Descarga la aplicación para disfrutar aún más
Vista previa del material en texto
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA ANÁLISIS MOLECULAR DE LA DIVERSIDAD BACTERIANA EN ÚLCERAS DE PIE DIABÉTICO TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGIA GENÓMICA PRESENTA Q.F.B CYNTHIA MARTINA MORALES REYES REYNOSA, TAMPS DICIEMBRE, 2016 2 INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA ANÁLISIS MOLECULAR DE LA DIVERSIDAD BACTERIANA EN ÚLCERAS DE PIE DIABÉTICO TESIS QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOTECNOLOGÍA GENÓMICA PRESENTA CYNTHIA MARTINA MORALES REYES REYNOSA, TAMAULIPAS DICIEMBRE 2016 3 4 5 ÍNDICE Sección Página AGRADECIMIENTOS. . . . . . . .7 DEDICATORIAS. . . . . . . . .8 ABREVIATURAS . . . . . . . . .9 LISTA DE CUADROS. . . . . . . . .11 LISTA DE FIGURAS. . . . . . . . .12 RESUMEN . . . . . . . . . .13 ABSTRAC. . . . . . . . . . .14 1. ANTECEDENTES. . . . . . . . .15 1.1 Definición del pie diabético. . . . . . .15 1.2 Importancia del pie diabético. . . . . . .15 1.3 Fisiopatología del pie diabético. . . . . .16 1.4 Clasificación del pie diabético. . . . . . .17 1.5 Infección en el pie diabético. . . . . . .18 1.6 Análisis de la diversidad bacteriana en úlceras de pie diabético. .21 2. JUSTIFICACIÓN. . . . . . . . . 27 3. HIPOTESIS. . . . . . . . . . 28 4. OBJETIVOS. . . . . . . . . 28 4.1 General. . . . . . . . . . 28 4.2 Específicos. . . . . . . . . 28 5. Materiales y métodos. . . . . . . . 30 5.1 Muestras biológicas. . . . . . . . 30 5.2 Extracción de ADN genómico. . . . . . . 31 5.3 Electroforesis en gel de agarosa. . . . . . . 32 5.4 Amplificación de la región 16S de ARN ribosomal. . . . 32 5.5 Creación de una biblioteca de clonas. . . . . . 33 5.6 Análisis de restricción de las clonas. . . . . . 34 5.7 Determinación de la diversidad mediante PCR de punto final y análisis de restricción del gen 16S de ARN ribosomal. . . . . 35 5.8 Extracción de ADN total de las biopsias. . . . . 35 5.9 PCR de punto final para la identificación de bacterias en pie diabético.35 5.10 Electroforesis en gel de agarosa de los productos de PCR. . 37 6 5.11 Análisis de restricción del ARN 16S ribosomal presente en las biopsias seleccionadas. . . . . . . . . 37 5.12 Análisis de restricción in silico de las biopsias seleccionadas. . 38 5.13 Análisis de restricción in vitro de las biopsias seleccionadas. . 39 6. RESULTADOS. . . . . . . . . 41 6.1 Obtención y caracterización de las biopsias. . . . . 41 6.2 Resultados del cultivo microbiológico. . . . . . 42 6.3 Extracción de ADN genómico de cepas controles y biopsias. . . 43 6.4 Amplificación de la región 16S ARNr. . . . . . 45 6.5 Clonación – Transformación. . . . . . . 47 6.6 ARDRA – RFLP. . . . . . . . 48 6.7 Estrategia alternativa. . . . . . . . 49 6.8 Extracción de ADN total de las biopsias de pie diabético. . . 50 6.9 PCR y perfiles de RFLP para las bacterias seleccionadas. . . 50 6.10 Comparación de resultados . . . . . . 59 7. DISCUSIÓN. . . . . . . . .61 8. CONCLUSIONES. . . . . . . . .68 9. RECOMENDACIONES. . . . . . . .69 10. BIBLIOGRAFIA. . . . . . . . .70 7 AGRADECIMIENTOS A CONACYT por otorgarme la beca para realizar ésta maestría. Al IPN por la beca BEIFI durante estos estudios. Al Dr. Virgilio Bocanegra García por su confianza y ejemplo. A mis tutores, por sus valiosas correcciones y enseñanzas. Al laboratorio de Medicina de Conservación, por su compañerismo y amistad. Al Dr. Bladinieres, porque sin su aporte no hubiera sido posible este trabajo. A la Q.F.B Krystal Lira por su ayuda en este proyecto y por su amistad. Al M. en C. Mario Sánchez por el apoyo en este trabajo A todo el Centro de Biotecnología Genómica por hacerme sentir como en casa. A mis amigas Viridiana, Roció y Leyda, porque gracias a ellas hasta los días difíciles fueron agradables. A Dios por su infinito amor. A mi familia y esposo, por su amor y apoyo incondicional. 8 DEDICATORIAS A mi familia y esposo, sin ellos no sería quien ahora soy. A todas aquellas personas que están incondicionalmente en mi vida, en especial a mi amiga Roció Requena. Dedico este trabajo a todos los maestros que han estado en mi camino de aprendizaje. 9 ABREVIATURAS % Porciento °C Grados centígrados µL Microlitros DNA Ácido desoxirribonucleico Pb Pares de bases mM Milimolar ng Nanogramos µM Micromolar U Unidades DM Diabetes mellitus OMS Organización Mundial de la Salud ARN Ácido ribonucleico ADN Ácido desoxirribonucleico ARDRA Análisis de restricción de ARN ribosomal amplificado RFLP Polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción PCR Reacción en cadena de la polimerasa mg Miligramos NaCl Cloruro de sodio rpm Revoluciones por minuto OMS Organización Mundial de la Salud IWGDF International Working Group on the Diabetic Foot IDSA Infectious Diseases Society of America pPCR Producto de PCR NCBI National Center for Biotechnology Information DGGE Electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización ARNr ARN ribosómico 10 TBE Tris/Borato/EDTA SDS Dodecilsulfato sódico CTAB Bromuro de hexadeciltrimetilamonio MgCl2 Cloruro de magnesio DNTPs Desoxirribonucleótidos trifosfato Min Minutos V Voltios Vol Volumen LB Luria Bertani 11 LISTA DE CUADROS PÁGINA 1. Clasificación del pie diabético por grados Meggit-Wagner. 18 2. Bacterias presentes en la infección de úlcera de pie diabético 19 3. Comparación de las bacterias detectadas por cultivo y secuenciación del gen 16S ARNr 26 4. Condiciones de PCR 16S iniciadores 41F-1389R 32 5. Condiciones de la PCR con los iniciadores M13 34 6. Protocolo de restricción para el análisis de clonas 34 7. Iniciadores para la PCR empleados para cada una de las muestras de pie diabético 36 8. Condiciones de PCR 16S iniciadores 41F-1389R 38 9. Secuencias de referencia del Genbank 39 10. Protocolo de restricción para las enzimas HaeIII y HindIII 39 11. Características del material biológico empleado 12. Resultados del cultivo microbiológico 42 43 13. Resumen de los ensayos de clonación 48 14. Biopsias positivas para las bacterias amplificadas 51 15. Resultados obtenidos en el proyecto 58 16. Diversidad bacteriana detectada por cultivo, PCR y RFLP 16S en biopsias de pie diabético 60 12 LISTA DE FIGURAS PÁGINA 1. Diagrama general de la evolución del trabajo 30 2. Diagrama general de la nueva metodología 35 3. Características de los pacientes participantes de este estudio 4. Características de las biopsias analizadas. 5. Electroforesis del ADN genómico de combinación de bacterias. 41 42 44 6. Electroforesis de ADN genómico de tejidomuscular bovino. 7. Electroforesis de ADN genómico de una biopsia de pie diabético. 8. Electroforesis de ADN genómico de la combinación de biopsia de trabajo 9. Electroforesis de ADN genómico de bacterias. 10. Electroforesis del producto de PCR del gen 16S de ARNr. 11. Electroforesis de los productos de PCR del gen 16S de ARNr a partir de ADN metagenómico. 12. Electroforesis de los productos obtenidos de la amplificación del gen 16S de ARNr. 13. Electroforesis de la amplificación del fragmento M13. 14. Representación de los perfiles de digestión in silico con la enzima HaeIII. 15. Perfiles RFLP de las clonas positivas. 16. Electroforesis del ADN de las biopsias de trabajo 17. Electroforesis de la muestra M1 18. Electroforesis de la muestra M2 19. Electroforesis de la muestra M3 20. Electroforesis de la muestra M4 21. Electroforesis de la muestra M5 22. Electroforesis de la muestra M6 23. Electroforesis de la muestra M7 24. Electroforesis de la muestra M8 25. Electroforesis de la muestra M9 26. Electroforesis de la muestra M10 27. Representación de los perfiles de digestión con la enzima HaeIII y HindIII mediante el programa NEBcutter V2.0. 28. Electroforesis de los patrones de digestión de las muestras M4, M7, M3 y M1. 29. Electroforesis de los patrones de digestión de las muestras M6 y M10. 30. Electroforesis de los patrones de digestión de las muestras M8, M5, M9, M2. 44 44 45 45 46 46 47 47 48 49 50 52 52 53 53 54 54 54 55 55 56 56 57 58 58 13 RESUMEN La diabetes mellitus es una enfermedad asociada a un conjunto de trastornos metabólicos caracterizados por una hiperglucemia crónica, que en los últimos años ha presentado un notable incremento, teniendo una cifra en el 2015 de 415 millones de diabéticos a nivel mundial. La DM presenta diversas complicaciones y entre las más comunes e incapacitantes se encuentra el pie diabético, de la cual, tan solo en el año 2012, se reportó que 3 millones de mexicanos presentaron algún síntoma de pie diabético, de los cuales 128 mil sufrieron una amputación. La identificación de los patógenos más prevalentes en la infección de pie diabético es fundamental para la administración de la terapia antibiótica adecuada y prevenir amputaciones. En este trabajo se buscó la identificación de las bacterias presentes en una mezcla de 10 biopsias de pie diabético mediante técnicas moleculares y su comparación con los resultados obtenidos por cultivo tradicional, obteniéndose la identificación de bacterias Gram positivas, Gram negativas y anaerobios estrictos en las muestras analizadas. La metodología empleada consistió en la amplificación del gen 16S ribosomal para su clonación, RFLP del gen 16S y PCR punto final género o especie específica. La diversidad detectada por la técnica PCR fue mayor que la detectada por método de cultivo. Mediante RFLP al gen 16S de ARNr se observaron los fragmentos de digestión correspondientes a las bacterias identificadas por PCR y además de otros patrones que pudieran corresponder a otra bacteria. Se detectaron por PCR un máximo de 3 bacterias por muestra analizada, además se encontraron 4 patrones de RFLP que no correspondían a ninguna de las bacterias detectadas. En total se detectaron 25 bacterias por métodos moleculares, en comparación con un total de 11 bacterias detectadas por cultivo. De este modo se demuestra que, la metodología por cultivo solo refleja el crecimiento de la bacteria más predominante, pero no refleja el total de microorganismos presentes, comprobándose así que la metodología molecular es la opción más adecuada para la identificación de la diversidad bacteriana de ulceras de pie diabético. 14 ABSTRACT Diabetes mellitus is a disease associated with a set of metabolic disorders characterized by chronic hyperglycemia, which in recent years has presented a remarkable prevalence increase, with 415 million diabetic patients worldwide in 2015. Being a complex disease, it presents several complications and among the most common and incapacitating is the diabetic foot, that just only in 2012, it was reported that 3 million Mexicans had any symptoms related to diabetic foot, of which 128 thousand suffered an amputation. Amputation is one of the most serious outcomes of diabetic foot and occurs because there is a limited understanding of the nature of these infections. The identification of the most prevalent pathogens in diabetic foot infection is essential for the administration of adequate antibiotic therapy and to prevent amputations. The aim of this work was to identify the bacteria present in 10 diabetic foot biopsies by molecular techniques and their comparison with the results obtained by traditional culture, obtaining the identification of Gram positive bacteria, Gram negative bacteria and strict anaerobes in the analyzed samples. The methodology used consisted of amplification of the 16S ribosomal gene and cloning, RFLP of the 16S gene and endpoint PCR. The diversity detected by the PCR technique was greater than that detected by culture method. Through RFLP to the 16S rRNA gene the digestion fragments of the bacteria identified by PCR and in addition to other patterns that could correspond to another bacterium were observed. A maximum of 3 bacteria per sample was detected by PCR, in addition 4 patterns of RFLP were found that did not correspond to any of the bacteria detected. In total, 25 bacteria were detected by molecular methods, compared to a total of 11 bacteria detected per culture. In this way, it is demonstrated that, the methodology by microbiological cultures only reflects the growth of the most predominant bacterium, proving that molecular methodology is the most adequate option for the identification of bacterial diversity of Diabetic foot ulcers. 15 1. ANTECEDENTES La diabetes mellitus (DM) es un conjunto de trastornos metabólicos caracterizados por una hiperglucemia crónica. De acuerdo a la causa de la hiperglucemia, la diabetes se divide en, diabetes mellitus tipo I cuando no se producen las cantidades normales de insulina o la diabetes tipo II cuando el organismo no utiliza correctamente la insulina que se produce.1 La diabetes se considera una enfermedad crónica, no transmisible de origen multifactorial. En los últimos años se presentó un notable incremento de la DM, de acuerdo a la International Diabetes Federation, en el 2015 existían en el mundo 415 millones de personas con diabetes y, se calcula que para el 2040 la cifra se incremente a 642 millones.2 México ocupa el noveno lugar en diabetes mellitus a nivel mundial, en este país 13 de cada 100 muertes son causadas por esta enfermedad, debido a que existen más de 10 millones de diabéticos con una prevalencia de 10.7% en personas de 20 a 69 años.3, 4 El aumento mundial en la prevalencia de la DM causa un inevitable crecimiento en la presentación de sus complicaciones. Entre las complicaciones más comunes se encuentran las cardiopatías, las neuropatías, las retinopatías y las lesiones crónicas que comprenden el cuadro clínico llamado pie diabético.5, 6 1.1 Definición del pie diabético La Organización Mundial de la Salud (OMS) define al píe diabético como “el pie de un paciente que tiene el riesgo potencial de consecuencias patológicas, que incluyen infección, ulceración y/o destrucción de tejidos profundos asociados a anormalidades neurológicas, varios niveles de enfermedad vascular y/o complicaciones metabólicas de la diabetes en las extremidades inferiores”.7 Diferentes autores definen el pie diabético cómo una herida crónica que tiene la incapacidad de sanar por sí misma, que engloba alteraciones circulatorias, neuropatía diabética, cierre retardado de heridas, infecciones, gangrena y la pérdida del miembro infectado.816 1.2 Importancia del pie diabético El pie diabético es una causa importante de morbilidad y mortalidad del paciente diabético, 15% de ellos lo padecen a lo largo de su vida y los pacientes mayores de 60 años tienen un riesgo mayor a padecer pie diabético.9, 10 De acuerdo diversos autores como Abdulrazak et al (2005), las infecciones en los pies son la principal causa de hospitalización de los pacientes con diabetes. Para los sistemas de salud a nivel mundial el pie diabético y en particular la amputación representa una gran carga económica, llevándose una parte importante de los recursos asignados al tratamiento de la DM. Cabe mencionar que el 85% de las amputaciones no traumáticas son consecuencia de una úlcera de pie diabético.11, 3 Tan solo en el año 2012, la Encuesta Nacional de Salud y Nutrición, reportó que el 47.6 % de pacientes con DM presentaron algún síntoma de pie diabético, esto es 3 millones de mexicanos, de los cuales 128 mil sufrieron una amputación. De acuerdo al Instituto Mexicano del Seguro Social, en el año 2013, Tamaulipas contaba con 132,251 individuos con diabetes, de los cuales 560 habían sufrido una amputación, contando con una edad promedio de 62.7 años.¡Error! Marcador no definido. La rehabilitación seguida después de una amputación por infección de pie diabético tiene altos costos económicos, sociales y emocionales. La sobrevivencia posterior a una amputación ocasionada por pie diabético a 3 años es de 50% y además después de una amputación la incidencia de una nueva amputación a los 2 y 5 años es del 50%.9 En los últimos años hubo un alza en los casos de pie diabético y de amputaciones, esto es debido al gran incremento del 9.2% en el número de casos de diabetes mellitus en la población mexicana.10 1.3 Fisiopatología del pie diabético La fisiopatología del pie diabético es muy compleja, su prevalencia y gravedad se deben, en gran parte, a los problemas fisiológicos del paciente y a los factores relacionados con los patógenos que pueden infectar el pie diabético (tales como virulencia, resistencia a antibióticos y carga microbiana). Por tanto, el inicio del pie diabético involucra múltiples 17 factores entre los que se encuentran una compleja interacción entre la poli-neuropatía distal, la anatomía anormal del pie (deformación), la inmunidad humoral alterada, la alteración en la respuesta inflamatoria, los cambios funcionales en la microcirculación y la enfermedad arterial periférica.12, 13 Debido a que se trata de una herida crónica, el pie diabético pasa por un proceso inflamatorio constante en el que los leucocitos polimorfonucleares además de jugar un papel importante en la defensa del hospedero, liberan enzimas citolíticas, radicales libres de oxígeno, mediadores inflamatorios y proteasas, los cuales ocasionan daño tisular adicional que favorece la infección.6, 14 1.4 Clasificación Meggit-Wagner del pie diabético Dentro de las clasificaciones del pie diabético, una de las más empleadas es la del modelo de Meggit-Wagner, el cual incluye seis grados de severidad, dependiendo del tamaño y profundidad de la herida, pero a partir del grado tres se considera una infección. Por su parte el Diabetes Foot Group de la Universidad de Texas proponen un esquema derivado del anterior y, en este, la infección se incluye como un modificador de co-morbilidad, pero no se especifica la severidad de la infección. El International Working Group on the Diabetic Foot (IWGDF) y la Infectious Diseases Society of America (IDSA), propusieron clasificaciones basadas en signos y síntomas clínicos.15 El sistema de clasificación de Meggit-Wagner es el sistema de estadios de lesiones de pie diabético más conocidoque se correlaciona significativamente con el riesgo de amputación, de 6 grados, cada uno describe un tipo de lesión como se muestra en el cuadro 1.16 18 Cuadro 1. Clasificación del pie diabético por grados Meggit-Wagner. Clasificación de Meggit-Wagner Grado Lesión Características 0 Ninguna, pie en riesgo Callos gruesos, cabezas de metatarsianos prominentes, dedos en garra, deformidades óseas. I Úlcera superficial Destrucción del espesor total de la piel. II Úlcera profunda Penetra la piel grasa, ligamentos, pero sin afectar hueso. Úlcera infectada. III Úlcera profunda más absceso (osteomielitis) Extensa y profunda, secreción, mal olor. IV Gangrena limitada Necrosis de una parte del pie o de los dedos, talón o planta. V Gangrena extensa Todo el pie afectado, efectos sistémicos. 1.5 Infección en el pie diabético El International Working Group of the Diabetic Foot (IWGDF) define a la infección como la invasión y multiplicación de microorganismos patógenos dentro de los tejidos corporales. La infección de pie diabético se define además como la presencia de al menos dos signos o síntomas inflamatorios, que pueden sereritema, dolor, hinchazón, temperatura o induración.16 La infección de pie diabético es seguida, a menudo, de amputación debido a que hay muy poca comprensión de la naturaleza de estas infecciones. Las infecciones de pie diabético ocurren de manera general en un sitio de trauma o ulceración de la piel y los microorganismos pueden propagarse de forma continua a los tejidos subcutáneos que incluyen la fascia, los tendones, los músculos, las articulaciones y los huesos. Este crecimiento excesivo de microorganismos dentro de la herida promueve la inflamación perjudicial y la destrucción del tejido. Un agravante de la infección es la neuropatía periférica, la cual causa que los síntomas de la infección estén disminuidos.17, 12 Las infecciones del pie diabético son la mayoría de las veces poli-microbianas y, entre los organismos frecuentemente aislados se encuentran Staphylococcus aureus, estreptococos beta hemolíticos, enterococos algunos organismos Gram negativos 19 entéricos. En los pacientes con heridas crónicas o que han sido recientemente tratados con terapia antibiótica, la diversidad de patógenos se reporta como más compleja incluyendo anaerobios estrictos. Las infecciones más profundas (tejido subcutáneo o músculo) y con peligro para la extremidad son poli-microbianas con participación de bacterias Gram positivas, enterobacterias y anaerobios, los cuales provocan la aparición de necrosis tisular. Además, la disminución de la reacción inmunológica en los tejidos necrosados permite la colonización e infección de microorganismos de virulencia menor como estafilococos coagulasa negativos.11, 12, 9 La presencia de una mezcla de diferentes bacterias provoca una mayor producción de factores de virulencia, tales como hemolisinas, proteasas y colagenasas, los cuales causan inflamación, impiden la cicatrización de heridas y contribuyen la cronicidad de la infección. Además, esta relación simbiótica ha demostrado que los anaerobios obligados pueden hacer frente a los efectos tóxicos del oxígeno mediante la interacción con las poblaciones de bacterias aerobias o facultativas de manera simbiótica como parte de una co-agregación. Como ejemplo de esto, se ha descrito el hecho de que, las especies aerobias consumen el oxígeno y crean nichos que permiten el crecimiento de las bacterias anaerobias obligadas.12, 17 En el cuadro 2 se muestran las bacterias reportadas en úlceras de pie diabético infectado. Cuadro 2. Bacterias presentes en la infección de úlcera de pie diabético. Autor y año Bacterias reportadas Aerobios Anaerobios facultativos Anaerobios estrictos Down , et al, 200818 Acinetobacter spp. Stenotrophomonas spp. Gordonia spp. Delftia spp. Gemella spp. Bacillus spp Hydrogenophaga spp. Alcaligenes faecalis Sphingomonas spp. Acidovorax spp. Brevibacterium spp. Riemella spp. Bradyrhizobium Staphylococcus spp. Rhodopseudomonas spp. Enterococcus spp. Haemophilus spp. Morganellaspp. Serratia spp. Proteus spp. Streptococcus spp. Klebsiella spp. Actinomyces spp. Corynebacterium spp. Salmonella enterica Enterobacter spp. Eikenella spp. Escherichia coli Peptoniphilus spp. Veillonella spp. Clostridium spp. Finegoldia magna Dialister spp. Peptococcus niger Fusobacterium spp. Varibaculum cambriense Anaerococcus spp. Prevotella spp. Eubacterium spp. Bacteroides spp. Selenomonadaceae spp. 20 Pantoea agglomerans Dowd, et al, 200817 Pseudomonas spp Brevibacterium spp. Arthrobacter spp. Bacillus spp. Citrobacter spp. Aerosphaera spp. Brevundimonas Corynebacterium spp. Streptococcus spp. Serratia spp. Staphylococcus spp. Enterococcus spp. Actinomyces spp. Helcococcus spp. Salmonella spp. Rothia spp. Proteus spp. Granulicatella spp. Aerococcus Bacteroides spp. Peptoniphilus spp. Finegoldia spp. Anaerococcus spp. Prevotella spp. Peptostreptococcus spp. Porphyromonas spp. Clostridium spp. Varibaculum spp. Fusobacterium spp. Anaerobiospirillum spp. Actinobaculum spp. Dermabacter spp. Veillonella spp. Tissierella spp. Propionibacterium spp. Peptococcus spp. Oates, et al, 201219 Micrococcus yunnanensis Stenotrophomonas spp. Sphingomonas sp. Bacillus pumilus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus simulans Staphylococcus spp. Enterococcus faecalis Streptococcus spp. Streptococcus dysgalactiae Klebsiella spp. Enterobacter spp. Prevotella bivia Bacteroides fragilis Clostridium spp. Gardner, et al, 201332 Staphylococcus spp. Streptococcus spp. Corynebacterium spp. Peptoniphilus spp. Porphyromonas spp. Anaerococcus spp. Finegoldia spp. Prevotella spp. Shilpa Durgad, et al, 2014 20 Pseudomonas aeruginosa Citrobacter Escherichia coli Klebsiella Pneumoniae Staphylococcus aureus Enterococcus Streptococcus Morganella Enterobacter Clostridium Peptostreptococcus Smith, et al, 2016 21 Alcaligenes faecalis Actinobaculum masiliense Actinobaculum schaalii Actinomyces europaeus Actinomyces hominis Actinomyces neuii Actinomyces radingae Corynebacterium accolens Anaerococcus murdoch Anaerococcus tetradius Anaerococcus vaginalis Bacteriodes fragilis Bilophila wadsworthia Bulleidia extructa Campylobacter ureolyticus Clostridium saccharogumia Van Asten, et al, 2016 22 Pseudomonas Staphylococcus spp. Corynebacterium spp. Streptococcus spp. Actinomyces Enterobacter Helcococcus Peptoniphilus spp. Finegoldia spp. Anaerococcus spp. Propionibacterium spp. Clostridium spp. Porphyromonas Prevotella 21 1.6 Análisis de la diversidad bacteriana en el pie diabético La identificación de los patógenos más prevalentes en la infección de pie diabético es fundamental para la administración de la terapia antibiótica adecuada y prevenir amputaciones.23 La toma de muestra de pie diabético con hisopo por su facilidad es de uso común, pero se considera un método limitado, ya que carece de especificidad y sensibilidad en comparación con las muestras de tejido como una biopsia. Es importante que cualquier muestra se tome después de una previa limpieza de la herida, para reducir la tasa de falsos positivos. Pellizzer, et al, (2001) determinaron que la biopsia de tejido era el mejor método para la evaluación microbiológica de la infección del pie diabético, en comparación con la muestra tomada por hisopo.24, 25 Los métodos de cultivo convencionales para evaluar la diversidad bacteriana de la úlcera de pie diabético dependen de la proliferación microbiana y su estado metabólico. De esta manera prospera aquella bacteria que sobrevive en el entorno típico tradicional y no necesariamente el más abundante en la ulceración de pie diabético.26 Los estudios realizados en México sobre la diversidad bacteriana del pie diabético son pocos, debido a que las investigaciones se centran en conocer que antibiótico es efectivo para el tratamiento. Ruiz, et al, (2007) de México, publicaron un estudio realizado en el Hospital Regional del ISSSTE de Zapopan, Jalisco. Investigaron la etiología bacteriana y la resistencia más frecuente en infecciones de pie diabético. Se trató de un estudio descriptivo, retrospectivo, transversal en pacientes diabéticos con lesiones del pie del periodo comprendido de marzo del 2004 hasta abril del 2007. Reportaron un total de 105 bacterias, 79 pacientes presentaban al menos una bacteria (75.2%); en 26 (24.7%) pacientes una segunda bacteria y no se reportó ningún caso con una tercera bacteria. La bacteria más frecuente fue S. aureus en 21 de los 71 pacientes (27.3%). 65 (61.9%) bacterias presentaron resistencia a más de dos familias de antibióticos con mecanismo de acción diferente. Finalmente, concluyeron que el agente causal principal de las infecciones del pie del diabético es S. aureus, en segundo lugar E. coli y en un tercer lugar S. epidermidis.4 22 El cultivo de anaerobios ha sido siempre un reto para los laboratorios de microbiología, debido a la dificultad de mantener una atmósfera anaerobia estricta de manera constante y el tratamiento adecuado en la toma y transporte de la muestra, por lo cual se subestiman muchos anaerobios obligados. Además de esto los resultados de un cultivo microbiológico están disponibles de 2 a 3 días después de tomada la muestra, por tanto, el médico no se espera al resultado y selecciona la terapia antibiótica empíricamente.24, 27 A pesar de la dificultad del cultivo de anaerobios, Abdulrazak, et al, (2005) de Kuwait, publicaron un estudio prospectivo de las heridas de pie diabético de 86 pacientes, a las que realizaron cultivo para bacterias aerobias y anaerobias. Reportaron S. aureus como el aislado más común, ya que se recuperó de un 38,4% de los casos. Otros organismos reportados fueron P. aeruginosa (17,5%) y P. mirabilis (18%) y otros organismos Gram- negativos anaerobios (10,5%), principalmente Bacteroides fragilis.11 Este estudio muestra como a pesar de la utilización de técnicas de cultivo para el desarrollo de bacterias anaerobias, S. aureus sigue siendo el aislado más común, sin embargo, se demuestra la presencia, aunque de baja prevalencia, de anaerobios como es el caso de B. fragilis Por su parte, Tiwari, et al, (2012) de la India, reportaron un estudio prospectivo realizado durante los años 2008-2009, en sesenta y dos pacientes con pie diabético, los cuales se sometieron historia clínica detallada, examen clínico, cultivo microbiano y estudio de sensibilidad antibiótica. Obtuvieron que, de los 62 casos, el 43,5% tenía infección mono-microbiana, 35.5% tenían infecciones poli-microbianas, y el 21% presentaban un cultivo sin crecimiento bacteriano. Entre las 82 bacterias aisladas reportaron Gram negativas en un 68% y 32% Gram positivas, reportando a E. coli como el aislado más común. El 21% de los pacientes a pesar de tener un cultivo sin crecimiento, presentaban signos de infección persistente, esto puede sugerir la presencia de bacterias anaerobias o no cultivables.28 Las herramientas de biología molecular son una buena opción para definir la diversidad microbiana del pie diabético, y en algunas aplicaciones estas técnicas resultan ser más sensibles que las técnicas de cultivo microbiano.25 Es por esto que recientes estudios 23 optan por confirmar los hallazgos microbiológicos por métodos moleculares, como es el caso de Roudbary, et al (2014) en Irán, los cuales publicaron un estudio en donde investigaron la incidencia de hongos y bacterias patógenas en infecciones del pie diabético. El estudio se llevó a cabo en un total de 57 pacientes diabéticos que presentaban una infección de pie diabético sin curación, los cuales fueron remitidos a una clínica diabética durante el periodo 2011 – 2012. Para la obtención de la muestrautilizaron hisopo estéril, tomando la muestra a profundidad. Las levaduras aisladas pertenecieron al género Candida, incluyendo las especies C. albicans en un 30%, C. parapsilosis en un 58% y C. glabrata en un 12%. En cuanto a las bacterias aisladas predominaron los bacilos Gram negativos E. coli y P. aeruginosa, además de que S. aureus fue aislado en el 20.8% de las muestras. Otras bacterias Gram positivas detectadas fueron estreptococos (4%) y Enterococcus faecalis (2%).29 Las herramientas genómicas tales como la amplificación de ácidos nucleicos, la secuenciación de ADN y el desarrollo de bibliotecas de gen 16S ribosomal, son prometedoras para la identificación completa de la diversidad bacteriana de una úlcera de pie diabético.26 La definición del microbioma bacteriano se ha hecho posible gracias al descubrimiento de secuencias de ADN ribosomal 16S, conocido como marcador universal. Estas secuencias universalmente distribuidas en las especies bacterianas, se analizan para identificar especies bacterianas individuales. Las técnicas basadas en la genómica tienen la capacidad de superar los problemas presentes en el cultivo bacteriano. Por tanto, las tecnologías moleculares, sobre todo las relacionadas con las identificaciones por medio de la subunidad 16S ARN ribosomal, son una herramienta prometedora para comprender mejor la diversidad bacteriana de la úlcera de pie diabético.26 La determinación del perfil PCR-RFLP, también llamado estudio ARDRA (por sus siglas en inglés, Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis), del gen 16S rRNA consiste en una PCR combinada con la subsecuente digestión de sus productos utilizando enzimas de restricción, mediante este análisis de RFLP se evidencian los cambios genéticos entre especies, y de este modo identificar el microbioma bacteriano de una muestra compleja como lo son las biopsias de pie diabético. A continuación, se 24 muestran algunos trabajos que emplean el uso de técnicas moleculares para el estudio de la diversidad bacteriana en las infecciones de pie diabético: Downd, et al, (2008) de Estados Unidos, mediante el uso de pirosecuenciación evaluaron la diversidad bacteriana de 40 úlceras crónicas de pie diabético. Para la secuenciación del gen 16S ARNr se utilizaron los cebadores 530F y 1100R. En este estudio, se reportó que el género más frecuente fue Corynebacterium, que fue encontrado en 30 de las 40 úlceras diabéticas, por su parte Bacteroides, Peptoniphilus, Fingoldia y Anaerococcus spp. también fueron altamente prevalentes. Este artículo destaca la diversidad de la población bacteriana en pie diabético y apoya la presencia de pato-grupos, los cuales comprenden bacterias diferentes que producen simbióticamente una comunidad patógena.17 Singh, S K. et al, (2009) de La India, publicaron un estudio en el que determinaron la diversidad bacteriana en las infecciones del pie diabético a nivel genético por huellas digitales, es este caso, ERIC-PCR (Enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence-based). Un número de nueve pacientes fueron seleccionados para el estudio, a los cuales se tomó muestra de pus y de tejido de la zona de la herida de pie diabético. Las bacterias fueron aisladas por cultivo tradicional y posteriormente analizaron su variabilidad genética por medio de ERIC-PCR. En total fueron 38 tipos de bacterias aislados por cultivo y por medio de ERIC-PCR se detectaron hasta 8 tipos de cepas bacterianas aeróbicas de un único paciente, comparado con solo 2 tipos encontrados por cultivo. Concluyeron que la técnica molecular de ERIC-PCR es un método de detección más sensible que las técnicas convencionales.30 Gontcharova, V. et al, (2010), en Estados Unidos, publicaron un estudio donde realizaron la secuenciación del gen 16S ribosomal para evaluar la microbiota bacteriana de las úlceras diabéticas en comparación con la piel sana. Se obtuvieron 23 muestras de úlceras diabéticas por desbridamiento y 28 muestras de piel intacta. Realizaron secuenciación bTEFAP (Bacterial tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing). Como resultados observaron la presencia de más de una bacteria en las heridas de pie diabético, apoyando la idea de que estas establecen un grupo simbiótico, lo cual contribuye a la cronicidad de la herida. Además de esto se estableció que los resultados del microbioma 25 bacteriano de la piel sana muestran una diversidad menor. En lo reportado se estableció que las úlceras de pie diabético contienen géneros como Corynebacterium, Streptococcus y Anaerococcus; aunque la piel intacta también contiene la presencia del genero Corynebacterium pero en menor cantidad, lo que lo estableció como una bacteria oportunista en las heridas crónicas de úlcera de pie diabético.31 Oates et al, (2012) del Reino Unido, publicaron un estudio en el que utilizaron técnicas de cultivo bacteriano en comparación con PCR-DGGE para el análisis de las especies bacterianas presentes en muestras de desbridamiento de pie diabético y muestras de piel sana. Por medio de PCR-DGGE determinaron que S. aureus está presente en las muestras procedentes de pie diabético, mientras que en las muestras de piel sana S. aureus no estuvo presente. Además, también reportaron que la diversidad microbiana es mucho menor en la piel sana que en las muestras de úlceras de pie diabético.19 Gardner, et al, (2013) de los Estados Unidos, reportaron un análisis del microbioma del pie diabético en 52 pacientes, por secuenciación del gen 16S ARNr. Los objetivos del estudio fueron comparar la carga biológica de la ulcera de píe diabético detectada por la secuenciación del gen 16S ARNr con la obtenida por cultivo tradicional. Cincuenta y dos sujetos fueron inscritos con una edad media de 53,9 (±11,89) años. Cuarenta y tres (82,7%) eran hombres y 48 (92,3%) eran blancos. Cuarenta y tres (82,7%) tenían diabetes tipo 2, mientras que el resto tenía diabetes tipo 1. El gen 16S ARNr se amplificó utilizando los cebadores 27F y 534R. Se identificaron un total de 13 filos, la mayoría de las secuencias clasificadas en Firmicutes (67%), Actinobacteria (14%), Proteobacteria (9,8%), Bacteroides (7,3%), y Fusobacteria (1,4%). La bacteria mayormente aislada fue S. aureus, en 46% de las muestras tanto en el estudio molecular como el cultivo. El cultivo reveló que 14 (27%) de las úlceras de pie diabético contenían anaerobios en comparación con 52 (100%) mostrado por el método de secuenciación. En el cuadro 3 se muestra la comparación en porcentaje de la presencia de diferentes tipos de bacterias evaluadas por cultivo y por secuenciación de ARNr 16S, por lo tanto se concluyó que los cultivos no representan plenamente el microbioma de las ulceras de pie diabético en comparación con las técnicas genómicas.32 26 Cuadro 3. Comparación de las bacterias detectadas por cultivo y secuenciación del gen 16S ARNr.26 Bacteria Cultivo (%) Secuenciación 16S (%) Staphylococcus 40 94 Anaerobios 27 100 Proteobacteria 35 100 Streptococcus 37 83 Los antecedentes citados muestran una diversidad bacteriana variable presente en la úlcera de pie diabético, así como, la problemática de identificar de manera fiable las bacterias involucradas, en la mayoría de estos artículos se da la comparación del cultivo microbiológico con los métodos moleculares y en la mayoría de los casos se presenta una diferencia de géneros bacterianos detectados por estos métodos. De este modo estos trabajos apoyan la idea de que el pie diabético tiene la presencia de una diversidad de bacterias aerobias estrictas y que la presencia de anaerobias facultativas y estrictas, así como bacterias no cultivables. 27 2. JUSTIFICACIÓN El pie diabético es un problema de salud en México que genera altos costos económicos, cada año se realizan en promedio 28,000 amputaciones, y esto va en aumentodebido al alza en las complicaciones de la diabetes mellitus. La amputación de pie diabético es consecuencia de la carencia de un tratamiento adecuado debido a que no existen protocolos estandarizados. Esta amputación ocasiona una incapacidad de movilidad en el paciente, así como tiene consecuencias psicológicas y laborales. El efecto de la infección bacteriana depende del tipo de bacteria presente, sin embargo, los métodos de cultivo solo detectan una o dos bacterias a la vez, por lo que no se conoce el efecto de la diversidad microbiana sobre la herida de pie diabético. En la práctica diaria no se tiene conocimiento de la presencia de anaerobios en el pie diabético, la cual puede significar un agravante para la enfermedad Es por esto que la identificación de la diversidad bacteriana del pie diabético mediante herramientas moleculares es una excelente primera aproximación para determinar las bacterias presentes en estas heridas. 28 3. HIPÓTESIS Mediante métodos moleculares es posible detectar una mayor diversidad bacteriana en úlceras de pie diabético que por cultivo microbiológico. 29 4. OBJETIVOS 4.1 General Determinar la diversidad microbiana de la úlcera de pie diabético y comparar dicha diversidad con los resultados reportados por cultivo microbiológico. 4.2 Específicos 1. Caracterizar mediante métodos moleculares (ARDRA, PCR de punto final y RFLP del RNA16S) la diversidad microbiana presente en biopsias de infecciones de pie diabético. 2. Comparar los resultados de la caracterización molecular con los resultados por métodos microbiológicos 3. Valorar la diversidad presente y determinar si concuerda con la detectada por métodos de cultivo. 30 31 5. MATERIALES Y MÉTODOS La figura 1 muestra el esquema general del proyecto Figura 1. Diagrama general de la evolución del trabajo 5.1 Muestras biológicas Se utilizaron 10 biopsias de pie diabético de grado III elegidas de acuerdo con la clasificación de Meggit-Wagner. Las biopsias fueron obtenidas con la colaboración del Dr. Eduardo Bladinieres Cámara, cirujano vascular, responsable de la clínica Angiología y Cirugía Vascular del Noreste. Se eligieron biopsias de pacientes adultos con diabetes, de los cuales 6 eran hombres y 4 mujeres, 50% de ellos presentaban lesión en tendón, 30% lesión en hueso y 20% lesión en músculo. Los pacientes presentaban signos de infección aguda y no habían recibido tratamiento previo a la toma de muestra. Se obtuvieron consentimientos informados para el presente estudio. Muestras: 10 biopsias de pie diabético Extracción de ADN genómico de una muestra compuesta PCR del 16S de ARNr Clonación por medio de TOPO TA® Seleccionar aprox. 300 colonias y someter cada una a lisis térmica PCR ADNr 16S único ARDRA - HhaI, HaeIII, Alu I PCR de punto final RFLP del gen 16S ARN Metodología alternativa 32 Se excluyeron a los pacientes que no presentaran un grado 3 de Meggit-Wagner, menores de edad, paciente con pie de Charcot y aquellos pacientes que habían recibido tratamiento antibiótico tres días antes de la toma de muestra. 5.2 Extracción de ADN genómico. Se colocaron 100 mg de tejido de una sola muestra compuesta por 10 biopsias seleccionados, se maceró añadiendo 25 µL de proteinasa K y se incubó a 55°C por 16 horas con agitación constante. Después de transcurrido este tiempo se realizó la extracción de ADN utilizando el estuche comercial Wizard ® Genomic DNA Purification (Promega) siguiendo las especificaciones del fabricante. Para la extracción de ADN se estandarizó el protocolo CTAB en combinación con el estuche comercial Wizard ® Genomic DNA Purification (Promega): se agregaron 200 µL de lisis enzimática al tejido tratado con proteinasa K, se llevó a incubación durante 30 minutos a 37°C, se añadieron 300 µL de TE 1X y 30 µL de SDS al 10%, se incubó a 55°C durante 60 minutos, después de este tiempo se agregaron 100 µL de NaCl 5M más 80 µL de solución CTAB y se incubó a 65°C por 10 minutos. Después de este paso se empleó el estuche comercial Wizard ® Genomic DNA Purification (Promega), adicionándose 200 µL de una solución para precipitar proteínas y se colocó en hielo durante 5 minutos, después de transcurrido este tiempo, la muestra se centrifugó por 4 minutos a 13,000 rpm, se removió el sobrenadante a un tubo limpio, se añadieron 600 µL de isopropanol y se mezcló por inversión. La muestra se centrifugó por 1 minuto a 13,000 rpm y se decantó el sobrenadante, y a la pastilla formada se agregaron 600 µL de etanol al 70%, mezclándose por inversión y se centrifugó 1 minuto. Después de centrifugar se aspiró el etanol, quedando una pastilla de ADN, la cual se dejó secar en papel absorbente por 15 minutos, finalmente se agregaron 100 µL de solución de rehidratación y se incubó 60 minutos a 36°C. 33 5.3 Electroforesis en gel de agarosa Para comprobar la extracción e integridad del ADN, se realizó un gel de agarosa al 1%, con TBE 1X. Al gel se le agregaron 4 µL del ADN extraído más 2 µL de SYBR Green, se utilizó 1 µL de marcador lambda 500 ng/µL. La electroforesis se realizó con un voltaje de 100 voltios por 60 minutos. 5.4 Amplificación de la región 16S ARN ribosomal Para la amplificación de la región 16S de ARNr se realizó una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando el termociclador Labnet®. Se utilizó el estuche de reacción Go Taq® Flexi DNA polymerase, los cebadores universales utilizados fueron 41F (5´- gctcagattgaacgctggcg-3´) y 1389R (5′-acgggcggtgtgtacaag-3′) de acuerdo con el protocolo que se muestra en el cuadro 4 de Fisher et al. (2007).33 Cuadro 4. Condiciones de PCR 16S usando los iniciadores 41F-1389R Condiciones de reacción Programa de amplificación Reactivo Con. inicial Vol.( µL) Temp. (°C) Tiempo (min) Ciclos Solución amortiguadora 5X 5 95 4 1 MgCl2 25 mM 1.8 94 0.5 30 DNTPs 10 mM 0.6 50 1 41F 10 µM 1.5 72 1 1389R 10 µM 1.5 72 7 1 Taq 5 U/µL 0.01 H2O - - - 12.59 ADN 200 ng 2.0 Vol. final 25 34 5.5 Creación de una biblioteca de clonas La creación de la biblioteca de clonas se llevó a cabo utilizando el estuche comercial de clonación TOPO TA® (Invitrogen), los productos de la amplificación de la región 16S ARNr fueron clonados en el vector pCR II-TOPO y la transformación se realizó en cepa DH5α-T1 de E. coli, de acuerdo a los protocolos del fabricante. Reacción de ligación: para la reacción de ligación se utilizó TOPO TA® (Invitrogen) con 2 µL de producto de PCR, 1 µL del vector y agua a un volumen final de 6 µL. La reacción se mezcló e incubó a temperatura ambiente (22-23 °C) por 5 minutos. Después la reacción se colocó en hielo hasta proceder con el protocolo de transformación. Reacción de transformación: se añadieron 2 µL de la reacción de ligación a un vial de células competentes previamente descongeladas en frio. La reacción se mantuvo en hielo de 5 a 30 minutos. Después a la reacción se le realizó un choque por calor durante 50 segundos a 42°C y se transfirió inmediatamente a hielo. En seguida se colocaron 250 µL de medio Soc a temperatura ambiente. El tubo de la reacción se agitó de manera horizontal a 200 rpm a 37° C por dos horas. Después se centrifugó y eliminó el sobrenadante. Se esparcieron 30 µL de la reacción en placas de medio Luria Bertani a las que se añadieron previamente 40 µL de X-gal. Finalmente, las placas se incubaron durante 16 horas a 37°C. Análisis de transformantes: después del proceso de ligación-transformación, se observó el crecimiento de células transformadas, las cuales se presentaron como colonias pequeñas de color blanco. Se recuperó la mayoría de las colonias y se inocularon en 360 µLde caldo LB con kanamicina. Cuando se observó crecimiento en caldo LB con kanamicina, se tomaron 100 µL del cultivo para realizar lisado. Se seleccionaron las colonias blancas y se les realizó lisis térmica por medio de incubación durante 10 minutos a 94°C. Después de esto se realizó una PCR utilizando los iniciadores M13F (5´-gtaaaacgacggccagt-3´) y M13R (5´-aacagctatgaccatg-3´) de acuerdo a lo establecido en el protocolo de Fisher et al., (2007) el cual se muestra en el cuadro 5. 35 Cuadro 5. Condiciones de la PCR con los iniciadores M13 Condiciones de reacción Programa de amplificación Reactivo Con. inicial Vol. (µL) Temp. (°C) Tiempo (min) Ciclos Solución amortiguadora 5X 5 95 4 1 MgCl2 25 Mm 1.8 94 0.5 30 dNTPs 10 Mm 0.6 50 1 M13 F 10 µM 1.5 72 1 M13 R 10 µM 1.5 72 7 1 Taq 5 U/µL 0.01 H2O - - - 12.59 ADN 200 ng 2.0 Vol. final 25 5.6 Análisis de restricción de las clonas Después se realizó el análisis de restricción de ADN ribosomal amplificado (ARDRA), utilizándose la enzima HaeIII (Promega), de acuerdo con el protocolo de restricción que se muestra en el cuadro 6: Cuadro 6. Protocolo de restricción para el análisis de clonas Protocolo de restricción Reactivo Volumen (µL) Agua miliQ estéril 7.85 Solución amortiguadora 10X 1.5 Albumina sérica bovina 0.15 ADN (pPCR) 5.0 Enzima 10 U/µL 0.5 Volumen final 15 La reacción de digestión se incubó a 37 °C por 16 horas, transcurrido este tiempo se visualizó el producto de digestión en un gel de agarosa al 3% (TBE 1X, 90 voltios por 120 minutos). 36 5.7 Determinación de la diversidad mediante PCR de punto final y análisis de restricción del gen 16S de ARN ribosomal A continuación, se presenta un diagrama general de metodología alternativa (figura 2). Los detalles del porque agregar esta metodología adicional se explican en la sección de resultados. Figura 2. Diagrama general de la metodología alternativa 5.8 Extracción de ADN total de las biopsias De cada una de las biopsias elegidas se obtuvo ADN genómico mediante la metodología estandarizada CTAB-Wizard de Promega. Se tomaron alrededor de 2 mm cúbicos de tejido y se sometieron a un pretratamiento con proteinasa K a 95°C por 16 horas, con la finalidad de lisar por completo las muestras que contenían fragmento de hueso, tendón y musculo. Seguido de este tiempo se aplicó la metodología CTAB-Wizard, de acuerdo a las condiciones previamente estandarizadas. 5.9 PCR de punto final para la identificación de bacterias en pie diabético Se realizó PCR de punto final para cada una de las muestras de pie diabético. Las bacterias fueron seleccionadas de una revisión de literatura donde se buscó las bacterias más comúnmente reportadas en el pie diabético. A continuación, en el cuadro 7 se muestran los iniciadores que fueron seleccionados en una evaluación de la literatura y sus condiciones de amplificación Extracción de ADN genómico de cada biopsia PCR convencional para la detección de las bacterias PCR 16S para cada una de las biopsias RFLP in silico e in vitro con HaeIII y HindIII 37 Cuadro 7. Iniciadores para la PCR empleados para cada una de las muestras de pie diabético Bacteria Iniciador Secuencia pb Tm (⁰c) Referencia S. pyogenes 1258 F:5'aaagaccgccttaaccacct-'3 r:5'tggcaaggtaaacttctaaagca-'3 407 55 Dongyou Liu, 200534 B. fragilis LEU F- 5′cggatgccattgataaagtagg-3′ r- 5′ctggaagcaagcacattagc-3′ 448 58 Papaparaskeva s, et al, 201335 C. perfringens Cper F 5'gctaatgttactgccgttga-'3 r 5'cctctgatacatcgtgtaag-'3 300 324 53 Meer RR et al, 199736 P. mirabilis ureR F 5′ggtgagatttgtattaatgg-3′ r 5′ataatctggaagatgacgag-3′. 225 58 Weiwei Zhang et al 201337 Prevotella intermedia Pi 192 Pi468 F 5'-ccacatatggcatctgacgtggac-'3 r 5'cccgctttactccccaacaa-3' 277 55 Yanbin Zhou 201438 Finegoldia magna Pmag F 5-cgggntttagtagacagaag-3 r 5-cagtttccaatgctttacgg-3 553 60 Riggio and A. Lennon 200339 Acinetobacter sp Ac436 Ac676 F, 5'-tttaagcgaggaggagg-3' r, 5'-attctaccatcctctccc-3' 280 58 Neil Woodford , et al. 200440 Enterobacter cloacae Uw4 F 5-tagcaacggagatccaa-3 r 5-ccattcatcatcctgcat-3 500 52 Jiping Li, et al, 200041 S. aureus SaU 5′tacatgtcgttaaacctggtg-3′ 5′tacagttgtaccgatgaatgg-3′ 224 50 Naoko Chiba, et al, 200942 E. coli mdh F:5´-ggtatggatcgttccgacct-3´ r: 5´-ggcagaatggtaacaccagagt-3´ 304 55 Klein et al. 200243 Serratia marcescens SermaF SermaR 5'-tgcctggaaagcggcgatgg-3' 5'cgccagctcgtcgttgtggt-3' 155 60 Joyner et al, 201444 Enterococcus faecalis FL1 FL2 5'-acttatgtgactaacttaacc-3' 5'-taatggtgaatcttggtttgg-3' 360 52 Iweriebor et al, 201545 Enterococcus faecium FM1 FM2 5'-gaaaaaacaatagaagaatat-3' 5'tgcttttttgaattcttcttta-3' 215 48 Iweriebor et al, 2015 45 Enterococcus sp. ENT1 ENT2 5'-tactgacaaaccattcatgatg-3' 5'-aacttcgtcaccaacgcgaac-3' 112 57 Iweriebor et al, 201545 Pseudomonas aeruginosa PASSF PASSR 5'-gggggatcttcggacctca-3' 5'-tccttagagtgcccacccg-3' 956 50 Spilker et al, 200446 Pseudomonas sp. PAGSF PAGSR 5'-gacgggtgagtaatgccta-3' 5'-cactggtgttccttcctata-3' 618 50 Spilker et al, 2004 46 S. aureus SA1 SA2 5'gcgattgatggtgatacgg-3' 5'caagccttgacgcgaactaaa-3' 276 53 Brakstad et al, 199247 38 Todas las PCR fueron realizadas en el termociclador Labnet®. Se utilizó el estuche comercial de reacción Go Taq® Flexi DNA polymerase (5U/µL), con una concentración de MgCl2 de 25 mM y 10 µM de iniciadores. Todas las PCR se realizaron a un volumen final de 15 µL. 5.10 Electroforesis en gel de agarosa de los productos de PCR Para comprobar la presencia del amplicon positivo esperado, a todos los productos de PCR se le realizó una electroforesis en gel de agarosa del 1.5% (TEB 1X) con un voltaje de 90 voltios por 45 minutos. 5.11 Análisis de restricción del ARNr 16S presente en las biopsias seleccionadas Mediante el análisis de restricción del gen 16S de ARN ribosomal se observaron los diferentes patrones de restricción correspondientes a las bacterias seleccionadas y de esta manera se confirmó su presencia, así como también, se buscó observar patrones que no correspondían a ninguna bacteria positiva por PCR y así se dedujo si existían otras bacterias presentes. Se realizó una PCR 16S para cada una de las biopsias, se utilizaron los iniciadores 41F (5´-gctcagattgaacgctggcg-3´) y 1389R (5′-acgggcggtgtgtacaag-3′) de acuerdo con el protocolo de Fisher et al., (2007), para la amplificación del gen 16S ribosomal, para la obtención de un fragmento aproximado de 1450 pares de bases. A continuación, en el cuadro 8, se muestran las condiciones de reacción y amplificación para estos iniciadores. 39 La amplificación se comprobó en un gel de agarosa al 1.5% en TBE 1X, se colocaron 8 µL del producto de PCR y 2 µL de SYBER Green, utilizándose 1 µ de marcador de 100 pares de bases. Se realizó la electroforesis a 100 voltios por 45 minutos. 5.12 Análisis de restricción in silico de las biopsias seleccionadas Antes de realizar las digestiones in vitro se buscó conocer los fragmentos de restricciónin silico para las bacterias detectadas por PCR. Primeramente, se obtuvieron las secuencias del gen 16S ARN ribosomal de la base de datos del NCBI, cuyos números de referencia de las secuencias se muestran en el cuadro 9. Después se realizó una digestión in silico para la secuencia 16S de las bacterias identificadas en este estudio por medio del programa en línea NEBcutter V2.0 de New England BioLabs Inc (http://nc2.neb.com/NEBcutter2/). Se analizaron las secuencias para determinar que enzimas eran las más adecuadas para la digestión in silico. Para la mayoría de las bacterias se seleccionó la enzima HaeIII, pero en algunas bacterias esta enzima no efectuaba cortes in silico, por lo que se utilizó HindIII en esas bacterias. Como resultado se observaron los fragmentos de digestión in silico, seleccionándose un gel al 3% y un marcador de 100 pares de bases. Cuadro 8. Condiciones de PCR 16S iniciadores 41F-1389R Condiciones de reacción Programa de amplificación Reactivo Con. inicial Vol. (µL) T (°C) Tiempo (min) Ciclos Solución amortiguadora 5X 5 95 4 1 MgCl2 25 mM 1.8 94 0.5 30 dNTPs 10 mM 0.6 50 1 41 F 10 µM 1.5 72 1 1389 R 10 µM 1.5 72 7 1 Taq 5 U/µL 0.01 H2O - - - 12.59 ADN 200 ng 2.0 Vol.final 25 http://nc2.neb.com/NEBcutter2/ 40 Cuadro 9. Secuencias de referencia del Genbank Bacteria Número de referencia Genbank S. pyogenes NC_002737.2 B. fragilis NC_006347.1 C. perfringens NC_008593.1 P. mirabilis NC_010554.1 Prevotella intermedia NC_014371.1 Acinetobacter spp. NC_014259.1 Enterobacter cloacae NC_014121.1 S. aureus NZ_LN831049.1 E. coli NC_000913.3 Serratia marcescens NZ_HG326223.1 Enterococcus faecalis NC_004668.1 Enterococcus faecium NC_017960.1 Enterococcus sp. NC_018081.1 Pseudomonas aeruginosa NC_002516.2 Pseudomonas sp. NC_004129.6 S. aureus NC_007795.1 5.13 Análisis de restricción in vitro de las biopsias seleccionadas Se efectuó la digestión in silico para las amplificaciones del gel 16S de las muestras de trabajo con las enzimas HaeIII y HindIII. Las condiciones de la digestión para ambas enzimas se muestran en el cuadro 10: Cuadro 10. Protocolo de restricción para las enzimas HaeIII y HindIII Protocolo de restricción Reactivo Volumen (µL) Agua miliQ estéril 7.85 Solución amortiguadora 10X 1.5 Albumina sérica bovina 0.15 ADN (PCR) 5.0 Enzima 10 U/µL 0.5 Volumen final 15 41 La reacción se incubó a 37°C por 16 horas. Después de transcurrido el tiempo se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 3% (TBE 1X, 90 voltios, por 120 minutos), para observar los patrones de corte obtenidos colocándose 10 µL del producto de la reacción de digestión y 3 µL de SYBR Green, se utilizó el marcador de 100 pares de bases. 42 6. RESULTADOS 6.1 Obtención y caracterización de las biopsias Mediante la colaboración con la clínica Angiología y Cirugía Vascular del Noreste, se obtuvieron 10 biopsias de úlcera de pie diabético grado 3 de la clasificación de Wagner. Las biopsias fueron obtenidas previo consentimiento informado. Los pacientes de este estudio en su mayoría eran hombres en un 70%. La edad de los pacientes oscilaba entre los 29 y 75 años, teniendo una edad promedio de 66.7 años. Figura 3. Características de los pacientes participantes de este estudio El procedimiento de toma de la muestra se llevó a cabo por biopsia quirúrgica en quirófano, por incisión, previa anestesia local y con la utilización de un bisturí. Las biopsias se transportaron al laboratorio en menos de 12 horas de su obtención. Las características de las biopsias se muestran en el cuadro 11. 70% 30% Género de los pacientes Hombres Mujeres 0 20 40 60 80 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213 Edad de los pacientes 43 Cuadro 11. Características del material biológico empleado Paciente Tipo de muestra Descripción de la muestra M1 Tendón Fragmento infectado de tendón del quinto dedo del pie derecho M2 Tendón Fragmento de tendón infectado de la región plantar de pie derecho M3 Tendón Fragmento de tendón infectado del tercer dedo del pie izquierdo M4 Tejido necrótico Lesión profunda con necrosis, sepsis y síndrome compartamental M5 Tendón y hueso Fragmento de tendón plantar y fragmentos de hueso del primer metatarso M6 Músculo Musculo de la región plantar del pie derecho M7 Hueso Fragmento del quinto metatarso del pie derecho M8 Tendón Fragmento de tendón de la región plantar del pie izquierdo M9 Músculo y Tendón Fragmento de musculo plantar y tendón flexor del pie izquierdo M10 Fascia muscular y tendón Fragmento de fascia muscular y tendón de la región plantar del pie derecho En la figura 4 se muestran las diferentes proporciones de las características del material biológico empleado en este trabajo. Figura 4. Características de las biopsias analizadas. 6.2 Resultados del cultivo microbiológico Antes del análisis molecular se realizó cultivo microbiológico de las biopsias a su llegada al laboratorio, obteniéndose los siguientes resultados descritos en el cuadro 12. 34% 11% 11% 11% 11% 11% 11% Tendón Hueso Tejido necrótico Tendón y hueso Músculo Músculo y tendón Fascia muscular y tendón 44 Cuadro 12. Resultados del cultivo microbiológico Muestra Bacterias detectadas M1 S. aureus, Enterobacter M2 S. aureus M3 S. aureus M4 Providencia stuartii M5 Citrobacter diversus M6 S. aureus M7 S. aureus M8 Enterococcus M9 Enterococcus M10 Enterobacter En el perfil de resistencia a antimicrobianos de las biopsias de trabajo, los antibióticos que mostraron mayor efectividad fueron cefalotina y trimetoprim con sulfametoxazol en un 30% de las muestras. Las muestras M4 y M7 mostraron una amplia resistencia a antibióticos, siendo efectivos solo cloranfenicol en M4 y vancomicina en la muestra M7. 6.3 Extracción de ADN genómico de cepas controles y biopsias Dada la complejidad de la muestra y de que esta se encontraba en poca cantidad, con el fin de no perder la muestra, se realizaron extracciones de prueba, utilizando tres diferentes protocolos: Wizard ® Genomic DNA Purification (Promega), lisis enzimática/CTAB y CTAB + Wizard con pretratamiento con Proteinasa K, a 55°C por 12 horas. Se realizó con las tres metodologías la extracción de ADN genómico de una combinación de bacterias, previamente caracterizadas, que se utilizó como control positivo. Las bacterias utilizadas en esta combinación fueron: S. aureus, S. epidermidis, E. coli, S. tiphymurium, L. monocytogenes, P. aeruginosa, A. hydrophila, V. parahemolyticus, V. cholerae, Enterococcus sp, C. freundii, S. liquefaciens, Klebsiella spp, P. vulgaris, E. aerogenes y E. cloacae. Obteniéndose de manera satisfactoria la extracción con el método CTAB + Wizard con pretratamiento con proteinasa K, a 55°C por 12 horas (figura 5). 45 Figura 5. Electroforesis del ADN genómico de combinación de bacterias. Gel de agarosa al 1%, 100V por 1 hora. Carril 1: biopsia + mezcla de bacterias. Carril 2: mezcla de bacterias. Marcador lambda 500 ng/µL. También como control se utilizó una muestra de tejido muscular bovino al que se añadió un conjunto de las bacterias antes mencionadas, esto para simular la dificultad del tejido de trabajo. Como metodología de extracción de ADN se utilizó el protocolo CTAB + Wizard con pretratamiento con proteinasa K, 55°C por 12 horas (figura 6). Figura 6. Electroforesis de ADN genómico de tejido muscular bovino. Gel de agarosa al 1%, 100 V por 1 hora. Carril 1: tejido muscular bovino. Marcador lambda 500 ng/µL. Como prueba para la obtención de ADN de tejido, se utilizó una biopsia de pie diabético del año 2014, para la cual se utilizó elprotocolo CTAB + Wizard con pretratamiento con proteinasa K, a 55°C por 12 horas (figura 7). Figura 7. Electroforesis de ADN genómico de una biopsia de pie diabético. Gel de agarosa al 1%, 100 V por 1 hora. Carril 1: biopsia. Marcador lambda 500 ng/µL. 46 Después de realizadas estas extracciones de ensayo, se realizó la extracción de ADN genómico del conjunto de 10 biopsias de grado III de Wagner, mediante el protocolo CTAB + Wizard obteniendo lo siguientes resultados (figura 8). Figura 8. Electroforesis de ADN genómico de la combinación de biopsia de trabajo. Gel de agarosa al 1%, 100 V por 1 hora. Carril 1: biopsias de trabajo. Marcador lambda 500 ng/µL. A su vez, para una posterior digestión de prueba, se realizó la extracción de ADN genómico de un grupo de bacterias individuales: S. aureus, E. cloacae, P. aeruginosa, E. coli, P. vulgaris. Para la extracción se utilizó el protocolo CTAB + Wizard con pretratamiento con Proteinasa K, a 55°C por 12 horas (figura 9). Figura 9. Electroforesis de ADN genómico de bacterias. Gel de agarosa al 1%, 100 V por 1 hora. Carril 1: S. aureus. Carril 2: E. cloacae. Carril 3: P. aeruginosa. Carril 4: E. coli. Carril 5: P. vulgaris. Marcador lambda 500 ng/µL 6.4 Amplificación del gen 16S ARNr Utilizando los iniciadores universales 41F y 1389R, se amplificó un fragmento de aproximadamente 1492 pares de bases correspondientes al gen 16S ARNr a partir de 47 muestras de ADN metagenómico. El producto de la amplificación se observa en la figura 10, en un gel de agarosa al 1.5 % Figura 10. Electroforesis del producto de PCR del gen 16S de ARNr. Carril 1: mezcla de bacterias. Marcador DNA 100 pb LMC. Gel de agarosa al 1.5%, 90 Voltios por 1 hora. Se realizó una PCR para el 16S ARNr del ADN genómico proveniente de las bacterias S. aureus, E. cloacae, P. aeruginosa, E. coli, P. vulgaris, obteniéndose el amplicon de 1492 pares de bases correspondientes al gen 16S ARNr (figura 11). Figura 11. Electroforesis de los productos de PCR del gen 16S de ARNr a partir de ADN metagenómico. Carril 1: S. aureus, carril 2: E. cloacae, carril 3: P. aeruginosa, carril 4: E. coli, carril 5: P. vulgaris. Marcador Promega 100 pb DNA Ladder Molecular Weight. Gel de agarosa al 1.5%, 90 Voltios por 1 hora. Con la utilización de los iniciadores descritos se amplificó el gen 16S de ARNr del ADN genómico extraído de la muestra única de biopsias Meggit-Wagner grado III, obteniéndose el amplicon correspondiente de 1492 pares de bases (figura 12). 1500 pb 1000 500 - 1030 pb 48 Figura 12. Electroforesis de los productos obtenidos de la amplificación del gen 16S de ARNr. Carril 1: muestra de biopsias grado III de Meggit-Wagner. Marcador DNA 100 pb LMC. Gel de agarosa al 1.5%, 90 Voltios por 1 hora. 6.5 Clonación – Transformación Para la clonación se utilizaron los vectores pCR II® 2.1 -TOPO® y StrataClone PCR Cloning Kit y se transformaron células de E. coli DH5α de acuerdo a las instrucciones del proveedor. En el ensayo 4, se obtuvo el producto de PCR 16S ARNr de la muestra compuesta obtenida de las biopsias, este inserto se ligó en los vectores pCR II® 2.1 -TOPO® y con estos y el vector intacto Pet28 (10 ng) se transformaron células de E. coli DH5α preparadas en el laboratorio. Como resultados se obtuvieron 120 colonias blancas de la transformación con el vector TOPO, las cuales tuvieron crecimiento en caldo LB con kanamicina. De estas 120 colonias se obtuvo la extracción de ADN por lisado de las colonias, posteriormente se realizó PCR M13 de las colonias, de las cuales se obtuvieron 3 clonas positivas en las que se observó en gel de agarosa al 1.5% la amplificación del fragmento de 1400 pares de bases (figura 13). Figura 13. Electroforesis de la amplificación del fragmento M13. Marcador DNA 100 pb Promega. Gel de agarosa al 1.5%, 90 Voltios por 1 hora. - 1030 pb 49 En el cuadro 13 se muestra en resumen los ensayos realizados para la metodología de ligación-transformación. Cuadro 13. Resumen de los ensayos de clonación Ensayo Vector Células Resultado 1 TOPO E. coli DH5α No se obtuvo el inserto 2 Pet28 E. coli DH5α No se obtuvo el inserto 3 TOPO y Pet28 E. coli DH5α No se obtuvo el inserto 4 TOPO y Pet28 E. coli DH5α 3 clonas con inserto con vector TOPO 5 TOPO y Pet28 E. coli DH5α No se obtuvo el inserto 6 StrataClone E. coli DH5α No se obtuvo el inserto 6.6 ARDRA – RFLP Para el análisis de los perfiles de ARDRA, se realizó un análisis de digestión in silico mediante el programa NEBcutter V2.0 (http://nc2.neb.com/NEBcutter2/), se utilizaron cinco bacterias encontradas comúnmente en los cultivos microbiológicos de pie diabético, las bacterias empleadas fueron: E. cloacae, E. coli, P. aeruginosa, P. mirabilis y S. aureus, cuyas secuencias de referencia del Genbank se muestran en el cuadro 9. La enzima utilizada fue HaeIII, mostrándose los siguientes patrones de digestión (figura 14): Figura 14: Representación de los perfiles de digestión in silico con la enzima HaeIII. Carril 1: E. cloacae, carril 2: E. coli, carril 3: P. aeruginosa, carril 4: P. vulgaris y carril 5: S. aureus Gel de agarosa al 2.5 %, con un marcador de 100 pares de bases. http://nc2.neb.com/NEBcutter2/ 50 Posteriormente a las 3 clonas positivas se les realizo digestión con la enzima HaeIII, de acuerdo con el protocolo descrito anteriormente, obteniéndose los siguientes patrones de bandeo (figura 15): Figura 15. Perfiles RFLP de las clonas positivas. Carril M: marcador VC 100 pb Plus DNA Ladder. Carriles 1: clona 1; carril 2: clona 3; carril 3: clona 9. Gel de agarosa al 2.5 %. En la figura se aprecian diferentes patrones de bandeo generados por cada fragmento, lo cual establece que en cada una de estas colonias se encuentra un ADN diferente y por medio de secuenciación se puede conocer a que bacteria pertenece. Sin embargo, dado la poca cantidad de clonas positivas y del tiempo de terminación de este proyecto, estas tres clonas no se secuenciaron y se optó por una segunda estrategia para este estudio que se describe a continuación. 6.7 Estrategia alternativa Dado a que no se obtuvo de la manera esperada la biblioteca de clonas, se optó por realizar una segunda metodología basándose en la Reacción en Cadena de la Polimerasa de punto final, para la detección de las bacterias más comúnmente reportadas en la literatura para el pie diabético, complementado por un análisis adicional, basado en la restricción de el gen 16S de ARN ribosomal de las biopsias de trabajo, para de esta manera analizar los diferentes patrones de digestión producidos por las enzimas que se seleccionaron. Las bacterias seleccionadas para ser identificadas por PCR con iniciadores específicos fueron: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Enteroccoccus sp, Escherichia M 1 3 9 3000 pb 2500 pb 51 coli, Serratia marcescens, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Pseudomonas sp, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp, Enterobacter cloacae, Proteus mirabilis, Prevotella intermedia, Bacteriodes fragilis, Clostridium perfringes y Finegoldia magna. 6.8 Extracción de ADN total de las biopsias de pie diabético Se extrajo de manera individual el ADN de las 10 biopsias mediante el protocolo CTAB + Wizard con pretratamiento con Proteinasa K, a 55°C por 12 horas. La extracción del ADN se comprobó mediante una electroforesis en gel de agarosa al 1% (TBE 1X) con un voltaje de 100 voltios durante 60 minutos. En el siguiente gel de la figura 16 se puede observar la extracción de ADN genómico de las biopsias de trabajo. Figura 16. Electroforesis del ADN de las biopsias de trabajo. Gel de agarosa al 1%, 100 V por 1 hora. Marcadorlambda 500 ng/µL. 6.9 PCR y perfiles de RFLP para las bacterias seleccionadas Se seleccionaron un grupo de 16 bacterias, las más comúnmente encontradas en el pie diabético de acuerdo a la literatura. Se realizó PCR con los iniciadores correspondientes de estas 16 bacterias, a cada una de las biopsias. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 52 Se realizaron las PCRs de acuerdo a las condiciones de reacción y amplificación establecidas en el apartado de materiales y métodos. A continuación, en el cuadro 14 se muestra las bacterias positivas por PCR en cada una de las biopsias. Cuadro 14. Biopsias positivas para las bacterias amplificadas M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 S. aureus + + + Enterococcus sp + + + + E. faecalis + + + + S. pyogenes + E. coli + + + + + + + + S. marcescens + Pseudomonas sp + Acinetobacter sp + F. magna + + + B. fragilis P. aeruginosa E. faecium C. perfringes P. mirabilis P. intermedia E. cloacae La amplificación del fragmento esperado se comprobó mediante un gel de agarosa al 1.5%, en TBE al 1X, a un voltaje de 90 voltios durante 45 minutos. Se colocó en el gel 10 µL del producto de PCR más 3 µL de SYBR Green, se utilizó el marcador Novagen de 100 pares de bases. A continuación, se muestran las electroforesis en gel de agarosa al 1.5% de cada muestra de pie diabético, se representa solo los amplicones positivos para las bacterias amplificadas. Primeramente, en la electroforesis de la figura 17, muestra los productos de PCR positivos para E. coli mdh y E. faecalis en la muestra M1. 53 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7 Figura 17. Electroforesis de la muestra M1. Carril 1: marcador Novagen de 100 pares de bases; carril 2: control negativo E. coli; carril 3: control negativo E. faecalis; carril 4: E. coli mdh; carril 5: E. faecalis. A continuación, se muestra la figura 18, la cual muestra amplicones positivos para E. coli, S. pyogenes y F. magna para la muestra M2. Figura 18. Electroforesis de la muestra M2. Carril 1: marcador Novagen de 100 pb; carril 2: E. coli mdh; carril 3: S. pyogenes; carril 4: control negativo E. coli; carril 5: control negativo S. pyogenes; carril 6: control negativo F. magna; carril 7: F. magna. En la figura 19 se pueden observar los productos de PCR identificados como S. aureus, Pseudomonas sp., E. faecalis en la muestra M3. 54 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 Figura 19. Electroforesis de la muestra M3. Carril 1: marcador Novagen de 100 pb; carril 2: control negativo S. aureus; carril 3: S. aureus; carril 4: Pseudomonas sp.; carril 5: E. faecalis; carril 6: control negativo Pseudomonas sp.; carril 7: control negativo E. faecalis. En la figura 20 se aprecia el gel de electroforesis de la muestra M4, la cual fue positiva para E. coli, S. aureus y E. faecalis. Figura 20. Electroforesis de la muestra M4. Carril 1: control negativo S. aureus; 2: S. aureus; 3; control negativo E. faecalis; 4: E. faecalis; 5: E. coli mdh; 6: control negativo E. coli; 7: marcador Novagen de 100 pb. La figura 21 muestra mediante un gel de agarosa, los productos de PCR de la muestra M5 que dieron positivo para Acinetobacter sp., E. coli y F. magna. 55 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 7 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Figura 21. Electroforesis de la muestra M5. Carril 1: marcador Novagen de 100 pares de bases; 2: Acinetobacter sp.; 3. E. coli mdh; 4: control positivo E. coli; 5: control negativo Acinetobacter sp.; 6: F. magna; 7: control negativo F. magna. La figura 22 muestra amplicones positivos para Enterococcus sp., E. coli y E. faecalis para la muestra M6. Figura 22. Electroforesis de la muestra M6. Carril 1: marcador Novagen 100 pb; 2: Enterococcus sp; 3: control negativo Enterococcus sp; 4: control negativo E. faecalis; 5: control negativo E. coli; 6: E. coli mdh; 7: E. faecalis. En la figura 23 se muestran amplicones positivos para E. coli, Enterococcus sp. y S. marcescens para la muestra M7. Figura 23. Electroforesis de la muestra M7. Carril 1: Marcador Novagen 100 pb; 2 y 3: Control negativo E. coli; 4: E. coli mdh; 5: Control negativo Enterococcus sp; 6: Enterococcus sp; 7: Control negativo S. marcescens; 8: S. marcescens; 9: control positivo Enterococcus sp. 56 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 El siguiente gel de electroforesis de la figura 24 para la muestra M8, identifica productos de PCR positivos para E. coli y F. magna. Figura 24. Electroforesis de la muestra M8. Carril 1: marcador Novagen 100 pb; 2: E. coli mdh; 3: E. coli; 4: control negativo E. coli; 5: F. magna; 6: control negativo F. magna. En la siguiente figura (figura 25), se muestran los amplicones positivos para Enterococcus sp. y S. aureus para la muestra M9. Figura 25. Electroforesis de la muestra M9. Carril 1: marcador Novagen 100 pb; carril 3: control negativo Enterococcus sp; carril 4: Enterococcus sp; cariil 5: control negativo S. aureus; carril 6: S. aureus. La electroforesis de la figura 26 muestra productos de PCR positivos para Enterococcus sp. y E. coli en la muestra M10. 57 1 2 3 4 5 6 7 Figura 26. Electroforesis de la muestra M10. Carril 1: marcador Novagen 100 pb; 2: control negativo Enterococcus sp; 3: control negativo E. coli; 4: Enterococcus sp; 5: control negativo; 6: E. coli mdh; 7: control positivo E. coli mdh. La digestión in silico de las bacterias detectadas por PCR permitió ver los diferentes patrones que se podían obtener para diferenciar estas bacterias. En la figura 27 se muestran los diferentes patrones de RFLP obtenidos in silico por el programa en línea NEBcutter V2.0. Figura 27. Representación de los perfiles de digestión con la enzima HaeIII y HindIII mediante el programa NEBcutter V2.0. SA= S. aureus; Esp= Enterococcus sp; EC= E. coli; SM= S. marcescens; EF= E. faecalis; Psp= Pseudomonas sp; SP= S. pyogenes; FM= F. magna; Asp= Acinetobacter sp. A través de RFLP se corroboró a las bacterias detectadas por PCR de acuerdo a los patrones de digestión originados por las enzimas HaeIII y HindIII. Al ADN de las muestras se les realizó una PCR para el gen 16S con los iniciadores 47F y 1389R, obteniéndose el producto de amplificación esperado de 1450 pares de bases, visualizado en un gel de agarosa al 1.5 % en TBE 1X (100 voltios por 45 minutos). Después de esto, 58 1 2 3 4 5 6 7 7 se realizó la digestión de acuerdo al protocolo descrito, en las muestras M4, M6 y M9 se utilizó la enzima HindIII, por su parte la enzima HaeIII se utilizó en las muestras M1, M2, M3, M5, M7, M8 y M10 Los patrones de digestión de la muestra M4 denotó patrones de corte de 800, 400 y 150 pb correspondientes a S. aureus, así como bandeos a aproximadamente 300 y 200 pb que se identificaron como el patrón de digestión de E. coli, y patrones de digestión de E. faecalis de 310 y 100 pares de bases. La
Compartir