Analiz-MondragAn-Cisneros

Vista previa del material en texto

TESIS INDIVIDUAL 
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA 
ESTRATEGIAS DE ADAPTACIÓN DE 
UN CONSORCIO SULFOXIDANTE 
ALCALÓFILO A LA 
METILDIETANOLAMINA (MDEA) 
PARA OBTENER EL TÍTULO DE 
 
INGENIERA AMBIENTAL 
PRESENTA: 
 
ANALIZ MONDRAGÓN CISNEROS 
México, D. F. JUNIO 2008 
 
DIRECTOR INTERNO: M. EN C. GLORÍA LÓPEZ JIMÉNEZ 
 
DIRECTOR EXTERNO: DRA. PATRICIA OLGUÍN LORA 
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA 
ING. VESICA MARÍA DOMÍNGUEZ GALICIA 
SUBDIRECTORA ACADÉMICA DE LA UPIBI-IPN 
Presente. 
 
Los abajo firmantes, designados por la Subdirección Académica como miembros del Jurado 
Calificador del trabajo de tesis titulado "Estrategias de adaptación de un consorcio sulfoxidante 
alcalófilo a la metildietanolamina (MDEA)", que presenta la C. ANALIZ MONDRAGON 
CISNEROS, egresada y pasante de la carrera de Ingeniería Ambiental, boleta número 98080683, 
informamos que después de haber revisado cuidadosamente el informe escrito, consideramos que 
reúne las características de calidad académica que se requieren para aspirar a la obtención del título 
mencionado. 
Por lo anterior, otorgamos nuestro aval para que continúen los trámites de titulación y se proceda a 
programar el examen profesional correspondiente, de acuerdo al artículo 39 del Reglamento de 
Titulación Profesional vigente en nuestro instituto. 
 
DRA. MARINA OLIVIA FRANCO HERNÁNDEZ 
PRESIDENTE 
M. EN C. GLORIA LÓPEZ JIMÉNEZ 
SECRETARIA 
DRA. PATRICIA OLGUIN LORA 
PRIMER VOCAL 
DRA. ELVIA INÉS GARCÍA PEÑA 
SEGUNDO VOCAL 
QBP. MIRIAM JUÁREZ JUÁREZ 
TERCER VOCAL 
Se extiende el presente a los 23 días del mes de Mayo del año 2008 
Av. Acueducto s/n. Col. Barrio la Laguna Ticomán C.P. 07340 México, D.F. Tel.:5729-6000 Exts.: 56347 y 46117 Fax: 56305 
 
SECRETARIA 
DE 
EDUCACIÓN PÚBLICA 
ASUNTO: Aval de Calidad 
Académica de trabajo de Tesis 
NOMBRE FIRMA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Este trabajo se realizó en el Instituto Mexicano del Petróleo (IMP) en el Laboratorio 
de Biotecnología, dentro del proyecto D.00011- IMP, bajo la dirección de la Dra. 
Patricia Olguín Lora. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
Durante este tiempo, buenos y malos momentos me ayudaron a fortalecer mi 
carácter, me brindaron una perspectiva de la vida mucho más amplia y me han 
enseñado a ser más cautelosa pero sin dejar de ser auténtica. Existen grupos de 
personas a las que no puedo dejar de reconocer debido a que durante todo este 
tiempo estuvieron presentes de una u otra forma de mi vida, evitando así que me 
perdiera en el proceso y que saliera airosa de esta experiencia. 
 
Agradezco a Dios… porque a pesar de que muchas veces puse mis intereses por 
encima de ti, nunca me fallaste en ti confío. Siempre me has ayudado a seguir 
adelante y por ti aún no pierdo la esperanza, sé que todos pueden decepcionarme 
menos tú y reconozco que sin ti no hubiese podido sobrevivir en estos últimos 
meses. Muchas Gracias. 
 
Agradezco a mis padres María Cisneros Gutiérrez y Jorge A. Mondragón 
González, a mi hermano Jorge A. Mondragón Cisneros por ser más de lo que 
les pedí y de lo que en algunas ocasiones merecía. Por brindarme todo lo que me 
hizo falta antes de que lo notara, antes de que lo pidiera. Por valerse de sus 
experiencias para enseñarme el valor de prever. Por tener la paciencia que tantas 
veces he necesitado. Junto a ustedes aprendí que soy justa a lo que siempre he 
querido ser. Gracias por brindarme todo esto, los quiero mucho. 
 
Al Instituto Mexicano del Petróleo (IMP) y Unidad Profesional 
Interdisciplinaria de Biotecnología (UPIBI), por brindarme la oportunidad de 
crecer con experiencias y entre personas inigualables que nunca olvidaré. Allí 
aprendí que no hace falta ser reconocida para sentirse orgullosa de una misma. 
Que se es grande tan solo por dejarse ser y mantenerse como tal a pesar de 
cuantos jalones te dé la vida. 
 
Deseo dejar constancia de mi más profundo y sincero agradecimiento a la Dra. 
Patricia Olguín Lora ya que sin su ayuda y su comprensión, todo este trabajo 
habría sido imposible de realizar. 
 
Mi satisfacción y agradecimiento la M. en C. Gloría López Jiménez por su ayuda 
quien ha facilitado mi labor en la tesis, quién me apoyo siempre y aprendí el valor 
de planificar y ordenar mis aspiraciones. 
 
También quiero agradecer la amistad recibida de mi Amigo Salador Villa Pérez 
por abrirme los brazos desde el principio y darle un toque cómico y televisivo a mi 
vida. Por darle valor a mi sinceridad brindándome la suya. Por ser un amigo entre 
tantos conocidos, junto a usted aprendí que los patrones solo aplican a los 
desconocidos y se invalidan desde que eres capaz de ver más allá. 
 
Y por último, a Fabiola De la Rosa Mosqueda e Irma Angélica Hernández, por 
enseñarme cuanto valgo y reconocerme tan sólo al mirarme, Por estar presente 
aún cuando no lo he notado. Por tener fe en mí y aspirarme con sus logros. Junto 
a ustedes aprendí que vivir la realidad puede ser más satisfactorio que soñar 
despierta. 
 
Sin ánimo de olvidar a nadie en particular y a todas aquellas personas que de una 
u otra manera han compartido mi vida durante el transcurso de estos últimos años 
mi más sincero agradecimiento a su comprensión, estímulo y ayuda, ya que todos 
son parte de mi vida. 
 
GRACIAS 
 i
INDICE Pagina 
 
Contenido 
 
i 
Índice de tablas. iv 
Índice de figuras. v 
Introducción. 1 
Ciclo Biogeoquimico del azufre. 4 
Compuestos azufrados. 6 
Sulfatos (SO4-2). 7 
Tiosulfatos (S2O3-2). 7 
Azufre. 7 
Endulzamiento de Gas. 8 
Gas Natural. 8 
Gases Ácidos. 9 
Proceso de Endulzamiento de Gas Natural. 9 
Etapa de absorción. 10 
Etapa de regeneración. 10 
Aminas. 11 
Metildietanolamina (MDEA). 12 
Microorganismos Sulfoxidantes Alcalófilos. 13 
Reactores. 15 
Reactores químicos. 15 
Reactores biológicos (Biorreactores). 16 
Biorreactores en lote. 16 
Biorreactores continuos. 17 
Inmovilización de microorganismos. 18 
Métodos de inmovilización. 19 
Justificación. 21 
Hipótesis de trabajo. 22 
Objetivos. 23 
Objetivo General. 23 
Objetivos Específico. 23 
Materiales y Métodos. 24 
 ii
Origen del cultivo mixto sulfoxidante. 24 
Caracterización microscópica de la actividad sulfoxidante del cultivo 
mixto. 
24 
Caracterización de la actividad sulfoxidante del cultivo mixto. 25 
Esterilización del Medio Mineral. 25 
Preparación del inoculo para las cinéticas de oxidación de tiosulfato. 26 
Estudio de la adaptación progresiva del cultivo mixto en un reactor 
biológico operado en forma continúa a diferentes concentraciones 
de Metildietanolamina (MDEA). 
27 
Parámetros de Operación del reactor biológico inoculado con el 
cultivo mixto sulfoxidante. 
29 
Inmovilización del cultivo mixto sulfoxidante en alcohol Polivinilico 
(PVA). 
33 
Adaptación del cultivo mixto inmovilizado en un reactor continuo 33 
Métodos Analíticos. 35 
Cuantificación de Biomasa. 35 
Reactivos. 36 
Procedimiento. 37 
Cuantificación de sulfatos (SO4-2) y Tiosulfato (S2O3-2). 38 
Reactivos. 39 
Procedimiento. 40 
Tinción Gram. 42 
Reactivos. 42 
Tratamiento de resultados. 43 
Velocidad de oxidación del tiosulfato (S2O3-2). 43 
Velocidad especifica de oxidación del tiosulfato. 44 
Modelo de Monod. 45 
Resultados. 47 
Caracterización microscópica del cultivo mixto. 47 
Caracterización de la actividad sulfoxidante del cultivo mixto. 48 
Efecto de la concentración de tiosulfato (S2O3-2) en el cultivo mixto. 50 
Adaptación progresiva del cultivo mixto sulfoxidante en un reactor 
biológico operado en forma continúa a diferentes concentraciones 
53 
 iii
de Metildietanolamina (MDEA). 
Inmovilización del cultivo mixto sulfoxidante en alcohol Polivinilico 
(PVA) y determinación de su actividad sulfoxidante en un reactor 
biológico. 
58 
Conclusiones. 61 
Recomendaciones. 62 
Referencias Bibliográficas. 63iv
 
INDICE DE TABLAS 
 
Tablas Descripción Paginas
 
Tabla 1 
 
Emisiones y descargas de contaminantes al agua y 
derrames de hidrocarburos por subsidiarias de PEMEX 
(toneladas). 
 
2 
Tabla 2 Alcanolaminas utilizadas en la purificación del gas 
natural. 
12 
Tabla 3 Características físico-químicas de la metildietanolamina 
(MDEA). 
13 
Tabla 4 Composición del medio mineral para el crecimiento de 
microorganismos sulfoxidantes. 
26 
Tabla 5 Preparación de las diluciones para la curva patrón para 
proteína. 
37 
Tabla 6 Preparación de las diluciones para la curva patrón de 
sulfato y tiosulfato. 
41 
Tabla 7 Resultados del reactor biológico a diferentes 
concentraciones de Amina con S2O32- (entrada), S2O32- 
(salida), SO4-2 salida y Proteína. 
57 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 v
 
INDICE DE FIGURAS 
 
Figuras Descripción Paginas
 
Figura 1 
 
Ciclo Biogeoquímico del Azufre 
 
6 
Figura 2 Proceso de endulzamiento de gas por aminas. 11 
Figura 3 Oxidación biológica de sulfuro en función de la 
concentración de oxigeno disuelto y la concentración 
de sulfuro en el medio (O2/S2-). 
18 
Figura 4 Reactor sulfoxidante de flujo ascendente. 29 
Figura 5 Reactor sulfoxidante experimental. 32 
Figura 6 Reactor biológico con el cultivo sulfoxidante 
inmovilizado. 
35 
Figura 7 Cromatograma, picos y tiempos de retención 
característicos en la determinación de Sulfato (SO4-2) 
y tiosulfato (S2O3-2). 
41 
Figura 8 Consumo de tiosulfato en función del tiempo en un 
experimento en lote. 
43 
Figura 9 Velocidades especificas de consumo de tiosulfato en 
función de la concentración de tiosulfato. 
45 
Figura 10 Cultivo mixto sulfoxidante con tinción Gram, donde se 
observa el crecimiento en forma dispersa y la forma 
de bacilos de los microorganismos. 
47 
Figura 11 Comportamiento de la oxidación de tiosulfato, 
aparición de sulfato y crecimiento de la biomasa 
(proteína). 
49 
Figura 12 Velocidad de oxidación de tiosulfato por el cultivo 
mixto, en función de la concentración de tiosulfato. 
51 
Figura 13 Velocidad máxima de crecimiento de cultivo mixto, en 
función de la concentración de tiosulfato. 
52 
Figura 14 Tiosulfato (entrada y salida), aparición de sulfatos (A) 
y crecimiento microbiano medido como proteína (B) en 
55 
 vi
reactor biológico sulfoxidante adicionado de diferentes 
concentraciones de metildietanolamina (MDEA). 
Figura 15 Porcentaje de oxidación de tiosulfato en el reactor 
biológico sulfoxidante 
56 
Figura 16 Comportamiento de la oxidación de tiosulfato por el 
cultivo mixto inmovilizado en un reactor operando en 
lote (A) y en continúo (B). 
59 
Figura 17 Porcentaje de oxidación de tiosulfato (S2O32-) a sulfato 
(SO4-2), en presencia de microorganismos 
inmovilizados, en el reactor operado en lote (A) y en 
continuo (B). 
60 
 
 
 
 
 1
1. INTRODUCCIÓN 
 
Las actividades económicas desarrolladas por el hombre generan los bienes y 
servicios que garantizan su bienestar social. Las cuales, cada día son más 
complejas y requieren de tecnologías más avanzadas, de tal forma que 
mantengan un alto nivel de productividad. Sin embargo, muchas de esas 
actividades son fuente de contaminación, lo que constituye un problema que 
afecta la vida sobre el planeta. 
 
La contaminación es un desequilibrio que se genera en el medio ambiente por la 
adición de una ó más sustancias en cantidades que provocan efectos adversos en 
los organismos vivos. En los últimos años se han empezado a realizar acciones 
para prevenir y controlar la contaminación ambiental. Existen fuentes de 
contaminación ya sea naturales como provenientes de los volcanes, incendios 
forestales, y los no naturales provenientes de industrias siderúrgicas, fabricas de 
cemento, productos químicos, oficinas y hogares (Erkerlin y col., 1997). Todos 
ellos son factores que generan un alto nivel de contaminación. 
 
En México, la industria del petróleo, es una de las actividades que genera una 
gran cantidad de contaminación ambiental. Durante el año del 2003 hubo un 
incremento en las emisiones y descargas totales de PEMEX con un 18.9% en 
relación con el año 2002, al pasar de 1.2 a 1.4 millones de toneladas, debido al 
aumento en la producción o proceso del crudo, a los incrementos en las emisiones 
de la atmósfera y la generación de residuos peligrosos. 
 
PEMEX Refinación (PR) aportó mayor cantidad de contaminantes, con 47.1% del 
total, por el aumento en emisiones a la atmósfera, la generación de residuos 
peligrosos, fugas y derrames, seguida de PEMEX Exploración y Producción (PEP) 
con 43.1% por incrementos en las emisiones al aire y generación de residuos; por 
su parte, PEMEX Gas y Petroquímica Básica (PGPB) contribuyo con 6.6%, debido 
al crecimiento en la generación de residuos peligrosos y fugas de hidrocarburo, y 
PEMEX Petroquímica (PPQ) con 3.2% debido a mayores emisiones a la 
 2
atmósfera, descargas de contaminantes al agua y derrames de hidrocarburos. 
(Tabla 1 PEMEX) (Desarrollo Sustentable PEMEX, 2003) 
 
 
Tabla 1 Emisiones y descargas de contaminantes al agua y derrames de 
hidrocarburos por subsidiarias de PEMEX (Toneladas). 
Subsidiarias de 
PEMEX 
Emisiones al 
aire 
Descargas 
al agua 
Generación de 
residuos 
peligrosos 
Hidrocarburos 
derramados 
PEP 204,992 263 381,980 1,297 
PR 552,229 1,171 85,959 4,426 
PGPB 84,127 327 1,662 3,845 
PPQ 31,309 892 11,995 3 
TOTALES 872,657 2,653 481,596 9,570 
2002 vs. 2003(%) 131,480 2,653 97,243 -10,425 
2002 vs. 2003(%) 17.7 -12.8 25.3 -52.1 
PEP Pemex Exploración y Refinación, PR Pemex Refinación, PGPB Pemex Gas Petroquímica 
Básica, PPQ Pemex Petroquímica (Desarrollo Sustentable PEMEX, 2003) 
 
 
Dentro de los contaminantes de importancia en el ámbito mundial y nacional, los 
compuestos azufrados tienen un gran impacto debido a los efectos graves que 
ocasionan en el equilibrio ambiental y a la salud. Este elemento es esencial para la 
vida en la tierra, por lo que el entendimiento del ciclo biogeoquímico es importante. 
El ciclo involucra el metabolismo de diferentes grupos de bacterias especializadas 
en usar compuestos azufrados, en sus distintos estados de oxidación y en 
diversas condiciones ambientales (temperatura, salinidad y pH) (Lens y Kuenen, 
2001). 
 
Existen diversas tecnologías biotecnológicas para eliminar o remediar los efectos 
de la contaminación por compuestos azufrados. Las cuales toman en cuenta las 
conversiones que realizan naturalmente las bacterias en el ciclo biogeoquímico del 
azufre. 
 
 3
Las diferentes corrientes de desecho (líquidas, gaseosas) que se generan en 
procesos industriales donde se generan compuestos azufrados, tienen 
características muy variadas en cuanto a temperatura, pH, salinidad y otros 
compuestos. Algunos de estos procesos sobre todo fisicoquímicos, operan a 
condiciones extremas de temperatura y pH, pero necesitan una gran inversión en 
energía, por lo que los costos de desarrollo son muy altos. Dichas condiciones, se 
encuentran lejos de los óptimos de operación de los microorganismos 
sulfoxidantes, por lo que es necesario contar con microorganismos que puedan 
oxidar los compuestos azufrados en ambientes extremos (extremófilos), para 
posteriormente ser utilizados en procesos biotecnológicos que traten corrientes 
contaminadas con compuestos azufrados en condiciones extremas. 
 
La mayoría de los reactores utilizados en los procesos biológicos utilizan los 
microorganismos en dispersiones homogéneas para convertir sustratos a 
productos. Esto significa que los microorganismos se encuentran libremente 
suspendidos en el medio de cultivo, por lo que son mucho más sensibles a 
choques tóxicos o de carga, además que la concentración de biomasa en el 
reactor es baja y por lo tanto los rendimientos de conversión de los reactores son 
bajos. Una alternativa para obtener mejores resultados en estos reactores, es la 
inmovilización de las células microbianasen diferentes soportes, lo cual mejora la 
eficiencia de un biorreactor, debido a que la densidad microbiana es mayor y 
dentro de los soportes los microorganismos se pueden proteger contra 
condiciones ambientales adversas tales como pH, temperatura, solventes 
orgánicos, y compuestos orgánicos tóxicos (Park and Chang, 2000). 
 
El proceso fisicoquímico comercial para la remoción de H2S del gas natural, utiliza 
soluciones de aminas, el cual consta de dos etapas: una de absorción donde la 
solución de aminas entra en contacto con el gas amargo con el fin de absorber el 
H2S. La otra etapa de regeneración donde, el H2S se des-absorbe por medio de 
calor de la solución de aminas ácidas. Finalmente, el compuesto se transforma en 
azufre elemental por medio del proceso Claus o produciendo gases ricos en SO2 
(Kohl y Nielsen, 1997). 
 4
Este proceso fisicoquímico tiene alternativas biológicas donde en vez de utilizar la 
solución de aminas, utilizan álcalis y los siguientes pasos son remplazados por 
reactores biológicos con microorganismos sulfoxidantes alcalófilos. En México el 
proceso tradicional utiliza soluciones de aminas por lo que para proponer una 
alternativa biológica es necesario contar con microorganismos ya sea en forma 
libre o inmovilizada capaces de sobrevivir en estas condiciones del proceso, 
obteniendo resultados en el ahorro de costos sin alterar la capacidad ni la calidad 
del proceso. 
 
 
1.1 CICLO BIOGEOQUIMICO DEL AZUFRE 
 
El ciclo biogeoquímico describe el transporte y distribución de materiales, los 
cuales controlan el recambio y transformación de éstos en los ambientes 
terrestres, acuáticos y atmosféricos. 
 
Describe los movimientos y las interacciones de los elementos químicos 
esenciales para la vida a través de la geosfera, durante los procesos físicos, 
químicos y biológicos. Los principales elementos químicos son: carbono, 
hidrógeno, nitrógeno, oxígeno, fósforo, azufre o los contaminantes. Los ciclos de 
estos elementos se combinan de diferentes maneras e interrelacionan entre sí 
(Atlas Richard, 2002). 
 
El azufre está incorporado prácticamente en todas las proteínas y de esta manera 
es un elemento absolutamente esencial para todos los seres vivos. Se desplaza a 
través de la biosfera, comprende desde el suelo (o desde el agua en los 
ambientes acuáticos) a las plantas o a los animales y de regreso nuevamente al 
suelo o al agua. Algunos de los compuestos azufrados presentes en la tierra son 
llevados al mar por los ríos. Este azufre es devuelto a la tierra por un mecanismo 
que consiste en convertirlo en compuestos gaseosos tales como el ácido 
sulfhídrico (H2S) y el bióxido de azufre (SO2). Generalmente son lavados por las 
 5
lluvias, aunque parte del bióxido de azufre puede ser directamente absorbido por 
las plantas desde la atmósfera. 
 
Las bacterias desempeñan un papel crucial en el reciclaje del azufre. Cuando está 
presente en el aire, la descomposición de los compuestos del azufre (incluyendo la 
descomposición de las proteínas) produce sulfato (SO4-2). Bajo condiciones 
anaeróbicas, el ácido sulfúrico (gas a olor a huevos en putrefacción) y el sulfuro de 
dimetilo (CH3SCH3) son los productos principales. Cuando estos gases llegan a la 
atmósfera, son oxidados y se convierten en bióxido de azufre (SO2) (Atlas Richard, 
2002). La oxidación posterior del bióxido de azufre y su disolución en el agua de 
lluvia produce ácido sulfhídrico y sulfatos, formas principalmente bajo las cuales 
regresa el azufre a los ecosistemas terrestres. Pero en todos los casos, el azufre 
elemental (S°) es la forma no asimilable y sólo puede entrar en el ciclo por la 
acción de algunas bacterias que son capaces de oxidarlo a SO4-2. El carbón 
mineral y el petróleo contienen también azufre y su combustión libera bióxido de 
azufre a la atmósfera (Figura 1) (Atlas Richard, 2002). 
 
 6
 
 
Figura 1. Ciclo Biogeoquímico del azufre. 
 
 
1.1.1 COMPUESTOS AZUFRADOS 
 
Entre los compuestos azufrados que se emiten en grandes cantidades a la 
atmósfera se encuentra: SULFATOS (SO42-) Y TIOSULFATO (S2O3-2) 
 
 
 
 
 
 
SO 42-
S0 
HS - 
Depósitos 
de sulfato 
(Agua 
Marina) 
Minerales 
de sulfuro 
(Ejemplo. 
Pirita) 
Depósitos 
De azufre 
Oxidación 
Biológica 
Con O2 o NO3- 
Oxidación 
Biológica con
O 2 o NO 3- 
Oxidación 
Anaeróbica por 
b acterias fotótrofas 
Procesos de 
mineralización 
Oxidación 
Biológica con O2 
o NO3- 
Oxidación 
Anaeróbica por 
Bacterias fotótrofas 
Oxidación 
Espontánea 
Reducción 
Asimilativa 
De sulfato 
Compuestos 
orgánicos de 
Azufre 
Reducción 
Desasimilativa 
De sulfato 
Reducción 
Desasimilativa de 
Sulfato 
 7
SULFATOS (SO42-) 
 
Los sulfatos (SO4-2) son muy abundantes en la naturaleza. Una de las principales 
fuentes son los drenajes de minas debido a la oxidación de la pirita y en los 
efluentes industriales por el uso del ácido sulfhídrico (H2S). La problemática que 
existe al uso de los sulfatos es la corrosión de metales a concentraciones de 
200ppm y sobre todo en tuberías de cobre (Chopin y col., 1977). 
 
 
TIOSULFATO (S2O3-2) 
 
El tiosulfato (S2O3-2) es un anión meta-estable que tiende a su descomposición 
química en soluciones acuosas. A concentraciones menores se descompone más 
rápido que a concentraciones mayores. Los agentes oxidantes fuertes como los 
iones bromato y los iones hipoclorito oxidan cuantitativamente los iones tiosulfato 
a tetrationato. 
 
El anión de tiosulfato (S2O3-2), junto con otros compuestos es altamente agresivo 
por los problemas de corrosión de metales. Es utilizado en las industrias 
fotográfica, de papel, farmacéutica y del petróleo, por lo tanto se encuentra como 
contaminante en las aguas de desecho de estas industrias (Chopin y col., 1977). 
 
 
AZUFRE 
 
El azufre, es un elemento no metálico, inodoro, de color amarillo pálido. Se 
encuentra en el grupo 16 del sistema periódico, su número atómico es 16 y su 
masa atómica es 32.064. 
 
Es un elemento muy abundante en la corteza terrestre. Se encuentra ampliamente 
distribuido tanto en estado libre como combinado con otros elementos como 
 8
sulfuros metálicos, sulfuro de plomo (PbS), y otros elementos formando sulfatos 
como la baritina (BaSO4), el yeso (CaSO4.2H2O), etc. (Chopin y col., 1977). 
 
Los sulfatos están presente en las cercanías de aguas termales, zonas volcánicas, 
por lo cual no es un contaminante del ambiente y puede ser utilizado como materia 
prima en la fabricación de ácido sulfúrico que es muy utilizado en la industria 
papelera entre otras (Lens y Kuenen, 2001). 
 
 
1.2 ENDULZAMIENTO DE GAS 
 
 
1.2.1 GAS NATURAL 
 
El gas natural es una mezcla de gases que se encuentra frecuentemente en 
yacimientos fósiles, solo o acompañando al petróleo o a los depósitos de carbón. 
La composición del gas varía en función del yacimiento del que se extrae, está 
compuesto principalmente por metano en cantidades del 90 o 95%, y suele 
contener otros gases como nitrógeno, etano, CO2, H2S, butano, propano, 
mercaptanos y trazas de hidrocarburos más pesados (Ikoku, 1992). 
 
El gas natural arrastra desde los yacimientos a compuestos indeseables como son 
el ácido sulfhídrico (H2S), bióxido de carbono (CO2), y agua en fase gaseosa. El 
gas que se recibe o extrae es: Húmedo: por la presencia de hidrocarburos 
líquidos. Amargo: por los componentes ácidos que contiene. Hidratado: por la 
presencia de agua que es arrastrada desde los yacimientos. 
 
Cuando en el gas natural el H2S esta por encima de la concentración de 4ppm por 
cada pie cúbico de gas, se dice que es un “gas amargo” y cuando la concentración 
está por debajo de 4ppm se dice que es un “gas dulce” (Ikoku, 1992). 
 
 
 9
1.2.2 GASES ÀCIDOS 
 
Al H2S y CO2 se les denomina gases ácidos del gas natural. El ácido sulfhídrico 
(H2S), también conocido como sulfuro de hidrógeno, tiene las características de 
tener un desagradableolor y ser muy tóxico. 
 
El ácido sulfhídrico (H2S) que es separado del gas natural mediante el proceso de 
endulzamiento, se envía a plantas recuperadoras de azufre y posteriormente se 
vende en forma líquida para sus diversos usos industriales (producción del 
pólvora o usos médicos) (Mackenzie et al., 1987). 
 
El dióxido de carbono (CO2) es un gas incoloro e inodoro, que a concentraciones 
bajas no es tóxico, pero en concentraciones elevadas incrementa la frecuencia 
respiratoria y puede llegar a producir sofocación. El dióxido de carbono es soluble 
en agua formando compuestos ácidos, los cuales tienen propiedades corrosivas 
que el CO2 presenta en agua. 
 
 
1.2.3 PROCESO DE ENDULZAMIENTO DE GAS NATURAL 
 
En la Figura 2 se presenta un diagrama esquemático del proceso de 
endulzamiento de gas por aminas (Morales et al., 2003). Se muestran las dos 
etapas de que consta el proceso (absorción y regeneración). La unidad de 
absorción de aminas es la única etapa de alta presión, donde todo el H2S y parte 
del CO2 se absorben en la solución de alcanolaminas y la unidad de regeneración 
que es la etapa en la cual hay consumo de energía para que se produzca una 
desorción con la alcanolamina del H2S y el CO2 donde se envían a una columna a 
baja presión y posteriormente se alimentan a la unidad Claus para la formación de 
azufre elemental. A continuación se describen las etapas de absorción y 
regeneración del proceso de endulzamiento de gas natural por aminas. 
 
 
 10
ETAPA DE ABSORCIÓN 
 
En la etapa de absorción el gas amargo fluye a contracorriente de la solución de 
alcanolamina. El gas entra al sistema de absorción a una presión de 70kg.cm-2 
(1010psi) y una temperatura 60°C. La alcanolamina utilizada es la 
metildietanolamina (MDEA), a una concentración de 51% en peso (13.35% mol). 
(Kohl, 1997). 
 
La solución alcalina (amina pobre por no contener gas ácido) permite la absorción 
casi completa del ácido sulfhídrico y el dióxido de carbono. La concentración de 
H2S queda en el gas después de haber pasado por el proceso de endulzamiento, 
debe ser menor de 4 ppm para que pueda ser comercializado (Kohl, 1997). 
 
 
ETAPA DE REGENERACION 
 
En la etapa de regeneración, la solución de amina se separa del H2S absorbido 
por medio de calor. Para ello la solución de amina rica, después de la desorción 
de hidrocarburos, es conducida a un intercambiador térmico donde incrementa su 
temperatura a 103°C (presión a 3.5 kg.cm-2). Con esta temperatura, se alimenta a 
una torre de regeneración donde se incrementa la temperatura hasta 126°C 
mediante su recirculación en un rehervidor (Kohl, 1997) 
 
La regeneración por destilación aloja a una mezcla de gas ácido y vapor de agua, 
la cual pasa a través de enfriadores donde se separa el agua por condensación y 
finalmente llega al tanque acumulador. El gas ácido, se envía en algunos casos a 
la unidad recuperadora de azufre (Claus) (Kohl, 1997) y en otros casos como el 
caso de los centros procesadores de gas de la sonda de Campeche es incinerado. 
 
 11
CLAUS
GAS AMARGO
GAS DULCE
TORRE DE 
ABSORCION
TORRE DE REGENERACION
REHERVIDOR
AZUFRE
CLAUS
AZUFRE
GASES DE COLA
1
2
CLAUS
GAS AMARGO
GAS DULCE
TORRE DE 
ABSORCION
TORRE DE REGENERACION
REHERVIDOR
AZUFRE
CLAUS
AZUFRE
GASES DE COLA
1
2
 
 
Figura 2. Proceso de endulzamiento de gas por aminas. 1: Corrientes de solución 
de aminas (1): rica ó ácida y (2): pobre. 
 
 
1.2.3.1 AMINAS 
 
Las aminas que tienen mayor interés comercial para ser usadas en la purificación 
de gases son la monoetanolamina (MEA), dietanolamina (DEA) y la 
metildietanolamina (MDEA) (Kohl y Nielsen, 1997). La trietanolamina (TEA) ha 
sido desplazada debido principalmente a su baja capacidad de absorción (por su 
elevado peso molecular), su baja reactividad (como amina terciaria), y su poca 
estabilidad. 
 
Estas moléculas, presentan las propiedades de las aminas y de los alcoholes, 
tienen por lo menos un grupo hidroxilo que sirve para reducir la presión de vapor e 
incrementar la solubilidad del agua y un grupo amino que proporciona la 
 12
alcalinidad necesaria en soluciones acuosas para dar lugar a la absorción de 
gases ácidos (Kohl, 1997). 
 
Las aminas que contienen dos átomos de hidrógeno unidos directamente al átomo 
de nitrógeno, tales como la monoetanolamina y la 2-(2-aminoetoxil etanol), son 
denominadas aminas primarias (Tabla 2) y son generalmente las más alcalinas. La 
dietanolamina y la di-isopropanolamina tienen un átomo de hidrógeno 
directamente enlazado al átomo de nitrógeno y se denominan aminas 
secundarias. La trietanolamina (TEA) y la metildietanolamina (MDEA) tienen 
completamente substituidos los hidrógenos del grupo amina y se denominan 
aminas terciarias. (Tabla 2) 
 
 
Tabla 2. Alcanolaminas utilizadas en la purificación del gas natural (Kohl y 
Nielsen, 1997; Manning y Thompson; 1991) 
PRIMARIA SECUNDARIA TERCIARIA 
NH2-CH2CH2OH CH3CH2-NH-CH2CH2OH CH3N-(CH2CH2OH)2 
Monoetanolamina (MEA) 
Dietilenglicolamina (DGA) 
Dietanolamina (DEA) 
di-isopropanolamina (DIPA) 
Trietanolamina(TEA) 
Metildietanolamina (MDEA) 
 
 
1.2.3.2 METILDIETANOLAMINA (MDEA) 
 
La metildietanolamina (MDEA) es una amina terciaria, es altamente selectiva para 
la absorción del gas H2S en comparación del CO2. Puede utilizarse en 
concentraciones altas por tener una mayor capacidad de reaccionar con el gas 
ácido. Se usa normalmente en un rango del 20% al 50% en peso. 
 
La MDEA tiene ventajas frente a las aminas primarias y secundarias, tales como: 
baja presión de vapor, un rendimiento energético más alto, bajos calores de 
 13
reacción con los gases ácidos, alta resistencia a la degradación, bajos problemas 
de corrosión, alta selectividad en la absorción de H2S en presencia de CO2. La 
tabla 3 muestra las propiedades físicas y químicas de la metildietanolamina 
(MDEA) usada para purificación de gases (Kohl y Nielsen, 1997). 
 
 
Tabla 3. Características fisicoquímicas de la metildietanolamina (MDEA) (Kohl, 
1997). 
Propiedades MDEA 
Peso Molecular (PM) 119.17 
Gravedad específica (20/20°C) 1.0418 
Punto de ebullición (°C) 
760 mmHg 
50 mmHg 
10 mmHg 
 
247.2 
164 
128 
Presión de vapor (mmHg A 20°C) 101 
Punto de congelación (°C) -21.0°C 
Solubilidad en % en peso a 20°C 101 
Calor de vaporización (Btu/lb. a 1 atm) 223 
 
 
1.3 MICROORGANISMOS SULFOXIDANTES ALCALÓFILOS 
 
La oxidación biológica de HS- a SO4-2 es una de las principales reacciones del 
ciclo biogeoquímico del azufre. Los microorganismos sulfoxidantes son aquellos 
que oxidan exclusivamente compuestos inorgánicos reducidos de azufre y el SO4-2 
es el principal producto de oxidación. Tradicionalmente las bacterias sulfoxidantes 
incluyen las bacterias verdes, púrpuras e incoloras del azufre que pertenecen 
tanto a las proteobacterias como a las arqueobacterias (Brüser y col., 2000). 
 
Existe una gran variedad de bacterias sulfoxidantes que tienen diversas 
propiedades morfológicas, fisiológicas y ecológicas. 
 14
 
No existe una definición específica que caracterice a un organismo alcalófilo o 
alcalino tolerante (Horikoshi, 1999). Varios microorganismos presentan más de un 
valor de pH óptimo de crecimiento en función de las condiciones de cultivo, 
particularmente nutrimentos, iones metálicos y temperatura. Sin embargo se 
puede plantear que el término alcalófilo se refiere a microorganismos que crecen 
adecuadamente o bien de manera óptima a valores de pH mayores a 9, 
frecuentemente entre 10 y 12, pero no pueden crecer o crecen muy lentamente a 
valores de pH cercanos al neutro 6.5. La condición alcalófila de microorganismos 
con actividad sulfoxidante se ha encontrado en condiciones oxicas o anóxicas 
(Sorokin, 2000), las cuales son particularmente importantes en la industria 
petrolera. 
 
Los microorganismos sulfoxidantes alcalófilos se encuentran clasificados dentro 
de los microorganismosextremos o extremófilos, por las condiciones de pH a las 
cuales pueden crecer. Los microorganismos extremófilos son aquellos que pueden 
sobrevivir en ambientes considerados como hostiles para la mayoría de los 
organismos vivos, siendo quizá una forma de vida de las más antiguas de la 
Tierra. Se cree que los extremófilos se adaptaron a los desafíos ambientales que 
las formas de vida más tempranas tuvieron que soportar. (Clive, 1990) 
 
A partir de 1950, algunos investigadores descubrieron que las moléculas que 
provenían de organismos que viven en condiciones ambientales adversas (pH 
ácido o alcalino, elevada o baja temperatura, alta salinidad, presión elevada) 
podrían tener diversas aplicaciones. La biotecnología y la industria petrolera son 
áreas donde el uso de microorganismos extremos puede ser potencialmente útil. 
Su aislamiento y cultivo ha sido lento y difícil. Sin embargo, los avances técnicos 
están contribuyendo a mejorar el proceso y a conocer su genoma. 
 
Los microorganismos extremos se han clasificado en 6 tipos diferentes con base al 
factor ambiental que soportan: termófilos, psicrófilos, barófilos, halófilos, acidófilos 
y alcalófilo (Madigan y col., 1999). 
 15
 
Los microorganismos sulfoxidantes se han aislado de lagos salados (pH alcalino y 
altas concentraciones de Na2CO3/NaHCO3/NaCl de las estepas de Asia y África 
del este. Las diferentes especies se han clasificado como dos nuevos géneros 
Thioalcalomicrobium y Thioalcalovibrio. Estos organismos son quimiolitoautótrofos 
debido a su capacidad para crecer a pH entre 9 y 11 y de oxidar compuestos 
reducidos de azufre (sulfuro, tiosulfato, tiocianato). Otra notable característica de 
estos organismos es su capacidad de crecer en ambientes salinos-altos 0.6 a 4 M 
de sodio total (Sorokin y col. 2001a). 
 
Las reacciones que llevan a cabo los microorganismos sulfoxidantes son: 
 
Absorción-hidrólisis de H2S 
H2S (g) + OH- → HS- + H2O 
 
Oxidación biológica de sulfuro en azufre elemental 
HS- + ½O2 → So + OH- 
 
En el caso de existir un exceso de oxígeno, el azufre elemental se oxida a sulfato 
So + 1½O2 + H2O → SO42- + 2H+ 
 
 
1.4 REACTORES 
 
 
1.4.1 REACTORES QUIMICOS 
 
Un reactor químico es un aparato o equipo industrial en el que se realiza la 
transformación química, cuyas características son: alto rendimiento en tiempos 
cortos, el equipo es de bajo costo y consume el mínimo de energía. Además, 
proporciona el tiempo suficiente de contacto entre las sustancias y el catalizador 
para que se lleve a cabo la reacción. Permite condiciones de presión, temperatura 
 16
y composición de modo que la reacción tenga lugar a una velocidad deseada 
(Smith J.M. 1991). 
 
Los reactores químicos se han clasificado de la siguiente manera: 
 
1) En base a su tipo de operación donde se asocian los reactores homogéneos 
como son los reactores por lotes, reactores continuos y reactores semicontinuos. 
 
2) En base a su característica de diseño donde se asocian reactores en forma de 
tanques, reactores tubulares, reactores de lecho fijo, reactores de torre y reactores 
para fases dispersas. (Loya, 2005) 
 
 
1.4.2 REACTORES BIOLOGICOS (BIOREACTORES) 
 
Un biorreactor es un sistema en el cual se efectúa una conversión biológica que 
implica enzimas, microorganismos, y células de animales o de plantas. Las 
características del biorreactor son (Loya, 2005): 
 
• Tienen una alta selectividad 
• Una alta eficiencia en producir el producto deseado 
• Proporciona un alto nivel de control para los productos que se quieran obtener. 
 
Los bioreactores se han clasificado de la siguiente forma: 
 
 
1.4.2.1 BIORREACTORES EN LOTE 
 
Un biorreactor en lote es un sistema en donde se tiene un medio de cultivo, el cual 
es inoculado con microorganismos para que se lleven a cabo cierto tipo de 
reacciones, de acuerdo a los productos que se quieren obtener por el sustrato que 
hemos introducido en el medio de cultivo. Los sistemas en lote son alimentados 
 17
una sola vez o varias en tiempos determinados. Las características del biorreactor 
son (Loya, 2005): 
 
• Baja inversión de capital comparada con los procesos continuos. 
• Mayor flexibilidad en la operación del equipo 
• Calidad constante del producto 
 
 
1.4.2.2 BIOREACTOR CONTINÚO 
 
La definición de un cultivo o quimiostato continuo, es el proceso de alimentación 
interrumpida. Un medio de cultivo estéril contenido en un biorreactor, se está 
alimentando continuamente para mantener el estado del sistema estable. Las 
características del biorreactor continuo son (Loya, 2005): 
 
• Tiene un costo reducido de trabajo por la automatización 
• Calidad constante en el producto, debido a los parámetros de funcionamiento 
invariables 
• Potencial creciente para automatizar el proceso 
 
La figura 3 muestra resultados obtenidos en un reactor sulfoxidante continuo 
(Alcántara y col., 2003). Se observa la oxidación de los compuestos azufrados en 
función del oxígeno disuelto medido como una relación O2/S2-. Como se muestra 
en la figura, en relaciones O2/S2- de 0.5 se obtiene un 80 % de azufre elemental a 
partir de la oxidación parcial de sulfuro, mientras que en relaciones O2/S2- de 2, se 
obtiene una oxidación completa a sulfatos. 
 
 18
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 1.75 2
Relaciones molares (O2/S
2-)
C
om
pu
es
to
s 
de
 a
zu
fre
%
sulfato azufre tiosulfato sulfuro
HS- + 1/2O2 
 So +OH- 
So + 11/2 O2 + H2O 
 SO4
2- +2H+
Exceso de O2
 
Figura 3. Oxidación biológica de sulfuro en función de la concentración 
de oxígeno disuelto y la concentración de sulfuro en el medio (O2/S2-). 
 
 
1.5 INMOVILIZACION DE MICROORGANISMOS 
 
Tradicionalmente las enzimas y células bacterianas han sido usadas en 
dispersiones homogéneas para convertir sustratos a productos. Esto significa que 
una enzima puede estar disuelta en la solución de sustrato o que las células vivas 
pueden estar suspendidas en el medio de cultivo. (J.M Walker). 
 
Para lograr el máximo aprovechamiento de la actividad enzimática surge como 
una alternativa la inmovilización de células, y en algunos casos la inmovilización 
de la propia enzima. 
 
La inmovilización de células puede ser definida como la unión física o química de 
células a un soporte biológicamente inerte el cual le dará a las células ciertas 
características deseables dentro de un proceso biocatalítico. 
 19
La inmovilización incluye células muertas, células en estado vivo sin crecimiento y 
células vivas en crecimiento, utilizadas para procesos bioquímicos complejos 
donde se requiere de toda la maquinaria metabólica para una aplicación específica 
(Sydney, 1987). Estas técnicas son directas y siempre tendrán su lugar en los 
laboratorios o en las plantas industriales, no obstante en estos procesos 
homogéneos los microorganismos no expresan su potencial total y el control del 
proceso tiende a ser difícil (J.M. Walker). 
 
La inmovilización de células microbianas no sólo mejora la productividad de un 
biorreactor sino también proporciona ventajas a las células libres. Se pueden 
manejar más fácilmente y recuperar de la solución sin dificultad. Los procesos 
continuos pueden funcionar a altas tasas de dilución sin la perdida de la biomasa o 
lavado de los reactores (Zaragoza, 2003). 
 
Las células microbianas inmovilizadas en una matriz de hidrogel como el alcohol 
polivinílico, quitosano o carragenina se pueden proteger contra condiciones 
ambientales ásperas tales como pH, temperatura, solvente orgánico, y 
compuestos orgánicos (Park y Chang, 2000). 
 
 
1.5.1 MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN: 
 
Hay numerosas formas en las cuales los biocatalizadores (células) pueden ser 
confinados a un espacio restringido conduciendo a un sistema de reacción 
heterogéneo. La clave del éxito está en llevar acabo la inmovilización de tal forma 
que la solución del sustrato pase a través de esta región fácilmente e interactúe 
con el biocatalizador eficientemente. 
 
Dentro de los métodos de inmovilización se encuentran: el enlace físico o 
adsorción, el enlace covalente y el atrapamiento (Primrose, 1991). 
 
 20
En este estudio nos enfocaremos a este último, es por esto que se presentan sólo 
los detalles del método de atrapamiento. 
 
El método más frecuentemente utilizado de inmovilización de células involucra el 
atrapamiento en una matriz polimérica, en este caso alcohol polivinílico. Aquí los 
microorganismos o biocatalizadores, son envueltos dentro de una matriz 
polimérica o hydrogel. (Zaragoza, 2003) 
 
El biocatalizador puede realmente estar en solución libre dentro de los confines del 
sistema de atrapamiento (hydrogel). (J.M. Walker) 
 
Los hidrogeles son polímeros hidrofilicos entrecruzados los cuales se hinchan 
cuando entran en contacto con agua, soluciones buffer o fluidos biológicos 
(Vladimir, 1996). Son sintetizados a partir de monómeros o de polímeros usando 
pequeñas cantidades de agentes entrecruzantes como los aldehídos. (Zaragoza, 
2003) 
 
El alcohol polivinilico (PVA) es un polímero hidroxilico altamente cristalino, 
comercialmente producido por la hidrólisis del polivinil acetato. Este polímero es 
soluble en agua y posee resistencia a la abrasión debido a su baja tensión 
superficial. Es biodegradable y sus aplicaciones industriales están limitadas por el 
uso de soluciones acuosas. Sus principales usos son en fibras, adhesivos, 
recubrimientos, películas, geles, etc. (Guenet, 1992) 
 21
2. JUSTIFICACIÓN 
 
Existen alternativas biológicas para el tratamiento del gas natural, que reducen las 
etapas del proceso fisicoquímico actual y por lo tanto los costos de operación. 
Para poder ofrecer dichas alternativas, es necesario realizar estudios de 
adaptación de los microorganismos en reactores biológicos para que puedan 
desarrollarse en las condiciones actuales de los procesos industriales, tales como 
el pH, la concentración de amina, entre otros. 
 
En este trabajo se pretende estudiar algunas estrategias de adaptación de 
microorganismos sulfoxidantes libres e inmovilizados en geles de alcohol 
polivinílico, para que soporten concentraciones altas de metildietanolamina 
(MDEA), y así puedan ser utilizados en procesos biotecnológicos, que traten las 
corrientes contaminadas con compuestos azufrados de la industria petrolera. 
 
 22
 
3. HIPOTESIS DE TRABAJO 
 
El cultivo mixto sulfoxidante tendrá la capacidad de oxidar tiosulfato en presencia 
de la Metildietanolamina (MDEA) y conservará su actividad al inmovilizar las 
células en un hidrogel de alcohol polivinílico (PVA). 
 
 23
4. OBJETIVOS 
 
4.1 OBJETIVO GENERAL: 
 
Adaptar un cultivo mixto sulfoxidante alcalófilo sin inmovilizar e inmovilizado a la 
oxidación de tiosulfato, en presencia de diferentes concentraciones de 
metildietanolamina (MDEA), en un reactor biológico que funcione en forma 
continua. 
 
 
4.1.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: 
 
1. Caracterizar la actividad sulfoxidante del cultivo mixto, determinando los 
parámetros cinéticos: velocidad específica máxima de utilización de 
sustrato (qmáx) y constante de afinidad por el sustrato (KS), mediante la 
aplicación del modelo de Monod. 
2. Estudiar la adaptación progresiva del cultivo mixto en un reactor biológico 
operado en forma continua a diferentes concentraciones de 
metildietanolamina (MDEA) 
3. Inmovilizar el cultivo mixto sulfoxidante alcalófilo en hidrogeles de alcohol 
polivínilico (PVA) 
4. Determinar la actividad sulfoxidante del cultivo mixto inmovilizado en un 
reactor biológico alimentado con tiosulfato. 
 24
5. MATERIALES Y METODOS 
 
5.1 ORIGEN DEL CULTIVO MIXTO SULFOXIDANTE 
 
El cultivo mixto sulfoxidante proviene de enriquecimientos sucesivos de muestras 
de suelo de la región de lagos de Xochimilco (Alcántara y col., 2005). 
 
 
5.2 CARACTERIZACIÓN MICROSCÓPICA DEL CULTIVO MIXTO. 
 
En trabajos previos (Alcántara y col., 2005), el cultivo mixto sulfoxidante se 
caracterizó microbiológicamente (micro y macroscópicamente). En este estudio 
solo se corroboró la parte microscópica. 
 
A la biomasa del reactor, se le realizó una caracterización microscópica, siguiendo 
la técnica de tinción de Gram. (Ver métodos microbiológicos). 
 
Las muestras se observaron en microscopio marca Nikon modelo Eclipse E 800 y 
se observó su morfología: cocos o bacilos Gram (+ ó -) y su agrupación. 
 
 
 
 
 
 25
5.3 CARACTERIZACIÓN DE LA ACTIVIDAD SULFOXIDANTE DEL 
CULTIVO MIXTO 
 
Se realizaron cinéticas de oxidación de tiosulfato, con el propósito de caracterizar 
físico químicamente al inoculo utilizado para la operación del reactor en continuó. 
 
En matraces Erlenmeyer de 125 mL, se adicionaron 49 mL de medio mineral 
(tabla 4) estéril (ver esterilización de medio mineral), adicionado de la fuente de 
energía (tiosulfato). Las concentraciones de tiosulfato utilizadas fueron de 1.0, 2.5, 
5.0, 7.5, 10.0, 15.0 y 20.0 mM. 
 
Se adicionó 1 mL del inoculo previamente obtenido (ver preparación de inoculo). 
 
Los matraces se incubaron en una agitadora orbital marca Lab-line, 
manteniéndose a 150 rpm. Se tomaron muestras a diferentes intervalos de tiempo, 
para seguir la oxidación del tiosulfato, la aparición de sulfato y el crecimiento de la 
biomasa (proteína). 
 
 
5.3.1 ESTERILIZACIÓN DEL MEDIO MINERAL 
 
La esterilización del medio mineral se llevó a cabo por filtración, mediante una 
membrana estéril de 0.2 µm de tamaño de poro y con una jeringa estéril de 50 mL 
Plastipak. 
 
Todo el material utilizado para las cinéticas fue esterilizado en una autoclave 
marca Yamato a 120 °C de temperatura y 15 libras de presión durante15 minutos. 
Todo esto se trabajo en campana de flujo laminar. 
 
 
 
 26
5.3.2 PREPARACIÓN DEL INOCULO PARA LAS CINÉTICAS DE OXIDACIÓN 
DE TIOSULFATO 
 
Para obtener el inoculo necesario para la prueba de oxidación de tiosulfato, 
previamente se inocularon 6 matraces Erlenmeyer de 150 mL, conteniendo 50 mL 
de medio mineral estéril (tabla 4) más la fuente de energía (tiosulfato, Na2S2O3) y 
se adicionó 1 mL de inoculo. Los matraces se incubaron a 150 rpm, durante 72 
horas. Posteriormente el contenido de los matraces se colocó en tubos para 
centrífuga estériles y se centrifugaron a 10,000 rpm durante 10 minutos en una 
centrifuga marca Eppendorf 5810 R. 
 
El sobrenadante fue desechado y el precipitado (biomasa) de todos los tubos se 
recuperó en medio mineral sin tiosulfato, en un volumen aproximado de 40 mL. Se 
ajustó el valor de la densidad óptica del inoculo a un valor de 1.0, utilizando una 
longitud de onda de 540 nm en un espectrofotómetro marca HACH. La dilución del 
inoculo para ajustar la densidad óptica se realizó con medio mineral sin tiosulfato 
esterilizado por filtración. 
 
 
Tabla 4. Composición del medio mineral para el crecimiento de microorganismos 
sulfoxidantes (Sorokin y col. 2001a). 
Compuesto g*L-1 
Na2CO3 14 
NaHCO3 9 
NaCl 5 
K2HPO4 0.5 
KNO3 0.5055 
MgCl2.6H2O 0.2481 
Solución de elementos traza* 2 mL 
Na2S2O3 
pH 
10 
10 (± 0.2) 
 
 27
 
*Composición de la solución de elementos traza 
Compuesto g*L-1 
Fe III-Citrato 1000 
MnCl2.4H2O 10 
ZnCl2 5 
Lic. 5 
KBr 2.5 
KI 2.5 
CuS04.5H2O 0.005 
CaCl2 1000 
Na2MoO4.2H2O 1.00 
CoCl2.6H2O 5.00 
SnCl2.2H2O 0.50 
BaCl2.2H2O 0.50 
AlCl3.6H2O 1 
H3BO3 10.00 
EDTA 20.00 
 
 
5.4 ESTUDIO DE LA ADAPTACIÓN PROGRESIVA DEL CULTIVO 
MIXTO EN UN REACTOR BIOLÓGICO OPERADO EN FORMA 
CONTINUA A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE 
METILDIETANOLAMINA (MDEA). 
 
El cultivo mixto sulfoxidante se colocó en un reactor de flujo ascendente, con las 
siguientes características (Figura 4): 
 
El reactor consta de dos columnas(A y E): En la columna de reacción (E), se lleva 
básicamente la reacciónde oxidación del sustrato. En esta columna se colocaron 
 28
los electrodos de medición de pH y potencial redox conectados a un 
biocontrolador que llevó el registro de estos dos parámetros durante la operación 
del sistema. Para el control de pH, se preparó una solución de NaOH 1 N (G), y el 
controlador lo adicionó cuando así fue necesario. 
 
 El medio mineral adicionado de tiosulfato (S2O3-2) como fuente de energía (B), se 
realizó a través de una bomba peristáltica, en cuya conexión final se colocó un 
tubo de vidrio que llegaba al fondo de la columna (E) para asegurar que el medio 
llegara a este punto y así empezar la reacción. 
 
La columna de aireación (A), se utilizó para suministrar y dispersar el oxígeno 
proveniente del aire (C) al reactor. Las dos columnas se encuentran acopladas y 
conectadas por medio de la bomba de recirculación (D), que introduce el medio 
donde se lleva a cabo una parte de la aireación del sistema. La figura 4 muestra el 
diagrama del reactor utilizado en el laboratorio. 
 29
MM, S 2O3
+ Amina 
(B)
Salida
Aire}
( C)
REACTOR 
(E)
Na OH 1N
(G)
AEREADOR
(A)
Recirculación 
(D)
pH/mV
 
Figura 4. Reactor sulfoxidante de flujo ascendente. 
 
 
5.4.1 PARÁMETROS DE OPERACIÓN DEL REACTOR BIOLÓGICO 
INOCULADO CON EL CULTIVO MIXTO SULFOXIDANTE 
 
Tasa de dilución. El volumen del medio de alimentación adicionado al reactor se 
modificó durante el transcurso del experimento permitiendo el cambio continuo en 
cuanto al volumen en el recipiente, del efluente y, por lo tanto, del contenido 
celular en estos. Al inicio se logró mantener el desarrollo celular en etapa de 
crecimiento, permitiendo la toma de muestras para los ensayos cinéticos. La tasa 
de dilución fue de 1.0 d-1 la cual permitió el enriquecimiento del cultivo mixto. 
 
 30
Temperatura: La temperatura a la que operó el reactor fue de 30°C, ésta se 
controló en un cuarto de temperatura controlada en donde se implemento el 
sistema. Esta temperatura permitió el crecimiento y el desarrollo de la actividad 
metabólica de los microorganismos sulfoxidantes. 
 
pH: El pH es un parámetro crítico en el crecimiento de microorganismos, ya que 
cada tipo de microorganismos sólo puede crecer en un rango estrecho de pH; 
fuera del cual mueren rápidamente. La operación del reactor se llevó a cabo a un 
pH 10, el cual se controló con la adición de NaOH 1N al medio, mediante una 
bomba peristáltica controlada por el biocontrolador. 
 
Oxígeno. El suministro de oxígeno se logró mediante el empleo de línea de 
oxigeno proveniente de un compresor. Se conectó un tubo con un difusor con 
apertura hacia el fondo del reactor, donde las burbujas ascendentes de aire 
ayudaron a dispersar la mezcla de aire y la dilución del oxígeno. Debido a que el 
oxígeno es ligeramente soluble en el medio su suministro se realizó de manera 
continua. 
 
Medio de alimentación. La adición del medio de alimentación al reactor se logró 
mediante el empleo de una bomba peristáltica marca Masterflex. La composición 
del medio de alimentación fue la descrita en la tabla 4. El volumen de alimentación 
del reactor se preparó diariamente y se mantuvo a 4 °C. 
 
Fuente de energía. Los microorganismos utilizados en los experimentos basan 
sus funciones metabólicas en el uso de tiosulfato (S2O3-2) una forma reducida de 
azufre que puede ser oxidada hasta sulfato. Por lo que el medio contiene, además 
de la fuente de carbono (Na2CO3 y NaHCO3), 10 g.L-1 de tiosulfato de sodio 
(Na2S2O3), que corresponde a una concentración de S2O3-2 de 4.2 g.L-1. 
 
 31
Potencial redox: Nos indica la capacidad del substrato para aceptar o donar 
electrones, esto es: sus características oxidantes o reductoras. Uno de los factores 
que intervienen en el potencial redox, aunque no el único, es la concentración de 
oxígeno [O2]. El potencial redox fue monitoreado con un electrodo conectado a un 
equipo “controller, B y C electronics PH 7685. Microprocesador”. 
 
La figura 5 muestra el reactor utilizado en el laboratorio: (1) columna de reacción 
de vidrio con fondo cónico, de 114 cm de altura, con diámetro interno de 5.5 cm, y 
un volumen útil de 1.6 L. La columna Aireación (2), es de vidrio con fondo cónico 
de 50 cm. de altura, con un diámetro interno de 6 cm., el volumen útil fue de 0.7 L. 
 
El reactor se alimento con medio mineral con Tiosulfato (S2O3-2) (3), a través de 
una bomba de alimentación (4), una bomba de recirculación (5) conecta las dos 
columnas (1 y 2), por lo que el volumen de operación total del reactor es de 2.3 L. 
 
La bomba que suministra el álcali (6), está conectada al biocontrolador (7), donde 
igualmente se encuentran conectados el medidor de pH (8A) y el medidor de 
temperatura. 
 
El electrodo de potencial redox (8 B), se conectó a un equipo para registrar este 
parámetro (8). La salida del reactor o efluente se colectó en un recipiente de 
plástico para su posterior tratamiento (9). 
 32
09/05/2008
8
1
4
5
2
7
6
9
8A
3
8B
 
 
Figura 5 Reactor sulfoxidante experimental. 
 
 33
5.4.2 INMOVILIZACIÓN DEL CULTIVO MIXTO SULFOXIDANTE EN ALCOHOL 
POLIVINÍLICO (PVA). 
 
El cultivo mixto se inmovilizó en hidrogeles de alcohol polivínilico (PVA). Se 
prepararon geles de PVA a partir de un reactivo comercial, que se mezcló con 
agua desionizada a temperatura de 90°C. Se utilizó una relación de 2:1 (PVA: 
Agua). La mezcla completamente homogénea, se dejó enfriar a temperatura 
ambiente y se le adicionó el concentrado celular (microorganismos sulfoxidantes), 
se mezclaron en un ambiente estéril y se homogenizó nuevamente. La mezcla se 
depositó en moldes de plástico con geometría cilíndrica de 35mm de diámetro y 
23mm de altura y posteriormente se enfrió a –4°C, formándose así el gel de 
alcohol polivinílico. Se cortó el gel en forma de partículas esféricas (pellets) y se 
determinó la actividad sulfoxidante de los microorganismos inmovilizados, como se 
describió previamente en el punto. Finalmente los geles se sumergieron en el 
medio mineral con tiosulfato para poder absorber agua, dando lugar al 
hinchamiento adicional, posteriormente se adaptaron al medio mineral con 
tiosulfato en el reactor operado en forma continua. 
 
 
5.4.3 ADAPTACIÓN DEL CULTIVO MIXTO INMOVILIZADO EN UN REACTOR 
CONTINÚO 
 
En la figura 6, se muestra el diseño del reactor biológico utilizado, inoculado con el 
cultivo mixto sulfoxidante inmovilizado. El reactor consta de una columna de vidrio 
(1) con fondo cónico de 56 cm de altura, con diámetro interno 3 cm volumen útil 
0.274 L (80% de capacidad), donde se llevó a cabo la reacción de oxidación de 
tiosulfato. 
 
 34
En la parte superior de la columna de reacción (1), se colocaron los electrodos de 
medición pH (apliSens) y Temperatura, conectados a un biocontrolador marca B & 
C modelo ADI 1030 (2). 
 
La alimentación del reactor con medio mineral y tiosulfato (3), fue de forma 
ascendente, a través de una bomba peristáltica, con el objeto de dispersar el 
medio mineral con sustrato, en toda la columna (1). Para el suministro de aire (4), 
se colocó en la parte superior de la columna un tubo de vidrio con un difusor, que 
llegaba al fondo de la columna con el objetivo de dispersar la mezcla de aire y la 
dilución del oxígeno al reactor. 
 
Se tomaron muestras a la entrada y salida (5) del reactor, para analizar el 
consumo de tiosulfato, la aparición de sulfatos y el pH. En la salida del reactor se 
colocó una malla (6), para evitar la salida de los pellets. 
 
 
 35
MM, S2O3SALIDA 
(5)
AIRE
(4)
REACTOR 
+
MICROOGANISMOS
INMOVILIZADO 
(1)
pH/mV
BIOCONTROLADOR
(2)
(3)
MALLA 
(6)
 
Figura 6 Reactor biológico con el cultivo sulfoxidante inmovilizado. 
 
 
5.5 MÉTODOS ANALÍTICOS 
 
5.5.1 CUANTIFICACIÓN DE BIOMASA 
 
La biomasa se estimó indirectamente por el contenido de proteína. Se utilizó el 
método colorimétrico propuesto por (Lowry y col., 1951).La técnica se basa en la reacción de la proteína con el tartrato de cobre en medio 
alcalino y la subsecuente reducción del reactivo de Folin por el complejo tartrato-
 36
cobre-proteína, produciendo el característico color azul que posee un máximo de 
absorbancia a 590 nm. 
 
 
Reactivos 
 
Solución estándar de albúmina a una concentración de 1 g.L-1. Pesar 1 g de 
albúmina sérica bovina, disolver en agua desionizada y aforar a100 mL. 
 
Reactivo A. Sulfato de cobre pentahidratado al 1%. Pesar 1.0 g de sulfato de 
cobre pentahidratado, disolver en agua desionizada y aforar a100 mL. 
 
Reactivo B. Tartrato doble de sodio y potasio al 2 %. Pesar 2.0 g de tartrato doble 
de sodio y potasio, disolver en agua desionizada y aforar a100 mL. 
 
Reactivo C. Carbonato de sodio al 2 % en hidróxido de sodio 0.1 N. Pesar 20 g de 
carbonato de sodio, disolver en la solución de hidróxido de sodio (pesar 4 g de 
hidróxido de sodio), disolver en agua desionizada y aforar a 1 L. 
 
Reactivo D. Al momento de utilizarse se mezclan una parte de A y una de B (1A + 
1B). 
 
Reactivo E. Al momento de utilizarse se mezclan una parte de D y 50 de C (1D + 
50C). 
 
Reactivo de Folin Cicalteau. Al momento de utilizar, se mezclan una parte del 
reactivo de Folin y una de agua (1:1) 
 37
 
Solución de hidróxido de sodio 1 N. Pesar 40 g de hidróxido de sodio, disolver 
en agua destilada y aforar a 1 L. 
 
 
Procedimiento 
 
Preparación de la curva patrón. De la solución estándar de albúmina sérica 
bovina, se realizaron diluciones, en matraces aforados de 10 mL, como se 
muestra en la tabla 5. 
 
 
Tabla 5. Preparación de las diluciones para la curva patrón de proteína 
Concentración de 
proteínas (mg.L-1) 
Solución estándar de 
proteínas (mL) 
Matraz aforado (mL) 
10 0.1 Aforar a 10mL 
30 0.3 Aforar a 10mL 
50 0.5 Aforar a 10mL 
70 0.7 Aforar a 10mL 
100 1.0 Aforar a 10mL 
200 2.0 Aforar a 10mL 
300 3.0 Aforar a 10mL 
 
 
Preparación de las muestras. Tomar 1 ml de la biomasa proveniente del reactor 
colocarlo en un vial eppendorf de 1.8 mL y centrifugar a 10000 rpm durante 10 
minutos, en una centrifuga Beckman Microfuge 12. Retirar el sobrenadante y 
 38
agregar al precipitado 1 mL de la solución de hidróxido de sodio 1N. Agitar 
enérgicamente en vortex hasta disolver completamente el precipitado. Tomar 1 mL 
de las muestras y de las diluciones patrón y colocarlos en un tubo de ensaye. 
Colocar solo las muestras en baño maría durante 10 minutos. Retirar y dejar 
enfriar los tubos en el refrigerador. Adicionar 5 mL de reactivo E a todos los tubos 
(muestras y estándares) y agitar vigorosamente en vortex. 
 
Dejar reposar durante 10 minutos, agregar 0.5 mL de reactivo de Folin y agitar en 
vortex, reposar durante 30 minutos a temperatura ambiente y en oscuridad. Al final 
de este tiempo leer en espectrofotómetro UV/VIS a 590 nm. Usar un blanco de 
agua tratado de la misma manera. 
 
Construir la curva patrón de concentración de proteína vs absorbancia y calcular 
con la ecuación de la curva patrón la concentración de proteínas de las muestras. 
 
 
5.5.2 CUANTIFICACIÓN DE SO4-2 Y S2O3-2 
 
La concentración de estos iones se analiza por medio de electroforesis capilar 
(EC). El fundamento de la técnica consiste en el movimiento diferencial de las 
especies con carga: iónica, catiónica o neutra, provocado por la atracción o 
repulsión de un campo eléctrico. 
 
Se utilizó un equipo EC marca Waters, el sistema consiste de: una fuente de alto 
voltaje, un capilar cuyos extremos se encuentran sumergidos junto con dos 
electrodos en viales que contienen un electrolito con capacidad amortiguadora, un 
detector y un sistema de recuperación de datos. El equipo cuenta con un carrusel 
automatizado, en el extremo opuesto se encuentra otro que contiene la solución 
tampón del electrolito. Ambos compartimentos están unidos por el capilar que a su 
 39
vez está conectado a la fuente de alta tensión (20 a 30 kv) y que posteriormente 
es sometido a la luz UV/vis proveniente del detector. 
 
El capilar se llena con el electrolito y posteriormente se hace pasar la muestra, 
este sistema se somete a la influencia de un campo eléctrico y como resultado las 
especies iónicas del electrolito o de las muestras migran hacia el electrodo 
correspondiente. La migración de cada uno de los componentes de la muestra 
ocurre a diferentes velocidades y se separan a zonas diferentes según la 
movilidad de cada analítico (sulfato y tiosulfato fluyen a un tiempo de retención 
aproximado de 3.3 y 3.5 minutos, respectivamente). El electrolito debe tener 
mayor movilidad que la muestra y por lo tanto está ocupa únicamente una franja 
del capilar. 
 
Las condiciones para el análisis general de los iones se presentan a continuación: 
• Columna de sílice fundida de 60 cm de largo por 70 µm de diámetro interno. 
• Temperatura de columna: 25 °C. 
• Suministro de energía: negativa, con voltaje de 15 KV. 
• Con corriente de 18 a 20 µA. 
• Lámpara de Mercurio, UV a 254 nm. 
• Modo de inyección: hidrostática. 
 
 
Reactivos 
 
Solución estándar de sulfato y tiosulfato. Preparación de soluciones de 1 g.L-1 
de cada uno de los iones. Pesar 0.1478 g y 0.1696 de sulfato de sodio y tiosulfato 
de potasio, respectivamente, disolverlos y aforar a 100 mL. 
 40
 
Electrolito comercial: High mobility electrolite. 
 
 
Procedimiento 
 
Preparación de la curva patrón. Se utilizó una solución estándar preparada con 
reactivos de alta pureza y agua desionizada, efectuándose alícuotas 
progresivamente más concentradas (10, 30, 60, 80 y 100 mg.L-1). Está solución se 
transfiere a viales eppendorf de 0.5 mL con una jeringa en cuyo extremo se coloca 
un filtro de 0.45 µm (tabla 6). 
 
Preparación de las muestras. Las muestras se centrifugan a 10,000 rpm durante 
10 minutos, se toma una alícuota sobrenadante y se preparan diluciones 1:50. Se 
toman 100 µL del sobrenadante y se completa el volumen a 5 mL. Se 
homogeneízan por medio de agitación en vortex y se toman 500 µL y se filtra a 
través de membranas de acetato de celulosa de 12 mm de diámetro y 0.45 µm de 
tamaño de poro. Las muestras se colocan en viales de 200 µL y son analizados 
automáticamente en el equipo de EC. 
 
Para los estándares se sigue el mismo procedimiento. 
 
Con base a los resultados se construye la curva patrón concentración de sulfato y 
tiosulfato vs tamaño de pico (figura 7). Calcular la concentración de las muestras y 
corregir con el factor de dilución. 
 
 
 
 41
Tabla 6. Preparación de las diluciones para la curva patrón de sulfato y 
tiosulfato 
S2O4-2 
(mg.L-1) 
Solución de 
S2O4-2 
(mL) 
S2O3-2 
(mg.L-1) 
Solución de 
S2O3-2 
(mL) 
Agua 
(mL) 
10 .050 100 .500 4.45 
30 .150 80 .400 4.45 
60 .300 60 .300 4.40 
80 .400 30 .150 4.45 
100 .500 10 .050 4.45 
* Cada muestra se filtra y se coloca en un vial eppendorf de 0.5mL 
 
S2O3-2
SO4-2
Minutos
m
V
 
Figura 7. Cromatograma, picos y tiempos de retención característicos en la 
determinación de Sulfato (SO4-2) y tiosulfato (S2O32-) 
 
 
 
 42
 
5.5.3 TINCIÓN DE GRAM 
 
La morfología microscópica de las bacterias se realizó por medio de la técnica de 
tinción de Gram, para ello; la preparación se dividió en dos etapas: 
 
1) Fijación de la muestra: Para fijar la muestra se suspendió una azada de células 
en una gota de agua. La suspensión se distribuyó sobre un portaobjetos y se dejó 
secar al aire. Para fijar las células, el portaobjetos se pasó por la flama de un 
mechero (de forma rápida para evitar quemarlas por exposición prolongada). 
 
2) tinción de Gram. La muestra fija y seca, se cubre con solución de cristal violeta 
durante 2 minutos, se lavó con una suave corriente de agua. Inmediatamente 
después, se cubrió con una solución de lugol durante 1 minuto, para después lavar 
con una solución de alcohol-acetona (70:30), hasta eliminar el color violeta. Se 
enjuagó,y finalmente se aplicó una solución de safranina por 30 segundos; se 
enjuagó con agua y se dejó secar al aire. Las muestras se observaron al 
microscopio (NIKON, Eclipse E 800) con el objetivo de inmersión. 
 
 
Reactivos 
 
Cristal violeta. Pesar 10 g de cristal violeta y 4 g de oxalato de sodio. Disolver en 
100 mL de alcohol absoluto. En un matraz aforado de 500 mL disolver con agua 
destilada y aforar hasta la marca. 
 
Lugol. Pesar 1 g de yodo y 2 g de yoduro de potasio. En un matraz aforado de 
100 mL disolver con agua destilada y aforar hasta la marca. 
 43
 
Safranina. Pesar 2.6 g de safranina. Disolver con 10 mL de etano. En un matraz 
aforado de 100 mL disolver con agua destilada y aforar hasta la marca. 
 
Alcohol acetona. En una probeta de 100 mL vaciar 70 mL de etanol y 
posteriormente vaciar 30 mL de acetona. 
 
 
5.6 TRATAMIENTOS DE RESULTADOS 
 
 
5.6.1 VELOCIDAD DE OXIDACION DEL TIOSULFATO (S2O3-2) 
 
La velocidad de oxidación del tiosulfato es el decremento de la concentración del 
sustrato en función del tiempo. 
 
Y = -242.7 X + 4716.9
R2 = 0.9942
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
S
2O
32
- (g
*L
-1
)
Tiempo (h)
 
 44
Figura 8 Consumo de tiosulfato en función del tiempo en un 
experimento en lote. 
 
Para obtener la velocidad de oxidación del tiosulfato, se grafica la concentración 
de tiosulfato vs. el tiempo, como se muestra en la figura 8. Del comportamiento de 
este experimento se obtiene la pendiente por regresión lineal (velocidad de 
oxidación). 
 
 
5.6.2 VELOCIDAD EXPECIFICA DE OXIDACION DEL TIOSULFATO 
 
La pendiente obtenida en la sección anterior (figura 8), se divide entre la 
concentración de proteína inicial (g*L-1) y se obtiene la velocidad específica de 
oxidación del tiosulfato (q= g S2O32- *g Proteína*h). 
 
Para obtener la velocidad máxima de oxidación de tiosulfato se gráfica todas las 
velocidades específicas de oxidación vs concentración de tiosulfato (Figura 9) y 
estos datos experimentales se ajustan con el Modelo de Monod descrito en el 
punto 5.6.3, con el cual se calculan los parámetros cinéticos: Velocidad específica 
máxima de desaparición del sustrato (qmáx) y constante de afinidad para el sustrato 
(KS). 
 
 
 45
0
50
100
150
200
250
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
q m
ax
(g
S 2
O
32
- /g
Pr
ot
eí
na
*h
)
S2O3-2(mM)
ks
qmáx.
 
 
Figura 9 Velocidades especificas de consumo de tiosulfato en función de la 
concentración de tiosulfato. 
 
 
5.6.3 MODELO DE MONOD (Monod 1961) 
 
La cinética de Monod se divide en dos etapas: 
 
1) La primera de orden 1, donde la velocidad es proporcional a la concentración 
del sustrato. Esta etapa se obtiene la concentración de sustrato se acerca a kS. 
 
2) La segunda etapa es de orden 2. Cuando la concentración de sustrato es 
superior a Ks, entonces la velocidad de consumo del sustrato es constante, y ya no 
depede de la concentración de sustrato, entonces se llega a la velocidad máxima. 
 
 46
Los parámetros cinéticos del modelo de Monod son: velocidad máxima específica 
de desaparición del sustrato (gS2O3*gProteína*h) y la constante de afinidad por el 
sustrato (KS = mM), las cuales se estiman por el modelo de Monod (Ec. 1): 
 
 ( )2
32
2
32
−
−
+
⋅−
=−
OSS
OS
máx SK
Sq
q (Ec. 1) 
 
Donde: 
 
-qmáx= Velocidad específica máxima de desaparición del sustrato 
(gS2O3*gProteína*h) 
-q = Velocidad específica de desaparición del sustrato (gS2O32-*gProteína*h) 
2
32
−OS
S = Concentración de sustrato (tiosulfato S2O32-) (mM) 
KS= Constante de afinidad para el sustrato (tiosulfato S2O32-) (mM) 
 47
6. RESULTADOS 
 
 
6.1 CARACTERIZACIÓN MICROSCÓPICA DEL CULTIVO MIXTO. 
 
Una muestra del cultivo mixto sulfoxidante alcalófilos se fijó en un portaobjetos, se 
le realizó la tinción de Gram y se observó en el microscopio (NIKON, Eclipse E 
800), con el objeto de caracterizarlo microscópicamente. 
 
En la muestra del cultivo se observaron microorganismos Gram negativos (-), en 
forma de bacilos delgados y cortos que crece en forma dispersa (figura 10). 
 
 
 
 
Figura 10. Cultivo mixto sulfoxidante con tinción de Gram, donde se 
observa el crecimiento en forma dispersa y la forma de bacilos de los 
microorganismos. 
 
 
 
 
 
 48
6.2 CARACTERIZACIÓN DE LA ACTIVIDAD SULFOXIDANTE DEL 
CULTIVO MIXTO 
 
Se midió la actividad sulfoxidante del cultivo mixto utilizado para inocular el reactor 
biológico, con objeto de caracterizar su cinética de oxidación. 
 
La actividad se midió realizando cinéticas de oxidación de tiosulfato, a diferentes 
concentraciones del mismo sustrato. Posteriormente se calcularon los parámetros 
cinéticos qmáx, kS y µmáx siguiendo la metodología descrita previamente. 
 
La figura 11 presenta el comportamiento de la oxidación del tiosulfato a su sulfato 
y el crecimiento de la biomasa medida como proteína. La figura 11 muestra la 
oxidación de 10g.L-1 de Na2S2O3 que corresponden a 4.5 g.L-1 de tiosulfato 
(S2O32-). Se observa en la figura que el experimento inició con una concentración 
de S2O32- de aproximadamente 4.5 g.L-1 y que a lo largo del experimento el 
sustrato desaparece con la consecuente aparición del metabolito de oxidación, 
sulfato (SO4-2) y el crecimiento de la biomasa (proteína). 
 
La estequiometria de la reacción de oxidación del tiosulfato se presenta en la 
ecuación 2. 
 
+−− +⎯→⎯++ HSOOHOOS 222 2422
2
32 Ec. 2 
 
En la ecuación 2, tenemos que por cada mol de tiosulfato se tienen 2 moles de 
sulfato, entonces por los 4.5g de S2O32-, se esperan 7.8 g de SO4-2. Se observa en 
la curva (figura 9), que la producción de sulfatos fue aproximadamente 7.7 g.L-1, 
iniciándose con una concentración de 4.5 g de tiosulfato. 
 
 49
La oxidación total del sustrato se llevo a cabo en 24 horas, el crecimiento de la 
biomasa (proteína) se presenta a partir de las 14 horas y se obtuvo un crecimiento 
constante a partir de las 38 horas. 
 
La aparición del metabolito de oxidación (sulfato) se obtiene igualmente a partir de 
las 14 horas, manteniéndose aproximadamente constante a partir de las 38 horas 
(Figura 11). 
 
 
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
0 14 24 38 48 62 74
T (h)
Co
nc
en
tra
ci
ón
 
(m
g·
L-
1 )
0
5
10
15
20
25
30
35
Pr
ot
eí
na
s 
(m
g·
L-
1 )
Sulfatos Tiosulfato Proteínas
 
 
Figura 11. Comportamiento de la oxidación de tiosulfato, aparición de sulfato y 
crecimiento de la biomasa (proteína). 
 
 
 
 
 
 50
 
6.2.1 EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE TIOSULFATO (S2O3-2) EN EL 
CULTIVO MIXTO. 
 
Con objeto de determinar algunos parámetros cinéticos del cultivo sulfoxidante, se 
realizaron cinéticas de oxidación de tiosulfato a diferentes concentraciones como 
se muestra en la figura 12. En la figura 13 se observan las velocidades específicas 
en función de la concentración de tiosulfato 
 
Se observa en la figura 13, que al incrementar la concentración de S2O3-2 en el 
intervalo de 0 a 10 mM la velocidad de oxidación es de orden 1, lo que significa 
que la velocidad de oxidación del tiosulfato depende de la concentración del 
sustrato. Al incrementar la concentración de 10 y hasta 60 mM, la actividad 
sulfoxidante se mantiene constante (reacción de orden cero), debido a la 
saturación del sistema enzimático de los microorganismos, lo que significa que la 
velocidad de oxidación ya no depende de la concentración de sustrato. Los 
resultados obtenidos son representativos de un sustrato que no es inhibitorio para 
el crecimiento microbiano. 
 
Se determinaron los parámetros cinéticos de oxidación del tiosulfato para el cultivo 
mixto adaptado a 30 °C. Se determinó la velocidad de oxidación del sustrato: 
tiosulfato (-qmáx) y la constante de afinidad de la biomasa por el sustrato (ks), en 
base al consumo de sustrato en un período de tiempo. Se obtuvo una velocidad 
máxima de oxidación(-qmáx) de 200 g S2O3-2.g-1Proteína.h-1 y la constante de 
saturación (KS) de 8 mM. En la literatura no se encontraron valores reportados de 
parámetros cinéticos siguiendo la concentración de tiosulfato, sin embargo; 
Sorokin y col., 2003 reportan parámetros cinéticos como qmax=225 µmol O2 g-1 
Proteína h-1, que no corresponde a los valores encontrados en nuestro trabajo, ya 
que ellos determinan la oxidación de tiosulfato indirectamente midiendo la 
disminución de la concentración de oxígeno en el medio. La KS encontrada por 
 51
estos autores fue 3.5 µM, mucho mas pequeña que la reportada en este trabajo. 
Los parámetros cinéticos reportados por Sorokin y col., 2003 fueron para una cepa 
pura de Thialkalimicrobium crecida en un reactor en lote, esta cepa fue reportada 
como sulfoxidante, haloalcalofila. Por los valores encontrados en nuestro trabajo 
podemos concluir que el cultivo mixto utilizado está mucho mas adaptado a la 
oxidación de tiosulfato, por la Ks de 8 mM encontrada. 
 
0
50
100
150
200
250
0 20 40 60 80
q m
ax
(g
S 2
O 3
/g
Pr
ot
eín
a.h
)
S2O3 (mM)
 
Figura 12 Velocidad de oxidación de tiosulfato por el cultivo mixto, en 
función de la concentración de tiosulfato. 
 
Además se determinó la velocidad máxima de crecimiento de la biomasa como 
proteína (µmáx) a lo largo del tiempo del experimento. En la figura 12 se muestran 
los resultados correspondientes a la velocidad específica de crecimiento del cultivo 
mixto (µmáx) en función de la concentración del sustrato. Se observó el mismo 
comportamiento que en la velocidad específica de oxidación de tiosulfato. La 
figura 13 muestra que en concentraciones de tiosulfato de 0 a 10 mM, el 
crecimiento microbiano depende de la concentración de tiosulfato, y que en 
concentraciones mayores a 10 mM, el crecimiento ya no es función de la 
 52
concentración de sustrato. Se obtuvo la curva típica que describe el modelo de 
Monod 1961. La velocidad de crecimiento del cultivo mixto (µmáx) fue de 0.12 h-1. 
 
Sorokin y col., 2003, encontraron valores de 0.33 h-1 y 0.15 h-1 para 
Thialkalimicrobium y Thioalkalcalivibrio reportadas como cepas sulfoxidantes, 
haloalcalofilas, crecidas en reactores en lote. Los resultados reportados en este 
trabajo son semejantes a los de Sorokin y col., 2003. 
 
 
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0 10 20 30 40 50 60 70
µ
(h
-1
)
S2O3 (mM)
 
 
Figura 13. Velocidad máxima de crecimiento del cultivo mixto, en 
función de la concentración de tiosulfato 
 
 
 
 
 
 53
6.3 ADAPTACIÓN PROGRESIVA DEL CULTIVO MIXTO 
SULFOXIDANTE EN UN REACTOR BIOLÓGICO OPERADO EN 
FORMA CONTINÚA, A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE 
METILDIETANOLAMINA (MDEA) 
 
La figura 14A muestra el comportamiento de la oxidación de tiosulfato en el reactor 
biológico en operación continúa. Se alimentó con una concentración de tiosulfato 
de sodio de aproximadamente 4.4 g * L-1 de tiosulfato (S2O32-) y con 8 diferentes 
concentraciones de metildietanolamina (MDEA). El reactor funcionó por un periodo 
de 200 días, se mantuvo a una temperatura de 30°C y a un pH de 10. 
 
Durante el primer periodo de alimentación (0-45 días), donde el reactor solo se 
alimento con tiosulfato, se observa que la oxidación casi fue completa (92%, 
figura 15), ya que en la salida casi no había tiosulfato y la concentración de 
sulfatos generada fue aproximadamente 7.01 g * L-1 de sulfato (SO4-2). Lo que 
significa que el cultivo mixto sulfoxidante estaba bien adaptado al sustrato. 
 
En el segundo periodo (día 46), donde se adicionó 20 mM de Metildietanolamina 
MDEA, se observó que la oxidación de tiosulfato disminuyó en los primeros 10 
días se obtuvo una oxidación de tiosulfato de un 50% de eficiencia (figura 15), 
pero después de esos días, incrementa la oxidación a un 85% de eficiencia (figura 
15). El periodos más drástico fue con la adición de 70mM de Metildietanolamina 
(MDEA), ya que la oxidación de tiosulfato disminuyó a un 70%, lo que se ve 
reflejado en la poca aparición de sulfatos y la correspondiente concentración del 
sustrato a la salida del reactor (Figura 14). 
 
En general, se observa que con la adición de amina, la oxidación de tiosulfato a 
sulfato disminuye. Sin embargo; el cultivo mixto sulfoxidante es capaz de llevar a 
cabo la oxidación del sustrato en presencia de la solución de amina a las 
 54
concentraciones experimentadas, ya que durante la operación del reactor siempre 
se obtuvieron sulfatos (oxidación global 85% eficiencia, figura 15). 
 
La figura 14B, muestra el comportamiento de la biomasa medida como proteína a 
lo largo de la operación del reactor. 
 
En el primer periodo donde el reactor solo se alimento con tiosulfato, encontramos 
que la concentración total del microorganismo es de 19.27mg*L-, cuando se 
empezó adicionar 0-40mM de Metildietanolamina (MDEA), la concentración de 
proteína fue de 20 – 25 mg*L-1. A partir de la adición de amina en concentraciones 
de 50 – 70 mM hubo un aumento de biomasa (proteína) a valores de 37 mg*L-1. 
Después de esa concentración de amina, la biomasa empezó a disminuir, pero en 
cuanto se llego a la concentración de amina de 200mM empezó a normalizar el 
crecimiento microbiano. 
 
En general el comportamiento del crecimiento del cultivo mixto sulfoxidante no 
tuvo una tendencia y no existieron picos tanto de disminución como de aumento 
drásticos en las diferentes concentraciones de amina utilizados. Por lo que 
podemos concluir, que la concentración de proteína no influye en la oxidación de 
tiosulfato (S2O32-) a sulfato (SO42-), demostrando así que efectivamente la 
metildietanolamina (MDEA) es un inhibidor de la actividad sulfoxidante, pero que 
es posible mantener esta actividad si se adaptan los microorganismos 
progresivamente a concentraciones elevadas de amina. 
 
En la figura 15 muestra el porcentaje de oxidación del tiosulfato a, se observa que 
cuando se adicionó una concentración de 20 mM de MDEA, el porcentaje de 
oxidación bajo hasta un 40% en los primeros días, pero rápidamente se 
restableció la eficiencia de oxidación. Igualmente en la concentración de 70 mM de 
MDEA la oxiación bajó hasta un 45%. En las concentraciones utilizadas de MDEA 
se obtuvo un oxidación global de 85%. 
 55
 
 
 
 
Figura 14. Tiosulfato (entrada y salida), aparición de sulfatos (A) y crecimiento 
microbiano medido como proteína (B) en reactor biológico sulfoxidante adicionado 
de diferentes concentraciones de metildietanolamina (MDEA) 
 
 
 56
 
 
Figura 15. Porcentaje de oxidación de tiosulfato en el rector biológico 
sulfoxidante. 
 
 
La tabla 7 muestra un resumen de los resultados de la operación del reactor, en 
las diferentes etapas de alimentación con tiosulfato adicionado de MDEA. 
 
La alimentación del reactor esta dividida en 9 etapas de acuerdo a la 
concentración de amina adicionada desde 0 a 200 mM. Se observa que la 
oxidación del tiosulfato a sulfato es casi total ya que si se observan las columnas 
de sulfato teorico y experimental, la diferencia no es grande, hubo disminución de 
la oxidación de tiosulfato o conversión a sulfato cuando se adicionaron 
 57
concentraciones de amina de 30mM a 40mM y una franca disminución de sulfatos 
al adicionar 70 mM de MDEA. Esto concuerdsa con lo explicado en la Figura 14. 
 
En lo que respecta a la proteína, la tabla 7 muestra las concentraciones promedio 
de la misma en las diferentes etapas de alimentación del reactor. Como se 
observó en la figura 14B, el comportamiento de la misma no tuvo una tendencia, 
sin embargo; a partir de una concentración de 70 mM de amina fue aumentando la 
proteína utilizando la misma concentración de tiosulfato en la alimentación. 
 
Tabla 7 Resultados del reactor biológico a diferentes concentraciones de Amina 
con S2O3-2 (entrada), S2O3-2 (salida), SO4-2 (salida) y Proteína. 
Días Amina 
(mM) 
S2O3-2 
E 
(g*L-1) 
S2O3-2 
S 
(g*L-1)