9. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………………..………...29 
9.1 Muestra de alimento………………………………………………………...29 
9.2 Materiales analíticos…… ………..………………………………………...29 
 9.3. Método……..…………................................................................................30 
 9.4. Diagramas de bloques……………………………………...……………....31 
 9.4.1 Preparación del blanco……………………………...…….………31 
 9.4.2 Preparación del estándar para análisis por HPLC…...…………....32 
 9.4.3 Preparación de la muestra de LDP……………………………......33 
 9.4.4 Análisis de folatos con HPLC…………………………………….34 
10. RESULTADOS……………......…………………………………………………..35 
 10.1 Estándares de ácido fólico………………………………………………...35 
 - 4 - 
 10.2 Muestras de LDP………………………………………………………….36 
 10.3 Muestras de LDP con la adición de estándar de ác. Fólico a diferentes 
concentraciones………………………………………………..……………….38 
11. DISCUSIÓN……………….………………………………………………….....40 
12. CONCLUSIONES……………………………………………………………....43 
ANEXO 1…………………………………………………………………………….44 
ANEXO 2…………………………………………………………………………….45 
13. RECOMENDACIONES………………………..………………………………46 
14. BIBLIOGRAFÍA………………...…………………………………………..….47 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 5 - 
Índice de Tablas y Figuras 
 
Tablas Página 
 
- Tabla 1. Principales fuentes de ácido fólico en alimentos consumidos en 
México………………………………………………………………………….23 
- Tabla 2. Recomendaciones IDA para ácido fólico.…………………………….24 
- Tabla 3. Cuadro de datos para elaborar la curva tipo del estándar de ácido 
fólico….………………………………………………………………………...44 
 
 
Figuras Página 
 
- Figura 1. Croquis de ubicación de la planta Liconsa GMS……..……………...14 
- Figura 2. Organigrama del departamento de Control de Calidad………............15 
- Figura 3. Estructura del ácido fólico……………………………………...……17 
- Figura 4. Degradación oxidativa de los folatos H4 …………….........................19 
- Figura 5. Absorción y metabolismo de los folatos……………………………..21 
- Figura 6. Efecto de la homocisteína sobre el sistema cardiovascular…….........22 
- Figura 7. Cromatograma del STD de ácido fólico, con una concentración de 
3.50µg/50mL; tR de 5.27 min………………………………………………….35 
- Figura 8. Cromatograma del STD de ácido fólico, con una concentración de 
3.50µg/100mL; tR de 5.27 min………………………………………………...35 
- Figura 9. Cromatograma de la muestra de LDP, tR de ácido fólico 5.31min…36 
- Figura 10. Cromatograma de la muestra de LDP, tR de ácido fólico 5.3min….36 
- Figura 11. Cromatograma de la muestra de LDP, tR de ácido fólico 5.29min..37 
- Figura 12. Cromatograma la muestra de LDP, tR de ácido fólico 5.35min…....37 
- Figura 13. Cromatograma de la muestra de LDP con adición de STD de ácido 
fólico a concentración de 3.5µg/100mL; tR de ácido fólico 5.35 min………...38 
- Figura 14. Cromatograma de la muestra de LDP con adición de STD de ácido 
fólico con concentración de 7µg/100mL; tR de ác. fólico 5.36 min…………...38 
- Figura 15. Cromatograma de la muestra de LDP con adición de STD de ácido 
fólico con concentración de 10.5µg/100mL; tR ác. fólico de 5.37 min………..39 
- Figura 16. Curva tipo del estándar de ácido fólico……………………….…….44 
 - 6 - 
- Figura 17. Cromatograma del STD de ácido fólico, a concentración de 
3.50µg/100mL, tR de 5.27 min………………………………………………...45 
- Figura 18. Cromatograma del STD de ácido fólico, a concentración de 
3.50µg/100mL; tR de 5.3 min………………………………………………….45 
- Figura 19. Cromatograma del STD de ácido fólico, a concentración de 
3.50µg/100mL, tR de 5.36 min………………………………………………...46 
 
 
 
 
 
Abreviaturas 
 
HPLC Cromatografía de líquidos de alta resolución 
LDP Leche descremada en polvo 
IDR Ingesta diaria recomendada 
UV Ultravioleta 
tR Tiempo de Retención 
STD Estándar 
GMS Gerencia Metropolitana Sur 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 7 - 
RESUMEN 
 
La decisión de fortificar la leche Liconsa nace a partir de que el país pone en 
manifiesto la desnutrición y anemia siendo la población infantil la más afectada. Para 
contribuir a resolver esta problemática, la Secretaría de Desarrollo Social del Gobierno 
Federal, a través de Liconsa, trabajó intensamente para fortificar la leche con hierro, 
zinc, ácido fólico y vitaminas, elementos que se suman a los valores nutricionales de la 
leche Liconsa. 
 
El ácido fólico tiene una destacada función metabólica tienen una importante 
repercusión en la salud. Es esencialmente reconocido en la prevención de los defectos 
del tubo neural tal y como es la prevención de la aparición de espina bífida en neonatos 
(4). 
 
La metodología se llevó a cabo mediante una HOMOGENIZACIÓN de la 
muestra LDP con buffer de fosfatos a pH neutros, seguido de una EXTRACCIÓN que 
consiste en sometera la muestra homogenizada en un baño a ebullición durante 40 min. 
e inmediatamente enfriando con hielo, posteriormente la etapa de CENTRIFUGACIÓN 
durante 10 min. a 1200rpm, y decantar inmediatamente para llevar a cabo la 
FILTRACIÓN CON ACRODISCOS y el ANÁLISIS EN HPLC. 
 
 En la referencia que se utilizó para llevar a cabo la metodología de la técnica 
implica el uso de la enzima conjugasa (γ-glutamilhidrolasa), para así poder hacer la 
transformación de poliglutamatos a monoglutamatos y de esta manera hacer más fácil la 
determinación por HPLC. Sin embargo no fue posible la utilización de ninguna solución 
enzimática debido a que el tiempo de adquisición de la enzima no estuvo dentro del 
lapso de las sesiones experimentales. 
 
Los resultados obtenidos sin el uso de la enzima fueron reproducibles ya que los 
tR oscilan entre 5.21 y 5.27min. Aún no se estandariza la técnica a causa de la falta de 
la enzima conjugasa que es con la que señala la técnica para la conversión de 
poliglutamatos a monoglutamatos. 
 
 
 - 8 - 
1. ANTECEDENTES HISTÓRICOS. 
 
En 1938, preocupado por la constante merma de la economía doméstica de las 
familias más desprotegidas, el Gobierno del Presidente Lázaro Cárdenas decidió crear el 
Comité Regulador del Mercado de las Subsistencias. 
 
En mayo de 1941 el Presidente Manuel Ávila Camacho promulgó una Ley en 
que advertía que era una exigencia inaplazable “atacar desde su origen la formación de 
los precios mediante una intervención activa del Gobierno en sus causas 
determinantes”, de esta manera y en sustitución del Comité Regulador, se creó la 
Nacional Distribuidora y Reguladora, S.A. de C. V. (NADYRSA) sociedad establecida 
por Ley. 
 
En mayo de 1944, en la Colonia Santa Julia de la Ciudad de México, se dio el 
primer antecedente de lo que hoy conocemos como el Programa de Abasto Social, al 
fundarse la primera lechería de la cadena planeada por NADYRSA. 
 
En 1945, frente a la grave escasez de leche que comenzó a sufrir el país como 
consecuencia de las secuelas de la Segunda Guerra Mundial, el Gobernador Lic. Javier 
Rojo Gómez comisionó al Lic. Francisco Doria Paz, Presidente del Consejo Consultivo 
de la Ciudad de México, para analizar la situación general del mercado lechero. Las 
indagaciones del comisionado mostraron una situación adversa: los introductores de 
leche del país no contaban con la suficiente capacidad para vender su producto a la 
población. 
 
En noviembre de 1946, un acuerdo presidencial que buscaba incentivar la 
inversión y abatir el rezago en la oferta del producto, otorgó las franquicias de exención 
de impuesto a la Empresa recientemente creada. 
 
De esta forma, el 13 de julio de 1949, se ordenó la liquidación de la Nacional 
Distribuidora y Reguladora, S.A. de C.V., para dar paso a la Compañía Exportadora e 
Importadora Mexicana, S.A. (CEIMSA), la cual quedó encargada del abastecimiento y 
regulación de los precios de los productos de primera necesidad. 
 
 - 9 - 
En 1950 CEIMSA asumió la responsabilidad de elaborar, distribuir y vender la 
leche reconstituida. 
 
Tres años después Lechería Nacional, S.A. dejaría de operar por sí misma y 
empezaría a producirle a CEIMSA, arrendándole también 300 lecherías de su 
propiedad. 
 
En 1954 una planta rehidratadora construida por CEIMSA, inicia operaciones 
con 30,000 litros diarios, al tiempo que suscribe un contrato de maquila con la planta 
“CREMEX” para rehidratar otro tanto por día. Esto permite surtir adicionalmente 20 
mil raciones, de un cuarto de litro cada una, al Instituto Nacional de Protección a la 
Infancia (INPI), para integrar el paquete de los desayunos escolares. 
 
La constante expansión en este rubro llevó a la necesidad de construir, en 1961, 
la Compañía Rehidratadora de Leche (CEIMSA, S.A.), a fin de que el Programa de 
Leche Reconstituida, se manejara con independencia y CEIMSA se concretara a las 
labores de coordinación, ya con su nueva estructura de sociedad mercantil del estado, 
bajo el nombre de Compañía Nacional de Subsistencias Populares, S.A. (CONASUPO, 
S.A.) y con la finalidad de regular y abastecer el mercado de productos básicos. 
 
Liconsa Hoy 
 
Para noviembre de 2000 y de acuerdo al artículo undécimo transitorio del 
Decreto de Presupuesto de Egresos de la Federación para ese ejercicio, se adscribe el 
Programa Tortilla y se consolida y unifican las Estructuras Administrativas de 
LICONSA, S.A. de C.V., que es un Empresa de Participación Estatal Mayoritaria en los 
términos de la Legislación vigente y del Fidelist que fue constituido como Fideicomiso 
Público del Gobierno Federal. 
 
En la actual administración se han construido alianzas estratégicas con 
Instituciones Públicas y Privadas para fortalecer a la Empresa y desarrollar proyectos 
innovadores. Asimismo, se han enfrentado escenarios internacionales adversos para 
adquirir la materia prima y ha impulsado negociaciones para mejorar paulatinamente los 
precios de la leche de importación. 
 - 10 - 
 
Un hecho que es necesario resaltar es la fortificación de la leche, al adicionarle 
minerales como hierro, zinc, ácido fólico, vitaminas B2 Y B12, además de las vitaminas 
A y D que ya se le habían incorporado. Con ello, se tiene la certeza de contar con un 
producto de la más alta calidad, que combate de manera frontal la desnutrición y la 
anemia que afecta a una parte significativa de la población infantil en México. 
 
Las Reglas de Operación 2004 para el Programa de Abasto Social de Leche 
facultan a LICONSA, S.A. de C.V. para incorporar a su padrón de beneficiarios a 
nuevos grupos de la población, como son las mujeres de: 12 a 15 años, en período de 
lactancia y de 49 a 59 años. 
 
Se reabrió la planta industrial Xalapa y se fusionó como las demás plantas 
productoras a las Gerencias Estatales, Metropolitanas y de Programas de Abasto Social, 
consolidando la producción y el abasto social de leche. 
 
LICONSA, S.A. de C.V. produce más de mil millones de litros de leche al año 
con 10 plantas industriales. El proceso de producción incluye la rehidratación, 
reconstitución, enriquecimiento y fortificación de leche en polvo descremada, el 
envasado de leche entera en polvo y pasteurización, homogenización y envasado de 
leche fresca de producción nacional. 
 
Se consolida la estrategia de servicios y valores agregados en las lecherías, tales 
como servicios telefónicos, correo y venta de productos básicos, además de una mayor 
vinculación con el sector salud para otorgar orientación alimentaria y nutricional en los 
puntos de atención. 
 
La calidad del desempeño institucional ha sido ampliamente reconocida, toda 
vez que algunas plantas industriales han obtenido la Certificación ISO 9000:2001, así 
como el premio Intragob, el distintivo a la Empresa Socialmente Responsable, la 
Certificación en Equidad y Género, así como cuatro Certificados de Acreditación como 
Laboratorios de Prueba. El 31 de diciembre de 2003, concluye la operación del 
Programa Tortilla. 
 
 - 11 - 
Desde el año 2004 se publicas las Reglas de Operación para el Programa de 
Adquisición de Leche Nacional, que tiene como objetivo comprar leche a pequeños y 
medianos productores nacionales. 
 
La compra de leche nacional se adquiere con las características de leche fresca y 
leche en polvo (entera y descremada), como insumo para la pasteurización y 
reconstitución de la leche y es por conducto de la red de acopio y enfriamiento integrada 
hasta el momento por 38 Centros de Acopio ubicados en los Estados de Campeche, 
Chihuahua, Guanajuato, Jalisco, Michoacán, Querétaro, Veracruz y Zacatecas; sin 
embargo, también se capta leche nacional proveniente de productores y proveedores de 
otros Estados del país. 
 
La compra o adquisición de leche nacional en el año 2005, ha registrado un 
incremento relevante, motivado por dos razones. La primera, es el precio establecido 
parala adquisición de leche nacional, el cual es muy atractivo para los productores, ya 
que es de 3.64 pesos por litro, lo que a su vez minimiza el efecto de la estacionalidad en 
los precios del mercado. La segunda razón, es la red de acopio y enfriamiento con la 
que cuenta LICONSA, S.A. de C. V., que permite una mayor participación de las 
distintas cuencas lecheras del país, lo que representa el beneficio de 8,650 productores. 
 
Este programa no provoca distorsiones en el mercado nacional de leche, ya que 
el lácteo adquirido se incorpora íntegramente al proceso productivo de LICONSA para 
atender el Programa de Abasto Social que le es propio. 
 
La tendencia para futuros ejercicio, será la compra de mayores volúmenes a 
productores nacionales y se pretende continuar con la disminución de leche en polvo 
importada. 
 
Después de más de 65 meses (1 de junio de 2001) sin que se modificara el precio 
de la leche Liconsa, el 17 de noviembre de 2006 aumentó de $3.50 a $4.50 por litro. 
 
Además de generar ahorros a las familias inscritas en el Padrón de Beneficiarios 
se han comprobado las propiedades nutricionales de la leche, ya que el Instituto 
Nacional de Salud Pública presentó en abril de 2006 los resultados del estudio “Segunda 
 - 12 - 
evaluación del impacto de la leche fortificada LICONSA en el estado de nutrición de 
los niños beneficiarios del Programa de Abasto Social de Leche”, y que fue realizado 
durante dos años, es decir, 2004 y 2005 en el cual se comparó la efectividad de la leche 
administrada a niños que tenían entre 12 y 30 meses de edad al inicio del estudio, el 
cual destaca los siguientes resultados: 
 
 Los niños que consumieron leche fortificada por dos años tuvieron tres veces 
menos anemia que los que no la tomaron y el 62 por ciento registra menos 
deficiencia de hierro. Lo que permite concluir que la fortificación de la leche es 
efectiva para disminuir la prevalencia de anemia y mejorar la concentración de 
hemoglobina. 
 
 Uno de los hallazgos más importantes fue que los niños que toman la leche 
LICONSA alcanzaron una estatura mayor de 2.6 centímetros y este aumento de 
talla se asoció a una mejor masa muscular de 700 gramos más que los niños que no 
consumieron leche LICONSA. 
 
 El impacto de la leche fortificada tiene un efecto positivo de corregir de manera 
temprana la deficiencia de hierro (entre los 12 y 24 meses de edad de los niños). 
 
 Los niños que en cualquier período de tiempo recibieron leche fortificada 
LICONSA dedicaron mayor tiempo a la actividad física ligera, moderada e intensa 
que los que nunca recibieron leche fortificada. 
 
Por otra parte, LICONSA al cierre de 2006 dispondrá de una infraestructura de 
acopio y enfriamiento conformada por una red de 49 Centro de Acopio, algunos de ellos 
operados por asociaciones de productores, en 17 Entidades Federativas con una 
capacidad total en tanques de 1’060,500 litros diarios. El precio de compra a los 
productores durante ese año fue de $3.84 pesos por litro la leche fría y $3.70 por litro de 
leche caliente. 
 
 
 
 
 - 13 - 
2. OBJETIVOS GENERALES DE LICONSA S.A. DE C. V. 
 
Objeto Social de Liconsa, S.A. de C. V. 
 
La Sociedad tiene por objeto 
 
Coadyuvar al fomento económico y social del país, participando en: 
 
a) El tratamiento industrial de leche fresca o en polvo, así como de otros 
productos lácteos, a través de plantas propias, rentadas o contratadas con el 
sector privado. 
 
b) La distribución y venta de leche fluida pasteurizada o en polvo a los 
sectores urbanos y rurales en pobreza, en establecimientos propios, 
rentados, o de particulares a través de cualquier canal de distribución que se 
precise en las Reglas de Operación del Programa de Abasto Social de 
Leche, previamente autorizado por el Órgano de Gobierno de la Empresa. 
 
La adquisición, renta u obtención en comodato de bienes muebles e inmuebles, 
equipo, materiales y materias primas como leche líquida o en polvo, de origen 
nacional o internacional, que se utilicen para desarrollar las actividades necesarias 
para el cumplimiento del objeto social. 
 
La celebración de toda clase de actos, contratos y convenios, de cualquier 
naturaleza, necesarios para el cumplimiento del objeto social. 
 
Objetivos Generales 
 
El objetivo de este Manual es el de establecer de manera clara la organización 
interna de LICONSA, S.A. de C.V., a partir de su Estructura Orgánica y de la 
distribución de las funciones entre las áreas que la conforman, a fin de optimizar su 
operación para la consecución de sus objetivos, metas y el ejercicio eficiente de sus 
recursos. 
 
 - 14 - 
 2.1 Ubicación de la Planta 
Calle: Santa Catarina, No. 2, Colonia: Santa Catarina, C.P. 56619 
 
 
Fig. 1. Croquis de ubicación de la planta Liconsa GMS 
 
 
2.2 Misión - Visión 
 
MISIÓN 
 
Es una Empresa de Participación Estatal Mayoritaria que industrializa y 
distribuye leche de alta calidad, a un precio accesible, en apoyo de la alimentación y 
nutrición a los beneficiarios de familias en condiciones de pobreza, para contribuir 
al desarrollo de capital humano. 
 
 
 
 
 
 
 - 15 - 
VISIÓN 
 
Ser la Empresa líder del Sector Desarrollo Social, de vanguardia, 
autofinanciable, que atienda con elevada vocación de servicio, al total de la 
población objetivo, mejorando los procesos en industrialización y distribución de 
leche de alta calidad nutricional a precio accesible. 
 
 
3. DISTRIBUCIÓN DE PERSONAL EN EL DEPARTAMENTO DE CONTROL 
DE CALIDAD. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
20
3
TOTAL 23
Coordinador ( 1 ) 
Microbiologia 
15
Secretaria ( 1 ) 
9
JEFE DE DEPARTAMENTO DE
CONTROL DE CALIDAD
SPS IV
Coordinador ( 1 ) 
Fisicoquimicos 
15
Tec. Quimico ( 1 ) 
Mat. Prim. e Insumos 
12 
CONFIANZA
SINDICALIZADOS
PERSONAL
Ayudante especial ( 2 )
Tec. Muestreador ( 2 ) 
Envasado 
11
Tec. Muestreador ( 1 ) 
Lecherias 
11
Tec. en act y estadist.( 1 ) 
de los sist. de gestion 
11
Ayudante especial ( 1 )
Tec. Químico ( 3 ) 
A. Microbiología 
12
Tec. Químico ( 1 ) 
A. Microbiología 
12
Tec. Muestreador ( 1 ) 
Mat. Prim. y Mat. de Envase 
11
Tec. quimico (3) 
A. Fisicoquimicos 
12
Tec. Muestreador ( 3 ) 
Proceso 
11
Figura 2. Organigrama del departamento de Control de Calidad 
 - 16 - 
4. INTRODUCCIÓN. 
 
En México se presentan tasas inaceptablemente altas de desnutrición 
concentradas en la población pobre. A la vez tenemos tasas crecientes de sobrepeso y 
obesidad. Los niños desnutridos pierden entre un 12 y 15% de su potencial intelectual 
corren un riesgo dentro de 8 a 12 veces mayor de contraer enfermedades infecciosas y 
son mas propensos a padecer enfermedades crónico degenerativas. Estos factores se 
traducen a través del tiempo en una menor productividad laboral y consecuentemente en 
una menor capacidad de generar ingresos y de salir de la pobreza. 
 
La decisión de fortificar la leche Liconsa nace a partir de que el país pone en 
manifiesto la desnutrición y anemia, siendo este un grave problema de salud pública, en 
especial de los mexicanos en condiciones de pobreza y dentro de ese sector, la 
población infantil es la más afectada. 
 
Para contribuir a resolver esta problemática, la Secretaría de Desarrollo Social 
del Gobierno Federal, a través de Liconsa, trabajó intensamente para fortificar la leche 
que distribuye a través de su programa de Abasto Social de Leche, con los principales 
micronutrientes, de los que la dieta de amplios sectores poblacionales acusa déficit. 
 
A partir del año 2002 la leche Liconsa se fortificó con hierro, zinc, ácido fólico yvitaminas, elementos que se suman a los valores nutricionales de la leche Liconsa. Para 
la verificación de dicha fortificación se llevan a cabo diferentes análisis para la 
determinación cuantitativa de la adición de micronutrientes. 
 
5. ÁCIDO FÓLICO. 
 
El ácido fólico (2-amino-4-hidroxi-6-metil-pteridina Ac. P-aminobenzoico Ac. 
L-glutámico) es un compuesto pteridino heterocíclico con la siguiente estructura (Fig. 
3). 
 
 
 - 17 - 
El término «folato» se utiliza de forma genérica para denominar las distintas 
formas químicas derivadas del ácido fólico, una de las vitaminas del grupo B, por lo que 
es hidrosoluble. 
 
 
Figura 3. Estructura del ácido fólico (Fennema 1992) 
 
5.1 Comportamiento químico de los compuestos folatos. 
 
El nombre genérico de folatos describe a diferentes formas de vitaminas 
constituidas de un anillo de pteridina además del ácido p-aminobenzoico y de uno a seis 
ácidos glutámicos. El organismo humano no puede sintetizar el ácido fólico por lo que 
depende totalmente de la ingesta en los alimentos. 
 
El ácido fólico se encuentra en forma natural como poliglutamatos los cuales son 
convertidos a monoglutamatos por medio de una conjugasa encontrada en las 
vellosidades intestinales (γ metil carboxipeptidasa), facilitándose con ello su absorción 
en la parte alta del intestino delgado; todos los monoglutamatos por medio de una 
reductasa son convertidos a tetrahidrofolatos (THF) y dihidrofolatos; los THF son los 
compuestos biológicamente activos, el monoglutamato 5 metil THF es la forma 
predominante en el suero. 
 
 
 - 18 - 
Normalmente se posee alrededor de 5 a 20 mg de ácido fólico en diversos 
depósitos corporales, ya en el interior de la célula los monoglutamatos pierden su grupo 
metilo por medio de una reacción que requiere cianocobalamina, transformándose de 
nuevo en poliglutamatos, los cuales a su vez son receptores de folatos, con lo que se 
cierra el círculo para su utilización; la mitad de los depósitos corporales se encuentran 
en el hígado en forma de poliglutamato de 5 metil THF. 
 
Los humanos no pueden sintetizar el ácido fólico y son totalmente dependientes 
de las fuentes alimentarias; los folatos normalmente presentes en los alimentos se 
encuentran en forma de poliglutamatos, mientras que los folatos sintéticos contienen 
únicamente monoglutamatos. El ácido fólico sintético de los complementos vitamínicos 
no requiere de esta conversión a través de la conjugasa (7). 
 
Los compuestos de folato más importantes que surgen de forma natural en los 
alimentos lo son el 5 metil tetrahidrofolato (5Me-H4 folato), 5-formil tetrahidrofolato 
(5HCO-H4 folato) y el tetrahidrofolato (H4 folato). Los compuestos de folato son 
considerados como la vitamina más inestable del complejo B, esto, principalmente por 
calor y oxidación. Además de que puede surgir la interconversión entre cada una de las 
moléculas, dependiendo del ambiente oxidativo y del pH del medio en que se encuentre. 
 
5.2 Análisis para la detección de folatos. 
 
La detección de este nutriente en un alimento es de mucha cautela; esto a 
consecuencia de las cantidades tan bajas en que se encuentra en los alimentos, también 
al alto nivel de inestabilidad que posee. 
 
La forma principal de folato que naturalmente se presenta en los alimentos es la 
de 5-metil-folato H4. La degradación oxidativa de este compuesto se produce por 
conversión dando, al menos dos productos (Fig.4). El primero presumiblemente, se trata 
del 5-metil-5,6-dihidrofolato (5-metil-folato H2) que retiene la actividad vitamínica 
dado que puede, de nuevo, reducirse fácilmente al 5-metil-folato H4. 
 
 
 - 19 - 
La estabilidad de los folatos puede verse afectada por el efecto del pH, de la 
concentración de oxígeno y la temperatura. El ácido fólico es generalmente la forma 
más estable; resiste la oxidación aunque su estabilidad disminuye en medios ácidos. 
La composición iónica del medio influye también de forma significativa en la 
estabilidad de la mayoría de los folatos. Los folatos son degradados por los iones 
superoxidos aunque no se ha determinado la cuantía de las pérdidas de folatos en los 
alimentos inducidas por tales radicales (7). 
 
Figura 4. Degradación oxidativa de los folatos H4 (Fennema). 
 - 20 - 
Los folatos deben ser primero extraídos de la matriz del alimento. Esto es 
usualmente acompañado por tratamiento de calor con soluciones amortiguadoras que 
contengan antioxidantes y a un pH cercano al neutral, con variables importantes como: 
el tiempo de calentamiento, temperatura, tipo y concentración de antioxidantes 
utilizados. Luego se añade una composición enzimática para llevar a cabo la hidrólisis 
de estos componentes. El efecto de componentes no folatos en la muestra debe ser 
eliminado antes de la determinación de folato para evitar interferencias. Esta limpieza es 
requerida si el método de HPLC es el utilizado para la detección, esto para mayor 
claridad en los resultados obtenidos. Finalmente, es la etapa de la determinación. Para 
las formas naturales de folato se requiere el detector de luz UV además de un detector 
de fluorescencia; a diferencia de la detección de ácido fólico la cual solo requiere 
evaluación a través del detector de luz UV (6). 
 
5.3 Características funcionales del ácido fólico. 
 
Los folatos (más conocidos genéricamente como ácido fólico) son un 
componente esencial de la dieta, necesario para la formación de las células de las series 
blanca y roja de la sangre, y las células epiteliales del tracto digestivo. Especialmente en 
estas células de rápida multiplicación y en otras células, los folatos forman parte de las 
reacciones de transferencia de carbono, destacando por su importancia las implicadas en 
el metabolismo del ADN, ARN y aminoácidos. 
 
El papel fundamental del ácido fólico es el de actuar como una coenzima 
necesaria para formar varios compuestos clave como son: formación de 
nucleoproteínas, necesarias en la división celular y en la transmisión de rasgos 
hereditarios. Participación en la síntesis de tiamina, vitamina necesaria en la formación 
de la nucleoproteína del DNA. 
 
El ácido fólico desempeña el papel de transporte básico del grupo C, para la 
formación del grupo hemo, proteína de la hemoglobina. El ácido fólico es de fácil 
absorción en el sistema gastrointestinal y llevado por la sangre a los tejidos, se almacena 
principalmente en el hígado y es excretado por la orina y heces fecales. 
 
 - 21 - 
Los folatos sufren cambios en su forma iónica en función del pH. los cambios en 
la carga del anillo de pteridina son responsables, en parte, de la dependencia del pH en 
relación con la estabilidad de los folatos y del comportamiento de los mismos durante la 
separación cromatográfica. 
 
En la mayoría de los casos, el ácido fólico (con el anillo de pteridina totalmente 
oxidado) exhibe una estabilidad sustancialmente mayor que la de los folatos H4 o los 
folatos H2. La estabilidad de cada folato depende exclusivamente de la naturaleza 
química del anillo de pteridina sin influencia alguna de la longitud de la cadena 
poliglutamilo. 
 
El ácido fólico, debido a su excelente estabilidad, es la única forma de folato que 
se añade a los alimentos, si bien ello se hace en muy pocos productos. Las pérdidas 
globales de folatos de un alimento dependen de la magnitud de la extracción, de las 
formas químicas presentes y de la naturaleza del entorno químico (catalizadores, 
oxidantes, pH, iones tampón, etc.). Por ello, es difícil predecir la retención de folato en 
un alimento determinado (7). 
 
Figura 5. Absorción y metabolismo de los folatos 
 
5.4 Ácido fólico como precursor de la salud. 
 
Los folatos, debido a su destacada función metabólica, tienen una importante 
repercusión en la salud. Juegan un papel esencial reconocido en la prevención de los 
 - 22 - 
defectos del tubo neural taly como es la prevención de la aparición de espina bífida en 
neonatos (4), y existen claras evidencias epidemiológicas que sugieren que unos niveles 
elevados de homocisteína en plasma (>15μmol/L) constituye un factor de riesgo 
independiente para las enfermedades cardiovasculares (2). 
 
Sin embargo, una ingesta elevada de ácido fólico reduce los niveles de 
homocisteína de modo que una dosis extra de 200μg de ácido fólico diaria provoca una 
reducción de 11-12% de los niveles de homocisteína plasmática (6). 
 
 
Figura 6. Efecto de la homocisteína sobre el sistema cardiovascular. 
 
5.5 Ácido fólico en los alimentos. 
 
El ácido fólico (ácido pteroil-L-glutámico) se encuentra en la naturaleza sólo en 
cantidades trazas. Las formas de los folatos que principalmente se encuentran 
naturalmente en los vegetales, animales y microorganismos son las especies químicas 
poliglutamilo de los 5,6,7,8-tetrahidrofolatos (folatos H4) (fig. 4) en los que los dobles 
enlaces del anillo de la uterina están reducidos (7). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 23 - 
Tabla 1. Principales fuentes de ácido fólico en alimentos consumidos en México. 
 
 
5.6 Ingesta Diaria Recomendada de ácido fólico en humanos 
 
En 1968 se describió por vez primera la relación entre niveles bajos de folatos en 
la gestación y defectos del tubo neural. En 1992 se recomienda la ingesta de 0.4mg/día 
de ácido fólico en mujeres en edad reproductiva, para 1995 se permitió la 
suplementación de los cereales con ácido fólico y es hasta 1998 cuando se lleva a cabo 
la suplementación de harinas comerciales con 0.140mg de ácido fólico por l00mg de 
harina, con lo que se añade 0.1mg/ día a la dieta normal, sugiriéndose incrementar la 
suplementación a 0.350mg/ 100mg de harina. 
 
Con esta campaña se pretende que a toda mujer en edad reproductiva, se le 
provea y recomiende una ingesta diaria de ácido fólico de 0.4mg, especialmente durante 
la etapa periconcepcional (tres meses previos al embarazo y hasta la semana 12 de 
gestación) y en aquellas mujeres que, por antecedentes o condición social o geográfica 
 - 24 - 
se identifique alto riesgo para defectos del tubo neural, deben ingerir de 4mg. de ácido 
fólico durante su etapa periconcepcional (7). 
 
Es por tanto comprensible que durante periodos de rápida multiplicación y 
crecimiento celulares los requerimientos de folato en la dieta sean mayores (9). Así, por 
ejemplo, durante los periodos de gestación o lactancia la ingesta diaria recomendada 
(IDR) pasa de 200 a 400 µg/día (3). 
 
Tabla 2. Ingesta Diaria Recomendada (DRI) para ácido fólico 
Ingesta Dietaria Recomendada (DRI) para ácido fólico 
Etapa de vida Edades Hombres (μg/día) Mujeres (μg/día) 
Infantes 0 – 6 meses 65 (IA)* 65 (IA)* 
Infantes 7 – 12 meses 80 (IA)* 80 (IA)* 
Niños 1 – 3 años 150 150 
Niños 4 – 8 años 200 200 
Niños 9 – 13 años 300 300 
Adolescentes 14 – 18 años 400 400 
Adultos 19 años o más 400 400 
Embarazadas 18 años o menos - 600 
Embarazadas 19 años o más - 600 
Lactantes 18 años o menos - 500 
Lactantes 19 años o más - 500 
*IA: Ingesta Adecuada 
 
6. JUSTIFICACIÓN. 
 
Ante la importancia de los folatos en la salud y de su papel en el metabolismo, 
surge la necesidad de establecer valores adecuados de ingesta, que sean fiables y estén 
basados en datos contrastados. Es, por tanto, prioritario aumentar el interés y la 
formación de los consumidores acerca de esta vitamina, especialmente mujeres, con la 
 - 25 - 
finalidad de aumentar su nivel de folato, así como de explorar las posibilidades de 
promocionar lo beneficiosas que son para la salud algunas fuentes de folatos 
 
Tradicionalmente, los folatos procedentes de los alimentos eran determinados 
por el Método Microbiológico (8). Con este ensayo se obtiene el resultado de folatos 
totales, ya que no discrimina entre las diferentes formas químicas de folatos. El método 
está basado en el crecimiento de un microorganismo, generalmente el Lactobacillus 
rhamnosus variedad casei, que responde a las formas monoglutámicas así como a las di- 
y triglutámicas (10). No obstante, estos datos pueden ser enmascarados por la presencia 
en la muestra de compuestos no folatos que pueden activar o inhibir el crecimiento del 
microorganismo. Surge así la necesidad de investigar nuevos métodos de determinación 
de folatos en alimentos que permitan la diferenciación entre las diferentes formas 
químicas, lo que permite obtener datos más exactos y fiables. 
 
Para la separación de las diferentes formas se han desarrollado métodos de 
HPLC que permiten diferenciar y cuantificar las distintas formas derivadas tras una 
extracción previa de la matriz del alimento y la posterior deconjugación por incubación 
con la enzima conjugasa (11) 
 
Las técnicas utilizando el sistema de HPLC también poseen grandes ventajas 
como el permitir mayor rapidez en la detección total de folatos, además de permitir 
resultados individuales de los diferentes tipos de folato presentes en los alimentos, esto 
a diferencia del método microbiológico. 
 
El ácido fólico utilizado como suplemento posee una eficacia 1.7 veces mayor 
que los folatos que naturalmente existen en los alimentos (10). La forma en los 
alimentos (ácido fólico o folatos) y su disponibilidad (mono o poliglutámica) son 
esenciales para conocer nuestras necesidades reales en la dieta. 
 
Por lo tanto la necesidad de establecer un método fiable de determinación de 
ácido fólico en leche y con esto poder brindar recomendaciones más reales y científicas, 
así como consejos para la obtención de una nutrición más óptima en cuanto a ácido 
fólico se refiere. 
 
 - 26 - 
Tal es el caso del la cuantificación de ácido fólico, ya que se busca la técnica 
adecuada para la realización del análisis cuantitativo dentro de Liconsa Gerencia 
Metropolitana Sur. 
 
7. OBJETIVOS GENERALES Y ESPECÍFICOS. 
 
Objetivos Generales. 
 
 Implementación de la técnica para la determinación de ácido fólico en leche en 
polvo por Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC). 
 
 Detectar el ácido fólico en muestras de leche en polvo. 
 
Objetivos Específicos 
 
 Reducir los egresos generados debido a la realización de la determinación fuera 
de la planta. 
 
 Estandarizar la técnica. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 27 - 
8. METODOLOGÍA. 
 
Debido a que la cromatografía de fase inversa, que es la más utilizada, se 
caracteriza por que la fase estacionaria es no polar o débilmente polar y el disolvente es 
más polar. Un disolvente menos polar tiene mayor fuerza eluyente. La cromatografía de 
fase inversa elimina las colas de los picos, porque la fase estacionaria tiene pocos 
puntos que adsorban con fuerza a ningún soluto originando colas. 
 
En una separación con fase inversa, la fuerza eluyente disminuye a medida que 
el disolvente se hace más polar. Combinando adecuadamente acetonitrílo-metanol, se 
dispone de una gama suficiente de interacciones bipolares, por puentes de hidrógeno, 
para separar un gran número de compuestos por cromatografía de fase inversa. 
Haciendo la mezcla de acetonitrílo- metanol; el metanol es el segundo disolvente 
orgánico que tiene mayor viscosidad y una longitud de onda de corte mayor (5). 
 
Haciendo caso a esta referencia se procedió a hacer un cambio en la fase móvil 
para así poder eluir la muestra y de esta manera poder detectar el ácido fólico en ella, 
ya que se esta trabajando con dos compuestos que ocasionan interacciones altamente 
dipolares. Experimentalmente ésta fase móvil no produjo resultados aceptables en la 
determinación de ácido fólico por lo que de acuerdo a la referencia consultada 
Vahteristo et. al. (1998) lo correspondiente es una mezcla de acetonitrílo-buffer de 
fosfatos 90:10, de esta manera el pH de la muestra se mantendría ya que el buffer de 
fosfatos tiene la función de ser un amortiguador de pH. 
 
Losgrupos folatos son altamente degradables en contacto con el aire y luz, se 
propone trabajar en condiciones de reducida luminosidad (casi a oscuras) y evitando el 
contacto con el aire, esto se logra colocando la muestra bajo una atmósfera de nitrógeno 
a fin de proteger los compuestos folatos de que se lleve a cabo una oxidación. 
 
Los folatos en los alimentos están presentes en distintas formas químicas y en 
varios estados de oxidación con diferentes sustituyentes del átomo de carbono y 
diferente grado de conjugación con el ácido glutámico. Se ha estimado que un 80% de 
los folatos presentes de forma natural en los alimentos se encuentra en forma 
poliglutámicas y el resto como glutamatos. Las formas poliglutamáticas no son 
 - 28 - 
asimilables por el organismo, ya que necesitan una desconjugación previa hasta formas 
monoglutamaticas. Esta transformación es realizada por la enzima g-glutamilhidrolasa o 
folato conjugasa (8). 
 
Los folatos para su análisis cromatográfico requieren ser hidrolizados 
enzimáticamente a formas monoglutamatos antes de poder ser cuantificados. 
 
9. MATERIALES Y MÉTODOS. 
 
9.1 Muestra de alimento. 
 Leche Descremada en Polvo (LDP) enriquecida con ácido fólico. 
 
9.2 Materiales analíticos. 
 
Reactivos 
Los reactivos usados son específicos para cromatografía líquida como: 
acetonitrílo, Metanol y agua todos de grado HPLC. 
 
Patrones 
Ácido fólico (AF o PGA) 
 
 Equipo 
Para este estudio se utilizó un cromatógrafo de líquidos de alta resolución 
(HPLC) de marca Perkin Elmer, modelo serie 200, equipado con una bomba 
cuaternaria, automuestreador, horno con temperatura ajustada a 35°C, con una columna 
SUPELCO Discovery C18 de 25cm x 4.6mm, loop de inyección de 200 µl, detector 
ultravioleta con una longitud de onda de 290 nm. El cromatógrafo de líquidos de alta 
resolución (HPLC) es controlado por un PC con software HP. 
 
 
 
 
 
 
 - 29 - 
 
9.3 Método. 
 
Preparación de soluciones 
 
• Buffer de Fosfátos pH 6.5 – 7.85 
Para un litro de solución se pesan 3.404g de KH2PO4 y 3.919g de NaHPO4 y se afora 
con agua destilada (el pH se verifica antes de iniciar la sesión experimental). 
• Bufer de Fosfátos pH 2.2 (fase móvil) 
Para un litro de solución se pesan 3.404g de KH2PO4 y 3.919g de NaHPO4 y se afora 
con agua grado HPLC; el pH se ajusta con HCl 6N. 
• Solución de HCl 6N 
Para un litro de solución se miden 220mL en probeta de 1000mL y se adiciona agua 
destilada hasta completar un litro. 
• Ácido Ascórbico 2% 
Para 200mL se pesan 4g y se afora con agua destilada. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 30 - 
9.4 Desarrollo Experimental. 
 
 
9.4.1 Preparación del Blanco 
 
 
Adicionar 50mL de buffer de fosfatos pH.6.5-7.85 
 
 
Homogenizar y someterlo en atmósfera de N2 durante 
10seg. 
 
 
Colocar en parrilla a ebullición durante 40min con 
agitación constante. Homogenizar 
 
 
Enfriar inmediatamente con hielo. 
 
 
Homogenizar y transferir a matraces de 100ml y 
aforar con buffer pH 6.5 – 7.85. 
α 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 31 - 
9.4.2 Preparación del Estándar para análisis por HPLC 
 
Adicionar 1 mL de sol. Estándar de ác. Fólico en un 
matraz ámbar. 
 
 
Adicionar 50mL de buffer de fosfatos pH.6.5-7.85 
 
 
Adicionar 10mL de ác. Ascórbico 2%. 
 
 
Homogenizar y someterlo en atmósfera de N2 durante 
10seg. 
 
 
Colocar en parrilla a ebullición durante 40min con 
agitación constante. Homogenizar 
 
 
Enfriar inmediatamente con hielo. 
 
 
Homogenizar y transferir a matraces de 100ml y 
aforar con buffer pH 6.5 – 7.85. 
 
 
 
 α 
 
 
 
 - 32 - 
9.4.3 Preparación de la muestra de Leche en Polvo Descremada 
 
Pesar de 10g de leche en polvo descremada LDP. 
 
Adicionar 50mL de buffer de fosfatos pH.6.5-7.85 
 
Adicionar 10mL de ác. Ascórbico 2%. 
 
Homogenizar y someterlo en atmósfera de N2 durante 
10seg. 
 
Colocar en parrilla a ebullición durante 40min con 
agitación constante. Homogenizar 
 
Enfriar inmediatamente con hielo. 
 
Homogenizar y transferir a matraces de 100ml y 
aforar con buffer pH 6.5 – 7.85. 
 
Someter la muestra a centrifugación durante 10min. A 
1200rpm. 
 
Filtrar la muestra en filtros Whatman Nº 4 y 
colocarlos en envase ámbar. 
 
 
 α
 
 
 
 
 - 33 - 
 
 
 
Purificación de folatos 
 
 
 Tomar 5mL y aplicar N2. 
 
 
 
Introducir a un baño a 37 °C durante 3hrs. 
 
 
 Enfriar inmediatamente con hielo.
 
 
 Filtrar la muestra en filtros Whatman Nº 4 y colocarlos en envase ámbar. 
 
El tratamiento para el blanco, estándar de ácido fólico y muestra de LDP se llevó a cabo 
en un sistema de HPLC de la siguiente manera: 
 
9.4.4 Análisis de Folatos con HPLC 
 
 Estabilizar el sistema con gradiente de acetonitrílo y 
Fosfato (90:10 , pH 2.2) 
 
 
Ajustar la columna a temperatura de 35°C
 
 
Longitud de onda de 290nm.
α
 
 
 
Fijar el flujo de inyección 
 
 - 34 - 
10. RESULTADOS. 
 
10.1 Estándares de ácido fólico 
 
 
Figura 7. Cromatograma del STD de ácido fólico, con una concentración de 
3.50µg/mL; tR de 5.26 min. 
 
 
 
 
Figura 8. Cromatograma del STD de ácido fólico, con una concentración de 
3.50µg/mL; tR de 5.27 min. 
 - 35 - 
 10.2 Muestras de Leche en polvo descremada (LDP) 
 
 
 
Figura 9. Cromatograma de la muestra de leche en polvo descremada, tR de ácido 
fólico 5.31min. 
 
 
 
Figura 10. Cromatograma de la muestra de leche en polvo descremada, tR de ácido 
fólico 5.35min. 
 
 - 36 - 
 
Figura 11. Cromatograma de la muestra de leche en polvo descremada, tR de ácido 
fólico 5.29min 
 
 
 
Figura 12. Cromatograma de la muestra de leche en polvo descremada, tR de ácido 
fólico 5.33min 
 
 
 
 - 37 - 
10.3 Muestras de leche en polvo descremada (LDP) con la adición de 
estándar de ácido fólico a diferentes concentraciones. 
 
 
Figura 13. Cromatograma de la muestra de leche en polvo descremada con adición de 
STD de ácido fólico a concentración de 3.5µg/mL; tR de ácido fólico 5.32 min. 
 
Figura 14. Cromatograma de la muestra de leche en polvo descremada con adición de 
STD de ácido fólico con concentración de 7µg/mL; tR de ácido fólico 5.36 min. 
 - 38 - 
 
Figura 15. Cromatograma de la muestra de leche en polvo descremada con adición de 
STD de ácido fólico con concentración de 10.5µg/mL; tR ácido fólico de 5.37 min. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 39 - 
11. DISCUSIÓN. 
 
El objetivo de este trabajo es mostrar un método optimizado que permita la 
extracción e identificación adecuada del ácido fólico en leche en polvo descremada 
(LDP) con equipo de vanguardia como lo es el sistema de HPLC; para lo cual se hace 
referencia en autores que han desarrollado métodos reproducibles y confiables como es 
el caso de Vahteristo et. al. 1998, pues después de este aporte que hizo el método se ha 
utilizado para la extracción de ácido fólico en diferentes alimentos y los resultados en la 
mayoría de ellos han sido reproducibles y se han estandarizado y validado. 
 
Para la implementación de la técnica de extracción de ácido fólico se 
consultaron las etapas del método cromatográfico empleado para el análisis de folatos 
en alimentos basado en el método de Vahteristo et al. (1996); para el cual las etapas de 
extracción son: homogeneizado, extracción con buffer de fosfatos, desconjugación, 
purificación, filtración, y el análisis en HPLC; llevando a cabo este procedimiento en el 
laboratorio de Liconsa GMS se hizo una modificación sometiendo la muestra a un 
proceso de centrifugación debido a que el cromatógrafo no cuenta con una precolumna 
la cual pueda hacer más fácil y limpia la inyección en la columna para la obtención del 
cromatograma. 
 
Los estándares de ácido fólico se trabajaron tal cual se indica en el desarrollo 
experimental, se hicieron variacionesen cuanto al volumen de solubilización esto como 
se puede observar en la fig. 6 y 7 no produce variaciones considerables en los tiempos 
de retención de esta forma al procesar la muestra de con volumen de 100mL en lugar de 
50mL hace más fácil la filtración en los acrodiscos. 
 
Al hacer la inyección en el cromatógrafo de la muestra de leche en polvo 
descremada se observaron varios picos en el cual hay uno que se aproxima al tiempo de 
retención que se obtuvo al procesar el estándar, el tiempo de retención de esta muestra 
fue de 5.31min, aunque se observan dos antes de éste para lo cual se prosiguió 
inyectando mas muestras para poder verificar la reproducibilidad del cromatograma. 
 
 - 40 - 
En la fig. 10 se observa la semejanza que este tiene con el cromatograma de la 
fig. 9, nuevamente aquí se observa un pico en el tiempo de retención 5.35min. Éste pico 
es el más próximo al tR de los estándares procesados. 
 
Las variaciones de las alturas en cuanto a los picos observados en los 
cromatogramas pueden deberse a la limpieza en el momento de trabajar o bien en la 
limpieza de la columna ya que durante las sesiones experimentales fue detectado que la 
columna retenía fácilmente la acumulación de sólidos, debido a esto no todos los 
cromatogramas tienen una altura que sea homogénea, a pesar de esta variante sigue 
saliendo un pico en el tR cercano al detectado en el proceso de los estándares. 
 
El tratamiento enzimático al que debe ser sometida la muestra debe llevarse a 
cabo con la enzima cojugasa (11), debido a que esta enzima convierte los 
poliglutamatos en monoglutamatos haciendo la identificación por HPLC de manera más 
fácil y rápida. 
 
Se realizó la curva tipo de los estándares de ácido fólico a concentraciones de 
3.5µg/mL, 7 µg/mL, 10.5 µg/mL, 14 µg/mL y 17.5 µg/mL, en donde la identificación 
del ácido fólico se efectúa en un tiempo de retención oscila entre 5.21 y 5.27 min. La 
respuesta al comportamiento de los estándares trabajados fue lineal (Anexo 1). 
 
Durante el procedimiento se trabajaron muestras de leche en polvo descremada y 
muestras de leche en polvo descremada con la adición de estándar a concentraciones de 
3.5µg/mL, 7µg/mL y 10µg/mL; para lo cual se utilizó como referencia los 
cromatogramas de la curva tipo a dichas concentraciones para tener como referencia el 
tiempo de retención que podría identificarse el ácido fólico (Anexo 2). 
 
Las muestras de leche en polvo descremada, fueron trabajadas con aforos de 
100mL debido a que en aforos de 50mL la frecuencia con la que se rompía la membrana 
de los acrodiscos por los cuales es filtrada la muestra es alta. A pesar de que la muestra 
era diluida al doble no afecta para la identificación del ácido fólico; esto se comprobó 
en el tratamiento de los estándares. La filtración de la muestra es fundamental pues en 
esta etapa se reduce el tamaño de partícula de la muestra a identificar, esta filtración es 
de las etapas finales del proceso por lo cual debe de hacerse de manera adecuada para 
 - 41 - 
facilitar la inyección y la identificación del ácido fólico; pues mientras menor sea la 
cantidad de materia extraña los cromatogramas saldrán limpios. 
 
La adición del antioxidante ácido ascórbico no interfiere en la detección del 
ácido fólico ni en los tiempos de retención, este antioxidante es utilizado debido a la 
susceptibilidad de los folatos en condiciones oxidativas; el ácido ascórbico otorga 
estabilidad a las condiciones alcalinas (11). 
 
La estabilidad de las soluciones en cuanto a pH eran comprobadas regularmente 
previo a cada análisis, a fin de comprobar que las concentraciones si correspondían con 
las determinadas cuando dichas soluciones fueron preparadas para su almacenamiento. 
 
Por cuestiones de tiempo no fue posible trabajar con la enzima conjugasa que es 
la recomendada por referencia bibliográfica Vahteristo et. al. 1998. Aún cuando no se 
trabajó con dicha enzima los resultados son favorables y reproducibles, ya que se estuvo 
trabajando con varias muestras en las cuales se comprobó que es viable trabajar la 
técnica. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 - 42 - 
12. CONCLUSIONES. 
 
• Se logró la identificación del ácido fólico en muestras de leche en polvo 
descremada, con la técnica propuesta. 
 
• Los resultados son reproducibles en un 85% de las muestras de leche en 
polvo descremada procesadas con esta técnica. 
 
• El método es fiable y reproducible, aunque para llevar a cabo la 
estandarización de la técnica es necesario trabajar con la conjugasa para 
valorar cual de los dos métodos es el más confiable para la cuantificación del 
ácido fólico. 
 
• El pH óptimo para la extracción del ácido fólico es de 6.85 + 0.15. 
 
 
• En el proceso de extracción del ácido fólico el ácido ascórbico utilizado 
como antioxidante otorga una mayor estabilidad y no interfiere para la 
identificación. 
 
• El cambio de la fase móvil fue fundamental ya que es una mezcla de 
acetonitrílo – buffer de fosfatos en proporciones de 90:10, lo que ayuda a 
mantener estable el pH del ácido fólico. 
 
• La sensibilidad a la luz, calor y oxígeno de esta molécula la hacen 
susceptible a los métodos empleados en la preparación de los alimentos, ya 
que se pierde gran cantidad al lixiviarse con el agua de cocción, puesto que 
es una vitamina hidrosoluble. 
 
• La optimización del método cromatográfico, permite resultados fiables, 
rápidos para la extracción e identificación del ácido fólico en leche en polvo 
descremada. 
 
 - 43 - 
ANEXO 1 
 
 
Tlabla 3. Cuadro de datos para elaborar la curva tipo del estándar de ácido fólico. 
 
 
Área Concentración de ácido fólico (µg/mL) 
131202 3.5 
273588 7 
131386 10.5 
155746 14 
164781 17.5 
 
 
 
 
 
Figura 16. Curva tipo del estándar de ácido Fólico 
 
 
 
 
 
 - 44 - 
ANEXO 2. 
 
 
Figura 17. Cromatograma del STD de ácido fólico, a concentración de 3.50µg/mL, tR 
de 5.27 min. 
 
 
Figura 18. Cromatograma del STD de ácido fólico, a concentración de 3.50µg/mL; tR 
de 5.3 min. 
 
 - 45 - 
 
Figura 19. Cromatograma del STD de ácido fólico, a concentración de 3.50µg/mL, tR 
de 5.36 min. 
 
 
 
13. RECOMENDACIONES. 
 
• La adquisición de una precolumna compatible con la columna del 
cromatógrafo para hacer que la muestra al ser inyectada sea más pura. 
 
• Las condiciones físicas de trabajo son en un cuarto con luminosidad roja ya 
que esta es la de menor intensidad y se evita de esta manera la oxidación del 
ácido fólico durante la extracción. 
 
• Los pH’s de las soluciones deben verificarse antes de iniciar la sesión 
experimental para evitar variaciones en los resultados. 
 
 
 
 
 
 - 46 - 
14. BIBLIOGRAFÍA. 
 
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