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ANAüLISIS-MOLECULAR-DE-LA-DIVERSIDAD-BACTERIANA

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 
 
 
 
 
ANÁLISIS MOLECULAR DE LA DIVERSIDAD BACTERIANA EN ÚLCERAS DE 
PIE DIABÉTICO 
 
 
TESIS 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGIA GENÓMICA 
 
PRESENTA 
 
Q.F.B CYNTHIA MARTINA MORALES REYES 
 
REYNOSA, TAMPS DICIEMBRE, 2016 
 
 
 
2 
 
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
 
CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 
 
 
 
 
ANÁLISIS MOLECULAR DE LA DIVERSIDAD BACTERIANA EN ÚLCERAS DE 
PIE DIABÉTICO 
 
 
TESIS 
 
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA 
 
PRESENTA 
 
CYNTHIA MARTINA MORALES REYES 
 
REYNOSA, TAMAULIPAS DICIEMBRE 2016 
 
 
3 
 
 
 
 
 
4 
 
 
 
 
5 
 
ÍNDICE 
 
 
 Sección Página 
AGRADECIMIENTOS. . . . . . . .7 
DEDICATORIAS. . . . . . . . .8 
 
ABREVIATURAS . . . . . . . . .9 
LISTA DE CUADROS. . . . . . . . .11 
LISTA DE FIGURAS. . . . . . . . .12 
RESUMEN . . . . . . . . . .13 
ABSTRAC. . . . . . . . . . .14 
1. ANTECEDENTES. . . . . . . . .15 
1.1 Definición del pie diabético. . . . . . .15 
1.2 Importancia del pie diabético. . . . . . .15 
1.3 Fisiopatología del pie diabético. . . . . .16 
1.4 Clasificación del pie diabético. . . . . . .17 
1.5 Infección en el pie diabético. . . . . . .18 
1.6 Análisis de la diversidad bacteriana en úlceras de pie diabético. .21 
2. JUSTIFICACIÓN. . . . . . . . . 27 
3. HIPOTESIS. . . . . . . . . . 28 
4. OBJETIVOS. . . . . . . . . 28 
4.1 General. . . . . . . . . . 28 
4.2 Específicos. . . . . . . . . 28 
5. Materiales y métodos. . . . . . . . 30 
5.1 Muestras biológicas. . . . . . . . 30 
5.2 Extracción de ADN genómico. . . . . . . 31 
5.3 Electroforesis en gel de agarosa. . . . . . . 32 
5.4 Amplificación de la región 16S de ARN ribosomal. . . . 32 
5.5 Creación de una biblioteca de clonas. . . . . . 33 
5.6 Análisis de restricción de las clonas. . . . . . 34 
5.7 Determinación de la diversidad mediante PCR de punto final y análisis de 
restricción del gen 16S de ARN ribosomal. . . . . 35 
5.8 Extracción de ADN total de las biopsias. . . . . 35 
5.9 PCR de punto final para la identificación de bacterias en pie diabético.35 
5.10 Electroforesis en gel de agarosa de los productos de PCR. . 37 
6 
 
5.11 Análisis de restricción del ARN 16S ribosomal presente en las biopsias 
seleccionadas. . . . . . . . . 37 
5.12 Análisis de restricción in silico de las biopsias seleccionadas. . 38 
5.13 Análisis de restricción in vitro de las biopsias seleccionadas. . 39 
6. RESULTADOS. . . . . . . . . 41 
6.1 Obtención y caracterización de las biopsias. . . . . 41 
6.2 Resultados del cultivo microbiológico. . . . . . 42 
6.3 Extracción de ADN genómico de cepas controles y biopsias. . . 43 
6.4 Amplificación de la región 16S ARNr. . . . . . 45 
6.5 Clonación – Transformación. . . . . . . 47 
6.6 ARDRA – RFLP. . . . . . . . 48 
6.7 Estrategia alternativa. . . . . . . . 49 
6.8 Extracción de ADN total de las biopsias de pie diabético. . . 50 
6.9 PCR y perfiles de RFLP para las bacterias seleccionadas. . . 50 
6.10 Comparación de resultados . . . . . . 59 
7. DISCUSIÓN. . . . . . . . .61 
 
8. CONCLUSIONES. . . . . . . . .68 
 
9. RECOMENDACIONES. . . . . . . .69 
 
10. BIBLIOGRAFIA. . . . . . . . .70 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
7 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
A CONACYT por otorgarme la beca para realizar ésta maestría. 
 
Al IPN por la beca BEIFI durante estos estudios. 
 
Al Dr. Virgilio Bocanegra García por su confianza y ejemplo. 
 
A mis tutores, por sus valiosas correcciones y enseñanzas. 
 
Al laboratorio de Medicina de Conservación, por su compañerismo y amistad. 
 
Al Dr. Bladinieres, porque sin su aporte no hubiera sido posible este trabajo. 
 
A la Q.F.B Krystal Lira por su ayuda en este proyecto y por su amistad. 
 
Al M. en C. Mario Sánchez por el apoyo en este trabajo 
 
A todo el Centro de Biotecnología Genómica por hacerme sentir como en casa. 
 
A mis amigas Viridiana, Roció y Leyda, porque gracias a ellas hasta los días difíciles 
fueron agradables. 
 
A Dios por su infinito amor. 
 
A mi familia y esposo, por su amor y apoyo incondicional. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
8 
 
DEDICATORIAS 
 
A mi familia y esposo, sin ellos no sería quien ahora soy. 
A todas aquellas personas que están incondicionalmente en mi vida, en especial a mi 
amiga Roció Requena. 
Dedico este trabajo a todos los maestros que han estado en mi camino de aprendizaje. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
9 
 
ABREVIATURAS 
 
% Porciento 
°C Grados centígrados 
µL Microlitros 
DNA Ácido desoxirribonucleico 
Pb Pares de bases 
mM Milimolar 
ng Nanogramos 
µM Micromolar 
U Unidades 
DM Diabetes mellitus 
OMS Organización Mundial de la Salud 
ARN Ácido ribonucleico 
ADN Ácido desoxirribonucleico 
ARDRA Análisis de restricción de ARN ribosomal amplificado 
RFLP Polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción 
PCR Reacción en cadena de la polimerasa 
mg Miligramos 
NaCl Cloruro de sodio 
rpm Revoluciones por minuto 
OMS Organización Mundial de la Salud 
IWGDF International Working Group on the Diabetic Foot 
IDSA Infectious Diseases Society of America 
pPCR Producto de PCR 
NCBI National Center for Biotechnology Information 
DGGE Electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización 
ARNr ARN ribosómico 
10 
 
TBE Tris/Borato/EDTA 
SDS Dodecilsulfato sódico 
CTAB Bromuro de hexadeciltrimetilamonio 
MgCl2 Cloruro de magnesio 
DNTPs Desoxirribonucleótidos trifosfato 
Min Minutos 
V Voltios 
Vol Volumen 
LB Luria Bertani 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
11 
 
LISTA DE CUADROS 
PÁGINA 
1. Clasificación del pie diabético por grados Meggit-Wagner. 18 
2. Bacterias presentes en la infección de úlcera de pie diabético 19 
3. Comparación de las bacterias detectadas por cultivo y 
secuenciación del gen 16S ARNr 
26 
4. Condiciones de PCR 16S iniciadores 41F-1389R 32 
5. Condiciones de la PCR con los iniciadores M13 34 
6. Protocolo de restricción para el análisis de clonas 34 
7. Iniciadores para la PCR empleados para cada una de las muestras 
de pie diabético 
 
36 
8. Condiciones de PCR 16S iniciadores 41F-1389R 38 
9. Secuencias de referencia del Genbank 39 
10. Protocolo de restricción para las enzimas HaeIII y HindIII 39 
11. Características del material biológico empleado 
12. Resultados del cultivo microbiológico 
42 
43 
13. Resumen de los ensayos de clonación 48 
14. Biopsias positivas para las bacterias amplificadas 51 
15. Resultados obtenidos en el proyecto 58 
16. Diversidad bacteriana detectada por cultivo, PCR y RFLP 16S en 
biopsias de pie diabético 
60 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
12 
 
LISTA DE FIGURAS 
 PÁGINA 
1. Diagrama general de la evolución del trabajo 30 
2. Diagrama general de la nueva metodología 35 
3. Características de los pacientes participantes de este estudio 
4. Características de las biopsias analizadas. 
5. Electroforesis del ADN genómico de combinación de bacterias. 
41 
 
42 
 
44 
6. Electroforesis de ADN genómico de tejidomuscular bovino. 
7. Electroforesis de ADN genómico de una biopsia de pie 
diabético. 
8. Electroforesis de ADN genómico de la combinación de biopsia 
de trabajo 
9. Electroforesis de ADN genómico de bacterias. 
10. Electroforesis del producto de PCR del gen 16S de ARNr. 
11. Electroforesis de los productos de PCR del gen 16S de ARNr a 
partir de ADN metagenómico. 
12. Electroforesis de los productos obtenidos de la amplificación del 
gen 16S de ARNr. 
13. Electroforesis de la amplificación del fragmento M13. 
14. Representación de los perfiles de digestión in silico con la 
enzima HaeIII. 
15. Perfiles RFLP de las clonas positivas. 
16. Electroforesis del ADN de las biopsias de trabajo 
17. Electroforesis de la muestra M1 
18. Electroforesis de la muestra M2 
19. Electroforesis de la muestra M3 
20. Electroforesis de la muestra M4 
21. Electroforesis de la muestra M5 
22. Electroforesis de la muestra M6 
23. Electroforesis de la muestra M7 
24. Electroforesis de la muestra M8 
25. Electroforesis de la muestra M9 
26. Electroforesis de la muestra M10 
27. Representación de los perfiles de digestión con la enzima HaeIII 
y HindIII mediante el programa NEBcutter V2.0. 
28. Electroforesis de los patrones de digestión de las muestras M4, 
M7, M3 y M1. 
29. Electroforesis de los patrones de digestión de las muestras M6 y 
M10. 
30. Electroforesis de los patrones de digestión de las muestras M8, 
M5, M9, M2. 
 
44 
44 
 
45 
 
45 
46 
46 
 
47 
 
47 
48 
 
49 
50 
52 
52 
53 
53 
54 
54 
54 
55 
55 
56 
 
56 
 
57 
 
58 
 
58 
 
 
 
 
13 
 
RESUMEN 
 
La diabetes mellitus es una enfermedad asociada a un conjunto de trastornos metabólicos 
caracterizados por una hiperglucemia crónica, que en los últimos años ha presentado un 
notable incremento, teniendo una cifra en el 2015 de 415 millones de diabéticos a nivel 
mundial. La DM presenta diversas complicaciones y entre las más comunes e 
incapacitantes se encuentra el pie diabético, de la cual, tan solo en el año 2012, se 
reportó que 3 millones de mexicanos presentaron algún síntoma de pie diabético, de los 
cuales 128 mil sufrieron una amputación. La identificación de los patógenos más 
prevalentes en la infección de pie diabético es fundamental para la administración de la 
terapia antibiótica adecuada y prevenir amputaciones. 
En este trabajo se buscó la identificación de las bacterias presentes en una mezcla de 10 
biopsias de pie diabético mediante técnicas moleculares y su comparación con los 
resultados obtenidos por cultivo tradicional, obteniéndose la identificación de bacterias 
Gram positivas, Gram negativas y anaerobios estrictos en las muestras analizadas. La 
metodología empleada consistió en la amplificación del gen 16S ribosomal para su 
clonación, RFLP del gen 16S y PCR punto final género o especie específica. La 
diversidad detectada por la técnica PCR fue mayor que la detectada por método de 
cultivo. Mediante RFLP al gen 16S de ARNr se observaron los fragmentos de digestión 
correspondientes a las bacterias identificadas por PCR y además de otros patrones que 
pudieran corresponder a otra bacteria. Se detectaron por PCR un máximo de 3 bacterias 
por muestra analizada, además se encontraron 4 patrones de RFLP que no correspondían 
a ninguna de las bacterias detectadas. En total se detectaron 25 bacterias por métodos 
moleculares, en comparación con un total de 11 bacterias detectadas por cultivo. De este 
modo se demuestra que, la metodología por cultivo solo refleja el crecimiento de la 
bacteria más predominante, pero no refleja el total de microorganismos presentes, 
comprobándose así que la metodología molecular es la opción más adecuada para la 
identificación de la diversidad bacteriana de ulceras de pie diabético. 
 
 
14 
 
ABSTRACT 
 
Diabetes mellitus is a disease associated with a set of metabolic disorders characterized 
by chronic hyperglycemia, which in recent years has presented a remarkable prevalence 
increase, with 415 million diabetic patients worldwide in 2015. Being a complex disease, 
it presents several complications and among the most common and incapacitating is the 
diabetic foot, that just only in 2012, it was reported that 3 million Mexicans had any 
symptoms related to diabetic foot, of which 128 thousand suffered an amputation. 
Amputation is one of the most serious outcomes of diabetic foot and occurs because 
there is a limited understanding of the nature of these infections. The identification of the 
most prevalent pathogens in diabetic foot infection is essential for the administration of 
adequate antibiotic therapy and to prevent amputations. 
The aim of this work was to identify the bacteria present in 10 diabetic foot biopsies by 
molecular techniques and their comparison with the results obtained by traditional 
culture, obtaining the identification of Gram positive bacteria, Gram negative bacteria 
and strict anaerobes in the analyzed samples. The methodology used consisted of 
amplification of the 16S ribosomal gene and cloning, RFLP of the 16S gene and 
endpoint PCR. The diversity detected by the PCR technique was greater than that 
detected by culture method. Through RFLP to the 16S rRNA gene the digestion 
fragments of the bacteria identified by PCR and in addition to other patterns that could 
correspond to another bacterium were observed. A maximum of 3 bacteria per sample 
was detected by PCR, in addition 4 patterns of RFLP were found that did not correspond 
to any of the bacteria detected. In total, 25 bacteria were detected by molecular methods, 
compared to a total of 11 bacteria detected per culture. In this way, it is demonstrated 
that, the methodology by microbiological cultures only reflects the growth of the most 
predominant bacterium, proving that molecular methodology is the most adequate option 
for the identification of bacterial diversity of Diabetic foot ulcers. 
 
 
15 
 
1. ANTECEDENTES 
 
La diabetes mellitus (DM) es un conjunto de trastornos metabólicos caracterizados por 
una hiperglucemia crónica. De acuerdo a la causa de la hiperglucemia, la diabetes se 
divide en, diabetes mellitus tipo I cuando no se producen las cantidades normales de 
insulina o la diabetes tipo II cuando el organismo no utiliza correctamente la insulina 
que se produce.1 La diabetes se considera una enfermedad crónica, no transmisible de 
origen multifactorial. En los últimos años se presentó un notable incremento de la DM, 
de acuerdo a la International Diabetes Federation, en el 2015 existían en el mundo 415 
millones de personas con diabetes y, se calcula que para el 2040 la cifra se incremente a 
642 millones.2 México ocupa el noveno lugar en diabetes mellitus a nivel mundial, en 
este país 13 de cada 100 muertes son causadas por esta enfermedad, debido a que existen 
más de 10 millones de diabéticos con una prevalencia de 10.7% en personas de 20 a 69 
años.3, 4 El aumento mundial en la prevalencia de la DM causa un inevitable crecimiento 
en la presentación de sus complicaciones. Entre las complicaciones más comunes se 
encuentran las cardiopatías, las neuropatías, las retinopatías y las lesiones crónicas que 
comprenden el cuadro clínico llamado pie diabético.5, 6 
 
1.1 Definición del pie diabético 
La Organización Mundial de la Salud (OMS) define al píe diabético como “el pie de un 
paciente que tiene el riesgo potencial de consecuencias patológicas, que incluyen 
infección, ulceración y/o destrucción de tejidos profundos asociados a anormalidades 
neurológicas, varios niveles de enfermedad vascular y/o complicaciones metabólicas de 
la diabetes en las extremidades inferiores”.7 Diferentes autores definen el pie diabético 
cómo una herida crónica que tiene la incapacidad de sanar por sí misma, que engloba 
alteraciones circulatorias, neuropatía diabética, cierre retardado de heridas, infecciones, 
gangrena y la pérdida del miembro infectado.816 
 
1.2 Importancia del pie diabético 
El pie diabético es una causa importante de morbilidad y mortalidad del paciente 
diabético, 15% de ellos lo padecen a lo largo de su vida y los pacientes mayores de 60 
años tienen un riesgo mayor a padecer pie diabético.9, 10 
De acuerdo diversos autores como Abdulrazak et al (2005), las infecciones en los pies 
son la principal causa de hospitalización de los pacientes con diabetes. Para los sistemas 
de salud a nivel mundial el pie diabético y en particular la amputación representa una 
gran carga económica, llevándose una parte importante de los recursos asignados al 
tratamiento de la DM. Cabe mencionar que el 85% de las amputaciones no traumáticas 
son consecuencia de una úlcera de pie diabético.11, 3 
Tan solo en el año 2012, la Encuesta Nacional de Salud y Nutrición, reportó que el 47.6 
% de pacientes con DM presentaron algún síntoma de pie diabético, esto es 3 millones 
de mexicanos, de los cuales 128 mil sufrieron una amputación. De acuerdo al Instituto 
Mexicano del Seguro Social, en el año 2013, Tamaulipas contaba con 132,251 
individuos con diabetes, de los cuales 560 habían sufrido una amputación, contando con 
una edad promedio de 62.7 años.¡Error! Marcador no definido. 
La rehabilitación seguida después de una amputación por infección de pie diabético tiene 
altos costos económicos, sociales y emocionales. La sobrevivencia posterior a una 
amputación ocasionada por pie diabético a 3 años es de 50% y además después de una 
amputación la incidencia de una nueva amputación a los 2 y 5 años es del 50%.9 En los 
últimos años hubo un alza en los casos de pie diabético y de amputaciones, esto es 
debido al gran incremento del 9.2% en el número de casos de diabetes mellitus en la 
población mexicana.10 
 
1.3 Fisiopatología del pie diabético 
La fisiopatología del pie diabético es muy compleja, su prevalencia y gravedad se deben, 
en gran parte, a los problemas fisiológicos del paciente y a los factores relacionados con 
los patógenos que pueden infectar el pie diabético (tales como virulencia, resistencia a 
antibióticos y carga microbiana). Por tanto, el inicio del pie diabético involucra múltiples 
17 
 
factores entre los que se encuentran una compleja interacción entre la poli-neuropatía 
distal, la anatomía anormal del pie (deformación), la inmunidad humoral alterada, la 
alteración en la respuesta inflamatoria, los cambios funcionales en la microcirculación y 
la enfermedad arterial periférica.12, 13 
Debido a que se trata de una herida crónica, el pie diabético pasa por un proceso 
inflamatorio constante en el que los leucocitos polimorfonucleares además de jugar un 
papel importante en la defensa del hospedero, liberan enzimas citolíticas, radicales libres 
de oxígeno, mediadores inflamatorios y proteasas, los cuales ocasionan daño tisular 
adicional que favorece la infección.6, 14 
 
1.4 Clasificación Meggit-Wagner del pie diabético 
Dentro de las clasificaciones del pie diabético, una de las más empleadas es la del 
modelo de Meggit-Wagner, el cual incluye seis grados de severidad, dependiendo del 
tamaño y profundidad de la herida, pero a partir del grado tres se considera una 
infección. Por su parte el Diabetes Foot Group de la Universidad de Texas proponen un 
esquema derivado del anterior y, en este, la infección se incluye como un modificador de 
co-morbilidad, pero no se especifica la severidad de la infección. El International 
Working Group on the Diabetic Foot (IWGDF) y la Infectious Diseases Society of 
America (IDSA), propusieron clasificaciones basadas en signos y síntomas clínicos.15 
El sistema de clasificación de Meggit-Wagner es el sistema de estadios de lesiones de 
pie diabético más conocidoque se correlaciona significativamente con el riesgo de 
amputación, de 6 grados, cada uno describe un tipo de lesión como se muestra en el 
cuadro 1.16 
 
 
 
 
18 
 
 
Cuadro 1. Clasificación del pie diabético por grados Meggit-Wagner. 
Clasificación de Meggit-Wagner 
Grado Lesión Características 
0 Ninguna, pie en riesgo Callos gruesos, cabezas de metatarsianos prominentes, 
dedos en garra, deformidades óseas. 
I Úlcera superficial Destrucción del espesor total de la piel. 
II Úlcera profunda Penetra la piel grasa, ligamentos, pero sin afectar hueso. 
Úlcera infectada. 
III Úlcera profunda más 
absceso (osteomielitis) 
Extensa y profunda, secreción, mal olor. 
IV Gangrena limitada Necrosis de una parte del pie o de los dedos, talón o 
planta. 
V Gangrena extensa Todo el pie afectado, efectos sistémicos. 
 
 
1.5 Infección en el pie diabético 
El International Working Group of the Diabetic Foot (IWGDF) define a la infección 
como la invasión y multiplicación de microorganismos patógenos dentro de los tejidos 
corporales. La infección de pie diabético se define además como la presencia de al 
menos dos signos o síntomas inflamatorios, que pueden sereritema, dolor, hinchazón, 
temperatura o induración.16 
La infección de pie diabético es seguida, a menudo, de amputación debido a que hay 
muy poca comprensión de la naturaleza de estas infecciones. Las infecciones de pie 
diabético ocurren de manera general en un sitio de trauma o ulceración de la piel y los 
microorganismos pueden propagarse de forma continua a los tejidos subcutáneos que 
incluyen la fascia, los tendones, los músculos, las articulaciones y los huesos. Este 
crecimiento excesivo de microorganismos dentro de la herida promueve la inflamación 
perjudicial y la destrucción del tejido. Un agravante de la infección es la neuropatía 
periférica, la cual causa que los síntomas de la infección estén disminuidos.17, 12 
Las infecciones del pie diabético son la mayoría de las veces poli-microbianas y, entre 
los organismos frecuentemente aislados se encuentran Staphylococcus aureus, 
estreptococos beta hemolíticos, enterococos algunos organismos Gram negativos 
19 
 
entéricos. En los pacientes con heridas crónicas o que han sido recientemente tratados 
con terapia antibiótica, la diversidad de patógenos se reporta como más compleja 
incluyendo anaerobios estrictos. Las infecciones más profundas (tejido subcutáneo o 
músculo) y con peligro para la extremidad son poli-microbianas con participación de 
bacterias Gram positivas, enterobacterias y anaerobios, los cuales provocan la aparición 
de necrosis tisular. Además, la disminución de la reacción inmunológica en los tejidos 
necrosados permite la colonización e infección de microorganismos de virulencia menor 
como estafilococos coagulasa negativos.11, 12, 9 
La presencia de una mezcla de diferentes bacterias provoca una mayor producción de 
factores de virulencia, tales como hemolisinas, proteasas y colagenasas, los cuales 
causan inflamación, impiden la cicatrización de heridas y contribuyen la cronicidad de la 
infección. Además, esta relación simbiótica ha demostrado que los anaerobios obligados 
pueden hacer frente a los efectos tóxicos del oxígeno mediante la interacción con las 
poblaciones de bacterias aerobias o facultativas de manera simbiótica como parte de una 
co-agregación. Como ejemplo de esto, se ha descrito el hecho de que, las especies 
aerobias consumen el oxígeno y crean nichos que permiten el crecimiento de las 
bacterias anaerobias obligadas.12, 17 En el cuadro 2 se muestran las bacterias reportadas 
en úlceras de pie diabético infectado. 
 
Cuadro 2. Bacterias presentes en la infección de úlcera de pie diabético. 
Autor y año Bacterias reportadas 
Aerobios Anaerobios facultativos Anaerobios estrictos 
Down , et al, 
200818 
Acinetobacter spp. 
Stenotrophomonas spp. 
Gordonia spp. 
Delftia spp. 
Gemella spp. 
Bacillus spp 
Hydrogenophaga spp. 
Alcaligenes faecalis 
Sphingomonas spp. 
Acidovorax spp. 
Brevibacterium spp. 
Riemella spp. 
Bradyrhizobium 
 
Staphylococcus spp. 
Rhodopseudomonas spp. 
Enterococcus spp. 
Haemophilus spp. 
Morganellaspp. 
Serratia spp. 
Proteus spp. 
Streptococcus spp. 
Klebsiella spp. 
Actinomyces spp. 
Corynebacterium spp. 
Salmonella enterica 
Enterobacter spp. 
Eikenella spp. 
Escherichia coli 
Peptoniphilus spp. 
Veillonella spp. 
Clostridium spp. 
Finegoldia magna 
Dialister spp. 
Peptococcus niger 
Fusobacterium spp. 
Varibaculum cambriense 
Anaerococcus spp. 
Prevotella spp. 
Eubacterium spp. 
Bacteroides spp. 
Selenomonadaceae spp. 
 
20 
 
Pantoea agglomerans 
Dowd, et al, 
200817 
Pseudomonas spp 
Brevibacterium spp. 
Arthrobacter spp. 
Bacillus spp. 
Citrobacter spp. 
Aerosphaera spp. 
Brevundimonas 
 
Corynebacterium spp. 
Streptococcus spp. 
Serratia spp. 
Staphylococcus spp. 
Enterococcus spp. 
Actinomyces spp. 
Helcococcus spp. 
Salmonella spp. 
Rothia spp. 
Proteus spp. 
Granulicatella spp. 
Aerococcus 
Bacteroides spp. 
Peptoniphilus spp. 
Finegoldia spp. 
Anaerococcus spp. 
Prevotella spp. 
Peptostreptococcus spp. 
Porphyromonas spp. 
Clostridium spp. 
Varibaculum spp. 
Fusobacterium spp. 
Anaerobiospirillum spp. 
Actinobaculum spp. 
Dermabacter spp. 
Veillonella spp. 
Tissierella spp. 
Propionibacterium spp. 
Peptococcus spp. 
Oates, et al, 
201219 
Micrococcus yunnanensis 
Stenotrophomonas spp. 
Sphingomonas sp. 
Bacillus pumilus 
 
Staphylococcus 
epidermidis 
Staphylococcus simulans 
Staphylococcus spp. 
Enterococcus faecalis 
Streptococcus spp. 
Streptococcus dysgalactiae 
Klebsiella spp. 
Enterobacter spp. 
Prevotella bivia 
Bacteroides fragilis 
Clostridium spp. 
 
 
 
Gardner, et 
al, 201332 
 Staphylococcus spp. 
Streptococcus spp. 
Corynebacterium spp. 
 
Peptoniphilus spp. 
Porphyromonas spp. 
Anaerococcus spp. 
Finegoldia spp. 
Prevotella spp. 
Shilpa 
Durgad, et al, 
2014 20 
Pseudomonas aeruginosa 
Citrobacter 
 
Escherichia coli 
Klebsiella 
Pneumoniae 
Staphylococcus 
aureus 
Enterococcus 
Streptococcus 
Morganella 
Enterobacter 
Clostridium 
Peptostreptococcus 
Smith, et al, 
2016 21 
Alcaligenes faecalis Actinobaculum masiliense 
Actinobaculum schaalii 
Actinomyces europaeus 
Actinomyces hominis 
Actinomyces neuii 
Actinomyces radingae 
Corynebacterium accolens 
 
Anaerococcus murdoch 
Anaerococcus tetradius 
Anaerococcus vaginalis 
Bacteriodes fragilis 
Bilophila wadsworthia 
Bulleidia extructa 
Campylobacter ureolyticus 
Clostridium saccharogumia 
Van Asten, et 
al, 2016 22 
Pseudomonas Staphylococcus spp. 
Corynebacterium spp. 
Streptococcus spp. 
Actinomyces 
Enterobacter 
Helcococcus 
Peptoniphilus spp. 
Finegoldia spp. 
Anaerococcus spp. 
Propionibacterium spp. 
Clostridium spp. 
Porphyromonas 
Prevotella 
21 
 
 
1.6 Análisis de la diversidad bacteriana en el pie diabético 
La identificación de los patógenos más prevalentes en la infección de pie diabético es 
fundamental para la administración de la terapia antibiótica adecuada y prevenir 
amputaciones.23 La toma de muestra de pie diabético con hisopo por su facilidad es de 
uso común, pero se considera un método limitado, ya que carece de especificidad y 
sensibilidad en comparación con las muestras de tejido como una biopsia. Es importante 
que cualquier muestra se tome después de una previa limpieza de la herida, para reducir 
la tasa de falsos positivos. Pellizzer, et al, (2001) determinaron que la biopsia de tejido 
era el mejor método para la evaluación microbiológica de la infección del pie diabético, 
en comparación con la muestra tomada por hisopo.24, 25 
Los métodos de cultivo convencionales para evaluar la diversidad bacteriana de la úlcera 
de pie diabético dependen de la proliferación microbiana y su estado metabólico. De esta 
manera prospera aquella bacteria que sobrevive en el entorno típico tradicional y no 
necesariamente el más abundante en la ulceración de pie diabético.26 
Los estudios realizados en México sobre la diversidad bacteriana del pie diabético son 
pocos, debido a que las investigaciones se centran en conocer que antibiótico es efectivo 
para el tratamiento. Ruiz, et al, (2007) de México, publicaron un estudio realizado en el 
Hospital Regional del ISSSTE de Zapopan, Jalisco. Investigaron la etiología bacteriana y 
la resistencia más frecuente en infecciones de pie diabético. Se trató de un estudio 
descriptivo, retrospectivo, transversal en pacientes diabéticos con lesiones del pie del 
periodo comprendido de marzo del 2004 hasta abril del 2007. Reportaron un total de 105 
bacterias, 79 pacientes presentaban al menos una bacteria (75.2%); en 26 (24.7%) 
pacientes una segunda bacteria y no se reportó ningún caso con una tercera bacteria. La 
bacteria más frecuente fue S. aureus en 21 de los 71 pacientes (27.3%). 65 (61.9%) 
bacterias presentaron resistencia a más de dos familias de antibióticos con mecanismo de 
acción diferente. Finalmente, concluyeron que el agente causal principal de las 
infecciones del pie del diabético es S. aureus, en segundo lugar E. coli y en un tercer 
lugar S. epidermidis.4 
22 
 
El cultivo de anaerobios ha sido siempre un reto para los laboratorios de microbiología, 
debido a la dificultad de mantener una atmósfera anaerobia estricta de manera constante 
y el tratamiento adecuado en la toma y transporte de la muestra, por lo cual se 
subestiman muchos anaerobios obligados. Además de esto los resultados de un cultivo 
microbiológico están disponibles de 2 a 3 días después de tomada la muestra, por tanto, 
el médico no se espera al resultado y selecciona la terapia antibiótica empíricamente.24, 
27 
A pesar de la dificultad del cultivo de anaerobios, Abdulrazak, et al, (2005) de Kuwait, 
publicaron un estudio prospectivo de las heridas de pie diabético de 86 pacientes, a las 
que realizaron cultivo para bacterias aerobias y anaerobias. Reportaron S. aureus como 
el aislado más común, ya que se recuperó de un 38,4% de los casos. Otros organismos 
reportados fueron P. aeruginosa (17,5%) y P. mirabilis (18%) y otros organismos Gram-
negativos anaerobios (10,5%), principalmente Bacteroides fragilis.11 Este estudio 
muestra como a pesar de la utilización de técnicas de cultivo para el desarrollo de 
bacterias anaerobias, S. aureus sigue siendo el aislado más común, sin embargo, se 
demuestra la presencia, aunque de baja prevalencia, de anaerobios como es el caso de B. 
fragilis 
Por su parte, Tiwari, et al, (2012) de la India, reportaron un estudio prospectivo 
realizado durante los años 2008-2009, en sesenta y dos pacientes con pie diabético, los 
cuales se sometieron historia clínica detallada, examen clínico, cultivo microbiano y 
estudio de sensibilidad antibiótica. Obtuvieron que, de los 62 casos, el 43,5% tenía 
infección mono-microbiana, 35.5% tenían infecciones poli-microbianas, y el 21% 
presentaban un cultivo sin crecimiento bacteriano. Entre las 82 bacterias aisladas 
reportaron Gram negativas en un 68% y 32% Gram positivas, reportando a E. coli como 
el aislado más común. El 21% de los pacientes a pesar de tener un cultivo sin 
crecimiento, presentaban signos de infección persistente, esto puede sugerir la presencia 
de bacterias anaerobias o no cultivables.28 
Las herramientas de biología molecular son una buena opción para definir la diversidad 
microbiana del pie diabético, y en algunas aplicaciones estas técnicas resultan ser más 
sensibles que las técnicas de cultivo microbiano.25 Es por esto que recientes estudios 
23 
 
optan por confirmar los hallazgos microbiológicos por métodos moleculares, como es el 
caso de Roudbary, et al (2014) en Irán, los cuales publicaron un estudio en donde 
investigaron la incidencia de hongos y bacterias patógenas en infecciones del pie 
diabético. El estudio se llevó a cabo en un total de 57 pacientes diabéticos que 
presentaban una infección de pie diabético sin curación, los cuales fueron remitidos a 
una clínica diabética durante el periodo 2011 – 2012. Para la obtención de la muestrautilizaron hisopo estéril, tomando la muestra a profundidad. Las levaduras aisladas 
pertenecieron al género Candida, incluyendo las especies C. albicans en un 30%, C. 
parapsilosis en un 58% y C. glabrata en un 12%. En cuanto a las bacterias aisladas 
predominaron los bacilos Gram negativos E. coli y P. aeruginosa, además de que S. 
aureus fue aislado en el 20.8% de las muestras. Otras bacterias Gram positivas 
detectadas fueron estreptococos (4%) y Enterococcus faecalis (2%).29 
Las herramientas genómicas tales como la amplificación de ácidos nucleicos, la 
secuenciación de ADN y el desarrollo de bibliotecas de gen 16S ribosomal, son 
prometedoras para la identificación completa de la diversidad bacteriana de una úlcera 
de pie diabético.26 La definición del microbioma bacteriano se ha hecho posible gracias 
al descubrimiento de secuencias de ADN ribosomal 16S, conocido como marcador 
universal. Estas secuencias universalmente distribuidas en las especies bacterianas, se 
analizan para identificar especies bacterianas individuales. Las técnicas basadas en la 
genómica tienen la capacidad de superar los problemas presentes en el cultivo 
bacteriano. Por tanto, las tecnologías moleculares, sobre todo las relacionadas con las 
identificaciones por medio de la subunidad 16S ARN ribosomal, son una herramienta 
prometedora para comprender mejor la diversidad bacteriana de la úlcera de pie 
diabético.26 
La determinación del perfil PCR-RFLP, también llamado estudio ARDRA (por sus 
siglas en inglés, Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis), del gen 16S rRNA 
consiste en una PCR combinada con la subsecuente digestión de sus productos 
utilizando enzimas de restricción, mediante este análisis de RFLP se evidencian los 
cambios genéticos entre especies, y de este modo identificar el microbioma bacteriano 
de una muestra compleja como lo son las biopsias de pie diabético. A continuación, se 
24 
 
muestran algunos trabajos que emplean el uso de técnicas moleculares para el estudio de 
la diversidad bacteriana en las infecciones de pie diabético: 
Downd, et al, (2008) de Estados Unidos, mediante el uso de pirosecuenciación evaluaron 
la diversidad bacteriana de 40 úlceras crónicas de pie diabético. Para la secuenciación 
del gen 16S ARNr se utilizaron los cebadores 530F y 1100R. En este estudio, se reportó 
que el género más frecuente fue Corynebacterium, que fue encontrado en 30 de las 40 
úlceras diabéticas, por su parte Bacteroides, Peptoniphilus, Fingoldia y Anaerococcus 
spp. también fueron altamente prevalentes. Este artículo destaca la diversidad de la 
población bacteriana en pie diabético y apoya la presencia de pato-grupos, los cuales 
comprenden bacterias diferentes que producen simbióticamente una comunidad 
patógena.17 
Singh, S K. et al, (2009) de La India, publicaron un estudio en el que determinaron la 
diversidad bacteriana en las infecciones del pie diabético a nivel genético por huellas 
digitales, es este caso, ERIC-PCR (Enterobacterial repetitive intergenic consensus 
sequence-based). Un número de nueve pacientes fueron seleccionados para el estudio, a 
los cuales se tomó muestra de pus y de tejido de la zona de la herida de pie diabético. 
Las bacterias fueron aisladas por cultivo tradicional y posteriormente analizaron su 
variabilidad genética por medio de ERIC-PCR. En total fueron 38 tipos de bacterias 
aislados por cultivo y por medio de ERIC-PCR se detectaron hasta 8 tipos de cepas 
bacterianas aeróbicas de un único paciente, comparado con solo 2 tipos encontrados por 
cultivo. Concluyeron que la técnica molecular de ERIC-PCR es un método de detección 
más sensible que las técnicas convencionales.30 
Gontcharova, V. et al, (2010), en Estados Unidos, publicaron un estudio donde 
realizaron la secuenciación del gen 16S ribosomal para evaluar la microbiota bacteriana 
de las úlceras diabéticas en comparación con la piel sana. Se obtuvieron 23 muestras de 
úlceras diabéticas por desbridamiento y 28 muestras de piel intacta. Realizaron 
secuenciación bTEFAP (Bacterial tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing). Como 
resultados observaron la presencia de más de una bacteria en las heridas de pie diabético, 
apoyando la idea de que estas establecen un grupo simbiótico, lo cual contribuye a la 
cronicidad de la herida. Además de esto se estableció que los resultados del microbioma 
25 
 
bacteriano de la piel sana muestran una diversidad menor. En lo reportado se estableció 
que las úlceras de pie diabético contienen géneros como Corynebacterium, 
Streptococcus y Anaerococcus; aunque la piel intacta también contiene la presencia del 
genero Corynebacterium pero en menor cantidad, lo que lo estableció como una bacteria 
oportunista en las heridas crónicas de úlcera de pie diabético.31 
Oates et al, (2012) del Reino Unido, publicaron un estudio en el que utilizaron técnicas 
de cultivo bacteriano en comparación con PCR-DGGE para el análisis de las especies 
bacterianas presentes en muestras de desbridamiento de pie diabético y muestras de piel 
sana. Por medio de PCR-DGGE determinaron que S. aureus está presente en las 
muestras procedentes de pie diabético, mientras que en las muestras de piel sana S. 
aureus no estuvo presente. Además, también reportaron que la diversidad microbiana es 
mucho menor en la piel sana que en las muestras de úlceras de pie diabético.19 
Gardner, et al, (2013) de los Estados Unidos, reportaron un análisis del microbioma del 
pie diabético en 52 pacientes, por secuenciación del gen 16S ARNr. Los objetivos del 
estudio fueron comparar la carga biológica de la ulcera de píe diabético detectada por la 
secuenciación del gen 16S ARNr con la obtenida por cultivo tradicional. Cincuenta y dos 
sujetos fueron inscritos con una edad media de 53,9 (±11,89) años. Cuarenta y tres 
(82,7%) eran hombres y 48 (92,3%) eran blancos. Cuarenta y tres (82,7%) tenían 
diabetes tipo 2, mientras que el resto tenía diabetes tipo 1. El gen 16S ARNr se amplificó 
utilizando los cebadores 27F y 534R. Se identificaron un total de 13 filos, la mayoría de 
las secuencias clasificadas en Firmicutes (67%), Actinobacteria (14%), Proteobacteria 
(9,8%), Bacteroides (7,3%), y Fusobacteria (1,4%). La bacteria mayormente aislada fue 
S. aureus, en 46% de las muestras tanto en el estudio molecular como el cultivo. El 
cultivo reveló que 14 (27%) de las úlceras de pie diabético contenían anaerobios en 
comparación con 52 (100%) mostrado por el método de secuenciación. En el cuadro 3 se 
muestra la comparación en porcentaje de la presencia de diferentes tipos de bacterias 
evaluadas por cultivo y por secuenciación de ARNr 16S, por lo tanto se concluyó que los 
cultivos no representan plenamente el microbioma de las ulceras de pie diabético en 
comparación con las técnicas genómicas.32 
 
26 
 
 
 
Cuadro 3. Comparación de las bacterias detectadas por cultivo y secuenciación del 
gen 16S ARNr.26 
Bacteria Cultivo (%) Secuenciación 16S (%) 
Staphylococcus 40 94 
Anaerobios 27 100 
Proteobacteria 35 100 
Streptococcus 37 83 
 
Los antecedentes citados muestran una diversidad bacteriana variable presente en la 
úlcera de pie diabético, así como, la problemática de identificar de manera fiable las 
bacterias involucradas, en la mayoría de estos artículos se da la comparación del cultivo 
microbiológico con los métodos moleculares y en la mayoría de los casos se presenta 
una diferencia de géneros bacterianos detectados por estos métodos. De este modo estos 
trabajos apoyan la idea de que el pie diabético tiene la presencia de una diversidad de 
bacterias aerobias estrictas y que la presencia de anaerobias facultativas y estrictas, así 
como bacterias no cultivables. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
27 
 
 
 
2. JUSTIFICACIÓN 
 
El pie diabético es un problema de salud en México que genera altos costos económicos, 
cada año se realizan en promedio 28,000 amputaciones, y esto va en aumentodebido al 
alza en las complicaciones de la diabetes mellitus. 
La amputación de pie diabético es consecuencia de la carencia de un tratamiento 
adecuado debido a que no existen protocolos estandarizados. Esta amputación ocasiona 
una incapacidad de movilidad en el paciente, así como tiene consecuencias psicológicas 
y laborales. El efecto de la infección bacteriana depende del tipo de bacteria presente, sin 
embargo, los métodos de cultivo solo detectan una o dos bacterias a la vez, por lo que no 
se conoce el efecto de la diversidad microbiana sobre la herida de pie diabético. En la 
práctica diaria no se tiene conocimiento de la presencia de anaerobios en el pie diabético, 
la cual puede significar un agravante para la enfermedad 
Es por esto que la identificación de la diversidad bacteriana del pie diabético mediante 
herramientas moleculares es una excelente primera aproximación para determinar las 
bacterias presentes en estas heridas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
28 
 
 
 
 
3. HIPÓTESIS 
 
Mediante métodos moleculares es posible detectar una mayor diversidad bacteriana en 
úlceras de pie diabético que por cultivo microbiológico. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
29 
 
 
 
4. OBJETIVOS 
 
4.1 General 
Determinar la diversidad microbiana de la úlcera de pie diabético y comparar dicha 
diversidad con los resultados reportados por cultivo microbiológico. 
 
4.2 Específicos 
1. Caracterizar mediante métodos moleculares (ARDRA, PCR de punto final y RFLP del 
RNA16S) la diversidad microbiana presente en biopsias de infecciones de pie diabético. 
2. Comparar los resultados de la caracterización molecular con los resultados por 
métodos microbiológicos 
3. Valorar la diversidad presente y determinar si concuerda con la detectada por métodos 
de cultivo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
30 
 
 
31 
 
5. MATERIALES Y MÉTODOS 
 
La figura 1 muestra el esquema general del proyecto 
 
Figura 1. Diagrama general de la evolución del trabajo 
 
5.1 Muestras biológicas 
Se utilizaron 10 biopsias de pie diabético de grado III elegidas de acuerdo con la 
clasificación de Meggit-Wagner. Las biopsias fueron obtenidas con la colaboración del 
Dr. Eduardo Bladinieres Cámara, cirujano vascular, responsable de la clínica Angiología 
y Cirugía Vascular del Noreste. 
Se eligieron biopsias de pacientes adultos con diabetes, de los cuales 6 eran hombres y 4 
mujeres, 50% de ellos presentaban lesión en tendón, 30% lesión en hueso y 20% lesión 
en músculo. Los pacientes presentaban signos de infección aguda y no habían recibido 
tratamiento previo a la toma de muestra. Se obtuvieron consentimientos informados para 
el presente estudio. 
Muestras: 10 
biopsias de pie 
diabético
Extracción de ADN 
genómico de una 
muestra compuesta
PCR del 16S de 
ARNr 
Clonación por medio 
de TOPO TA® 
Seleccionar aprox. 
300 colonias y 
someter cada una a 
lisis térmica
PCR ADNr 16S
único 
ARDRA 
- HhaI, HaeIII, Alu I
PCR de punto final 
RFLP del gen 16S
ARN
Metodología alternativa 
32 
 
Se excluyeron a los pacientes que no presentaran un grado 3 de Meggit-Wagner, 
menores de edad, paciente con pie de Charcot y aquellos pacientes que habían recibido 
tratamiento antibiótico tres días antes de la toma de muestra. 
 
5.2 Extracción de ADN genómico. 
Se colocaron 100 mg de tejido de una sola muestra compuesta por 10 biopsias 
seleccionados, se maceró añadiendo 25 µL de proteinasa K y se incubó a 55°C por 16 
horas con agitación constante. Después de transcurrido este tiempo se realizó la 
extracción de ADN utilizando el estuche comercial Wizard ® Genomic DNA 
Purification (Promega) siguiendo las especificaciones del fabricante. 
Para la extracción de ADN se estandarizó el protocolo CTAB en combinación con el 
estuche comercial Wizard ® Genomic DNA Purification (Promega): se agregaron 200 
µL de lisis enzimática al tejido tratado con proteinasa K, se llevó a incubación durante 
30 minutos a 37°C, se añadieron 300 µL de TE 1X y 30 µL de SDS al 10%, se incubó a 
55°C durante 60 minutos, después de este tiempo se agregaron 100 µL de NaCl 5M más 
80 µL de solución CTAB y se incubó a 65°C por 10 minutos. Después de este paso se 
empleó el estuche comercial Wizard ® Genomic DNA Purification (Promega), 
adicionándose 200 µL de una solución para precipitar proteínas y se colocó en hielo 
durante 5 minutos, después de transcurrido este tiempo, la muestra se centrifugó por 4 
minutos a 13,000 rpm, se removió el sobrenadante a un tubo limpio, se añadieron 600 
µL de isopropanol y se mezcló por inversión. La muestra se centrifugó por 1 minuto a 
13,000 rpm y se decantó el sobrenadante, y a la pastilla formada se agregaron 600 µL de 
etanol al 70%, mezclándose por inversión y se centrifugó 1 minuto. Después de 
centrifugar se aspiró el etanol, quedando una pastilla de ADN, la cual se dejó secar en 
papel absorbente por 15 minutos, finalmente se agregaron 100 µL de solución de 
rehidratación y se incubó 60 minutos a 36°C. 
 
 
 
33 
 
5.3 Electroforesis en gel de agarosa 
Para comprobar la extracción e integridad del ADN, se realizó un gel de agarosa al 1%, 
con TBE 1X. Al gel se le agregaron 4 µL del ADN extraído más 2 µL de SYBR Green, 
se utilizó 1 µL de marcador lambda 500 ng/µL. La electroforesis se realizó con un 
voltaje de 100 voltios por 60 minutos. 
 
5.4 Amplificación de la región 16S ARN ribosomal 
Para la amplificación de la región 16S de ARNr se realizó una reacción en cadena de la 
polimerasa (PCR) utilizando el termociclador Labnet®. Se utilizó el estuche de reacción 
Go Taq® Flexi DNA polymerase, los cebadores universales utilizados fueron 41F (5´-
gctcagattgaacgctggcg-3´) y 1389R (5′-acgggcggtgtgtacaag-3′) de acuerdo con el 
protocolo que se muestra en el cuadro 4 de Fisher et al. (2007).33 
 
Cuadro 4. Condiciones de PCR 16S usando los iniciadores 41F-1389R 
Condiciones de reacción Programa de amplificación 
Reactivo Con. inicial Vol.( µL) Temp. (°C) Tiempo (min) Ciclos 
Solución 
amortiguadora 
5X 5 95 4 1 
MgCl2 25 mM 1.8 94 0.5 30 
DNTPs 10 mM 0.6 50 1 
41F 10 µM 1.5 72 1 
1389R 10 µM 1.5 72 7 1 
Taq 5 U/µL 0.01 
H2O - - - 12.59 
ADN 200 ng 2.0 
Vol. final 25 
 
 
 
 
 
34 
 
5.5 Creación de una biblioteca de clonas 
La creación de la biblioteca de clonas se llevó a cabo utilizando el estuche comercial de 
clonación TOPO TA® (Invitrogen), los productos de la amplificación de la región 16S 
ARNr fueron clonados en el vector pCR II-TOPO y la transformación se realizó en cepa 
DH5α-T1 de E. coli, de acuerdo a los protocolos del fabricante. 
Reacción de ligación: para la reacción de ligación se utilizó TOPO TA® (Invitrogen) 
con 2 µL de producto de PCR, 1 µL del vector y agua a un volumen final de 6 µL. La 
reacción se mezcló e incubó a temperatura ambiente (22-23 °C) por 5 minutos. Después 
la reacción se colocó en hielo hasta proceder con el protocolo de transformación. 
Reacción de transformación: se añadieron 2 µL de la reacción de ligación a un vial de 
células competentes previamente descongeladas en frio. La reacción se mantuvo en hielo 
de 5 a 30 minutos. Después a la reacción se le realizó un choque por calor durante 50 
segundos a 42°C y se transfirió inmediatamente a hielo. En seguida se colocaron 250 µL 
de medio Soc a temperatura ambiente. El tubo de la reacción se agitó de manera 
horizontal a 200 rpm a 37° C por dos horas. Después se centrifugó y eliminó el 
sobrenadante. Se esparcieron 30 µL de la reacción en placas de medio Luria Bertani a las 
que se añadieron previamente 40 µL de X-gal. Finalmente, las placas se incubaron 
durante 16 horas a 37°C. 
Análisis de transformantes: después del proceso de ligación-transformación, se observó 
el crecimiento de células transformadas, las cuales se presentaron como colonias 
pequeñas de color blanco. Se recuperó la mayoría de las colonias y se inocularon en 360 
µLde caldo LB con kanamicina. Cuando se observó crecimiento en caldo LB con 
kanamicina, se tomaron 100 µL del cultivo para realizar lisado. 
Se seleccionaron las colonias blancas y se les realizó lisis térmica por medio de 
incubación durante 10 minutos a 94°C. Después de esto se realizó una PCR utilizando 
los iniciadores M13F (5´-gtaaaacgacggccagt-3´) y M13R (5´-aacagctatgaccatg-3´) de 
acuerdo a lo establecido en el protocolo de Fisher et al., (2007) el cual se muestra en el 
cuadro 5. 
 
35 
 
Cuadro 5. Condiciones de la PCR con los iniciadores M13 
Condiciones de reacción Programa de amplificación 
Reactivo Con. inicial Vol. (µL) Temp. (°C) Tiempo 
(min) 
Ciclos 
Solución 
amortiguadora 
5X 5 95 4 1 
MgCl2 25 Mm 1.8 94 0.5 30 
dNTPs 10 Mm 0.6 50 1 
M13 F 10 µM 1.5 72 1 
M13 R 10 µM 1.5 72 7 1 
Taq 5 U/µL 0.01 
H2O - - - 12.59 
ADN 200 ng 2.0 
Vol. final 25 
 
 
5.6 Análisis de restricción de las clonas 
Después se realizó el análisis de restricción de ADN ribosomal amplificado (ARDRA), 
utilizándose la enzima HaeIII (Promega), de acuerdo con el protocolo de restricción que 
se muestra en el cuadro 6: 
 
Cuadro 6. Protocolo de restricción para el análisis de clonas 
Protocolo de restricción 
Reactivo Volumen (µL) 
Agua miliQ estéril 7.85 
Solución amortiguadora 10X 1.5 
Albumina sérica bovina 0.15 
ADN (pPCR) 5.0 
Enzima 10 U/µL 0.5 
Volumen final 15 
 
La reacción de digestión se incubó a 37 °C por 16 horas, transcurrido este tiempo se 
visualizó el producto de digestión en un gel de agarosa al 3% (TBE 1X, 90 voltios por 
120 minutos). 
 
36 
 
5.7 Determinación de la diversidad mediante PCR de punto final y análisis de restricción 
del gen 16S de ARN ribosomal 
A continuación, se presenta un diagrama general de metodología alternativa (figura 2). 
Los detalles del porque agregar esta metodología adicional se explican en la sección de 
resultados. 
Figura 2. Diagrama general de la metodología alternativa 
 
 
5.8 Extracción de ADN total de las biopsias 
De cada una de las biopsias elegidas se obtuvo ADN genómico mediante la metodología 
estandarizada CTAB-Wizard de Promega. Se tomaron alrededor de 2 mm cúbicos de 
tejido y se sometieron a un pretratamiento con proteinasa K a 95°C por 16 horas, con la 
finalidad de lisar por completo las muestras que contenían fragmento de hueso, tendón y 
musculo. Seguido de este tiempo se aplicó la metodología CTAB-Wizard, de acuerdo a 
las condiciones previamente estandarizadas. 
 
5.9 PCR de punto final para la identificación de bacterias en pie diabético 
Se realizó PCR de punto final para cada una de las muestras de pie diabético. Las 
bacterias fueron seleccionadas de una revisión de literatura donde se buscó las bacterias 
más comúnmente reportadas en el pie diabético. A continuación, en el cuadro 7 se 
muestran los iniciadores que fueron seleccionados en una evaluación de la literatura y 
sus condiciones de amplificación 
 
Extracción de 
ADN genómico 
de cada biopsia 
PCR 
convencional 
para la 
detección de las 
bacterias
PCR 16S para 
cada una de las 
biopsias
RFLP in silico 
e in vitro con 
HaeIII y 
HindIII
37 
 
Cuadro 7. Iniciadores para la PCR empleados para cada una de las muestras de pie 
diabético 
 
 
 
Bacteria Iniciador Secuencia pb Tm 
(⁰c) 
Referencia 
S. pyogenes 1258 F:5'aaagaccgccttaaccacct-'3 
r:5'tggcaaggtaaacttctaaagca-'3 
407 55 Dongyou Liu, 
200534 
B. fragilis LEU F- 5′cggatgccattgataaagtagg-3′ 
r- 5′ctggaagcaagcacattagc-3′ 
448 58 Papaparaskeva
s, et al, 201335 
C. perfringens Cper F 5'gctaatgttactgccgttga-'3 
 r 5'cctctgatacatcgtgtaag-'3 
300 
324 
53 Meer RR et al, 
199736 
P. mirabilis ureR F 5′ggtgagatttgtattaatgg-3′ 
r 5′ataatctggaagatgacgag-3′. 
225 58 Weiwei Zhang 
et al 201337 
Prevotella 
intermedia 
Pi 192 
Pi468 
F 5'-ccacatatggcatctgacgtggac-'3 
r 5'cccgctttactccccaacaa-3' 
277 55 Yanbin Zhou 
201438 
Finegoldia 
magna 
Pmag F 5-cgggntttagtagacagaag-3 
r 5-cagtttccaatgctttacgg-3 
553 60 Riggio and A. 
Lennon 200339 
Acinetobacter
 sp 
Ac436 
Ac676 
F, 5'-tttaagcgaggaggagg-3' 
r, 5'-attctaccatcctctccc-3' 
280 58 Neil 
Woodford , et 
al. 200440 
Enterobacter 
cloacae 
Uw4 F 5-tagcaacggagatccaa-3 
r 5-ccattcatcatcctgcat-3 
500 52 Jiping Li, et 
al, 200041 
S. aureus SaU 5′tacatgtcgttaaacctggtg-3′ 
5′tacagttgtaccgatgaatgg-3′ 
224 50 Naoko Chiba, 
et al, 200942 
E. coli mdh F:5´-ggtatggatcgttccgacct-3´ 
r: 5´-ggcagaatggtaacaccagagt-3´ 
304 55 Klein et al. 
200243 
 Serratia 
marcescens 
SermaF 
SermaR 
5'-tgcctggaaagcggcgatgg-3' 
5'cgccagctcgtcgttgtggt-3' 
155 60 Joyner et al, 
201444 
Enterococcus 
faecalis 
FL1 
FL2 
5'-acttatgtgactaacttaacc-3' 
5'-taatggtgaatcttggtttgg-3' 
360 52 Iweriebor et 
al, 201545 
Enterococcus 
faecium 
FM1 
FM2 
5'-gaaaaaacaatagaagaatat-3' 
5'tgcttttttgaattcttcttta-3' 
215 48 Iweriebor et 
al, 2015 45 
Enterococcus 
sp. 
ENT1 
ENT2 
5'-tactgacaaaccattcatgatg-3' 
5'-aacttcgtcaccaacgcgaac-3' 
112 57 Iweriebor et 
al, 201545 
Pseudomonas 
aeruginosa 
PASSF 
PASSR 
5'-gggggatcttcggacctca-3' 
5'-tccttagagtgcccacccg-3' 
956 50 Spilker et al, 
200446 
Pseudomonas 
sp. 
PAGSF 
PAGSR 
5'-gacgggtgagtaatgccta-3' 
5'-cactggtgttccttcctata-3' 
618 50 Spilker et al, 
2004 46 
S. aureus SA1 
SA2 
5'gcgattgatggtgatacgg-3' 
5'caagccttgacgcgaactaaa-3' 
276 53 Brakstad et al, 
199247 
38 
 
Todas las PCR fueron realizadas en el termociclador Labnet®. Se utilizó el estuche 
comercial de reacción Go Taq® Flexi DNA polymerase (5U/µL), con una concentración 
de MgCl2 de 25 mM y 10 µM de iniciadores. Todas las PCR se realizaron a un volumen 
final de 15 µL. 
 
5.10 Electroforesis en gel de agarosa de los productos de PCR 
Para comprobar la presencia del amplicon positivo esperado, a todos los productos de 
PCR se le realizó una electroforesis en gel de agarosa del 1.5% (TEB 1X) con un voltaje 
de 90 voltios por 45 minutos. 
 
5.11 Análisis de restricción del ARNr 16S presente en las biopsias seleccionadas 
Mediante el análisis de restricción del gen 16S de ARN ribosomal se observaron los 
diferentes patrones de restricción correspondientes a las bacterias seleccionadas y de esta 
manera se confirmó su presencia, así como también, se buscó observar patrones que no 
correspondían a ninguna bacteria positiva por PCR y así se dedujo si existían otras 
bacterias presentes. 
Se realizó una PCR 16S para cada una de las biopsias, se utilizaron los iniciadores 41F 
(5´-gctcagattgaacgctggcg-3´) y 1389R (5′-acgggcggtgtgtacaag-3′) de acuerdo con el 
protocolo de Fisher et al., (2007), para la amplificación del gen 16S ribosomal, para la 
obtención de un fragmento aproximado de 1450 pares de bases. A continuación, en el 
cuadro 8, se muestran las condiciones de reacción y amplificación para estos iniciadores. 
 
 
 
 
 
39 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
La amplificación se comprobó en un gel de agarosa al 1.5% en TBE 1X, se colocaron 8 
µL del producto de PCR y 2 µL de SYBER Green, utilizándose 1 µ de marcador de 100 
pares de bases. Se realizó la electroforesis a 100 voltios por 45 minutos. 
 
 
5.12 Análisis de restricción in silico de las biopsias seleccionadas 
Antes de realizar las digestiones in vitro se buscó conocer los fragmentos de restricciónin silico para las bacterias detectadas por PCR. Primeramente, se obtuvieron las 
secuencias del gen 16S ARN ribosomal de la base de datos del NCBI, cuyos números de 
referencia de las secuencias se muestran en el cuadro 9. Después se realizó una digestión 
in silico para la secuencia 16S de las bacterias identificadas en este estudio por medio 
del programa en línea NEBcutter V2.0 de New England BioLabs Inc 
(http://nc2.neb.com/NEBcutter2/). Se analizaron las secuencias para determinar que 
enzimas eran las más adecuadas para la digestión in silico. Para la mayoría de las 
bacterias se seleccionó la enzima HaeIII, pero en algunas bacterias esta enzima no 
efectuaba cortes in silico, por lo que se utilizó HindIII en esas bacterias. Como resultado 
se observaron los fragmentos de digestión in silico, seleccionándose un gel al 3% y un 
marcador de 100 pares de bases. 
Cuadro 8. Condiciones de PCR 16S iniciadores 41F-1389R 
Condiciones de reacción Programa de amplificación 
Reactivo Con. inicial Vol. (µL) T (°C) Tiempo 
(min) 
Ciclos 
Solución 
amortiguadora 
5X 5 95 4 1 
MgCl2 25 mM 1.8 94 0.5 30 
dNTPs 10 mM 0.6 50 1 
41 F 10 µM 1.5 72 1 
1389 R 10 µM 1.5 72 7 1 
Taq 5 U/µL 0.01 
H2O - - - 12.59 
ADN 200 ng 2.0 
Vol.final 25 
http://nc2.neb.com/NEBcutter2/
40 
 
Cuadro 9. Secuencias de referencia del Genbank 
Bacteria Número de referencia Genbank 
S. pyogenes NC_002737.2 
B. fragilis NC_006347.1 
C. perfringens NC_008593.1 
P. mirabilis NC_010554.1 
Prevotella intermedia NC_014371.1 
Acinetobacter spp. NC_014259.1 
Enterobacter cloacae NC_014121.1 
S. aureus NZ_LN831049.1 
E. coli NC_000913.3 
Serratia marcescens NZ_HG326223.1 
Enterococcus faecalis NC_004668.1 
Enterococcus faecium NC_017960.1 
Enterococcus sp. NC_018081.1 
Pseudomonas aeruginosa NC_002516.2 
Pseudomonas sp. NC_004129.6 
S. aureus NC_007795.1 
 
 
5.13 Análisis de restricción in vitro de las biopsias seleccionadas 
Se efectuó la digestión in silico para las amplificaciones del gel 16S de las muestras de 
trabajo con las enzimas HaeIII y HindIII. Las condiciones de la digestión para ambas 
enzimas se muestran en el cuadro 10: 
 
Cuadro 10. Protocolo de restricción para las enzimas HaeIII y HindIII 
Protocolo de restricción 
Reactivo Volumen (µL) 
Agua miliQ estéril 7.85 
Solución amortiguadora 10X 1.5 
Albumina sérica bovina 0.15 
ADN (PCR) 5.0 
Enzima 10 U/µL 0.5 
Volumen final 15 
 
 
41 
 
La reacción se incubó a 37°C por 16 horas. Después de transcurrido el tiempo se realizó 
una electroforesis en gel de agarosa al 3% (TBE 1X, 90 voltios, por 120 minutos), para 
observar los patrones de corte obtenidos colocándose 10 µL del producto de la reacción 
de digestión y 3 µL de SYBR Green, se utilizó el marcador de 100 pares de bases. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
42 
 
6. RESULTADOS 
 
6.1 Obtención y caracterización de las biopsias 
Mediante la colaboración con la clínica Angiología y Cirugía Vascular del Noreste, se 
obtuvieron 10 biopsias de úlcera de pie diabético grado 3 de la clasificación de Wagner. 
Las biopsias fueron obtenidas previo consentimiento informado. 
Los pacientes de este estudio en su mayoría eran hombres en un 70%. La edad de los 
pacientes oscilaba entre los 29 y 75 años, teniendo una edad promedio de 66.7 años. 
 
 
Figura 3. Características de los pacientes participantes de este estudio 
 
El procedimiento de toma de la muestra se llevó a cabo por biopsia quirúrgica en 
quirófano, por incisión, previa anestesia local y con la utilización de un bisturí. Las 
biopsias se transportaron al laboratorio en menos de 12 horas de su obtención. Las 
características de las biopsias se muestran en el cuadro 11. 
 
 
 
 
 
70%
30%
Género de los pacientes 
Hombres Mujeres
0
20
40
60
80
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213
Edad de los pacientes 
43 
 
Cuadro 11. Características del material biológico empleado 
Paciente Tipo de muestra Descripción de la muestra 
M1 Tendón Fragmento infectado de tendón del quinto dedo del pie 
derecho 
M2 Tendón Fragmento de tendón infectado de la región plantar de 
pie derecho 
M3 Tendón Fragmento de tendón infectado del tercer dedo del pie 
izquierdo 
M4 Tejido necrótico Lesión profunda con necrosis, sepsis y síndrome 
compartamental 
M5 Tendón y hueso Fragmento de tendón plantar y fragmentos de hueso 
del primer metatarso 
M6 Músculo Musculo de la región plantar del pie derecho 
M7 Hueso Fragmento del quinto metatarso del pie derecho 
M8 Tendón Fragmento de tendón de la región plantar del pie 
izquierdo 
M9 Músculo y Tendón Fragmento de musculo plantar y tendón flexor del pie 
izquierdo 
M10 Fascia muscular y 
tendón 
Fragmento de fascia muscular y tendón de la región 
plantar del pie derecho 
 
En la figura 4 se muestran las diferentes proporciones de las características del material 
biológico empleado en este trabajo. 
 
Figura 4. Características de las biopsias analizadas. 
 
6.2 Resultados del cultivo microbiológico 
Antes del análisis molecular se realizó cultivo microbiológico de las biopsias a su 
llegada al laboratorio, obteniéndose los siguientes resultados descritos en el cuadro 12. 
 
34%
11%
11%
11%
11%
11%
11%
Tendón
Hueso
Tejido necrótico
Tendón y hueso
Músculo
Músculo y tendón
Fascia muscular y tendón
44 
 
Cuadro 12. Resultados del cultivo microbiológico 
Muestra Bacterias detectadas 
M1 S. aureus, Enterobacter 
M2 S. aureus 
M3 S. aureus 
M4 Providencia stuartii 
M5 Citrobacter diversus 
M6 S. aureus 
M7 S. aureus 
M8 Enterococcus 
M9 Enterococcus 
M10 Enterobacter 
 
En el perfil de resistencia a antimicrobianos de las biopsias de trabajo, los antibióticos 
que mostraron mayor efectividad fueron cefalotina y trimetoprim con sulfametoxazol en 
un 30% de las muestras. Las muestras M4 y M7 mostraron una amplia resistencia a 
antibióticos, siendo efectivos solo cloranfenicol en M4 y vancomicina en la muestra M7. 
 
6.3 Extracción de ADN genómico de cepas controles y biopsias 
Dada la complejidad de la muestra y de que esta se encontraba en poca cantidad, con el 
fin de no perder la muestra, se realizaron extracciones de prueba, utilizando tres 
diferentes protocolos: Wizard ® Genomic DNA Purification (Promega), lisis 
enzimática/CTAB y CTAB + Wizard con pretratamiento con Proteinasa K, a 55°C por 
12 horas. 
Se realizó con las tres metodologías la extracción de ADN genómico de una 
combinación de bacterias, previamente caracterizadas, que se utilizó como control 
positivo. Las bacterias utilizadas en esta combinación fueron: S. aureus, S. epidermidis, 
E. coli, S. tiphymurium, L. monocytogenes, P. aeruginosa, A. hydrophila, V. 
parahemolyticus, V. cholerae, Enterococcus sp, C. freundii, S. liquefaciens, Klebsiella 
spp, P. vulgaris, E. aerogenes y E. cloacae. Obteniéndose de manera satisfactoria la 
extracción con el método CTAB + Wizard con pretratamiento con proteinasa K, a 55°C 
por 12 horas (figura 5). 
45 
 
 
Figura 5. Electroforesis del ADN genómico de combinación de bacterias. Gel de 
agarosa al 1%, 100V por 1 hora. Carril 1: biopsia + mezcla de bacterias. Carril 2: mezcla 
de bacterias. Marcador lambda 500 ng/µL. 
 
También como control se utilizó una muestra de tejido muscular bovino al que se añadió 
un conjunto de las bacterias antes mencionadas, esto para simular la dificultad del tejido 
de trabajo. Como metodología de extracción de ADN se utilizó el protocolo CTAB + 
Wizard con pretratamiento con proteinasa K, 55°C por 12 horas (figura 6). 
 
Figura 6. Electroforesis de ADN genómico de tejido muscular bovino. Gel de 
agarosa al 1%, 100 V por 1 hora. Carril 1: tejido muscular bovino. Marcador lambda 500 
ng/µL. 
 
Como prueba para la obtención de ADN de tejido, se utilizó una biopsia de pie diabético 
del año 2014, para la cual se utilizó elprotocolo CTAB + Wizard con pretratamiento con 
proteinasa K, a 55°C por 12 horas (figura 7). 
 
Figura 7. Electroforesis de ADN genómico de una biopsia de pie diabético. Gel de 
agarosa al 1%, 100 V por 1 hora. Carril 1: biopsia. Marcador lambda 500 ng/µL. 
 
46 
 
Después de realizadas estas extracciones de ensayo, se realizó la extracción de ADN 
genómico del conjunto de 10 biopsias de grado III de Wagner, mediante el protocolo 
CTAB + Wizard obteniendo lo siguientes resultados (figura 8). 
 
 
 
Figura 8. Electroforesis de ADN genómico de la combinación de biopsia de trabajo. 
Gel de agarosa al 1%, 100 V por 1 hora. Carril 1: biopsias de trabajo. Marcador lambda 
500 ng/µL. 
 
A su vez, para una posterior digestión de prueba, se realizó la extracción de ADN 
genómico de un grupo de bacterias individuales: S. aureus, E. cloacae, P. aeruginosa, E. 
coli, P. vulgaris. Para la extracción se utilizó el protocolo CTAB + Wizard con 
pretratamiento con Proteinasa K, a 55°C por 12 horas (figura 9). 
 
Figura 9. Electroforesis de ADN genómico de bacterias. Gel de agarosa al 1%, 100 V 
por 1 hora. Carril 1: S. aureus. Carril 2: E. cloacae. Carril 3: P. aeruginosa. Carril 4: E. 
coli. Carril 5: P. vulgaris. Marcador lambda 500 ng/µL 
 
 
6.4 Amplificación del gen 16S ARNr 
Utilizando los iniciadores universales 41F y 1389R, se amplificó un fragmento de 
aproximadamente 1492 pares de bases correspondientes al gen 16S ARNr a partir de 
47 
 
muestras de ADN metagenómico. El producto de la amplificación se observa en la figura 
10, en un gel de agarosa al 1.5 % 
 
Figura 10. Electroforesis del producto de PCR del gen 16S de ARNr. Carril 1: 
mezcla de bacterias. Marcador DNA 100 pb LMC. Gel de agarosa al 1.5%, 90 Voltios 
por 1 hora. 
 
Se realizó una PCR para el 16S ARNr del ADN genómico proveniente de las bacterias S. 
aureus, E. cloacae, P. aeruginosa, E. coli, P. vulgaris, obteniéndose el amplicon de 
1492 pares de bases correspondientes al gen 16S ARNr (figura 11). 
 
Figura 11. Electroforesis de los productos de PCR del gen 16S de ARNr a partir de 
ADN metagenómico. Carril 1: S. aureus, carril 2: E. cloacae, carril 3: P. aeruginosa, 
carril 4: E. coli, carril 5: P. vulgaris. Marcador Promega 100 pb DNA Ladder Molecular 
Weight. Gel de agarosa al 1.5%, 90 Voltios por 1 hora. 
 
Con la utilización de los iniciadores descritos se amplificó el gen 16S de ARNr del ADN 
genómico extraído de la muestra única de biopsias Meggit-Wagner grado III, 
obteniéndose el amplicon correspondiente de 1492 pares de bases (figura 12). 
1500 pb 
1000 
 
500 
- 1030 pb 
 
48 
 
 
Figura 12. Electroforesis de los productos obtenidos de la amplificación del gen 16S 
de ARNr. Carril 1: muestra de biopsias grado III de Meggit-Wagner. Marcador DNA 
100 pb LMC. Gel de agarosa al 1.5%, 90 Voltios por 1 hora. 
 
 
6.5 Clonación – Transformación 
Para la clonación se utilizaron los vectores pCR II® 2.1 -TOPO® y StrataClone PCR 
Cloning Kit y se transformaron células de E. coli DH5α de acuerdo a las instrucciones 
del proveedor. 
En el ensayo 4, se obtuvo el producto de PCR 16S ARNr de la muestra compuesta 
obtenida de las biopsias, este inserto se ligó en los vectores pCR II® 2.1 -TOPO® y con 
estos y el vector intacto Pet28 (10 ng) se transformaron células de E. coli DH5α 
preparadas en el laboratorio. Como resultados se obtuvieron 120 colonias blancas de la 
transformación con el vector TOPO, las cuales tuvieron crecimiento en caldo LB con 
kanamicina. De estas 120 colonias se obtuvo la extracción de ADN por lisado de las 
colonias, posteriormente se realizó PCR M13 de las colonias, de las cuales se obtuvieron 
3 clonas positivas en las que se observó en gel de agarosa al 1.5% la amplificación del 
fragmento de 1400 pares de bases (figura 13). 
 
 
 
 
Figura 13. Electroforesis de la amplificación del fragmento M13. Marcador DNA 
100 pb Promega. Gel de agarosa al 1.5%, 90 Voltios por 1 hora. 
- 1030 pb 
 
49 
 
En el cuadro 13 se muestra en resumen los ensayos realizados para la metodología de 
ligación-transformación. 
 
Cuadro 13. Resumen de los ensayos de clonación 
Ensayo Vector Células Resultado 
1 TOPO E. coli DH5α No se obtuvo el inserto 
2 Pet28 E. coli DH5α No se obtuvo el inserto 
3 TOPO y Pet28 E. coli DH5α No se obtuvo el inserto 
4 TOPO y Pet28 E. coli DH5α 3 clonas con inserto con vector TOPO 
5 TOPO y Pet28 E. coli DH5α No se obtuvo el inserto 
6 StrataClone E. coli DH5α No se obtuvo el inserto 
 
 
6.6 ARDRA – RFLP 
Para el análisis de los perfiles de ARDRA, se realizó un análisis de digestión in silico 
mediante el programa NEBcutter V2.0 (http://nc2.neb.com/NEBcutter2/), se utilizaron 
cinco bacterias encontradas comúnmente en los cultivos microbiológicos de pie 
diabético, las bacterias empleadas fueron: E. cloacae, E. coli, P. aeruginosa, P. mirabilis 
y S. aureus, cuyas secuencias de referencia del Genbank se muestran en el cuadro 9. La 
enzima utilizada fue HaeIII, mostrándose los siguientes patrones de digestión (figura 
14): 
 
Figura 14: Representación de los perfiles de digestión in silico con la enzima 
HaeIII. Carril 1: E. cloacae, carril 2: E. coli, carril 3: P. aeruginosa, carril 4: P. vulgaris 
y carril 5: S. aureus Gel de agarosa al 2.5 %, con un marcador de 100 pares de bases. 
 
http://nc2.neb.com/NEBcutter2/
50 
 
Posteriormente a las 3 clonas positivas se les realizo digestión con la enzima HaeIII, de 
acuerdo con el protocolo descrito anteriormente, obteniéndose los siguientes patrones de 
bandeo (figura 15): 
 
 
 
 
Figura 15. Perfiles RFLP de las clonas positivas. Carril M: marcador VC 100 pb Plus 
DNA Ladder. Carriles 1: clona 1; carril 2: clona 3; carril 3: clona 9. Gel de agarosa al 2.5 
%. 
 
En la figura se aprecian diferentes patrones de bandeo generados por cada fragmento, lo 
cual establece que en cada una de estas colonias se encuentra un ADN diferente y por 
medio de secuenciación se puede conocer a que bacteria pertenece. Sin embargo, dado la 
poca cantidad de clonas positivas y del tiempo de terminación de este proyecto, estas tres 
clonas no se secuenciaron y se optó por una segunda estrategia para este estudio que se 
describe a continuación. 
 
6.7 Estrategia alternativa 
Dado a que no se obtuvo de la manera esperada la biblioteca de clonas, se optó por 
realizar una segunda metodología basándose en la Reacción en Cadena de la Polimerasa 
de punto final, para la detección de las bacterias más comúnmente reportadas en la 
literatura para el pie diabético, complementado por un análisis adicional, basado en la 
restricción de el gen 16S de ARN ribosomal de las biopsias de trabajo, para de esta 
manera analizar los diferentes patrones de digestión producidos por las enzimas que se 
seleccionaron. 
Las bacterias seleccionadas para ser identificadas por PCR con iniciadores específicos 
fueron: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Enteroccoccus sp, Escherichia 
 M 1 3 9 
3000 pb 
2500 pb 
51 
 
coli, Serratia marcescens, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Pseudomonas 
sp, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp, Enterobacter cloacae, Proteus 
mirabilis, Prevotella intermedia, Bacteriodes fragilis, Clostridium perfringes y 
Finegoldia magna. 
 
6.8 Extracción de ADN total de las biopsias de pie diabético 
Se extrajo de manera individual el ADN de las 10 biopsias mediante el protocolo CTAB 
+ Wizard con pretratamiento con Proteinasa K, a 55°C por 12 horas. La extracción del 
ADN se comprobó mediante una electroforesis en gel de agarosa al 1% (TBE 1X) con 
un voltaje de 100 voltios durante 60 minutos. En el siguiente gel de la figura 16 se puede 
observar la extracción de ADN genómico de las biopsias de trabajo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 16. Electroforesis del ADN de las biopsias de trabajo. Gel de agarosa al 1%, 
100 V por 1 hora. Marcadorlambda 500 ng/µL. 
 
 
6.9 PCR y perfiles de RFLP para las bacterias seleccionadas 
Se seleccionaron un grupo de 16 bacterias, las más comúnmente encontradas en el pie 
diabético de acuerdo a la literatura. Se realizó PCR con los iniciadores correspondientes 
de estas 16 bacterias, a cada una de las biopsias. 
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 
52 
 
Se realizaron las PCRs de acuerdo a las condiciones de reacción y amplificación 
establecidas en el apartado de materiales y métodos. A continuación, en el cuadro 14 se 
muestra las bacterias positivas por PCR en cada una de las biopsias. 
 
Cuadro 14. Biopsias positivas para las bacterias amplificadas 
 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 
S. aureus + + + 
Enterococcus sp + + + + 
E. faecalis + + + + 
S. pyogenes + 
E. coli + + + + + + + + 
S. marcescens + 
Pseudomonas sp + 
Acinetobacter sp + 
F. magna + + + 
B. fragilis 
P. aeruginosa 
E. faecium 
C. perfringes 
P. mirabilis 
P. intermedia 
E. cloacae 
 
La amplificación del fragmento esperado se comprobó mediante un gel de agarosa al 
1.5%, en TBE al 1X, a un voltaje de 90 voltios durante 45 minutos. Se colocó en el gel 
10 µL del producto de PCR más 3 µL de SYBR Green, se utilizó el marcador Novagen 
de 100 pares de bases. A continuación, se muestran las electroforesis en gel de agarosa al 
1.5% de cada muestra de pie diabético, se representa solo los amplicones positivos para 
las bacterias amplificadas. Primeramente, en la electroforesis de la figura 17, muestra los 
productos de PCR positivos para E. coli mdh y E. faecalis en la muestra M1. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
53 
 
1 2 3 4 5 
1 2 3 4 5 6 7 
 
 
 
 
 
 
Figura 17. Electroforesis de la muestra M1. Carril 1: marcador Novagen de 100 pares 
de bases; carril 2: control negativo E. coli; carril 3: control negativo E. faecalis; carril 4: 
E. coli mdh; carril 5: E. faecalis. 
 
A continuación, se muestra la figura 18, la cual muestra amplicones positivos para E. 
coli, S. pyogenes y F. magna para la muestra M2. 
 
 
 
 
 
 
Figura 18. Electroforesis de la muestra M2. Carril 1: marcador Novagen de 100 pb; 
carril 2: E. coli mdh; carril 3: S. pyogenes; carril 4: control negativo E. coli; carril 5: 
control negativo S. pyogenes; carril 6: control negativo F. magna; carril 7: F. magna. 
 
En la figura 19 se pueden observar los productos de PCR identificados como S. aureus, 
Pseudomonas sp., E. faecalis en la muestra M3. 
 
 
 
54 
 
1 2 3 4 5 6 7 
1 2 3 4 5 6 7 
 
 
 
 
 
Figura 19. Electroforesis de la muestra M3. Carril 1: marcador Novagen de 100 pb; 
carril 2: control negativo S. aureus; carril 3: S. aureus; carril 4: Pseudomonas sp.; carril 
5: E. faecalis; carril 6: control negativo Pseudomonas sp.; carril 7: control negativo E. 
faecalis. 
 
En la figura 20 se aprecia el gel de electroforesis de la muestra M4, la cual fue positiva 
para E. coli, S. aureus y E. faecalis. 
 
 
Figura 20. Electroforesis de la muestra M4. Carril 1: control negativo S. aureus; 2: S. 
aureus; 3; control negativo E. faecalis; 4: E. faecalis; 5: E. coli mdh; 6: control negativo 
E. coli; 7: marcador Novagen de 100 pb. 
 
La figura 21 muestra mediante un gel de agarosa, los productos de PCR de la muestra 
M5 que dieron positivo para Acinetobacter sp., E. coli y F. magna. 
 
 
 
 
55 
 
 1 2 3 4 5 6 7 
1 2 3 4 5 6 7 
7 
1 2 3 4 5 6 7 8 9 
 
 
 
 
 
 
Figura 21. Electroforesis de la muestra M5. Carril 1: marcador Novagen de 100 pares 
de bases; 2: Acinetobacter sp.; 3. E. coli mdh; 4: control positivo E. coli; 5: control 
negativo Acinetobacter sp.; 6: F. magna; 7: control negativo F. magna. 
 
La figura 22 muestra amplicones positivos para Enterococcus sp., E. coli y E. faecalis 
para la muestra M6. 
 
 
 
 
 
Figura 22. Electroforesis de la muestra M6. Carril 1: marcador Novagen 100 pb; 2: 
Enterococcus sp; 3: control negativo Enterococcus sp; 4: control negativo E. faecalis; 5: 
control negativo E. coli; 6: E. coli mdh; 7: E. faecalis. 
En la figura 23 se muestran amplicones positivos para E. coli, Enterococcus sp. y S. 
marcescens para la muestra M7. 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 23. Electroforesis de la muestra M7. Carril 1: Marcador Novagen 100 pb; 2 y 
3: Control negativo E. coli; 4: E. coli mdh; 5: Control negativo Enterococcus sp; 6: 
Enterococcus sp; 7: Control negativo S. marcescens; 8: S. marcescens; 9: control 
positivo Enterococcus sp. 
 
56 
 
1 2 3 4 5 6 
1 2 3 4 5 6 
El siguiente gel de electroforesis de la figura 24 para la muestra M8, identifica productos 
de PCR positivos para E. coli y F. magna. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 24. Electroforesis de la muestra M8. Carril 1: marcador Novagen 100 pb; 2: E. 
coli mdh; 3: E. coli; 4: control negativo E. coli; 5: F. magna; 6: control negativo F. 
magna. 
 
 
En la siguiente figura (figura 25), se muestran los amplicones positivos para 
Enterococcus sp. y S. aureus para la muestra M9. 
 
 
Figura 25. Electroforesis de la muestra M9. Carril 1: marcador Novagen 100 pb; carril 
3: control negativo Enterococcus sp; carril 4: Enterococcus sp; cariil 5: control negativo 
S. aureus; carril 6: S. aureus. 
 
 
La electroforesis de la figura 26 muestra productos de PCR positivos para Enterococcus 
sp. y E. coli en la muestra M10. 
 
57 
 
1 2 3 4 5 6 
7 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 26. Electroforesis de la muestra M10. Carril 1: marcador Novagen 100 pb; 2: 
control negativo Enterococcus sp; 3: control negativo E. coli; 4: Enterococcus sp; 5: 
control negativo; 6: E. coli mdh; 7: control positivo E. coli mdh. 
 
La digestión in silico de las bacterias detectadas por PCR permitió ver los diferentes 
patrones que se podían obtener para diferenciar estas bacterias. En la figura 27 se 
muestran los diferentes patrones de RFLP obtenidos in silico por el programa en línea 
NEBcutter V2.0. 
 
Figura 27. Representación de los perfiles de digestión con la enzima HaeIII y 
HindIII mediante el programa NEBcutter V2.0. SA= S. aureus; Esp= Enterococcus 
sp; EC= E. coli; SM= S. marcescens; EF= E. faecalis; Psp= Pseudomonas sp; SP= S. 
pyogenes; FM= F. magna; Asp= Acinetobacter sp. 
 
A través de RFLP se corroboró a las bacterias detectadas por PCR de acuerdo a los 
patrones de digestión originados por las enzimas HaeIII y HindIII. Al ADN de las 
muestras se les realizó una PCR para el gen 16S con los iniciadores 47F y 1389R, 
obteniéndose el producto de amplificación esperado de 1450 pares de bases, visualizado 
en un gel de agarosa al 1.5 % en TBE 1X (100 voltios por 45 minutos). Después de esto, 
58 
 
1 2 3 4 5 6 
7 
7 
se realizó la digestión de acuerdo al protocolo descrito, en las muestras M4, M6 y M9 se 
utilizó la enzima HindIII, por su parte la enzima HaeIII se utilizó en las muestras M1, 
M2, M3, M5, M7, M8 y M10 
Los patrones de digestión de la muestra M4 denotó patrones de corte de 800, 400 y 150 
pb correspondientes a S. aureus, así como bandeos a aproximadamente 300 y 200 pb que 
se identificaron como el patrón de digestión de E. coli, y patrones de digestión de E. 
faecalis de 310 y 100 pares de bases. La

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