ALVARO-R-ESCALANTE-SANSORES

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN BIOTECNOLOGÍA APLICADA 
 
 
DESARROLLO DE UN BIOFERTILIZANTE DE RIZOBACTERIAS 
TOLERANTES A AGROQUÍMICOS Y SU EVALUACIÓN EN 
INVERNADERO 
 
 
 TESIS 
 
QUE PARA OPTENER EL GRADO DE MAESTRO 
EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA APLICADA 
 PRESENTA 
 
 
ALVARO RICARDO ESCALANTE SANSORES 
 
TEPETITLA DE LARDIZABAL, TLAXCALA, ENERO, 2018 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
A la M.C. Lilia Tapia, al Dr. Erik Ocaranza, y a la Dra. Myrna Solís, por permitirme 
ser parte del presente proyecto, así como de sus enseñanzas, y el apoyo que me 
brindaron durante toda la maestría. 
 
A los miembros de mi comité revisor, la Dra. Flor de Fátima Rosas, y al Dr. Eric 
López, por su tiempo y ayuda durante la realización del proyecto. 
 
A mis compañeros de laboratorio por su apoyo y ayuda brindada dentro del 
laboratorio. 
 
Al consejo nacional de ciencia y tecnología (CONACyT) por la beca otorgada para 
la realización de mis estudios de maestría. 
 
Al programa institucional de formación de investigadores (PIFI) del Instituto 
Politécnico Nacional, por el apoyo económico brindado a lo largo de la maestría. 
 
A Rita Karen, por su incondicional ayuda y por compartir esta experiencia juntos. 
 
A mi madre y hermana por su apoyo y confianza en mí. 
 
A la memoria de mi Padre. 
 
 
RESUMEN ........................................................................................................................................................................... 8 
ABSTRACT ......................................................................................................................................................................... 9 
1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................................................... 10 
2. MARCO TEÓRICO .................................................................................................................................................. 11 
2.1. BIOESTIMULANTES VEGETALES ........................................................................................................ 11 
2.2. RIZOBACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO VEGETAL .................................................. 13 
2.1.1. Mecanismos de acción de las PGPR ............................................................................................ 15 
2.3. BIOFERTILIZANTES ................................................................................................................................. 20 
3 JUSTIFICACIÓN ...................................................................................................................................................... 24 
4 OBJETIVOS ............................................................................................................................................................ 25 
4.1 OBJETIVO GENERAL .............................................................................................................................. 25 
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................................................... 25 
5 METODOLOGÍA ...................................................................................................................................................... 26 
5.1 MEDIOS DE CULTIVO ............................................................................................................................. 26 
5.2 CONSERVACIÓN DE CEPAS BACTERIANAS .................................................................................... 26 
5.3 ENSAYO DE GERMINACIÓN ................................................................................................................. 27 
5.4 SOLUBILIZACIÓN DE FOSFATOS ........................................................................................................ 28 
5.5 DETERMINACIÓN DE FITORREGULADORES ................................................................................... 29 
5.6 EVALUACION DE LA TOLERANCIA A AGROQUÍMICOS ................................................................. 30 
5.7 ACTIVIDAD ANTAGONISTA CONTRA Streptomyces sp ................................................................... 31 
5.8 EVALUACIÓN DE LAS BACTERIAS EN INVERNADERO ................................................................. 33 
5.8.1 Cultivo de Papa (Solanum tuberosum) ......................................................................................... 33 
5.8.2 Cultivo de Jitomate (Solanum lycopersicum) ............................................................................... 35 
5.9 EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO BACTERIANO EN DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO .... 36 
5.10 EVALUACIÓN DE DIFERENTES SOPORTES Y SU VIABILIDAD EN ALMACENAMIENTO ....... 37 
5.11 ANÁLISIS ESTADÍSTICOS ...................................................................................................................... 38 
6 RESULTADOS ........................................................................................................................................................ 39 
6.1 ENSAYO DE GERMINACIÓN ................................................................................................................. 39 
6.2 SOLUBILIZACIÓN DE FOSFATOS ........................................................................................................ 40 
6.3 DETERMINACIÓN DE FITORREGULADORES ................................................................................... 43 
6.4 EVALUACION DE LA TOLERANCIA A AGROQUÍMICOS ................................................................. 47 
6.5 ACTIVIDAD ANTAGONISTA CONTRA Streptomyces sp ................................................................... 48 
6.6 EVALUACIÓN DE LAS BACTERIAS EN INVERNADERO ................................................................. 49 
6.6.1 Papa (Solanum tuberosum) ................................................................................................................. 49 
6.6.2 Cultivo de Jitomate (Solanum lycopersicum) .................................................................................... 56 
6.7 EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO BACTERIANO EN DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO .... 59 
6.8 EVALUACIÓN DE DIFERENTES SOPORTES Y SU VIABILIDAD EN ALMACENAMIENTO ................................. 62 
7 CONCLUSIONES .................................................................................................................................................... 65 
8 REFERENCIAS ....................................................................................................................................................... 66 
 
 
 
ÍNDICE DE TABLAS 
Tabla 1. Dosis recomendada por los fabricantes de los siete agroquímicos empleados en la evaluación in 
vitro de la resistencia a agroquímicos ............................................................................................................. 31 
Tabla 2. Notación de los tratamientos en el cultivo de papa ........................................................................... 34 
Tabla 3. Resultados de ensayo de germinación (Índice de vigor relativo) ...................................................... 39 
Tabla 4. Índice de solubilización de fosfatos (PSI) .......................................................................................... 41 
Tabla 5. Cuantificación de fitohormonas por HPLC ........................................................................................ 45 
Tabla 6. Tolerancia a agroquímicos de las cepas aisladas ............................................................................. 47 
Tabla 7. Inhibición de Streptomyces ............................................................................................................... 48 
Tabla 8. Resultados al día 15 del experimentoen Papa ................................................................................. 50 
Tabla 9. Resultados al día 50 del experimento en Papa ................................................................................. 51 
Tabla 10. Resultados al día 70 del experimento en Papa ............................................................................... 53 
Tabla 11. Resultados del muestro al día 45. ................................................................................................... 56 
Tabla 12. Resultados del muestro al día 90 .................................................................................................... 57 
Tabla 13. Crecimiento bacteriano en medio con digestato ............................................................................. 60 
Tabla 14. Crecimiento bacteriano en medio con lixiviado ............................................................................... 60 
Tabla 15. Composición elemental del lixiviado y digestato ............................................................................. 61 
Tabla 16. Crecimiento bacteriano en la suspensión inicial .............................................................................. 62 
Tabla 17. Supervivencia después del secado ................................................................................................. 62 
 
ÍNDICE DE FIGURAS 
Figura 1. Ensayo de antagonismo contra Streptomyces sp ............................................................................ 32 
Figura 2. Distribución de los tratamientos aplicados en el experimento en papa ............................................ 34 
Figura 3. Ensayo de germinación de semillas de jitomate inoculadas con rizobacterias in vitro ..................... 40 
Figura 4. Solubilización de fósforo inorgánico en medio NBRIP ..................................................................... 42 
Figura 5. TLC de los extractos bacterianos en luz UV de onda corta (254 nm) .............................................. 43 
Figura 6. Revelado de TLC con ácido sulfúrico 5% y luz UV de onda larga (365 nm) .................................... 44 
Figura 7. Curvas de calibración y cromatogramas de AIA, GA y Kinetina ...................................................... 45 
Figura 8. Streptomyces sp. aislado de papa ................................................................................................... 48 
Figura 9. Peso y longitud de plantas al día 15 ................................................................................................ 50 
Figura 10. Peso y longitud de plantas al día 50 .............................................................................................. 52 
Figura 11.Peso y longitud de plantas al día 70 ............................................................................................... 53 
Figura 12. Rendimiento de papa por planta en invernadero ........................................................................... 54 
Figura 13. Cinética de crecimiento de experimento en papa .......................................................................... 55 
Figura 14. Peso fresco y seco de frutos .......................................................................................................... 58 
Figura 15. Gráfica de vida de anaquel ............................................................................................................ 64 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMEN 
 
Como resultado de uso de agroquímicos, en partículas plaguicidas, la contaminación 
actual del suelo es un problema de gran preocupación. Una cantidad considerable de los 
plaguicidas terminan en el suelo, lo que resulta en efectos dañinos a otros organismos no 
blanco, incluyendo a los microrganismos del suelo. Los plaguicidas que permanecen 
afectan de manera adversa la estructura composición, y actividades metabólicas de las 
comunidades microbianas, estos cambios conllevan a la pérdida de fertilidad y 
sustentabilidad de los campos agrícolas. Una alternativa ha sido el uso de rizobacterias 
benéficas conocidas como PGPR, por sus siglas en inglés (Plant growth promoting 
rhizobacteria), como inoculantes. Las PGPR’s pueden facilitar el crecimiento vegetal a 
través de diversos mecanismos; fijación de nitrógeno, solubilización de fósforo, producción 
de diversos compuestos como sideróforos, fitohormonas y antibióticos. Las rizobacterias 
promotoras de crecimiento vegetal resistentes o tolerantes a agroquímicos podrían ser 
integradas a las prácticas agrícolas convencionales, manteniendo su efecto en el 
incremento del rendimiento de los cultivos. 
En este trabajo se aislaron 118 rizobacterias que crecieron en presencia plaguicidas a 
diferentes concentraciones. Posteriormente se evaluó su efecto en semillas de jitomate y 
se observó que 4 rizobacterias promovían el crecimiento, los cuales fueron seleccionadas. 
A continuación, se evaluó en los microrganismos la capacidad de solubilizar fósforo 
inorgánico, producir ácido indol acético, ácido giberélico y kinetina, además se evaluó su 
capacidad antagonista contra Streptomyces in vitro. 
Con la finalidad de evaluar el efecto de las rizobacterias en las plantas se efectuaron dos 
experimentos en invernadero. En uno de ellos se inocularon papas y se observó que la 
cepa 3 y 4 incrementaban el rendimiento de papa. En el segundo experimento se 
inocularon semillas de jitomate y después de 70 días se registró un incremento en el peso 
seco de los frutos de las plantas inoculadas con la cepa 1. 
Se desarrollaron tres presentaciones diferentes (líquido, soporte sólido y encapsulado), y 
se evaluó su vida de anaquel, probando que las presentaciones líquidas y el soporte sólido 
fue capaz de mantener las células viables a concentraciones mayores a 8 log durante 90 
días. 
ABSTRACT 
 
Because of the use of agrochemicals, particularly pesticides, the current 
contamination of the soil is a problem of great concern. A considerable amount of 
the pesticides ends up in the soil, which results in harmful effects to other non-
target organisms, including soil microorganisms. The pesticides that remain, 
adversely affect the composition, structure and metabolic activities of the microbial 
communities, these changes lead to the loss of fertility and sustainability of 
agricultural fields. A recent alternative is the use of beneficial rhizobacteria known 
as PGPR (Plant growth promoting rhizobacteria), as inoculants. PGPR's can 
facilitate plant growth through various mechanisms; nitrogen fixation, phosphorus 
solubilization, production of various compounds such as siderophores, 
phytohormones and antibiotics. The pesticide resistant or tolerant PGPR could be 
integrated into conventional agricultural practices, maintaining its effect on 
increasing crop yields. 
In this work, 118 rhizobacteria that grew in the presence of pesticides at different 
concentrations were isolated. Subsequently, its effect on tomato seeds was 
evaluated and it was observed that 4 rhizobacteria promoted growth, which were 
selected. Next, the ability to solubilize inorganic phosphorus, produce indole acetic 
acid, gibberellic acid and kinetin was evaluated in the microorganisms, and its 
antagonistic use against Streptomyces in vitro was evaluated. 
In order to evaluate the effect of rhizobacteria on the plants, two greenhouse 
experiments were carried out. In one of them potatoes were inoculated, and it was 
observed that strain 3 and 4 increased potato yield. In the second experiment, 
tomato seeds were inoculated and after 70 days an increase in the dry weight of 
the fruits of the plants inoculated with strain 1 was registered. 
Three different presentations were developed (liquid, solid support and 
encapsulation), and their shelf life was evaluated, proving that liquid presentations 
and solid support was able to keep viable cells at concentrations greater than 8 
logs for 90 days.1. INTRODUCCIÓN 
 
En las últimas décadas el aumento sostenido de la población mundial ha llevado a 
la búsqueda de nuevas tecnologías capaces de incrementar el rendimiento de los 
cultivos vegetales. El uso de fertilizantes químicos ha mejorado la producción, sin 
embargo, su uso desmedido ha generado daños ambientales y a la salud (Pérez-
Montaño et al., 2014) 
Debido a esta problemática, investigadores a nivel mundial se han enfocado a 
encontrar alternativas a la fertilización química, que sean rentables y sustentables. 
Una tecnología alternativa ha sido el uso y producción de biofertilizantes. Los 
biofertilizantes son productos que contienen microrganismos vivos y que, al ser 
aplicados en plantas, promueven el crecimiento de la misma (Vessey, 2003). 
Muchos biofertilizantes están formulados con rizobacterias promotoras de 
crecimiento vegetal, PGPR por sus siglas en inglés. Estos microrganismos 
colonizan la rizósfera de las plantas y mediante diversos mecanismos facilitan 
nutrientes a la planta, o disminuyen el efecto nocivo de otros agentes bióticos o 
abióticos (Ahemad & Kibret, 2013). 
A pesar de que la investigación sobre biofertilizantes ha ido en aumento en los 
últimos años, aún es una tecnología que no ha sido aceptada ampliamente para 
su uso, una razón es que algunos biofertilizantes no suelen tener el efecto deseado 
en todos los suelos, debido a condiciones prexistentes del mismo suelo, como 
puede ser, características del suelo, competencia directa por otros 
microrganismos, contaminación (fertilizantes, pesticidas) (Ahemad & Khan, 2012). 
Debido a esto, es importante la búsqueda de microrganismos adaptados a estas 
condiciones, para maximizar los efectos benéficos bajo condiciones adversas. 
Este trabajo de tesis se desarrolla en el marco del proyecto del Fondo Nacional 
del Emprendedor 2015, programas de desarrollo empresarial modalidad fomento 
a las iniciativas de innovación en vinculación con la empresa Agroquímicos El 
Trébol SA de CV. La problemática que presenta la empresa es que, debido al uso 
de agroquímicos, en particular plaguicidas, en los campos de cultivo e 
invernaderos de la región, afecta de manera negativa los biofertilizantes usados, 
por lo que el efecto esperado no se obtiene. Por lo que en este proyecto se 
contempló el desarrollo de un biofertilizante formulado con rizobacterias 
promotoras de crecimiento vegetal que sean tolerantes a los pesticidas usados 
frecuentemente en la región central de la República Mexicana. 
2. MARCO TEÓRICO 
 
2.1. BIOESTIMULANTES VEGETALES 
Actualmente no existe una definición regulatoria del término bioestimulante en 
ninguna parte del mundo, sin embargo, la comunidad científica ha reconocido 
como tal una amplia serie de sustancias y microrganismos benéficos, entre ellos 
encontramos los ácidos húmicos y fúlvicos, hidrolizados de proteína y otros 
compuestos nitrogenados, extractos botánicos, biopolímeros, algunos compuestos 
inorgánicos, bacterias y hongos benéficos (Halpern et al., 2015). 
Las sustancias húmicas son constituyentes naturales de la materia orgánica del 
suelo, resultantes de la descomposición de residuos animales, vegetales y 
microbianos. Originalmente categorizadas como ácidos húmicos y fúlvicos por su 
peso molecular y solubilidad. (Rose et al., 2014). Aunque el uso de estas 
sustancias promueve el crecimiento vegetal, sus resultados son muy variables, 
debido a la fuente de las sustancias húmicas, la dosis y la forma de aplicación 
(Rose et al., 2014). Los efectos bioestimulantes de las sustancias húmicas (SH) 
han sido atribuidos a diferentes mecanismos, como es la alta capacidad de 
intercambio catiónico de las sustancias polianiónicas (SH), el aumento de la 
disponibilidad de fósforo, o debido a la estimulación de la ATPasa de la membrana 
vegetal (Jindo et al., 2012). 
Los hidrolizados de proteína son obtenidos de hidrólisis enzimática o química de 
residuos agroindustriales, tanto como de residuos animales o vegetales (Halpern 
et al., 2015). Estos compuestos han tenido cierto éxito como bioestimulantes al 
aumentar directamente la asimilación de nitrógeno, también se ha reportado el 
efecto quelante de ciertos aminoácidos como la prolina, el cual puede actuar 
protegiendo a la planta de metales pesados, o contribuyendo a la solubilización de 
algunos micronutrientes. Otros efectos indirectos reportados han sido el aumento 
en la biomasa microbiana, así como su actividad en el suelo (Calvo et al., 2014). 
El uso de extractos de algas marinas ha sido usado recientemente como 
bioestimulante, algunos de los componentes que se atribuyen al afecto son 
polisacáridos como la laminarina, alginatos y carragenanos; esteroles, y otros 
compuestos nitrogenados. Muchos de los extractos provienen de algas marrones 
y rojas (Khan et al., 2009). El uso de extractos botánicos es menos usado como 
bioestimulante, su uso se ha enfocado principalmente a las propiedades 
plaguicidas que posee. (du Jardin, 2015). 
Algunos biopolímeros han sido usados como bioestimulante, el quitosan ha sido 
usado como un potenciador de la resistencia sistémica de las plantas, al unirse en 
receptores específicos, similares a bacterias patógenas (Katiyar et al., 2015). 
Los hongos micorrizas son un grupo heterogéneo de diversos taxones, los cuales 
establecen simbiosis con alrededor del 90% de las especies vegetales. Los hongos 
micorrizas arbusculares, son el tipo de endomicorrizas encontrados en la mayoría 
de los cultivos y hortalizas, donde la hifa fúngica penetra dentro de la pared celular 
de las raíces vegetales, formando estructuras ramificadas llamadas arbúsculos (du 
Jardin, 2015). Existen ciertos beneficios aceptados por el uso agrícola de 
micorrizas, entre ellos proporcionar micro y macronutrientes, esencialmente 
fósforo, un mejor balance acuoso y protección contra estrés biótico y abiótico, sin 
embargo, la mayor limitación actual es la dificultad de propagar las micorrizas 
arbusculares a gran escala (Gianinazzi et al., 2010). 
Por otra parte, el uso de bacterias benéficas ha venido aumentando en los últimos 
años. Podemos distinguir dos tipos principales: 1) endosimbiontes mutualistas del 
género Rhizobium y 2) mutualistas rizosféricas como las PGPR’s (rizobacterias 
promotoras de crecimiento vegetal). Las bacterias del género Rhizobium han sido 
comercializadas ampliamente como biofertilizantes (facilitando la nutrición 
vegetal), mientras que las PGPR’s son multifuncionales e influencian muchos 
aspectos de la vida vegetal, entre ellos, la nutrición y el crecimiento, morfogénesis 
y desarrollo, así como la respuesta a factores bióticos y abióticos (Bhattacharyya 
& Jha, 2012). Sin embargo, debido a la complejidad de estas interacciones, así 
como las respuestas variables en diferentes cultivares y ambientes, muchas veces 
se traducen en resultados inconsistentes en la práctica (Arora, et al., 2011). 
 
2.2. RIZOBACTERIAS PROMOTORAS DE CRECIMIENTO 
VEGETAL 
 
La rizósfera es la zona del suelo que está rodeando directamente el sistema 
radicular de las plantas (Walker et al., 2003), por lo tanto, las rizobacterias son el 
grupo de bacterias competentes en colonizar la raíz (Kloepper et al., 1991). 
Las raíces, además de proporcionar el sustento mecánico y facilitar la toma de 
agua y nutrientes, también sintetizan, acumulan y secretan una gran cantidad de 
diversos compuestos (Walker et al., 2003). Estos compuestos actúan como 
atrayentes químicos para un vasto número de diversas comunidades microbianas. 
Estas sustancias secretadas por las raíces son llamadas exudados radiculares y 
modifican las propiedades físicas y químicas el suelo y por lo tanto regulan la 
estructura de las comunidades microbianas en la proximidad de la superficie 
radicular (Dakora & Phillips, 2002). 
Algunos de estos exudados actúan como repelentes contra algunos 
microrganismos, mientas que otros actúan como atrayentes.La composición de 
los exudados dependerá del estado fisiológico y de la especie de planta, así como 
de los microrganismos presentes. (Kang et al., 2010). 
Por lo tanto, la rizósfera puede ser definida como el volumen de suelo 
específicamente influenciado por las raíces y sus exudados (Dessaux et al., 2009). 
Específicamente se reconocen tres componentes separados pero que interactúan 
dentro de la rizósfera: a) El suelo rizosférico, b) El rizoplano, y c) la raíz. El 
rizoplano es la superficie de la raíz y las partículas de suelo adheridas fuertemente 
a ella (Barea et al., 2005). La colonización del rizoplano y otros tejidos de la raíz 
es conocido como colonización radicular, mientas que la colonización del volumen 
de suelo adyacente, bajo la influencia de la raíz, es conocida como colonización 
rizosférica (Kloepper, 1994). 
Muchos géneros diferentes de bacterias son componentes vitales del suelo. Están 
involucradas en varias actividades bióticas del suelo, como la transformación de 
nutrientes (Ahemad, et al., 2009). Sin embargo, las bacterias que viven alrededor 
o sobre las raíces vegetales (rizobacterias) son las más versátiles transformando, 
movilizando y solubilizando los nutrientes, comparadas con las que viven en el 
suelo como tal (Hynes et al., 2008). 
Las rizobacterias son las dominantes en procesos de reciclado de nutrientes y, en 
consecuencia, son cruciales para la fertilidad del suelo (Glick, 2012). Actualmente 
los productos de origen biológico, como los biofertilizantes y bioestimulantes, para 
mejorar los cultivos están ganando importancia entre los agrónomos y productores, 
en este contexto la investigación mundial se está enfocando a explorar un gran 
intervalo de rizobacterias con características deseables para ser usadas como 
bioinoculantes o biofertilizantes para promover el crecimiento y desarrollo vegetal 
(Ahemad & Kibret, 2014). 
Las rizobacterias benéficas se conocen como PGPR, acrónimo del inglés “Plant 
growth-promoting rhizobacteria”, este término fue usado por primera vez por 
Kloepper (Kloepper & Schroth, 1978). En general las PGPR deben cumplir tres 
criterios: ser capaces de colonizar la raíz o la zona de influencia, sobrevivir y 
multiplicarse en el microhábitat asociados a la raíz y estimular el crecimiento 
vegetal (Kloepper, 1994). 
Las PGPR, representan una gran variedad de bacterias del suelo, que cuando 
crecen en asociación con una planta hospedadora, resulta en una estimulación de 
su crecimiento (Vessey, 2003). Son de los microorganismos de importancia 
agronómica más usados y estudiados recientemente. 
Se ha reportado que las PGPR están asociadas a muchos tipos de plantas y se 
encuentran presentes en una gran variedad de ambientes. Para que exista este 
efecto benéfico en el crecimiento de la planta, se necesita que ambos organismos 
estén relacionados estrechamente. Algunas bacterias colonizan la superficie de la 
raíz el rizoplano, otras pueden ser capaces de tener comportamiento endofítico, 
colonizando el interior de raíces, tallos, hojas, etc. (Compant, et al, 2005). 
Durante el proceso de colonización, las bacterias son atraídas por los exudados 
radiculares, ricos en carbohidratos y aminoácidos, necesarios para el crecimiento 
bacteriano (Ahemad & Kibret, 2014). 
Algunos géneros que se han reportado tener actividad PGPR son: Pseudomonas, 
Serratia, Azospirillium, Azotobacter, Bacillus, Burkholderia, Enterobacter, 
Rhizobium, Erwinia, Acinetobacter, Alcaligenes, Arthrobacter y Flavobacterium 
(Armada, et al., 2015, Luna, et al., 2012, Menamo & Wolde, 2015, Çakmakçi, et 
al., 2006, Kumar et al., 2014, Vessey, 2003, Kloepper, & Schroth, 1978, Kloepper, 
1991, Zaidi, 2015, Compant, et, al, 2005) 
2.1.1. Mecanismos de acción de las PGPR 
La promoción del crecimiento vegetal ocurre por la alteración de la comunidad 
microbiana en la rizósfera, mediante la producción de varias sustancias (Kloepper 
& Schorth, 1978). Generalmente las PGPR actúan directamente, al facilitar la 
adquisición de recursos (nitrógeno, fósforo y otros minerales esenciales) o 
modulando el nivel de hormonas de la planta. Indirectamente actúan al reducir 
efectos inhibitorios de patógenos o el ambiente (Glick, 2012). 
Mecanismos directos 
Fijación de nitrógeno 
El nitrógeno es el nutriente más importante para el crecimiento y la productividad 
de las plantas. A pesar de que la atmósfera está compuesta aproximadamente del 
78% de N2 es inaccesible para las plantas. El nitrógeno atmosférico es convertido 
en formas asimilables para la planta mediante la “Fijación Biológica de Nitrógeno” 
(BNF), el cual transforma el Nitrógeno gaseoso en amoniaco por microrganismos 
que portan un sistema enzimático conocido como Nitrogenasa (Kim & Rees, 1994). 
Los organismos fijadores de Nitrógeno son categorizados como: a) simbióticos, 
que incluye miembros de la familia Rhizobiaceae los cuales forman simbiosis con 
leguminosas, y b) no simbióticos o de vida libre, como las cianobacterias, y 
miembros de géneros como: Azospirillum, Azotobacter, Azocarus, etc 
(Bhattacharyya & Jha, 2012). 
Solubilización de fosfatos 
El fósforo (P), es el segundo nutriente más importante y limitante del crecimiento 
de la planta, después del nitrógeno, es abundante en el suelo tanto en forma 
orgánica como inorgánica (Khan et al., 2009). A pesar de que el suelo es un gran 
reservorio de P, la cantidad biodisponible para las plantas es baja. Esto es debido 
a que la mayor parte del fósforo del suelo se encuentra en formas insolubles, 
mientras que las plantas solamente pueden absorberlo en dos formas solubles: 
monobásico (H2PO4-) y dibásico (HPO42-). El fósforo en el suelo se encuentra en 
formas insolubles como la apatita, fitato, fosfomonoésteres y fosfodiésteres (Glick, 
2012). 
Microrganismos con actividad solubilizadora de fosfatos (PSM) pueden proveer 
formas asimilables de fósforo para la planta. Los géneros como: Azotobacter, 
Bacillus, Beijerinckia, Burkholderia, Enterobacter, Erwinia, Flavobacterium, 
Microbacterium, Pseudomonas, Rhizobium y Serratia han sido reportados como 
las bacterias solubilizadoras de fosfatos (PSB) más relevantes (Bhattacharyya & 
Jha, 2012). 
La solubilización de fósforo inorgánico ocurre como consecuencia de la acción de 
algunos ácidos orgánicos de bajo peso molecular, los cuales son sintetizados por 
varias rizobacterias (Zaidi, et al., 2009). Por otra parte, la solubilización de fósforo 
orgánico (mineralización) ocurre a través de la síntesis de una variedad de 
diferentes fosfatasas, las cuales catalizan la hidrólisis de ésteres fosfóricos. Ambos 
mecanismos son posibles en una misma bacteria (Glick, 2012). 
Producción de sideróforos 
El Hierro (Fe), es un nutriente vital para la mayoría de las formas de vida. En 
ambientes aeróbicos el hierro está presente principalmente como Fe3+ y es común 
que forme hidróxidos y oxihidróxidos insolubles, haciéndolo generalmente 
inaccesible para plantas y microrganismos (Rajkumar et al., 2010). Comúnmente, 
las bacterias adquieren hierro mediante la secreción de quelantes de bajo peso 
molecular llamados sideróforos. La mayoría de los sideróforos son solubles en 
agua y pueden ser intra o extra celulares. Algunas rizobacterias tienen la habilidad 
de usar sideróforos de otros géneros (heterólogos), mientras que otros solamente 
pueden utilizar los sideróforos de la misma especie (Khan et al., 2009). 
En las rizobacterias, el hierro (Fe3+) en el complejo Fe3+ - sideróforo en la 
membrana bacteriana es reducido a Fe2+, el cual es después liberado dentro de la 
célula por medio de un mecanismo de transporte. Durante este proceso de 
reducción el sideróforo puede ser destruido o reciclado (Neilands, 1995). 
Además de hierro, algunos sideróforos pueden formar complejos estables con 
otros metales pesados como Al, Cd, Cu, Ga, In, Pb y Zn, al igual que algunos 
radionúcleos como U y Np (Neubauer et al., 2000). Porlo tanto, los sideróforos 
bacterianos pueden aliviar el estrés causado a las plantas por altos niveles de 
metales pesados en el suelo. 
Las plantas asimilan el hierro bacteriano por diferentes mecanismos como: a) 
directamente del complejo sideróforo-Fe, o por medio de reacciones de 
intercambio iónico (Schmidt, 1999). 
PRODUCCIÓN DE FITOHORMONAS 
Ácido indol acético (AIA) 
La síntesis microbiana de la fitohormona auxina ácido indol-3-acético (AIA), ha sido 
conocida por bastante tiempo. Generalmente AIA secretado por las rizobacterias 
interfiere con muchos procesos de desarrollo de las plantas, debido a que la 
cantidad de AIA de la planta puede verse alterada por la adquisición de AIA 
bacteriano (Spaepen et al., 2007). 
Generalmente el AIA afecta la división, extensión y diferenciación celular, estimula 
la germinación de semillas, incrementa el desarrollo de xilema y la raíz, inicia la 
formación de raíces laterales y adventicias, controla la respuesta a luz y gravedad, 
afecta la fotosíntesis, formación de pigmentos, la biosíntesis de varios metabolitos 
y resistencia a condiciones de estrés. De igual manera AIA “afloja” la pared celular 
vegetal, lo que resulta en el incremento de los exudados de la raíz, lo que provee 
de nutrientes adicionales a las bacterias de la rizósfera. Por lo que el AIA de las 
rizobacterias se ha identificado como una molécula efectora en las interacciones 
planta-microrganismo, tanto en patogénesis como en fitoestimulación (Spaepen & 
Vanderleyden, 2011). 
La biosíntesis de AIA comienza con el aminoácido triptófano en la mayoría de las 
bacterias y plantas. La síntesis de AIA vía ácido indol-3-pirúvico y aldehído indol-
3-acético es presentada por la mayoría de las bacterias como Erwinia, 
Agrobacterium, Pseudomonas, Bradyrhizobium, Rhizobium, Azospirillum, 
Klebsiella, y Enterobacter (Patten & Glick, 1996). 
Ácido giberélico 
El ácido giberélico (GA) pertenece a un gran grupo de moléculas (Giberelinas), 
químicamente son diterpenos tetracíclicos, y regulan diversos procesos biolgócos 
en las plantas, incluyendo la germinación, la elongación del tallo, la floración y la 
producción de frutos (Ahemad & Kribet, 2014). 
Azospirillum sp. fue la primera bacteria en ser reportada como productora de 
giberelinas, mediante la hidroxilación de precursores (GA3 o GA5), sin embargo, 
el precursor inicial es el isoprenil pirofosfato (IPP) (Cassan, et al., 2013). 
Otros géneros de bacterias en los que se ha reportado la producción de giberelinas 
son: Rhizobium, Acetobacter, Herbaspirillum y Bacillus (Bottini et al., 2004). 
Citoquininas 
Las citoquininas son un grupo de compuestos naturales que regulan la división 
celular y procesos de diferenciación celular en tejidos meristemáticos, en plantas 
superiores. (Ahemad & Kribet, 2014). Existen dos grupos principales de 
citoquininas: Las derivadas de adenina, tales como la Kinetina y la Zeatina; y las 
moléculas derivadas de fenilurea, como el thiadiazuron. (Cassan et al., 2013) 
Estos fitorreguladores han sido asociados con muchos procesos fisiológicos y 
celulares, incluyendo la senescencia, la acumulación de clorofila, la formación de 
órganos, el desarrollo de la raíz, la elongación radicular, el desarrollo del tallo y la 
expansión de hojas (Cassan et al., 2013). Gran parte de las bacterias aisladas de 
la rizósfera son capaces de producir compuestos de la familia de las citoquininas, 
en el medio de cultivo (Bashan & de Bashan, 2010). 
En los géneros de bacterias productoras de citoquininas encontramos: Serratia, 
Pseudomonas, Burkholderia, Agrobacterium, Erwinia, Xanthomonas, Arthrobacter, 
y Bacillus (Garcia de Salamone et al., 2006). 
Reducción en los niveles de etileno 
El etileno es un metabolito esencial para el crecimiento y desarrollo normal de las 
plantas (Khalid et al., 2006). Esta hormona vegetal es producida endógenamente 
por casi todas las plantas, sin embargo, puede ser producido por otros factores 
bióticos y abióticos en los suelos. Además de ser un regulador de crecimiento en 
plantas, el etileno también es una hormona de estrés. Bajo condiciones de estrés 
como los generados por: salinidad, sequía, inundación, metales pesados y 
patogenicidad, los niveles endógenos de etileno incrementan significativamente, 
lo cual afecta negativamente el crecimiento general de la planta. Altas 
concentraciones de etileno inducen defoliación y otros procesos celulares que 
pueden reducir el rendimiento de ciertos cultivos (Saleem et al., 2007). 
PGPR’s que poseen la enzima 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC) 
desaminasa, facilita el crecimiento y desarrollo de las plantas al reducir los niveles 
de etileno, induciendo tolerancia o reduciendo el estrés (Nadeem et al., 2007). Las 
rizobacterias toman el precursor del etileno, ACC, y lo convierten en 2-
oxobutanoato y amonia (Arshad et al., 2007). 
MECANISMOS INDIRECTOS 
El principal mecanismo indirecto de las PGPR es a través del biocontrol de 
microrganismos patógenos (Glick, 2012). Los principales modos de biocontrol son: 
la competencia directa de nutrientes, desplazamiento de nicho, resistencia 
sistémica inducida, y la producción de ciertos metabolitos (Lugtenberg & Kamilova, 
2009). 
Entre las bacterias que presentan actividad de biocontrol, se ha reportado la 
producción de compuestos tales como: sideróforos, antibióticos, compuestos 
volátiles, enzimas líticas y enzimas detoxificantes (Compant et al., 2005). Algunos 
de los antibióticos que se han reportado se encuentra: cianuro de hidrógeno, 
oomicina, fenazina, oligomicina, kanosamina y zwitermicina, así como algunos 
lipopeptidos cíclicos (Compant et al., 2005). Las enzimas líticas juegan un papel 
importante en contra de los organismos patógenos, principalmente atacan la pared 
celular, como son: las quitinasas, celulasas, glucanasas. (Compant et al., 2005). 
2.3. BIOFERTILIZANTES 
 
Durante los últimos años la agricultura se ha caracterizado por el uso intensivo de 
fertilizantes químicos y plaguicidas, esto para mantener altas producciones, sin 
tener en cuenta lo que esto ocasiona, como el deterioro y/o destrucción de los 
agroecosistemas, evidenciado principalmente en la pérdida de productividad de 
los suelos, alteración en la calidad de los productos agrícolas, contaminación del 
ambiente y problemas de salud a la población en general (Higa & Parr, 1994). En 
el 2012 se reportó el uso de más de 156 millones de toneladas de fertilizantes 
químicos a nivel mundial, lo cual deja de ser viable debido al agotamiento de 
recursos y a los altos costos (Naveed et al., 2015). 
Este impacto negativo, ha generado el desarrollo de tecnologías sustentables y de 
origen biológico. Recientemente, el uso de biofertilizantes ha sido una de las 
herramientas más importantes para la agricultura sustentable para incrementar la 
fertilidad del suelo, utilizando fuentes renovables, capaces de maximizar los 
beneficios ecológicos y minimizar los daños ambientales, así como los costos 
(Kizilkaya, 2008). 
Vessey, (2003) define los biofertilizantes como “una substancia que contiene 
microorganismos vivos, que cuando es aplicada a semillas, superficie foliar o al 
suelo, coloniza la rizósfera o el interior de la planta y promueve el crecimiento, 
incrementando la cantidad o disponibilidad de nutrientes primarios a la planta 
hospedadora”. 
A diferencia de los fertilizantes químicos, los biofertilizantes no son usados para 
proveer los nutrientes como tal. Generalmente, los biofertilizantes pueden ser 
clasificados en cuatro categorías: a) Biofertilizantes fijadores de N2, los cuales 
contienen bacterias con actividad Nitrogenasa; b) Biofertilizantes solubilizadores 
de P, contienen microrganismos solubilizadores de fosfatos; c) Aceleradores de la 
descomposición, contienen ciertas bacterias ligninolíticas y celulolíticas y d) 
PGPR, los cuales promueven el crecimiento por una gran variedad de 
mecanismos.(Naveed et al., 2015) 
La finalidad del uso de biofertilizantes es la sustitución total o parcial de los 
fertilizantes minerales, disminuyendo así la contaminación generada por los 
mismos, así como los daños que provoca a la salud (Armenta-Bojórquez, 2010). 
Muchos autores han reportado el uso de biofertilizantes, afectando positivamente 
el crecimiento de muchas plantas de interés agrícola: hortalizas (Esitken, 2011), 
papa (Singh, 2013), tomate (Bernabeu et al., 2015), berenjena (Seymen et al., 
2013), pepino (Gül et al., 2013), rabano (Yildirim et al., 2008), chille (Silva et 
al.,2014), lechuga (Chamangasht et al., 2012) y brócoli (Yildirim et al., 2011). 
En México el mayor impacto de los biofertilizantes fue en los años 70’s y 80’s con 
el descubrimiento de la fijación biológica de nitrógeno en leguminosas, sobre todo 
en soya y garbanzo (Armenta-Bojórquez, 2010). La utilización de inoculantes a 
base de Rhizobium fue una práctica generalizada en los productores (INIFAP, 
1990). Recientemente, en los últimos años han aparecido preparaciones 
comerciales con PGPR que han sido utilizados mayormente en hortalizas 
(Armenta-Bojórquez, 2010). Sin embargo, no se ha tenido la aceptación esperada 
por parte los productores, debido a la desconfianza de reducir la fertilidad del suelo 
y con ello, sus ganancias. Esta desconfianza se basa principalmente en la 
respuesta variable de los biofertilizantes, debido al tipo de microrganismos, suelo, 
plantas y condiciones ambientales presentes (Armenta-Bojórquez, 2010). 
Debido a lo anterior se deben tomar las precauciones necesarias para seleccionar 
el microrganismo adecuado y que se favorezca con las condiciones presentes en 
el suelo, o proveerle las condiciones favorables. La utilización de cepas nativas de 
microorganismos en la elaboración de biofertilizantes, presentan mayores 
posibilidades de efectividad en el campo, por estar adaptados a las condiciones 
del suelo de cada región (Armenta Bojórquez et al., 2010). 
Otro aspecto importante en la formulación de biofertilizantes es la elección correcta 
de un material de soporte. Generalmente cuando el soporte es inadecuado, la 
población bacteriana se reduce rápidamente, por lo que la formulación y la elección 
del soporte correcto, deben proveer a las bacterias con un ambiente favorable que 
prolongue su viabilidad (Bashan et al., 2014). 
Los materiales elegidos como soporte deben poseer ciertas características para 
que sean considerados ideales, como son: la facilidad de uso, no fitotóxico, que 
mantenga o prolongue la supervivencia de las bacterias, así como una vida de 
almacenaje adecuada (Bashan et al., 2014). 
Los biofertilizantes líquidos fueron los primeros en ser usados, esencialmente son 
suspensiones bacterianas solas o suplementadas con algún aditivo que mejore la 
estabilización, como son espesantes o protectores. Su principal ventaja que son 
de fácil manejo, así como de formulación. (Bashan et al., 2014). 
Otro tipo de biofertilizantes son los que usan soportes orgánicos, siendo sin duda, 
el Peat moss el más utilizado a nivel mundial (Albareda et al., 2008). El paet moss 
tiene característica que lo hacen un buen soporte sólido, como son: tamaño de 
partícula controlable, pH neutro, buena retención de humedad y alto contenido de 
materia orgánica (Bashan et al., 2014). 
Actualmente, las formulaciones encapsuladas son prometedoras, sin embargo, 
aún se encuentran en etapa experimental para su aplicación en la agricultura. La 
encapsulación de microrganismos suele ser en una matriz polimérica natural o 
sintética. El objetivo de la encapsulación es mantener las células atrapadas en la 
matriz polimérica, a concentraciones altas y por un tiempo prolongado (Bashan et 
al., 2014). 
 
3 JUSTIFICACIÓN 
Debido al incremento acelerado de la población mundial, la demanda de alimentos 
ha aumentado, lo que conlleva a la necesidad de mayores extensiones de cultivo. 
Adicionalmente las malas prácticas agrícolas han ido intensificando los problemas 
de producción, particularmente el uso intensivo de fertilizantes y agroquímicos en 
general conllevan a un deterioro tanto del suelo como del ambiente. 
Recientemente se están implementando técnicas agrícolas más sostenibles, como 
el uso de biofertilizantes, que, hacen uso de microorganismos que regularmente 
viven asociados a plantas, como alternativa al uso de fertilizantes químicos. Sin 
embargo, muchos biofertilizantes disponibles en el mercado se ven afectados por 
los agroquímicos que han sido aplicados en los suelos agrícolas, traduciéndose 
en una disminución de los efectos benéficos de los microrganismos que los 
conforman. 
El uso de bacterias promotoras de crecimiento vegetal (PGPR), se ha convertido 
en una buena alternativa a los fertilizantes químicos, al aumentar la calidad de los 
cultivos, adaptable a las prácticas de cultivo y reduciendo el impacto ambiental y a 
la salud de los agricultores. Sin embargo, muchas de estas rizobacterias se ven 
afectadas por los agroquímicos usados en la práctica agrícola. 
Si bien es muy importante que se formulen biofertilizantes que ayuden al desarrollo 
de las plantas mediante los mecanismos ya descritos, también es importante tomar 
en cuenta que los microorganismos seleccionados para formularlos deben tener 
resistencia a los agroquímicos. A pesar de que algunos productores agrícolas que 
han iniciado el desuso de fertilizantes químicos y están optando por los abonos 
orgánicos, la presencia de plagas los ha orillado a que todavía hacen uso de 
pesticidas para control de plagas o malezas y estos, también afectan a las 
bacterias benéficas del suelo. Por todo lo anterior se vislumbra la importancia de 
llevar a cabo estudios para formular biofertilizantes con microrganismos tolerantes 
a agroquímicos. 
 
4 OBJETIVOS 
 
4.1 OBJETIVO GENERAL 
 
Evaluar el efecto en el cultivo en invernadero de jitomate y papa, al aplicar un 
biofertilizante formulado con bacterias promotoras de crecimiento vegetal, 
tolerantes a agroquímicos. 
 
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 
 
Seleccionar in vitro cepas promotoras de crecimiento vegetal de una colección 
previa de bacterias tolerantes a agroquímicos. 
Evaluar en las rizobacterias la capacidad de solubilización de fósforo, la 
producción de fitorreguladores (ácido indol acético, ácido giberélico y citoquininas) 
y el efecto antagonista contra Streptomyces sp 
Evaluar el rendimiento de jitomate y papa inoculados con rizobacterias 
Evaluar diferentes medios de cultivo para elaborar un biofertilizante, su posible 
presentación comercial y así como su vida de anaquel 
5 METODOLOGÍA 
5.1 MEDIOS DE CULTIVO 
 
Caldo Nutritivo: Este medio se utilizó para propagar y conservar todos los cultivos 
bacterianos. Esta formulado con Peptona de carne 5g y Extracto de levadura 3g 
en un litro 
Medio LB suplementado con triptófano: Medio utilizado para la producción de 
fitohormonas. Formulado con Peptona de carne 10g, Extracto de levadura 5g, 
Cloruro de sodio 5g en un litro 
Medio mínimo de sales: Medio utilizado en la determinación de bacterias 
solubilizadoras de fosfato. Formulado con KH2PO410 5g, K2HPO4 4.5g, 
NH4SO4*2H20 1.0g MgCl2*7H2O0.2g, Glucosa 10g, Agar 15g en un litro 
Medio NBRIP: Medio utilizado para la determinación de bacterias solubilizadoras 
de fosfato con una fuente insoluble de fósforo. Formulado con: Glucosa 10g, 
Ca3(PO4)2 5g, MgCl2.6H2O 5g, MgSO4.7H2O 0.25, NaCl 0.2g, (NH4)2SO4 0.1g. 
Agar 15g en un litro 
5.2 CONSERVACIÓN DE CEPAS BACTERIANAS 
 
Se partió de una colección de 118 bacterias previamente aisladas por otros 
miembros del grupo de trabajo, a partir de suelo rizosférico de maíz y papa. Las 
bacterias fueron previamente identificadas como tolerantes a agroquímicos. 
Para su propagación se utilizó caldo nutritivo (8 g/l), esterilizado en autoclave (1.1 
atm, 121°C por 15 min). Las bacterias fueron propagadas en 25 mlde caldo 
nutritivo en tubos estériles tipo falcon de 50 ml estériles. 
Bajo condiciones estériles, se tomó una colonia aislada en las cajas Petri, y se 
transfirió a los tubos, fueron incubados a 30°C a 120 rpm durante 24 horas. La 
suspensión bacteriana se centrifugó a 10,000 rpm a 4°C durante 20 min, para 
separar las células. Las células se cosecharon y fueron resuspendidas en caldo 
nutritivo con glicerol al 20% y depositadas en crio-viales de 2 ml para su 
conservación a -80°C. 
5.3 ENSAYO DE GERMINACIÓN 
Para la selección de las cepas que se utilizaron en este trabajo se planteó un 
ensayo de germinación in vitro, para seleccionar aquellas bacterias que, al ser 
inoculadas en semillas, reportaran los mejores valores de índice de vigor relativo. 
Se siguió la metodología propuesta por Mia et al., (2010). 
Las bacterias fueron propagadas en caldo nutritivo y su concentración se ajustó 
por turbidez a aproximadamente 108 UFC/ml. 
Se usaron semillas comerciales de tomate (Solanum lycopersicum), las cuales 
fueron desinfectadas superficialmente, con una solución de hipoclorito de sodio al 
1%, por inmersión durante 2 minutos. Posteriormente fueron enjuagadas 5 veces 
con agua destilada estéril y se secaron a temperatura ambiente. 
Treinta semillas secas y desinfectadas fueron introducidas en cada tubo de la 
suspensión bacteriana durante 20 minutos. Posteriormente se colocaron 10 
semillas en cada caja Petri, donde previamente se colocó papel filtro de poro 
mediano estéril. El papel filtro se humedeció con 2 ml de agua destilada estéril. 
 Como control se colocaron las semillas en caldo nutritivo estéril. Las cajas fueron 
incubadas en oscuridad a 30°C durante 120 horas. 
Transcurrido el tiempo de incubación se registró el número de semillas germinadas 
y la longitud total de la plántula, para calcular el índice de vigor relativo (IVR) con 
la siguiente ecuación (Mia et al., 2010): 
% 𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺ó𝐺𝐺 𝐺𝐺𝐺𝐺𝑟𝑟𝐺𝐺𝑟𝑟𝐺𝐺𝑟𝑟𝑟𝑟: 
𝑆𝑆𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝑟𝑟𝑟𝑟𝐺𝐺𝑆𝑆 𝑔𝑔𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝑔𝑔𝐺𝐺𝑆𝑆 𝑟𝑟𝐺𝐺𝐺𝐺𝑟𝑟𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝑟𝑟𝑟𝑟
𝑆𝑆𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝑟𝑟𝑟𝑟𝐺𝐺𝑆𝑆 𝑔𝑔𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝑔𝑔𝐺𝐺𝑆𝑆 𝐺𝐺𝐺𝐺 𝐺𝐺𝑟𝑟𝐺𝐺𝑟𝑟𝐺𝐺𝑟𝑟𝑟𝑟
 𝑥𝑥 100 
 
% 𝐸𝐸𝑟𝑟𝑟𝑟𝐺𝐺𝑔𝑔𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺ó𝐺𝐺 𝐺𝐺𝐺𝐺𝑟𝑟𝐺𝐺𝑟𝑟𝐺𝐺𝑟𝑟𝑟𝑟: 
𝐸𝐸𝑟𝑟𝑟𝑟𝐺𝐺𝑔𝑔𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺ó𝐺𝐺 𝑔𝑔𝐺𝐺 𝑟𝑟𝐺𝐺 𝑝𝑝𝑟𝑟á𝐺𝐺𝑟𝑟𝑛𝑛𝑟𝑟𝐺𝐺 𝑟𝑟𝐺𝐺𝐺𝐺𝑟𝑟𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝑟𝑟𝑟𝑟 (𝐺𝐺𝐺𝐺)
𝐸𝐸𝑟𝑟𝑟𝑟𝐺𝐺𝑔𝑔𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺ó𝐺𝐺 𝑔𝑔𝐺𝐺 𝑟𝑟𝐺𝐺 𝑝𝑝𝑟𝑟á𝐺𝐺𝑟𝑟𝑛𝑛𝑟𝑟𝐺𝐺 𝐺𝐺𝑟𝑟𝐺𝐺𝑟𝑟𝐺𝐺𝑟𝑟𝑟𝑟 (𝐺𝐺𝐺𝐺)
 𝑥𝑥 100 
 
𝐼𝐼𝐼𝐼𝐼𝐼:
%𝐺𝐺𝐼𝐼 𝑥𝑥 %𝐸𝐸𝐼𝐼
100
 
Las bacterias seleccionadas de acuerdo con el IVR fueron las utilizadas en los 
demás ensayos y para la formulación del biofertilizante. 
5.4 SOLUBILIZACIÓN DE FOSFATOS 
 
El fósforo es un elemento esencial en la nutrición vegetal, aunque es abundante 
en el suelo, se encuentra en formas insolubles e inaccesibles para las plantas 
(ésteres y anhídridos fosfóricos), las bacterias solubilizadoras de fosfatos juegan 
un rol importante en la mineralización del fósforo. 
Para evaluar la capacidad de las bacterias seleccionadas en el ensayo de 
germinación para solubilizar fósforo, se utilizó el medio NBRIP (Nautiyal, 1999), el 
cual está formulado con fosfato tricálcico como fuente de fósforo insoluble. 
Las bacterias seleccionadas en el experimento de germinación fueron inoculadas 
en cajas Petri con medio mínimo de sales y se incubaron por 3 días para obtener 
colonias aisladas y puras. Posteriormente cada colonia aislada se inoculó en el 
medio NBRIP cada colonia aislada, mediante un palillo estéril, picando una colonia, 
y luego picando una sola vez en el medio NBRIP, con un total de 4 picaduras por 
caja. El experimento fue realizado por triplicado. Las placas fueron incubadas por 
14 días a 30°C. 
Finalmente se midió el diámetro de la colonia y del halo de solubilización, para 
calcular el índice de solubilización de fósforo (PSI) con la ecuación de Edi-
Premono, 1996: 
𝑃𝑃𝑆𝑆𝐼𝐼 = 
𝐷𝐷í𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝑟𝑟𝐺𝐺𝑟𝑟 𝑔𝑔𝐺𝐺 𝑟𝑟𝐺𝐺 𝐺𝐺𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺 + 𝑔𝑔í𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝑟𝑟𝐺𝐺𝑟𝑟 𝑔𝑔𝐺𝐺𝑟𝑟 ℎ𝐺𝐺𝑟𝑟𝑟𝑟
𝐷𝐷í𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝑟𝑟𝐺𝐺𝑟𝑟 𝑔𝑔𝐺𝐺 𝑟𝑟𝐺𝐺 𝐺𝐺𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝑟𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺𝐺
 
 
 
 
5.5 DETERMINACIÓN DE FITORREGULADORES 
 
Para elaborar biofertilizantes se han seleccionados rizobacterias que tienen el 
potencial para producir AIA, GA y quinetinas, por ello se evaluó la producción de 
estos fitorreguladores. De acuerdo con las metodologías de Ullah et al., (2013) y 
Karadeniz et al., (2006): 
Las cepas seleccionadas previamente, se incubaron en caldo nutritivo durante 24 
horas. La suspensión bacteriana se ajustó a una concentración aproximada de 108 
UFC/ml y se inoculó 1 ml en 50 ml de medio LB adicionado con 0.2 g/L de L-
triptófano (>99% Sigma). La suspensión se incubó a 30°C, 220 rpm durante 120 
horas. 
Después del tiempo de incubación, se centrifugó a 10,000 rpm a 4°C por 20 min, 
se tomó el sobrenadante y se ajustó hasta un pH de 2.5-2.8 con HCL concentrado. 
Posteriormente se realizó 3 veces consecutivas la extracción de las fitohormonas, 
con un volumen de 20 ml de acetato de etilo. Se tomó la fase orgánica y se refrigeró 
a 4°C en un frasco ámbar. 
En la fase orgánica pueden encontrar el ácido indol acético (AIA) y el ácido 
giberélico (GA). Para obtener hormonas de la familia de citocininas, se tomó la 
fase acuosa descartada en el proceso de extracción anterior y se neutraliza a un 
pH de 7 con NaOH y se repitió el proceso de extracción con acetato de etilo (20 
ml, 3 veces). 
Ambas fracciones orgánicas obtenidas se mezclaron y se llevó a sequedad en un 
evaporador rotatorio, el residuo fue resuspendido en Metanol. 
Para comprobar la presencia de los fitorreguladores en los extractos se realizó una 
cromatografía en capa fina, en placas de Sílica gel 60 F254. En cada carril se 
colocaron 20 μl de los extractos y como control negativo una extracción del medio 
de cultivo estéril, la fase móvil empleada fue una mezcla de acetato de etilo, 
cloroformo y ácido acético (60:35:5). Para identificación de los fitorreguladores se 
usaron estándares de AIA (>95% Sigma aldrich), GA3 (>90% Sigma aldrich) y 
Kinetina (>95% Caisson labs) Las placas fueron reveladas con luz UV de onda 
corta (254 nm) para AIA y Kinetina, además de una mezcla de etanol-ácido 
sulfúrico 95:5 para GA. 
Para la cuantificación de los fitorreguladores, los extractos fueron analizados en 
un sistema de HPLC con detector UV, bajos condiciones isocráticas, con una fase 
móvil de metanol 70%, una columna de fase reversa C18 250 x 4.6 mm, λ=254 nm 
y un flujo de 1ml/min. 
Se construyeron curvas de calibración de los estándares AIA, GA y Kinetina. La 
cuantificación se realizó relacionando el área bajo la curva con la concentración. 
5.6 EVALUACION DE LA TOLERANCIA A 
AGROQUÍMICOS 
 
Los plaguicidas usados en los cultivos para combatir enfermedades en plantas 
causados por bacterias y hongos suelen dañar de igual manera la microbiota 
benéfica, disminuyendo así los posibles efectos positivos de éstas. Por ello se 
evaluó la resistencia de las bacterias seleccionadas a algunos agroquímicos 
usados frecuentemente en la zona centro de México. 
La evaluación in vitro de la resistencia de las cuatro rizobacterias a siete 
agroquímicos fue evaluada mediante el método de difusión en placa (Kirby-Bauer) 
usando la metodología propuesta por Drouin et al., (2010). Se prepararon 
soluciones acuosas de los siete agroquímicos con las dosis recomendadas por el 
fabricante (1 X) y también dosis 10X, 100 X y 1000 X (Tabla 1). Se aplicaron 20 µl 
de cada solución en un disco de papel filtro estéril de 12.5 mm de diámetro, y se 
dejaron secar a temperatura ambiente bajo condiciones asépticas. Por otro lado, 
las bacterias a evaluar se propagaron en caldo nutritivo hasta una concentración 
de 1 x 108 UFC/ml.Como control se usó un bioestimulante comercial cuyo 
ingrediente activo es Bacillus. subtilis con una concentración de 1X108 células/ml. 
A continuación, se inocularon por extensión en placa 100 µl de las suspensiones 
bacterianas en placas Petri con agar nutritivo. El área de la placa se dividió en 
cuatro cuadrantes y se colocó un disco con agroquímico en el centro de cada 
cuadrante, correspondiente a las cuatro concentraciones evaluadas. Las placas 
fueron refrigeradas a 4°C durante la noche para permitir la difusión del 
agroquímico, posteriormente se incubaron a 30°C durante 48 horas. Transcurrido 
el tiempo de incubación, se midió en diámetro de inhibición para cada tratamiento. 
Se consideró positiva la resistencia si el diámetro del halo fue menor a dos mm 
con respecto al diámetro del disco. 
 
Tabla 1. Dosis recomendada por los fabricantes de los siete agroquímicos empleados en la 
evaluación in vitro de la resistencia a agroquímicos 
NOMBRE ACTIVO ABREVIACIÓN USO DOSIS RECOMENDADA 
BACTROL ESTREPTOMICINA BACT BACTERICIDA 2 mg/ml 
PROMYL BENOMILO PROM FUNGICIDA 1 mg/ml 
RIZOLEX TOLCLOFOS RIZOL FUNGICIDA 1.25 mg/ml 
AGRY-GENT GENTAMICINA AGRY BACTERICIDA 0.8 g/ml 
PULSOR THIFLUZAMIDE PULS FUNGICIDA 1% 
BUCKMAN TIOCIANATOMETILO BUCK BACT/FUNG 6% 
CERCOBIN TIOFANATOMETILO CERCO FUNGICIDA 1 mg/ml 
 
 
5.7 ACTIVIDAD ANTAGONISTA CONTRA Streptomyces 
sp 
La rolla (scab) de la papa es una enfermedad económicamente importante, debido 
a las serias pérdidas que produce, y es causada por actinomicetos del género 
Streptomyces, su control químico no es deseable debido a la gran cantidad de 
efectos colaterales causados por los agroquímicos (Chen et al., 2017), por lo tanto, 
la búsqueda de opciones para el biocontrol de Streptomyces es necesario. 
Para la prueba se aisló el actinomiceto de lesiones típicas en tubérculos de papa, 
y fue purificado por siembra continua en medio extracto de malta. Para el 
aislamiento de Streptomyces sp., se recolectaron tubérculos con lesiones típicas, 
y fueron desinfectados superficialmente con hipoclorito de sodio al 1.5%, las 
muestras de papa con lesiones fueron cortadas en cubos de aproximadamente 1 
cm3 y fueron maceradas en mortero con agua destilada estéril. Se tomó 1 ml de la 
suspensión y se inoculó en placas Petri de agar agua al 2%. Se incubaron a 28°C 
durante 10 días. Para la purificación se tomaron colonias con morfología 
característica y fueron sembradas en medio extracto de malta (Faucher et al., 
1992). 
Para evaluar la actividad antagonista, se siguió la metodología de Bensidhoum et 
al., (2016). En placas Petri con medio PDA, en el centro se inoculó el patógeno 
(Streptomyces sp.) mediante picadura. Las bacterias seleccionadas fueron 
inoculadas a 2 cm del centro y en líneas de 2 cm de longitud de la siguiente manera 
(ver figura 1) 
Todos los tratamientos se realizaron por triplicado. Como control se usó el 
crecimiento de Streptomyces sin adición de bacterias. Las placas fueron incubadas 
a 30°C durante 120 horas, transcurrido el tiempo se midió el diámetro de la colonia 
de Streptomyces y se calculó el porcentaje de inhibición: 
%𝐼𝐼 =
𝐷𝐷𝐷𝐷 − 𝐷𝐷𝐷𝐷
𝐷𝐷𝐷𝐷
 𝑋𝑋 100 
Donde DC: Diámetro Streptomyces en el Control, DT: Diámetro Streptomyces en 
el Tratamiento 
 
Figura 1. Ensayo de antagonismo contra 
Streptomyces sp 
5.8 EVALUACIÓN DE LAS BACTERIAS EN 
INVERNADERO 
5.8.1 Cultivo de Papa (Solanum tuberosum) 
Las cepas seleccionadas previamente fueron evaluadas como promotoras de 
crecimiento vegetal en un cultivo de papa en invernadero, se realizó bajo la 
siguiente metodología: 
El experimento se llevó a cabo en un invernadero localizado en el municipio de 
Villa Guerrero, en el Estado de México (18°57'36.0"N 99°37'48.0"W). 
Para la preparación de los inóculos se propagaron las bacterias seleccionadas en 
un volumen de 5 L cuya concentración final fue aproximadamente a 1.5 x 108 
UFC/ml 
Se probaron 10 tratamientos (ver tabla 2 y figura 2) sobre plántulas de papa en 
cepellón en un arreglo completamente al azar. 
Cada tratamiento se aplicó en un total de 450 plántulas de aproximadamente 50 
días de edad. Los tratamientos fueron aplicados, justo después del trasplante, 
directamente sobre la base de cada plántula, con la ayuda de una bomba 
aspersora manual. Se distribuyó homogéneamente los 5L en las 450 plántulas en 
una sola aplicación. 
 
 Tabla 2. Notación de los tratamientos en el cultivo de papa 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Distribución de los tratamientos aplicados en el experimento en papa 
 
Entre cada tratamiento se dejó un área aproximada de 200 plántulas sin 
tratamiento, lo que fue tomado como control absoluto. Como control negativo fue 
el medio de cultivo estéril y como control positivo se utilizó un producto comercial 
(PROBACIL) formulado con B. subtilis. Se realizaron muestreos a los días 15, 50 
No. Tratamiento 
1 CEPA 1 
2 CEPA 2 
3 CEPA 3 
4 CEPA 4 
5 CEPA 1 + CEPA 2 
6 CEPA 3 + CEPA 4 
7 CEPA 1 + CEPA 3 
8 CEPA 2 + CEPA 4 
9 Probacil (CONTROL POSITIVO) 
CONTROL 
ABSOLUTO 
SUELO SIN TRATAMIENTO 
 
y 70 después de la inoculación. En cada muestreo se tomaron al azar 10 plántulas 
por tratamiento y se registró la longitud y el peso de tallos y raíces, para el día 70, 
se midió el peso del tubérculo. 
5.8.2 Cultivo de Jitomate (Solanum 
lycopersicum) 
Las cepas seleccionadas previamente fueron evaluadas también como 
promotoras de crecimiento vegetal en un cultivo de jitomate en invernadero, se 
realizó bajo la siguiente metodología: 
Para la preparación de los inóculos se propagaron las bacterias seleccionadas en 
un volumen de 1 L cuya concentración final sea aproximada a 1.5 x 108 UFC/ml 
El experimento se llevó a cabo en un invernadero localizado en el municipio de 
Tonatico, en el Estado de México (18°48'15.9"N, 99°39'44.3"W). Se probaron 10 
tratamientos, de manera similar al experimento anterior (ver tabla 2) en un arreglo 
completamente al azar, sobre plántulas de jitomate. 
Cada tratamiento tuvo un total de 100 plántulas de aproximadamente 30 días de 
edad. Los tratamientos fueron aplicados, justo después del trasplante, 
directamente sobre la base de cada plántula, con la ayuda de una bomba 
aspersora manual. Se distribuyó homogéneamente el inóculo sobre las 100 
plántulas en una sola aplicación. 
Se llevaron a cabo muestreos al día 45 y 90 después del trasplante, con la finalidad 
de monitorear algunos parámetros indirectos de crecimiento, debido a la 
imposibilidad de sacrificar plantas para registrar su peso, ya que las plantas 
estaban destinadas a varios ciclos de cosecha. En los muestreos se registró el 
grosor del tallo, así como el número de frutos. Para el día 90 se recolectaron los 
frutos y se registró su peso fresco y seco. 
 
 
5.9 EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO BACTERIANO EN 
DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO 
 
Con la finalidad de proponer a la empresa un medio de cultivo para la formulación 
del biofertilizante, se evaluó el crecimiento de las cepas aisladas en dos medios 
de cultivo a diferentes porcentajes de concentración, con la finalidad de encontrar 
un medio que permita el crecimiento a concentraciones mayores 108 UFC/ml, 
como alternativa más rentable al caldo nutritivo. 
Se utilizó como materia prima lixiviado de vermicomposta y digestato de estiércol 
de vaca. El lixiviado se obtuvo de un productor local de vermicomposta, la 
vermicomposta fue producida usando lombriz roja californiana alimentadas con 
residuos vegetales. El digestato usado fue de estiércol de vaca, de 30 días de 
digestión y con un porcentaje de sólidos totales de 7%. Se probaron soluciones 
acuosas en concentraciones de 5%, 10%, 20% y 40% en ambos casos. 
Para cuantificar el crecimiento bacteriano, se propagaron las cepas purificadas en 
caldo nutritivo hasta alcanzar una concentración de 1 x 108 UFC/ml, luego los 
cultivos fueron centrifugados ylas células fueron cosechadas y enjuagadas en 
solución salina estéril, y resuspendidas en un volumen igual de solución salina. 
Fueron inoculados con 20 µl de las suspensiones bacterianas lavadas en tubos 
falcon con 20 ml de los medios de cultivo a probar y se incubaron a 30°C, 120 rpm 
durante 48 horas. Transcurrido el tiempo se cuantificó el crecimiento bacteriano 
mediante la técnica de extensión en placa con agar nutritivo, con la finalidad de 
seleccionar el medio que permita un mayor crecimiento celular. 
 
 
 
 
 
5.10 EVALUACIÓN DE DIFERENTES SOPORTES Y SU 
VIABILIDAD EN ALMACENAMIENTO 
Para proponer a la empresa cómo elaborar el biofertilizante, es necesario indicarle 
el soporte, para ello se evaluaron diferentes soportes o “presentaciones” del 
biofertilizante, se utilizó la siguiente metodología. 
Las bacterias seleccionadas para el desarrollo del biofertilizante fueron 
propagadas en medio líquido de lixiviado de vermicomposta al 5% e incubadas por 
48 horas. Esta suspensión fue utilizada para todas las presentaciones evaluadas 
(suspensión inicial). Pasado el tiempo de incubación se cuantifico el crecimiento 
bacteriano por medio de siembra en placa. 
La primera presentación fue adsorbiendo las bacterias en Peat Moss, siguiendo la 
metodología de Rose et al., (2010). La turba Peat Moss comercial (Premier) fue 
molida hasta un tamaño de partícula menor a malla 100, posteriormente fue 
secada a en un horno a 60° C durante 48 horas. Transcurrido el tiempo la turba 
fue esterilizada en autoclave 121°C 20 minutos, enfriada, e incubada por 24 horas 
a 30°C y luego esterilizada de nuevo bajo las mismas condiciones. Se colocaron 
50 g de turba estéril en bolsas tipo Ziplock desinfectadas, y se agregaron 50 ml de 
la suspensión bacteriana inicial (humedad final de 50%) y se homogenizó la 
mezcla. 
Otra presentación evaluada fue un producto seco obtenido mediante secado por 
aspersión. Se siguió la metodología modificada de Ananta et al., (2005). Para la 
preparación del medio a secar, se tomaron 200 ml de la suspensión bacteriana 
inicial y se agregaron 20 gramos de Malto dextrina, para obtener un porcentaje de 
sólidos totales de aproximadamente 10%. Para el secado se utilizó un secador 
marca Prendo, con un flujo constante 4.5 ml/min y una temperatura de aire de 
entrada de 100°C y una temperatura de salida de 80°C. Los sólidos secos fueron 
recuperados con un separador ciclónico y envasados en frascos de vidrio. Se 
cuantificó el número de bacterias por siembra en placa para determinar el 
porcentaje de supervivencia al proceso de secado. 
La suspensión bacteriana restante fue dividida en dos volúmenes iguales, y 
almacenados en frascos separados de polipropileno previamente esterilizados. A 
un frasco se le adiciono glicerol (10 g/l) para obtener dos presentaciones, una 
presentación líquida compuesta únicamente por la suspensión bacteriana y otra 
adicionada con glicerol para prevenir la desecación de las células bacterianas. 
Todas las presentaciones fueron almacenadas a una temperatura promedio de 
25°C. El conteo bacteriano se realizó cada 30 días durante un periodo de 3 meses. 
 
5.11 ANÁLISIS ESTADÍSTICOS 
 
Todos los datos fueron analizados mediante un ANOVA de una vía y comparación 
de medias por el método HSD de Tukey con una confianza del 95%. Se utilizó el 
paquete estadístico MiniTab 17 para realizar los análisis. 
 
6 RESULTADOS 
6.1 ENSAYO DE GERMINACIÓN 
Al analizar los datos de germinación, se obtuvo que de las 118 aislados probados, 
13 era fitopatógenas, es decir, redujeron el desarrollo vegetal, 101 aislados 
tuvieron un efecto estadísticamente similar al control y 4 cepas que tuvieron un 
índice de vigor estadísticamente diferente al control, es decir estas cepas 
promovieron tanto la germinación como la elongación de la plántula (figura 3), por 
lo que fueron seleccionadas. Los resultados evidenciaron que las bacterias 
influyeron en la germinación y elongación de las semillas probadas, siendo las 
cepas presentadas en la tabla 3, las que tuvieron un mayor efecto positivo y con 
una diferencia estadística significativa respecto al control. Estas cepas fueron 
seleccionadas para ser usadas en el desarrollo del biofertilizante, y por lo tanto en 
los experimentos posteriores. 
 Tabla 3. Resultados de ensayo de germinación (Índice de vigor relativo) 
CLAVE AISLAMIENTO IVR (%) ERROR STD 
CONTROL - 100 8.9149 c 
CEPA 1 Maíz 388.152 27.3737 a 
CEPA 2 Papa 333.452 39.3841 ab 
CEPA 3 Papa 394.279 48.7351 a 
CEPA 4 Papa 342.642 65.5395 ab 
 
El experimento anterior reveló una mejora significativa en las plántulas inoculadas 
con las bacterias probadas, para mejorar el establecimiento de los cultivos es 
requisito que las plántulas tengan mayor vigor y viabilidad, esto puede influenciar 
en el crecimiento y la productividad del cultivo (McDonald & Copeland, 1997). 
 
El incremento de la germinación y la elongación de la plántula son considerados 
efectos típicos de la aplicación exógena de fitohormonas, en particular giberelinas 
y auxinas (Mia et al., 2012). Saxena et al., (2013) encontraron resultados similares 
en plántulas de mijo (Pennisetum glaucum), al ser inoculadas con suspensiones 
de B. subtilis por 1 h, resultando en el incremento significativo en el índice de vigor, 
mayor al 100% respecto al control. Por otra parte, Mangmang et al., (2015), 
reportaron un aumento de hasta 9% en germinación y 110% en el índice de vigor, 
respecto al control, al inocular semillas de pepino (Cucumis sativus), con cepas de 
A. brasilense atribuyéndoselo particularmente a la producción de ácido indol 
acético por parte de las cepas PGPR. 
 
6.2 SOLUBILIZACIÓN DE FOSFATOS 
Se midió la actividad solubilizadora de fósforo en las 4 rizobacterias seleccionadas. 
Todas las cepas probadas tuvieron la capacidad de solubilizar fósforo inorgánico, 
indicado por la presencia de un halo traslúcido en las placas con medio NBRIP. 
Hubo diferencia significativa entre las bacterias probadas. Las cepas 1, 2, 3 y 4 
tuvieron un índice de solubilización de 3.07, 2.41, 3.25 7 2.17 respectivamente. De 
Figura 3. Ensayo de germinación de semillas de jitomate inoculadas con rizobacterias in vitro 
acuerdo con el análisis estadístico hay diferencia significativa entre las 
rizobacterias probadas. Los resultados e presentan en la tabla 4. 
 
 Tabla 4. Índice de solubilización de fosfatos (PSI) 
 
 
 
 
 
Letras iguales indican que no hay diferencia significativa 
Otros autores han reportado índices de solubilización (PSI) en aislados 
bacterianos rizosféricos, valores entre 1.0 – 6.0, siendo las últimas excelentes 
bacterias solubilizando fósforo inorgánico (Ahemad et al., 2012, Chang & Yang, 
2009, Muleta et al., 2013). Por tanto, las bacterias seleccionadas tienen una 
capacidad solubilizadora moderada. El aislado con mayor PSI fue la cepa 3 con 
una media de 3.25, sin embargo, no tuvo una diferencia significativa con la cepa 
1, con una media 3.07 (ver figura 4). 
CLAVE PSI 
 
CONTROL Sin crecimiento - 
CEPA 4 2.17±0.05 a 
CEPA 2 2.41±0.02 a 
CEPA 1 3.07±0.16 b 
CEPA 3 3.25±0.19 b 
 
Figura 4. Solubilización de fósforo inorgánico en medio NBRIP 
 
El fósforo es un macronutriente elemental para el crecimiento y desarrollo de 
cualquier forma de vida, en los cultivos el fósforo es añadido en forma de 
fertilizante, sin embargo, el 99% es rápidamente convertido a formas insolubles, 
que no son asimilables por las plantas (Fernández et al., 2007), debido a esto el 
uso de bacterias solubilizadoras de fósforo (BSF) es una técnica menos costosa y 
sustentable para la sustitución de los fertilizantes fosfóricos (Sharma et al., 2009). 
En un estudio previo, Mehta et al., (2015), analizaron la composición elemental de 
plántulas inoculadas con una cepa de Bacillus solubilizadora de fosfatos, y 
encontró quehabía un aumento significativo mayor al 2% en la asimilación de 
fósforo, respecto al control sin inocular, concluyendo que el uso de BSF puede 
mejorar la nutrición vegetal y por tanto promover el crecimiento. 
 
 
 
6.3 DETERMINACIÓN DE FITORREGULADORES 
La identificación de fitorreguladores por cromatografía en capa fina (TLC)evidenció 
que las 4 cepas produjeron AIA, sin embargo, no fue concluyente respecto a los 
estándares de GA y Kinetina por esta metodología. En la figura 5 se muestra la 
placa revelada con UV de onda corta (254 nm). 
En los carriles de izquierda a derecha: Extractos de CEPA1, CEPA 2, CEPA 3, 
CEPA 4, estándar de AIA, GA y Kinetina, Control negativo. Con luz UV de onda 
corta se puede observar claramente el estándar de AIA con un factor de retención 
(Rf) de 0.86, así como el estándar de Kinetina con un Rf de 0.27. En los carriles 
de muestras se observa un compuesto con un Rf igual al estándar de AIA y otras 
bandas con un Rf de 0.21 que no corresponden al estándar de Kinetina. 
Figura 5. TLC de los extractos bacterianos en luz UV de onda corta (254 nm) 
 
 
En la figura 6, la placa fue tratada con revelador de ácido sulfúrico y visualizada a 
luz UV de onda larga (365 nm), y se observó el estándar de GA con un Rf de 0.41, 
en los carriles de muestra, se pudo observar un compuesto muy tenue con un Rf 
de 0.40 muy similar al del estándar de GA. 
Los resultados pudieron confirmar la capacidad de las bacterias seleccionadas de 
biosintetizar fitohormonas. La producción de fitohormonas ha sido un mecanismo 
de acción de las PGPR’s muy estudiado y al que le han atribuido gran parte del 
efecto benéfico hacia las plantas. 
Figura 6. Revelado de TLC con ácido sulfúrico 5% y luz UV de onda larga (365 nm) 
Para el análisis cuantitativo se utilizó un equipo de cromatografía de alta resolución 
(HPLC) se construyeron curvas de calibración de los estándares para relacionar el 
área bajo la curva con la absorbancia de soluciones de cantidades conocidas del 
estándar, (10 – 120 µg/ml) (ver figura 7). 
 
Los compuestos con tiempo de retención igual al estándar fueron cuantificados, 
los resultados obtenidos se muestran en la tabla 5. 
Tabla 5. Cuantificación de fitohormonas por HPLC 
Cepa AIA (µg/ml) GA (µg/ml) Kinetina (µg/ml) 
CEPA 1 47.84 ±1.86 99.19 ±33.62 0 0 
CEPA 2 29.11 ±2.86 66.60 ±8.05 0 0 
CEPA 3 28.11 ±10.09 0.00 0.00 0 0 
CEPA 4 23.83 ±5.85 41.86 ±8.34 0 0 
 
Los resultados cuantitativos obtenidos por HPLC confirman los resultados 
observados en la placa cromatográfica (TLC). Las cuatro cepas fueron capaces de 
biosintetizar AIA, así como tres fueron capaces de producir GA. Ambas 
2000150010005000
140
120
100
80
60
40
20
0
R-cuad. 99.6%
Área
C
o
n
ce
n
tr
ac
ió
n
Kinetina
Concentración = - 2.471 + 0.06045 Área
9008007006005004003002001000
140
120
100
80
60
40
20
0
R-cuad. 99.5%
Área
C
o
n
ce
n
tr
ac
ió
n
GA
Concentración = - 1.193 + 0.1483 Área
8007006005004003002001000
140
120
100
80
60
40
20
0
R-cuad. 99.4%
Área
C
o
n
ce
n
tr
ac
ió
n
IAA
Concentración = 2.142 + 0.1570 Área
Figura 7. Curvas de calibración y cromatogramas de AIA, GA y Kinetina 
fitohormonas están implicadas en muchos procesos de crecimiento y 
diferenciación celular en las plantas, como promover germinación y elongación de 
plántulas, elongación radicular y de tallo. 
Aunque se han descrito muchos mecanismos para explicar la promoción de 
crecimiento vegetal en las PGPR’s, el principal mecanismo para explicar este 
efecto ha sido la habilidad de las bacterias de producir o metabolizar fitohormonas 
(Bashan & de Bashan, 2010). 
Las cuatro bacterias seleccionadas en este trabajo fueron capaces de sintetizar 
ácido indol acético y tres fueron capaces de sintetizar ácido giberélico 
En leguminosas el ácido indol acético (AIA) actúa promoviendo la formación de 
nódulos y simbiosis con bacterias del género Rhizobium, en otras plantas no 
noduladas, el AIA ha promovido el establecimiento de raíces laterales, así como la 
elongación de raíces principales. El ácido giberélico, pertenece a la familia de las 
giberelinas, es una fitohormona que regula diversos procesos como la 
germinación, la elongación del tallo, floración y maduración del fruto (Cassán et 
al., 2013). 
Lim & Kim, (2009), realizaron un experimento para evaluar el efecto del ácido indol 
acético producido por diversas cepas de Bacillus, purificaron las auxinas 
producidas por las bacterias y plantas de tomate y chile fueron tratadas, mostrando 
un aumento mayor al 20% en peso seco de tallos y raíces, comprobando así el 
efecto únicamente de la fitohormona producida por las bacterias. 
En un trabajo previo de Khan et al., (2012), aislaron hongos endofíticos que 
secretaban giberelina, los cuales fueron probados como promotores de 
crecimiento en una variedad mutante de arroz deficiente en la producción de GA, 
resultando en un incremento del 22% en largo del tallo y del 50% en el peso de la 
plántula, concluyendo que el uso de microrganismos productores de GA puede 
mejorar la productividad de cultivos de importancia económica. 
 
6.4 EVALUACION DE LA TOLERANCIA A 
AGROQUÍMICOS 
La evaluación in vitro de la resistencia de las rizobacterias a siete agroquímicos 
mostro que las cuatro bacterias evaluadas fueron capaces de crecer en presencia 
de los agroquímicos a concentraciones superiores a la dosis recomendada (tabla 
6), en comparación con el control, que en la mayoría de casos donde su 
crecimiento fue inhibido por la acción de los plaguicidas. 
Estos resultados nos indican que la CEPA 1, CEPA 2 y CEPA 4 pueden ser 
utilizadas como inoculantes en suelos que contengan o utilicen los agroquímicos 
probados, y su crecimiento no será afectado negativamente. La CEPA 3 es 
sensible a dos agroquímicos usados, Rizolex y Promyl. 
Tabla 6. Tolerancia a agroquímicos de las cepas aisladas 
 BACT PROM RIZOL AGRY PULS BUCK CERCO 
 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 
CEPA1 - - - + + + + + + + + + - - - + - + + + - + + + - + + + 
CEPA2 - - + + + + + + + + + + - - - + - + + + - + + + - + + + 
CEPA3 - - + + - - - - - - - - - - + + - - + + - - + + + + + + 
CEPA4 - - + + + + + + + + + + - - - + - + + + - + + + - + + + 
CNTRL - - - - - - - - - - - + - - - - - - - + - - - + - - - + 
+: Crecimiento -: Inhibición 4:1X 3:10X 2:100X 1:1000X 
 
El uso extensivo de agroquímicos y la contaminación causada por estos afectan 
negativamente todo el ecosistema del suelo, reduciendo germinación de semillas, 
rendimiento de cultivos y alterando el metabolismo de plantas como de 
microrganismos, a su vez afectando las comunidades microbianas y el reciclado 
de nutrientes (Dimkpa et al., 2009). 
En un trabajo similar, Patil et al., (2017), reportaron una cepa silvestre de 
Pseudomonas, la cual es resistente a diversos plaguicidas, con diversas 
actividades PGPR, y que fue capaz de aumentar la germinación y altura de la 
planta en suelos contaminados con agroquímicos. Con esto se demuestra la 
utilidad de aislar microrganismos benéficos de suelos contaminados con diversos 
agroquímicos, debido a que las bacterias que no estén adaptadas a estas 
condiciones podrían limitar su crecimiento. 
6.5 ACTIVIDAD ANTAGONISTA CONTRA Streptomyces 
sp 
El ensayo de antagonismo contra Streptomyces sp. (ver figura 8) mostró que tres 
cepas (CEPA 1, 2 y 4) fueron capaces de inhibir el crecimiento del patógeno en un 
porcentaje de reducción de crecimiento de 37%, 59% y 63% respectivamente, en 
cuanto a la CEPA 3, no fue capaz de inhibir el crecimiento del patógeno cuyo 
diámetro fue igual al control (tabla 7). 
 Tabla 7. Inhibición de Streptomyces 
Tratamiento Diámetro (cm) % Inhibición 
Control 0.9 ± 0.1 a - 
CEPA 4 0.333 ± 0.05 c 63% 
CEPA 1 0.366 ± 0.05 c 59% 
CEPA 2 0.566 ± 0.05 b 37% 
CEPA